citometria

C i t o m e t r í a d e F l u j oC i t o m e t r í a d e F l u j o

LA CITOMETRÍA DE FLUJO ES UNA TÉCNICA DE

ANÁLISIS CELULAR MULTIPARAMÉTRICO, QUE PERMITE ANALIZAR DE MANERA

OBJETIVA CARACTERIASTICAS FISICAS Y BIOLOGICAS DE LAS CELULAS EN SUSPENSIÓN A UNA VELOCIDAD

APROXIMADA DE 500 A 4000 CELULAS POR SEGUNDO.

DEFINICIONDEFINICION

PARÁMETROS DETECTADOSPARÁMETROS DETECTADOSPARÁMETROS DETECTADOSPARÁMETROS DETECTADOS

FORWARD SCATTER ( FSC )FORWARD SCATTER ( FSC )

Luz refractada en ángulo cónico pequeño (0-10º) que casi coincide con la

dirección de la luz incidente. Es proporcional alEs proporcional al tamañotamaño de la partícula de la partícula que produce la refracción.que produce la refracción.

FSCFSC

FUENTE DE LUZ FUENTE DE LUZ INCIDENTE INCIDENTE

Luz refractada en ángulo recto. Es proporcional a la Es proporcional a la complejidadcomplejidad de la de la estructura interna de la partícula. estructura interna de la partícula.

SIDE SCATTER (SSC)SIDE SCATTER (SSC)

SSCSSC

FLUORESCENCIA

Relacionada a características antigénicas de la célula ( FL-1, FL-2, FL3,......)

FL1FL1

FL2

FL3

PE PI

PerCPPE-Cy5

FITCEGFPEYFPAlexa 488

PARÁMETROS DETECTADOSPARÁMETROS DETECTADOSPARÁMETROS DETECTADOSPARÁMETROS DETECTADOS

Antigeno-1

Antigeno-2

Antigeno-3

ESPECTRO ESPECTRO ELECTROMAGNETICOELECTROMAGNETICO

El espectro visible a la vista humana se encuentra entre los 400nm a 700 nm

CONCEPTOS BÁSICOSCONCEPTOS BÁSICOSCONCEPTOS BÁSICOSCONCEPTOS BÁSICOS


FLUOROCROMO

La diferencia entre la longitud de onda de absorción y emisión se denomina Stokes shiff.

Son moléculas químicas que absorben luz a una determinada longitud de onda y emiten a otra diferente. En CMF los Ac-Mo. están conjugados con fluorocromos siendo la intensidad de fluorescencia detectada por el citómetro directamente proporcional al número de moléculas unidas al Ag


ANTICUERPOS MONOCLONALESANTICUERPOS MONOCLONALES

SON ANTICUERPOS ESPECIFICOS PARA UN SOLO ANTIGENO. EN CMF ESTOS Ac. MONOCLONALES ESTAN UNIDOS A FLUOROCROMOS.

FLUOROCROMO

RECONOCIMIENTO ESPECIFICO

Complejos Ag-Ac

FUNCIONAMIENTO DEL CITOMETRO DE FLUJOFUNCIONAMIENTO DEL CITOMETRO DE FLUJO

G:\EXPO UAP 06-11-7\flow cytometry.exe

SISTEMA DE SISTEMA DE FLUIDOSFLUIDOS

SISTEMA SISTEMA OPTICOOPTICO

SISTEMA SISTEMA ELECTRONICOELECTRONICO

COMPONENTES DE UN CITOMETRO DE FLUJOCOMPONENTES DE UN CITOMETRO DE FLUJO

- Amplificador-convertidor- Sistema informatico

- Inyección de la muestra - Cámara de flujo

- Fuentes de luz- Detectores

SISTEMA DE FLUIDOSSISTEMA DE FLUIDOS

CREA UN FLUJO LAMINAR EN EL SENO DEL FLUIDO DE ARRASTRE. LAS PARTICULAS SON ARRASTRADAS DE FORMA DEFINIDA.

BOMBA DE

AIRE

CONTENEDOR DE

BUFFER

CONTENEDOR DE

DESHECHOS

FILTROCAMARA

DEFLUJO

TUBOCON

MUESTRA

CONTROLADOR DE FLUJO

DE MUESTRA

REGULADORDE PRESIÓN

ENFOQUE HIDRODINAMICO PRODUCE UN TORRENTE UNICO DE PARTICULAS

SISTEMA DE FLUIDOSSISTEMA DE FLUIDOS

TIPOS DE FILTROS TIPOS DE FILTROS OPTICOSOPTICOS

La óptica de lectura,óptica de lectura, compuesta por las lentes de recolección de luz emitida luego de la interacción entre el haz del láser y las partículas y el sistema de filtros para direccionar longitudes de onda específicas hacia los detectores correspondientes.

SISTEMASISTEMA OPTICOOPTICO

Absorción

Interferencia

SISTEMASISTEMA OPTICOOPTICO

DetectoresDetectores Fotomultiplicadores (PMT): Se usan para la detección de la señal de fluorescencia (FL1, FL2, FL3………FL4) y luz dispersada a 90 grados (SSC).

Fotodetectores diodos: Se usan para detectar la dispersión frontal de la luz (FSC).

SISTEMA OPTICOSISTEMA OPTICO

PMT 1

PMT 1

PMT 4 PMT 3

DichroicFilters

BandpassFilters

Laser

Flow cell

PMT 2Sample

SSC

FSC

SISTEMA ELECTRONICOSISTEMA ELECTRONICO

Convierte todas las señales de luz detectadas en señales electrónicas que son almacenadas en el ordenador (computador)

Creación de las señales de voltaje

CITOMETRO DE FLUJOCITOMETRO DE FLUJO

FACSCAN FACSCALIBUR

FACSARIAFACSCANTO

““Sorting” celularSorting” celular

“Sorting” electrostático

Permite separar físicamente, poblaciones de células o partículas previamente reconocidas por su tamaño o granulosidad y la fluorescencia de sus marcadores.

Los tipos de separación que se realizan mediante citometría de flujo son:

-

sorting de poblaciones celulares en base a sus tamaños (FS) y granulosidades (SS).

-

sorting de linfocitos en base a marcadores de expresión.

-

sorting de núcleos de células tumorales en base a su contenido de DNA.

-

sorting de células vivas en base a parámetros metabólicos.

-

sorting de células vivas/muertas en función de su afinidad a colorantes vitales/letales.

““Sorting” celularSorting” celular

PRESENTACION DE LOS DATOSPRESENTACION DE LOS DATOS

histogramashistogramas

2D-plot2D-plot

Contour diagramContour diagram

0 200 400 600 800 1000Forward Scatter

0 200 400 600 800 1000Forward Scatter


Density plotDensity plot 3D-PLOT3D-PLOT


ANÀLISIS DE LOS DATOSANÀLISIS DE LOS DATOS

0 200 400 600 800 1000Forward Scatter

R7COMPLEJIDAD COMPLEJIDAD

CELULARCELULAR

TAMAÑO CELULARTAMAÑO CELULAR

Granulocitos

Monocitos

Linfocitos

Eje “Y” SSCSSC

Eje “X” FSCFSC

INTERPRETACION INTERPRETACION DEL FSC y el SSCDEL FSC y el SSC


10 0 10 1 10 2 10 3 10 4

Mouse IgG1 FITC

FL1 FL1 ( (FITCFITC, PE, PerCP……..etc), PE, PerCP……..etc)

FL2 FL2 (FITC, (FITC, PE,, PerCP……..etc)PerCP……..etc)

+ + Positivo simple para FL1

++ Positivo simple para FL2

++ ++ Doble positivo para FL1 y FL2

+ +

+

+

INTERPRETACION INTERPRETACION DE LA DE LA

FLUORESCENCIAFLUORESCENCIA

10 0 10 1 10 2 10 3 10 4

CD45 APC

Complejidad celular

FL4FL4

GRANULOCITOS

MONOCITOS

LINFOCITOS


GATE GATE CD45/SIDECD45/SIDE

CD45: ANTIGENO COMUN LEUCOCITARIO

10 0 10 1 10 2 10 3 10 4

CD7 FITC

10 0 10 1 10 2 10 3 10 4

CD7 FITC

10 0 10 1 10 2 10 3 10 4

CD5 PE

10 0 10 1 10 2 10 3 10 4

CD5 PE

One-Color Cell AnalysisOne-Color Cell Analysis

Control Negativo

Fluorescencia

Dot-plot Histograma

R1

R1

10 0 10 1 10 2 10 3 10 4Mouse IgG1 FITC

10 0 10 1 10 2 10 3 10 4Mouse IgG1 FITC

PEPE

FITCFITC


10 0 10 1 10 2 10 3 10 4

CD3 PerCP10 0 10 1 10 2 10 3 10 4

CD3 PerCP10 0 10 1 10 2 10 3 10 4

Mouse IgG1 FITC


Control Negativo Dot-plot Histograma

PerCPPerCP

10 0 10 1 10 2 10 3 10 4

CD45 APC10 0 10 1 10 2 10 3 10 4

CD45 APC

APCAPC

Fluorescencia

10 0 10 1 10 2 10 3 10 4Mouse IgG1 FITC

R1

R1

10 0 10 1 10 2 10 3 10 4CD38 PE100 101 102 103 104

CD4 PE

Two-Color Cell AnalysisTwo-Color Cell Analysis


Control Negativo

FL2FL2

FL1FL1

FL2FL2

FL3FL3

Control Negativo

Cèlulas CD8+

Cèlulas CD4+

Cèlulas CD38+

Cèlulas CD38+

HLA-DR+

100 101 102 103 104Mouse IgG2a PE

10 0 10 1 10 2 10 3 10 4Mouse IgG1 FITC

10 0 10 1 10 2 10 3 10 4

CD3-FITC

10 0 10 1 10 2 10 3 10 4CD45-PerCP

Three-Color Cell AnalysisThree-Color Cell Analysis


Células CD45+

Células CD3+

Células CD3+

Células CD3+ CD4+Células

CD4+

APLICACIONES DE LA APLICACIONES DE LA CITOMETRIA DE FLUJOCITOMETRIA DE FLUJO

INMUNOFENOTIPIFICACION DE SUBPOBLACIONES LINFOCITARIAS T CD4, CD8,

EN PACIENTES HIV POSITIVOS.

INMUNOFENOTIPIFICACION DE LEUCEMIAS AGUDAS , CRONICAS Y LINFOMAS

ENUMERACION, IDENTIFICACION DE CELULAS “stem cell” CD34

ANALISIS MULTIPARAMETRICO DEL CONTENIDO DEL DNA Y FASES DEL CICLO

CELULAR.

DETECCION Y CUANTIFICACION DE PROTEINAS INTRACELULARES

(CITOQUINAS)

ESTUDIOS DE LA FUNCIÓN INMUNE

APOPTOSIS

ESTUDIOS CINÉTICOS (FUNCIÓN CELULAR)

ANÁLISIS PLAQUETARIO (ENFERMEDAD CORONARIA)

DETECCIÓN DE MICROORGANISMOS (BACTERIAS, PARÁSITOS)

ANÁLISIS DE MUESTRAS AMBIENTALES (GIARDIA, CRYPTOSPIRIDIUM)

INMUNOFENOTIPIFICACIONINMUNOFENOTIPIFICACION

Es la identificación y cuantificación de distintas poblaciones celulares en base a la expresión diferencial de marcadores de membrana.

ANÁLISISANÁLISISENEN

CITÓMETROCITÓMETRO


RECUENTO DE SUBPOBLACIONES DE LINFOCITOS T

IDENTIFICACIÓN DE SUBPOBLACIONES CELULARES EN

LA HEMATOPOYESIS

• NIVELES DE LINFOCITOS T EN PACIENTES CON VIH• IMPLICACIÓN EN LA RESPUESTA INMUNE CELULAR• GRADO DE INMUNOSUPRESIÓN

• DIAGNÓSTICO Y CLASIFICACIÓN DE ENFERMEDADES HEMATOPOYÉTICAS• LEUCEMIAS AGUDAS Y CRÓNICAS• LINFOMAS• INMUNODEFICIENCIAS• DETECCIÓN DE ENFERMEDAD MÍNIMA RESIDUAL• ENUMERACIÓN DE PRECURSORES HEMATOPOYÉTICOS “Stem cell”• DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES CONGÉNITAS PLAQUETARIAS


MUESTRAS BIOLÓGICASMUESTRAS BIOLÓGICAS

SANGRE PERIFÉRICA

MÉDULA ÓSEA

LIQUIDO CEFALORAQUÍDEO (LCR)

LAVADO BRONCO ALVEOLAR

LIQUIDO ASCÍTICO

TEJIDO LINFOIDE

GANGLIO

AMIGDALA

TIMO

RECUENTO DE RECUENTO DE SUBPOBLACIONES DE SUBPOBLACIONES DE

LINFOCITOS T : LINFOCITOS T : en pacientes HIV+


• El recuento de células CD4 se usa junto con la carga viral (CV) para evaluar el estado de salud del paciente seropositivo.

• Para determinar cuándo iniciar tratamiento antirretroviral de Alta Actividad (HAART).

Las “current guidelines for antiretroviral therapy” de la Organización Mundial de la Salud (OMS) recomienda iniciar HARRT:

Estadio I y recuentos de linfocitos T CD4 inferiores a 200 células/mL

Estadio III y recuentos de linfocitos T CD4 inferiores a 350 células/mL

Estadio IV independientemente del recuento de linfocitos T CD4.

• Para el seguimiento durante la terapia HAART.

• Evaluación de la respuesta inmune celular.

10 0 10 1 10 2 10 3 10 4

CD3-FITC

10 0 10 1 10 2 10 3 10 4

CD45-PerCP

R1

ABSOLUTE COUNTSUSING TRITEST ™/ TRUCOUNT ™

# of events in quadrant containing cell population total # of beads per test

# of events in Absolute Count bead region test volume

# of events in quadrant containing cell population total # of beads per test

# of events in Absolute Count bead region test volumex # CD4 cells/µL=

LYSE - NO WASH


R1

R2

R3

R4GATEEVENTS% GATED

G1 (CD45+)G2 (Control beads)G3 (CD3+)G4 (CD4+)G5 (CD8+)

1265959

1335297

1106

100,006,3921,655,9814,57

297959

254050

X = 15,00 cel/ml

R2

10 0 10 1 10 2 10 3 10 4CD3-FITC

R4

RECUENTO DE RECUENTO DE SUBPOBLACIONES DE SUBPOBLACIONES DE

LINFOCITOS T : LINFOCITOS T : en pacientes pos-trasplante


10 0 10 1 10 2 10 3 10 4CD45-PerCP

R1

10 0 10 1 10 2 10 3 10 4

CD3-FITC

10 0 10 1 10 2 10 3 10 4CD3-FITC

R4

INMUNOSUPRESION

SEGUIMIENTO DURANTE TERAPIA INMUNOSUPRESORA DESPUES DEL TRASPLANTE DE ORGANOS SOLIDOS: HIGADO, RIÑON, PULMON.

DETECCION TEMPRANA DE RECHAZO AGUDO

CONCLUSIONESCONCLUSIONES

1. Nuestros resultados sugieren el utilizar la CV como un marcador predictivo a la hora de iniciar la terapia antirretroviral sin importar el tipo de tratamiento, lo cual concuerda con investigaciones realizadas por otros autores Mellors y col. 1996, Romera y col. 1998.

2. En relación a la progresión a SIDA la CV se sitúa como el marcador de elección con mayor valor predictivo de progresión a diferencia del recuento de linfocitos T CD4+, en los resultados de nuestro estudio se pudo demostrar mediante un análisis de rangos establecidos en el Laboratorio que pacientes que iniciaron su terapia antiretroviral con valores de carga viral entre los rangos de log CV 5-5.99 el 25% progresaron a SIDA mientras que los pacientes con recuento de CD4 menor a 100 celulas, no muestran diferencias estadísticamente significativa con respecto al grupo de pacientes con recuento de CD4 entre 300 -400 celulas.

3. Es de importancia señalar que descenso del número de linfocitos T CD4+ es una consecuencia del

aumento de la carga viral y que tienen una importancia decisiva para la supervivencia y el desarrollo a SIDA.

IDENTIFICACIÓN DE IDENTIFICACIÓN DE SUBPOBLACIONES CELULARES SUBPOBLACIONES CELULARES

EN LA HEMATOPOYESISEN LA HEMATOPOYESISINMUNOFENOTIPIFICACIONINMUNOFENOTIPIFICACION

10 0 10 1 10 2 10 3 10 4

CD20 PE

R2

CD 19 - FITC

CD

45

-A

PC

Linfocitos BCD19+ CD45+

INMUNOFENOTIPIFICACIONINMUNOFENOTIPIFICACIONDIAGNÓSTICO Y CLASIFICACIÓN DE ENFERMEDADES HEMATOPOYÉTICAS LEUCEMIAS, LINFOMAS, ETC.

LLA-B Pre-B

10 0 10 1 10 2 10 3 10 4

CD45 APC

R1

10 0 10 1 10 2 10 3 10 4

CD10FITC

10 0 10 1 10 2 10 3 10 4CD34 PerCP

10 0 10 1 10 2 10 3 10 4

CD19 PE

INMUNOFENOTIPIFICACIONINMUNOFENOTIPIFICACIONDIAGNÓSTICO Y CLASIFICACIÓNCLASIFICACIÓN DE ENFERMEDADES HEMATOPOYÉTICAS LEUCEMIAS, LINFOMAS, ETC.

LLA-T Madura

10 0 10 1 10 2 10 3 10 4CD45 APC

10 0 10 1 10 2 10 3 10 4

CD4 PE

10 0 10 1 10 2 10 3 10 4

CD7 FITC10 0 10 1 10 2 10 3 10 4

CD10 FITC

INMUNOFENOTIPIFICACIONINMUNOFENOTIPIFICACIONENUMERACIÓN DE PRECURSORES HEMATOPOYÉTICOS “Stem cell”0

Stem cells = 21.89 cel/uL

%CD34+ de CD45+ = 0.12% Viabilidad= 100.00%

100 101 102 103 104

CD45 FITC

PACHECO URIBE S.P 30-10-7.001

CD45

100 101 102 103 104

CD34 PE


CD34

0 200 400 600 800 1000Forward Scatter


R7

100 101 102 103 104

CD45 FITC


R6

1. EL ESTUDIO DE MARCADORES INMUNOLÓGICOS POR CITOMETRÍA DE FLUJO PERMITE HACER UN DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL DE LA LEUCEMIA “ HAIRY CEL” DE OTROS PROCESOS LINFOPROLIFERATIVOS Y OTRAS POBLACIONES CELULARES NORMALES CON MORFOLOGÍA SIMILAR (RINSHO K ET AL, Blood (1997) 89: 2008-14.

2. LA ACENTUADA EXPRESIÓN DE CD103+, CD11C+ Y CD25+ PARA NUESTROS CASOS REPORTADOS SUGIERE UN APORTE DIAGNÓSTICO PRECISO Y ESPECÍFICO DE UNA HAIRY CELL CLÁSICA CON EXPRESIÓN DEL PAN DE MARCADORES DE LINAJE LINFOIDE B CD22+, CD20+ Y CD19+

3. EL USO DE CD45/CD103/CD11C/CD25 SON DE GRAN UTILIDAD PARA DIFERENCIAR LAS CÉLULAS ATÍPICAS EN LA LEUCEMIA “ HAIRY CELL” DEL RESTO DE POBLACIONES CELULARES, POR SU POSICIÓN Y POSITIVIDAD A LOS MARCADORES INMUNOFLUORESCENTES EVIDENCIADOS EN LAS “GATES” CD45/CD103/CD11C/CD25 RESPECTIVAMENTE.

CONCLUSIONESCONCLUSIONES

citometria

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