clase 8 Metodos espectrofotometricos

8/3/2019 clase 8 Metodos espectrofotometricos

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BIO 368

ANALISIS INSTRUMENTAL

METODOS ESPECTROFOTOMETRICOS


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QUE SON LAS RADIACIONES ELECTROMAGNETICAS?

Las radiaciones electromagnticas son ondas autopropagadas que

poseen un componente elctrico y otro magntico. Ellos oscilan

en planos perpendiculares uno de otro y de la direccin de propagacin,

y se encuentran en fase. Es lo que se denomina vulgarmente luz.


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Estas ondas se diferencias unas de otras en su longitud de onda.

La longitud de onda es la distancia que hay entre los picks de 2ondas, y puede ir desde distancias muy grandes, de kilmetros, hasta

distancias muy pequeas, del orden de millonsimas de milmetro

llongitud de onda


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Para representar el espectro de radiacin

electromagntica se utiliza una escala logartmica, es

decir una escala que de un punto al siguiente semultiplica por 10.


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4.- La radiacin UV puede afectar a las molculas biolgicas al incidir sobre ellas ,pudiendo afectar al genoma y producir mutaciones (cncer).

5.- Los rayos X y Gamma son tan pequeo que por fuerza chocan con los tomos si se

interpone materia en su trayectoria. De ah su uso en radiografas e investigacin demateriales.

1.- Algunos tipos deradiacin son capaces

de atravesar la

atmsfera.

2.- Las ondas de radioson las ms largas

(kms).

3.- Las microondas,son de onda larga,ms larga que la

radiacin visible, se

utilizan en los radares

y telfonos mviles.


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CLASIFICACION DE LAS ONDAS ELECTROMAGNETICAS

Se las clasifica de acuerdo a la FRECUENCIA o LONGITUD

de la onda. Ordenadas de mayor a menor longitud de onda ():

- Ondas de radio >100 cm

- Microondas 400 m - 30 cm

- Radiacin infrarroja 0,8 - 25 m

- Luz visible 400 - 700 nm-Luz ultravioleta 10 - 400 nm

UV A 320 - 400 nm

UV B 280 - 320 nm

- Rayos X 0,1 - 1 nm- Rayos gama < 0,1 nm

Nos referiremos en este curso principalmente a la espectrofotometra

ultravioleta y visible, reas ms utilizadas en Bioqumica.


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PROPIEDADES DE LAS RADIACIONESELECTROMAGNETICAS

Las radiaciones electromagnticas presentan:Energa

Frecuencia (longitud de onda)

Intensidad (fotones)

Muy bien ejemplificadas en los espectros electrnicos:

Un electrn para pasar de su estado basal de energa a

un estado de mayor energa (o estado excitado) debe recibir

energa, lo que da lugar a un espectro de absorcin si la energa

proviene de radiaciones electromagnticas.

Cuando un electrn cae de un nivel de excitacin mayor a

uno menor, se emite energa, dando lugar a un espectro de emisin.


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Espectro de Absorcin

Cada elemento quimico posee lneas de

absorcin en algunas longitudes de onda,

hecho que est asociado a las diferencias deenergia de sus distintos orbitales atomicos.

De hecho, se emplea el espectro de

absorcin para identificar los elementoscomponentes de algunas muestras.


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EJEMPLO DE NIVELES DE ENERGIA QUE PUEDE

ALCANZAR UN ELECTRON


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Aplicaciones de la espectroscopa de absorcin uv-vis

Cualitativa, Identificacin de cromforos por el espectro

A vs

Cuantitativa, medir la concentracin del cromforo

A = b C


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UV

Visible


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Las protenas absorben en el uv-vis?


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ABSORBANCIA

max(nm)

(M-1 cm-1)

Triptofano 278

287

5600

4500

Tirosina 275 1400

Fenilalanina 258 200


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Absorcin uv-vis de Protenas


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Absorcin en el uv de residuos aromticos


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Estimacin del coeficiente de absortividad molar de una protena

280 (M-1 cm-1) = 5500 x n(Trp) + 1490 x n(Tyr) + 125 x n(SS)

n(Trp) = nmero residuos de triptofano en la secuencia

n(Tyr) = nmero residuos de tirosina en la secuencia

n(SS) = nmero de enlaces disulfuro en la protena


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Cambio espectral de la tirosina cuando se desprotona (pKa = 10.9), el

mximo de absorcin pasa de 280 nm a 295 nm

Titulacin espectrofotomtrica

de Ribonucleasa pancratica

bovina

RNasa tiene 6 residuos de tirosina

Espectro uv de la RNasa en funcin del pH


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Absorcin en

el UV lejanode los cidos

nucleicos

Cromforo, responsable

de la absorcin, las

bases nitrogenadas


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Espectro de absorcin de 2 bases nitrogenadas que formanparte de los cidos nucleicos a diferentes pHs


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Aplicaciones espectroscopa de absorcin uv-vis

Identificacin

Cuantificacin

Cintica

Determinacin de parmetros estructurales:

desnaturalizacin

ubicacin de residuos

ionizacin de residuosasociacin con ligandos

ALGUNOS CONCEPTOS FUNDAMENTALES DE


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La razn entre la intensidad de la luz transmitida (I) y la luz incidente(I

o

) en

una solucin es lo que se denomina la transmitancia (T):

T = (I/ Io) x 100(La intensidad se expresa como el nmero de fotones interactuando

en la unidad de tiempo).

Una sustancia totalmente transparente tiene una transmitancia de 100%,

mientras que una sustancia totalmente opaca tendr transmitancia 0.

Para valores intermedios de transmitancia se prefiere utilizar el conceptode extincin o absorbancia, que es el logaritmo del recproco de la

transmitancia:

ALGUNOS CONCEPTOS FUNDAMENTALES DEESPECTROFOTOMETRIA

A = log (1/T) = log ( Io/I)

A, por ser un logaritmo, carece de unidades y tiene un rango de valoresque va de 0 a infinito.


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LA LEY DE LAMBERT-BEER

Esta ley relaciona la absorcin de luz con la concentracin de la

sustancia absorbente y el grosor de la capa de solucin que debe cruzarla luz, y establece que hay una proporcionalidad entre ambas :

A = x c x l

:coeficiente de extincin molar o absorbancia molar a una longitud deonda () dada.

c:concentracin de la solucin absorbente (Molar)l:paso de la luz a travs de la solucin (en cm)

(A menudo se usan otras unidades para expresar estos valores; hay que

ser cuidadoso en su uso)

Si bien la ley de Lambert-Beer establece una relacin lineal entre

absorbancia y concentracin, ello se pierde a altas concentraciones.


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0


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LIMITACIONES DE APLICABILIDAD DE LA LEY DE BEER

A) Limitaciones reales de la ley

B) Limitaciones Qumicas

C) Limitaciones Instrumentales

La proporcionalidad directa entre absorbancia y

concentracin cuandob

es cte presenta desviaciones:

La atenuacin de una radiacin es cuantitativamenteproporcional a ala concentracin de la especie absorbente


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LIMITACIONES DE APLICABILIDAD DE LA LEY DE BEER

C) L im i t a c ione s I n s t r umen ta l e s

El cumplimiento estricto de la Ley de Beer slo se observa pararadiaciones monocromticas (radiacin formada por una solalongitud de onda) y stas en la prctica no se consiguen, ya quecon los dispositivos disponibles (filtros, monocromadores) seobtienen una banda de longitudes de onda ms o menos simtrica

entorno a la deseada.Otra desviacin: Presencia de radiacin parsita o dispersa.


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IMPORTANCIA DEL BLANCOEN ESPECTROFOTOMETRIA

Debe contener todos los componentes de la muestra excepto la

sustancia cuya absorbancia se desea medir. Este valor debe sustraerse

en cada lectura, ya sea restndole su valor de absorbancia o ajustando

el instrumento a cero con el blanco.


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INSTRUMENTACION UTILIZADA

- Colormetro de filtro

- Espectrofotmetro de simple haz

- Espectrofotmetro de doble haz

- Espectrofotmetro de arreglo de diodos


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APLICACIONES

CARACTERSTICAS DE LOS MTODOSESPECTROFOTOMTRICOS- Amplia aplicabilidad.

- Elevada sensibilidad: los lmites deteccin 10-4 a 10-5 M.- Selectividad de moderada a alta.

- Buena exactitud: errores de concentracin 1-5% o incluso menores.

- Facilidad y comodidad en las medidas espectrofotomtricas.

- Se prestan a una fcil automatizacin.


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ESQUEMA CON LA ESTRUCTURA BASICA DE UNCOLORIMETRO O ESPECTROFOTMETRO


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LA FUENTE LUMINOSA


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LA FUENTE LUMINOSA

-Lmpara de tungsteno (luz visible; de 350 a 800 nm)

-Lmpara de deuterio o hidrgeno (luz ultravioleta; de 190 a 380 nm)


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Abertura de la rendija de entradade la luz


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El MONOCROMADOR

Es un dispositivo ptico que selecciona y transmite una banda estrecha

de longitudes de onda de luz a partir de la luz generada por la lmpara.

Tipos de monocromadorusados:

- Filtro (banda ancha; poco selectivo). Utilizado en los colormetros.Filtros diferentes para distintas aplicaciones. Ms econmico.

- Prisma. Resuelve el espectro en sus componentes porrefraccin.

- Red de difraccin (grating). Descompone el espectro pordifraccin.


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El monocromador separa una luz incidentepolicromtica en sus componentes y genera

la luz monocromatica.

El i f i d l l


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Refraccin: cambio enla direccin de una onda

por cambios de su velocidad

al pasar a un medio dedistinta densidad.

diafragma

El prisma genera refraccin de la luz

La refraccin es el cambio de direccin que experimenta una onda al pasar de unmedio material a otro.


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La radiacin se reflejada y se esparce las ondas

cuando encuentran un obstculo o al atravesar una

rendija.

DIFRACCION:


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LA RED DE DIFRACCIONEspejo al que se le han grabado una serie de hendiduras paralelas (>5 000/cm).

La radiacin reflejada por una hendidura se sobrepone a las de las hendiduras

vecinas, produciendo interferencias. Si la distancia entre las hendiduras es un

nmero entero de , se refleja luz; de otro modo se interfieren.Las reflejadas estn determinadas por el ngulo que forma la luz con

la red. El ngulo de desviacin de los haces de luz en una red de difraccin

depende de la longitud de onda de la luz. As, la red de difraccin

separa una luz incidente policromtica en sus componentes de

distinta longitud de onda.


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CUBETAS PARA LAS MUESTRAS

-Vidrio: luz visible (> 350 nm)-Plstico: desechables; luz visible-Cuarzo: luz ultravioleta y visible (muy caras)

EL DETECTOR


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EL DETECTOR

- Fotovoltaicos (La luz genera cambios en la intensidad de

corriente)

Resumen


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A= a. b. C El espectrofotmetro convencional enfoca la luz policromtica de la

fuente en un monocromador. Este tiene como componentesprincipales una ranura de entrada, un elemento que dispersa la luz en

sus longitudes de onda componentes (en general una red dedifraccin), y una ranura de salida que permite seleccionar la longitudde onda deseada.

Esa luz monocromtica atraviesa la muestra, y llega al detector. Lasmediciones fotomtricas se hacen en base a la relacin entre la

potencia de luz que alcanza al detector cuando est interpuesta lamuestra (P) y cuando no lo est (P0) o cuando est interpuesto unblanco.

detector

fuente

Resumen

E f d l d


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Espectrofotmetro de arreglo de

diodos El espectrofotmetro de arreglo de diodos (diode array) fue

introducido a mediados de los aos 1970. Es una variacinde los espectrofotmetros de la regin ultravioleta.

Utiliza una ptica invertida respecto del convencional: todala luz de la fuente atraviesa la muestra, y luego esdispersada en un monocromador que, en lugar de una ranurade salida, tiene en el plano focal un dispositivo que integraen unpequeo circuito varios cientos de detectores tipo

fotodiodo de silicio.

Este espectrofotmetro se compone de una serie de diodosfotosensibles lugar lado a lado y aislados unos de otros enforma de capas mltiples sndwich.


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ESTRUCTURA ESQUEMATICA DE UNESPECTROFOTOMETRO DE ARREGLO DE DIODOS


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Cada elemento del dispositivo recibe luz de un rangoparticular de longitudes de onda, y un ordenador procesalos datos recibidos. Las principales ventajas delespectrofotmetro de dispositivo de fotodiodos son que paraobtener un espectro no hace falta mover ningn elemento, ylos espectros se obtienen en forma casi instantnea.

0.1nm de resolucin2 nm de resolucin

diodos


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ESQUEMA DE UNESPECTROFOTOMETRO

DE DOBLE HAZ

ESQUEMA DE UNESPECTROFOTOMETRODE SIMPLE


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