Clase 6: Levaduras y Clase 6: Levaduras y AntifúngicosAntifúngicos

Bioq. María de los Angeles SosaBioq. María de los Angeles Sosa

Microbiología GeneralMicrobiología General

20092009

Crecimiento inicial a 25-28ºCCrecimiento inicial a 25-28ºC

Crecimiento inicial a 25-28ºC

Hialino

Hialino, hifas delgadas

TabicadoCrecimiento

en cicloheximida

DematiaceosColonias parecidas

a bacterias

Crec. de 2-5 diasColonias lisas, pastosas o

MucoidesLEVADURAS

CandidaCandida

Blastoconidio

Pseudomicelio

Macromorfología de Macromorfología de CandidaCandida

““Las candidiasis son micosis Las candidiasis son micosis producidas por hongos del producidas por hongos del

género género Candida Candida ””

La infección puede ser La infección puede ser

aguda o crónica, superficialaguda o crónica, superficial

o profunda, localizada o o profunda, localizada o

diseminadadiseminada

La candidiasis es un indicador de algún desequilibrio, por ello, ante su manifestación se debe buscar siempre el origen o factor predisponente que la desencadena.

alteraciones en las defensas celularesalteraciones en las defensas celulares

fisiología fisiología

biota normal biota normal

desequilibrio

Estos organismos no son patógenos por naturaleza

Factores predisponentesFactores predisponentesFisiológicasFisiológicas: embarazo, vejez, RN, etc.: embarazo, vejez, RN, etc.

EndócrinasEndócrinas: : diabetes, hipotiroidismo, enfermedad de Addison.diabetes, hipotiroidismo, enfermedad de Addison.

Enfermedades hematológicasEnfermedades hematológicas: linfomas, leucemias, agranulocitosis, : linfomas, leucemias, agranulocitosis, anemia aplásica, inmunodepresión celular, hipogammaglobulinemia y anemia aplásica, inmunodepresión celular, hipogammaglobulinemia y agammaglobulinemia.agammaglobulinemia.

IatrogénicasIatrogénicas: corticoides, antibióticos de amplio espectro, alimentación : corticoides, antibióticos de amplio espectro, alimentación parenteral, diálisis reiteradas, cirugías a cielo abierto, transplantes parenteral, diálisis reiteradas, cirugías a cielo abierto, transplantes renales o cardíacos y operaciones abdominales, sondas y catéteres, renales o cardíacos y operaciones abdominales, sondas y catéteres, etc.etc.

OtrosOtros: : drogadicción (IV), quemaduras graves y extensas, infecciones drogadicción (IV), quemaduras graves y extensas, infecciones por HIV y otras enfermedades infecciosas (TBC, fiebre reumática, por HIV y otras enfermedades infecciosas (TBC, fiebre reumática, endocarditis, meningitis, etc.), insuficiencia renal aguda o crónica, endocarditis, meningitis, etc.), insuficiencia renal aguda o crónica, neoplasias, etc.neoplasias, etc.

CandidiasisCandidiasis

Candidiasis cutáneas Candidiasis cutáneas

Candidiasis muco-cutáneasCandidiasis muco-cutáneas

Candidiasis generalizadaCandidiasis generalizada

Rippon, J.W., 1989

Dermatitis del pañal

Candidiasis cutánea

Candidiasis de pequeños y grandes pliegues Submamario

Axilar

Paroniquia por Candida

Mayor incidencia en RN, lactantes y pacientes con

inmunodeficiencias.

Muguet bucal

• pH bajo de la boca• contagio en canal del parto• chupetes, tetinas, mamaderas mal lavadas• materiales y manos del personal de unidades maternales

Se presenta como pseudomembranas blancas griseas cremosas, sobre lengua, paladar blando, mucosa bucal, faringe y esófago.

Candidiasis mucocutánea

Candidiasis sistémicasCandidiasis sistémicas

Hospederos normalesHospederos normalesSondas y catéteres Sondas y catéteres

Colonizan Fungemias transitorias Colonizan Fungemias transitorias

Hemo ++Hemo ++

Hospederos inmunosuprimidosHospederos inmunosuprimidos Invasión micelial de los órganos y tejidosInvasión micelial de los órganos y tejidos

Formación de trombos Formación de trombos

Mortalidad + de 55%Mortalidad + de 55%

CriptococosisCriptococosis

DefiniciónDefinición

““La criptococosis es una micosis cosmopolita La criptococosis es una micosis cosmopolita causadas por levaduras encapsuladas de la causadas por levaduras encapsuladas de la especie especie Cryptococcus neoformans var. Cryptococcus neoformans var. neoformansneoformans””

““La La mayoría de las infecciones graves se observan mayoría de las infecciones graves se observan cuando hay alteraciones importantes de la cuando hay alteraciones importantes de la inmunidad celular (SIDA, linfomas...)inmunidad celular (SIDA, linfomas...)””

““Suelen Suelen tener un curso subagudo o crónico con tener un curso subagudo o crónico con afectación pulmonar y meníngeaafectación pulmonar y meníngea””

Kobayashi GS, 1997

Cuadro clínicoCuadro clínico

Afección pulmonarAfección pulmonar

MeningoencefalitisMeningoencefalitis

Lesiones de PielLesiones de Piel

LLevaduras encapsuladasevaduras encapsuladas (tinción con tinta o con (tinción con tinta o con nigrosina) en el nigrosina) en el sedimentosedimento del LCR u otros líquidos del LCR u otros líquidos corporalescorporales

En enfermos con SIDA, las cápsulas En enfermos con SIDA, las cápsulas pueden ser muy pueden ser muy pequeñaspequeñas e incluso estar ausentes e incluso estar ausentes

Identificación de Identificación de levaduraslevaduras

Observación macro y micro-morfológica de la coloniaObservación macro y micro-morfológica de la coloniaSiembra en medios cromogénicosSiembra en medios cromogénicosMétodos convencionalesMétodos convencionales– Presencia de cápsulaPresencia de cápsula– Examen micro-morfológicoExamen micro-morfológico

Producción de clamidoconidiosProducción de clamidoconidiosProducción de pseudomicelioProducción de pseudomicelio

– Formación de tubos germinativos/prueba de filamentizaciónFormación de tubos germinativos/prueba de filamentización– Otras pruebas bioquímicas:Otras pruebas bioquímicas:

Producción de ureasaProducción de ureasa

– ZimogramaZimograma– AuxonogramaAuxonograma

Sistemas comercialesSistemas comerciales

Cultivos en agar cromogénicoCultivos en agar cromogénico

CHROM agar CHROM agar

CandidaCandida

CandidaCandida ID ID

Tiempo: 48 – 72 hs

Incubación: 35-37ºC

Observación directaObservación directa

**** Tinta China**** Tinta China (Pelikan negra)(Pelikan negra)

LCR LCR (sedimento)(sedimento)

80% de (80% de (+) +)

Examen micológico directoExamen micológico directo

Presencia de levaduras Presencia de levaduras con prolongación de las con prolongación de las paredes paralelas, paredes paralelas, sin sin constricción en la base constricción en la base de unión a célula madrede unión a célula madre

Producción de tubos germinativosProducción de tubos germinativos

POSITIVAPOSITIVA

37º C no más de 3 horas

25ºC por 25ºC por 2 a 7 días2 a 7 días

en agar harina de maíz - Tween 80

agar arroz

Métodos Métodos bioquímicosbioquímicos

UreasaUreasa

Cryptococcus neoformans: UREASA (+)

Métodos bioquímicosMétodos bioquímicos

• ZimogramaCapacidad de fermentación de fuentes de carbono

•Auxonograma Capacidad de asimilación de fuentes de carbono y nitrógeno

Observación de la producción de gas

Asimilación de compuestos carbonados Asimilación de compuestos carbonados

y nitrogenados: y nitrogenados: AuxonogramaAuxonograma

Resultado Resultado positivopositivo: :

halo de crecimientohalo de crecimiento

alrededor del azúcar.alrededor del azúcar.

AP

IF

ungi

chro

m I

ID 32 C

APICandida

30ºC por 30ºC por 24 a 48 hrs24 a 48 hrs

35ºC por 35ºC por 24 a 48 hrs24 a 48 hrs

30ºC por 30ºC por 24 a 48 24 a 48 hrshrs

AntifúngicosAntifúngicos

IntroducciónIntroducción

Blancos de acción o “target”Blancos de acción o “target” para desarrollo de para desarrollo de antifúngicos:antifúngicos:

Ergosterol de la membrana celular, Ergosterol de la membrana celular,

la producción de quitina y alfa- y beta-glucanos la producción de quitina y alfa- y beta-glucanos de la pared celularde la pared celular

La vía del acido aminoadípico en la síntesis de La vía del acido aminoadípico en la síntesis de lisinalisina

Las diferencias en la síntesis de ácido nucleico.Las diferencias en la síntesis de ácido nucleico.

Los mecanismos de la división nuclear. Los mecanismos de la división nuclear.

ClasificaciónClasificación

Según su sitio blanco:

a) interferentes del ergosterol

b) inhibidores de síntesis de pared

c) inhibidores del metabolismo de ácidos nucleicos

d) inhibidores del ensamblaje de microtúbulos

ClasificaciónClasificación

Según su estructura química: a) azoles b) polienos c) alilaminas

d)papulacandinas e) terpenoides f) lipopéptidos g) pirimidinas h) poliquétidos

AzolesAzoles

Los antifúngicos azólicos son preparados Los antifúngicos azólicos son preparados sintéticos que se caracterízan por la sintéticos que se caracterízan por la presencia de uno o más anillos de cinco presencia de uno o más anillos de cinco elementos con dos moléculas de elementos con dos moléculas de nitrógeno (imidazoles) ó tres moléculas de nitrógeno (imidazoles) ó tres moléculas de nitrógeno (triazoles).nitrógeno (triazoles).

AzólicosAzólicos

Imidazoles Triazoles

ClasificaciónClasificación

De primera generación: imidazoles tópicos. De primera generación: imidazoles tópicos. De segunda generación: imidazoles sistémicos.De segunda generación: imidazoles sistémicos.De tercera generación: triazoles.De tercera generación: triazoles.Micosis superficiales: Clotrimazol, Miconazol, Tioconazol Micosis superficiales: Clotrimazol, Miconazol, Tioconazol y Ketoconazoly KetoconazolMicosis sistémicas se utilizan Fluconazol e Itraconazol.Micosis sistémicas se utilizan Fluconazol e Itraconazol.En los últimos años se han incorporado al uso clínico En los últimos años se han incorporado al uso clínico tres nuevos compuestos: voriconazol, posaconazol y tres nuevos compuestos: voriconazol, posaconazol y ravuconazol. Todos ellos poseen amplio espectro.ravuconazol. Todos ellos poseen amplio espectro.

Mecanismo de acciónMecanismo de acción

Inhiben la 14-alfa-demetilación del lanosterol en la Inhiben la 14-alfa-demetilación del lanosterol en la biosíntesis del ergosterol. biosíntesis del ergosterol. Esta enzima también juega un rol importante en la Esta enzima también juega un rol importante en la síntesis de síntesis de colesterolcolesterol en mamíferos pero, usando en mamíferos pero, usando concentraciones terapéuticas, los azoles tendrían concentraciones terapéuticas, los azoles tendrían mayor afinidad por la enzima fúngica.mayor afinidad por la enzima fúngica.

La depleción de La depleción de ergosterolergosterol altera la fluidez de la altera la fluidez de la membrana reduciendo la actividad de enzimas membrana reduciendo la actividad de enzimas asociadas a ésta, aumentando así la asociadas a ésta, aumentando así la permeabilidad e inhibiendo el crecimiento y permeabilidad e inhibiendo el crecimiento y replicación celular.replicación celular.

Mecanismos de ResistenciaMecanismos de Resistencia

Disminución de la permeabilidad de la membrana Disminución de la permeabilidad de la membrana fúngica producida por fúngica producida por cambios en el ergosterolcambios en el ergosterol. . La penetración de los azoles dependerá de que La penetración de los azoles dependerá de que sean lipofílicos (itraconazol, ketoconazol) o sean lipofílicos (itraconazol, ketoconazol) o hidrofílicos (fluconazol).hidrofílicos (fluconazol).Mutación de la enzima lanosterol - 14 Mutación de la enzima lanosterol - 14 - - demetilasademetilasa, condicionando una menor afinidad , condicionando una menor afinidad por los azoles.por los azoles.Sobreproducción de las enzimas del citocromo p-Sobreproducción de las enzimas del citocromo p-450450, lo que lleva al aumento de la síntesis de , lo que lleva al aumento de la síntesis de esteroles y contrarresta la acción de los azoles.esteroles y contrarresta la acción de los azoles.Presencia de bomba de eflujoPresencia de bomba de eflujo con capacidad de con capacidad de extraer azoles.extraer azoles.

PolienosPolienos

Son productos naturales con dobles enlaces Son productos naturales con dobles enlaces conjugados. Los principales agentes conjugados. Los principales agentes pertenecientes a este grupo son la pertenecientes a este grupo son la

Anfotericina BAnfotericina B (administración endovenosa) (administración endovenosa) la la NistatinaNistatina (aplicación tópica). (aplicación tópica).

Poseen amplio espectro y se los utiliza para el Poseen amplio espectro y se los utiliza para el tratamiento de micosis sistémicas severas, tratamiento de micosis sistémicas severas, incluso como tratamiento empírico en casos en incluso como tratamiento empírico en casos en los que se desconoce el agente causal de la los que se desconoce el agente causal de la infección fúngica.infección fúngica.

Mecanismo de acciónMecanismo de acción

Interacción con los esteroles (ergosterol) Interacción con los esteroles (ergosterol) de la membrana plasmática provocando la de la membrana plasmática provocando la despolarización de la membrana y la despolarización de la membrana y la formación de poros que aumentan la formación de poros que aumentan la permeabilidad a proteínas, azúcares y permeabilidad a proteínas, azúcares y cationes, conduciendo eventualmente a la cationes, conduciendo eventualmente a la muerte celular.muerte celular.

Mecanismo de ResistenciaMecanismo de Resistencia

La resistencia a estos compuestos se La resistencia a estos compuestos se podría deber a cambios podría deber a cambios cualitativoscualitativos o o cuantitativos cuantitativos del ergosterol presente en del ergosterol presente en las membranas. Los cambios cuantitativos las membranas. Los cambios cuantitativos se deberían a la inhibición de la vía de se deberían a la inhibición de la vía de síntesis del ergosterol.síntesis del ergosterol.

AlilaminasAlilaminas

Es un grupo de antifúngicos sintéticos que está Es un grupo de antifúngicos sintéticos que está representado por Naftifina y representado por Naftifina y TerbinafinaTerbinafina. .

Son de menor espectro que los azoles.Son de menor espectro que los azoles.

Activos frente a dermatofitos, Activos frente a dermatofitos, CandidaCandida..

La Terbinafina puede emplearse tanto en La Terbinafina puede emplearse tanto en infecciones superficiales como en sistémicas. infecciones superficiales como en sistémicas.

Naftifine

Mecanismo de AcciónMecanismo de Acción

Inhibición de la enzima escualeno-Inhibición de la enzima escualeno-epoxidasa. Esto resulta en la acumulación epoxidasa. Esto resulta en la acumulación de escualeno y conduce a la muerte de la de escualeno y conduce a la muerte de la célula fúngica por aumento de la célula fúngica por aumento de la permeabilidad de la membrana plasmática permeabilidad de la membrana plasmática que lleva a la disrupción celular.que lleva a la disrupción celular.

Test de sensibilidad Test de sensibilidad antifúngica antifúngica

AntifungigramasAntifungigramas

¿Porqué estudiar la susceptibilidad ¿Porqué estudiar la susceptibilidad

de los hongos?de los hongos?

¿Porqué estudiar la susceptibilidad ¿Porqué estudiar la susceptibilidad

de los hongos?de los hongos? Por la existencia de Por la existencia de levaduras y hongos miceliales con levaduras y hongos miceliales con

resistencia “natural”resistencia “natural” a los nuevos azoles. a los nuevos azoles.

Por el Por el cambio de patrón de susceptibilidadcambio de patrón de susceptibilidad en cepas de en cepas de levaduras como consecuencia del tratamiento antifúngico.levaduras como consecuencia del tratamiento antifúngico.

Por la Por la aparición de nuevas especiesaparición de nuevas especies de hongos patógenos de hongos patógenos oportunistas de susceptibilidad desconocida.oportunistas de susceptibilidad desconocida.

Por el Por el desarrollo de nuevos antifúngicosdesarrollo de nuevos antifúngicos..

Por la Por la necesidad de tener una orientación terapétuica y necesidad de tener una orientación terapétuica y profiláctica. profiláctica. Poder predecir la rta al ATFPoder predecir la rta al ATF

NCCLS M27-A2 (2002)NCCLS M27-A2 (2002) MacrométodoMacrométodo

MacrodiluciónMacrodilución en caldoen caldo

+10 tubos con concentraciones del

antifúngico + inóculo

24 - 72h a 35oC lectura visual y

puntuación de inhibición de

crecimiento de 0 à 4

* CIM de azoles

Concentración que inhibe 80% o

substancialmente (=2),

* CIM de AMB:

La cc que inhibe totalmente (=0)

CIM = cálculo de porcentajes de inhibición respecto a un control

de crecimiento .

CIMCIM

INÓCULOS

CONCENTRACIONES DECRECIENTES DE ANTIFÚNGICOS

Control de esterilidad del medio

Control de crecimiento

Inóculo cepa ATCC

MicrométodoMicrométodo

TabletasTabletas

AB FZ

5FC IZ

KZ

Neo-Sensitab. ROSCONeo-Sensitab. ROSCO

Método difusión en agar

TabletasTabletas

• Metodología: Difusión• Medio: SHADOMY• Inóculo: 105 UFC/ml (0.5 Mc Farland. Dil 1/10)

• Método de Siembra: Inundación.• Incubación: 35ºC durante 24 y 48 h• Determinación del halo: Visual

Susceptibilidad “in vitro”: Susceptibilidad “in vitro”: Neosensitabs (Rosco)Neosensitabs (Rosco)

C. albicansC. albicans SENSIBLESENSIBLE CIM FCZ <0.13 ug/mlCIM FCZ <0.13 ug/ml

25 ug

50 ug

Halo= 43 mm

Halo= 51 mm

C. kruseiC. krusei RESISTENTERESISTENTECIM FCZ 32 ug/mlCIM FCZ 32 ug/ml

50 ug

25 ugHalo= 14 mm

Halo= 17 mm

Fin!!Fin!!