Citogenetica convencional
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Estudio de cromosomas, estructura y herencia.
Los transtornos cromosómicos constituyen una entidad dentro de las enfermedades genéticas.
CITOGENÉTICA CONVENCIONAL
Estudio Citogenético/ Cromosómico
Células estén división celular (Mitosis)
Análisis cromosómico (morfología y patrón de bandas) en Metafase.
Algunas células normalmente en proceso de proliferación y diferenciación por lo que no necesitan de un estimulante mitogénico para que entren división.
Otras células ya diferenciadas requieren de un estimulante mitógeno para que entren en mitosis.
Cultivos Indirectos y Cultivos Directos
Cultivos a corto plazo y cultivos a largo plazo
Cultivo Celular DirectoLa célula no requiere de un estimulante mitogénico para entrar
en división celular. Cultivo de Células Fetales
Cultivo a largo plazo (10-14 d)
Muestra: Liquido Amniótico obtenido por Amniocentesis alrededor de la 16ª semana de gestación.
Dx prenatal de una alteración cromosómica. Cultivo de Vellosidades Coriales
Cultivo corto plazo (24 –48 horas) y Cultivo largo plazo (10-14 d)
Muestra: Biopsia aspiración de Vellosidades Coriónicas alrededor de la 10ª sem. de gestación.
Dx prenatal de una alteración cromosómica. Cultivo de Restos Endouterinos
Cultivo largo plazo (10-14 días)
Muestra: Legrado uterino y/o producto abortado
Detectar una anomalía cromosómica del producto.
Procedimiento (“Cultivo Directo” de Líquidos Orgánicos )
Centrifugar a 1000 RPM por 10min.
Eliminar sobrenadante y colectar los sedimentos
Adicionar 6 ml. De Solución Hipotónica ( ClK 0.075 M ) agitar con Pipeta Pasteur
Incubar a 37°C por 30 min.
Centrifugar a 1000 RPM por 10 min. Eliminar el sobrenandante.
Procedimiento (“Cultivo Directo” de Líquidos Orgánicos )
Añadir 5 ml de Fijador. Agitar con Pipeta Pasteur y dejar a TA por 30 min.
Centrifugar a 1000 RPM por 10 min, eliminar sobrenandante y añadir 5 ml de Fijador. Repetir este paso 2 o 3 veces.
Colocar 3 a 4 gotas sobre una lámina portaobjeto y fijarlo al calor.
Coloración convencional (Giemsa).
Bandeo Cromosómico (Banda GTG).
Observación Microscópica.
Cultivo Celular Indirecto
La célula requiere de un estimulante mitogénico para que entre en división celular.
Cultivo de Linfocitos
Cultivo a corto plazo (72 horas)
Muestra: Sangre Periférica
Se realiza para detectar cualquier alteración cromosómica constitucional (que el defecto cromosómico este presente en todas las células de nuestro organismo).
Se utiliza para detectar las autosomopatías (Síndromes Down, Patau, Edwards, etc.) y las Gonosomopatías (Síndromes de Turner,
Triple X, Klinefelter, etc.)
Cultivo Celular: MEDIOS DE CULTIVO CELULAR
Contienen todos los aminoácidos, vitaminas, cofactores, coenzimas, enzimas, sales, iones, indicadores de pH. Todo lo necesario para que la célula pueda dividirse in vitro.
Existen distintos medios de cultivo los cuales se seleccionan dependiendo del tipo de muestra o tipo de célula a cultivar y lograr que estos respondan adecuadamente con un crecimiento celular.
Cultivo Celular
Medios de Cultivo más Utilizados
1. Medio McCoy’s 5A Modified
Cultivo Sangre Periférica (Linfocitos)
2. Medio RPMI 1640:
Cultivo Sangre Periférica (Linfocitos)
3. Medio Tc199:
Cultivo Sangre Periférica (Linfocitos)
4. Medio Ham F10 ó Ham F12
Cultivo de células fetales
Cultivo Celular
SUPLEMENTOS
Las células requieren para su crecimiento y división celular de suplementos, los cuales serán utilizados dependiendo del tipo de células que se desea cultivar y del tipo de estudio citogenético requerido.
1.- SUERO BOVINO FETAL (SBF) : Se utiliza a diferentes concentraciones:
20% para el cultivo de SP
30% para el cultivo de células fetales
Cultivo Celular
2.- PENICILINA + ESTREPTOMICINA: Utilizado como antibióticos para evitar la contaminación bacteriana.
3.- ANTIMICOTICOS: Fungizona para evitar el crecimiento de hongos, si es que fuera necesario.
4.- L- GLUTAMINA: Aa que en su forma levógira mejora el crecimiento celular.
5.- ESTIMULANTE MITOGENICO: Utilizado para estimular el proceso de mitosis en el cultivo de linfocitos.
Fitohemaglutinina (PHA)
CULTIVO DE SANGRE PERIFERICA (LINFOCITOS)
Toma de Muestra
. Condiciones de asepsia
. Anticoagulante heparina
. Volumen de muestra
CULTIVO DE SANGRE PERIFERICA (LINFOCITOS)
Eliminar el
P.G (dejar un
pequeño remanente)
dejando la interfase
(Globulos blancos)
y el plasma.
CULTIVO DE SANGRE PERIFERICA (LINFOCITOS)
. El índice máximo de
mitosis se obtiene a las
70-72horas. Por lo tanto
habrán más células en
metafase
CULTIVO DE SANGRE PERIFERICA (LINFOCITOS)
. Diariamente se
debe mezclar el
frasco de cultivo.
. Controlar cambios
de color que indica
cambios del ph o
turbidez que indica
contaminación.
CULTIVO DE SANGRE PERIFERICA (LINFOCITOS)
. COSECHA
1. Colchicinización
. Agregar Colchicina
100 uL. Mezclar suavemente
CULTIVO DE SANGRE PERIFERICA (LINFOCITOS)
Eliminar el sobrenadante. Trabajar siempre con el sedimento
CULTIVO DE SANGRE PERIFERICA (LINFOCITOS)
2. Hipotonización
. Adicionar solución
hipotónica: Cloruro
de Potasio 0.075 M
7mL y homogenizar.
CULTIVO DE SANGRE PERIFERICA (LINFOCITOS)
3. FIJACIÓN:
. Adicionar Fijador
(Metanol +Acido Acético Glacial ) V/V
. Sacar el tubo de la estufa y adicionar 5 mL de fijador Carnoy para detener la acción de la solución hipotónica.Observar color marrón oscuro.. Homogenizar. Centrifugar 2500 RPM por 12 minutos.
CULTIVO DE SANGRE PERIFERICA (LINFOCITOS)
. Eliminar el sobrenadante y
repetir el paso anterior 3 veces hasta que ya no haya turbidez.
El último sedimento resuspender con 1mL de fijador.
CULTIVO DE SANGRE PERIFERICA (LINFOCITOS)
4. Preparado Cromosómico
. Adicionar 3 a 4 gotas sobre
una lámina portaobjetos
helada.
. Secar al calor de un
mechero.
. Guardar en una gradilla
CULTIVO DE SANGRE PERIFERICA (LINFOCITOS)
Coloración Convencional: Bandeo GTG
- Tripsina 1% (buffer)
- Solución Salina Fisiológica
- Giemsa 4%