CIENCIAS BIOLÓGICAS Y DE LA SALUD148.206.53.84/tesiuami/UAMI10331.pdf · Informe final de Servicio...
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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA METROPOLITANA UNIDAD IZTAPALAPA CIENCIAS BIOLÓGICAS Y DE LA SALUD LICENCIATURA EN HIDROBIOLOGÍA INFORME FINAL DE SERVICIO SOCIAL Dra. Irene de los Ángeles Barriga Sosa Caracterización genética de un grupo de delfines Tursiops truncatus en cautiverio a través de análisis PCR-RFLP de la región control (D-Loop) del genoma mitocondrial. Castro Prieto Aines del Carmen 02/04/03 PEXPA
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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA METROPOLITANAUNIDAD IZTAPALAPA
CIENCIAS BIOLÓGICAS Y DE LA SALUD
LICENCIATURA EN HIDROBIOLOGÍA
INFORME FINAL DE SERVICIO SOCIALDra. Irene de los Ángeles Barriga Sosa
Caracterización genética de un grupo de delfines Tursiopstruncatus en cautiverio a través de análisis PCR-RFLP de la
región control (D-Loop) del genoma mitocondrial.
Castro Prieto Aines del Carmen
02/04/03
PEXPA
LA MOLÉCULA DEL DNA CONTIENE ELCÓDIGO GENÉTICO UNIVERSAL, EL CUAL
PROMUEVE LA FUERZA DE LA VIDACOMPARTIDA POR TODOS LOS SERES
VIVOS EN NUESTRO PLANETA TIERRA. ELENTENDER ESTO, REPRESENTA UN GRAN
PASO HACIA EL DESARROLLO DE UNACOEXISTENCIA MÁS PACÍFICA ENTRE LOSSERES HUMANOS Y EL MEDIO EN EL QUEVIVIMOS. DESPUÉS DE TODO, A PESAR DELA AUTENTICIDAD QUE POSEEMOS COMO
INDIVIDUOS, ¡NOS ENCONTRAMOSCONECTADOS A TODO COMO UNO SÓLO ATRAVÉS DE UNA HEBRA COMÚN DE DNA!
CONTENIDO
Justificación ..1
Introducción ..3
Antecedentes .................................................................6
Objetivo ................................................................10
Objetivos particulares 10
Hipótesis ..10
Marco teórico ...............................................................11
§ Características generales de la especie Tursiops truncatus ..11
§ Ácidos nucléicos 13
§ El mtDNA animal como marcador genético en poblaciones 14
§ DNA recombinante 16
§ Restricción enzimática .............18
§ Aplicación de la genética en el manejo y conservación de los
cetáceos ..20
Metodología 22
I) Extracción de DNA .22
II) Amplificación de DNA (PCR) .....................24
III) Purificación de los fragmentos amplificados 26
IV) Polimorfismo de la longitud de los fragmentos de la restricción.............27
Resultados y discusión... ..29
Conclusiones ..38
Criterios de evaluación .39
Literatura citada 40
ANEXO 45
INDICE
Págs.
Informe final de Servicio Social
1
JUSTIFICACIÓN
El delfín nariz de botella o tursión, Tursiops truncatus, es una especie
cosmopolita de los océanos trópico-templados que se caracteriza por poseer una
gran inteligencia y alta adaptabilidad al cautiverio. Por esta razón es comúnmente
encontrado en los oceanarios a nivel mundial. Se explotan con fines de
entretenimiento y recientemente con fines terapéuticos como la delfinoterapia.
Algunas dependencias gubernamentales como SEMARNAT y ONG s se
han preocupado por las condiciones en las que muchos de estos organismos se
encuentran. Se han decretado Normas Oficiales Mexicanas ecológicas como la
NOM-EM-136-ECOL-2002, que exige un buen manejo y conservación de los
mamíferos marinos en cautiverio para mantenerlos en la mejor calidad de vida
posible. La Ley General de Vida Silvestre, fue reformada por decreto publicado en
el Diario Oficial de la Federación el 10 de enero de 2002. Por virtud de dicha
reforma se prohíbe el aprovechamiento extractivo de mamíferos marinos, con
excepción de la captura que tenga por objeto la investigación científica y la
educación superior de instituciones acreditadas, por lo que es necesario expedir
una nueva Norma Oficial Mexicana de Emergencia que se ajuste a las
disposiciones de la reforma que establezca las especificaciones para la
conservación de estas especies de ejemplares de vida silvestre que se encuentren
en cautiverio.
Una forma de contribuir en el manejo y conservación de esta especie en
cautiverio es precisamente, aprovechar su confinamiento para llevar a cabo
investigación científica que nos permita conocer y aprender más de la biología,
ecología y etología de estos odontocetos. De esta forma podemos contribuir a
mantener la biodiversidad de las especies con quienes compartimos la biosfera así
como a la difusión de la ciencia y cultura en general, que es tan importante para el
desarrollo y crecimiento de la humanidad.
Para cualquier especie que requiera manejo, tal es el caso de los cetáceos
en cautiverio, la información de la estructura genética poblacional es fundamental
Informe final de Servicio Social
2
ya que nos permite caracterizar a los individuos y conocer la variabilidad
intraespecífica existente entre éstas.
La caracterización fenotípica de un individuo es la forma más sencilla de
poder identificarlo, aunque está sujeta a errores, sin embargo la información de su
acervo génico revela fehacientemente su identidad.
Los delfines en cautiverio deben estar adecuadamente identificados ya que
son sometidos a diferentes actividades que requieren de un buen manejo de los
individuos.
No hay duda de que la genética de poblaciones debe jugar un papel
importante en el manejo y conservación, especialmente en la propagación de
poblaciones en cautiverio y en la introducción artificial de poblaciones en un área
natural o de restauración (Lande, 1991).
Una herramienta útil para el estudio de la variabilidad poblacional es el
análisis del polimorfismo de la longitud de los fragmentos de la restricción (RFLP)
de secciones específicas amplificadas de ADN mitocondrial (ADNmt), por medio
de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Este análisis ha probado ser de
gran utilidad para detectar variación intraespecífica en una gran variedad de
especies (Grijalva-Chon et al. 2002; Wang et al. 1996; Baker et al. 1998).
Informe final de Servicio Social
3
INTRODUCCIÓN
Para mucha gente la palabra delfín los evoca inmediatamente a pensar
en el delfín nariz de botella, Tursiops truncatus. Esto no es sorprendente ya que
esta especie es la más común en los oceanarios además de su particular
asociación con los humanos en aguas costeras que los caracteriza.
Es una especie cosmopolita que se distribuye en aguas cálido-templadas,
tanto en la zona costera como en la zona pelágica. Su accesibilidad en aguas
cercanas a la costa ha permitido que sea el cetáceo más estudiado.
Las técnicas genéticas tienen el potencial para proveer información
detallada sobre la identificación, sexo, parentesco, filopatría, dispersión, sistemas
de apareamiento y éxito reproductivo; mucho de lo anterior es difícil o imposible
de obtener por otros medios (Mann et al. 2000).
Los análisis genéticos nos informan sobre individuos muestreados en
diversas formas. La más fundamental de éstas, aunque técnicamente no la más
fácil, es la identificación individual (Amos y Hoelzel, 1990). Generalmente se
empelan minisatélites de DNA (fingerprinting) o análisis de microsatélites
multilocus. La identificación genética puede ser usada exactamente como la foto-
identificación lo es, para el análisis de asociaciones, movimientos locales y
migratorios así como el tamaño de la población.
Para cualquier especie que requiera manejo, tal es el caso de los cetáceos
en cautiverio, la información de la estructura genética poblacional es fundamental
ya que nos permite caracterizar a dichas poblaciones y conocer la variabilidad
intraespecífica existente entre éstas.
Las muestras de tejido pueden ser colectadas en una gran variedad de
formas. El DNA es una molécula muy resilente y experimentos recientes han
probado que el DNA puede ser obtenido hasta de las barbas de las ballenas
(Kimura et al. 1997) y de manchas de sangre de delfín (Eggert et al. 1998).
En el presente estudio se pretende obtener tejido sanguíneo de T. truncatus
para extraer mtDNA preferentemente de las células blancas.
Informe final de Servicio Social
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El genoma mitocondrial existe como múltiples copias en células
eucariotas. A esta pequeña molécula circular se le ha estimado un rango de
mutación de 5-10 veces mayor que el de una simple copia de DNA nuclear (Brown
et al. 1979) y por consiguiente, tiene el potencial de ser un marcador de DNA
altamente variable dentro de las poblaciones. Muchos autores sugieren que la
disparidad usual en la tasa de sustitución entre DNA nuclear y mtDNA de
vertebrados puede explicarse debido a que el genoma mitocondrial tiene un
mecanismo de reparación ineficiente comparado con el del genoma nuclear.
En general la herencia del mtDNA se piensa que es estrictamente materna,
sin recombinación alguna (Harrison, 1989; Hoelzel et al. 1991; Brown et al. 1979 ).
Muchos estudios de mtDNA se enfocan en la parte más variable de genoma
mitocondrial, la región control conocida también como desplazamiento Loop o D-
Loop (Baker et al. 1994). La región control es amplificada a través de la PCR y las
secuencias nucleotídicas examinadas para observar cambios en las bases, lo
cual indica diferentes haplotipos mitocondriales y por consecuente orígenes
matrilineales diferentes (Baker et al. op cit.).
El análisis genético de las relaciones entre individuos es dependiente de la
existencia de variabilidad en los marcadores de DNA.
A través de la electroforesis de proteínas se ha encontrado que los
cetáceos como grupo en general presentan una variabilidad considerablemente
pequeña y que el rango de evolución de la región control del mtDNA en cetáceos
tiene un rango de magnitud mucho menor que la sugerida para los estudios en
humanos (Hoelzel y Dover, 1991).
Los niveles bajos en la variabilidad del DNA se ven reflejados en similitudes
entre individuos que no necesariamente están filogenéticamente emparentados.
Muchos de estos estudios en cetáceos se ven limitados por el tamaño de la
muestra, que generalmente no es la suficiente (Mann et al. 2000).
Idealmente la secuenciación del genoma mitocondrial nos permitiría
observar los cambios en las bases nucleotídicas que dan origen a la
individualidad, pero como el presente proyecto es un estudio piloto nos
enfocaremos únicamente en el fragmento correspondiente a la región control (D-
Informe final de Servicio Social
5
Loop) del genoma mitocondrial, como se mencionó anteriormente, esperando
encontrar variabilidad que nos permita caracterizar genéticamente a cada uno de
los individuos muestreados.
La secuenciación del gen B-globina de la hemoglobina humana realizada
por A. Jeffrey en 1979, reveló una inesperada y alta variación en la secuencia
entre individuos de aproximadamente una base sustituida cada cientos de pares
de bases. Estas fueron, efectivamente un nuevo tipo de marcador genético
sabiendo que las enzimas de restricción que cortan el DNA en sitios de
restricción cortan el DNA de diferentes personas en fragmentos de diferentes
longitudes. Estos nuevos sitos de corte resultaron ser polimórficos y revelados
como RFLP s (Thain y Hickman, 1996).
Una herramienta útil para el estudio de la variabilidad poblacional es el
análisis del polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restricción (RFLP) de
secciones específicas amplificadas de ADN mitocondrial (ADNmt), por medio de la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Este análisis ha probado ser de gran
utilidad para detectar variación intraespecífica en una gran variedad de especies
de cetáceos (Grijalva-Chon et al, 2002; Wang et al. 1996; Baker et al. 1998).
Para especies protegidas, como lo son algunos cetáceos, por regulaciones
internacionales o amenazadas de sobreexplotación, la genética molecular es una
herramienta muy poderosa en cuanto a la conservación de dichas especies (Baker
et al. 1998); Así como en el desarrollo de acciones que impliquen un manejo
efectivo, es necesario entender la estructura de la población y la diversidad
genética dentro de poblaciones de estas especies (Wang et al. 1996).
Informe final de Servicio Social
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ANTECEDENTES
Las mitocondrias de los organismos vivos actuales provienen de
mitocondrias preexistentes. Por lo general se trata de organelos citoplasmáticos
pequeños con capas internas en forma de estantes o crestas que se originan
como invaginaciones de la membrana mitocondrial interna. Estas estructuras son
de aproximadamente el mismo tamaño que las bacterias y se presentan en las
células de los eucariontes pero no en bacterias ni en virus. Las mitocondrias
proporcionan a los animales y plantas superiores energía celular para sostener la
vida por medio de procesos oxidativos de los ciclos del ácido cítrico y los ácidos
grasos, así como los procesos acoplados de la fosforilación oxidativa y el
transporte de electrones. Contienen una cantidad pequeña de DNA único que ha
permanecido autónomo fuera del genoma nuclear durante la larga evolución de los
organismos. El genoma mitocondrial constituye sólo una pequeña porción del DNA
nuclear (menos del 1%) y existe como moléculas circulares relativamente
pequeñas, que pueden ser aisladas y caracterizadas fácilmente sin embargo,
codifica sólo un número limitado de estructuras y funciones. Contienen un aparato
de síntesis de proteínas distintivo con ribosomas, tRNA y aminoacil-tRNA
sientetasas específicos; los ribosomas de dicho aparato son similares a los que se
encuentran en las bacterias y sin embargo son muy diferentes a los que se
encuentran en el citoplasma de las células eucarióticas. Las moléculas de rRNA
mitocondrial son del mismo tamaño que las de las bacterias y como regla más
pequeñas que las propias células eucarióticas (Gardner et al. 2000).
Los cambios en la secuencia de DNA mitocondrial son de cuatro principales
tipos: rearreglos secuenciales, adiciones, deleciones o supresiones, y sustitución
de nucleótidos. En un gran número de especies las tasas de sustitución en el
mtDNA han sido estimadas y son 5-10 veces mayores que en una simple copia
de DNA nuclear (Brown et al. 1979), aunque estas partes varían dentro del
genoma mitocondrial (Hoelzel et al. 1991).
Varios estudios han demostrado que la parte que evoluciona más rápido del
genoma del mtDNA es la región de control no codificadora que contiene la D-Loop
(Hoelzel et al. 1991; Wang et al. 1996; Baker et al. 1996). El tamaño de esta
Informe final de Servicio Social
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región varia entre las especies animales de ~200 a 4,100 pb. Hoelzel et al. en
1991, realizó un estudio de la región D-Loop del mtDNA en algunos cetáceos y las
secuencias D-Loop sugieren que las tasas de sustitución en los primates,
roedores y cetáceos son similares. Por otro lado, las deleciones/inserciones son
menos comunes en D-Loop de cetáceos y están agrupadas en sus terminaciones
5 y 3 . El número de eventos de deleción o inserción, independientes de cada
evento, también fue menor para cetáceos que para primates.
El estudio del genoma mitocondrial también ha permitido determinar la
división misticeto/odontoceto que se estima de 30-40Ma. La división dentro de
Delphinidae (a la cual pertenece T. truncatus) parece ser de 5-10Ma (Gingerich et
al. 1983).
Los rangos de divergencia varían a lo largo de las regiones D-loop de
cetáceos. Las tasas determinadas de comparaciones entre secuencias
interespecíficas de D-loop para primates (0.5%-1%/Ma), roedores (0.5%-1%/Ma) y
cetáceos (0.5%/Ma) sugieren una pequeña diferencia en comparación con el
notificado para el genoma mitocondrial de mamíferos.
La variación en la D-loop está influenciada por varios factores incluyendo el
desplazamiento de DNA, la posible mutación compensatoria relacionada a la
conservación de estructuras secundarias de RNA y a la selección especialmente
dentro de la región central. (Hoelzel et al. 1991).
Recientemente el mtDNA ha sido empleado para estudiar poblaciones de
mamíferos marinos. Wang et al. (1999) estudió dos morfotipos distintos de delfín
naríz de botella que habían sido referenciados como T. truncatus y T. aduncus,
poblaciones que se consideran simpátricas en aguas Chinas; comparaciones de
fragmentos amplificados (PCR) de la región control del mtDNA indicaron que
dichas especies son genéticamente distintas. Estos resultados tienen una
implicación muy importante en la conservación de dichas especies en aquélla
región.
Dowling y Brown (1993) llevaron a cabo un análisis de restricción
enzimática del mtDNA para determinar la distribución de la variación genética
dentro y entre poblaciones del delfín nariz de botella, T. Truncatus, y encontraron
Informe final de Servicio Social
8
que el nivel de divergencia entre los haplotipos de mtDNA en la costa del Atlántico
y los del Golfo de México sugieren un aislamiento considerable entre dichas
regiones.
García-Martínez et al. (1995) determinó la distribución de la variabilidad a
lo largo de la molécula de mtDNA en delfines (Stenella coeruleoalba) en aguas
mediterráneas españolas, a través del análisis de sitios de restricción.
Wang et al. (1996) realizó un estudio de PCR-RFLP en Phocoena phocoena
para examinar la posibilidad de una base genética para las subpoblaciones
provisionales dentro del Noreste del Atlántico del Norte. La diversidad genética
fue estimada para ayudarnos a entender los efectos que la explotación puede
tener en la variación genética de dichas poblaciones. También se revisaron
aspectos de su historia zoogeográfica y sistemática de dicha especie. Estudios
similares se han llevado a cabo por la Comisión Internacional Ballenera para la
identificación de especies a través de la carne de cetáceos como la ballena minke
(Balaenoptera acutorostrata), jorobada (Megaptera novaeangliae), Bryde
(Balaenoptera edeni), (Balaenoptera physalus) y azul (Balaenoptera musculus);
que se comercializa en el mercado Japonés (Plaumbi et al. 1988).
Southern et al. (1988) clonó el genoma mitocondrial del delfín
Cephalorhynchus commersonii y comprobó que existe una resemblanza cercana
en la organización general del genoma mitocondrial del delfín y genomas
mitocondriales de mamíferos terrestres como los bovinos, roedores e incluso los
seres humanos. Para obtener dicho resultado, comparó secuencias de 2381pb de
la región mayor no codificadora del genoma mitocondrial: tres genes tRNA, partes
del citocromo b, y el gen 16S rRNA. La evolución del último gen en los mamíferos
comparados, involucra mutaciones puntuales con una fuerte tendencia hacia
cambios específicos C-T, C-A y A-T resultando en una alta posición conservadora
de G, y las variaciones en longitud similares en tamaño a los rearreglos ocurridos
durante la divergencia de los genes mitocondriales tRNA . La interpretación de los
patrones visualizados de la conservación estructural debe de aguardar elucidación
de la estructura mitocondrial del gen 16S rRNA. La información generada del
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análisis comparativo concluye que la similaridad entre el delfín y la vaca es mucho
mayor que para cualquier otro par de mamíferos que se hayan comparado.
La filogenia de los grupos de cetáceos basados en secuencias de DNA a
partir del análisis de segmentos de tres genes mitocondriales: dos genes
ribosomales (12S, 395pb y 16S, 533pb) y porciones de secuencias del gen
citocromo b, sugiere que el suborden Odontoceti constituye un agrupamiento no
natural que reta al escenario convencional de una historia evolutiva larga e
independiente de los odontocetos y misticetos, Fig. 1 (Milinkovitch et al. 1994).
Fig. 1 Filogenia de los cetáceos
Kocher et al. (1989) diseñó oligonulceótidos universales, comparando
secuencias de mtDNA de mamíferos, ranas y moscas enfocándose en regiones
altamente conservadas. Existen muchas regiones donde pueden establecerse los
oligonucleótidos, por lo cual es posible amplificar casi cualquier segmento del
genoma mitocondrial que se desee. En este caso, tomaron ventaja de la
estabilidad evolutiva de las regiones de rRNA.
Informe final de Servicio Social
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OBJETIVO
El objetivo del presente estudio es caracterizar genéticamente un fragmento
de la región control (D-Loop) del genoma mitocondrial de un grupo de delfines
Tursipos truncatus en cautiverio, aplicando la técnica PCR-RFLP en muestras de
tejido sanguíneo, como un estudio piloto sobre la caracterización genética de
dichos individuos.
OBJETIVOS PARTICULARES
§ Diseñar (si es necesario) oligonucleótidos específicos para la región control
del genoma mitocondrial de T. truncatus.
§ Seleccionar enzimas de restricción informativas para la discriminación de
poblaciones.
§ Caracterizar los haplotipos de individuos de T. truncatus generados a partir
de la patrones de restricción de la región control.
§ Estimar la variabilidad genética intra e inter específica (dependiendo de los
resultados) de la población analizada.
HIPÓTESIS
Si dos individuos de la especie T. truncatus varían en una secuencia
particular de DNA, en este caso, un fragmento de la región control (D-Loop) del
genoma mitocondrial entonces, una endonucleasa de restricción específica
producirá fragmentos de longitudes diferentes cuando corte el mtDNA de las dos
fuentes. Es decir, una mutación que afecta el sitio de corte de la enzima de
restricción producirá variaciones en el patrón de mtDNA. Lo que nos permitirá
caracterizar individualmente a los individuos muestreados.
Informe final de Servicio Social
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M A R C O T E Ó R I C O
Características generales de la especie Tursiops truncatus
El delfín nariz de botella, T. Truncatus (Montagu 1821), pertenece al orden
de los cetáceos, Fig. 2. Los cetáceos son un grupo de mamíferos marinos que
incluyen a las ballenas, marsopas y delfines. Se dividen en dos subórdenes:
Odontoceti, al que pertenecen las ballenas dentadas; y Mysticeti, al que
pertenecen las ballenas barbadas. T. Truncatus en un odontoceto que presenta
una longitud total entre 2.3 y 3.1m, generalmente los machos son más largos que
las hembras. El tamaño varía con base en las zonas geográficas. Presenta un
peso entre 150 y 275kg. El número de dientes en las mandíbulas puede variar
entre 18 y 26 pares. El patrón de coloración también es variable, usualmente gris
oscuro en la parte dorsal, gris más tenue en los costados tendiendo hacia una
coloración blanca o rosada en la parte ventral; las poblaciones del Pacífico Norte
templado frecuentemente más café que gris en la parte dorsal, y tienen un
alrededor del ano un área rosa distintiva; poblaciones del Indo-Pacífico y el Mar
Rojo, a veces son más oscuras que la población Atlántica. Presenta cuerpo en
forma de torpedo, cabeza robusta con un pico corto distintivo, generalmente con
manchas blancas en la mandíbula inferior. Las aletas pectorales y la dorsal
terminan en forma de punta, regularmente largas. Su distribución es cosmopolita
en aguas costeras excepto en aguas polares, incluyendo el mar Mediterráneo, el
mar Rojo y el Golfo Pérsico. En el Pacífico, su rango de distribución abarca desde
Noreste de Japón y Sureste de California hasta el Sureste de Australia, Nueva
Zelanda y Chile; en el Atlántico desde Nueva Escocia y el Noreste de Noruega
hasta la Patagonia y el Sureste de África y Sur de Australia. Existen dos
morfotipos (separados morfológica y ecológicamente), una forma costera y una
oceánica, aparentemente se encuentran al menos en regiones tropicales y cálido-
templadas.
Informe final de Servicio Social
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Se han reportado tres poblaciones separadas, una forma de mayor longitud
en el Atlántico (T. truncatus), y dos más pequeñas; una en las aguas templadas
del Pacífico Norte (T. gilli) y otra en el Indo-Pacífico y el Mar Rojo (T. aduncus)
(Gill, 2001).
Clasificación sistemáticaReino: Animalia
Phylum: Chordata
Clase: Mammalia
Órden: Cetacea
Subórden: Odontoceti
Familia: Delphinidae
Género: Tursiops
Especie: Tursiops Truncatus
Nombre común: Delfín nariz
de botella, Tursión o Delfín
mular.
Fig 2. Morfología y Anatomía de T. truncatus
Informe final de Servicio Social
13
Ácidos Nucleicos
La información genética de todos los organismos vivos, con excepción de
los virus de RNA, se almacena en el DNA (Ácido Desoxirribonucleico).
Los ácidos nucleicos son macromoléculas compuestas de subunidades
repetidas denominadas nucleótidos. Cada nucleótido está compuesto de un grupo
fosfato, un azúcar de 5 carbonos o pentosa y un compuesto cíclico nitrogenado
que se denomina base. Hay cuatro bases diferentes que se encuentran en el DNA:
adenina, guanina, timina y citosina. La adenina y la guanina son bases de doble
anillo que se denominan purinas; la citosina, la timina y el uracilo (en el RNA) son
bases de anillo sencillo, denominadas pirimidinas. El apareamiento de dichas
bases es específico A-T y G-C.
El DNA es una estructura de doble hélice en la cual las dos cadenas están
unidas mediante puentes de hidrógeno entre las dos bases de cada par de
nucleótidos y enlaces hidrófobos en el centro o núcleo de pares de bases
apiladas , Fig. 3.Fig. 3 Estructura del DNA
Los organismos vivos perpetúan su especie por medio de la reproducción.
Esta acarrea la transmisión fiel de la información genética de los progenitores a la
descendencia. Como la información genética se almacena en el DNA, la
duplicación semiconservadora del DNA es esencial para toda la biología.
Informe final de Servicio Social
14
El mtDNA animal como marcador genético en poblaciones
Actualmente se encuentran disponibles varias técnicas que difieren en la
naturaleza de la información que generan y en la proporción del genoma que
puede ser estudiado. La secuenciación completa de fragmentos de DNA
homólogos de diferentes organismos es el método más poderoso y directo para
obtener información sobre la cantidad de variación genética o el grado de
divergencia genética.
La información sobre la variación del mtDNA en poblaciones naturales es
resultado de comparaciones entre los patrones de fragmentos de restricción
enzimática y los sitios de mapeo. Las diferencias entre dichos patrones pueden
servir convenientemente como marcadores de linajes genéticamente distintos.
Medidas simples de distancia genética pueden derivarse de comparaciones entre
los mapas de sitios de restricción o patrones de fragmentos de restricción.
Alternativamente, cada sitio (fragmento) puede ser tratado como un carácter que
posee dos estados (presente o ausente) lo que permite generar un conjunto de
datos apropiados para llevar a cabo un análisis filogenético.
Los genomas mitocondriales extremadamente compactos y circulares de
los animales son secuencias homólogas de DNA. Ya que muestras puras de
mtDNA se han podido preparar de pequeñas cantidades de tejido con relativa
facilidad, se pueden comparar directamente secuencias de mtDNA de una
variedad amplia de organismos.
El mtDNA animal exhibe una conservación remarcable de contenido
génico. Cada molécula contiene una región de control que presenta secuencias
que funcionan en la iniciación de la replicación y trascripción del DNA. El orden de
los genes se conserva en los vertebrados, Fig 4. No presenta intrones y sólo en la
región control puede haber inserciones o duplicaciones. El tamaño varía dentro y
entre las especies en un rango de 14 kilobases (kb) a más de 30 kb.
La molécula de mtDNA es maternalmente heredada y esto tiene
consecuencias importantes (Harrison, 1989; Hoelzel et al. 1991; Brown et al.
1979). La herencia materna y la ausencia de recombinación hace al mtDNA un
Informe final de Servicio Social
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marcador particularmente apropiado para trazar historia evolutiva reciente,
incluyendo eventos de colonización, introducciones y cuellos de botella en
poblaciones.Fig. 4 Estructura del mtDNA (Drosophila yakuba)
El tamaño de la población efectiva es menor que aquella para los genes
nucleares. Consecuentemente, procesos estocásticos así como la selección
natural serán particularmente importantes en determinar las frecuencias de los
genotipos de mtDNA. Cuando las relaciones de unión restringen la independencia
de los marcadores de genes nucleares, el comportamiento del mtDNA es
diferente al de los genes nucleares y patrones de variación para marcadores
nucleares y mitocondriales pudieran no ser concordantes. La falta de concordancia
entre estos también puede ser resultado de la extinción al azar de linajes den
poblaciones (especies) derivadas de ancestros polimórficos.
Las secuencias en los genes grandes y pequeños de RNA ribosomal están
altamente conservadas, mientras que las sustituciones y reagrreglos son
acumulados rápidamente en la región control. Debido a esta variabilidad
intramolecular, las comparaciones entre secuencias de diferentes regiones de la
molécula pueden proveer información útil para taxa a muy diferentes niveles de
divergencia. Los estimados de la divergencia en las secuencias de mtDNA entre
Informe final de Servicio Social
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las poblaciones, especies y género provienen principalmente de comparaciones
entre los patrones de fragmentos de restricción o mapas de sitios de restricción.
Muy probablemente el uso más empleado del mtDNA como un marcador ha
sido el definir genéticamente afinidades entre especies relacionadas
cercanamente basadas en comparaciones entre los patrones de fragmentos de
restricción.
Como exhibe una variación considerable entre individuos dentro y entre
poblaciones, ha sido probado que es un marcador efectivo de la estructura de una
población y patrones de variación intraespecífica geográfica.
Asumiendo el hecho de una tasa constante de divergencia secuencial de
mtDNA, estimaciones de divergencia existente pueden ser empleadas para
calcular el tiempo desde que dos individuos (especies) compartieron por última
vez un ancestro hembra en común.
En varios grupos de animales, la hibridación interespecífica puede dar como
resultado descendencia partenogéncia o hibridogénica. El análisis del mtDNA
permite la identificación precisa del pariente materno.
Obviamente, las propiedades de mtDNA definidas para un grupo de
organismos no pueden ser asumidas en otros grupos (Harrison, 1989).
DNA RecombinanteAmplificación de DNA por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
Las tecnologías del DNA recombinantes y la clonación de genes son
métodos en los que segmentos de cromosomas grandes pueden aislarse,
duplicarse y estudiarse por técnicas de secuenciación de ácidos nucleicos,
microscopía electrónica y otras técnicas analíticas.
La reacción en cadena de la polimerasa, denominada PCR (Polymerase
Chain Reaction) es un procedimiento extremadamente eficaz que permite
amplificar una secuencia seleccionada de DNA de un genoma un millón de veces
o más. La PCR puede usarse para clonar una secuencia determinada de DNA in
vitro, sin tener que usar células vivas durante el proceso de clonación. Sin
Informe final de Servicio Social
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embargo, el procedimiento sólo puede aplicarse cuando se conoce la secuencia
de nucleótidos de al menos un segmento corto de DNA a cada lado de la región
de interés. La PCR implica utilizar oligonucleótidos sintéticos complementarios de
las secuencias conocidas que se extienden por la región de interés para cebar la
amplificación enzimática de este segmento de DNA en el tubo de ensayo.
El procedimiento consta de tres pasos: 1) El DNA genómico que contiene la
secuencia que va a ser amplificada se desnaturaliza por calor, 2) El DNA
desnaturalizado se híbrida con un exceso de los oligonucleótidos cebadores
sintéticos, 3) Se usa la DNA polimerasa para duplicar el segmento de DNA entre
los sitios complementarios de los olignonucleótidos cebadores. Este ciclo se repite
muchas veces hasta que se logra el nivel deseado de amplificación.
Se emplea la Taq polimerasa ya que permanece activa durante el paso de
la desnaturalización en cada ciclo de amplificación. De este modo, puede añadirse
un exceso de esta enzima y oligonucleótidos cebadores en el inicio de la PCR, y
los ciclos pueden llevarse a cabo mediante alteraciones cíclicas de temperatura.
Sintetiza de 5 3
Primer 5 TACAGCGCCACGTTA.............3
Templado 3 ATGTCGCGGTGCAATGATGCGTACCGTA.....5
La tecnología PCR permite obtener datos definitivos de la estructura de
genes y secuencias de DNA cuando sólo están disponibles cantidades muy
pequeñas de éste.
Ningún criterio puede proporcionar evidencia más significativa de la
identidad que las secuencias de DNA, después de todo, otros caracteres
fenotípicos son controlados por la expresión de estas secuencias (Gardner, et al.
2000).
Informe final de Servicio Social
18
Restricción Enzimática
Los experimentos originales de clonación por A. Chang y S. Cohen, se han
realizado empleando endonucleasas (enzimas que hacen cortes internos en los
ácidos nucléicos) denominadas endonucleasas de restricción. Muchas
endonucleasas hacen cortes al azar en el DNA. Sin embargo, la mayoría de las
endonucleasas de restricción son de sitio específico y rompen las moléculas del
DNA sólo en secuencias específicas de nucleótidos denominados sitios de
restricción. Como resultado, pueden usarse para generar mapas físicos de
cromosomas que son de gran ayuda para aislar segmentos pequeños de
cromosomas portadores de genes u otras secuencias de DNA de interés.
Una función que realizan las endonucleasas de restricción es proteger al
material genético de la bacteria de la posible invasión por DNA extraño.
Cada endonucleasa de restricción rompe una molécula de DNA extraño (un
DNA de otra especie) en un número fijo de fragmentos, el número depende del
número de sitios de restricción de la molécula particular de DNA.
Estas enzimas reconocen secuencias de DNA que son palíndromas, es
decir, secuencias de pares de nucleótidos que pueden leerse igual de izquierda a
derecha que en sentido inverso a partir de un eje central de simetría.
AND MADAM DNA
También hacen cortes escalonados , es decir, rompen las dos cadenas de
una doble hélice en puntos diferentes. Por la naturaleza palindrómica de los sitios
de restricción, los cortes escalonados producen segmentos de DNA con extremos
complementarios de cadena sencilla. Los fragmentos producidos pueden
reasociarse en condiciones de renaturalización apropiados.
Los tamaños de los fragmentos de restricción pueden ser determinados por
electroforesis en gel de poliacrilamida o de agarosa.
Informe final de Servicio Social
19
El DNA tiene una carga constante por unidad de masa. De este modo, las
velocidades de migración de fragmentos de DNA durante electroforesis
proporcionan estimaciones precisas de sus longitudes, con la velocidad de
migración siendo inversamente proporcional a la longitud. El gel de poliacrilamida
o de agarosa simplemente actúa como un tamiz molecular, con los fragmentos
más pequeños capaces de pasar a través del tamiz más rápidamente que las
moléculas grandes. La agarosa trabaja algo mejor que la poliacrilamida para los
fragmentos grandes ya que tiene un tamaño de poro ligeramente superior; los
geles de poliacrilamida proporcionan una mejor resolución para fragmentos cortos.
El tamaño de la molécula de DNA y los fragmentos de restricción se
estiman usando un conjunto de marcadores de DNA de tamaño conocido.
En su trabajo inicial sobre caracterización de endonucleasas de restricción,
H. Smith y D. Nathans usaron el cromosoma de DNA del virus simio 40 (VS40).
Ambos compartieron el Premio Nóbel de Fisiología y Medicina de 1978 con
W. Arber por el descubrimiento de las enzimas de restricción.
Existen tres métodos principales para el ordentamiento de fragmentos de
restricción, los cuales dependen del uso de la electroforesis en gel de agarosa o
de poliacrilamida para obtener estimaciones precisas del tamaño de los
fragmentos. Estos son: 1) digestión secuencial de cromosomas con dos o más
enzimas de restricción diferentes, 2) digestión parcial de cromosomas después de
marcar los extremos con un isótopo radiactivo y 3) determinar si las cadenas de
diferentes fragmentos de restricción se pueden hibridar uno con otro después de la
desnaturalización (Gardner, et al. 2000).
En la misma forma en que se pueden detectar diferencias en una proteína
específica debido a la variación genética, se pueden detectar diferencias en la
secuencia de DNA a través de la observación de fragmentos de diferentes
longitudes generados mediante el corte con una enzima de restricción dada.
Mientras que tradicionalmente se empleaba la variación en las proteínas
(proteínas polimórficas) como marcadores que indican la presencia de un alelo en
particular, ahora se emplean polimorfismos del DNA (fragmentos de restricción
polimórficos) como marcadores genéticos. Ya que los polimorfismos del DNA
Informe final de Servicio Social
20
pueden afectar cualquier secuencia de DNA, una alteración que produzca un
fragmento de restricción polimórfico puede ocurrir dentro de una secuencia
codificadora de un gen, secuencias no codificadoras (intrones), secuencias entre
genes, e incluso DNA sin una función específica conocida, como DNA repetitivo.
Por esta razón son marcadores extremadamente valorados (Rothwell, 1988).
Aplicación de la Genética en el Manejo y Conservación de Cetáceos
No hay duda alguna de que la genética de poblaciones debe jugar un papel
en el manejo y conservación, especialmente en la propagación de poblaciones en
cautiverio y en la introducción artificial de poblaciones a su hábitat natural.
Los factores demográficos son probablemente más importantes que los
factores genéticos para muchas especies. La variación genética dentro de las
poblaciones es necesaria ya que permite una adaptación continua a un medio
cambiante.
Aunque la Genética puede ser de importancia secundaria para decidir como
manejar una población en particular, es de extrema importancia para identificar
poblaciones que se encuentran muy separadas demográficamente. También es
útil ya que revela detalles de subdivisión y estructura social de la población, lo
cual tiene implicaciones importantes para el manejo. Nos permite distinguir
especies crípticas o subespecies que son prácticamente idénticas
morfológicamente y sin embargo, se encuentran aisladas reproductivamente.
Morfológicamente distintas especies pueden ser indistinguibles por
métodos moleculares probablemente debido a una especiación muy reciente, la
cual en poblaciones de gran tamaño no dan el tiempo suficiente para la
diferenciación de loci selectivamente casi neutral. Sin embargo, dos especies
pueden retener la capacidad de hibridarze e intercambiar genes pero aún así
permanecen fenotípicamente distintas debido a la selección natural y adaptación a
los diferentes ambientes en que habitan, aunado a una preferencia de
apareamiento dentro de las especies.
Informe final de Servicio Social
21
En general, los stocks definidos genéticamente deben basarse en
información de diferentes genes nucleares o una combinación de genes nucleares
y mitocondriales, en lugar de unos cuantos loci nucleares o únicamente mtDNA
(Lande, 1991).
Para especies protegidas por regulaciones internacionales o amenazadas
de sobreexplotación, la genética molecular es una herramienta muy poderosa para
la conservación de dichas especies (Baker, 1996). Así como en el desarrollo de
acciones que impliquen un manejo efectivo es necesario entender la estructura de
la población y la diversidad genética dentro de poblaciones de estas especies
(Wang et al. 1996).
Fig. 5 Dos delfines, T. Truncatus en cautiverio (madre e hijo)
Informe final de Servicio Social
22
METODOLOGÍA
Para poder obtener los resultados deseados, se llevaron a cabo 4 técnicas
experimentales consecutivas con cada una de las muestras proporcionadas. Estas
fueron las siguientes:
I) Extracción de DNA.
II) Amplificación de DNA mediante la reacción en cadena de la polimerasa
(PCR).
III) Purificación de los fragmentos amplificados.
IV) RFLP (Polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restricción).
Cada una de estas se llevaron a cabo siguiendo los siguientes protocolos, los
cuales se realizaron en el laboratorio de Genética y Biología Molecular de la
Planta Acuícola Experimental, PEXPA.
I) Extracción de DNASe obtuvieron muestras de tejido sanguíneo en vacutainers de 7ml con EDTA-
K3 y se almacenaron a 4°C hasta su procesamiento. Para separar el paquete de
leucocitos, el cual proporciona 5-10 veces mayor concentración de DNA que los
eritrocitos, las muestras de sangre fueron centrifugadas a 3,000rpm durante
15min. Se obtuvieron tres fases en el siguiente órden: suero sanguíneo, leucocitos
y eritrocitos. Con una pipeta pasteur se extrajo el paquete de blancos el cual se
almacenó a -70°C y se le adicionó glicerol al 10% para preservar adecuadamente
el DNA.
Protocolo para tejido sanguíneo de animales
Reactivos requeridos además de los proporcionados por el QIAampMR DNA Mini
Kit.PBS (Buffer fosfatado salino)
ü 50mM Fosfato de Potasio (K2PO4)
ü 150mM Cloruro de Sodio (NaCl)
pH 7.2
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23
v Aislamiento de DNA genómico de Sangre Total NO Nucleada
Al trabajar con tejido sanguíneo se recomienda extraer el DNA de una fracción
enriquecida de leucocitos, que conforman una pequeña parte de la sangre total, ya
que proveen de 5-10 veces más DNA que el volumen equivalente de sangre total.
Se realizó por duplicado cada una de las muestras. Se pipetó 20ml de
Proteinasa K en el fondo de un tubo de 1.5ml para microcentrifuga. Se agregaron
75ml de sangre anticoagulada, 220ml de PBS, 200ml de Buffer AL y se mezcló
vigorosamente en el vórtex. Se dejó incubar por 10min a 70°C. Posteriormente, se
agregó 200ml de etanol al 100% y se mezcló vigorosamente en el vórtex. Se
pipeteo la muestra completa (con todo y el precipitado blanco, en caso de que se
formara) en una columna (que sirve como tamiz) colocada sobre un tubo colector
de 2ml y se centrifugó a 8000rpm por 1min. Se desechó el fluido que queda en el
tubo colector, así como el tubo. Después se colocó la columna en un nuevo tubo
colector de 2ml y se agregó en la columna 500ml de Buffer AW1. Se centrifugó
durante 1min a 8000rpm. Se desechó el fluido y tubo colector. Nuevamente, se
colocó la columna en un tubo colector de 2ml y se agregaron 500ml de Buffer AW2.
Se centrifugó durante 3min a velocidad máxima (12000rpm). Se desechó el fluido
y tubo colector. Es importante secar la membrana ya que el etanol puede interferir
con reacciones subsecuentes. La columna no debe tener contacto con el fluido de
desecho; en caso de que suceda, se vacía el tubo colector y se reutiliza en otra
centrifugación por 1min a máxima velocidad. Se colocó la columna en un tubo
limpio de 1.5 o 2ml para microcentrifuga y se pipeteó 150ml de Buffer AE
directamente en la membrana. Se dejó incubar a temperatura ambiente por 1min.
Se centrifugó a 8000rpm por 1min. Se repitió el paso anterior empleando 100ml de
Buffer AE para incrementar la concentración de DNA. Las muestras de DNA
templado (mtDNA) se guardaron a una temperatura de 4°C.
Informe final de Servicio Social
24
v Determinación de la concentración de ácidos nucleicos
Para cuantificar el mtDNA se llevó a cabo una electroforesis en gel de agarosa
al 0.7% utilizando como amortiguador electroforético TAE (Tris-acetato 10mM y
EDTA mM 1x). Se empleó el marcador molecular 100pb lDNA (50UG) como
referencia para determinar la concentración aproximada de mtDNA. El gel fue
sometido a 60V durante 45min y posteriormente fue teñido con Bromuro de Etidio
(10mg/L). Las bandas de mtDNA se lograron observar al exponer el gel a la luz
ultravioleta (320nm), siendo la intensidad de la banda proporcional a la cantidad y
calidad del mtDNA total. Finalmente el gel fue fotografiado.
II) Amplificación del DNA mediante la reacción en cadena de la polimerasa(PCR)
v Diseño de oligonucleótidos
Un aspecto importante para llevar a cabo la PCR es el diseño de
oligonucleótidos iniciadores (primers). Para el diseño de estos se deben tomar en
cuenta las secuencias de genomas mitocondriales que presenten regiones
altamente conservadas (Kocher et al, 1989), publicadas y disponibles para varias
especies filogenéticamente emparentadas con T. truncatus en el Gene Bank, las
cuales sirven de base para tal diseño (Hoelzel et al. 1991); Se utilizaron los
oligonuclótidos descritos por Kocher et al. (1989) modificado por Storbeck [10mM]
5 TAATATACTGGTCTTGTAAACC-3 (22pb) y Rosel et al. (1994) [10mM] 5 -
TACCAAATGTATGAAACCTCAG-3 (22pb) para la región control. Es importante
considerar que los oligonucleótidos específicos complementarios al templado, con
algunas bases mal emparejadas al mismo pueden ser usados para la
amplificación; la polimerasa requiere un emparejamiento del oligonucleótido con el
templado únicamente en las últimas bases de la terminación 3 del oligonucleótido.
Informe final de Servicio Social
25
v Protocolo para la Amplificación del DNA empleando la Taq Polimerasa
Las condiciones de reacción óptimas así como el número de incubaciones,
temperatura y la cantidad de templado de DNA pueden variar y deben ser
individualmente determinadas a través de ensayo-error.
Se utilizó el TaqPCR Core Kit (QIAGENMR) siguiendo el siguiente protocolo:
Se descongeló el Buffer 10x PCR QIAGEN, mezcla dNTP (0.2mM) y solución de
primers. Se preparó la mezcla maestra en un tubo de 1.5ml como sigue: se
pipetearon en el tubo agua destilada, 2.5ml de Buffer 10X, 0.5ml dNTP s, 0.5ml
Primer A (10mM), 0.5ml Primer B (10mM) y 0.125ml de Taq polimerasa. Se
homogeneizó la mezcla. Se pipeteó la mezcla en un tubo que contenía 2ml del
templado de DNA. Obteniéndose así 25ml de mezcla en total. Es recomendable
que los tubos para PCR se mantengan en hielo antes de colocarlos en el
termociclador. Se programó el termociclador de acuerdo a las condiciones
apropiadas de anillamiento de los oligonucleótidos.
El ciclo de la PCR es relativamente fácil y está compuesto por 3 pasos. La
reacción de PCR requiere del templado de una sola hebra. El primer paso del ciclo
desnaturaliza el templado de dos hebras para obtener una sola. Esto permite que
los oligonucleótidos se adhieran al templado de DNA en sitios específicos; 94°C
durante 30seg funcionaron bien. El segundo paso involucra el anillamiento de los
oligonucleótidos al templado de DNA. El truco es disminuir la temperatura a un
nivel que el oligonucleótido pueda complementar las secuencia del templado de
DNA; 55°C durante 30seg. Finalmente, la extensión requiere de una temperatura
a la cual la Taq polimerasa pueda funcionar adecuadamente, esta fue 72°C
durante 30seg. Los oligonucleótidos son necesarios para la iniciación de la
reacción (Palumbi et al. 1991).
Se emplearon los siguientes perfiles de temperatura para reacciones de
amplificación del DNA en el análisis de la región control del genoma mitocondrial
para T. truncatus: Tres ciclos a 94°C por 3min, 55°C por 1min y 72°C por 2min; y
30 ciclos a 95°C por 15seg, 55°C por 30seg y 72°C por 2min seguido de un
periodo de extensión de 5min a 72°C (Wang et al. 1999). Se llevó a cabo la
Informe final de Servicio Social
26
amplificación en el termociclador TechneMR y/o BiometraMR con el programa
anteriormente mencionado. Al terminar las muestras se almacenaron a 4°C.
v Cuantificación de productos amplificados
Ver descripción anterior (determinación de la concentración de ácidos
nucléicos)
III) Purificación de los fragmentos amplificados
Se utilizó el QIAquik PCR Kit (QIAGENMR) para purificar fragmentos de
100pb a 10Kb. Se determinó el volumen obtenido por PCR. Se agregó a cada
muestra 5 volúmenes de buffer PB por 1 volumen de la reacción PCR y se mezcló.
Se colocó una columna QIAquick dentro de un tubo colector y en seguida se
introdujo la muestra dentro de la columna ya fuese pipeteando o decantando y se
centrifugó a 13 000rpm durante 1:30min. Esto permite extraer impurezas del DNA
como restos de nucleótidos, MgCl2, etc. Se desechó el sobrenadante.
Posteriormente, se agregaron 650ml de Buffer PE a la columna y se centrifugó a
13 000rmp durante 1:30min. Se desechó el sobrenadante y se colocó la columna
en el mismo tubo colector. Se centrifugó nuevamente a velocidad máxima (13000
rpm) durante 1min. Al termino de este periodo, se agregaron 30ml de Buffer EB (10
mM Tris-Cl, pH 8.5) o agua al centro de la membrana QIAquick y se dejó incubar
la columna durante 15min. Finalmente, se centrifugó a 13000 rpm. Las muestras
se guardaron a 4°C.
v Cuantificación de los fragmentos purificados
Ver descripción anterior (determinación de la concentración de ácidos
nucléicos).
Informe final de Servicio Social
27
IV) RFLP (Polimorfismo de la longitud de los fragmentos de la restricción)
Los productos de los purificados fueron digeridos con enzimas de
restricción que reconocen secuencias de cuatro pares de bases siguiendo las
instrucciones de los fabricantes.
Las enzimas de restricción se escogieron con base en la comparación y
alineación de secuencias publicadas en el Gene Bank de los fragmentos de la
región control, D-Loop, del genoma mitocondrial de T. truncatus y especies
emparentadas al mismo, como T. aduncus y Delphinus delphis, ya que presentan
sitios de restricción enzimática donde se pueden distinguir los haplotipos más
comunes o linajes maternales (Baker et al. 1998) de los individuos analizados.
Para esto último, se utilizó el programa Nebcutter disponible en la red. También se
tomaron como base las endonucleasas de restricción empleadas en previos
estudios de la región control del mtDNA para la especie en cuestión; Tal es el caso
de Southern et al. (1988); Milinkovitch et al. (1994); entre otros.
Dowling et al. (1990) señalan los pasos básicos que deben proseguir en el
análisis de RFLP:
1. Seleccionar las secuencias de DNA que serán analizadas.
2. Preparar el DNA.
3. Cortar el DNA con las endonucleasas de restricción seleccionadas.
4. Ordenar los fragmentos a través de electroforesis en gel.
5. Visualizar los fragmentos ordenados y
6. Analizar los resultados.
v Cuantificación de los fragmentos de restricción
Se llevó a cabo una electroforesis en gel de agarosa al 2%, el cual fue
sometido a 60Volts durante 2hs; se colocaron de 6 a 12ml de la reacción de
restricción más 1.5ml del dye, se emplearon 2.5ml de un marcador molecular de
referencia de 20pb. Las diferencias en el patrón de bandeo entre los individuos se
consideran como diferencias genéticas (Dowling et al. 1990).
Informe final de Servicio Social
28
v Análisis de los resultados de la restricción enzimática
Para analizar los resultados obtenidos por medio de la electroforesis en gel
de agarosa al 2%, las diferencias en el patrón de bandeo, se construirá una base
de datos haplotípica (no. de organismos/haplotipo) con sus frecuencias
correspondientes y una base de datos de ausencia/presencia de fragmentos
(análisis de parsimonia) para cada una de las enzimas empleadas. El programa
REAP nos permitirá analizar los haplotipos encontrados, a través de la estimación
de eventos mutacionales que pudieron haber ocurrido. Esto nos indicará la
variabilidad que exista entre las muestras analizadas (Wang et al. 1996; Baker et
al. 1998).
Informe final de Servicio Social
29
RESULTADOS Y DISCUSIÒN
Los organismos analizados fueron 7 delfines nariz de botella identificados
como Tursips truncatus (Fig 6.), los cuales se encuentran en el oceanario de
Atlantis , S.A. en la Cd. De México.
I) Extracción de DNA
Se logró extraer exitosamente el DNA total de 7 individuos de la especie T.
truncatus a partir de leucocitos (Fig. 7). La concentración de DNA de cada
individuo se cuantificó con base en un marcador molecular de 100pb (l), donde la
concentración de la primer banda intensa es proporcional a 102ng, ver Tabla 1.
Fig. 7 Extracción de DNA de 7 individuos de Tabla 1. Concentración en ng de DNAde la especie Tursiops truncatus. por ml de muestra de cada individuo.
Individuo Sexo [DNA]/ µl
Osiris (O) H 90ng/5µlKanty (K) M 306ng/5µlByron (B) M 102ng/5µlZeus (Z) M 90ng/5µlEra (E) H 102ng/5 µlIsis (I) H 306ng/5µlBebé (Bb) H 306ng/5µl
l O K B Z E I Bb
102ng
Fig. 6 Dos delfines hembrasnaríz de botella, T. truncatusen cautiverio en lasinstalaciones del parqueacuático Atlantis. Arriba,Bebé y abajo Isis .
Informe final de Servicio Social
30
En el caso de Isis* se cuantificó nuevamente la muestra para verificar la
concentración, aparentemente muy baja y se puede observar en la Fig. 8.
Fig. 8 Extracción de DNAde 2 individuos T. truncatus.
II) Amplificación del mtDNA
La amplificación de los fragmentos de la región control, D-Loop, se llevó a
cabo a una temperatura de anillamiento de 55°C, aplicando el protocolo
mencionado. No hubo necesidad de diseñar oligonucleótidos pues funcionaron los
propuestos por Kocher et al. (1989). La concentración de templado requerida para
lograr la amplificación del fragmento no fue la misma para cada individuo, en
general se utilizaron entre 1 y 2ml de templado, equivalentes a una concentración
de que varia en un rango de 100 y 300ng, dependiendo de la calidad del mismo.
La concentración se logró determinar con base en la intensidad de las bandas
amplificadas (Fig. 9) que son proporcionales a la concentración en ng de DNA
tomando como referencia un marcador molecular de 100pb (Fig. 10).
Bb Bb I I
Informe final de Servicio Social
31
Con base en el marcador molecular de la Fig. 10 se logró determinar el
tamaño de de los amplificados de la región control, que es de aproximadamente
700pb.
Así mismo se llevaron cabo reamplificados de algunas muestras, esto nos
permitió ahorrar templado y la concentración y calidad del los fragmentos
obtenidos fue adecuada para someterlos a la digestión enzimática, Fig. 11.
l O K B Z E I Bb Bb
~700pb 500pb
Fig. 11 Reamplificados de 6individuos T. truncatus
Fig 10 Patrón de bandeo deMarcador molecular 100pb.
Fig. 9 Amplificados de un fragmentode la región control del genoma mito-condrial de 7 individuos T.truncatus.
Informe final de Servicio Social
32
III) Purificación del mtDNA
Los fragmentos amplificados para los siete individuos fueron purificados
para poder ser sometidos a restricción enzimática. En la Fig. 12 se muestran
dichos purificados, los cuales varían en concentración.
Fig. 12 Purificación de amplificados de la región control mtDNA de 6
individuos T. truncatus.
IV) Restricción enzimática
La selección de enzimas informativas se llevó a cabo mediante una
búsqueda en el GeneBank (www.ncbi.nlm.nih.gov) de secuencias parciales o
totales de los genes en cuestión de T. truncatus de una misma población. Se
consideró el trabajo realizado por Wang et al. (1999) en una población de delfines
nariz de botella en aguas Chinas. Las secuencias obtenidas (AF056219 a 31) de
386pb se sometieron a una simulación de corte mediante el programa NebCutter
(www.neb.com) y las enzimas que evidenciaron patrones de corte diferentes para
los individuos de la misma población, son las que se sometieron a la reacción de
digestión. Estas las podemos observar en la Tabla 2. No todas las enzimas
cortaron para todos los individuos por lo que la ausencia de corte se considera
como una diferencia, además de los sitos de corte en diferentes sitios del DNA.
l O K B Z E I
700pb
Informe final de Servicio Social
33
Tabla 2. Selección de enzimas de restricciónEnzimas 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31HpyCH 41V 28 28 28 28 28 363 28 28 28 28 28MnI I 277 277 363 305 363 363Alu I 305 305 305 96 305 305 305 305Hha I 96 96 96 96 96 96 96 96HpyCH 4 V 156 156 156 156 156 156Mbo I 296
348348
Diferencias en los sitios de corte generadas por enzimas informativas para individuosde una población de T. truncatus, con secuencias de la región control, D-Loop, 386pbreportadas en GenBank, clave de acceso AF056219 a 31.
Se llevó a cabo la primer restricción con la enzima Alu I (10,000U/ml), de la
cual se esperaban obtener entre 4 y 5 fragmentos. La digestión se realizó con 3.5
unidades de la enzima y 14ml en promedio del purificado de DNA, que es
proporcional a una concentración de 500ng aproximadamente; en un periodo de
incubación de 18hs a 37°C. En la Fig. 13 podemos observar la digestión
incompleta de la región control de 6 individuos con dicha enzima, sin embrago es
posible observar que el patrón de corte para Era (pozo 6) es diferente al resto de
la población. Esto sugiere que dentro de dicha población existen dos haplotipos
diferentes. Habrá que probar con otras enzimas para aseverar dicha suposición.
l O K B Z E I
500pb
200pb
Fig. 13 Restricción enzimática conAluI de un fragmento de 700pb de laregión control para 6 individuos de la
especie T. truncatus.
Fig. 14 Patrón de bandeo demarcador molecular de 20pb.
Informe final de Servicio Social
34
Posteriormente se sometió la enzima HpyCH4 IV (10,000U/ml). Se
emplearon 5 unidades de la misma para digerir 8ml ó 400ng aproximadamente del
DNA purificado para cada individuo; en un periodo de incubación de 17hs a 37°C.
Podemos observar la restricción completa en la Fig. 15, donde la suma de los dos
fragmentos visibles es igual 680pb, casi el tamaño estimado del fragmento original
(700pb). Esto no significa que la reacción esté incompleta. Por un lado es difícil
determinar el número exacto de pares de bases basándonos en este método y por
otro, es probable que no se logre visualizar nítidamente en el gel una banda de
20pb. Sin embargo, todos los individuos comparten el mismo haplotipo, no hay
diferencias en este caso.
Las condiciones de la digestión para las enzimas Mbo I (5,000U/ml) y MnI I
(5,000U/ml) son las mismas que la enzima anterior. Para el caso de Mbo I no se
logró completar la reacción, Fig. 16.
Fig. 15 Restricción enzimática conHpyCH 4IV de un fragmento de~700pb de la región control, para 6individuos T. truncatus.Con base en el marcador molecu-lar de la Fig 15 se determinó queel fragmento inferior es de 160pby el superior de 520pb.
Fig. 16 Restricción enzimáticaincompleta con Mbo I de unfragmento de ~700pb de la regióncontrol, para 7 individuos T.truncatus.
l O K B Z E I
520pb
160pb
l O K B Z E I Bb
480pb
120pb
60pb
40pb
Informe final de Servicio Social
35
La digestión completa con MnI I (Fig. 17), nos permite observar tres
haplotipos; en este caso, Era e Isis presentan patrones de corte diferentes al resto
de la muestra.
Con base en los resultados expuestos, podemos caracterizar por el
momento, tres haplotipos diferentes para el grupo de delfines estudiado, utilizando
4 enzimas de restricción, de las cuales 2 fueron informativas Alu I y MnI I.
La endonucleasa de restricción AluI generó un patrón de corte específico
para Era, así mismo, la enzima MnII generó patrones de corte específicos para
Era e Isis, siendo éstos diferentes al resto de la población. Por lo tanto, los
productos obtenidos a partir de la digestión de los purificados de los individuos
analizados con las enzimas AluI y MnII nos permitieron caracterizar al menos dos
individuos de la población. La longitud de los fragmentos polimórficos específicos
para Era e Isis nos permitieron identificar fehacientemente a ambos individuos.
En este sentido radica la importancia del presente estudio. La identificación
de individuos pertenecientes a una población en cautiverio, en este caso
odontocetos, es de vital importancia para llevar a cabo planes de manejo que
eventualmente permitirán la conservación de dichas especies.
El manejo de mamíferos marinos en cautiverio requiere de un gran
conocimiento sobre las especies en cuestión. El conocer su biología y etología, en
principio, nos permite entenderlos mejor para poder brindarles la calidad de vida
Fig. 17 Restricción enzimática conMnI I de un fragmento de~700pb de la región control, para 6individuos T. truncatus.Con base en el marcador molecu-lar de la Fig 14 se determinó queel fragmento inferior es de 160pby el superior de 480pb. En el pozocorrespondiente a Zeus sealcanza a visualizar una posiblebanda de 40pb.
l O K B Z E I Bb
480pb
160pb
Informe final de Servicio Social
36
más óptima posible fuera de su hábitat natural sin embargo, nunca lograremos
igualar las condiciones que se tienen estando en vida silvestre.
Para los parques acuáticos, la pérdida de mamíferos marinos en cautiverio
es demasiado costosa y hasta corren el riesgo de que sus instalaciones sean
clausuradas o pagar multas muy elevadas. El manejo efectivo de dichas
poblaciones es básico para evitar este tipo de situaciones, e identificar
fehacientemente a cada uno de los individuos es el primer paso.
La variación en una secuencia particular de DNA, en este caso, un
fragmento de la región control (D-Loop) del genoma mitocondrial, a partir de una
endonucleasa de restricción específica originó fragmentos de longitudes
diferentes cuando cortó el mtDNA de las distintas fuentes, lo que permitió
caracterizar individualmente al menos dos individuos de la población (Era e Isis) y
comprobar la hipótesis propuesta, considerando ciertas restricciones.
Es difícil encontrar diferencias haplotípicas a nivel intraespecífico mediante
la restricción enzimática sin embargo, Hillis et al. (1990) califica el empleo de dicha
herramienta molecular para determinar las relaciones entre individuos, como
marginalmente apropiada o apropiada bajo ciertas restricciones (cuando los
niveles de variabilidad son apropiados). En este caso, dichas restricciones
estarían dadas por un tamaño de muestra lo suficientemente representativo, lo
cual incrementaría la probabilidad de encontrar diferencias entre los individuos y,
por otro lado, contar con una batería de enzimas de restricción amplia para
incrementar la confiabilidad de los resultados.
De antemano se sabe que todos los individuos fueron capturados en las
costas de Tamaulipas, excepto Isis, quien proviene de la zona sureste del Golfo de
México. Esta situación se ve reflejada en el haplotipo diferente al resto de la
población que presenta. En cuanto a Era, posiblemente proviene de un stock
diferente. Es común que algunos delfines se aparten de su población y
posteriormente se les encuentre formando parte de otra.
Dowling y Brown (1993) llevaron a cabo un análisis de endonculeasas de
restricción del mtDNA para determinar la distribución de la variación genética
dentro y entre poblaciones de delfín nariz de botella y encontraron que el nivel de
Informe final de Servicio Social
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divergencia entre los haplotipos de mtDNA en la costa del Atlántico y los del Golfo
de México sugieren un aislamiento considerable entre estas regiones. Los
cambios en el nivel del agua durante el Pleistoceno pudieron haber creado un
aislamiento geográfico que originó un hábitat adecuado para los delfines nariz de
botella en el Golfo de México. A diferencia de la costa del Atlántico, el análisis de
mtDNA de varias poblaciones de Tursiops en el Golfo de México demuestra que
existe evidencia muy limitada sobre subdivisión. Virtualmente todos los individuos
del Golfo poseen mtDNA s altamente similares o idénticos. El análisis de las
frecuencias haplotípicas en dicho estudio sugieren que existió un flujo genético
considerable entre las poblaciones, ya que la F-estadística indicó que la mayoría
de los haplotipos de DNA se encuentran distribuidos entre poblaciones. Estos
resultados requieren de un tamaño de muestra mayor, así como mayor número de
localidades de muestreo para poder realizar una cuantificación más precisa de la
subdivisión de la población. Esto sustenta el hecho de que la mayoría de los
individuos muestreados en el presente estudio compartan el mismo haplotipo.
Sin embargo, es evidente la presencia de tres haplotipos diferentes en
nuestra muestra. Es importante considerar la existencia de distintas poblaciones
nariz de botella costeras y oceánicas en los Océanos Atlántico y Pacífico.
Posiblemente algunos de estos haplotipos fueron aportados por algún stock
oceánico.
Hoelzel et al. (1991) concluye que la región control del mtDNA en tres
especies diferentes de cetáceos estudiados tiene un número de sitios polimórficos
muy bajo y que existen niveles similares de sustitución nucleotídica para la región
D-Loop así como para el resto del genoma mitocondrial; lo cual no coincide con la
gran cantidad de estudios realizados que determinan a dicha región como la más
variable dentro del mtDNA. También considera que la diversidad haplotípica
(promedio de heterocigosis) tiene un valor de 0.78, el cual es alto comparado con
los datos disponibles para cetáceos.
Cabe mencionar, que el presente trabajo es una primera aproximación para
la identificación genética de dichos organismos y consideramos que es una buena
Informe final de Servicio Social
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herramienta para discriminar poblaciones, además de que se considera una base
para futuros estudios sobre genética de poblaciones en la especie.
CONCLUSIONES
Se logró extraer DNA total a partir de leucocitos de un grupo de delfines de
la especie Tursiops truncatus en cautiverio; del cual se logró amplificar y purificar
un fragmento de la región control (D-Loop) del genoma mitocondrial, de
aproximadamente 700pb para cada uno de los individuos; la concentración final de
los purificados se determinó en un rango de ~100 a ~300ng; lo cual nos permitió
someter dichos fragmentos a diferentes reacciones de digestión enzimática
utilizando cuatro endonucleasas de restricción Alu I, HpyCH 4IV, Mbo I y MnI I; de
las cuales Alu I y MnI I fueron informativas al generar patrones de corte diferentes
en dos individuos (Era e Isis). Es decir, que alguna mutación de tipo sustitución,
deleción o inserción de nucleótidos en ésta región del genoma mitocondrial de
ambos, permite que las longitudes de los fragmentos que cortan dichas enzimas
sean diferentes al resto de la población obteniendo patrones de corte específicos
que permitan identificarlos individualmente. Se encontraron finalmente 3
haplotipos diferentes en la población analizada.
Los resultados obtenidos a partir del análisis del polimorfismo de la longitud
de los fragmentos restricción (RFLP) nos sugieren que es una herramienta
adecuada para caracterizar individuos siempre y cuando se cuente con un tamaño
de muestra óptimo, así como con un acervo de endonucleasas de restricción
amplio. En este caso se llevó a cabo un estudio piloto, donde los aspectos
mencionados anteriormente fueron una gran limitante sin embargo, se lograron
obtener resultados que proveen una pauta importante para continuar dicho análisis
en estudios posteriores y arrojar resultados más contundentes.
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CRITERIOS DE EVALUACIÓN
El alumno será evaluado conforme al desarrollo del proyecto teórico y
experimental durante las etapas que comprende el mismo y con base en el
contenido del reporte final.
AGRADECIMIENTOS
Agradezco el apoyo y la confianza de la Dra. Irene Barriga, Biol. Rodrigo Navarro,Atlantis S.A de C.V., mis compañeros de la PEXPA, Dr. César Pérez M., amigos y
profesores de la UAM-I; y por supuesto a mi familia que me ha motivado yayudado incondicionalmente a alcanzar mis metas a lo largo de mi vida
profesional.
La dedicación y el amor que he impreso en el presente estudio lo dedico a mi madre Ma. delRefugio Prieto Mtz.
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ANEXO
LISTA DE MATERIAL Y RELACIÓN DE COSTOS DEL PROYECTO
PROCEDIMIENTOMATERIAL Y/O
REACTIVOSCANTIDAD COSTO ($)
COSTO
UNITARIO ($)
Transporte de
muestras
Tubos para extracción de
sangre (EDTA-K) 5ml.
1 caja
(100 piezas)$277.73 $277.73
Extracción DNAQIAampR DNA Mini Kit,
QIAGEN.
1Kit
(50 reacciones)$1,420 $28.40
Amplificación DNATaqPCR Core Kit,
QIAGEN
1 Kit
(50 reacciones)$1,790 $7.16
Purificación DNAQIAquick PCR purification
Kit, QIAGEN
1 Kit
(50 reacciones)$1,000 $20.0
Restricción
enzimáticaEnzimas de restricción
ALUI
HpyCH4IV
MboI
MnLI
$500
$555
$600
$555
Cuantificación
DNA
Geles de Agarosa (500g)$7,390
100pb Ladder DNA size
standard1 $1,015
Consumibles
Microtubos 0.6ml
Microtubos 1.5ml
Puntas para pipeta 200ml
0.2-10ml
0.2-20 ml
Papel parafilmGuantes
1000pzas.
500pzas.
400pzas.
1000pzas.
1000pzas
1 rollo (5X75cm)
1 caja
$ 410.00
$180.0
$470.0
$420.0
$510.0
$280.11$90.0
$0.41
$0.36
$1.175
$0.042
$0.51
$280.11$0.9
TOTAL:
