CICY · 2018-04-26 · ~ S CICY CENTRO DE INVESTIGACION CIENTIFICA DE YUCA TAN A.C. POSGRADO EN...
108
• ... CICY ---- ------ -------- -------- ---- ------ ( POSGRADO EN ) aENaAS ( BIOlóGICAS Centro de Investigación Científica de Yucatán, A.C. Posgrado en Ciencias Biológicas CARACTERIZACIÓN DE LA ESTRUCTURA, FILOGENIA Y EXPRESIÓN DE GENES TIPO NPR1 EN Carica papaya L. Tesis que presenta MARIANA DE LOS ANGELES MENÉNDEZ CERÓN En al título de MAESTRO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS (Opción: Biotecnología) Mérida, Yucatán, México Enero 2011
Transcript of CICY · 2018-04-26 · ~ S CICY CENTRO DE INVESTIGACION CIENTIFICA DE YUCA TAN A.C. POSGRADO EN...
•
~
~ ... CICY
------------------------------------
( POSGRADO EN
) aENaAS ( BIOlóGICAS
Centro de Investigación Científica de Yucatán , A.C.
Posgrado en Ciencias Biológicas
CARACTERIZACIÓN DE LA ESTRUCTURA, FILOGENIA Y
EXPRESIÓN DE GENES TIPO NPR1 EN Carica papaya L.
Tesis que presenta
MARIANA DE LOS ANGELES MENÉNDEZ CERÓN
En opci~n al título de
MAESTRO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS
(Opción: Biotecnología)
Mérida, Yucatán, México
Enero 2011
•
CICY RECONOCIMIENTO
( POSGRADO EN
() OENOAS ( BIOLóGICAS
Por medio de la presente, hago constar que el trabajo de tesis titulado Caracterización de
la estructura, filogenia y expresión de genes tipo NPR1 en Carica papaya L, fue realizado
en los laboratorios de la Unidad de Biotecnología del Centro de Investigación Científica de
Yucatán , A.C. bajo la dirección de los Ores. Jorge Manuel Santamaría Fernández y Santy
Peraza Echeverría, dentro de la Opción Maestría en Biotecnología, perteneciente al
Programa de Posgrado en Ciencias Biológicas de este Centro.
Para los efectos que sean necesarios,
Centro de Investigación Científica de Yucatán A.C.
~ :S
CICY
CENTRO DE INVESTIGACION CIENTIFICA DE YUCA TAN A.C.
POSGRADO EN CIENCIAS BIOLOGICAS
DECLARACIÓN DE PROPIEDAD
( POSGRAOO EN
) OENOAS ( BIOLOG!CAS
Declaro que la información contenida en la sección de materiales y métodos
experimentales, los resultados y discusión de este documento proviene de las actividades
de experimentación realizadas durante el período que se me asignó, para desarrollar mi
trabajo de tesis, en las Unidades y Laboratorios del Centro de Investigación Científica de
Yucatán , A. C., y que dicha información le pertenece en términos de la Ley de la
Propiedad Industrial, por lo que no me reservo ningún derecho sobre ello.
Mérida, Yucatán a 31 de enero de 2011
* CICY
•
CARACTERIZACION DE LA ESTRUCTURA, FILOGENEA Y EXPRESION
DE GENES TIPO NPR1 EN CARICA PAPAYA
AGRADECIMIENTOS
Debo agradecer de manera especial al Dr. Jorge Manuel Santamaría Fernández y al Dr.
Santy Peraza Echeverría por aceptarme para realizar esta tesis de maestría, por
trasmitirme sus conocimientos y guiar mis propias ideas para que, sumando
capacidades, lograramos el exitoso desarrollo de la presente tesis. Les agradezco
también el haberme facilitado siempre los medios suficientes para llevar a cabo los
experimentos que permitieron el desarrollo de esta tesis.
A la Dr. Gabriela Fuentes por su ayuda en la realización de esta tesis con la identificación
de los transcriptos de CpNPR5.
A Eduardo Castillo, asistente técnico en el grupo del Dr. Santy Peraza Echeverría, por su
paciencia y disposición durante mis estancias en el laboratorio.
Al comité revisor integrado por el Dr. Santy Peraza Echeverría , el Dr. Jorge Santamaría
Fernández, el Dr. Octavio Martínez de la Vega, el Dr. Luis Sáenz Carbonell y el Dr.
Jorge Humberto Ramirez por la revisión, comentarios y valiosas sugerencias para llevar
a término la escritura de la presente tesis.
Al comité tutora! integrado por el Dr. Jorge Santamaría Fernández, Dr. Santy Peraza
Echeverría, el Dr. Octavio Martínez de la Vega y la Dra. Virginia Herrera Valencia por los
comentarios y sugerencias durante los exámenes tutoriales.
Al proyecto CONACYT de Ciencia Básica (83829): Sobrexpresión controlada del gen
NPR1 en papaya utilizando un promotor inducible por etanol : una estrategia
biotecnológica para el control de la antracnosis, del cual se desprende esta tesis.
Al CONACYT por haberme otorgado la beca (No. 224295) para la realización de mis
estudios dentro del Centro de Investigación Científica de Yucatán.
* CICY
•
CARACTERIZACION DE LA ESTRUCTURA, FILOGÉNEA Y EXPRESION
DE GENES TIPO NPR1 EN CARICA PAPAYA
A mis compañeros y técnicos de los laboratorios de Fisiología Molecular y Fitopatología
Molecular y Biotecnología de Cultivos Tropicales. En especial quiero expresar mi
agradecimiento al MC. Fabio ldrovo Espín quien fue un compañero generoso y
dispuesto a colaborar, como pocos, que compartió conocimientos y experiencias de tipo
profesional.
A mis amigos de la unidad de bioquímica, en especial a Yuri y Carlos, por su apoyo y
amistad.
A mi familia por el apoyo incondicional.
Al Dr. Ramiro Del Valle Robles, gracias por mi segunda oportunidad .
. . . Estoy satisfecho con el misterio de la eternidad
de la vida y con el conocimiento, el sentido, de la
maravillosa estructura de la existencia. Con el
humilde intento de comprender aunque más no
sea una porción diminuta de la Razón que se
manifiesta en la naturaleza.
Albert Einstein.
•
Índice
ÍNDICE
índice de Figuras .. ....... ..... ....... ............ ... ................................ .... .................................................. iv
índice de Cuadros ........... ....... .. .............. ....... ........ ... .. .. .... ... .. .... .. ... ... ... ......... ..... .............. .. ..... .... vii
Resumen .. ....... ..... ............ ......... ................... .. ................. ...... .. .................................... ...... 1
Abstract ...... .. ............. ... .. ............... ....... .. .. .... ... ... .. .. .... .. .... .. ... ...... .... ... .. ..... .... .. .... .. .......... 2
Capítulo l. . ......... .. ... ..... .. .... ... .. .... .. ................. .............. .. ...... ...... .... , ......... ............... ......... ... 3
1.1 Introducción .................. ..... .......... ... ......................................................................... .............. 3
1.2 Antecedentes generales .......... .. .... ... ..... ..... .. .... ... ....... ..... .......... ..... ......... ................ ... .. ......... 5
1.2.1 Papaya (Caricapapaya L.) ..... ..... .. ...... .. .. .. ......... ... ...... ... .. ... ............ .. .. ................ ...... ............ 5
1.2.1.1 Características taxonómicas .. ...... .... ......... .... .. .. .. ... ................ ........... ... ...... .................. ..... 5
1.2 .1.1 .1 Posición Taxonómica .................. .. ........ .. .... ... .. .. .. ... .... ... .... ... ................................ ........ 5
1.2.1.1.2 Descripción Taxonómica ........ ......... ................................. .. ... .... .......... ........ .................. 5
1.2.1.1.3 Fenología .......................... ....... .. .......... .. ......... .................. ........................................... .. 6
1.2.1 .1.4 Genética ...... .... ...... .... ..... ...................... .... ........... .. ............................. ... .... ... .. .............. . 7
1.2.1.2 Características Ecológicas ..... ........... ...................... ............ .............................................. 7
1.2.1.3 Origen ..................................... ..................... .............. .... ............. .. ................ ... ............ ... ... 8
1.2.1.3.1 Dispersión ........ .. .................. .............. ... ....... .. ... ... .. ... ... ... .......................... .................... . 8
1.2.1 .3.1.1 Distribución Actual ...................... ...... .. .... ........................ ........ .. .. .... ... .. .. ..... ............. .. 8
1.2.2 Papaya Maradol (Carica papaya L. var., Maradol) .................................. .... .. .. ... .... .. .. ........... 8
1.2.2.1 Características de Ca rica papaya L. var. Maradol ............ ... ............................................. 9
1.2.2.1.1 Características Comerciales del fruto ......... .. .. .......... ......... ... .............. ...... .................. .. 9
1.2.2.1.1.1 Papaya como alimento ...... .. ........ .. ........................................... .. ............................... 9
1.2.2.1 .2 Importancia Económica .. .......................... .. .......... .... .. .. ............................................... 1 O
1.2.2.2 Comercialización y Cosecha de Carica papaya ................................ .... .......................... 11
1.2.2.3 Medidas generales para el control de enfermedades fúngicas en campo .... ............. ..... 12
1.2.2.4 Manejo Postcosecha de Ca rica papaya var. Maradol. .................................................... 12
1.2.3Antracnosis ............. ... ... .... ......... ..... ...... .. .... ...... .... ..... .. .. ... ............................ ..... ........... ... 13
1.2.3.1 Ciclo de vida de Col/etotrichum gloeosporioides .............................. .. .... .... .................... 14
1.2.4 Respuesta de la planta al ataque de patógenos ................................................................. 17
1.2.4.1 Reconocimiento del patógeno ... ....... ...... .. ..... .......... .... ...... ....... .. ........... .. ..................... ... 17
1.2.4.2 HR: Respuesta Hipersensible ........... ........... ......... .. .............. .. ........ .... .. ................... ....... 18
1.2.4.3 SAR: Resistencia Sistémica Adquirida ................. ...... ... ...... .......... ..... .. .. ......................... 18
* CICY
CARACTERIZACION DE LA ESTRUCTURA, FILOGÉNEA Y EXPRESION
DE GENES TIPO NPR1 EN CARICA PAPAYA
A mis compañeros y técnicos de los laboratorios de Fisiología Molecular y Fitopatología
Molecular y Biotecnología de Cultivos Tropicales. En especial quiero expresar mi
agradecimiento al MC. Fabio ldrovo Espín quien fue un compañero generoso y
dispuesto a colaborar, como pocos, que compartió conocimientos y experiencias de tipo
profesional.
A mis amigos de la unidad de bioquímica, en especial a Yuri y Carlos, por su apoyo y
amistad.
A mi familia por el apoyo incondicional.
Al Dr. Ramiro Del Valle Robles, gracias por mi segunda oportunidad .
. . . Estoy satisfecho con el misterio de la eternidad
de la vida y con el conocimiento, el sentido, de la
maravillosa estructura de la existencia . Con el
humilde intento de comprender aunque más no
sea una porción diminuta de la Razón que se
manifiesta en la naturaleza.
Albert Einstein.
•
Índice
1.2.4.3.1 Genes de Resistencia .... .. ...... ...... .. .... ...... .. ............ .. ................................................... 19
1.2.5 NPR1 (No expresivo de genes PR-1) .. .. .... .......................................... .. .. .. ...... .... .. .. ............ 21
1.2.5.1 Características estructurales de NPR1 ...... .. ....... .. ...... .. .. .. .................................... .. ...... .. 21
1.2.5.2 Interacciones de NPR1 con otras proteínas ...... .. .. .. .............................................. .. ..... .. 22
1.2.5.3 Localización celular y activación de la proteína NPR1 .... .. ............................................. 22
1.2.5.4 Familia de genes tipo NPR1 de Arabidopsis ............... .... .. .. .. .............. .. .................. .. ...... 26
1.2.5.5 Expresión basal de genes tipo NPR1 .......................... .. .... .. .... .. ... ....... .. .......................... 26
1.2.5.6 Biotecnología de NPR1 .......... ... ......... .. ........ ... .. ......... .. ....... ... ... ................... ..... ... ........... 27
1.2.5.7 Genes tipo NPR1 en otros Genomas ...... ......... ... ........... .. ........................... .. .. .. .............. 28
1.2.5.8 NPR1 en Carica papaya ............ ......... .. ...................... .... .......... ... .. .... ...... .. ...................... 29
1.3 Hipótesis .... ...... ......... .. ....... ............................. ... ......................... .. .......... .......... ... .... .. .......... 30
1.4 Objetivos .......... ...... ...... ... .. ..... ..... .. .... ... ... .. ..... ...... .. .... .. .... ... ... ...... .. ...................................... 30
1.4.1 .1 General ........... ......................... ..... ......... ... ................. ...................................................... 30
1.4.1.2 Particulares ..... .............. ......... ... .... ... .. .. ... ... ..... ..... .. .. ....... .......... .............................. ......... 30
1.5 Estrategia experimental general ...... .. .... ....... ..... .. ... ....... ... ... .. .... ..... ... .. ...... ... ... ............ ........ 31
1.6 Referencias bibliográficas ..... .............. .. ....... ............................ ... ......... ... ...... ...................... 32
Capítulo 11. Caracterización in si/ico de genes tipo NPR1 del genoma secuenciado de la
papaya transgénica Sun Up .. .... .. ...... .. ... ... ... ..... .. .. ... .. ...... ........... .. ...... .. ..... .. ............. ......... ...... .. .41
11 .1 Introducción .... ..... ....... .... ....... .. .. .... .......... ..... ..... .. ..... ... .. .... ... .. ..... .. ....... ........................ .. ..... 41
11.2 Materiales y métodos ............................ ... ........ ... ............. .............................................. ..... .43
11.2 .1 Aislamiento in si/ico de genes tipo NPR1 del genoma SECUENCIADO de Carica papaya var. Sun Up ... ...................... .. ..................... ........ ......................... ... ............... 43
11 .2.2 Predicción de ORF ... ......... ...... ..... .... ........... .. .. .. .. .. .. .. .... ... .. ....... .. .... ............. ................... .44
11.2.3 Determinación de porcentajes de identidad ............................... : ........ .. ...... .. .. .. .............. .44
11.2.4 Alineamiento de las proteínas predichas e Identificación de dominios conservados ...... 44
11.2.5 Análisis filogenético de las secuencias .. .... .. .............. .. ........................ ............................ 46
11.3 Resultados ............. ... ....................... .. .. .............. ............. ............ .............. .... ....................... 4 7
11.3.1 identificación in silico de genes tipo NPR1 de Carica papaya var. Maradol ................... .47
11.3.2 ORFs (marcos de lectura abiertos) y Organización Genómica ...................... .. ........ .. .... .. 48
11.3.2.1 Predicción de ORFs tipo NPR1 .......... .... ............ .. ................... .. ....................... .. ............. 48
11.3.2.2 Alineamiento de proteínas tipo NPR1 de C. papaya ............ .... ...... .. ...... .. ...................... .49
¡¡
Índice
11.3.2.31dentificación de Dominios conseNados .. .. .... .. .. ... ... ...... ... ..... ... ................ .... .................. 53
11.3.2.4 Porcentajes de identidad de las secuencias tipo npr1 de papaya ..... .. ... .... ................. ... 58
11.3.3 Análisis filogenético de las secuencias ..... .... .. ........ ..... ... .. ....... ..... ............. ............ .. ... .. ... 59
11.4 Discusión ... .. ... ..... .. .... .. .. ..... .. ..... .. ....... .. ............... .. ...... .... .... .. .... ..... ...... ................. .............. 61
11.5 Referencias Bibliográficas ............. .......... ........ ....... .. ........................................ ... .. .. ............ 64
Capítulo 111. Caracterización de la expresión basal de genes tipo NPR1 en Carica papaya
L. var. Maradol ............ .. ..... .... ... ............ .. ... .... ....... ... .......... ... ..... ... .. .' .. ... ......................... .... ... ... 71
111.1 Introducción ............ ........ .. ........ ..... ... ... ................ ......................... .. ......................... ... ......... 71
111 .2 Materiales y métodos ......... .. ......... ................. .......................... ... .... .. ................................ ... 73
111.2.1 Material vegeta1 ... ...... ........ .. ...... ............. ..... .. ........ ... ..................... .... .... .... ... .. ... ............... 73
111 .2.2 Extracción de ARN .. .. ... ... .. .. ... ... ......... .. ...... ....... .......... ........ .... .... ... ... ............ ....... ..... ....... 73
111 .2.3 Tratamiento con ADNasa .......... ..... ........ ........ ... ......... ............. .. ........... ............................ 74
111.2.4 Síntesis de ADNc .... ... .. ...... ...... .... ..... ......... ...... ...... .. .... .... ... .. ... ... .. .............................. ..... 74
111.2.5 Diseño de oligonucleótidos específicos ............. .... .. ................. .. ... ........................ .... ... .. . 75
111.2.6 Condiciones de amplificación de la RT-PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) .. 76
111.3 Resultados .... .. .. .... ............... .. ....... .... ................................ .... ....... .... ..................... ............... ?? 1
111.3.1 Extracción de ARN y tratamiento con ADNasa ............ ...... ............... ..... ..................... ..... 77
111.3.2 Análisis de expresión basal en C. papaya var. Maradol. ... ..... ..... .................. ...... .. ....... ... 79
111.4 Discusión ............ .......... ... .... .. .. ... ... ..... .... ... .... ... ..... ... .. .... ............... .. ............... ......... ...... ...... 80
111 .5 Referencias Bibliográficas ..................... .................................. ...... ... ..... .. ............ ....... ......... 82
Capítulo IV. . .................. ..... .... ... ...... .. .... .. ....... ... ..... .. .. ... ....... ..... .. .. ................... .. ................. 86
IV.1 Discusión General .............. .. ... ......... .......... .. .... ................................ .. .... ... .. ... ..... ... ....... ...... 86
IV.2 Conclusiones .......................... ..... ... .. ..... .. .. ...... .. .. ... ....... ............ ........ .. ... .. ..... ............ ....... ... 89
IV.3 Perspectivas ... .... ..... ..................... .. .................. ........ ........... ........ ... ......................... .... ....... . 89
IV.4 Referencias Bibliográficas ....... ..... ..... .... ... .. ... .... ............... : ... ... .. ... .. ........ .. ...... ................... .. 91
¡¡¡
Índice
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1.1 : Litografía de Carica papaya. Se observa (A) la planta en fructificación, (1)
inflorescencia hermafrodita, (2) corte transversal de la flor fecundada, (3) fruto
maduro con corte longitudinal que permite observar las semillas (4) semilla sin
sarcotesta , se observa la testa rugosa de la semilla y (5) corte longitudinal de la
semilla (Tropicos, 2008) ... .. .. ... ....... ... .. ........ .. ... ....... ........ ... .... ...... .. .. ... ....... ..................... .. 6
Figura 1.2 Ciclo de vida de Col/etotrichum gloeosporioides en Carica papaya L (Liberato, 2007;
Chau y Alvarez, 1983) . ..... ........ ...... ........ .. .... .... ........ ............... ......... ... ............................ 15
Figura 1.3 Diagrama conceptual de la localización de los dominios y residuos característicos de
la proteína NPR1 .. ....... ............................. ...... ... ......... .......... ..... ... ... ........... ....... .... ........ .. 21
Figura 1.4 Diagrama que ilustra el proceso de degradación de la proteína NPR1 por el
proteosoma en células no inducidas. La forma inactiva de NPR1 es un oligómero,
de forma basal existe cierta acumulación endógena de SA dentro de la célula. El SA
provoca el rompimiento de los puentes disulfuro del oligómero activando a NPR 1
(monómero) . En esta forma NPR1 se transloca al núcleo donde interactúa con
Cullin3 que ubiquitina a NPR1 resultando en la degradación mediante proteosoma
de la proteína de NPR1 y evitando con ello la activación de la expresión de los
genes del SAR (Pieterse y Van Loon, 2004; Spoel et al., 2009) ... ........ ..... .... ... ............ . 24
Figura 1.5. Diagrama que ilustra el proceso de activación y posterior degradación de la proteína
NPR1 . La forma inactiva de NPR1 es un oligómero. Cuando se produce un ataque
por un patógeno, este ataque promueve la HR, la que a su vez inicia una
acumulación de SA. El SA provoca un ambiente reductor en el citoplasma,
rompiendo los puentes disulfuro del oligómero y activando a NPR1 (monómero). En
esta forma NPR1 se transloca al núcleo donde interactúa con la proteína NIMIN y
factores de transcripción de la familia TGA, esta interacción aumenta la afinidad de
los factores TGA a los promotores de genes PR, lo que trae como resultado la
activación de la expresión de los genes del SAR. NPR1 se fosforila al interactuar el
complejo de iniciación (C .I.) de la ARN polimerasa ll. La fosforilación de NPR1
promueve su degradación por el proteosoma (Spoel et al., 2009; Pieterse y Van
Loon, 2004; Weigel et al., 2005) .. .... .. ... ...... .. .... ... ..... ........ ..... ..... ......... .... .... ................. .. 25
Figura 1.6. Árbol filogenético donde se muestran las relaciones filogenéticas existentes entre
las seis secuencias tipo NPR1 de A. thaliana (Hepworth et al., 2005) . .. .... ... .. ............... 26
Figura ll .1 Alineamiento CLUSTAL X de las secuencias tipo NPR1 del genoma de Carica
papaya (CpNPR1 , CpNPR3, CpNPR4 y CpNPR5) en negritas y de A. thaliana
iv
Índice
(AtNpr1 , AtNPR2 , AtNPR3, AtNPR4 y AtNPR5) en cursivas. El motivo fosfodegron
tipo IKB (Spoel et al., 2009) de seis aminoácidos se encuentra en Asp1 O - Ser15, el
dominio BTB (Hepwort et al., 2005) en Ser65 - Val194, los 4 dominios Ankyrin de la
región N-terminal (Cao et al., 1997) y la señal de localización nuclear (NLS por sus
siglas en inglés) (Kinkema et al., 2000) que va de Lys537- Lys554. Los aminoácidos
de relacionados con la localización nuclear de la proteína NPR1 se señalan con una
flecha (._J.,) y los relacionados con la interacción con TGA"s con un asterisco (* ). '
aquellos que intervienen en la transactivación con signo de mas(+) y aquellos que
intervienen en la fosforilación con un punto negro (e) . .... ... ... ............... ............. ... .... ..... 52
Figura 11.2 Secuencia de nucleótidos y traducción conceptual de la secuencia CpNPR1. Los
motivos conservados se encuentran señalados: el motivo BTB (292 - 367) se
subraya con una línea gruesa. La región de repeticiones de Ankyrin (292 - 367) se
subraya con una línea delgada y el dominio Ankyrin repeat (326 - 358) se subraya
con una línea doble ..... ... ...... .... ..... .... ................ ...... ................................................... ..... 64
Figura 11.3 Secuencia de nucleótidos y traducción conceptual de la secuencia CpNPR3. Los
motivos conservados se encuentran señalados. La región de repeticiones de
Ankyrin (216- 290) se subraya con una línea delgada ........ ... ....... ... ...... ................. ... .... 55
Figura 11.4 Secuencia de nucleótidos y traducción conceptual de la secuencia CpNPR4. Los
motivos conservados se encuentran señalados: el motivo BTB (57 - 130) se
subraya con una línea gruesa. La región de repeticiones de Ankyrin (286- 358) se
subraya con una línea delgada .............................. .............. .................. ..... ........... ......... 55
Figura 11.5 Secuencia de nucleótidos y traducción conceptual de la secuencia CpNPRS. Los
motivos conservados se encuentran señalados: el motivo BTB (26 - 1 08) se
subraya con una línea gruesa. La región de repeticiones de Ankyrin (282 - 355) se
subraya con una línea delgada .... ... .. ..... .......... ....... ......... ......... .... .... .. .... .. .............. ... ..... 5?
Figura 11.6 Árbol filogenético donde se muestran las relaciones filogenéticas existentes entre
las cuatro secuencias tipo NPR1 de C. papaya (resaltadas en negrillas) y las seis
secuencias tipo NPR1 de A. thaliana (resaltadas en cursivas) .................. ..... ...... ... ... ... 59
Figura 11.7 Árbol filogenético donde se muestran las relaciones filogenéticas entres las cuatro
secuencias de aminoácidos tipo NPR1 de C. papaya (e) , las seis secuencias tipo
NPR1 de A. thaliana (e) y 28 secuencias de diferentes plantas obtenidas del
GenBank ...... ........... .. .. .. .......... ...... .. ... ............... ...... .. .... ... ..... ...... ................................ ... .. 60
Figura 111.1 Gel de extracción de ARN de hoja y fruto. El gel se fraccionó por electroforesis en
agarosa al 1.2% y fue teñido con bromuro de etidio. Se señalan las bandas 25S y
18S, así como la banda de ADN ............... .......... . ........... .. ..... .. . ... ..... ...... .......... 77
V
Índice
Figura 111.2 Gel de extracción de ARN de hoja y fruto . El gel se fraccionó por electroforesis en
agarosa al 1.2% y fue teñido con bromuro de etidio. Se señalan las bandas 25S y
18S, así como la banda de ADN ....... ..... ... .. .......... .. .......... ............... ... ............................ 78
Figura 111.3 Gel de extracción de ARN de flor y peciolo. Gel fraccionado por electroforesis en
agarosa al 1.2% y teñido con bromuro de etidio. Se señalan las bandas 25S y 18S,
así como la banda de ADN .. .... ...... .... .. ....... .... ............................. .. ........... .... .................. 78
Figura 111.4 Amplificación del gen CpNPR4 en C. papaya var. Maradol con y sin ADNasa . Con
ADNc sintetizado partiendo de 21Jg de ARN. Los amplicones se fraccionaron por
electroforesis en gel de agarosa al 1.2% teñido con bromuro de etidio. Tamaño
esperado del amplicon: CpNPR4: 225pb . .. ..... ................................................................ 78
Figura 111.5 Amplificaciones de los genes tipo NPR1 en C. papaya var. Maradol con ADNc
sintetizado partiendo de 21Jg de ARN. Los amplicones se fraccionaron por
electroforesis en gel de agarosa al 1.2% teñido con bromuro de etidio. Tamaño
esperado de los amplicones: CpNPR1: 246pb, CpNPR3: 204pb, CpNPR4: 225pb,
CpNPR5: 216pb, CpActina :141pb .... .... ... ........ .. ........ ... .. ......... .. .... ... .. ..... .... ........... ...... ... 79
vi
•
Índice
ÍNDICE DE CUADROS
Cuadro 1.1 Producción de Papaya por continente ... ............. .. ............ ...... .............................. ......... 10 Cuadro 1.2 Valor de la producción de las variedades de papayas en México (SIAP, 2008) .. ....... .. 11 Cuadro 1.3 Clasificación de las proteínas de resistencia por su estructura ... .. ......... .... .... ... ..... ....... 20 Cuadro 1.4 Clasificación de las proteínas relacionadas con la patogénesis (PR) por su actividad . 20 Cuadro 1.5. Reportes de expresión basal de los genes tipo NPR1 ..... ............... ... .................... ... .... 27 Cuadro 1.6 Estudios de sobrexpresión del gen NPR1 en diferentes especies .. .............................. 28 Cuadro 1.7 Presencia de proteínas tipo NPR1 predichas en genomas secuenciados ...... .............. 28 Cuadro 1.8 Estrategia experimental para la caracterización estructural y expresión basal de genes tipo NPR1 de Carica papaya L. , var. Maradol. ... .. .... .. ..... ... .... .. ....... ........... ... .................. ... .. ..... ....... 31 Cuadro 11. 1. Lista secuencias tipo NPR1 de otras plantas utilizadas para el análisis filogenético . . 45 Cuadro 11.2 Resultados de la búsqueda de secuencias homólogas a AtNPR1 (con una longitud de
503 aa) en el genoma de C. papaya utilizando el programa TBLASTN . ¡Error! Marcador no definido.
Cuadro 11.3 Resultados del programa predictor de ORFs FGENESH en las secuencias ABIM01013147, ABIM01019889, ABIM01011811 y ABIM01002225 encontradas en el TBLASTN ¡Error! Marcador no definido.
Cuadro 11.4 Características de los dominios conservados en las secuencias tipo NPR1 de C. papaya y Arabidopsis de acuerdo al programa PROSITE ¡Error! Marcador no definido.
Cuadro 11.5 Porcentajes de identidad entre las cuatro secuencias tipo NPR1 de Carica papaya y las seis secuencias de la familia génica NPR1 de Arabidopsis thaliana. ¡Error! Marcador no definido.
Cuadro 111.1 Oligonucleótidos específicos diseñados para la RT-PCR de las secuencias tipo NPR1
de C. papaya ...... ......... .. ..... ......... ...... .. ... ......... .... ... .... ... .. ... ........ ........... .. ............... .. ..... .......... ...... ... 75
Cuadro 111.2 . Resultados de las lecturas realizadas de las muestras de los cuatro tejidos de
estudio. Se presenta la relación A260/A280 como indicador de pureza y la concentración en ¡Jg de
ARN por mg de tejido como indicador de rendimiento ... .... ..... ........ ........ ....... .... ....... ... ... ... ........... .. . 77
v ii
•
LISTADO DE ABREVIATURAS
HR: Hypersensitive Response. Respuesta Hipersensitiva.
INA: 2,6 dichloroisonicotinic acid . Ácido 2,6-dichloroisonicotinico.
ISR: lnduced Systemic Resistance. Resistencia Sistémica Inducida.
NPR1 : Nonexpresser of PR1 genes. No expresivo de genes PR1 .
NPR1= escrito en mayúsculas y cursivas, nos referimos al gen.
NPR 1 = escrito en mayúsculas, nos referimos a la proteína.
npr1 = escrito en minúsculas y cursivas, nos referimos a la planta mutante.
ORF: Open Reading Frame. Marco de Lectura Abierto.
PR: Pathogenesis-Related. Relacionado con patogénesis.
SA: Salicylic Acid . Ácido salicílico.
SAR: Systemic Acquired Resistance. Resistencia sistémica adquirida.
Índice
viii
•
Resumen
RESUMEN
México ocupa el primer lugar en exportación de papaya a nivel mundial y el segundo en
su producción, lo que se traduce en una importante fuente de divisas y empleos para el
país. Sin embargo, los frutos de la papaya son susceptible a diversas plagas y
enfermedades como la antracnosis, causada por el hongo Colletotrichum gloeosporioides,
esta enfermedad se considera la principal limitante fitosanitaria para la comercialización
de los frutos pues ocasiona pérdidas de hasta el 40% de la producción a nivel post
cosecha.
A nivel mundial se prevé la disminución en el uso de pesticidas para el control de
enfermedades en los cultivos debido a los riesgos que representan para el ambiente y la
salud humana. Una alteARNtiva al uso de estos productos químicos es la búsqueda de
genes clave de la cascada de señales presentes en las células vegetales involucrados en
la resistencia natural de la planta contra fitopatógenos. Uno de estos genes es el gen
NPR1 (no expresivo de genes PR-1 ), el cual es considerado el regulador maestro de la
Resistencia Sistémica Adquirida (SAR). En estudios previos realizados en la planta
modelo Arabidopsis thaliana se encontró que el gen NPR1 pertenece a una familia génica
de seis miembros.
En el presente trabajo se reporta el aislamiento in si/ico de las secuencias tipo NPR1 del
genoma secuenciado de Ca rica papaya var. S un Up denominadas CpNPR1 , CpNPR3,
CpNPR4 y CpNPR5. Las cuatro secuencias tipo NPR1 de papaya forman una pequeña
familia génica que comparten características estructurales con secuencias tipo NPR1 de
A. thaliana y de otras veintiun especies diferentes de p·lantas, como la presencia de los
dominios BTB/POZ y Ankirin. Las secuencias tipo NPR1 de papaya se agrupan en tres
ciados filogenéticos como los reportados para Arabidopsis.
Además se diseñaron oligonucleótidos para los cuatro genes tipo NPR1 aislados in si/ico
para evaluar sue expresión en plantas adultas de un cultivo comercial de C. papaya var.
Maradol. Se reporta la expresión basal de estos cuatro genes en los tejidos de peciolo,
hoja, flor y fruto.
•
Abstract
ABSTRACT
Mexico ranks tirst in worldwide export ot papaya and second in its production.
Untortunately, papaya truits are very susceptible to diseases such as Anthracnose
(caused by Colletotrichum gloeosporioides), which is considered the main post-harvest
problem. This disease limits papaya commercialization causing losses ot up to 40% ot
post-harvest production.
There is an increasing worldwide concern regarding the use ot chemicals to control plant
diseases, particularly postharvest diseases, as they represent a potential risk to human
health as well as to wildlite and ecosystems.
An option to the application ot these agrochemical products is the use ot biotechnology to
tind and eventually use master genes involved in the natural resistance against plant
pathogens to increase the pathogen resistance ot important crops. One ot these genes is
the NPR1 (Nonexpresser ot PR1 genes) gene that is considered as a master regulator ot
the Systemic Acquired Resistance (SAR). Earlier works with Arabidopsis thaliana , have
tound that the NPR1 gene belongs toa small gene tamily ot six members.
The present thesis reports the in si/ico analysis ot tour NPR1-Iike sequences trom C.
papaya var. "Sun Up" genome sequence. We tound tour NPR1-Iike sequences in papaya
and named as CpNPR1 , CpNPR3, CpNPR4 and CpNPR5 based on the similarity shared
with their Arabidopsis NPR1 orthologs.These tour NPR1-Iike sequences, share structural
characteristics with NPR1-Iike sequences trom Arabidopsis, and other species, including
the presence ot the BTB/POZ and Ankirin domains. Like in Arabidopsis, the papaya NPR1
sequences are distributed in three phylogenetic clades.
In addition, primers were designed tor the tour NPR1-Iike genes isolated in silico and their
expression was evaluated in adult plants trom a commercial plantation ot C. papaya var.
Maradol, tinding that the tour genes showed a basal expression in petiole, leat, tlower and
truit tissues.
2
Capitulo 1
CAPÍTULO l.
1.1 INTRODUCCIÓN
El fruto de Carica papaya tiene una gran importancia económica en los mercados
mundia les. En México, la exportación de C. papaya var. Maradol representan una
importante fuente de divisas para el país. Sin embargo, la producción de este cultivo se
hace cada vez más costosa debido a los diferentes métodos de control que se tienen que
implementar para el combate de plagas y enfermedades. En este sentido la enfermedad
fúngica de la antracnosis (causada por el hongo Colletotrichum gloesporioides)
representa uno de los problemas más serios debido al uso intensivo de fungicidas tóxicos
aplicados directamente tanto a la planta como al fruto para su control.
Los programas de mejoramiento de C. papaya incluyen la búsqueda de factores
beneficiosos para incrementar la calidad, la alta productividad y tolerancia a las plagas,
sin embargo C. papaya resulta un cultivo difícil de mejorar por cruzas intergenéticas, por
lo que las herramientas moleculares resultan una opción viable para su mejoramiento. La
sobrexpresión de genes es una de las opciones que nos permite hacer modificaciones
selectivas en el fenotipo de las especies de interés comercial. Uno de estos genes es el
gen NPR1 (No expresivo de genes PR1), el cual está involucrado en la expresión de
genes PR (Relacionado con Patogénesis). Trabajos recientes han mostrado que la
sobrexpresión del gen NPR1 de Arabidopsis en plantas transgénicas de tomate y trigo
conduce a activar la resistencia sistémica adquirida (SAR), creando de esta forma un
efecto protector contra patógenos bacterianos y fúngicos. De igual forma, la sobrexpresión
de un gen tipo NPR1 de manzana ha ocasionado que plantas transgénicas de esta planta
adquieran resistencia contra bacterias y hongos patogénic<Js. Estos resultados muestran
claramente por qué este gen ha sido considerado como un regulador maestro de la SAR
que tiene un gran potencial para el mejoramiento genético de cultivos agrícolas.
La manipulación genética de un gen tipo NPR1 endógeno en C. papaya, podría resultar
en un avance enormemente provechoso, debido a que se ha observado que en otros
modelos la sobreexpresión de este gen otorga una mayor resistencia contra patógenos
fúngicos. Existe evidencia suficiente para esperar que el gen NPR1 de papaya promueva
el desarrollo de una mayor resistencia contra antracnosis activando la SAR y promoviendo
la resistencia contra otros patógenos que pudieran afectar la producción de este cultivo.
3
•
Capitulo 1
Por lo tanto, el análisis y la caracterización molecular de los genes tipo NPR1 en C.
papaya var. Maradol forjaran las bases para el desarrollo de estrategias encaminadas a
lograr el mejoramiento genético de este cultivo. Hasta el momento solo existe un reporte
publicado acerca de la clonación de una secuencia parcial tipo NPR1 de C. papaya
evaluada para Phytophthora palmivora en hoja y raíz (Zhu et al., 2004) , sin información
adicional acerca de sus patrones de expresión o cuantos genes tipo NPR1 existen en el
genoma de esta planta (en Arabidopsis existen seis genes tipo NPR1), por lo tanto la
información molecular acerca de esta familia de genes en papaya sigue siendo muy
limitada. La publicación reciente de la secuencia genómica de C. papaya (número de
accesión del GenBank [ABIMOOOOOOOO]) (Ming et al., 2008) abre la posibilidad de cambiar
este escenario ya que se pueden identificar todas las potenciales tipo NPR1 de C. papaya
para poder realizar su caracterización estructural y funcional de forma sistemática.
En el presente proyecto se plantea la identificación de todas las secuencias tipo NPR1 del
genoma de C. papaya variedad Sun Up, así como la caracterización de los patrones de
expresión de los genes tipo NPR1 en diferentes tejidos de la planta (hoja, tallo , flor y fruto)
en papaya var. Maradol. Se seleccionaron órganos vegetales con tejidos y funciones
perfectamente diferenciadas entre sí que nos permitirían observar sí alguno de los genes
tipo NPR1 presenta expresión tejido dependiente.
4
•
1.2 ANTECEDENTES GENERALES
1.2.1 PAPAYA (CARICA PAPAYA l.)
1.2.1 .1 CARACTERÍSTICAS TAXONÓMICAS
1.2.1 .1.1 POSICIÓN TAXONÓMICA
REINO: SUBREINO: DIVISIÓN: CLASE: SUBCLASE: ORDEN:
Plantae Tracheobionta Magnoliophyta Magnoliopsida Dilleniidae Viola les
FAMILIA: Caricaceae GÉNERO: Carica L. ESPECIE: Carica papaya L.
Capitulo 1
Tomado del Sistema de Información Taxonómica Integrada (ITIS por sus siglas en inglés)
1.2.1.1.2 DESCRIPCIÓN TAXONÓMICA
Planta, monoica o dioica, generalmente de 2-8 m de altura, generalmente sin ramas, las
hojas se encuentran densamente concentradas en el ápice (Figura 1.1 ), lobadas con el
ápice acuminado a agudo, de 20-45 cm de largo y ancho, con el envés más pálido,
corteza verde o grisácea, lisa, con numerosas cicatrices foliares horizontales (Moreno,
1980).
Las inflorescencias se encuentran en las axilas de las hojas superiores (Figura 1.1 ). La
papaya silvestre por lo general es dioica, presenta inflorescencias masculinas en
agrupaciones cimosas y la flor femenina es individual y pedunculada. La papaya cultivada
presenta flores masculinas y femeninas típicas y tres clases comunes de flores
hermafrod itas (Moreno, 1980).
El fruto es una baya (Figura 1.1 ), amarilla o anaranjada hasta verdosa , variablemente
ovoide de (2)4-6(10)1 cm de largo 1.2-6 cm de ancho en estado silvestre, en cultivo llega a
1 Entre paréntesis se indican los rangos máximos y mínimos reportados y los números separados el guion indican el tamaño más frecuentemente reportado.
5
Capitulo 1
tamaños mucho mayores (10-50 cm de largo, dependiendo del cultivo) . Es unilocular, la
pulpa amarilla anaranjada, suculenta , blanda comestible, de olor acre distintivo; semillas
numerosas, elipsoides, más o menos de 4 mm de largo por 2 mm de ancho (en estado
seco), sarcotesta mucilaginosa, endotesta morena, arrugada. La papaya cultivada llega a
pesar hasta 7 Kg (Moreno, 1980; CONABIO). Las semillas se concentran en el saco
seminal y alcanzan su madurez cuando el fruto también está maduro (Jiménez, 2002).
Figura 1.1: Litografía de Carica papaya. Se observa (A) la planta en fructificación , (1)
inflorescencia hermafrodita, (2) corte transversal de la flor fecundada, (3) fruto maduro con
corte longitudinal que permite observar las semillas (4) semilla sin sarcotesta, se observa
la testa rugosa de la semilla y (5) corte longitudinal de la semilla (Tropicos, 2008)
1.2.1.1.3 FENOLOGÍA
La papaya presenta un ciclo de vida corto (Chen et al., 2007; Ming et al., 2008) . Florece
todo el año preferentemente de febrero a septiembre a partir de los 3 meses de edad con
fructificaciones a partir de 9 meses de edad y durante todo el año (Chen et al. , 2007; Ming
et al., 2008) . La papaya silvestre es polinizada por entomófila (principalmente por abejas)
y anemófila mientras que para la papaya cultivada la polinización es antropomorfa
(CONABIO; Chen et al. , 2007; Ming et al., 2008) .
6
Capitulo 1
1.2.1.1.4 GENÉTICA
C. papaya es diploide (2n=18), posee un genoma de 372Mb, con 9 pares de cromosomas
y sistema de cromosomas sexuales primitivos. Se predicen 24,746 genes y en promedio
los genes miden 2,373 bp con intrones de 479bp de longitud (Chen et al., 2007; Ming et
al., 2008) .
En mayo de 2008 se publicó la secuencia genómica de C. papaya siendo la primera . especie tropical en ser secuenciada. La secuenciación del genoma requirió de un grupo
de 84 investigadores pertenecientes a 30 centros de investigación y un iversidades de
Estados Unidos y China (Ming et al. , 2008) .
1.2.1.2 CARACTERÍSTICAS ECOLÓGICAS
La papaya silvestre presenta características de especie primaria pues crece en bosques
tropicales caducifolios y bosques tropicales perennifolios (CONABIO). La papaya cultivada
cuando se encuentra escapada del cultivo presenta características de especie secundaria
(Moreno, 1980) pudiendo crecer en lamerías y cañadas.
Se desarrolla de los O m hasta los 1500 m sobre el nivel del mar (Moreno, 1980), en
climas templados húmedos y trópicos subhúmedos, con una precipitación media anual de
1 ,500 mm y una temperatura media anual de 20° a 25 oc. Prefiere suelos fért iles, blandos,
profundos y permeables, sedimentarios, café-rocosos, calcáreos, rojizos no profundos,
arenoso-arcillosos, volcánico aluviales con pH 5.5 a 7.
Normalmente crece en sitios donde también se pueden encontrar especies como:
Bravaisa integerrima, Bursera sp., Acacia sp. , Stemf!ladenia sp., Pereskia sp., Brosimum
alicastrum, Sideroxylon sp., Ficus sp., Acrocomia sp. , Manilkara sp., Zanthoxylum sp. y
Quararibea sp. (CONABIO).
7
•
Capitulo 1
1.2.1.3 ORIGEN
C. papaya es originaria de Mesoamérica, aunque su origen exacto se desconoce. Se
piensa que el sitio de origen se encuentra en algún sitio entre el sur de México,
Centroamérica, Costa Rica y noroeste de América del Sur en Brasil (CONABIO).
El primer registro de esta especie junto con su descripción botánica se realizó en las
costas de Panamá y Colombia en 1526 por el historiador Fernández de Oviedo (Jiménez, . 2002; Fundación Produce Chiapas y Instituto de Estudios Superiores de Monterrey
Campus Chiapas, 2003) .
1.2.1.3.1 DISPERSIÓN
La dispersión de la papaya por el hombre se logró mediante el transporte de las semi llas,
este proceso se inició aproximadamente en el siglo XIV cuando las primeras semillas son
llevadas de América a Asia (Filipinas, Malasia e India); después en el siglo XVII llegan a
Europa (Nápoles, Italia) y finalmente en el siglo XIX las semillas fueron introducidas a
Hawái y Florida (Fundación Produce Chiapas y Instituto de Estudios Superiores de
Monterrey Campus Chiapas, 2003) .
1.2.1.3.1.1 DISTRIBUCIÓN ACTUAL
Distribución global : C. papaya se distribuye ampliamente en las zonas tropicales de
América. Se ha naturalizado en África, Europa y Asia (Moreno, 1980).
Distribución en México: Se encuentra en casi todo el país: Baja California, Campeche,
Colima, Chiapas, Guerrero, Jalisco, Nayarit, Oaxaca, Puebla, San Luis Potosí, Sinaloa,
Tabasco, Tamaulipas, Veracruz y Yucatán (Moreno, 1980; CONABIO).
1.2.2 PAPAYA MARADOL (CARICA PAPAYA L. VAR., MARADOL)
La papaya Maradol es una variedad de origen cubano, desarrollada por Adolfo Rod ríguez
Rivera. El nombre de la variedad surge al unir parte de los nombres del creador y su
esposa (María Luisa Nodals Ochoa) Mar-, de María y -adol, de Adolfo (SEDER, 2007;
8
Capitulo 1
SAGARPA, 2005; Fundación Produce Chiapas y Instituto de Estudios Superiores de
Monterrey Campus Chiapas, 2003) .
Rodríguez , trabajó de 1938 a 1956 para lagar obtener esta nueva variedad. Iniciando con
la línea "Corralillo" trabajó mediante cruzas con otra línea Cubana para fijar las principales
características de ambas: un mesocarpio de gran espesor, sabor y olor y, finalmente en
1956 mediante autopolinización logra la variedad Maradol (Fundación Produce Chiapas y
Instituto de Estudios Superiores de Monterrey Campus Chiapas, 2003).
En 1978 se introdujeron a México por primera vez las semillas de esta variedad a través
de la CONAFRUT (Comisión Nacional de Fruticultura) a Xalapa , Ver. (SAGARPA, 2005).
1.2.2.1 CARACTERÍSTICAS DE CARICA PAPA YA L. VAR. MARADOL
Es una planta semi-enana, de tronco grueso, follaje exuberante y entrenudos cortos.
Presenta cinco tipos florales (SEDER, 2007) . Los frutos con mayor aceptación comercial
son los redondos procedentes de flores femeninas y con frutos ovalados de flores
hermafroditas (SAGARPA, 2005) . El exocarpo es amarillo-naranja-brillante el mesocarpo
color rojo-salmón. La pulpa o mesocarpio posee una concentración de 12% brix. En la
Maradol certificada prevalecen los frutos alargados con un peso que oscila entre 1.5 a 2.6
kg . por fruto.
Existen a la venta semillas certificadas de esta variedad que presentan una germinación
de 66% de plantas hermafroditas y 33% de plantas femeninas. Las plantas pueden iniciar
la producción a los siete meses y ser cosechadas a los ocho. Sí se logra un buen control
de las enfermedades es posible que una planta produzca todo el año (SEDER, 2007) .
1.2.2.1.1 CARACTERÍSTICAS COMERCIALES DEL FRUTO
1.2.2.1.1.1 PAPAYA COMO ALIMENTO
La papaya es un fruto que se consume ya sea fresco o procesado. Es ingrediente en
postres, ensaladas, salsas, platos fuertes y bebidas. Esta fruta también es utilizada en la
9
•
Capítulo 1
industria alimenticia para la elaboración de mermeladas, confituras, néctares,
concentrados, enlatados, congelados y fruta cristalizada.
1.2.2.1.1.1.1 CONTENIDO NUTRICIONAL
El fruto de la papaya contiene .:::_89% de su peso total en agua. En 1 OOg de papaya fresca
se consumen 39kcal, 0.07g de lípidos totales, 9.81 g de carbohidratos, 0.61 g de proteínas,
17 de los 20 aminoácidos conocidos y, además, contiene los 8 aminoácidos esenciales
para la nutrición humana (USDA, 2008) .
También contiene 15 vitaminas: un alto contenido de vitamina A, vitamina K y vitamina C,
¡3-criptoxantina, ¡3-caroteno, luteína + zeaxantina, y en menores proporciones se
encuentran folato (una forma del ácido fólico) , colina, vitamina E, Niacina (83) , ácido
pantoténico (85), riboflavina (82) , tiamina (81 ), Vitamina (86) (Jiménez, 2002; USDA,
2008) ; además contiene 1 O minerales: manganeso, cobre, zinc, hierro, sodio, fósforo ,
magnesio, calcio, potasio y selenio (USDA, 208) . Por lo que se le considera un excelente
alimento.
1.2.2.1.2 IMPORTANCIA ECONÓMICA
En la actualidad la papaya se cultiva en forma comercial en América, África , Asia y
Oceanía, siendo el continente Americano el de mayor importancia en cuanto a número de
países productores además de poseer la mayor producción anual total de este producto
(FAOSTAT, 2009a) (Cuadro 1.1).
Cuadro 1.1 Producción de Papaya por continente
Continente No. de paises productores Producción anual (Ton)
Africa 18 1 ,489,036
América 23 3,699,826 Asia 14 2,003,915
Oceanía 4 14,757 Datos generados a partir de los informes de la F AOST A T 2009 para el año 2007. Solo se consideraron países con producciones reportadas con por lo menos una tonelada anual (FAOSTAT, 2009a) .
10
•
Capitulo 1
México cultiva papaya en veinte estados de la República Mexicana, siendo Veracruz,
Chiapas, Yucatán , Oaxaca y Michoacán los cinco estados con mayor producción en
toneladas, mientras que Morelos, Baja California, Hidalgo, Estado de México y Yucatán
reportan los mayores ingresos económicos por el comercio de este fruto (SIAP, 2008).
Los productores mexicanos cultivan cinco variedades diferentes de papaya (Maradol, roja,
amarilla, hawaiana y criolla), sin embargo la variedad Maradol destaca en cuanto a su
importancia en producción y derrama económica como se puede apreciar en los datos del
Cuadro 1.2 (SIAP, 2008) .
Cuadro 1.2 Valor de la producción de las variedades de papayas en México (SIAP, 2008).
Variedad Sup. Sup. Producción Rendimiento PMR Valor Sembrada Cosechada Producción
Ha Ha Ton Ton/Ha ($/Ton) Miles MX$ Maradol 16,276.91 14,602.41 619,519.42 42.43 3,848.97 2,384,514.17 Roja 1,351.50 1,253.50 26,906.50 21.46 2,153.49 57,942.88 Amarilla 227.00 227.00 5,040.50 22.20 3,197.95 16,119.25 Hawaiana 154.00 66.00 1,299.10 19.68 5,424.71 7,047.24 Criolla 8.50 8.50 168.1 o 19.78 3,337.30 561 .00
El cultivo de papaya destaca entre los primeros diez frutales con importancia económica
para México. En 2007 la producción de papaya se tradujo en ingresos de cerca de MXN$2,
696, 882, 400 (SIAP, 2008). Ese mismo año, nuestro país produjo el 12,7% del total de la
producción mundial de papayas colocándose como el segundo productor de este fruto a
nivel mundial y ocupó el primer lugar en exportaciones también a nivel mundial , teniendo
como principales destinos de exportación: E.U.A, Canadá, España y Francia (FAOSTAT,
2009b) , a pesar de que los estándares de exportación para este fruto ostentan estrictas
normas de calidad como la USDA (USDA, 2008; SAGARPA, 2005) (en el caso de E.U.A.)
y la CODEX STAN 183-1993, REV. 1-2001 , EMD. 1-2005 (FAO/OMS, 2005) (de
apl icación inteARNcional).
1.2.2.2 COMERCIALIZACIÓN Y COSECHA DE CARICA PAPAYA
La comercialización de la papaya está influenciada enormemente por la presencia de
heridas mecánicas y la susceptibilidad de las papayas a enfermedades fúngicas (Kader,
11
•
Capitulo 1
2002). Si existe un mal manejo en el control de enfermedades en pre y post cosecha, esto
se traduce en elevadas pérdidas en la producción (SAGARPA, 2005). La papaya se
cosecha en estado verde maduro (Martínez y González, 2006; Kader, 2002) , después
sigue un proceso de selección y limpieza encaminado a eliminar los frutos con daños
(mecánico o por enfermedad) seleccionando así los frutos destinados para venta.
1.2.2.3 MEDIDAS GENERALES PARA EL CONTROL DE ENFERMEDADES
FÚNGICAS EN CAMPO
Para controlar las enfermedades fúngicas en papaya, se realizan aplicaciones abundantes
de fungicidas sobre toda la planta cada 7-10 días (en época de seca, reduciendo el
periodo de fumigación en época de lluvias), en México comúnmente se utilizan
benzimidazoles, strobilurinas, inhibidores del ergosterol, carbamatos, productos cúpricos y
azufre como fungicidas. Para evitar que los hongos desarrollen resistencia a los químicos
se acostumbra la rotación de fungicidas. Estos tratamientos químicos deben de ir
acompañados de un saneamiento de la planta eliminado hojas y pecíolos senescentes
además de la eliminación de los frutos infectados para eliminar en lo posible las fuentes
de contagio de estas enfermedades (SAGARPA, 2005) . Es importante señalar que la
papaya es susceptible a mostrar síntomas de fitotoxicidad ante altas dosis de estos
productos (SAGARPA, 2005; Kader, 2002).
1.2.2.4 MANEJO POSTCOSECHA DE CARICA PAPAYA VAR. MARADOL
El tratamiento post-cosecha es un punto crítico en la prevención de la aparición de
enfermedades en los frutos de papaya por lo que se dic"e que de este tratamiento
depende el éxito de la comercialización del fruto (Jiménez, 2002) .
Se basa en procesos físicos y químicos astringentes encaminados a eliminar la mayor
cantidad de patógenos de la superficie del fruto.
Se inicia con un choque térmico generado mediante agua, vapor o aire a altas
temperaturas y seguido de un baño en agua fría, después los frutos se sumergen en un
baño con Thiabendazole o Pochlorax. Inmediatamente después se aplica cera a la
superficie para disminuir la actividad fúngica para que finalmente el fruto sea irradiado con
12
•
Capitulo 1
rayos gamma producidos con una fuente de Cobalto 60. AlteARNtivamente existe un
tratamiento orgánico con el cual se aplican un conjunto de productos a base de extractos
de cítricos, ácidos grasos de palma africana, cera de abejas y cera CaARNuba (Jiménez,
2002).
Posteriormente, los frutos son empacados en envolturas individuales de espuma o papel
en cajas con fondo de espuma o cartón corrugado para disminuir las heridas por abrasión . y finalmente el almacenamiento en atmósferas controladas subsecuentes de 3-5% y de 5-
8% C02 (Kader, 2002) a temperaturas de 10 a 12.7 oc (Martínez y González, 2006) por
un periodo de 2-4 semanas (Kader, 2002).
1.2.3 ANTRACNOSIS
La enfermedad postcosecha más importante que afecta a C. papaya es llamada
antracnosis. El patógeno que produce esta enfermedad se encuentra en casi cualquier
lugar donde crezca C. papaya y puede ser la principal causa de pérdida de frutos
cultivados (Kader, 2002) .
Esta enfermedad es causada por el hongo Colletotrichum g/oeosporioides del que se
conocen sus dos etapas (Kader, 2002) :
Etapa sexual : G/omerella cingulata (Stonem.) Spauld. & Schr.
Etapa asexual: Colletotrichum gloeosporioides (Penz) Arz.
Se ha identificado que C. gloeosporioides posee una lista de sinonimias de alrededor de
600 binomiales debido a su naturaleza altamente variable, y posee un amplio rango de
huéspedes, incluyendo las hojas, ramas jóvenes ·y frutos de muchas especies (Kader,
2002). Además utiliza una amplia gama de estrategias para invadir a sus húespedes;
desde hemibiotropismo intracelular hasta subcuticular/intramural necrotrofia,
desarrollando una serie de estructuras infectivas especializadas ej . tubos germinales,
apresorios, peg de penetración, vesículas de infección, hifas primarias e hifas secundarias
(O 'Connell et al., 2000) .
13
•
Capitulo 1
1.2.3.1 CICLO DE VIDA DE COLLETOTRICHUM GLOEOSPORIOIDES
En C. papaya, el hongo C. gloeosporioides utiliza la necrotrofia como estrategia infectiva
(Chau y Alvarez, 1983). El establecimiento de Colletotrichum en C. papaya se puede
separar en 7 etapas. En la Figura 1.2 se muestra en el ciclo de vida de C. gloeosporioides
(Prusky et al. , 2000) .
1) Aterrizaje de la espora en la superficie de la planta: Para alcanzar la superficie de
su huésped, es decir los frutos de C. papaya, los conidios tienen que ser
dispersados por la lluvia, pues presentan una alta dependencia de ambientes
húmedos (Sommer, 2002).
2) Adherencia de la espora a la superficie de la planta: Después de que el conidio ha
aterrizado sobre un fruto, se adhiere a la cutícula (Sommer, 2002; O'Connell et al. ,
2000) . Los conidios requieren del contacto con una superficie dura de la cutícula
por cerca de dos horas, en este tiempo el conidio detectará y responderá a la
señal química del huésped (Prusky et al., 2000). La superficie de los conidios de
Colletotrichum presenta una capa exterior con fibrillas cortas arregladas
perpendicularmente a la pared celular, esta capa denominada abrigo de la espora,
posee una estructura esponjosa y porosa que está compuesta en su mayoría de
glicoproteínas. Algunas de estas glicoproteínas son liberadas y funcionan como
anclaje para unir inicialmente estas proteínas a la membrana plasmática. La
espora de C. gloeosporioides también segrega un exudado que se distribuye en
forma de halo desde el conidio formando una fina capa sobre el substrato.
3) GERMINACIÓN DE LA ESPORA: En esta etapa el conidio forma el tubo germinal , se
han reportado compuestos químicos de control en los conidios para evitar la
germinación en condiciones adversas, en Colletotrichum gloeosporioides se ha
reportado un tipo de alcaloide autoinhibidor de la germinación, sí es que no se dan
las señales químicas adecuadas del huésped (Kolattukudy et al., 2000).
4) FORMACióN DEL APRESORIO: Una vez germinado el conidio, el tubo germinal se
dobla y se diferencia en un apresorio melanizado (aproximadamente a las 24hr de
la inoculación) y se pueden llegar a formar hasta dos apresorios por cada conidio
14
•
Capitulo 1
germinado de C. gloeosporioides sobre C. papaya (Sommer, 2002; O'Connell et
al. , 2000; Chau y Alvarez, 1983).
7 fOitw.aóN 1)[
1 AJUUUlJ\1[ oc lA I:SI'ORII 2AOHI-K .. NOAOf- lA .. ~JilA
6 COWNilAOON OC lDS TUIOOS
.'i PfOFI RAllÓN llloOAIOS I>JIJOS
wrRUJO
Figura 1.2 Ciclo de vida de Colletotrichum gloeosporioides en Carica papaya L (Liberato, 2007;
Chau y Alvarez, 1983).
5) PENETRACIÓN HACIA LOS TEJIDOS DE LA PLANTA: Después de tres O cuatro días de la
inoculación del hongo (Chau y Alvarez, 1983) , C. gloeosporioides penetra la cutícula,
desde la base del apresorio forma una delgada extensión que penetra directamente la
cutícu la de la papaya (O'Connell, 2000; Chau y Alvarez, 1983), en ocasiones el
apresorio se encuentra en los estomas y penetra directamente hacia los tejidos del
fruto (Chau y Alvarez, 1983). Desde las primeras etapas de penetración, el desarrollo
intramural se asocia con una hinchazón extensiva y una. disolución de las células del
huésped. Las células colindantes permanecen vivas, pero los síntomas no aparecen
hasta 24h después de la penetración. Por lo que en _papaya la infección de este
hongo consta de una pequeña fase biotrófica o una fase necrotrófica benigna, en la
cual , los mecanismos de defensa del huésped no son inducidos y el hongo continúa
su ramificación intramural y penetración de las células del anfitrión. Este tipo de
infección no está asociado con la diferenciación de la hifa en primaria y secundaria
(O 'Connell , 2000).
15
•
Capitulo 1
6) LA COLONIZACIÓN DE LOS TEJIDOS DE LA PLANTA: El hongo comienza SU desarrollo por
debajo de la cutícula entre las paredes celulares periclinales y anticlinales de la
células epidérmicas (O 'Connell , 2000).
7) FORMACIÓN DE LAS LESIONES SEGUIDA DE LA ESPORULACIÓN: las etapas anteriores
suceden cuando el fruto se encuentra en estado inmaduro. Una vez que comienza a
madurar, se da un incremento en las concentraciones de etileno y un aumento en la . taza de respiración , creándose las condiciones ideales de crecimiento del hongo que
se disemina rápidamente a través de los tejidos, tanto intra como intercelularmente,
matando las células del fruto y disolviéndolas conforme avanza la infección y
comienza el desarrollo de las primeras lesiones, observándose unos pequeños
hundimientos aguañosos superficiales color café que pueden alcanzar un tamaño de
2.5 cm o más de diámetro (Sommer, 2002). En ocasiones se puede observar que
muchas lesiones crecen juntas para producir una lesión más grande compuesta, de
forma irregular (Sommer, 2002) y hundida conforme el desarrollo del hongo avanza
en el tejido del huésped (Chau y Alvarez, 1983).
En este estado de la infección, se pueden observar en las áreas centrales de la lesión
célu las parenquimatosas con hifas intracelulares y en las orillas materiales granulares
e hifas intracelulares (Chau y Alvarez, 1983) y aunque las lesiones se hunden,
usualmente no penetran hacia el tejido fresco (Sommer, 2002).
Un estroma micelial compacto, separa la cutícula del tejido colapsado de la fruta y la
cutícula, esta última capa se observa distendida hacia arriba (Chau y Alvarez, 1983).
Se producen conidios en acervulus en una matriz soluble en agua, allí las esporas
pueden permanecer inconspicuas en las lesiones (Somm.er, 2002) .
Durante la esporulación, la cutícula se rompe y las esporas son liberadas (Chau y
Alvarez, 1983), en la superficie se puede observar la formación de masas de esporas
color salmón, que en ocasiones toman la forma de un blanco de tiro. En esta etapa la
lesión puede permanecer de color café claro o salmón, pero se pueden toARNr negro
o café obscuro (Sommer, 2002) .
16
•
Capitulo 1
1.2.4 RESPUESTA DE LA PLANTA AL ATAQUE DE PATÓGENOS
Las plantas carecen de células móviles de defensa y un sistema inmune adaptativo que
les brinde una protección ante las enfermedades (Jones y Dangl, 2006; Odjakova y
Hadjiivanova; 2001-b), sin embargo, han desarrollado estrategias alteARNtivas que les
permitan responder al ataque de los microorganismos (Cao et al., 1997). Estas respuestas
comprenden la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS), metabolitos
secundarios antimicrobianos, producción de fitoalexinas, lignificación de la pared celular,
integración a la pared celular de compuestos fenólicos y proteínas específicas, además de
la producción de proteínas R (Odjakova y Hadjiivanova, 2001-a; Ligterink et al. , 1997;
Glazebrook et al., 1997). Cuando la célula vegetal detecta e identifica al patógeno,
enciende estas ,respuestas de defensa, que pueden ser de corto (respuesta hipersensible)
y largo plazo (resistencia sistémica adquirida) (Gachomo et al. , 2003) .
1.2.4.1 RECONOCIMIENTO DEL PATÓGENO
El reconocimiento de microorganismos en las plantas se lleva a cabo a nivel molecular. La
célula vegetal presenta en la membrana el equivalente a los sistemas de defensa de
animales: los receptores de membrana llamados receptores de patrones de
reconocimiento (PRR) que identifican los patrones moleculares asociados con los
patógenos (PAMP). Los PAMP son moléculas altamente conservadas entre las diferentes
clases de microorganismos (como la flagelina de las bacterias), por esta razón los PRR
son altamente específicos y sensibles en la identificación de los PAMP (Gohre y
Robatzek, 2008; Benet y Mackey, 2007) . Cuando los PRR son capaces de reconocer los
PAMP activan la inmunidad activada por los PAMP (PTI) confiriéndole a la planta una
resistencia basal evitando así la virulencia del patógeno y promoviendo la deposición de
callosa en la pared celular y la presencia de proteínas de defensa (Torto-Aialibo et al.,
2009; Benet y Mackey, 2007; Pieterse y Van Loon, 2004). Sí el patógeno no posee PAMP
y logra evadir la identificación de los PRR puede entrar en contacto directo con el
citoplasma de la célula vegetal por medio de un haustorio (en el caso de hongos), que
atraviesa la pared y membrana celulares y forma un canal de comunicación entre el
citoplasma del hongo y el citoplasma de la célula vegetal. El patógeno (hongo) secreta
proteínas hacia el huésped y estas proteínas cumplen la función de efectores (Torto-
17
•
Capitulo 1
Alalibo et al. , 2009) que son identificados directa o indirectamente (teoría de la guarda)
(lnnes, 2004) por las proteínas codificadas por los genes R, activando la inmunidad
activada por efectores (ETI) (Pieterse y Van Loan, 2004). Esta respuesta acelera y
amplifica las respuestas de la PTI (Bent y Mackey, 2007) , resultando en una resistencia a
la enfermedad que se acompaña por la respuesta hipersensible (HR).
1.2.4.2 HR: RESPUESTA HIPERSENSIBLE
La respuesta hipersensible (HR por sus siglas en inglés) se caracteriza por la presencia
de manchas café formadas por células muertas en el sitio de la infección e involucra una
forma compleja de muerte celular programada controlada directa o indirectamente por las
interacciones a nivel molecular entre el patógeno y la planta (Heat, 2000) . La muerte
celular limita el crecimiento del patógeno (de tipo bíotrofo) (Durrant y Dong, 2004; Pieterse
y Van Loan, 2004; Gachomo et al., 2003; Heat, · 2000) confinándolo dentro de la lesión
necrótica evitando que la infección se disperse al resto de la planta (Heat, 2000) .
Esta resistencia se encuentra controlada a nivel molecular por la presencia de genes de
resistencia específicos (R). La HR requiere que se encienda la resistencia gen por gen en
la cual los productos de los genes R que codifican proteínas de defensa reconocen directa
o indirectamente una amplia gama de genes avr y sus productos (sintetizados por los
patógenos) (lnnes, 2004; Gachomo et al., 2003; Cook, 1998) que promueven la activación
de proteínas que a su vez promueven la síntesis de aquellas proteínas que intervienen en
el aumento de resistencia de la planta al patógeno (Heat, 2000). La mayoría de los
procesos de muerte celular de la HR están acompañados por un incremento en la
biosíntesis de ácido salicílico (SA) , activación transcripcional de varios genes relacionados
con la patogénesis (PR) y el establecimiento de una respuesta de resistencia no
específica en toda la planta, produciendo una resistencia sistémica adquirida (Durrant y
Dong, 2004; Devadas y Raina, 2002) .
1.2.4.3 SAR: RESISTENCIA SISTÉMICA ADQUIRIDA
La resistencia sistémica adquirida (SAR por sus siglas en ingles) es el desarrollo de una
resistencia secundaria a infecciones en tejidos distantes (Durrant y Dong, 2004), fue
experimentalmente definida en 1961 en plantas de tabaco (Cao et al., 1994).
18
•
Capitulo 1
La SAR se activa por patógenos que causan muerte celular ya sea como parte de la HR o
como un síntoma de la enfermedad, una vez activada, la SAR otorga res istencia de larga
duración y es efectiva contra un amplio espectro de patógenos (Durrant y Dong, 2004;
Cao et al., 1997).
La SAR provoca alteraciones a nivel celular que incluyen: reforzamiento de la pared
celular, estimulación de rutas metabólicas secundarias de compuestos moleculares con
actividad antibiótica y reguladores de defensa como el ácido salicílico (SA) , etileno y
metabolitos lipídicos derivados (Gachomo et al., 2003) . Molecularmente, se caracteriza
por un incremento en la expresión de los genes PR (Cuadro 1.4) tanto en tejidos locales y
sistémicos (Durrant y Dong, 2004) . Esta activación de genes PR requiere de la presencia
de SA que actúa como señal (Martín et al. , 2003), esto se comprobó en tabaco y
Arabidopsis al aplicar SA exógeno y observar que inducia la acumulación de ARNm de
PR (Cao et al., 1994).
1.2.4.3.1 GENES DE RESISTENCIA
En Arabidopsis se han identificado 150 genes de resistencia (R) de la familia NBS-LRR y
40 de estos genes son específicos para diferentes líneas de patógenos. Posteriormente,
estos genes fueron aislados de 1 O especies vegetales tanto monocotiledóneas como
dicotiledóneas (lnnes, 2004).
Los genes R codifican cinco tipos de proteínas (Cuadro 1.3) clasificadas en base a sus
motivos estructurales: (1) aquellos con una región catalíticas de cinasa de serina/ treonina
y un motivo de miristilación en el N terminal , (2) proteínas con una región rica en
repeticiones de leucinas (LRRs) y un sitio que tiene la función de unirse al nucleótido
(NBS) y un N-terminal que funge como cierre de leucina (LZ) o secuencia coiled-coil (CC).
(3) es similar a la clase 2, pero en vez de tener una secuencia CC presentan una región
similar al N-terminal a las proteínas del receptor de lnterleucina y Toll (IL-1 R) , conocido
como región TIR, las proteínas de estas tres primeras clases se localizan
intracelularmente. (4) carecen de un NBS y presentan un dominio transmembranal (TB),
un LRR extracelular y una pequeña cola citoplasmática (5) posee un TM y LRR
extracelular además de una región cinasa de serina/treonina citoplasmático (Martin et al.,
19
•
Capitulo 1
2003) . Las proteínas que contienen el dominio NB-LRR otorgan resistencia a patógenos
virales, bacterianos, fúngicos e incluso nematodos y áfidos (lnnes, 2004) .
Cuadro 1.3 Clasificación de las proteínas de resistencia por su estructura
el Ejemplo
ase Proteína R Planta Patógeno Efector
2
3
Pto Tomate Pseudomonas syringae (B)
RPM 1 Arabidopsis P. syringae (8) Pi-ta Maíz Puccinia sorghi (H) RPS4 Arabidopsis P. syringae (8)
P Linaza M. lini (H) 4 Cf-2 Tomate Cladosporium fulvum (H) 5 Xa21 Arroz Xanthomonas oryzae (8)
AvrPto, AvrPto8
AvrRpm1 , Avr8 AVR-Pita
AvrRps4
Avr2
El tipo de patógeno se indica en paréntesis abreviado como: 8, bacteria ; H, hongo (Martín et al., 2003).
La síntesis de proteínas relacionadas con la patogénesis (PR por sus siglas en inglés) es
considerada como la segunda línea de defensa corriente abajo en la cascada de señales
(Gachomo et al., 2003) , estas proteínas presentan actividad sobre compuestos clave del
patógeno y se han clasificado en once familias de acuerdo a afinidades estructurales
(Cuadro 1.4). Los miembros de una misma familia poseen una actividad biológica similar
pero pueden variar substancialmente en propiedades claves como la especificidad del
substrato las propiedades fisicoquímicas o la localización celular.
Cuadro 1.4 Clasificación de las proteínas relacionadas con la patogénesis (PR) por su actividad.
Familia de proteína . . . Relacionada la patogénesis Act1v1dad Blanco en el Patogeno
PR-1
PR-2 PR-3 PR-4 PR-5 PR-6 PR-7 PR-8 PR-9 PR-10 PR-11
Sin clasificar
Precursor de la proteína 1 relacionada con la patogénesis
1 ,3-¡3-glucanasa Endoquitinasa Endoquitinasa
Osmotina lnhibidor de proteinasa
Proteínasa Endoquitinasa
Peroxidasa
Membrana
Glucano de la pared celular Quitina de la pared celular Quitina de la pared celular
Membrana ? ?
Quitina de la pared celular
ARNasa ARN del patógeno Endoquitinasa Quitina de la pared celular
a-Amilasa Glucano de la pared celular lnhibidor de poligalacturonasa Poligalacturonasa
* La peroxidasa ejerce una actividad antimicrobial indirecta al catalizar una oxidación cruzada de proteínas y fenoles en la pared celular y promoviendo el reforzamiento de una barrera física (Odjakova y Hadjiivanova, 2001-a) .
20
•
Capitulo 1
1.2.5 NPR1 (NO EXPRESIVO DE GENES PR-1)
En 1994 Cao et al., reportan por primera vez la caracterización de una mutante de
Arabidopsis npr1 (No expresivo de genes PR-1 ), esta mutante se identificó de un grupo de
plantas transformadas con el constructo BGL2-GUS y mutagenizadas con
etilmetanosulfonato (EMS) , posteriormente se seleccionaron aquellas que eran
insensibles a SA y ácido 2,6-dichloroisonicotinico (INA) . La mutante npr1 presenta las
características de ser no responsiva a INA y SA, tener una disminución en los niveles de
expresión tanto del gen PR5 en 5 veces y del gen PR1 en 20 veces en comparación con
la silvestre, por esta razón se le denomina a la mutante "no expresivo de genes PR-1"
(NPR1) y en 1997, se logró la identificación y aislamiento del gen NPR1 de Arabidopsis
(Cao et al. , 1997). El gen NPR1 también recibe el nombre de NIM1 (non-immunity 1)
(Ryals, 1997; Delaney et al., 1995) y SAL 1 (insensible al ácido sal icílico 1 por sus siglas
en inglés) (Shah, 1997).
NPR1 actúa como un regulador positivo de los genes de inducción a la respuesta de la
SAR (PR1, PR2 y PR5) (Cao et al., 1997; Delaney et al., 1995) y ensayos de sobre
expresión de este gen han producido fenotipos resistentes a patógenos (Cao et al. , 1997;
Lin et al. , 2004; Malnoy et al. , 2007; Makandar et al., 2006; Chern et al. , 2005; Fitzgerald
et al. , 2004) por los datos anteriores a NPR1 se le ha denominado gen maestro de la
S A R.
1.2.5.1 CARACTERÍSTICAS ESTRUCTURALES DE NPR1
N ~ ~"' ....... ., N ''" '' [ f ~ 1:.~
1 wlrl 1
ca BTB .-N ...,~ 2 ~ :!1:::!1:: :!1:::!1:: _.
zz zz C/1 <{<{ <{<{
Figura 1.3 Diagrama conceptual de la localización de los dominios y residuos característicos de la proteína NPR1 .
La proteína de NPR1 posee dos dominios de interacción proteína-proteína. El primero es
un dominio BTB/POZ (Broad-Complex, Tramtrack, Bric-a-brac/Poxvirus Zinc finger)
(Hepworth et al. , 2005; Liu et al. , 2005; Rochon et al. , 2006) que se encuentra en el N-
21
Capitulo 1
terminal. Este dominio es característico de proteínas de unión a actina y se sabe que este
tipo de domin ios están involucrados en la oligomerización de proteínas y en la formación
de heterodímeros, como es el caso de la proteína de dedos de Zinc de anemia de Falconi
(eollins et al., 2001 ), y funciona como substrato para ligasas de ubiquitina que son base
para el complejo eullin3 (Spoel et al. , 2009) . El segundo dominio característico presente
en la proteína de NPR1 es una serie de dominios ankyrin-repeat (Hepworth et al. , 2005;
Liu et al., 2005; eao et al., 1997) que le permiten interactuar con factores de transcripción
tipo 8-Zip (Zhang et al., 1999) (TGA2, TGA3, TGA5 y TGA6) (Rochon et al., 2006; Zhang
et al. , 1999). NPR1 presenta también, en el e-terminal un motivo fosfodegron tipo IKB
(eollins et al. , 2001 }, varios residuos de cisteina que controlan el estado de
oligomerización y la localización nuclear de la proteína (Rochon, 2006; Mou, 2003) ,
además, se ha identificado que la integridad de la e-terminal es importante para su
localización nuclear (Rochon et al., 2006; Kinkema et al., 2000).
1.2.5.2 INTERACCIONES DE NPR1 CON OTRAS PROTEÍNAS
NPR1 interactúa con varios factores de transcripción de dominios básicos de cierres de
leucina miembros de la subclase TGA (TGA2, TGA3, TGA5, TGA6 y TGA7) (Liu et al.,
2005; Kinkema et al., 2000), también interactúa con otros factores de transcripción como
los WRKY (Mao et al., 2007; Y u et al., 2003) . Algunos de estos genes WRKY son blancos
transcripcionales de NPR1 y otros actúan como reguladores de la expresión corriente
arriba del gen NPR1 (Mao et al., 2007; Wang et al., 2005; Yu et al. , 2003) . NPR1 también
interactúa con las proteínas denominadas NIMIN1 y NIMIN2 (uniéndose al e-terminal de
NPR1) (Weigel et al. , 2001), formando un complejo con NPR1 al que también se une una
proteína tipo TGA (Weigel et al. , 2005).
1.2.5.3 LOCALIZACIÓN CELULAR Y ACTIVACIÓN DE LA PROTEÍNA NPR1
La proteína NPR1 se puede encontrar en el citoplasma y núcleo de las células vegetales.
La localización nuclear es esencial para que la proteína NPR1 sea funcional y pueda
activar los genes PR (Kinkema et al., 2000) .
22
Capitulo 1
La proteína NPR1 se acumula en el citoplasma en su forma inactiva al agregarse en
oligómeros. Los niveles de acumulación de proteína NPR1 son regulados por los niveles
de ácido salicílico (SA) celular (Kinkema et al. , 2000) . El SA citoplasmático regula los
cambios de potencial redox de la célula, y estos cambios inducen la monomerización de
las proteínas NPR1 citoplasmáticos al romper los puentes disulfuro que unen el
oligómero. Una vez que NPR1 se encuentra en su forma monomérica o activada es que
puede ingresar al núcleo (Liu et al. , 2005; Dong, 2004; Pieterse y Van Loon, 2004) .
En células de plantas no inducidas por la presencia de patógenos y debido a los niveles
endógenos de SA, existe una monomerización basal de NPR1 que es translocado al
núcleo. Una vez dentro del núcleo el complejo Cullin3 se une a NPR1 y lo marca con
ubuiquitinas para ser degradado por el proteosoma (Figura 1.4), evitando que se inicie la
síntesis de las PR y la SAR (Spoel et al. , 2009).
En células de plantas inducidas (Figura 1.5) por la presencia de patógenos, se enciende la
HR que desencadenará la SAR. Se promueve un aumento de SA celular, aumentando la
taza de monomerización de NPR1, por ende aumenta el número de moléculas de NPR1
que se translocan al núcleo. En estas condiciones también se promueve la producción de
factores de transcripción tipo TGA. Una vez dentro del núcleo NPR1 se une con las
proteínas NI MIN (Weigel et al., 2001) y los factores de transcripción tipo TGA (Rochon et
al. , 2006) formando un enhanceosoma. Una vez formado este complejo el TGA se une
directamente al promotor del gen PR permitiendo la síntesis de los genes PR (Dong,
2004) y activando la SAR. Después de formar parte del enhanceosoma NPR1 es
inactivado al ser degrado por el proteosoma (Spoel et al., 2009).
23
•
Capitulo 1
Célula no inducida
--:==---_ Concentración basal s - •
deSA - s
S-~ ~· S / ~
Citoplásma
Núcleo
Figura 1.4 Diagrama que ilustra el proceso de degradación de la proteína NPR1 por el proteosoma en células no inducidas. La forma inactiva de NPR1 es un oligómero, de forma basal existe cierta acumulación endógena de SA dentro de la célula. El SA provoca el rompimiento de los puentes disulfuro del oligómero activando a NPR1 (monómero) . En esta forma NPR1 se transloca al núcleo donde interactúa con Cullin3 que ubiquitina a NPR1 resultando en .la degradación mediante proteosoma de la proteína de NPR1 y evitando con ello la activación de la expresión de los genes del SAR (Pieterse y Van Loon, 2004; Spoel et al., 2009).
24
•
e("
e(-
Célula inducida Jnteccu)n por el Patógeno
HR ¡
Acumulación de SA
Cambio de potencial 11edox
SH
CD HS
Capitulo 1
Figura 1.5. Diagrama que ilustra el proceso de activación y posterior degradación de la proteína NPR1. La forma inactiva de NPR1 es un oligómero. Cuando se produce un ataque por un patógeno , este ataque promueve la HR, la que a su vez inicia una acumulación de SA. El SA provoca un ambiente reductor en el citoplasma, rompiendo los puentes disulfuro del oligómero y activando a NPR1 (monómero) . En esta forma NPR1 se transloca al núcleo donde interactúa con la proteína NIMIN y factores de transcripción de la familia TGA, esta interacción aumenta la afinidad de los factores TGA a los promotores de genes PR, lo que trae como resultado la activación de la expresión de los genes del SAR. NPR1 se fosforila al interactuar el complejo de iniciación (C.I.) de la ARN polimerasa 11. La fosforilación de NPR1 promueve su degradación por el proteosoma (Spoel et al., 2009; Pieterse y Van Loon , 2004; Weigel et al., 2005).
25
Capitulo 1
1.2.5.4 FAMILIA DE GENES TIPO NPR1 DE ARABIDOPSIS
En Arabidopsis, NPR1 pertenece a una pequeña familia génica (Figura 1.6) que
comprende a otros cinco miembros NPR2, NPR3, NPR4, NPR5 y NPR6 (Zhang et al.,
2006; Hepworth et al., 2005; Liu et al., 2005).
NPR1 es el único gen de la familia que ha demostrado tener una función como regulador
positivo de la SAR y ser dependiente de SA (Malnoy et al., 2007; Makandar et al. , 2006;
Chern et al., 2005; Fitzgerald et al. , 2004; Lin et al. , 2004; Cao et al. , 1998). NPR3 y NPR4
al parecer son reguladores negativos de la SAR y no son dependientes de SA (Zhang et
al., 2006) . Los genes NPR5 y NPR6 poseen funciones en los patrones de desarrollo de
las zonas distal y proximal de la lámina de la hoja, en los patrones de simetría floral e
interviene en la regulación de la abscisión de este órgano. Tanto NPR5 como NPR6 no se
relacionan con la resistencia a patógenos (Hepworth et al. , 2005) .
NPR1 (At1 g64280) l NPR2(At4g26120)
NPR3(At5g45110) - NPR4(At4g1 9660)
NPRS(At2g41370) NPR6(At3g57130)
Figura 1.6. Árbol filogenético donde se muestran las relaciones existentes entre las seis secuencias tipo NPR 1 de A. thaliana (Hepworth et al. , 2005) .
1.2.5.5 EXPRESIÓN BASAL DE GENES TIPO NPR1
La presencia de la proteína NPR1 se identificó por primera vez a partir muestras de hojas
de plantas silvestres de Arabidopsis por el grupo de Cao en 1998. Cinco años después se
realiza el primer reporte sobre la identificación del gen parálogo denominado BOP1
(Biade-On-Petiole1) o NPR5 (Ha et al., 2004) , seguido por los genes NPR4 (Liu et al.,
2005), NPR6 (Hepworth et al., 2005) y NPR3 (Zhang et al. , 2006) . Aproximadamente una
década después de la identificación de la proteína NPR1 en Arabidopsis comienzan los
26
Capitulo 1
reportes sobre la identificación mediante detección de expresión por RT-PCR de los
ortólogos de NPR1 en manzana (Malnoy et al., 2007), uva Chardonnay (Moroldo et al.,
2008) y soya (Sandhu et al. , 2009) .
Cuadro 1.5. Reportes de expresión basal de los genes tipo NPR1
Tipo de Técnica de Tejidos analizados . Planta . . . . . Referencia
gen 1dentlf1cac1on Presente Ausente
NPR1
NPR4 NPR4* y NPR3* NPR5
Arabidopsis Arabidopsis Arabidopsis Manzana Uva Chardonay Soya
Arabidopsis Arabidopsis
Arabidopsis
Inmune Blot Western Blot Inmune Blot RT-PCR RT-PCR RT-PCR
Northern blot RT-PCR en tiempo real RT-PCR
Hoja Hoja Hoja Hoja Hoja Hoja joven Hoja madura Tallo Flor Vaina inmadura Raíz Hoja Hoja
Ápice de la planta Hoja joven Hoja madura Peciolo Nodo
:otiledón Hojas caulinares Internado Pedicelo Silícula
Bulbo floral Raíz Flor
NPR5 y Arabidopsis RT-PCR Hoja NPR6 Tallo
Ápice Flor Raíz
• Expresión relativa en relación con actina endógena.
1.2.5.6 BIOTECNOLOGÍA DE NPR1
Ca o et al., 1998 Kinkema et al., 2000 Mou et. al., 2003 Malnoy et al., 2007 Moroldo et al. , 2008 Sandhu et al., 2009
Liu et al. , 2005 Zhang et al., 2006
Ha et al., 2004
Hepworth et al., 2005
El gen NPR1 ha sido utilizado en estudios de sobrexpresión constitutiva en cinco
diferentes especies (Cuadro 1.6). Los resultados de la sobrexpresión de este gen en
Arabidopsis (Cao et al. , 1998), trigo (Fitzgerald et al., 2004), tomate (Lin et al., 2004) y
manzana (Malnoy et al., 2007) han permitido llegar a la conclusión de que el aumento en
el número de copias de NPR1 aumenta la resistencia a bacterias y hongos. En el caso
particular de la sobre expresión de NPR1 en arroz, donde se observa un incremento en la
resistencia a bacterias, aunque se produce un efecto pleitropico, este efecto se origina
27
•
Capitulo 1
debido a los niveles constitutivamente altos de SA presentes en esta especie (Fitzgerald
et al., 2004; Chern et al., 2005) .
Cuadro 1.6 Estudios de sobrexpresión del gen NPR1 en diferentes especies.
Especie Patógeno Fenotipo Fuente
Arabidopsis thaliana Psm ES4526 Resistente Cao et al. , 1998
Peronospora parasitica Resistente
Oriza sativa Xanthomonas oryzae pv oryzae Resistente/ Fitzgerald et al. , 2004 pleiotropía •
Solanum lycopersicum Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici
Resistente Lin et al., 2004 Stemphylium solani Phytophthora infestans Resistente X campestris pv. Vesicatoria
Resistente Ralstonia solanacearum Cucumber Mosaic Virus (CMV) Tomato Mosaic Virus (ToMV) Tomato Yellow Leaf Curl Virus (TYLCV)
Oriza sativa X oryzae pv oryzae Resistente/ Chern et al., 2005 pleiotropía
Triticum sp. F. grminearum Resistente Makandar et al. , 2006
Maluspumila Venturia inaequalis Resistente Malnoy et al., 2007
Erwinia amylovora Resistente Gymnosporangium juniperi-virginianae Resistente
1.2.5.7 GENES TIPO NPR1 EN OTROS GENOMAS
El potencial que el gen NPR1 ha presentado para el mejoramiento genético, promovió la
búsqueda de genes tipo NPR1 durante la caracterización funcional de los genomas a
secuenciar. Los genomas que hasta el momento han incluido la predicción de la presencia
de genes tipo NPR1 dentro reportes de su estructura genómica son : Arabidopsis,
Populus, arroz y uva. En el cuadro Cuadro 1.7 se detalla esta información .
Cuadro 1.7 Presencia de proteínas tipo NPR1 predichas en genomas secuenciados.
p t - r Proteínas Tamaño del Especie N;~1ema~-
1 ~0 codificantes genoma Referencias Bibliográficas pre •c as predichas (Mb)
Arabidopsis thaliana 6 25,498
Populus trichocarpa 5 45,555
Vitis vinifera 2 30,434
Oryza sativa 5 37,544
* Reportes sobre la identificación de genes de defensa. ** Reportes sobre la identificación de genes tipo NPR1 .
125
485
-488
389
The Arabidopsis Genome lniciative, 2005
Tuskan et al., 2006
Jaillon et al. , 2007 Henanf et al. , 2009** M o roldo et al. , 2008*
Y u et al. , 2002; Goff et al., 2002
Yuexing et al., 2007**
28
Capitulo 1
1.2.5.8 NPR1 EN CARICA PAPAYA
El grupo de Zhu et al. , (Zhu et al., 2003) estudió el efecto del BTH sobre la SAR en C.
papaya var. Sun Up retada con P. palmivora. El BTH fue aplicado como un pretratamiento
previo a la inoculación con las esporas del hongo, y se evaluó la expresión de los genes
PR1 y de la proteína NPR1 en C. papaya después de ser tratada con BTH. Estos
resultados fueron comparados con patrones de inducción de NPR1 en Arabidopsis,
concluyendo que el BTH induce la SAR y el incremento del ARNm de dos genes PR1 . El
grupo reportó cuatro exones y tres intrones para el gen NPR1 de papaya (los intrones en
la misma posición que Arabidopsis) y la secuencia parcial del ADNc de CpNPR1 en
GenBank (CF588412 y AY548108) .
Ese mismo grupo en 2007 (Zhu et al., 2007), reportó en una memoria de congreso, haber
realizado la sobrexpresión constitutiva del promotor CaMV35S para dirigir la expresión de
NPR1 en C. papaya con AtNPR1 y CpNPR1 por infiltración biobalística, obteniendo
plantas transformadas retándolas contra P. palmivora, resultando en un ligero aumento en
la expresión de NPR1 y del gen PR-1 . Hasta el momento no ha habido nuevos reportes al
respecto.
29
•
Capitulo 1
1.3 HIPÓTESIS
El gen NPR1 de Arabidopsis thaliana pertenece a una pequeña familia de seis miembros,
y se ha comprobado también la presencia de genes homólogos tipo NPR1 en otras
especies que presentan expresión basal en varios tejidos analizados.
Por lo tanto es probable que en Carica papaya existan genes homólogos a AtNPR1 que
también formen parte de una pequeña familia génica cuyos miembros presenten
expresión basal en diferentes tejidos de la planta.
1.4 OBJETIVOS
1.4.1.1 GENERAL
Caracterizar la estructura y expresión basal de los genes tipo NPR1 de C. papaya L.
1.4.1.2 PARTICULARES
a) Caracterizar in si/ico la estructura de genes tipo NPR1 de Carica papaya L. var Sun
U p.
b) Evaluar los patrones de expresión basal de genes tipo NPR1 de Carica papaya L. ,
var. Maradol.
30
•
Capitulo 1
1.5 ESTRATEGIA EXPERIMENTAL GENERAL
La estrategia experimental general de este trabajo se resume en el Cuadro 1.8
Aislamiento in si/ico de genes tipo NPR1 a partir de la secuencia
genómica de C. papaya var S un Up utilizando el programa
TBLASTN y la secuencia NPR1 de Arabidopsis thaliana como referencia.
! Predicción de marcos de lectura abiertos que correspondan a genes tipo NPR1 utilizando el programa FGENESH
~ Análisis comparativo mediante Diseño de oligos específicos
alineamientos CLUST ALX para cada secuencia tipo NPR1
! identificada
1 Análisis filoqenético 1
Evaluar los patrones de expresión de las secuencias tipo NPR1 de C. papaya var Maradol en diferentes
tejidos de la planta: peciolo, hoja, flor, fruto
Cuadro 1.8 Estrategia experimental para la caracterización estructural y expresión basal de genes
tipo NPR1 de Carica papaya L., var. Maradol.
31
•
Capitulo 1
1.6 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Bent A. F. y D. Mackey. (2007). Elicitors, Effectors, and R Genes: the new paradigm anda
lifetime supply of questions. Annual Review of Phytopathology 45,399-436.
Cao H., J. Glazebrook, J.D. Clarke, S. Volko y X. Dong. (1997) . The Arabidopsis NPR1
gene that controls systemic acquired resistance encodes a novel protein containing
ankyrin repeats. Cell. 88(1),57- 63.
Cao H. , S.A. Bowling, A.S . Gordon y X. Dong. (1994). Characterization of an Arabidopsis
mutant that is nonresponsive to inducers of systemic acquired resistance. The Plant
Cell , 6 (11),1583-1592.
Cao H., X. Li y D. Xinnian. (1998). Generation of broad-spectrum disease resistance by
overexpression of an essential regu latory gene in systemic acquired resistance.
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America
(PNAS), 95, 6531-6536.
Chau K. F y A.M . Alvarez. (1983) A historical study of Anthracnose on Carica papaya.
Phytopathology 73, 1113-1116.
Chen, C., Q. Yu, S. Hou, Y. Li, M. Eustice, R.L. Skelton, O. Veatch , R.E. Herdes, L.
Diebold, J. Saw, Y. Feng, W. Qian, L. Bynum, L. Lei, L. Wang, P.H . Moore, R.E.
Paull, M. Alam y R. Ming. (2007). Construction of a Sequence-Tagged High-Density
Genetic Map of Papaya for Comparative Structural and Evolutionary Genomics in
Brassicales. Genetics 177, 2481-2491 .
Chern M., H.A. Fitzgerald, P.E. Canlas, D.A. Navarre y P.C. Ronald. (2005) .
Overexpression of a rice NPR1 homolog leads to constitutive activation of defense
response and hypersensitivity to light. Molecular Plant-Microbe lnteractions (MPMI) ,
18 (6), 511-520.
Collins T. , J.R. Stone y A.M. Williams. (2001). MINIREVIEW: All in the family : the
BTB/POZ, KRAB, and SCAN Domains. Molecular and Cellular Biology, 21 (11 ),
3609-3615.
CONABIO. Carica papaya. Disponible en: http://www.conabio.gob.mx/conocimiento/
info_especies/arboles/doctos/23-caric1 m.pdf.
Cook R.J. (1998). The molecular mechanisms responsible for resistance in plant
pathogen interactions of the gene-for-gene type function more broadly than
32
•
Capitulo 1
previously imagined. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United
States of America (PNAS}, 95, 9711-9712.
Delaney T.P. , L. Friedrich y J.A. Ryals. (1995). Arabidopsis signa! transduction mutant
detective in chemically and biologically induced disease resistance. Proceedings of
the National Academy of Sciences of the United States of America (PNAS}, 92,6601-
6606.
Devadas S. K. y R. Raina. (2002). Preexisting systemic acquired resistance suppresses
hypersensitive response-associated cell death in Arabidopsis hr/1 mutant. Plant
Physiology, 128,1234-1244.
Dong X. (2004). NPR1, all things considered. Current Opinion in Plant Biology, 7(5), 547-
552.
Durrant W.E. y X. Dong. (2004) . Systemic Acquired Resistance. Annual Review of
Phytopatology, 42,185-209.
FAO/OMS. (2005). Norma del Codex para la papaya (CODEX STAN 183-1993).
Disponible en: http:/ /www. codexalimentarius. net/down load/standards/314/
CXS_183s.pdf.
FAOSTAT. (2009) FAO dirección de estadística 2009. Palabras clave: Papayas, México,
Wold > (List) , 2007. http://faostat.fao.org/site/567/desktopdefault.aspx?pageid=567#
ancor.
FAOSTAT. (2009a) Índices de producción. Palabras clave: Papayas, México, Wold >
(List} , 2007. Disponible en: http://faostat.fao.org/site/612/default.aspx#ancor.
FAOSTAT. (2009b) . TradeSTAT. Palabras clave: Papayas, México, Wold > (List} , 2007.
Disponible en : http://faostat.fao.org/site/535/default.aspx#ancor.
Fitzgerald H.A., M. Chern , R. Navarre y P.C. Ronald . (2004) . Overexpression of (At)NPR1
in rice leads toa BTH- and environment-induced "lesion-mimic/cell death phenotype.
MPMI, 17(2),140-51.
Fundación Produce Chiapas e Instituto de Estudios Superiores de Monterrey Campus
Chiapas. (2003). Cadena Agroalimentaria de la papaya Maradol, Programa
estratégico de necesidades de Investigación y Transferencia de Tecnología del
estado de Chiapas. Disponible en: http://www.cofupro.org .mx/Publicacion/
Arch ivos/pen it4 7. pdf.
33
•
Capitulo 1
Gachomo E.W., 0.0. Shonukan y S.O. (2003) . The molecular initiation and subsequent
acquisition of disease resistance in plants. African JouARNI of Biotechnology, 2
(2) ,26-32 .
Glazebrook J., E.E. Rogers y F.M. Ausubel. (1997) . Use of Arabidopsis for Genetic
Dissection of Plant Defense Responses. Annual Review of Genetics, 31 : 547--69.
Goff S.A. , D. Ricke, T. Lan, G. Presting, R. Wang, M. Dunn, J. Glazebrook, A. Sessions,
P. Oeller, H. Varma, D. Hadley, D. Hutchison, C. Martin , F. Katagiri , B.M. Lange, T.
Moughamer, Y. Xia, P. Budworth, J. Zhong, T. Miguel, U. Paszkowski, S. Zhang, M.
Colbert, W. Sun, L. Chen, B. Cooper, S. Park, T.C. Wood, L. Mao, P. Quail , R. Wing,
R. Dean, Y. Yu , A. Zharkikh, R. Shen, S. Sahasrabudhe, A. Thomas, R. Cannings,
A. Gutin, D. Pruss, J. Reid, S. Tavtigian , J. Mitchell, G. Eldredge, T. Scholl, R.M.
Miller, S. Bhatnagar, N. Adey, T. Rubano, N. Tusneem, R. Robinson , J. Feldhaus, T.
Macalma, A. Oliphant y S. Briggs. (2002). A draft, sequence of the rice genome
(Oryza sativa L. ssp. Japonica). Science 296(5565), 92-1 OO.
Góhre V. y S. Robatzek. (2008). Breaking the barriers: microbial effector molecules
subvert plant immunity. Annual Review of Phytopathology 46,189-215.
Ha C.M. , J.H. Jun , H.G. Nam, J.C. Fletcher y T.B. Bop (2004). Blade-on-petiole1 encodes
a BTB/Poz domain protein required for leaf morphogenesis in Arabidopsis tha/iana,
Plant cell physiology, 45(10),1361-1370.
Heat M.C. (2000) . Hypersensitive response-related death. Plant Molecular Biology,
44(3),321-334.
Henanff G.L., T. Heitz, P. Mestre, J. Mutterer, B. Walter y J. Chong. (2009).
Characterization of Vitis vinífera NPR1 homologs involved in the regulation of
pathogenesis-related gene expression. BMC Plant Biology, 9: 54.
Hepworth S.R. , Y. Zhang, S. Mckim, X. Li y G.W. Haughn. (2005) . Blade-On-Petiole
dependent signaling controls leaf and floral patterning in Arabidopsis. The Plant Cell ,
17,1434-1448.
lnnes R.W. Guarding the goods. (2004) . New insights into the central alarm system of
plants. Plant physiology, 135,695-701.
ITIS (lntegrated Taxonomic lnformation System). Carica papaya L. Palabras clave: Carica
papaya. Disponible en: http://www.itis.gov/.
Jaillon 0. , J. Aury, B. Noel, A. Policriti , C. Clepet, A. Casagrande, N. Choisne, S. Aubourg ,
N. Vitulo, C. Jubin, A. Vezzi, F. Legeai, P. Hugueney, C. Dasilva, D. Horner, E. Mica,
34
Capitulo 1
D. Jublot, J. Poulain , C. Bruyére, A. Billault, B. Segurens, M. Gouyvenoux, E.
Ugarte, F. Cattonaro, V. Anthouard, V. Vico, C.D. Fabbro, M. Alaux, G.D. Gaspero,
V. Dumas, N. Felice, S. Paillard , l. Juman, M. Moroldo, S. Scalabrin, A. Canaguier,
I. L. Clainche, G. Malacrida, E. Durand, G. Pesole, V. Laucou, P. Chatelet, D.
Merdinoglu, M. Delledonne, M. Pezzotti, A. Lecharny, C. Scarpelli, F. Artiguenave,
M.E. Pé, G. Valle, M. Morgante, M. Caboche, A. Adam-Biondon , J. Weissenbach, F.
Quétier y P. Wincker. (2007) The grapevine genome sequence suggests ancestral
hexaploidization in majar angiosperm phyla. Nature 449, 463-467.
Jiménez, D.J.A. (2002). Manual práctico para el cultivo de la papaya Hawaiana. EARTH.
108.
Jones J.D.G. y J.L. Dangl. (2006) . The plant immune system (Review). Nature 444 (16),
323-329.
Kader A.A. , N.F Sommer y M.L. Arpaia. (2002) . Postharvest Handling Systems: Tropical
Fruits. En : Postharvest technology of horticultura/ crops. Kader, AA y Adaskaveg ,
J. E. (eds). Oakland, Calif: University of California, Division of Agriculture and Natural
Resources, 3311 (31 ), 385-398.
Kinkema M., W. Fan y X. Dong. (2000) . Nuclear localization of NPR1 is required for
activation of PR gene expression. The Plant Cell, 12, 2339-2350.
Kolattukudy P.E., Y-K Kim, D. Li , Z. Mei y L. Rogers. (2000) . Ear/y molecular
communication between Colletotrichum globesporioides and its host. Cap. 6. En:
Colletotrichum: Host Specificity, Pathology and Host-Pathogen lnteraction. D.
Prusky, S. Freeman, M. Dickman (eds). American Phytopathologica/ Society Press,
57-77pp.
Liberato JR (2007) Papaya Anthracnose (Colletotrichum gloeosporioides) Pest and
Diseases lmage Library. Updated on 1/10/2007 "11 :11 :15 PM . Disponible en:
http://www.padil .gov.au/viewPestDiagnosticlmages.aspx?id=383.
Ligterink W., T. Kroj, U. Nieden y H. Hirt. (1997). Receptor-mediated activation of a map
kinase in pathogen defense of plants. Science, 276(5321 ), 2054 - 2057.
Lin W.C., C.F. Lu, J.W. Wu, M.L. Cheng, Y.M. Lin , N.S. Yang, L. Black, S.K. Green , J.F.
Wang y C.P. Cheng. (2004). Transgenic tomato plants expressing the Arabidopsis
NPR1 gene display enhanced resistance to a spectrum of fungal and bacteria!
diseases. Transgenic Research , 13(6),567-581.
35
•
Capitulo 1
Liu G., E.B. Holub, J.M. Alonso, J.R. Ecker y P.R. Fobert. (2005). An Arabidopsis NPR1-
Iike gene, NPR4, is required for disease resistance. The Plant JouARNI 41 (2),304-
318.
Makandar R., J.S. Essig, M.A. Schapaugh, H.N. Trick y J. Shah. (2006) . Genetically
engineered resistance to fusarium head blight in wheat by expression of Arabidopsis
NPR1. Molecular Plant-Microbe lnteractions (MPMI), 19(2),123-129.
Malnoy M., Q. Jin, E.E. Borejesza-Wysocka, S.Y. He y H.S. Aldwinckle. (2007).
Overexpression of the apple MpNPR1 gene confers increased disease resistance in
malus x. Domestica. Molecular Plant-Microbe lnteractions (MPMI), 20(12) ,1568-
1580.
Mao P., M. Duan , C. Wei y Y. Li. (2007). WRKY62 transcription factor acts downstream of
cytosolic NPR1 and negatively regulates jasmonate-responsive gene expression.
Plant and Cell Physiology, 48(6) , 833-842.
Martin G.B., A.J. Bogdanove y G. Sessa. (2003) . Understanding the functions of plant
disease resistance proteins. Annual Reviewd of Plant Biology, 54,23-61.
Martínez C.M. H. y Y. A. González. (2006) Tecnología del manejo poscosecha de la
papaya (Carica papaya) para el mercado fresco. Centro Agrícola 33(2), 43-48.
Ming R., S. Hou , Y. Feng, Q. Yu, A. Dionne-Laporte, J.H. Saw, P. Senin , W. Wang , B.V.
Ly, K.L. ,T. Lewis, S.L. Salzberg, L. Feng, M.R. Jones, R.L. Skelton , J.E. Murray, C.
Chen , W. Qian, J. Shen, P. Du, M. Eustice, E. Tong, H. Tang, E. Lyons, R.E. Paull ,
T.P. Michael , K. Wall , D.W. Rice, H. Albert, M. Wang, Y.J. Zhu , M, Schatz, N.
Nagarajan, R.A. Acob, P. Guan, A. Bias, C.M. Wai, C.M. Ackerman, Y. Ren , C. Liu ,
J. Wang, J. Wang, J. Na, E.V. Shakirov, B. Haas, J. Thimmapuram, D. Nelson, X.
Wang, J.E. Bowers, A.R. Gschwend, AL. Delcher, R. Singh, J. Y. Suzuki, S.
Tripathi , K. Neupane, H. Wei, B. lrikura, M. Paidi , N. Jiang, W. Zhang, G. Presting,
A. Windsor, R. Navajas-Pérez, M. J. Torres, F. A. Feltus, B. Porter, Y. Li , A. M.
Burroughs, M. Luo, L. Liu , D. A. Christopher, S.M . Mount, P.H. Moore, T. Sugimura,
J. Jiang, M.A. Schuler, V. Friedman, T. Mitcheii-Oids, D.E. Shippen, C.W.
dePamphilis, J.D. Palmer, M. Freeling, AH. Paterson, D. Gonsalves, L. Wang y M.
Alam. (2008). The draft genome of the transgenic tropical fruit tree papaya (Carica
papaya Linnaeus). Nature 452, 991-997.
Moreno, N. (1980) . Caricácea. Flora de Veracruz. 10,1-17.
36
•
Capitulo 1
Moroldo M., S. Paillard, R. Marconi, L. Fabrice, A. Canaguier, C. Cruaud, V.O. Berardinis,
C. Guichard, V. Brunaud, I.L. Clainche, S. Scalabrin, R. Testolin, G.D. Gaspero, M.
Morgante y A. Adam-Biondon . (2008). A Pysical map of the heterozygous grapevine
'Cabernet Sauvignon ' allows mapping candidate genes for disease resistance. BMC
Plant Biology, 8(66) ,1-14.
Mou Z. , W. Fan, X. Dong y N. Carolina. (2003). lnducers of plant systemic acquired
resistance regulate NPR1 function through redox changes. Cell , 113(7),935-944.
o ·connell R. , S. Perfect, S. Hughes, R. Carzaniga, J. Bailey y J. Green. (2000).
Dissecting the Ce// Biology of Colletotrichum lnfection Processes. Cap. 5. En:
Colletotrichum: Host Specificity, Pathology and Host-Pathogen lnteraction. Prusky
D., Freeman S. y Dickman M. (eds). American Phytopathological Society Press, St.
Paul, 57-77.
Odjakova M. y C. Hadjiivanova. (2001 ). Review: The Complexity of Pathogen Defense in
Plants. Bulgarian JouARNI of Plant Physiology, 27(1-2), 101-109.
Pieterse C.M.J. y L.C. Van Loon. (2004). NPR1 : the spider in the web of induced
resistance signaling pathways. Current Opinion in Plant Biology, 7(4), 456-464.
Prusky D. , l. Kobiler, R. Ardi , D. Beno-Moalem, N. Yakoby y N.T. Keen. (2000).
Resistance mechanisms of Subbtropical Fruits to Col/etotrichum gloesporioides. Cap
14. En: Colletotrichum: Host Specificity, Pathology and Host-Pathogen lnteraction.
D. Prusky, S. Freeman y M. Dickman (eds). American Phytopathological Society
Press, 232-244.
Rochon A. , P. Boyle, T. Wignes, P.R. Fobert y C. Després. (2006). The coactivator
function of Arabidopsis NPR1 requires the core of its BTB/POZ domain and the
oxidation of e-terminal cysteines. The Plant Cell, 18,3670-3685.
Ryals J., K. Weymann, K. Lavvton, L. Friedrich, D.· Ellis, H. Steiner, J. Johnson, T.P.
Delaney, T. Jesse, P. Vos y S. Uknesa. (1997). The Arabidopsis NIMI Protein Shows
Homology to the Mammalian Transcription Factor lnhibitor IKB. The plant cell, 9,425-
439.
SAGARPA (Secretaria de Agricultura, Ganadería, Desarrollo Rural, Pesca Y
Alimentación). (2005) Plan Rector Sistema Nacional Papaya. Segunda fase:
Diagnóstico inicial base de referencia estructura estratégica, México D.F., 46p.
37
•
Capitulo 1
Sandhu D., I.M. Tasma, R. Frasch y M.B. Bhattacharyya. (2009) . Systemic Acqu ired
Resistance in soybean is regulated by two proteins, orthologous to Arabidopsis
NPR1 . BMC Plant Biology, 9,1 05.
SEDER (Secretaría de Desarrollo Rural). (2007). Paquete tecnológico papaya marado/ en
la mixteca poblana. Gobierno del estado de Puebla. Disponible en:
http://www .sdr.gob.mx/beta 1 /contenidos/CadenasAgropecuarias/docs/51 0148.235.1
38.1327-07 -2007PAPAYA %20MARADOL.pdf.
Shah J., F. Tsu i y D.F. Klessig . (1997). Characterization of a salicylic acid-insensitive
mutant (sai1) of Arabidopsis thaliana identified in a selective screen utilizing the SA
inducible expression of the tms2 gene. Molecular Plant-Microbe lnteractions (MPMI) ,
1 0(1 ),1 069-78.
Shearer H.L. , L. Wang, C. Delong , C. Després y P.R. Fobert. (2009) . NPR1 enhances the
DNA binding activity of the Arabidopsis bZIP transcription factor TGA7 1 óRedox.
Botany 87,561-570.
SIAP (Servicio de Información Agroalimentaria y Pesquera). (2008) . Anuario Estadístico
de la Producción Agrícola. PRODUCCION AGRICOLA: Ciclo: Cíclicos y Perennes
2007. Modalidad: Riego + Temporal. Resumen Cultivos Disponible en:
http://www.siap.gob.mx/ventana.p hp?idliga=1 042&tipo=1 .
Sommer N.F. , R. J. Fortlage y D.C. Edwars. (2002) Postharvest diseases of se/ected
commodities. En : Kader, AA y Adaskaveg, J.E. (eds). Postharvest technology of
horticultura/ crops. Oakland, Calif: University of California, Division of Agriculture and
Natural Resources. Vol. 3311 . Cap. 18. 117-160p.
Spoel S.H. , Z. Mou, Y. Tada, N.W. Spivey, P. Genschik y X. Dong. (2009) . Proteasome
mediated turnover of the transcription coactivator NPR1 plays dual roles in regulating
plant immunity. Cell , 137(5), 860-872.
The Arabidopsis Genome lnitiative (2000). Analysis of the genome sequence of the
flowering plant Arabidopsis thaliana . Nature 408 (6814) , 796-815.
Torto-Aialibo T. , C.W. Collmer, M. Lindeberg , D. Bird , A. Collmer y B.M. Tyler. (2009).
Common and contrasting themes in host cell-targeted effectors from bacteria!,
fungal , oomycete and nematode plant symbionts described using the Gene
Ontology. BMC Microbiology, 9 (Suppl1) , S3.
38
•
Capitulo 1
Tropicos. (2008) . Carica papaya L. : Specimens. 09 de Noviembre. Palabras clave: Carica
papaya L. Disponible en: http://www.tropicos.org./NameSpecimens.aspx?nameid=
6100032.
Tuskan G. A. , S. Difazio, S. Jansson, J. Bohlmann, l. Grigoriev, U. Hellsten , N. Putnam, S.
Ralph , S. Rombauts, A. Salamov, J. Schein , L. Sterck, A. Aerts , R. R. Bhalerao, R.
P. Bhalerao , D. Blaudez, W. Boerjan , A. Brun , A. Brunner, V. Busov, M. Campbell, J.
Carlson, M. Chalet, J. Chapman, G.-L. Chen , D. Cooper, P. M. Coutinho, J.
Couturier, S. Covert, Q . Cronk, R. Cunningham, J. Davis, S. Degroeve, A. Déjardin,
C. Depamphil is, J. Detter, B. Dirks, l. Dubchak, S. Duplessis, J. Ehlting, B. Ellis, K.
Gendler, D. Goodstein, M. Gribskov, J. Grimwood, A. Groover, L. Gunter, B.
Hamberger, B. Heinze, Y. Helariutta, B. Henrissat, D. Holl igan, R. Holt, W. Huang, N.
lslam-Faridi , S. Jones, M. Jones-Rhoades, R. Jorgensen, C. Joshi, J. Kangasjarvi, J.
Karlsson , C. Kelleher, R. Kirkpatrick, M. Kirst, A. Kohler, U. Kalluri, F. Larimer, J.
Leebens-Mack, J.-C. Leplé, P. Locascio, Y. Lou , S. Lucas, F. Martin, B. Montanini,
C. Napoli , D. R. Nelson , C. Nelson, K. Nieminen, O. Nilsson , V. Pereda, G. Peter, R.
Philippe, G. Pilate, A. Poliakov, J. Razumovskaya, P. Richardson , C. Rinaldi, K.
Ritland , P. Rouzé, D. Ryaboy, J. Schmutz, J. Schrader, B. Segerman, H. Shin, A.
Siddiqui, F. Sterky, A. Terry , C.-J . Tsai, E. Uberbacher, P. Unneberg, J. Vahala, K.
Wall , S. Wessler, G. Yang , T. Yin , C. Douglas, M. Marra, G. Sandberg, Y. Van De
Peer y D. Rokhsar. (2006). The genome of black cottonwood, Populus trichocarpa
(Torr. & Gray). Science 313(5793) , 1596- 1604.
USDA (National Nutrient Database for Standard Reference) . (2008). Papayas, raw.
(Scientific Name: Carica papaya): NDB No: 09226. Palabras clave: Papayas, raw,
100 grams. Disponible en: http://www.na/.usda.gov/fnic/foodcomp/search/.
Wang D., N.O. Weaver, M. Kesarwani y X. Dong. (2005) . ' lnduction of protein secretory
pathway is required for systemic acquired resistance. Science, 308 (5724), 1036-
1040.
Weigel R.R. , C. Bauscher, A.J . Pfitzner y U.M. Pfitzner. (2001 ). NIMIN-1 , NIMIN-2 and
NIMIN-3, members of a novel family of proteins from Arabidopsis that interact with
NPR1/NIM1 , a key regulator of systemic acquired resistance in plants. Plant
Molecular Biology, 46 (2) ,143-160.
Weigel R.R. , U.M. Pfitzner y C. Gatz. (2005). lnteraction of NIMIN1 with NPR1 modulates
pr gene expression in Arabidopsis. The Plant Cell , 17, 1279-1 291.
39
•
Capitulo 1
Yu D., C. Chen y Z. Chen . (2001). Evidence for an important role of WRKY DNA binding
proteins in the regulation of NPR1 gene expression. The Plant Ce//, 13:1527-1540.
Yu J., S. Hu, J. Wang , G.K. Wong , S. Li , B. Liu , Y. Deng, L. Dai , Y. Zhou , X . Zhang , M.
Cao, J. Liu , J. Sun , J. Tang, Y. Chen, X. Huang, W . Lin , C. Ye, W . Tong , L. Cong, J.
Geng, Y. Han , L. Li , W. Li , G. Hu, X. Huang, W. Li , J. Li , Z. Liu , L. Li , J. Liu , Q. Qi , J.
Liu , L. Li , T. Li , X. Wang, H. Lu , T. Wu, M. Zhu, P. Ni , H. Han, W . Dong, X . Ren , X.
Feng, P. Cui , X. Li , H. Wang, X . Xu, W. Zhai, Z. Xu , J. Zhang , S. He, J. Zhang , J. Xu ,
K. Zhang,X. Zheng, J. Dong, W.Zeng, L. Tao, J. Ye, J. Tan , X. Ren , X. Chen , J. He,
D. Liu, W . Tian, C. Tian , H. Xia, Q. Bao, G. Li, H. Gao, T. Cao, J. Wang, W . Zhao, P.
Li , W . Chen, X . Wang , Y. Zhang , J. Hu, J. Wang , S. Liu , J. Yang , G. Zhang, Y.
Xiong, Z. Li , L. Mao, C. Zhou, Z. Zhu, R. Chen , B. Hao, W . Zheng , S. Chen , W. Guo,
G. Li, S. Liu , M. Tao, J. Wang, L. Zhu, L. Yuan y H. Yang. (2002) . A draft sequence
of the rice genome (Oryza sativa L. ssp. Indica). Science 296 (5565) ,79-92.
Yuexing Y., S. Zhong, Q. Li, Y. Lou , L. Wang , J. Wang, M. Wang , Q. Li , D. Yang y Z. He.
(2007). Functional analysis of rice NPR1-Iike genes reveals that OsNPR1/NH1 is the
rice orthologue conferring disease resistance with enhanced herbivore susceptibility.
Plant Biotechnology JouARNI, 5 (2},313-324, 2007.
Zhang Y., W. Fan , M. Kinkema, X. Li y X. Dong. (1999) . lnteraction of NPR1 with basic
leucine cierre protein transcription factors that bind sequences required for salicyl ic
acid induction of the PR-1 gene. Proceedings of the National Academy of Sciences
of the United States of America (PNAS}, 96 (11 ),6523-6528.
Zhang Y., Y.T. Cheng, N. Qu, Q. Zhao, D. Bi y X. Li . (2006) . Negative regulation of
defense responses in Arabidopsis by two NPR1 paralogs. The Plant JouARNI, 48
8(5),647-656.
Zhu Y.J., R. Agbayani, W. Nishijima y P. Moore. (2007) . Characterization of disease
resistance of Carica papaya to Phytophthora. ISHS Acta Horticulturae, 740,265-269.
Zhu Y.J. , X. Qiu, P. H. Moore, W . Borth , J. Hu, S. Ferreira y H.H. Albert. (2003). Systematic
acquired resistance induced by BTH in papaya. Physiological and Molecular Plant
Pathology. 63(5) ,237 -248.
40
•
Capitulo 11
CAPÍTULO 11.
CARACTERIZACIÓN IN SILICO DE GENES TIPO NPR1 DEL GENOMA
SECUENCIADO DE LA PAPAYA TRANSGÉNICA SUN UP
11.1 INTRODUCCIÓN
C. papaya es una planta diploide (2n=18) con un genoma relativamente pequeño de 372
Mb cuyo genoma fue secuenciado y publicado en 2008 (Ming et al., 2008).
Se considera la especie económicamente más importante de la familia Caricacea (Mishra
et al. , 2007) debido a que el fruto se cultiva en forma comercial en casi todo el mundo
(Latino América , Estados Unidos [Hawaii y Florida] , África , Asia , Australia y Filipinas)
(FAOSTAT, 2009). Sin embargo, una de las principales causas de pérdidas en la
producción de frutos es la gran susceptibilidad de esta especie a las enfermedades
(Kader et al., 2002), particularmente a la antracosis causada por Col/etotrichum
gloeosporioides (Dickman y Alvarez, 1983), un hongo hemibiótrofo que es capaz de
infectar los frutos inmaduros de C. papaya (Chau y Alvarez, 1983).
En respuesta al ataque de patógenos, las plantas responden de varias formas (Cao et al. ,
1997). La célula vegetal posee receptores de patrones de reconocimiento o PRRs (por
sus siglas en inglés) encargados de identificar los patrones moleculares asociados con el
patógeno o PAMPs (por sus siglas en inglés) (Gohre y Robatzek, 2008) . Cuando los
PRRs logran identificar a los PAMPs se enciende en la célula de la planta la inmunidad
activada por PAMPs (PTI) evitando la infección del patógeno (Gohre y Robatzek, 2008;
Bent y Mackey, 2007). En ocasiones, el patógeno produce moléculas llamadas efectores,
que promueven su virulencia (Torto-Aialibo et al. , 2009) e interfieren con la PTI , sin
embargo, la planta posee proteínas R que identifican a estos efectores (Johnson y Knott,
1992), desencadenando la inmunidad activada por efectores (ETI), esta respuesta acelera
y amplifica las respuestas de la PTI (Bent y Mackey, 2007), resultando en una resistencia
a la enfermedad que normalmente se acompaña por la respuesta hipersensible (HR) que
es un tipo de muerte celular programada que ocurre en el sitio de ataque (Heat, 2000),
esta respuesta a su vez es capaz de promover un segundo sistema de defensa en la
planta llamado resistencia sistémica adquirida (SAR) que se caracteriza por ser de largo
41
•
Capitulo 11
plazo (Durrant y Dong, 2004) y conferir una resistencia de amplio espectro a la planta
(Dong, 2004; Cao et al. , 1997).
Actualmente se sabe que NPR1 es un gen clave en la respuesta sistémica adquirida
(SAR). Fue identificado y aislado por primera vez en 1997 a partir de una mutante de
Arabidopsis thaliana insensible aSA e INA que presentaba bajos niveles de expresión de
los genes marcadores de la SAR, PR1 y PR5, por lo que se le denominó a este gen "no
expresivo de genes PR-1 " (NPR1) (Cao et al. , 1997; Cao et al. , 1994), y desde entonces
se han real izado muchos esfuerzos para comprender su función en el sistema inmune
vegetal. NPR1 requiere de la interacción de factores de transcripción TGAs (TGA2, TGA3,
TGA5, TGA6 y TGA7) (Rochon et al. , 2006: Liu et al. , 2005; Collins et al. , 2001) y de las
proteínas NIMIN (Weigel et a/. ,2005; Weigel et al. , 2001) para promover la transcripción
de los genes relacionados con la patogénesis (PR) (Weigel et al., 2005 ; Pieterse y Van
Loon , 2004) , a su vez, la expresión de NPR1 se ha demostrado que está bajo la
regulación de otros factores de transcripción como los WRKY (Y u et al., 2001 ; Mao et al. ,
2007). La localización de la proteína NPR1 es esencial para su función. La proteína NPR1
se localiza en el citoplasma en su forma inactiva (oligómero) y dentro del núcleo en su
forma activa (monómero) , estos cambios conformacionales se inducen por los cambios en
los niveles citoplasmáticos de SA, debido a que la acumulación de SA provoca un cambio
en el potencial redox del citoplasma, induciendo el rompimiento de los puentes disulfuro
del oligómero y activando a la proteína NPR1 (Liu et al., 2005; Dong, 2004; Pieterse y Van
Loon, 2004; Kinkema et al., 2000).
Los trabajos de los grupos de Luí (2005) y Hepwort (2005) en A. thaliana revelan que
NPR1 pertenece a una pequeña familia génica que comprende a otros cinco miembros,
de los cuales sólo NPR1 has sido reportado como regulador positivo de la SAR. Los otros
genes relacionados con NPR1 cumplen funciones diferentes: NPR3 y NPR4 son
reguladores negativos de la SAR (Zhang et al. , 2006) , mientras que NPR5 y NPR6 no
tienen ninguna función relacionada con la SAR, pero ambos poseen funciones
redundantes en los patrones de crecimiento floral y en la abscisión de este órgano
(Hepwort et al., 2005) .
De manera interesante, la sobrexpresión de NPR1 en plantas ya sean dicotiledóneas
como Arabidopsis (Cao et al. , 1998), tomate (Lin et al. , 2004) y manzana (Malnoy et al. ,
42
•
Capitulo 11
2007) o monocotiledoneas como trigo (Makandar et al., 2007) y arroz (Chern et al., 2005;
Fitzgerald et al., 2004), ha resultado en un aumento los niveles naturales de resistencia
contra patógenos fúngicos y bacterianos, así como y el desarrollo de una resistencia de
amplio espectro.
El objetivo principal del presente capítulo de investigación fue caracterizar in silico a los
genes tipo NPR1 de la papaya transgénica Sun Up cuyo genoma se encuentra depositado
en el GenBank.
11.2 MATERIALES Y MÉTODOS
11.2.1 AISLAMIENTO IN S/L/CO DE GENES TIPO NPR1 DEL GENOMA
SECUENCIADO DE CARICA PAPAYAVAR. SUN UP
El aislamiento in silico de las secuencias tipo NPR1 del genoma de Carica papaya se
realizó en el banco de genes del National Center for Biotechnology lnformation (NCBI)
utilizando el programa TBLASTN (Zhang et al., 2000) con los siguientes parámetros
generales: 200 secuencias blanco, Expect theshold de 1 O, tamaño de la palabra con valor
de 3 y O blancos en el rango de query. Como parámetros de puntuación se utilizó la matriz
BLOSUM62, costos por la exitencia de gaps con valor de 11 , cotos por la ampliación de
gaps con valor de 1, se elijió un ajuste condicional a la composición del puntaje de la
matriz y se utilizaron filtros de regiones de baja complejidad sin mascaras. Las búsqueda
se realizó directamente en el genoma de papaya (taxid :3649, No. de accesión
ABIM01000000) utilizando como query la secuencia de aminoácidos de NPR1 de
Arabidopsis thaliana (número de accesión del Genbank U76707.1 ).
43
•
Capitulo 11
11.2.2 PREDICCIÓN DE ORF
La predicción de los marco de lectura abiertos (ORF, por sus siglas en inglés; open
reading frame) de las secuencias obtenidas con el programa TBLASTN (Zhang et al.,
2000) se realizaron con el programa FGENESH (Softberry, lnc.) utilizando el cód igo
genético de plantas dicotiledóneas (Arabidopsis) . Las secuencias de nucleótidos de las
ORFs predichas fueron editadas con el programa TRANSLATE (Swiss lnstitute of
Bioinformatics) con el formato de salida que incluye la secuencia de nucleótidos.
11.2.3 DETERMINACIÓN DE PORCENTAJES DE IDENTIDAD
Los porcentajes de identidad entre las secuencias de proteínas se determinaron utilizando
el programa MEGALIGN del paquete Lasergen (DNASTAR).
· 11.2.4 ALINEAMIENTO DE LAS PROTEÍNAS PREDICHAS E IDENTIFICACIÓN
DE DOMINIOS CONSERVADOS
Se realizó un al ineamiento multiple de las secuencias de amino ácidos predichos tipo
NPR1 de C. papaya con AtNPR1 (U76707.1) y sus proteínas relacionadas AtNPR2
(NM_118745), AtNPR3 (NM_123879), AtNPR4 (NM_118086) , AtNPR5 (NM_129700) ,
AtNPR6 (NM_115572) utilizando el programa CLUSTALX (Larkin et al. , 2008) por medio
de una matriz de serie Gonnet para proteina con una penalización de 1 O por apertura de
espaciós, de 0.2 por ampliación de espacios, 30% de intervalo en secuencias divergentes,
sin utilizar el parámetro de matriz negativa. Los aminoácidos idénticos y conservados
fueron sombreados con el programa Boxshade (Hofmann y Baron) con un valor de 0.5 de
fracción de las secuencias, un formato de entrada ALN y RTF _new de salida, sin línea de
consenso. La identificación de los dominios conservados se realizó en base a reportes
previos (Spoel et al., 2009; Rachan et al., 2006; Hepwort et al., 2005; Cao et al., 1997).
44
..
Capitulo JI
Se realizó otro alineamiento multiple con las 28 secuencias tipo NPR1 de plantas
superiores obtenidas del GenBank (que se presentan en el ¡Error! No se encuentra el
origen de la referencia.) incluyendo las de C. papaya y Arabidopsis el programa
CLUSTAL X (Larkin et al. , 2008) por medio de una matriz de serie Gonnet para proteina
con una penalización de 1 O por apertura de espaciós, de 0.2 por ampliación de espacios,
30% de intervalo en secuencias divergentes, sin utilizar el parámetro de matriz negativa.
Cuadro 11.1 . Lista secuencias tipo NPR1 de otras plantas utilizadas para el análisis filogenético.
Accesión División Genero Especie Nombre común XP _001778211 Briofita Physcomitrella Patens subsp. Patens Musgo
2 CAJ19095 Liliopsida Hordeum vulgare subsp. Cebada Vulgare
3 ACF84271 Zea mays Maíz 4 00925843 Musa acuminata Plátano 5 EF137717 Musa acuminata Plátano 6 OS01g56200 Oryza sativa Arroz 7 OS01g72020 Oryza sativa Arroz 8 OS01g09800 Oryza sativa Arroz 9 AAM88865 Magnoliopsida Brassica na pus Cano la 10 AAT57637 Lycopersicon escu/entum Tomate 11 AAT57640 Beta vulgaris Betabel 12 AAT57642 Helianthus annuus Girasol 13 ABA41254 Cydonia oblonga Membrillo 14 ABA41280 Eriobotrya japonica Níspero 15 CAP12787 Capsicum chinense Chile abanero 16 00648785 Capsicum annuum 17 ACC77697 Malus Malusx domestica manzana 18 CA065332 Vitis vinífera Uva 19 ABM64782 lpomoea batatas Camote 20 ABK62792 Pyrus pyrifolia Pera japonesa 21 ABH04326 Nicotiana tabacum Tabaco 22 AB028327 Medicago trunca tu/a 23 ABC54558 Gossypium hirsutum Algodón 24 ABA60146 Platanus .)( acerifolia 25 XM_002308869 Populus trichocarpa 26 XM_002308245 Populus trichocarpa 27 XM_002300827 Populus trichocarpa 28 XM_002323225 Popu/us trichocarpa
45
•
Capitulo 11
11.2.5 ANÁLISIS FILOGENÉTICO DE LAS SECUENCIAS
Para el análisis filogenético se consideró la región que se extiende del dominio BTB al
domino de ANKIRIN. Las secuencias de aminoácidos fueron editadas con el programa
EDITSEQ del paquete bioinformático Lasergen (DNASTAR). Posteriormente se utilizó el
programa CLUSTALX (Larkin et al. , 2008) para alinearlas por medio de una matriz de
serie Gonnet para proteína con una penalización de 1 O por apertura de espaciós, de 0.2
por ampliación de espacios, 30% de intervalo en secuencias divergentes, sin utilizar el
parámetro de matriz negativa, y el programa MEGA (Tamura et al. , 2007) para construir el
árbol filogenético con el método de distancia Neighbour-Joining (NJ) y el modelo de
substitución de corrección de Poisson para aminoácidos, se realizó una prueba de
Bootstrap con 100 replicas, deleción completa de Gap y datos perdidos y una contribución
uniforme de los sitios.
46
•
Capitulo 11
11.3 RESULTADOS
11.3.1 IDENTIFICACIÓN IN S/L/CO DE GENES TIPO NPR1 DE CARICA
PAPAYA VAR. MARADOL
En el genoma de Carica papaya se encontraron cuatro secuencias putativas tipo NPR1
como resu ltado de la búsqueda TBLASTN. Estas secuencias presentan porcentajes de
identidad del 29 al 57%, porcentajes de similitud del47 al 73% y un Valor Esperado (Valor
E)<9F 15 como se observa detalladamente en el ¡Error! No se encuentra el origen de la
referencia .. Todas estas secuencias presentaron los dominios característicos de la familia
NPR1 (ver más adelante). La secuencia de papaya más parecida a AtNPR1 (con una
longitud de 503 aa) fue la secuencia ubicada en el contig ABIM01013147, con porcentajes
de identidad y similitud del 57 y 73%, respectivamente. El análisis TBLASTN también
mostró en este mismo contig la presencia de una secuencia altamente divergente a NPR1
con un porcentaje de identidad <15%, la cual no fue considerada como parte de la familia
de NPR1 por no presentar el dominio BTB de esta familia. Las secuencias de papaya
fueron nombradas como CpNPR1 , CpNPR3, CpNPR4 y CpNPR5. También se realizó un
TBLASTN en el genoma de papaya con las otras secuencias tipo NPR1 de A. thaliana
(AtNPR2-AtNPR6) obteniendo las mismas cuatro secuencias dentro de los primeros
cuatro hits, confirmado la presencia de únicamente cuatro secuencias tipo NPR1 en el
genoma de papaya.
Cuadro 11.2 Resultados de la búsqueda de secuencias homólogas a AtNPR1 (con una longitud de
503 aa) en el genoma de C. papaya utilizando el programa TBLASTN.
Número de accesión Longitud del L<:mgitu? del % de % de Valor
d 1 G B k segmento ahneam1ento .d t .d d . .1.t d E Score e en an (bp) (aa) 1 en 1 a s1m1 1 u
ABIM01013147 27947 254 57 73 3E-74 279
ABIM01 019889 53066 260 45 64 2E-50 200
ABIM01 011811 10434 290 41 57 2E-38 160
ABIM01002225 32827 241 29 47 9E-15 82
ABIM01 023855 15978 80 31 51 0.009 42.4
ABIM01 019983 11506 105 29 47 0.039 40
ABIM01 028441 13995 76 32 50 0.46 36.6
ABIM01 021773 16303 91 31 47 0.52 36.2
ABIM01 018308 27615 85 29 51 1.4 35
47
•
Capitulo 11
ABIM01019641 13450 89 24 46 1.4 35
11.3.2 ORFS (MARCOS DE LECTURA ABIERTOS) Y ORGANIZACIÓN
GENÓMICA
11.3.2.1 PREDICCIÓN DE ORFS TIPO NPR1
Los resultados de los análisis realizados con el programa de predicción de ORFs
FGENESH, mostraron que para las accesiones ABIM01013147, ABIM01019889,
ABIM01011811 y ABIM01002225 existe por lo menos un marco de lectura abierto que
coincide con las coordenadas obtenidas con el programa TBLASTN (Cuadro 11.) y los
sitios consenso del splicing de las secuencias tipo NPR1 de Arabidopsis tha/iana . Estos
datos se confirmaron al analizar las accesiones antes mencionadas con los programas
predictores de ORFs e intrones GENSCANW (BIOSINO y Burge) y GeneMark
(Borodovsky et al. , 2005) los cuales mostraron resultados similares (datos no mostrados).
Cuadro 11.3 Resultados del programa predictor de ORFs FGENESH en las secuencias ABIM01013147, ABIM01019889, ABIM01011811 y ABIM01002225 encontradas en el TBLASTN
Accesión del Número de la Coordenadas de Long1tud de la Long1tud de la GenBank ORF predicha la ORF ORF (pb) proteína (aa)
ABIM01 013147 1 8364-10482 1338 445 2 17017-17498 443 140 3 18193-22508 924 307 4 24070-26291 843 280 5 27531-27717 186 61
ABIM01 019889 668-6059 1983 660 2 9018-12766 1503 500 3 16241-17977 1737 578 4 20739-25397 822 273
5 28539-29983 1284 427
6 31549-32111 297 98
ABIM01 011811 62-4980 1848 616
2 6480-9965 2781 926
ABIM01 002225 1 0163-12644 1437 478
2 20297-25208 1494 597
3 26143-16516 276 91
4 27667-29229 756 251
5 32240-32818 579 193
48
•
Capitulo 11
11.3.2.2 ALINEAMIENTO DE PROTEÍNAS TIPO NPR1 DE C. PAPAYA
Se realizó un alineamiento CLUSTLAL X con las 4 secuencias de C. papaya encontradas
y las 6 secuencias tipo NPR1 de Arabidopsis thaliana con la finalidad de observar las
regiones conservadas de las proteínas. En el alineamiento que se muestra en la Figura
0.1 se puede observar que las secuencias de aminoácidos tipó NPR1 de C. papaya y de
A. thaliana comparten regiones conservadas a lo largo del alineamiento mayormente en la
región que coincide con los dominios conservados BTB/POZ (Rochon et al., 2006;
Hepwort et al. , 2005) y Ankyrin (Cao et al., 1997). El motivo fosfodegron tipo IKB (Spoel et
al., 2009) presenta los residuos Ser-11 y Ser-15 que son fosforilados permitiendo que la
molécula de NPR1 se una al complejo Cullin3 para ser marcada mediante ubiquitinación
para ser degradada por el proteosoma, este complejo se encuentra conservado en las
secuencias CpNPR1 , CpNPR3, AtNPR1, AtNPR2, AtNPR3 y AtNPR4. Los residuos Lys-
541, Lys-542, Arg-544, Lys-553 y Lys-554 que se ubican dentro de la señal de
localización nuclear (NLS por sus siglas en ingles) son importantes para la entrada al
núcleo de la proteína NPR1 (Kinkema et al. , 2000) y se encontró que están ausentes en
las secuencias CpNPR1, CpNPR5, AtNPR5 y AtNPR6, pero conservados en el resto de
las secuencias.
El residuo Cys-82 se encuentra conservado en todas las secuencias, mientras que el
residuo Cys-216 solo está presente en las secuencias AtNPR1 y CpNPR1 , ambos
residuos se reducen para liberar los monómeros del oligómero de NPR1 y permitir su
entrada al núcleo (Mou et al. , 2004) . Los residuos Cys-521 y Cys-529 que participan en la
transactivación de la proteína con TGA2 (Rochon et al. , 2006) solo están presentes en la
secuencia AtN PR 1.
AtNPRl AtNPR2 CpNPRl AtNPR3 AtNPR4 CpNPR3 CpNPR4 CpNPRS
1 1 1 1 1
Motivo Fosfodegron Tipo lKB
DSxxxS
49
AtNPR5 AtNPR6
AtNPRl AtNPR2 CpNPRl AtNPR3 AtNPR4 CpNPR3 CpNPR4 CpNPRS AtNPR5 AtNPR6
AtNPRl AtNPR2 CpNPRl AtNPR3 AtNPR4 CpNPR3 CpNPR4 CpNPRS AtNPR5 AtNPR6
AtNPRl AtNPR2 CpNPRl AtNPR3 AtNPR4 CpNPR3 CpNPR4 CpNPRS AtNPR5 AtNPR6
AtNPRl AtNPR2 CpNPRl AtNPR3 AtNPR4 CpNPR3 CpNPR4 CpNPRS AtNPR5 AtNPR6
AtNPRl AtNPR2 CpNPRl AtNPR3 AtNPR4 CpNPR3 CpNPR4 CpNPRS AtNPR5
1 --------- ---- - - -- - -- -- - ----- -------- ------
1 -- ---- -- ----------------------------------
BTB
55 57 53 50 44 54 47 17 17 18
BTB
102 104 1 0 1
9 6 92 96 93 69 72 72
157 156 151 148 143
99 143 124 132 127
217 216 211 206 201 131 201 182 190 185
ler ANTKVRIN
263 262 258 257 248 182 252 242 243
Capitulo 11
50
•
AtNPR6
AtNPRl AtNPR2 CpNPRl AtNPR3 AtNPR4 CpNPR3 CpNPR4 CpNPRS AtNPR5 AtNPR6
AtNPRl AtNPR2 CpNPRl AtNPR3 AtNPR4 CpNPR3 CpNPR4 CpNPRS AtNPR5 AtNPR6
AtNPRl AtNPR2 CpNPRl AtNPR3 AtNPR4 CpNPR3 CpNPR4 CpNPRS AtNPR5 AtNPR6
AtNPRl AtNPR2 CpNPRl AtNPR3 AtNPR4 CpNPR3 CpNPR4 CpNPRS AtNPR5 AtNPR6
AtNPRl AtNPR2
314 313 312 310 301 236 306 302 303 296
373 372 371 369 360 295 365 362 363 356
430 430 428 426 417 352 421 419 423 413
433 433 431 429 420 355 481 422 426 416
489 489
CpNPRl AtNPR3 484 AtNPR4 477 CpNPR3 408
2° ANTKYRIN
411 ANTKYRIN
CpNPR4 540 ~~\J~'~í:e~ CpNPRS 470
Capitulo 11
3er ANTKVRIN 4l! ANTKYRIN
* * ~~ ~ --N~QLACG;Do&AEKRLammoml --D~HLASv;EqgPEKRL~
51
AtNPR5 AtNPR6
AtNPRl AtNPR2 CpNPRl AtNPRJ AtNPR4 CpNPR3 CpNPR4 CpNPR5 AtNPR5 AtNPR6
AtNPRl AtNPR2 CpNPRl AtNPRJ AtNPR4 CpNPR3 CpNPR4 CpNPR5 AtNPR5 AtNPR6
•
Capitulo 11
NLS ,¡.,¡.
546 ~TI~sEINLELGNS§LTDSTSSTSKSIGGKRSNRKLSHRRR--- -------- -544 Mi!~sE!KEECGKS-------STPKPiSAVRSNRKLSHRRLKVDKRDFLKRPY
544 537 464 597
597 GNGD-
Figura 0.1 Alineamiento CLUSTAL X de las secuencias tipo NPR1 del genoma de C. papaya (CpNPR1 , CpNPR3, CpNPR4 y CpNPR5) en negritas y de A. thaliana (AtNpr1 , AtNPR2, AtNPR3, AtNPR4 y AtNPR5) en cursivas. El motivo fosfodegron tipo IKB (Spoel et al. , 2009) de seis aminoácidos se encuentra en Asp1 O - Ser15, el dominio BTB (Hepwort et al., 2005) en Ser65 -Val194, los 4 dominios Ankyrin de la región N-terminal (Cao et al., 1997) y la señal de localización nuclear (NLS por sus siglas en inglés) (Kinkema et al., 2000) que va de Lys537- Lys554. Los aminoácidos relacionados con la localización nuclear de la proteína NPR1 se señalan con una flecha (.J..-) y los relacionados con la interacción con TGA"s con un asterisco (* ), aquellos que intervienen en la transactivación con signo de mas (+) y aquellos que intervienen en la fosforilación con un punto negro (•) .
52
•
Capitulo 11
11.3.2.3 IDENTIFICACIÓN DE DOMINIOS CONSERVADOS
Todas las secuencias tipo NPR1 de C. papaya presentan un dominio BTB y una región de
repeticiones de ankyrin, a excepción de la secuencia CpNPR3 que no presentó completo
el dominio BTB. Estos mismos dominios se presentan también en las secuencias tipo
NPR1 de Arabidopsis . Las coordenadas de estos dominios dentro de las secuencias de
ambas especies se indican en el Cuadro . La posición de cada uno de los dominios se
señala en las diferentes secuencias traducidas in silico con el código genetico de
arabidopsis tipo NPR1 de papaya Figura 0.2. (CpNPR1), Figura 0.3 (CpNPR3) , Figura 0.4
(CpNPR4) y Figura 0.5 (CpNPR5) .
Cuadro 11.4 Características de los dominios conservados en las secuencias tipo NPR1 de C. papaya y Arabidopsis de acuerdo al programa PROSITE
Secuenc1a Domm1o BTB Reg1on Ankynn repeat t1po NPR1 Longitud Pos1c1ón Long1tud Score Pos1c1ón Long1tud Score
(aa) en la secuenc1a (aa) en la secuenc1a (aa) CpNPR1 520 64-134 71 16.880 292-367 76 15.592 CpNPR3 500 216- 290 75 15.671 CpNPR4 616 57- 130 74 17.541 286-358 73 15.141 CpNPRS 478 26- 108 83 17.169 282-355 69 18.324 AtNPR1 593 65- 144 80 15.618 294 - 369 76 17.741 AtNPR2 600 67- 143 77 14.356 293-365 73 15.379 AtNPR3 586 60- 135 76 15.597 290- 364 75 15.884 AtNPR4 574 54- 130 77 15.018 281 - 355 75 15.91 o AtNPRS 491 26- 116 91 17.417 283 - 356 74 17.873 AtNPR6 467 27 - 111 85 17.686 276-349 74 15.910
53
1 1
61 21
121 41
181 61
241 81
301 101 361 121 421 141 481 161 541 181 601 201 661 221 721 241 781 261 841 281 901 301 961 321
1021 341
1081 361
1141 381
1161 401
1181 421
1241 441
•
a tggattatagaacaggaacctcagattccaacgacatcagcaacaacagcagtacttgt M D Y R T G T S D S N D I S N N S S T e
tgcgtggcaactaacacagacacgctttcgcatccattagagcctctaacgactccggag e V A T N T D T L S H P L E P L T T P E
a tctcgggtctgcagctgctctctcgtaacctgctgacaatctttgactcttctgacttt I S G L Q L L S R N L L T I F D S S D F
gacttcttcagtgacgcgaggctgatgctcggctccggccgtgagatccccgtgcaccgt D F F S D A R L M L G S G R E I P V H R
tgcattctttcctcgaggagtcccttcttcaaagccatcttctccggctctgcgttcaag e I L S S R S P F F K A I F S G S A F K
g agagaaccgccaagttccgcctcaaggaacttgctggagactatgatgtcggtttcgac E R T A K F R L K E L A G D Y D V G F D
gcgcttgttgccgttttagcttatctgtacactggcaaggtttggccgttaccaaaggga A L V A V L A Y L Y T G K V W P L P K G
g tttgtgtttgcgtggacgaagagtgctcgcacgtcggctgcaggccggcggtggatttc V e V e V D E E e S H V G e R P A V D F
c tggtggaggtgctctacgtggcttttaccttccagatttcggaattagtggccctttat L V E V L Y V A F T F Q I S E L V A L Y
c agcggcacttactggacattattgataaagttgagacggacaatattttagtgattctt Q R H L L D I I D K V E T D N I L V I L
tctgttgcaaatatatgtggtaaagtgtgtgacagattgctcggcaggtgtatggatatt S V A N I e G K V e D R L L G R e M D I
a ttgtcaaatctgatgtagatgcagtcacccttgataaatcgttgcccctgagcattgta I V K S D V D A V T L D K S L P L S I V
a aacaaatcatggatttacgagcagaatgcgacacacaaggccctgaaggtaggagtttt K Q I M D L R A E e D T Q G P E G R S F
c cagataaacatgtgaagcgaatacaccgtgctttggattcagatgatgttgaattagtt P D K H V K R I H R A L D S D D V E L V
aggatgcttctgaaggaggcacgcaccaatctggatgatgcacatgctctccactatgct R M L L K E A R T N L D D A H A L H Y A
g tagcatattgtgatgcaaagacaacaatagagctccttgaccttgggcttgcagatgtt V A Y e D A K T T I E L L D L G L A D V
a accatagaaattcaagaggctatactgtgctacatattgctgcaatgcggaaagagccc N H R N S R G Y T V L H I A A M R K E P
a aactcatagtatcgcttttaacaaaaggcgctcgaccatcagatcttaccccagatggg K L I V S L L T K G A R P S D L T P D G
a ggaaagcactccaaatatcaaaacggctcactaaagcagctgattattataacactaca R K A L Q I S K R L T K A A D Y Y N T T
g aggaaggaaaggctgcacccaaggatcggttatgtgtagaaatattggagcaggcagaa E E G K A A P K D R L e V E I L E Q A E
a ggcgagatccactacttggagaagcttctctctctcttgcaaaagctggtgatgatttc R R D P L L G E A S L S L A K A G D D F
a ggatgaaactgttgtaccttgaaaacagaggggttacttcttatctcctgtcttgggac R M K L L Y L E N R G V T S Y L L S W D
a attcaaaatggaaatga N S K W K
Capitulo 11
Figura 0.2 Secuencia de nucleótidos y traducción conceptual de la secuencia CpNPR1. Los motivos conservados se encuentran señalados: el motivo BTB (292 - 367) se subraya con una linea gruesa. La reg ión de repeticiones de Ankyrin (292 - 367) se subraya con una linea delgada y el dominio Ankyrin repeat (326- 358) se subraya con una linea doble.
54
•
1 atggctaattcagctgagccatcatcatctttgagctttacttcatcttcccacttatca 1 M A N S A E P S S S L S F T S S S H L S
61 aattgctcagctagccataacttctcatcctcttcttgccatgaaacggggcctaatctt 21 N e S A S H N F S S S S e H E T G P N L
121 gaggtgatcagtctaagcaggctaagctccaacttggaacggctcctgattgattcaact 41 E V I S L S R L S S N L E R L L I D S T
181 tgtgattacagtgatgctgatatcattgtggagggcatttctgttggtgttcatcgatgt 61 e D Y S D A D I I V E G I S V G V H R e
241 attttggctgctaggagcaagattttgaataaagtgaagcactct~caaataacactaat
81 I L A A R S K I L N K V K H S A N N T N
301 tcactggggcggcgtcttcttaactttaccggaaaggctatggtggaacatgttctccca 101 S L G R R L L N F T G K A M V E H V L P 361 atccttgtggtagcatttcattgccaattaactcagcttattgctcagtg~gttgataga
121 I L V V A F H e Q L T Q L I A Q e V D R
421 gtggcaaggtcagatcttgacaaggtttccattgagaaagaactcccctttgaagttgca 141 V A R S D L D K V S I E K E L P F E V A
481 gaggatattagactggtgagagacaagtctccgcctgatgaaaacaataaccgagaaatt 161 E D I R L V R D K S P P D E N N N R E I
541 ttggacccatttcgtgaaaaaagagtcaggcgaatacataaagcattggactcggatgat 181 L D P F R E K R V R R I H K A L D S D D
601 gttgaactggtgaagctacttctgactgagtctaatataagtctagatgatgctaatgct 201 V E L V K L L L T E S N I S L D D A N A
661 ctccattatgctgtggcatactgtgatccaaaagttgtgtctgaggttctttgcctaggt 221 L H Y A V A Y e D P K V V S E V L e L G
721 ctggctgatgtcaatcttcggaattctaggggttacactgttctccatatcgctgcaatg 241 L A D V N L R N S R G Y T V L H I A A M
781 cgtaaagagccatcaatattagtgtcacttttgaccaaaggagcttctgcttcagagttg 261 R K E P S I L V S L L T K G A S A S E L
841 actttggatgggcagagttctgttaacatctgcaggggtttgacaaggccaaaagattat 281 T L D G Q S S V N I e R G L T R P K D Y 901 cacgcaaaaatggagcagggccaagaaaccaataaagaccggatatgcatcgatattcta 301 H A K M E Q G Q E T N K D R I e I D I L
961 gagagagaaatgaggaggaatccaatggctggagatgtatctatgaactcgcacacagtg 321 E R E M R R N P M A G D V S M N S H T V
1021 gctgatgatctgcacatgaagctgctatacctggaaaacagagtttcatttgcacgatta 341 A D D L H M K L L Y L E N R V S F A R L
1081 tttttccctgctgaagccagggtagccatgaacattgctaatgctgaaacatctgagttt 361 F F P A E A R V A M N I A N A E T S E F
1141 gccggtccttcagcctcatcaggatcgaatgggaacctaagggaggttgacttaaatgag 381 A G P S A S S G S N G N L R E V D L N E
1161 acacctaccatgcagaagaaaaggcttctttctagggtggaatcacttatgaaaacagtg 401 T P T M Q K K R L L S R V E S L M K T V
1181 aacatgggtcgccgctttttccctcattgctctgaagtg~tggataggttcatggaggat
421 N M G R R F F P H e S E V L D R F M E D
1241 gacctcccagatttgttttaccttgagaagggcactcctgatgaacagagaagaaagaga 441 D L P D L F Y L E K G T P D E Q R R K R
1301 actcggtttatggagcttaaagatgatgtccaaaaggcatttattaaagacaaagcccga 446 T R F M E L K D D V Q K A F I K D K A R
1361 agtagctgctctggattgtcttcctcttcgtcttcatcttctttaaaagatgctgtaact 448 S S e S G L S S S S S S S S L K D A V T
1421 tag 501
Capitulo 11
Figura 0.3 Secuencia de nucleótidos y traducción conceptual de la secuencia CpNPR3. Los motivos conservados se encuentran señalados: la región de repeticiones de Ankyrin (216 - 290) se subraya con una línea delgada.
55
•
Capitulo 11
atggaaaacggtagtgaaatgtcatctctttgagcttcgcctcctctaat~atcaagt
M E N G S E M S S S L S FA S S NL S S
61 agttccagtagccttagccacgat~ttgtacaagtcttgaaaatttgagccaaacaag
21 S S S S L S H O P e T S L E N L S L N K
121 ctcagctgcaaccttgaaaaccta~gtttcactctgaatatgactacagt~tgccgag
41 L S e N L E N L L F H S E Y O Y S O A E
181 attgttgttgaagacaaacccgtg~cgtccaccgttgtatattggctgcagcagccag
61 I V V E D K P V A y H R C I L A A R S O
241 ttttttcatcagctttttagcaag~agtagttaaggaaggtaaaccaag~atcttatg
81 F F H O L F S K G V V K E G K P R Y L M
301 tctgagttggtgccttttggtgtg~tggatatgaagcattcagcgtgttctgaattat
101 S E L V P F G V V G X E A F S V F L N Y
361 ttgtataccgggaagctcaggcca~tccgccggaagtttcaacctgtgtt~tcttacc
121 L Y T G K L R P S P P E V S T C V D L T
421 tgtaatcatgatgcgtgtggtcct~tattacttatgctttggaattgatgatgcttct
141 e N H D A e G P A I T Y A L E L M Y A S
481 gccactttccaggtgaaagaactt~tctgcttcttcagcgtcgtctgct~attttgtc
161 A T F Q V K E L V L L L Q R R L L O F V
541 gagaaggcttttgtagaagatgta~cccaattcttgtagcggcctttcacyccaactt
181 E K A F V E O V I P I L V A A F H e Q L
601 aaccagcttctctctaactgcatt0gagagttgcgaggtcagatattgatytgcgtgt 201 N Q L L S N e I Q R V A R S O I O e A e 661 ctcagcaaagaactcccttctgaa~atttagtaaacttaaatcagtacgcccgaaatt
221 L S K E L P S E V F S K L K S V R L E I
721 cagcaagaccatgaatcaagtgat~ggaagtggacgctgtggatgaaaag~cattaag
241 Q Q D H E S S O L E V O A V O E K S I K
781 aaaattcacatggcactggactct~tgacgttgaactggtgaatcgatta~cagtgaa
261 K I H M A L D S D O V E L V N R L L S E
841 tccaatataactttagacaaggccacgctctccactatgctgcagcctacgtgaccct 281 S N I T L O K A Y A L H Y A A A Y e O P
901 aaggttgttaaggagctactacgt~tggcttagctgatcttagtcttaggaccctcga
301 K V V K E L L R L G L A O L S L R N P R
961 ggccttactgtgcttcatgtggct~aagacgcaaggagccatcactgctg~ggcacta
321 G L T V L H V A A R R K E P S L L M A L
1021 ctgactgaaggagcctctgtatcg~aactacgttggatggacaaactgct~tgcaatc
341 L T E G A S V S G T T L O G Q T A V A I
1081 tgtagaagactcacaaggctgaaa~ctataacaagaacatagagcaggggaagtatcc
361 e R R L T R L K O Y N K N I E Q G Q V S
1141 cataaagatcggatatgcattggc~cctggagagagagatgggaaattca~ctccggg
381 H K D R I e I G I L E R E M G N S V S G
1161 aatgtcccaatttcatcacctatg~tactgatgatttgcaaaggacactg~ttatctg
401 N V P I S S P M N T O O L Q R T L O Y L
1181 gaggatagaggagatcctttatgt~actttggtgtattgatgttcagggaacatctgc
421 E D R G D P L e A L W e I O V Q G Y I e 1241 ggttttgtgtattgggcatattttgtctgaaagagaagggagagtgggag~acaaacc
441 G F V Y W A Y F e L K E K G E W E E Q T
1301 ttcatgcatggagattctggagag~agattacaaactgagctgggcatttEttcatta
446 F M H G O S G E R O Y K L S W A F T S L
1361 gtggcagatatggcatttgcacgg~gtttttccctgctgaagccaaacta~tatggag
448 V A O M A F A R L F F P A E A K L A M E
1421 attgctgatgcaagtttgagctca~taatgctggcctgtcagcttcaaaacaatgggc
501 I A D A S L S S A N A G L S A' S K S M G
1481 tcaagtggtaatctaagagacgtt~tctaaatgaaactcacactgtatggEcaaaagg
521 S S G N L R O V O L N E T H T V W T K R
1541 ttacaattgcaactgcagaaactt0taaaacagtggagacgggtagacg~atttcccg
541 L Q L Q L Q K L H K T V E T G R R Y F P
1601 cattgctcggacgtgcttgataac~tctagaagatgcggagatgcctgatctttgttc
561 H e S D V L D N F L E D A E M P D S L F
1661 ctggagaagggaactccagaagaa0aaaattgaaaaaaaggcgcttcatg~acttaaa
581 L E K G T P E E Q K L K K R R F M E L K
1721 gaggatgtgcagaaagcatttaac~ggacatggagaataaacgatca
601 E O V Q K A F N K D M E N K R S
Figura 0.4 Secuencia de nucleótidos y traducción conceptual de la secuencia CpNPR4. Los motivos conservados se encuentran señalados: el motivo BTB (57 - 130) se subraya con una línea gruesa. La reg ión de repeticiones de Ankyrin (286- 358) se subraya con una línea delgada.
56
•
1 atgagcagccttgaagagtctttaagatctctgtcacttgactatctaaacttgctgata 1 M S S L E E S L R S L S L D Y L N L L I
61 aatggtcaagctttctctgatgtgactttcagcgtagagggtcggttagtccacgcgcac 21 N G Q A F S D V T F S V E G R L V H A H
121 aggtgcatcttagcggctaggagtctcttcttcaggaaattcttctgtggacccgaccca 41 R e I L A A R S L F F R K F F e G P D P
181 ccaccgggtttggacccgactggctctcggatgagtcccggggcg~cgagaggggcgggg
61 P P G L D P T G S R M S P G A A R G A G 241 gtgataccggtgaactcagtggggtatgaggtgttcttgttgctgctccagtttttgtat
81 V I P V N S V G Y E V F L L L L O F L Y 301 agcggacaagtctctattgtgccgcaaaagcacgagccaaggcctaattgtggggagaga 101 S G O V S I V P Q K H E P R P N e G E R 361 gggtgttggcacacgcattgcacctcagccgttgatcttgctcttgacacactcgcagcc 121 G e W H T H e T S A V D L A L D T L A A 421 gctcgatactttggggttgaacagcttgcattgctcactcagaagcaattggctagcatg 141 A R Y F G V E Q L A L L T Q K Q L A S M 481 gtggagaaggcatcaatcgaggacgtaatgaaagttttaatagcttcaagaaagcaagac 161 V E K A S I E D V M K V L I A S R K Q D 541 atgcaccaactctggactacttgttctcatcttgtcgctaaatcaggtttacccccggaa 181 M H Q L W T T e S H L V A K S G L P P E 601 gtcttggccaaacacctccctattgatgtggtggcaaaaatagaagagctccggctcaag 201 V L A K H L P I D V V A K I E E L R L K 661 tcatcgctggctcggcgttcacttatgccgcaccaccaccatcatcaccatcaccaccac 221 S S L A R R S L M P H H H H H H H H H H 721 caccacgatctctccgccgcggctgatctcgaggaccaaaaaattaggcggatgagacgg 241 H H D L S A A A D L E D Q K I R R M R R 781 gccctcgactcctcagatgtagaacttgtaaagctcatggtgatgggagaagggcttaat 261 A L D S S D V E L V K L M V M G E G L N 841 ctcgacgaggcattggctttacactacgctgtcgagaattgcagtcgagaggtggtgaaa 281 L D E A L A L H Y A V E N e S R E V V K 901 gccttgctagagctcggtgcagccgatgttaacttcccggcagggcccgcagggaagaca 301 A L L E L G A A D V N F P A G P A G K T 961 ccgcttcacattgcggcggagatggtgtcgccggacatggttgctgtcttgttggaccac 321 P L H I A A E M V S P D M V A V L L D H
1021 catgccgacccgaatgtaagaactgtagatggagtcactccattagacattctaagaacc 341 H A D P N V R T V D G V T P L D I L R T
1081 ctaacctcggatttcttgttcaaaggtgcggtccctgggttaacccacattgagccaaac 361 L T S D F L F K G A V P G L T H I E P N
1141 aagctcagactttgtctggagctggttcagtctgcggctttggtcatttcccgggaagaa 381 K L R L e L E L V Q S A A L V I S R E E
1161 gctggaagtgtcaatgcaccaacctcaactgctatttatccacccatgagcgaagaacat 401 A G S V N A P T S T A I Y P P M S E E H
1181 aacagcagtagtagcgggaacctgaatttggattcaagattggtttatctgaatcttggt 421 N S S S S G N L N L D S R L V Y L N L G
1241 gccgggcagatgagttcaggagatggtgatcatgatcatagcagcagtcatagtagccaa 441 A G Q M S S G D G D H D H S S S H S S Q
1301 agggaagccatgaaccgacatgatccaacaatgtatcaccactctcatgacttctag 446 R E A M N R H D P T M Y H H S H D F
Capitulo 11
Figura 0.5 Secuencia de nucleótidos y traducción conceptual de la secuencia CpNPRS. Los motivos conservados se encuentran señalados: el motivo BTB (26 - 1 08) se subraya con una línea gruesa. La región de repeticiones de Ankyrin (282 - 355) se subraya con una línea delgada.
57
•
Capitulo 11
11.3.2.4 PORCENTAJES DE IDENTIDAD DE LAS SECUENCIAS TIPO NPR1 DE
PAPAYA
Para determinar los porcentajes de identidad se utilizaron las secuencias de aminoácidos
desde el dominio BTB hasta el dominio Ankirin, debido a que son los dominios mejor
conservados entre todas las secuencias. Los porcentajes de identidad de las cuatro
secuencias tipo NPR1 identificadas en C. papaya en relación con las secuencias de A.
thaliana son relativamente altos (mayores a 31 .9%) como se puede apreciar en el Cuadro
. La secuencia CpNPR1 alcanzó sus mayores porcentajes de identidad con las
secuencias AtNPR1 (61%) y AtNPR2 (57.7%) y la menor identidad con la secuencia
AtNPR5 (33.1 %). Las secuencia CpNPR3 obtuvo los mayores porcentajes de identidad
(63.3 y 62.2%) con las secuencias AtNPR3 y AtNPR4 respectivamente al igual que la
secuencia CpNPR4 (58.6 y 55.5%), tanto CpNPR3 como CpNPR4 obtuvieron su menor
identidad con AtNPR5 (35.6 .y 56.1 %) y AtNPR6 (35.6 y 35.8%). Mientras que la
secuencia CpNPR5 logró el mayor porcentaje de identidad alcanzando 91.6% con la
secuencia AtNPR5.
Cuadro 11.5 Porcentajes de identidad entre las cuatro secuencias tipo NPR 1 de Ca rica papaya y las seis secuencias de la familia génica NPR1 de Arabidopsis lhaliana.
CpNPR1 CpNPR3 CpNPR4 CpNPR5 AtNPR1 AtNPR2 AtNPR3 AtNPR4 AtNPR5 AtNPR6
CpNPR1 48.9 45.0 33.1 61.0 57.7 42.5 44.5 31 .9 33.6
CpNPR3 58.6 36.6 47.0 44.3 63.3 62.2 35.6 35.6
CpNPR4 36.7 42.6 41 .9 58.6 55.5 36.1 35.8
CpNPRS 32.7 31.6 33.9 34.8 91.6 86.9
AtNPR1 69.9 41 .8 43.9 31 .8 33.1
AtNPR2 42.2 42.6 30.7 30.7
AtNPR3 76.6 33.7 33.0
AtNPR4 33.9 33.9
AtNPR5 85.7
AtNPR6
58
•
Capitulo 11
11.3.3 ANÁLISIS FILOGENÉTICO DE LAS SECUENCIAS
El árbol filogenético (Figura 0.6) de las secuencias tipo NPR1 de C. papaya y de A.
thaliana presenta una distribución de tres grupos o ciados claramente distinguibles. Cada
uno de estos ciados presenta por lo menos una secuencia tipo NPR1 de C. papaya
agrupado con secuencias de A. thaliana . Los ciados que componen el árbol filogenético
se encuentran respaldados con valores bootstrap elevados(> 84%).
100.0 AtNPR3
84.1 AtNPR4 11 1
CpNPR3 91.5 CpNPR4
99.9 100.0
AtNPR2
1 AtNPR1
CpNPR1 85.6 AtNPR5 100.0
1 CpNPR5
AtNPR6
111
71 .6
70 60 50 40 30 20 10
Figura 0.6 Árbol filogenético donde se muestran las relaciones filogenéticas existentes entre las cuatro secuencias tipo NPR1 de C. papaya (resaltadas en negrillas) y las seis secuencias tipo NPR1 de A. tha/iana (resaltadas en cursivas) .
De igual forma se realizó un segundo análisis filogenético con las secuencias tipo NPR1
de C. papaya, Arabidospsis, 16 especies de Magnoliopsidas, 4 Liliopsidas y una briofita
(21 especies con 28 secuencias tipo NPR1), cuadro 11.5.
Con dichas secuencias se construyó un árbol filogenético (Figura 0.7) que mantiene la
distribución en tres ciados y donde las secuencias de papaya y Arabidopsis se agrupan de
la misma forma observada en el árbol anterior (Figura 0.6). Dentro del ciado 1 se
encuentran las secuencias AtNPR1 , AtNPR2 y CpNPR1 , las secuencias AtNPR3,
AtNPR4, CpNPR3, CpNPR4 se encuentran en el ciado 11 y el ciado 111 contiene a las
secuencias AtNPR5, AtNPR6 y CpNPR5. Llama la atención que la secuencia de
Physcomitrel/a patens parece ser la secuencia ancestral de los ciados 1 y 11. Además, a
pesar de que el árbol contiene especies magnoliofitas y liliofitas no es notoria la
separación de estos grupos dentro del ciado 1 que contiene las secuencias AtNPR1 ,
AtNPR2 y CpNPR1 .
59
•
Capitulo 11
~e
Figura 0.7 Árbol filogenético donde se muestran las relaciones filogenéticas entres las cuatro
secuencias de aminoácidos tipo NPR1 de C. papaya (e), las seis secuencias tipo NPR1 de A.
thaliana (e ) y 28 secuencias de diferentes plantas obtenidas de GenBank.
60
•
Capitulo 11
11.4 DISCUSIÓN
Desde la identificación de NPR1 en 1997, se han aislado seis genes pertenecientes a la
familia NPR1 en la planta modelo Arabidopsis thaliana (Zhang et al. , 2006; Liu et al.,
2005; Hepwort et al., 2005; Cao et al. , 1997). También se ha comprobado la presencia de
homólogos del gen NPR1 en otras especies de plantas como tabaco (Liu et al. , 2002) ,
girasol (Radwan et al., 2005) , tomate (Ekengren et al., 2003) , arroz (Yuexing et al. , 2007;
Chern et al. , 2005) , manzana (Malnoy et al., 2007), uva (Henanaff et al., 2008) y plátano
(Zhao et al. , 2009; Endah et al., 2008), así como de homólogos del gen NPR4 de
Arabidopsis en uva (Henanaff et al., 2008), pera, membrillo, níspero, cereza, ciruela y una
especie oARNmental del género Prunus (Pilotti et al. , 2008) . En este capítulo se reporta la
identificación in silico de cuatro secuencias tipo NPR1 en el genoma secuenciado de C.
papaya var Sun Up.
La presencia de cuatro genes tipo NPR1 en C. papaya, parecería ser consistente con la
reducción en el números de genes del genoma de esta planta (Ming et al., 2008) , si
comparamos estos resultados con los seis genes tipo NPR1 presentes en Arabidopsis
thaliana (The Arabidopsis Genome lniciative, 2005) veríamos que existe una relación
entre el tamaño del proteóma y el número de cópias de génes tipo NPR1 presentes. Sin
embargo al contrastar estos con el número de genes tipo NPR1 encontrados en otras
especies con genomas secuenciados esta hipótesis es fácil de refutar. Populus
trichocarpa (Tuskan et al., 2006) y Oryza sativa (Goff et al., 2002; Yu et al., 2002) poseen
cada una cinco genes tipo NPR1, menos que aquellas reportadas para Arabidopsis y mas
que las que están presentes en papaya, aunque tanto Populus como Oryza poseen
genomas de mayor tamaño que los de Arabidopsis y papaya. Otro caso es el de Vitis
vinífera (Moroldo et al., 2008; Jaillon et al., 2007) qúe posee el genoma mas grande, si
comparamos estas cinco plantas, sin embargo solamente se han encontrado hasta el
momento dos copias de genes tipo NPR 1. En base a esta evidencia podemos decir que
no es posible afirmar que exista una relación entre el número de copias de genes tipo
NPR1 con el tamaño del genoma.
Del alineamiento de las cuatro secuencias de aminoácidos tipo NPR1 identificadas en C.
papaya y Arabidopsis (Figura 0.1 ), se deduce la existencia de una relación estructural
entre estas. Se aprecian zonas conservadas que coinciden con los dominios BTB y
61
•
Capitulo 11
Ankyrin característicos de las secuencias tipo NPR1 (Rochon et al. , 2006; Liu et al., 2005;
Hepwort et al. , 2005; Cao et al., 1997). En el mismo alineamiento se observa que las
secuencias NPR1, NPR2, NPR3, y NPR4 de papaya y Arabidopsis presentan el motivo
fosfodegron tipo IKB implicado en la fosforilación para el marcaje (Spoel et al. , 2009) y
degradación por proteosoma de la proteína, lo que sugiere que todas las proteína tipo
NPR1 implicadas en la SAR de Arabidopsis y papaya sufren degradación proteosómica.
Las secuencias CpNPR5, AtNPR5 y AtNPR6 no conservan el motivo fosfodegron tipo IKB
(Figura 0.1 ), ni la señal de localización nuclear típicos de las secuencias NPR1 , además
presentan pocos de los amino ácidos implicados en la activación de AtNPR1, esto se
puede deber a que estas secuencias no están implicadas en la SAR, y si en el desarrollo
floral y de la lámina de la hoja, por lo que probablemente las proteínas CpNPR5, AtNPR5
y AtNPR6, requieren sitios de regulación (activación, SLN y degradación) diferentes.
La localización del dominio BTB de NPR1 de la secuencia de Arabidopsis (del aminoácido
65 al 144 en AtNPR1) y el dominio Ankyrin (del aminoácido 294 al 369 en AtNPR1)
determinada con el programa PROSITE coinciden exactamente con los reportados por el
grupo de Liu (2005), mientras que los cuatro dominios Ankyrin reportados anteriormente
por el grupo de Cao (1997) y Piloti (2008) no fueron confirmados por los análisis
realizados, esto se puede deber a las diferentes técnicas de identificación utilizadas, ya
que los grupos de Cao (1997) y Piloti (2008) realizaron la identificación de los dominios
Ankyrin manualmente en base a secuencias consenso del dominio Ankyrin .
La estructura que presenta el árbol filogenético de las secuencias de C. papaya y
Arabidopsis mantiene la estructura de tres ciados reportada para la familia de genes tipo
NPR1 de A. tha/iana (Hepwort et al., 2005) . Esta estructura se mantiene aún en el árbol
donde se analizan las relaciones filogenéticas de otras 28 secuencias tipo NPR1.
lnteresantemente, en cada ciado se encuentra al menos una secuencia tipo NPR1 de C.
papaya.
Sí consideramos las funciones identificadas para los genes de Arabidopsis, podemos
observar una correspondencia entre las funciones de los genes tipo NPR1 y la estructura
filogenética de la familia NPR1 . Ya que hasta el momento AtNPR1 es el único gen
considerado regulador maestro de la SAR (Dong, 2004; Cao et al., 1997) y la secuencia
CpNPR1 se agrupa junto con ella en el mismo ciado, por lo tanto se esperaría que cumpla
con una fu nción similar en el genoma de C. papaya. AtNPR3 y AtNPR4, que se
62
•
Capitulo 11
encuentran en el ciado 11 (Figura 0.6 y Figura 0.7), cumplen la función de ser reguladores
negativos de los genes PR (Zhang et al., 2006) y por lo tanto la SAR. En este mismo
ciado se encuentran las secuencias CpNPR3 y CpNPR4, por lo que se puede inferir que
estas últimas funcionen como reguladores negativos de los genes PR en C. papaya. La
función de AtNPR5 se relaciona con el desarrollo de la simetría floral y no guarda relación
con la SAR (Hepwort et al. , 2005) por lo que la secuencia CpNPR5 de C. papaya muy
probablemente esté involucrada en este proceso y al igual que en Arabidopsis no esté
involucrada en procesos relacionados con la SAR debido a la cercanía filogenética con
AtNPR5.
En base al grado de conservación de los dominios BTB y Ankyrin , así como, al porcentaje
de identidad y la relación filogenética existente entre las secuencias tipo NPR1 de C.
papaya y las de Arabidopsis, podemos concluir que las secuencias CpNPR1 , CpNPR3,
CpNPR4 y CpNPR5 conforman una pequeña familia génica dentro del genoma
secuenciado de la papaya transgénica Sun Up. El aislamiento in silico de las secuencias
tipo NPR1 de papaya nos sirvió de punto de partida para el segundo capítulo de
investigación de esta tesis, pues en base a las secuencias predichas, se realizó el diseño
de los oligos específicos para evaluar la expresión basal de estas secuencias en
diferentes tejidos de una planta de papaya var. Maradol proveniente de una plantación
comercial.
63
Capitulo 11
11.5 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Bent A. F. y D. Mackey. (2007) . Elicitors, Effectors, and R Genes: the new paradigm anda
lifetime supply of questions. Annual Review of Phytopathology 45,399-436.
BIOSINO y Surge C. GENSCAN Server. Disponible en : http://genscanw.biosino.org/.
Borodovsky M., A. Lukashin , A. Lomsadze, V. Ter-Hovhannisyan , Y. Chernoff y M.
Borodovsky. (2005). Eukaryotic GeneMark.hmm. Disponible en:
http://exon. biology.gatech .edu/eukhmm.cgi .
Cao H. , J. Glazebrook, J.D. Clarke, S. Volko y X. Dong. (1997) . The Arabidopsis NPR1
gene that controls systemic acquired resistance encodes a novel protein containing
ankyrin repeats. Cell, 88(1),57- 63.
Cao H., S.A. Bowling, A.S. Gordon y X. Dong. (1994) . Characterization of an Arabidopsis
mutant that is nonresponsive to inducers of systemic acquired resistance. The Plant
Cell, 6 (11),1583-1592.
Cao H. , X. Li y D. Xinnian . (1998) . Generation of broad-spectrum disease resistance by
overexpression of an essential regulatory gene in systemic acquired resistance.
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America
(PNAS), 95,6531-6536.
Chau K.F y A.M. Alvarez. (1983) A historical study of Anthracnose on Carica papaya.
Phytopathology 73, 1113-1116.
Chern M. , H.A. Fitzgerald , P.E. Canlas, D.A. Navarre y P.C. Ronald . (2005) .
Overexpression of a rice NPR1 homolog leads to constitutive activation of defense
response and hypersensitivity to light. Molecular Plant-Microbe lnteractions (MPMI),
18 (6),511-520.
Collins T. , J.R. Stone y A.M. Williams. (2001 ). MINIR.EVIEW: All in the family : the
BTB/POZ, KRAB, and SCAN Domains. Molecular and Cellular Biology, 21 (11 ),3609-
3615.
Dickman M.B. y M.A. Alvarez. (1983) . Latent infection of papaya caused by Col/etotrichum
gloeosporoides. Plant disease 67,748-750.
DNAStar. MegAiign - for DNA and protein sequence alignments and analysis. Disponible
en : http://www.dnastar.com/t-products-lasergene.aspx.
Dong X. (2004) . NPR1 , all things considered. Current Opinion in Plant Biology, 7(5),547-
552.
64
•
Capitulo 11
Durrant W.E. y X. Dong. (2004) . Systemic Acquired Resistance. Annual Review of
Phytopatology, 42,185-209.
Ekengren S.K. , Y. Liu , M. Schiff, S.P. Dinesh-Kumar y G.B. Martín. (2003) Two MAPK
cascades, NPR1, and TGA transcription factors play a role in Pto-mediated disease
resistance in tomate, The Plant JouARNI, 36 (6),905-917.
Endah R., G. Beyene, A. Kiggundu, N.V. Berg, U. Schlu, K. Kunert y R. Chikwamba.
(2008). Plant physiology and biochemistry elicitor and fúsarium-induced expression
of NPR1-Iike genes in banana. Plant Physiology and Biochemistry, 46(11),1007-
101 4.
FAOSTAT. (2009) Índices de producción. Palabras clave: Papayas, México, Wold > (List) ,
2007. Disponible en: http:l/faostat.fao.org/site/612/default.aspx#ancor.
Fitzgerald H.A. , M. Chern, R. Navarre y P.C. Ronald . (2004). Overexpression of (At)NPR1
in rice leads to a BTH- and environment-induced lesion-mimic/cell death phenotype.
MPMI , 17(2),140-51 .
Goff S.A., D. Ricke, T. Lan, G. Presting, R. Wang, M. Dunn, J. Glazebrook, A. Sessions,
P. Oeller, H. Varma, D. Hadley, D. Hutchison, C. Martín , F. Katagiri, B.M. Lange, T.
Moughamer, Y. Xia, P. Budworth, J. Zhong, T. Miguel, U. Paszkowski, S. Zhang, M.
Colbert, W. Sun, L. Chen, B. Cooper, S. Park, T.C. Wood, L. Mao, P. Quail , R. Wing,
R. Dean, Y. Yu, A. Zharkikh, R. Shen, S. Sahasrabudhe, A. Thomas, R. Cannings,
A. Gutin , D. Pruss, J. Reid, S. Tavtigian, J. Mitchell, G. Eldredge, T. Scholl, R.M.
Miller, S. Bhatnagar, N. Adey, T. Rubano, N. Tusneem, R. Robinson , J. Feldhaus, T.
Macalma, A. Oliphant y S. Briggs. (2002). A draft, sequence of the rice genome
(Oryza sativa L. ssp. Japonica). Science 296(5565), 92-1 OO.
Góhre V. y S. Robatzek. (2008). Breaking the barriers: microbial effector molecules
subvert plant immunity. Annual Review of Phytopathology 46,189-215.
Heat M.C. (2000) . Hypersensitive response-related death. Plant Molecular Biology,
44(3) ,321-334.
Henanff G.L., T. Heitz, P. Mestre, J. Mutterer, B. Walter y J. Chong. (2009) .
Characterization of Vitis vinifera NPR1 homologs involved in the regulation of
pathogenesis-related gene expression. BMC Plant Biology, 9, 54.
Hepworth S.R., Y. Zhang, S. Mckim, X. Li y G.W. Haughn. (2005) . Blade-On-Petiole
dependent signaling controls leaf and floral patterning in Arabidopsis. The Plant Cell ,
17,1434-1448.
65
•
Capitulo 11
Hofmann K. y M. Baron . BOXSHADE version 3.21 , online. Disponible en:
http://www.ch .embnet.org/software/BOX_form.html.
Jaillon 0 ., J. Aury, B. Noel, A. Policriti, C. Clepet, A. Casagrande, N. Choisne, S. Aubourg ,
N. Vítulo, C. Jubin, A. Vezzi, F. Legeai , P. Hugueney, C. Dasilva, D. Horner, E. Mica,
D. Jublot, J. Poulain , C. Bruyére, A. Billault, B. Segurens, M. Gouyvenoux, E.
Ugarte, F. Cattonaro, V. Anthouard, V. Vico, C.D. Fabbro, M. Alaux, G.D. Gaspero,
V. Dumas, N. Felice, S. Paillard, l. Juman, M. Moroldo, S. Scalabrin , A. Canaguier,
I.L. Clainche, G. Malacrida, E. Durand, G. Pesole, V. Laucou, P. Chatelet, D.
Merdinoglu , M. Delledonne, M. Pezzotti, A. Lecharny, C. Scarpelli , F. Artiguenave,
M.E. Pé, G. Valle, M. Morgante, M. Caboche, A. Adam-Biondon , J. Weissenbach , F.
Quétier y P. Wincker. (2007). The grapevine genome sequence suggests ancestral
hexaploidization in major angiosperm phyla. Nature 449, 463-467.
Johnson R. y D.R. Knott. (1992) . Specificity in gene-for-gene interactions between plants
and pathogens, Plant Pathology, 41 (1 ), 1-4.
Kader A.A., N.F Sommer y M.L. Arpaia. (2002) . Postharvest Handling Systems: Tropical
Fruits. En: Postharvest technology of horticultura/ crops. Kader, A.A y Adaskaveg,
J.E. (eds) . Oakland, Calif: University of California, Division of Agriculture and Natural
Resources. 3311 (31) , 385-398.
Kinkema M., W. Fan y X. Dong. (2000) . Nuclear localization of NPR1 is required for
activation of PR gene expression. The Plant Cell, 12, 2339-2350.
Larkin , M.A. , G. Blackshields, N.P. Brown, R. Chenna, P.A. McGettigan, H. McWilliam, F.
Valentin , I.M. Wallace, A. Wilm, R. Lopez, J.D. Thompson, T.J . Gibson y D.G.
Higgins, (2008) Clustal X version 2.0.1 O. Disponible en: http://www.clustal.org/.
Lin W.C., C.F. Lu , J.W. Wu, M.L. Cheng, Y.M. Lin, N.S. Yang, L. Black, S.K. Green, J.F.
Wang y C.P. Cheng . (2004). Transgenic tomato plants expressing the Arabidopsis
NPR1 gene display enhanced resistance to a spectrum of fungal and bacteria!
diseases. Transgenic Research, 13(6), 567-581 .
Liu G., E.B. Holub, J.M. Alonso, J.R. Ecker y P.R. Fobert. (2005). An Arabidopsis NPR1-
Iike gene, NPR4, is required for disease resistance. The Plant JouARNI 41 (2), 304-
318.
Liu Y., M. Schiff, R. Marathe y S. P. Dinesh-Kumar. (2002) . Tobacco RAR1 , EDS1 and
NPR1/NIM1 like genes are required for n-mediated resistance to tobacco mosaic
virus. The Plant JouARNI, 30(4), 415-429.
66
•
Capitulo 11
Makandar R., J.S. Essig, M.A. Schapaugh, H.N. Trick y J. Shah. (2006). Genetically
engineered resistance to fusarium head blight in wheat by expression of Arabidopsis
NPR1. Molecular Plant-Microbe lnteractions (MPMI}, 19(2), 123-129.
Malnoy M., Q. Jin, E.E. Borejesza-Wysocka, S.Y. He y H.S. Aldwinckle. (2007) .
Overexpression of the apple MpNPR1 gene confers increased disease resistance in
malus x. Domestica. Molecular Plant-Microbe lnteractions (MPMI) , 20(12) , 1568-
1580.
Mao P. , M. Duan, C. Wei y Y. Li. (2007). WRKY62 transcription factor acts downstream of
cytosolic NPR1 and negatively regulates jasmonate-responsive gene expression.
Plant and Cell Physiology, 48(6), 833-842.
McGinnis M .A. NCBI/NLM/NIH. 45 Center Orive, MSC 6511 , Bldg 45, Room 4AN.44C,
Bethesda, MD 20892.
Ming R. , S. Hou, Y. Feng, Q. Yu , A. Dionne-Laporte, J.H. Saw, P. Senin , W. Wang, B.V.
Ly, K.L. ,T. Lewis, S.L. Salzberg, L. Feng, M.R. Jones, R.L. Skelton, J.E. Murray, C.
Chen, W. Qian, J. Shen, P. Du, M. Eustice, E. Tong, H. Tang, E. Lyons, R.E. Paull ,
T.P. Michael, K. Wall , D.W. Rice, H. Albert, M. Wang, Y.J. Zhu, M, Schatz, N.
Nagarajan, R.A. Acob, P. Guan , A. Bias, C.M. Wai, C.M. Ackerman, Y. Ren , C. Liu ,
J. Wang, J. Wang, J. Na, E.V. Shakirov, B. Haas, J. Thimmapuram, D. Nelson, X.
Wang, J.E. Bowers, A.R. Gschwend, A.L. Delcher, R. Singh , J. Y. Suzuki, S.
Tripathi, K. Neupane, H. Wei , B. lrikura, M. Paidi, N. Jiang, W. Zhang, G. Presting,
A. Windsor, R. Navajas-Pérez, M. J. Torres, F. A. Feltus, B. Porter, Y. Li , A. M.
Burroughs, M. Luo, L. Liu, D. A. Christopher, S.M. Mount, P.H. Moore, T. Sugimura,
J. Jiang, M.A. Schuler, V. Friedman, T. Mitcheii-Oids, D.E. Shippen, C.W.
dePamphilis, J.D. Palmer, M. Freeling, A.H . Paterson, D. Gonsalves, L. Wang y M.
Alam. (2008). The draft genome of the transgenic· tropical fruit tree papaya (Carica
papaya Linnaeus) . Nature 452, 991-997.
Mishra M., R. Chandra y S. Saxena. (2007). Papaya. Serie: Genome mapping and
molecular breeding in plants, vol. 4 fruits and nuts. C. Kole, Springer-Verlag Berlin
Heidelberg, 343-351 .
Moroldo M. , S. Paillard , R. Marconi , L. Fabrice, A. Canaguier, C. Cruaud, V.O. Berardinis,
C. Guichard, V. Brunaud, I.L. Clainche, S. Scalabrin, R. Testolin , G.D. Gaspero, M.
Morgante y A. Adam-Biondon . (2008) . A Pysical map of the heterozygous grapevine
67
•
Capitulo 11
'Cabernet Sauvignon ' allows mapping candidate genes for disease resistance. BMC
Plant Biology, 8(66),1-14.
NCIB. Basic local alignment search tool (blast). Version en línea. Disponible en:
http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi?cmd=web&page_type=blastnews#1 .
O 'Connell R. , S. Perfect, S. Hughes, R. Carzaniga, J. Bailey y J. Green . (2000).
Dissecting the Ce// Biology of Colletotrichum lnfection Processes. Cap. 5. En:
Colletotrichum: Host Specificity, Pathology and Host-Pathogen lnteraction. Prusky
D. , Freeman S. y Dickman M. (eds). American Phytopathological Society Press, St.
Paul, 57-77.
Pieterse C.M.J. y L. C. Van Loan . (2004). NPR1: the spider in the web of induced
resistance signaling pathways. Current Opinion in Plant Biology, 7(4) , 456-464.
Pilotti M., A. Brunetti , A. Gallelli y S. Loreti. (2008). NPR1-Iike genes from cONA of
rosaceous trees: cloning strategy and genetic variation . Tree Genetics & Genomes,
4(1 ),49-63.
Radwan 0 ., S. Mouzeyar, J.S. Venisse, P. Nicolas y M.F. Bouzidi. (2005) . Resistance of
sunflower to the biotrophic oomycete Plasmopara halstedii is associated with a
delayed hypersensitive response within the hypocotyls. JouARNI Of Experimental
Botany, 56(420),2683-2693.
Rachan A. , P. Boyle, T. Wignes, P.R. Fobert y C. Després. (2006) . The coactivator
function of Arabidopsis NPR1 requires the core of its BTB/POZ domain and the
oxidation of e-terminal cysteines. The Plant Cell, 18, 3670-3685.
Softberry, lnc. FGNESH-hmm-based gene structure prediction (multiple genes, both
chains). Disponible en: http://linux1 .softberry.com/berry.phtml?topic=fgenesh&
group=programs&subgroup=gfind.
Spoel S.H., Z. Mou, Y. Tada, N.W. Spivey, P. Genschik y X. Dóng. (2009). Proteasome
mediated turnover of the transcription coactivator NPR1 plays dual roles in regulati ng
plant immunity. Cell , 137(5),860-872.
Swiss lnstitute of Bioinformatics. Translate tool. EXPASY proteomics tools . Disponible en:
http://ca.expasy .org/tools/dna. html.
Tamura K., J. Dudley, Nei M y Kumar S. (2007). MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics
Analysis (M EGA) software version 4.0. Molecular Biology and Evolution 24,1596-
1599.
68
•
Capitulo 11
The Arabidopsis Genome lnitiative (2000). Analysis of the genome sequence of the
flowering plant Arabidopsis thaliana. Nature 408 (6814) , 796-815.
Torto-Aialibo T., C.W. Collmer, M. Lindeberg, D. Bird, A. Collmer y B.M. Tyler. (2009).
Common and contrasting themes in host cell-targeted effectors from bacteria!,
fu ngal , oomycete and nematode plant symbionts described using the Gene
Ontology. BMC Microbiology, 9 (Suppl 1 ), S3.
Tuskan G. A. , S. Difazio, S. Jansson, J. Bohlmann, l. GrigoriEw, U. Hellsten, N. Putnam, S.
Ralph, S. Rombauts, A. Salamov, J. Schein , L. Sterck, A. Aerts, R. R. Bhalerao, R.
P. Bhalerao, D. Blaudez, W. Boerjan, A. Brun , A. Brunner, V . Busov, M. Campbell , J.
Carlson , M. Chalet, J. Chapman, G.-L. Chen, D. Cooper, P. M. Coutinho, J.
Couturier, S. Covert, Q. Cronk, R. Cunningham, J. Davis, S. Degroeve, A. Déjardin ,
C. Depamphilis, J. Detter, B. Dirks, l. Dubchak, S. Duplessis, J. Ehlting , B. Ellis, K.
Gendler, D. Goodstein, M. Gribskov, J. Grimwood, A. Groover, L. Gunter, B.
Hamberger, B. Heinze, Y. Helariutta, B. Henrissat, D. Holligan, R. Holt, W. Huang, N.
lslam-Faridi, S. Jones, M. Jones-Rhoades, R. Jorgensen, C. Joshi , J. Kangasjarvi , J.
Karlsson , C. Kelleher, R. Kirkpatrick, M. Kirst, A. Kohler, U. Kalluri , F. Larimer, J.
Leebens-Mack, J.-C. Leplé, P. Locascio, Y. Lou , S. Lucas, F. Martin , B. Montanini ,
C. Napoli , D. R. Nelson, C. Nelson, K. Nieminen , O. Nilsson, V. Pereda, G. Peter, R.
Philippe, G. Pilate, A. Poliakov, J. Razumovskaya, P. Richardson , C. Rinaldi , K.
Ritland, P. Rouzé, D. Ryaboy, J. Schmutz, J. Schrader, B. Segerman, H. Shin , A.
Siddiqui, F. Sterky, A. Terry, C.-J . Tsai, E. Uberbacher, P. Unneberg, J. Vahala, K.
Wall , S. Wessler, G. Yang , T. Yin , C. Douglas, M. Marra, G. Sandberg, Y. Van De
Peer y D. Rokhsar. (2006). The genome of black cottonwood , Populus trichocarpa
(Torr. & Gray). Science 313 (5793) ,1596 -1604.
Weigel R. R. , C. Bauscher, A.J . Pfitzner y U.M. Pfitzrier. (2001 ). NIMIN-1, NIMIN-2 and
NIMIN-3, members of a novel family of proteins from Arabidopsis that interact with
NPR1/NIM1, a key regulator of systemic acquired resistance in plants. Plant
Molecular Biology, 46 (2) , 143-160.
Weigel R. R. , U.M. Pfitzner y C. Gatz. (2005). lnteraction of NIMIN1 with NPR1 modulates
pr gene expression in Arabidopsis. The Plant Cell , 17,1279-1291.
Yu D., C. Chen y Z. Chen. (2001) . Evidence for an important role of WRKY DNA binding
proteins in the regulation of NPR1 gene expression . The Plant Ce//, 13,1527-1540.
69
•
Capitulo 11
Yu J., S. Hu, J. Wang, G.K. Wong, S. Li , B. Liu , Y. Deng, L. Dai , Y. Zhou, X. Zhang, M.
Cao, J. Liu, J. Sun , J. Tang, Y. Chen, X. Huang, W. Lin , C. Ye, W. Tong , L. Cong, J.
Geng, Y. Han, L. Li, W. Li, G. Hu, X. Huang, W. Li , J. Li , Z. Liu , L. Li , J. Liu , Q. Qi, J.
Liu , L. Li, T. Li , X. Wang, H. Lu , T. Wu, M. Zhu , P. Ni , H. Han , W. Dong, X. Ren, X.
Feng, P. Cui, X. Li, H. Wang, X. Xu , W. Zhai , Z. Xu , J. Zhang, S. He, J. Zhang, J. Xu ,
K. Zhang, X. Zheng, J. Dong, W.Zeng, L. Tao, J. Ye, J. Tan, X. Ren , X. Chen, J. He,
D. Liu , W. Tian , C. Tian , H. Xia, Q. Bao, G. Li, H. Gao, T. Cao, J. Wang, W. Zhao, P.
Li , W. Chen, X. Wang, Y. Zhang, J. Hu , J. Wang, S. Liu , J. Yang , G. Zhang, Y.
Xiong, Z. Li , L. Mao, C. Zhou, Z. Zhu, R. Chen, B. Hao, W. Zheng, S. Chen, W. Gua,
G. Li , S. Liu , M. Tao, J. Wang, L. Zhu, L. Yuan y H. Yang. (2002). A draft sequence
of the rice genome (Oryza sativa L. ssp. Indica). Science 296 (5565),79-92.
Yuexing Y., S. Zhong, Q. Li , Y. Lou, L. Wang, J. Wang, M. Wang, Q. Li , D. Yang y Z. He.
(2007) . Functional analysis of rice NPR1-Iike genes reveals that OsNPR1/NH1 is the
rice orthologue conferring disease resistance with enhanced herbivore susceptibility.
Plant Biotechnology JouARNI, 5 (2),313-324, 2007.
Zhang Y., Y.T. Cheng, N. Qu, Q. Zhao, D. Bi y X. Li . (2006). Negative regu lation of
defense responses in Arabidopsis by two NPR1 paralogs. The Plant JouARNI , 48
8(5),647 -656.
Zhang Z., S. Schwartz, L. Wagner y W. Miller (2000). A greedy algorithm for align ing DNA
sequences. JouARNI of Computational Biology; 7(1-2) ,203-14.
Zhao J., X. Huang, Y. Chen, Y. Chen y X. Huang . (2009) . Molecular cloning and
characterization of an ortholog of NPR1 gene from Dongguan daj iao (Musa spp.
Abb). Plant Molecular Biology Reporter, 27(3),243-249.
70
Capitulo 111
CAPÍTULO 11 1.
CARACTERIZACIÓN DE LA EXPRESIÓN BASAL DE GENES TIPO NPR1
EN CARICA PAPAYA L. VAR. MARADOL
111.1 INTRODUCCIÓN
Carica papaya L. es una planta originaria de América (CONABIO) y de amplia distribución
mundial (Moreno, 1980). Debido a sus características nutricionales y organolépticas, la
papaya es un fruto con gran demanda comercial , se cultiva en 59 países en cuatro
continentes (FAOSTAT, 2009b). México, destaca como el segundo productor y primer
exportador de este fruto a nivel mundial (FAOSTAT, 2009a) y la variedad Maradol genera
más del 96% de las ganancias de este rubro (SIAP, 2008) . Debido a que existen estrictos
estándares de exportación (SAGARPA, 2005; FAO/OMS), hay una importante pérdida de
la producción a nivel post-cosecha ya que la papaya es susceptible a la enfermedad
conocida como Antracnosis producida por el hongo Colletotrichum gloeosporioides (Kader
et al., 2002, Chau y Alvarez, 1983, Dickman y Alvarez, 1983).
Para combatir esta enfermedad los productores se valen de la aplicación de fungicidas
químicos (SAGARPA) . Sin embargo, las plantas poseen de forma natural , barreras de
defensa contra patógenos, a nivel molecular, la resistencia sistémica adquirida (SAR) es
una de las armas más importantes que poseen las plantas para defenderse ante el ataque
de patógenos (Durrant y Dong, 2004; Cao et al., 1997).
La SAR es activada por patógenos que provocan una muerte celular programada necrosis
en la planta como parte de la respuesta hipersensible (HR), una vez activada, la SAR
otorga resistencia de larga duración incluso de por vida y es efectiva contra un amplio
espectro de patógenos (Durrant y Dong, 2004; Cao et al., 1997). Esta respuesta se
produce cuando la célula vegetal identifica ciertas moléculas producidas por los
patógenos llamadas efectores lo que desencadena la HR (Heat, 2000; Pruski et al., 2000)
que a su vez desencadena la SAR (Durrant y Dong, 2004) . Molecularmente la SAR, se
caracteriza por un incremento en la expresión de los genes PR (Durrant y Dong, 2004).
71
•
Capitulo 111
Actualmente se considera al gen NPR1 (no expresivo de genes PR-1) como un regulador
maestro de la SAR (Pieterse y Van Loon, 2004; Cao et al. , 1997; Cao et al., 1994). Este
gen fue aislado por primera vez en 1997 a partir de una mutante de Arabidopsis thaliana
insensible a SA e INA con bajos niveles de expresión de los genes marcadores de la
SAR, PR1 y PR5, denominando a este gen "no expresivo de genes PR-1 " (NPR1 ) (Cao et
al. , 1997; Cao et al., 1994 ). En Arabidopsis, NPR1 pertenece a una pequeña familia
génica que comprende a otros cinco miembros NPR2, NPR3, NPR4, NPR5 y NPR6
(Zhang et al. , 2006; Hepworth et al. , 2005; Liu et al., 2005) .
Existen pocos reportes sobre análisis de expresión basal de los genes tipo NPR1 . En
1998 el grupo de Ca o reporta la presencia de la proteína NPR 1 detectada mediante
lnmuno Blot en muestras de hojas de plantas silvestres de Arabidopsis. Cinco años
después se realiza el primer reporte sobre la identificación de un gen parálogo designado
BOP1 (Biade-On-Petiole1) conocido también como NPR5. Se descubrió que este gen
esta involucrado en el desarrollo de la lámina de la hoja y estructura floral. Posteriormente
se publicó la identificación de los genes NPR4 (Liu et al. , 2005) y NPR3 (Zhang et al. ,
2006) parálogos de NPR1 , y de BOP2 o NPR6 (Hepworth et al. , 2005) . Aproximadamente
una década después de la identificación de la proteína NPR1 en Arabidopsis comienzan
los reportes sobre la identificación mediante PCR de los de ortólogos de NPR1 en
manzana (Malnoy et al. , 2007), uva Chardonnay (Moroldo et al. , 2008) y soya (Sandhu et
al., 2009) .
Este capítulo presenta el análisis de la expresión de la familia NPR1 en C. papaya var.
Maradol.
72
•
Capitulo 111
111.2 MATERIALES Y MÉTODOS
111.2.1 MATERIAL VEGETAL
Se obtuvieron muestras de diferentes tejidos de papaya var. Maradol: peciolo, hoja, flor y
fruto inmaduro de plantas adultas (aproximadamente 1 año de edad) de la plantación
comercial llamada "Rancho Alegre", ubicado a 65 kilómetros de Tizimín y cerca del puerto
de "El Cuyo" dentro del municipio de Tizimín en el estado de Yucatán .
Las superficies de los diferentes tejidos (peciolos, hojas y frutos) se limpiaron con alcohol
al 90% al igual que el material de disección (bisturí y cuchillo) que se utilizaron para hacer
los cortes. Hojas: se tomaron muestras de la lámina de la hoja sin nervaduras. Peciolo: se
tomaron tres muestras de aproximadamente 15 cm de largo del peciolo. Flores: se
el igieron flores con corolas cerradas. Frutos inmaduros: se tomaron los frutos de
aproximadamente 1 O cm de largo, aun en estado de inmadurez fisiológica, el iminando las
semillas al tomar la muestra.
Todas las muestras se guardaron en sobres de aluminio etiquetados con marcador
permanente y se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido hasta que fueron
almacenadas a -80°C en el laboratorio.
111.2.2 EXTRACCIÓN DE ARN
El ARN se extrajo utilizando el protocolo de extracción con CTAB modificado de Gasic et
al., (2004). Todo el proceso de extracción se llevó a cabo a 4°C. Se partió de 100 mg
(peso fresco) de los diferentes tejidos. Se pulverizaron en un mortero util izando nitrógeno
líquido hasta obtener un polvo fino. Se adicionaron 600 ¡JI de buffer de extracción con
CTAB (a 60°C), se mezclaron en vortex. La mezcla se incubó por 15 mina 60° C en baño
maría. Después se agregó 1 volumen de cloroformo: alcohol isoamílico (24: 1) y se incubó
en hielo por 5 min. Posteriormente se centrifugó a 12,000 rpm durante 10 min, se
agregaron 400 ¡JI de LiCI 7.5 M. Se dejó incubando toda la noche a 4° C. Al día siguiente
se centrifugó a 12,000 rpm por 30 min, la pastilla se disolvió en 80 ¡JI de agua ultra pura ,
se agregó 1 O ¡JI de Acetato de Na 3 M pH 5.5 y 25 ¡JI de etanol al 70 %. Se incubó por 3 h
a -80°C. Se centrifugó a 12,000 rpm por 30 min, la pastilla se lavó con 800 ¡JI de etanol al
73
•
Capitulo 111
75 %. Se dejó secar la pastilla colocando el tubo sobre una toalla de papel estéril por 1 O
min y finalmente se resuspendió la pastilla en 15 ¡.JI de agua ultrapura. El ARN extraído se
analizó para observar tanto su calidad así como su rendimiento. Para el análisis de
calidad se fracciono mediante electroforesis en geles de agarosa-TAE al 1.2 %, los cuales
se tiñeron con bromuro de etidio (5 mg/ml) . Posteriormente se visualizaron con ayuda de
un transiluminador de UV de un equipo GeiDoc (Biorad) . La cuantificación del material
obtenido se llevó a cabo mediante las lecturas de absorbancia a 260 y 280 nm en un
espectrofotómetro.
111.2.3 TRATAMIENTO CON ADNASA
Con el fin de eliminar cualquier ADN contaminante de las muestras de ARN, se llevó a
cabo un tratamiento con ADNasa (Promega Corporation) . Se tomaron 8¡.Jg de ARN total a
los que se les agregaron 1 ¡.JI de Buffer de ADNasa 1 Ox, 1 ¡.JI de ADNasa 1 (1 O U/¡.JI) y 1 ¡.JI
de inhibidor de ARNsa. La mezcla se dejó incubar 15 minutos a 30°C posteriormente se
agregó 1 ¡.JI de la solución de paro y se calentó a 65° por 1 O minutos. Las muestras así
procesadas se utilizaron para llevar a cabo la síntesis de ADNc.
111.2.4 SÍNTESIS DE ADNc
Para lograr obtener cadenas de ADNc a partir del ARN se tomó suficiente ARN para 4 ¡.Jg
y se adicionó 1 ¡.J I de Random Primers (Promega) a una concentración de 1 ¡.Jg mL-1 y se
dejo incubar a 70°C por 5 min, posteriormente se incubó por 5 minutos en hielo y se
agregó 9 ¡.JI de la siguiente mezcla de reacción : 4¡.JI de buffer 5x First standard, 2 ¡.JI de
DTT 0.1 M, 0.5 ¡.JI de MgCI2 25m M, 1 ¡.JI de dNTP 's 1 O mM, 0.5 j.JI .de AARNsa OUT (40 ¡.Jr1)
1
y 1 ¡.JI de RT o H20 según sea el caso (RT+ ó RT). La preparación se mezcló suavemente
y después se incubo a 25°C por 5 minutos, seguido de 42°C pór 105 minutos y finalmente
a 70°C por 25 minutos. Las muestras fueron almacenadas a -20°C hasta ser utilizadas.
74
•
Capitulo 111
111.2.5 DISEÑO DE OLIGONUCLEÓTIDOS ESPECÍFICOS
El diseño de oligonucleótidos específicos para la RT-PCR convencional se realizó por
medio de análisis bioinformáticos. Con el programa CLUSTALX (Larkin et al., 2008) por
medio de una matriz de serie Gonnet para proteína con una penalización de 10 por
apertura de espaciós, de 0.2 por ampliación de espacios, 30% de intervalo en secuencias
divergentes, sin utilizar el parámetro de matriz negativa, se realizó un alineamiento de
nucleótidos de los marcos de lectura abiertos predichos para las secuencias tipo NPR1
aisladas in silico en C. papaya , los nucleótidos idénticos y conservados fueron
sombreados con el programa Boxshade (Hofmann y Baron) con un valor de 0.5 de
fracción de las secuencias, un formato de entrada ALN y RTF _new de salida, sin línea de
consenso. Los oligonucleótidos se diseñaron procurando que tuvieran una longitud de 20-
25 bases, con una Tm mayor de 50°C y una proporción de GC del 50%. Se buscó
además que el amplicón se encontrará en la zona central de la secuencia predicha, que
tuviera una longitud de 200 a 300 bp y que atravesará por lo menos un intron. Los
oligonucleótidos diseñados se muestran en el Cuadro 111.1 .
Cuadro 111.1 Oligonucleótidos específicos diseñados para la RT-PCR de las secuencias tipo NPR1
de C. papaya
Secuencia Secuencias de los oligonucleótidos Posición dentro Tamaño esperado tipo NPR1 de la secuencia del amplicón (bp) CpNPR1 sentido 5.-TGGCCCTTT ATCAGCGGCAC-3. 530-549
246 antisentido 5"-TCCTACCTTCAGGGCCTTG-3. 156-775
CpNPR3 sentido 5.-TCCA TT ATGCTGTGGCATAC-3. 662-681 204
antisentido 5.-T AACAGAACTCTGCCCATCC-3" 646-865 CpNPR4 sentido 5.-TGA TTTGGAAGTGGACGCTG-3" 741-760
225 antisentido 5" -AGGCCTCGAGGGTTCCT AA-3 . 947-965
CpNPR5 sentido 5.-TGGCTCGGCGTTCACTT ATG-3" 667-687 216
antisentido 5" -AAGCCCTTCTCCCATCACC-3" 853-874 Actina sentido 5.-TGAGCAAGAGTTGGAGACTG-3. 674-694 141
antisentido 5.-TCCA TTCCAA TGAGTGAGGG-3. 795-815
75
•
Capitulo 111
111.2.6 CONDICIONES DE AMPLIFICACIÓN DE LA RT -PCR (REACCIÓN EN
CADENA DE LA POLIMERASA)
Para analizar la expresión de los genes tipo NPR1 se utilizó la técnica RT-PCR mediante
la cual se puede analizar la expresión de los diferentes genes. Se analizó la expresión de
los 4 genes tipo de NPR1. Para llevar a cabo los análisis de expresión de cada gen,
inicialmente se evaluaron diferentes temperaturas de alineamiento, número de ciclos y
tiempos de desnaturalización y alineación. Se establecieron las condiciones de RT-PCR
para cada gen tipo NPR1 . De igual modo se evaluó la expresión de varios genes con
expresión constitutiva y se establecieron las condiciones de RT -PCR para su análisis. El
gen control que se estableció fue el gen de Actina el cual presentó una buena
amplificación y con el tamaño del producto adecuado (amplicon 141 pb) . La expresión de
los genes tipo NPR1 se ana lizó amplificando su ARNm llevando a cabo el siguiente
protocolo. La mezcla de reacción contenía 11-JI de ARN, 11-JI del oligo sentido y 11-JI del oligo
antisentido (Sigma) (según el cuadro 0). Cada oligo se utilizó a una concentración de
1 01-JM , se adicionaron 51-JI de buffer para PCR 1 Ox (lnvitrogen), 1.51-JI de MgCI2(1nvitrogen),
11-JI de dNTP 's a 1 01-JM (lnvitrogen), 0.21-JI de Taq Polimerasa (lnvitrogen) (5U/1JI) y 38.8 IJI
de agua ultra pura para obtener un volumen final de reacción de 501-JI. Los geles de
expresión de la secuencia CpNPR5 fueron obtenidos por la Dr. Gabriela Fuentes Ortiz.
El protocolo para la determinación de PCR consistió en un paso inicial de
desnaturalización de 95° por 3 minutos, 35 ciclos con 30 segundos de desnaturalización a
95°C, 30 segundos de alineamiento a 55°C y 1 minuto a extensión a 72°C. Finalmente se
llevó a cabo una incubación a 72°C por 5 minutos para asegurar una completa extensión
de las secuencias y al término del programa se mantuvieron las muestras a 4°C. Los
productos de PCR se fraccionaron mediante electroforesis en gel de agarosa-TAE al 1.2
% y se tiñeron con bromuro de etidio (5 mg/ml) . Las bandas obtendidas se visualizaron
con ayuda de un transiluminador de UV y un equipo GeiDoc (Biorad).
76
•
Capitulo 111
111.3 RESULTADOS
111.3.1 EXTRACCIÓN DE ARN Y TRATAMIENTO CON ADNASA
Con el método de CTAB se obtuvo ARN de buena calidad y con altos rendimientos. Los
cuatro tejidos de papaya seleccionados: peciolo, hoja, flor y fruto tuvieron una buena
extracción de ARN tanto en calidad como en cantidad (Cuadro 111.2). Cabe señalar, que el
peciolo , requirió de una mayor cantidad de muestra inicial para lograr un rendimiento
comparable al de los otros tejidos antes mencionados. El protocolo de extracción
utilizando CTAB permitió la obtención de las 2 bandas ribosomales nítidas (25S y 18S)
(Figura 111.1 y Figura 111.2).
Cuadro 111.2. Resultados de las lecturas realizadas de las muestras de los cuatro tejidos de estudio. Se presenta la relación A260/A280 como indicador de pureza y la concentración en 1-19 de ARN por mg de tejido como indicador de rendimiento.
A260 de ARN Tejido A260 A280 --
A280 mg de tejido
Peciolo 0.01533 0.00713 2.15 0.0298
Hoja 0.0182 0.0084 2.16 0.1851
Flor 0.0391 0.0192 2.03 0.1965
Fruto 0.0200 0.0100 2.00 0.1846
En las extracciones de los tej idos de hoja, flor y fruto se observó la presencia de ADN , por
lo cual se hizo necesario realizar un tratamiento con ADNasa para todos los tejidos, y así
eliminar el ADN y evitar con esto los falsos positivos en las muestras sin retrotranscriptasa
(Figura 111. 3).
77
•
Figura 111.1 Gel de extracción de ARN de hoja y fruto. El gel se fraccionó por electroforesis en agarosa al 1.2% y fue teñido con bromuro de etidio. Se señalan las bandas 25S y 18S, así como la banda de ADN.
Capitulo 111
Figura 111.2 Gel de extracción de ARN de flor y peciolo. Gel fraccionado por electroforesis en agarosa al 1.2% y teñido con bromuro de etidio. Se señalan las bandas 25S y 18S, así como la banda de ADN.
Se realizó un ensayo para determinar si la cantidad de ADN que se obtenía en las
extracciones era suficiente para producir falsos positivos, para ello se probó el
oligonucleótido de CpNPR4. Se realizó una amplificación con ADNc sintetizado a partir de
ARN a 2¡.Jg. En ausencia de ADNasa se detectó un falso positivo (RT-), mientras que con
el tratamiento de A O Nasa sólo se detectó una banda en RT + (Figura 11 1.3).
Figura 111.3 Amplificación del gen CpNPR4 en C. papaya var. Maradol con y sin ADNasa . Con ADNc sintetizado partiendo de 2¡.Jg de ARN. Los amplicones se fraccionaron por electroforesis en gel de agarosa al 1.2% teñido con bromuro de etidio . Tamaño esperado del amplicon : CpNPR4: 225pb.
78
•
Capitulo 111
111.3.2 ANÁLISIS DE EXPRESIÓN BASAL EN C. PAPA YA VAR. MARADOL.
Como se observa en la
Figura 11 1.4 los transcriptos de los genes CpNPR1, CpNPR3, CpNPR4 y CpNPR5 están
presentes en los cuatro tejidos analizados: hoja, peciolo, flor y fruto. Se observa que el
gen control CpActina tiene una expresión constitutiva en todos los tejidos como se
esperaba.
En el caso de CpNPR1 se observa una mayor señal en flor y hoja y menor en peciolo y
fruto . En el caso de CpNPR3 y se observó una menor señal en fruto. La señal de CpNPR4
se observó mayor en tejido de peciolo, hoja y flor y particularmente baja en fruto. En lo
que se refiere a CpNPR5 la mayor señal fue en peciolo, flor y fruto y una señal muy débil
en hoja.
~o o 300
CpNPRl l OO 100
~00
300
CpNPR3 2oo
CpNPR4
CpNPRS
CpActina RT(+)
CpActina RT(-)
l OO
400
300
200 100
~00
)00
l OO lOO
~o o 300
l OO
100
400
300
200
100
MPM Peciolo Hoja Flor Fruto
Figura 111 .4 Amplificaciones de los genes tipo NPR1 en C. papaya var. Maradol con ADNc sintetizado partiendo de 2¡.Jg de ARN . Los amplicones se fraccionaron por electroforesis en gel de agarosa al 1.2% teñido con bromuro de etidio. Tamaño esperado de los amplicones: CpNPR1 : 246pb, CpNPR3: 204pb, CpNPR4: 225pb, CpNPR5: 216pb, CpActina: 141pb.
79
Capitulo 111
111.4 DISCUSIÓN
Desde el descubrimiento de la mutante de Arabidopsis npr1 se han realizado enormes
esfuerzos para entender el funcionamiento de este gen y su proteína codificante. Sin
embargo, los reportes previos sobre análisis de expresión basal de NPR1 se enfocan a
servir como una herramienta para identificar la presencia de este gen en estudios dirigidos
a identificar los niveles de expresión de NPR1 ante algún inductor (Cao et al. , 1998;
Henanff et al., 2009; Sandhu et al., 2009) , o al ser sobrexpresado (Manloy et al., 2007).
Por otro lado, existen pocos reportes que aborden el estudio de los parálogos a NPR1
(Zhang et al. , 2006; Liu et al., 2005; Hepworth et al., 2005; Ha et al., 2004) .
Se ha reportado la detección de la proteína NPR1 mediante Westernblot a partir de
extracciones de hoja de plantas silvestres de Arabidopsis (Mou et al., 2003; Kinkema et
al. , 2000; Cao et al. , 1998) y manzana (Manloy et al., 2007) sin ningún tipo de inducción,
así como la presencia de expresión basal de los respectivos ortólogos en uva (Henanff et
al., 2009) y soya (Sandhu et al., 2009) detectados mediante RT-PCR. El estudio de
Sandhu et al., (2009) documenta la presencia del ADNc de NPR1 en hoja, flor, fruto y tallo
(este último es un tejido de conducción similar al peciolo que fue el tejido seleccionado en
nuestro estud io) en soya, al igual que nuestro estudio en papaya. La expresión
constitutiva del transcripto de CpNPR1 en los tejidos analizados de papaya y soya
(Sandhu et al., 2009) resulta por demás interesante y apoya la teoría que predice la
presencia de niveles de expresión basales de este gen como una estrategia de defensa
de las plantas en espera de algún patógeno (Mou et al. , 2003; Pieterse y Van Loon,
2004) .
En el descubrimiento y estudio de los genes AtNPR3 y AtNPR4 se han utilizado
preferentemente mutantes, analizando el tejido de hoja (Zhang et al., 2006; Liu et al. ,
2005) . Existe un antecedente de expresión basal de los genes AtNPR5 y AtNPR6 en hoja,
tallo, ápice flor y raíz de Arabidopsis (Hepwort et al., 2005).
La presencia y expresión basal de los genes CpNPR3 y CpNPR4 se comprobó en hoja,
peciolo, flor y fruto de papaya Maradol. Previamente se había reportado la expresión
basal en hoja de los ortólogos AtNPR3 y AtNPR4 (Liu et al. , 2005). A estos genes se les
ha conferido la función de ser reguladores negativos del gen AtNPR1 (Zhang et al., 2006).
La proteína NPR1 no posee un sitio propio de unión a ADN, por lo que depende de su
80
Capitulo 111
interacción con los factores de transcripción TGA, para poder acoplarse al promotor de los
genes PR (Rochon et al. , 2006; Dong, 2004). Las proteínas AtNPR3 y AtNPR4 también
son capaces de unirse a los factores de transcripción TGA (Zhang et al. , 2006).
Al igual que el presente estudio, Ha et al., (2004) y Hepworth et al., (2005) lograron aislar
ortólogos de AtNPRS en peciolo, hojas y flor, sin embargo, no lograron encontrar copias
del transcripto en el fruto de Arabidopsis (silicua) . Estos resultados contradictorios, quizás
se puedan explicar por el hecho de que en nuestro estudio, el fruto analizado se
encontraba en los primeros estados de desarrollo, y quizás en este periodo aun es
necesaria la presencia de la proteína tipo NPRS y su expresión se apaga cuando los
frutos llegan a la madurez fisiológica. Otro posible escenario que podría dar una
explicación a estas diferencias sería aquel donde NPRS es un ARN mensajero raro en los
frutos y debido a que el fruto de Arabidopsis es una silicua, carente de pulpa, a diferencia
de las bayas carnosas de papaya, que en cualquier estado de madurez produce mucho
más pulpa que el fruto de Arabidopsis. Esta diferencia en la estructura de los frutos y en
los patrones de expresión sugiere que el mensajero de NPRS es más fácil de identificar
en frutos grandes y carnosos que en frutos pequeños y delgados.
Trabajos anteriores se han abocado a la identificación del gen NPR1 (Ca o et al. , 1994) y
su funcionamiento (Kinkema et al., 2000; Pietersen y Van Loon, 2004; Rochon et al.,
2006; Spoel et al., 2009), estos trabajos se han realizado principalmente en plantas de
Arabidopsis mutantes y/o tratadas con algún inductor de la SAR (ácido salicílico, INA,
BTH o algún patógeno) y usualmente el tejido analizado es la hoja.
81
•
Capitulo 111
111.5 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Cao H., J. Glazebrook, J.D. Clarke, S. Volko y X. Dong. (1997). The Arabidopsis NPR1
gene that controls systemic acquired resistance encodes a novel protein containing
ankyrin repeats. Cell. 88(1 ),57- 63.
Cao H., S.A. Bowling, A.S. Gordon y X. Dong. (1994) . Characterization of an Arabidopsis
mutant that is nonresponsive to inducers of systemic acquired resistance. The Plant
Cell , 6 (11),1583-1592.
Cao H., X. Li y D. Xinnian . (1998). Generation of broad-spectrum disease resistance by
overexpression of an essential regulatory gene in systemic acquired resistance.
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America
(PNAS), 95,6531-6536.
Chau K.F y A.M . Alvarez. (1983) A historical study of Anthracnose on Carica papaya .
Phytopathology 73, 1113-1116.
Chern M., H.A. Fitzgerald , P.E. Canlas, D.A. Navarre y P.C. Ronald. (2005) .
Overexpression of a rice NPR1 homolog leads to constitutive activation of defense
response and hypersensitivity to light. Molecular Plant-Microbe lnteractions (MPMI) ,
18 (6),511-520.
CONABIO. Carica papaya. Disponible en : http://www.conabio.gob.mx/conocimiento/
info_especies/arboles/doctos/23-caric1 m.pdf.
Delaney T.P., L. Friedrich y J.A. Ryals. (1995). Arabidopsis signa! transduction mutant
detective in chemically and biologically induced disease resistance. Proceedings of
the National Academy of Sciences of the United States of America (PNAS), 92,6601-
6606.
Dickman M.B. y A.M. Alvarez (1983) . Laten lnection of Papaya Cused by Colletotrichum
gloesporioides. Plant Disease 67,748-750.
Dong X. (2004) . NPR1 , all things considered. Current Opinion in Plant Biology, 7(5) ,547-
552.
Durrant W.E. y X. Dong. (2004). Systemic Acquired Resistance. Annual Review of
Phytopatology, 42,185-209.
82
•
Capitulo 111
FAO/OMS. (2005) . Norma del Codex para la papaya (CODEX STAN 183-1993).
Disponible en: http://www .codexalimentarius. netldown load/standards/314/CXS_
183s.pdf.
FAOSTAT. (2009a) FAO dirección de estadística 2009. Palabras clave: Papayas, México,
Wold > (List), 2007. Disponible en: http:l/faostat.fao.org/site/567/desktopdefault.
aspx?pageid=567#ancor.
FAOSTAT. (2009b) Índices de producción. Palabras clave: Papayas, México, Wold >
(List), 2007. Disponible en: http:l/faostat.fao.org/site/612/default.aspx#ancor.
Fitzgerald H.A. , M. Chern, R. Navarre y P.C. Ronald . (2004) . Overexpression of (At)NPR1
in rice leads to a BTH- and environment-induced lesion-mimic/cell death phenotype.
MPMI, 17(2),140-51 .
Gasic K., A. HeARNndez, S. Korban . (2004) . ARN extraction from different apple tissues
rich in polyphenols and polysaccharides for cONA library construction . Plant
Molecular Biology Reporter, 22(4),437-438, 2004.
Ha C.M. , J.H. Jun, H.G. Nam, J.C. Fletcher y T. B. Bop. (2004). Blade-on-Petiole1 encodes
a BTB/Poz domain protein required for leaf morphogenesis in Arabidopsis tha/iana ,
Plant Cell Physiology, 45(1 0), 1361-1370.
Heat M.C. (2000) . Hypersensitive response-related death. Plant Molecular Biology,
44(3),321-334.
Hepworth S.R., Y. Zhang, S. Mckim, X. Li y G.W. Haughn . (2005) . Blade-On-Petiole
dependent signaling controls leaf and floral patterning in Arabidopsis. The Plant Cell,
17,1 434-1448.
Hofmann K. y M. Baron . BOXSHADE version 3.21 , online. Disponible en:
http://www.ch .embnet.org/software/BOX_form.html.
Kader A.A., N.F Sommer y M.L. Arpaia. (2002) . Postharilest Handling Systems: Tropical
Fruits. En: Postharvest technology of horticultura/ crops. Kader, A.A y Adaskaveg ,
J.E. (eds). Oakland, Calif: University of California, Division of Agriculture and Natural
Resources. 3311 (31 ), 385-398.
Kinkema M. , W. Fan y X. Dong. (2000). Nuclear localization of NPR1 is required for
activation of PR gene expression. The Plant Cell , 12, 2339-2350.
Larkin , M.A. , G. Blackshields, N.P. Brown, R. Chenna, P.A. McGettigan, H. McWilliam, F.
Valentin , I.M. Wallace , A. Wilm, R. Lopez, J.D. Thompson, T.J. Gibson y D.G.
Higgins, (2008) Clustal X version 2.0.1 O. Disponible en: http://www.clustal.org/.
83
•
Capitulo 111
Lin W.C., C.F. Lu, J.W. Wu, M.L. Cheng, Y.M. Lin, N.S. Yang, L. Black, S.K. Green, J.F.
Wang y C.P. Cheng. (2004) . Transgenic tomato plants expressing the Arabidopsis
NPR1 gene display enhanced resistance to a spectrum of fungal and bacteria!
diseases. Transgenic Research, 13(6),567 -581.
Liu G., E.B. Holub, J.M. Alonso , J.R. Ecker y P.R. Fobert. (2005). An Arabidopsis NPR1-
Iike gene, NPR4, is required for disease resistance. The Plant JouARNI 41 (2) ,304-
318.
Makandar R., J.S. Essig, M.A. Schapaugh, H.N. Trick y J. Shah. (2006) . Genetically
engineered resistance to fusarium head blight in wheat by expression of Arabidopsis
NPR1. Molecular Plant-Microbe lnteractions (MPMI) , 19(2), 123-129.
Malnoy M., Q . Jin, E.E. Borejesza-Wysocka, S.Y. He y H.S. Aldwinckle. (2007).
Overexpression of the apple MpNPR1 gene confers increased disease resistance in
ma/us x. Domestica. Molecular Plant-Microbe lnteractions (MPMI) , 20(12) , 1568-
1580.
Moreno, N. (1980). Caricácea. Flora de Veracruz. 1 O, 1-17.
Mou Z., W. Fan, X. Dong y N. Carolina. (2003) . lnducers of plant systemic acquired
resistance regulate NPR1 function through redox changes. Cell , 113(7), 935-944.
Pieterse C.M.J. y L.C. Van Loon . (2004) . NPR1 : the spider in the web of induced
resistance signaling pathways. Current Opinion in Plant Biology, 7(4) , 456-464.
Prusky D., l. Kobiler, R. Ardi , D. Beno-Moalem, N. Yakoby y N.T. Keen . (2000).
Resistance mechanisms of Subbtropical Fruits to Colletotrichum g/oesporioides. Cap
14. En: Col/etotrichum: Host Specificity, Pathology and Host-Pathogen lnteraction.
D. Prusky, S. Freeman y M. Dickman (eds). American Phytopathological Society
Press, 232-244.
Rochon A. , P. Boyle, T. Wignes, P.R. Fobert y C. Després. (2006) . The coactivator
function of Arabidopsis NPR1 requires the core of its BTB/POZ domain and the
oxidation of e-terminal cysteines. The Plant Cell , 18,3670-3685.
SAGARPA (Secretaria de Agricultura, Ganadería, Desarrollo Rural , Pesca Y Alimentación) . (2005) Plan Rector Sistema Nacional Papaya. Segunda fase: Diagnóstico inicial base de referencia estructura estratégica, México D.F. , 46p.
Sandhu D., I.M. Tasma, R. Frasch y M.B. Bhattacharyya. (2009) . Systemic Acquired
Resistance in soybean is regulated by two proteins, orthologous to Arabidopsis
NPR1 . BMC Plant Biology, 9,105.
84
•
Capitulo 111
SIAP (Servicio de Información Agroalimentaria y Pesquera) . (2008) . Anuario Estadístico de la Producción Agrícola. PRODUCCION AGRICOLA: Ciclo: Cíclicos y Perennes 2007. Modalidad: Riego + Temporal. Resumen Cultivos. Disponible en: http://www.siap.gob. mx/ventana.php?idliga= 1 042&tipo= 1.
Spoel S.H., Z. Mou , Y. Tada, N.W. Spivey, P. Genschik y X. Dong. (2009) . Proteasome
mediated turnover of the transcription coactivator NPR1 plays dual roles in regulating
plant immunity. Cell , 137(5),860-872.
Ying L. , G. Chenxi y H. Bin. (2006). Sequence analysis of mARN polyadenylation signals of rice genes. Chinese Science Bulletin , 51 (9), 1069-1077.
Zhang C. y A.D. Shapiro. (2002) . A Genomic approach to identify regulatory nades in the
transcriptional network of Systemic Acquired Resistance in plants. BMC plant biology
2:9, Disponible en: http://www.biomedcentral.com/1471-2229/2/9.
Zhang Y., Y. T. Cheng, N. Qu, Q. Zhao, D. Bi y X. Li. (2006) . Negative regulation of
defense responses in Arabidopsis by two NPR1 paralogs. The Plant JouARNI, 48
8(5) ,64 7-656.
Zhu Y.J., R. Agbayani, W. Nishijima y P. Moore. (2007). Characterization of disease
resistance of Carica papaya to Phytophthora. ISHS Acta Horticulturae, 740,265-269.
85
•
Capitulo IV
CAPÍTULO IV.
IV.1 DISCUSIÓN GENERAL
Desde los inicios de la agricultura, los patógenos vegetales han sido la causa de un
importante porcentaje de las pérdidas de los cultivos, reflejándose directamente sobre la . disponibilidad de alimento y el desarrollo de las sociedades humanas (Baker et al., 2008;
Martin et al., 2003) . Lograr controlar estas enfermedades es uno de los principales
objetivos de los programas de agricultura (Martin et al., 2003). Por mucho tiempo esto se
logró con la selección de biotipos resistentes y la utilización del control químico, sin
embargo, en años recientes se han observado los efectos adversos de estos productos en
el medio ambiente e incluso en la salud humana, por lo que es necesario el desarrollo de
estrategias más seguras en el control de enfermedades. Los estudios sobre las
interacciones existentes entre patógenos y plantas, así como de sus respuestas, han
elucidado la existencia de sistemas de defensa vegetal además de haber identificado
algunos factores clave que promueven la resistencia contra patógenos (Gachomo et al.,
2003). Uno de estos elementos clave es el gen NPR1 (non Expresser of PR genes 1) ya
que es un regulador positivo de la resistencia sistémica adquirida (Malnoy et al., 2007;
Makandar et al., 2006; Chern et al., 2005; Delaney et al., 1995; Fitzgerald et al., 2004; Lin
et al., 2004; Cao et al., 1997). Este gen pertenece a una familia génica de seis miembros
en Arabidopsis (Zhang et al. , 2006; Liu et al., 2005; Hepwort et al. , 2005; Cao et al., 1997).
Desde el descubrimiento de estos genes se ha reportado la presencia de homólogos al
gen NPR1 en por lo menos siete especies de plantas (Zhao et al., 2009; Endah et al.,
2008; Henanaff et al., 2008; Malnoy et al. , 2007; Yuexing et al., 2007; Chern et al., 2005;
Radwan et al., 2005; Ekengren et al., 2003; Liu et al., 2002) y en igual número de
especies se ha logrado la identificación de homólogos al gen NPR4 (Henanaff et al., 2008;
Pilotti et al., 2008) .
En la presente tesis se reporta la identificación in silico de cuatro secuencias genómicas
tipo NPR1 en el genoma secuenciado de C. papaya Sun UP. Estas secuencias fueron
nombradas CpNPR1, CpNPR3, CpNPR4 y CpNPR5. También se reportan sus perfiles de
expresión basal en cuatro tejidos (peciolo, hoja, flor y fruto) de papaya Maradol.
86
•
Capitulo IV
Las secuencias tipo NPR1 de papaya se compararon con todas las secuencias tipo NPR1
de Arabidopsis. Todas estas secuencias tienen en común la presencia de un dominio BTB
y una región de repeticiones de Ankyrin característicos de las secuencias tipo NPR1
(Rochon et al., 2006; Liu et al., 2005; Hepwort et al. , 2005; Cao et al. , 1997). La presencia
de un tercer motivo denominado fosfodegron tipo IKB relacionado con la fosforilación para
el marcaje y degradación de la molécula (Spoel et al., 2009) estuvo presente en las
secuencias CpNPR1, CpNPR3 y CpNPR4. Las cuatro seclfencias tipo NPR1 de papaya,
se distribuyeron en tres ciados filogenéticos (ver Figura 0.6) , junto con las secuencias tipo
NPR1 de Arabidopsis. Utilizando como criterio la presencia o ausencia del motivo
fosfodegron tipo IKB, estos ciados pueden ser agrupados en dos clases: la primera que
agrupa los ciados 1 y 11 cuyas secuencias presentan el motivo fosfodegron tipo IKB y una
segunda clase a la cual pertenecería el ciado 111 que agrupa las secuencias carentes de
este motivo.
Es posible observar una relación entre la distribución de los ciados y las funciones
identificadas para los genes tipo NPR1 de Arabidopsis. La secuencia CpNPR1 se
relaciona con AtNPR1, identificado como un gen regulador positivo de la transcripción de
los genes PR (Dong, 2004; Cao et al., 1997) por lo que, la secuencia de C. papaya podría
tener una función similar. Las secuencias CpNPR3 y CpNPR4 son homologas a las
secuencias AtNPR3 y AtNPR4, identificadas hasta el momento como reguladores
negativos de los genes PR por competencia de los factores de transcripción tipo TGA
(Zhang et al., 2006) y por lo tanto de la SAR, así que se esperaría que tanto CpNPR3
como CpNPR4 realizaran una función equivalente al interactuar con los TGA de papaya.
Mientras que la secuencia CpNPR5 que se relaciona con AtNPR5 y AtNPR6, siendo los
únicos miembros de la familia génica tipo NPR1 cuya función no está involucrada con la
SAR, ya que sus funciones están más relacionadas con la morfofisiología floral y foliar
(Hepwort et al., 2005), de modo que resulta factible que CpNPR5 se encuentre regulando
este proceso morfológico y no procesos relacionados con la SAR.
La presencia de los cuatro genes: CpNPR1, CpNPR3, CpNPR4 y CpNPR5 identificados
en el genoma secuenciado de papaya Sun Up se confirmó en el genoma de papaya
Maradol, mediante el análisis de la expresión de estos genes por medio de RT-PCR al
detectarse la presencia de los transcriptos de dichos genes en los cuatro tejidos
seleccionados para el estudio: hoja, peciolo, flor y fruto.
87
Capitulo IV
Es probable que las secuencias CpNPR1, CpNPR3 y CpNPR4 se encuentren
involucradas en la regulación de la expresión de los genes PR y por tanto de la SAR. Los
genes PR se regulan positivamente por CpNPR 1 (Cao et al., 1997; Delaney et al. , 1995) y
negativamente por CpNPR3 y CpNPR4 (Zhang et al., 2006) . En un estudio realizado por
Zhang y colaboradores (2006) en mutantes de Arabidopsis cuyos genes NPR3 y NPR4
fueron silenciados, se observó que las plantas mutantes presentaban un aumento de la
expresión de los genes PR1 , PR2 y PR5 además de un aumento en Ja resistencia contra
bacterias y hongos, en comparación con las plantas silvestres; lo cual contrasta con lo
observado en la mutante npr1 (Cao et al., 1994). Del mismo modo en pruebas de dos
híbridos, se ha observado que existe interacción entre los factores de transcripción TGA2,
TGA3, TGA5 y TGA6 con NPR1, NPR3 y NPR4 (Zhang et al. , 2006; Liu et al., 2005;
Kinkema et al. , 2000) . Debido a estos resultados Zhang y su grupo concluyen que: es
posible que NPR3 y NPR4 regulen negativamente la expresión de los genes PR-1 y la
resistencia a patógenos a través de su asociación con los TGA, compitiendo con NPR1
para poder llevar a cabo esta interacción en plantas no inducidas o que una vez dada la
interacción con el TGA, se permita la transcripción de algún posible regulador negativo de
los genes PR y la SAR.
Debido a la función antagónica que han demostrado poseer NPR1 , NPR3 y NPR4 en
Arabidopsis y que los tres genes CpNPR1, CpNPR3 y CpNPR4 se expresan juntos en los
mismos tejidos analizados (peciolo, hoja, flor, fruto) en papaya y teniendo en cuenta que
las tres secuencias podrían ser degradadas por el proteosoma ya que presentan el motivo
fosfodegron tipo IKB al cual se le ha conferido esta función , se podría especular que los
genes NPR1 , NPR3 y NPR4 regulan conjuntamente la transcripción de los genes PR y de
la SAR, a su vez los genes NPR1 , NPR3 y NPR4 están regulados por características
estructurales propias de este tipo de proteínas que impiden el encendido innecesario de la
SAR, como lo son la degradación proteosómica y la falta de sitios de unión a ADN.
CpNPR5 se logró identificar en los cuatro tejidos: hoja, peciolo, flor y fruto. Por los
antecedentes en A. thaliana (Hepworth et al., 2005; Ha et al. , 2004) se esperaba que esta
secuencia estuviera ausente en el fruto , sin embargo la identificación de la secuencia
CpNPR5 en el fruto de papaya podría deberse a que las diferencias inherentes en la
morfofisiología de los frutos de ambas especies (la baya carnosa de papaya y la silicua
finas y delgadas de Arabidopsis) se reflejen en las discrepancias observadas sobre la
88
•
Capitulo IV
abundancia del mensajero de NPR5 dentro de este tejido en ambas especies. Un
segundo escenario propondría ser aquel donde la expresión de este gen se apaga cuando
los frutos llegan a la madurez fisiológica .
IV.2 CONCLUSIONES
1. En el presente trabajo se identificó la presencia de cuatro genes tipo NPR1 (CpNPR1 ,
CpNPR3, CpNPR4 y CpNPR5) en el genoma secuenciado de Carica papaya; la similitud
estructural y relaciones filogenéticas entre estas secuencias permitió concluir que forman
parte de una pequeña familia génica del tipo NPR 1.
2. Sólo las secuencias CpNPR1, CpNPR3 y CpNPR4 comparten el motivo fosfodegron
tipo IKB y la señal de localización nuclear con la secuencia NPR1 de Arabidopsis.
3. Se propone la presencia/ausencia del motivo tipo IKB como un criterio para la división
en dos clases de esta familia: una clase que presenta este motivo y está relacionada con
la SAR y una segunda clase que carece de este motivo y está involucrada en la
morfofisiología foliar y floral.
4. La expresión de los genes: CpNPR1, CpNPR3, CpNPR4 y CpNPR5 se detectó en el
transcriptoma de papaya var. Maradol por medio de RT-PCR.
5. Las cuatro secuencias tipo NPR1 presentaron expresión basal en los tejidos de peciolo,
hoja, flor y frutos inmaduros de papaya Maradol.
IV.3 PERSPECTIVAS
Los estudios presentados en esta tesis de Maestría servirán de base a futuras
investigaciones orientadas a la obtención de papayas con mayor resistencia a patógenos.
Un primer punto es completar la caracterización de los niveles de expresión basal de
estos genes en términos cuantitativos mediante análisis de Q-PCR.
89
•
Capitulo IV
Otro punto importante sería logar la caracterización de los niveles de expresión mediante
análisis de Q-PCR en respuesta a ácido salicílico (SA) ya que esta molécula funciona
como un inductor químico de la resistencia sistémica adquirida (SAR), con la finalidad de
observar la respuesta de cada uno de los genes a este inductor químico.
De igual relevancia sería logar la caracterización de los niveles de expresión mediante
análisis de Q-PCR en respuesta a Colletotrichum gloesporioides_, ya que las respuestas
de una planta ante una infección son complejas, y no solamente encienden la defensa de
la planta mediante la ruta SA - SAR. Este experimento permitiría observar el
comportamiento de los cuatro genes tipo NPR1 de papaya en condiciones de estrés
biótico.
Una vez realizados estos estudios, se seleccionará el gen o genes más adecuados para
la creación de líneas transformadas encaminadas a la obtención de variedades con una
mayor resistencia a patógenos como Colletotrichum gloesporioides.
De forma paralela se requerirá del aislamiento de los extremos 5' y 3' del ADNc de los
genes elegidos mediante la técnica RACE, con el fin de obtener las secuencias completas
deADNc.
Al obtenerse los extremos 5 · y 3 · se abre la posibilidad de analizar de las regiones UTR
de las secuencias de interés en busca de la identificación de sus secuencias regulatorias.
Así mismo, resultaría de gran interés científico sobrexpresar estos genes en papaya y
evaluar su resistencia ante patógenos como Colletotrichum gloesporioides.
90
•
Capitulo IV
IV.4 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Baker B., P. Zambryski, B. Staskawicz, S. P. Dinesh-Kumar. (2003) . Signaling in Plant
Microbe lnteractions. Science 276, 726-733.
Cao H., J. Glazebrook, J.D. Clarke, S. Volko y X. Dong. (1997) . The Arabidopsis NPR1
gene that controls systemic acquired resistance encodes a novel protein containing
ankyrin repeats. Cell. 88(1 ),57- 63.
Chern M., H.A. Fitzgerald, P.E. Canlas, D.A. Navarre y P.C. Ronald. (2005) .
Overexpression of a rice NPR1 homolog leads to constitutive activation of defense
response and hypersensitivity to light. Molecular Plant-M icrobe lnteractions (MPMI),
18 (6),511-520.
Delaney T.P., L. Friedrich y J.A. Ryals. (1995) . Arabidopsis signa! transduction mutant
detective in chemically and biologically induced disease resistance. Proceedings of
the National Academy of Sciences of the United States of America (PNAS), 92,6601-
6606.
Dong X. (2004) . NPR1, all things considered . Current Opinion in Plant Biology, 7(5),547-
552.
Ekengren S.K., Y. Liu , M. Schiff, S.P. Dinesh-Kumar y G.B. Martin. (2003) Two MAPK
cascades, NPR1 , and TGA transcription factors play a role in Pto-mediated disease
resistance in tomato, The Plant JouARNI, 36 (6) ,905-917.
Endah R. , G. Beyene, A. Kiggundu , N.V. Berg, U. Schlu, K. Kunert y R. Chikwamba.
(2008) . Plant physiology and biochemistry elicitor and fusarium-induced expression
of NPR 1-like genes in banana. Plant Physiology and Biochemistry, 46(11 ), 1007-
1014.
Fitzgerald H.A., M. Chern, R. Navarre y P.C. Ronald . (2004). Overexpression of (At)NPR1
in rice leads to a BTH- and environment-induced lesion-mimic/cell death phenotype.
MPMI , 17(2), 140-51 .
91
•
Capitulo IV
Gachomo E.W., O. O. Shonukan y S. O. Kotchoni. (2003). The molecular initiation and
subsequent acquisition of disease resistance in plants. African JouARN I of
Biotechnology 2 (2) , 26-32.
Ha C. M., J.H . Jun, H.G. Nam, J.C. Fletcher y T. B. Bop. (2004) . Blade-on-Petiole1 encodes
a BTB/Poz domain protein required for leaf morphogenesis in Arabidopsis thaliana,
Plant Cell Physiology, 45(1 0) , 1361-1370.
Henanff G.L. , T. Heitz, P. Mestre, J. Mutterer, B. Walter y J. Chong. (2009).
Characterization of Vitis vinífera NPR1 homologs involved in the regulation of
pathogenesis-related gene expression . BMC Plant Biology, 9, 54.
Hepworth S.R. , Y. Zhang, S. Mckim, X. Li y G.W. Haughn. (2005) . Blade-On-Petiole
dependent signaling controls leaf and floral patterning in Arabidopsis. The Plant Cell,
17,1434-1448.
Kinkema M., W. Fan y X. Dong. (2000) . Nuclear localization of NPR1 is required for
activation of PR gene expression. The Plant Cell , 12, 2339-2350.
Lin W.C., C.F. Lu , J.W. Wu , M.L. Cheng, Y.M. Lin , N.S. Yang, L. Black, S.K. Green, J.F.
Wang y C.P. Cheng. (2004). Transgenic tomate plants expressing the Arabidopsis
NPR1 gene display enhanced resistance to a spectrum of fungal and bacteria!
diseases. Transgenic Research , 13(6),567-581 .
Liu G., E.B. Holub, J.M. Alonso, J.R. Ecker y P.R. Fobert. (2005) . An Arabidopsis NPR1-
Iike gene, NPR4, is required for disease resistance. The Plant JouARNI 41 (2),304-
318.
Makandar R. , J.S. Essig, M.A. Schapaugh, H.N. Trick y J. Shah. (2006). Genetically
engineered resistance to fusarium head blight in wheat by expression of Arabidopsis
NPR1 . Molecular Plant-Microbe lnteractions (MPMI) , 19(2),123-129.
Malnoy M., Q. Jin, E.E. Borejesza-Wysocka, S.Y. He y H.S. Aldwinckle. (2007).
Overexpression of the apple MpNPR1 gene confers increased disease resistance in
malus x. Domestica. Molecular Plant-Microbe lnteractions (MPMI), 20(1 2), 1568-
1580.
Martin G.B., A. J. Bogdanove y G. Sessa. (2003). Understanding the functions of plant
disease Resistance Proteins. Annu. Rev. Plant Biol. 54,23-61 .
92
..
Capitulo IV
Moroldo M. , S. Paillard, R. Marconi, L. Fabrice, A. Canaguier, C. Cruaud, V.O. Berardinis,
C. Guichard, V. Brunaud, I.L. Clainche, S. Scalabrin, R. Testolin , G.D. Gaspero, M.
Morgante y A. Adam-Biondon . (2008) . A Pysical map of the heterozygous grapevine
'Cabernet Sauvignon ' allows mapping candidate genes for disease resistance. BMC
Plant Biology, 8(66) , 1-14.
Mou Z., W. Fan, X. Dong y N. Carolina. (2003) . lnducers of plant systemic acquired
resistance regulate NPR1 function through redox changes. Cell , 113(7),935-944.
Pieterse C.M.J. y L. C. Van Loon . (2004). NPR1 : the spider in the web of induced
resistance signaling pathways. Current Opinion in Plant Biology, 7(4) , 456-464.
Pilotti M., A. Brunetti, A. Gallelli y S. Loreti. (2008) . NPR1-Iike genes from cONA of
rosaceous trees: cloning strategy and genetic variation . Tree Genetics & Genomes,
4(1),49-63.
Radwan 0 ., S. Mouzeyar, J.S. Venisse, P. Nicolas y M.F. Bouzidi. (2005) . Resistance of
sunflower to the biotrophic oomycete Plasmopara halstedii is associated with a
delayed hypersensitive response within the hypocotyls. JouARNI Of Experimental
Botany, 56(420) ,2683-2693.
Rochon A. , P. Boyle, T. Wignes, P.R. Fobert y C. Després. (2006) . The coactivator
function of Arabidopsis NPR 1 requires the core of its BTB/POZ doma in and the
oxidation of e-terminal cysteines. The Plant Cell, 18,3670-3685.
Sandhu D., I.M. Tasma, R. Frasch y M.S. Bhattacharyya. (2009). Systemic Acquired
Resistance in soybean is regulated by two proteins, orthologous to Arabidopsis
NPR1 . BMC Plant Biology, 9,1 05.
Spoel S.H., Z. Mou, Y. Tada, N.W. Spivey, P. Genschik y X. Dong. (2009) . Proteasome
mediated turnover of the transcription coactivator NPR1 plays dual roles in regulating
plant immunity. Cell , 137(5),860-872.
Yuexing Y., S. Zhong, Q. Li , Y. Lou, L. Wang, J. Wang, M. Wang, Q. Li , D. Yang y Z. He.
(2007) . Functional analysis of rice NPR1-Iike genes reveals that OsNPR1/NH1 is the
93
•
Capitulo IV
rice orthologue conferring disease resistance with enhanced herbivore susceptibility.
Plant Biotechnology JouARNI, 5 (2),313-324, 2007.
Zhang Y. , Y.T. Cheng, N. Qu, Q. Zhao, D. Bi y X. Li. (2006). Negative regulation of
defense responses in Arabidopsis by two NPR1 paralogs. The Plant JouARNI, 48
8(5) ,647-656.
Zhao J. , X. Huang, Y. Chen, Y. Chen y X. Huang. (2009). Molecular cloning and
characterization of an ortholog of NPR1 gene from Dongguan dajiao (Musa spp.
Abb) . Plant Molecular Biology Reporter, 27(3),243-249.
94
