Ciclo de Krebs

En condiciones aeróbicas, el acetil-CoA que se encuentra en la mitocondria es oxidado completamente hasta CO2 mediante una ruta conocida como el ciclo de los ácidos tricarboxílicos (TCA), o ciclo de Krebs.

Esta ruta es la parte final de la degradación de todas las moléculas que funcionan como combustible: los aminoácidos, los ácidos grasos y los carbohidratos.

Generalmente, las entradas al ciclo inician con acetil-CoA, aunque otros intermediarios pueden continuar con el proceso.

El ciclo de Krebs ocupa un lugar central en el metabolismo celular, por lo que es regulado por otras rutas y recibe entrada de sustratos de varias rutas. Los pasos que lo integran incluyen reacciones degradativas y anabólicas, por ello que sitúe en esa posición central. Se dice, por lo tanto, que el ciclo de Krebs es una ruta anfibólica finamente regulada por otras rutas.Proteínas, triglicéridos y polisacáridos pueden proveer de acetil-CoA a la ruta.

El ciclo del ácido cítrico se complementa con la cadena respiratoria de transporte de electrones, de modo que los productos de NADH y FADH2 que produce el ciclo pueden volverse a oxidar en dicha cadena.

El ciclo de Krebs está regulado por la piruvato deshidrogenasa, ya que la conversión de piruvato a acetil-CoA es el paso previo para la ruta.

Funciones del ciclo de Krebs• Produce la mayor parte del dióxido de carbono en los tejidos

animales.• Es la mayor fuente de coenzimas que impulsan la producción

de ATP en la cadena respiratoria.• Dirige el exceso de energía hacia la biosíntesis de ácidos

grasos, por lo cual permite el almacenamiento energético.• Proporciona precursores para la biosíntesis de proteínas y

ácidos nucleicos.• Sus componentes regulan directamente (producto-

precursor) o indirectamente (alostéricamente) otras rutas metabólicas.

En el ciclo de los ácidos tricarboxílicos intervienen ocho enzimas que se encuentran en la matriz mitocondrial.De estas ocho enzimas, cuatro son oxidorreductasas que son coenzimas que captan equivalentes reductores (hidruro o hidrógeno).Provee intermediarios que son sustratos para otras rutas anabólicas.

EstequiometríaEn dos pasos oxidativos, entre citrato y succinil-CoA, se pierden dos carbonos en forma de CO2, de modo que estequiométricamente se ha oxidado completamente el acetil-CoA.El balance general del ciclo indica que el acetilo activo se oxida por completo a 2 CO2 y que se producen cuatro pares equivalentes reductores, tres como NADH + H+ y uno como FADH2, los cuales se utilizan después para generar energía.Además, el acoplamiento con la cadena respiratoria genera la mayor producción de ATP en el organismo, y la más importante.La regulación del ciclo de Krebs en las células animales ocurre fundamentalmente en dos sitios: primero a nivel de la piruvato deshidrogenasa y luego a nivel de la isocitrato deshidrogenasa, dentro del ciclo.

De modo general, las sintasas son enzimas que catalizan la condensación sin consumir ningún nucleósido trifosfato (ATP, GTP, etc.) como fuente de energía.

Las sintetasas catalizan condensaciones que sí utilizan ATP u otro nucleósido trifosfato como fuente de energía.

El ciclo de Krebs se compone de ocho reacciones

Reacción : Formación de citratoEs una reacción de condensación catalizada por la enzima citrato sintasa. El uso de agua es lo que libera la reacción del uso de energía. El grupo metílico del acetilo reacciona con el carbonilo del oxalacetato.

La condensación es del tipo aldólica y es seguida de una hidrólisis. En el sitio activo de la citrato cinasa se forma un intermediario: el citril-CoA.

Este intermediario es transitorio, y una hidrólisis hace que sean liberados inmediatamente citrato y CoA-SH. La hidrólisis ocurre a nivel del enlace tioéster, y esta reacción es lo que genera una alta liberación de energía que vuelve exergónica la actividad de la citrato sintasa.

Cuando el CoA-SH es liberado, este sirve como receptor del grupo acetilo que está dejando entrar la piruvato deshidrogenasa.

Reacción : Formación del isocitratoEn la enzima aconitasa (o aconitasa hidratasa) se cataliza una reacción de isomerización vía la síntesis de un intermediario, el cis-aconitato, que nunca abandona el sitio activo de la enzima.Esta transformación es reversible, y consiste en una hidratación y deshidratación sucesivas. Esto genera el intercambio de un H con el OH.

La isomerización del citrato en isocitrato es indispensable para permitir las reacciones de oxidación sucesivas.La aconitasa contiene átomos de Fe no unidos a un grupo hemo. Estos cuatro átomos se asocian a grupos sulfuro formando complejos 4Fe-4S. Tres grupos sulfuro son de origen inorgánico, mientras que el cuarto proviene de un Cys.

El complejo 4Fe-4S cataliza la reacción de deshidratación y rehidratación, mantiene secuestrado al cis-aconitato y evita el uso de energía por parte de la aconitato citrasa.

Este tipo de proteínas se conocen como ferrosulfuradas.

El doble enlace del cis-aconitato permite la adición de H2O en cualquier carbono. La reacción enzimática puede por ello producir tanto citrato como isocitrato.La reacción, sin embargo, tiende a la generación de citrato antes que a la formación de isocitrato (en una mezcla a pH 7.4 y 25°C solamente el 10% contiene isocitrato) ¿cómo se avanza, entonces, en el ciclo?

En la mitocondria, el isocitrato liberado del sitio activo de la enzima es inmediatamente aprovechado por la siguiente enzima en la siguiente reacción. Cuando se produce citrato, la aconitasa vuelve a reaccionar con este, hasta que la reacción favorezca al isocitrato.

Reacción : Oxidación y descarboxilación del isocitratoEl isocitrato reacciona inmediatamente con la isocitrato deshidrogenasa. Esta es la primera de las cuatro reacciones de oxidación. Para esta reacción es necesaria la presencia de NAD+ como cofactor.

En todas las células hay dos tipos de isocitrato deshidrogenasa, una variedad que requiere NAD+ como cofactor, y otra que requiere NADP+.

El intermediario de esta reacción es el oxalsuccinato, que en el sitio activo pierde rápidamente un CO2. Esto genera inmediatamente α-cetoglutarato. En el sitio activo de la enzima se encuentra un átomo de Mn+2 que dirige la descarboxilación y estabiliza al enol formado.La reacción del oxalsuccinato es básicamente una resonancia magnética.

La enzima dependiente de NAD se encuentra exclusivamente en la mitocondria. Tanto en el citosol como en la mitocondria, se encuentra la otra variedad. Parece ser que la función primordial de esta enzima es la producción de NADPH, importante para las reacciones anabólicas.

Reacción : Descarboxilación del α-cetoglutaratoEl isocitrato reacciona inmediatamente con la isocitrato deshidrogenasa. Esta es la primera de las cuatro reacciones de oxidación. Para esta reacción es necesaria la presencia de NAD+ como transportador de electrones y el CoA-SH como transportador del succinilo.El α-cetoglutarato reacciona con una α-cetoglutarato deshidrogenasa, que escinde el segundo CO2. Aquí termina la oxidación del piruvato.

La energía de oxidación se conserva gracias, nuevamente, al enlace tióester del succinil-CoA. Esta reacción es idéntica a la descarboxilación del piruvato que ocurre en la membrana mitocondrial, tanto en estructura como en función.Por ello se tienen homólogos E’1, E’2 y E’3, y los mismos cofactores (TPP, lipoato, NAD, FAD y CoA).

Son complejos homólogos mas no por ello idénticos (a excepción de E3 y E’3):1. La secuencia de aminoácidos de E’1 genera afinidad por

α-cetoglutarato (α-cetoglutarato deshidrogenasa). La secuencia de E1 genera la afinidad al piruvato.

2. El lipoil de E’2 debe jalar un grupo succinil, y no uno acetil como en E2.

Reacción : Generación de un enlace de alta energía en el succinil-CoA

El succinil-CoA tiene un enlace de alta energía libre de hidrólisis estándar negativa. Esta reacción utiliza este enlace de alta energía para promover la formación de un enlace fosfoanhídrido de GTP o ATP con una ΔG0´= -2.9kJ/mol.El proceso final es la liberación de succinato. La reacción la cataliza una succinil-CoA sintetasa o succínico tioquinasa.

Las células animales tienen dos isozimas de la succinil-CoA sintetasa. Una específica para ADP que produce ATP y otra específica para GDP y produce GTP.La formación de ATP (o GTP) a expensas de la energía liberada por el α-cetoglutarato es una fosforilación a nivel sustrato, idéntica a las reacciones que sintetizan ATP que se encuentran en reacciones glucolíticas catalizadas por la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa y la piruvato quinasa.El GTP puede donar un grupo fosfato al ADP y formar ATP. Ambos son equivalentes, y no es requerida energía adicional.

GTP + ADP GDP + ATP ΔG0´= 0 kJ/molLa reacción es catalizada por una nucleósido difosfato quinasa.

Reacción : Oxidación del succinato a fumaratoLas siguientes reacciones transforman el succinato para regenerar el oxalacetato. La primera de estas reacciones corre a cargo de una oxidación catalizada por la succinato deshidrogenasa.El aceptor de hidrógeno es el FAD, ya que el cambio de energía libre es insuficiente para permitir que el NAD interactúe. El producto final es fumarato.

En eucariontes, la succinato deshidrogenasa está fuertemente a la membrana mitocondrial. En procariontes, a la membrana plasmática.Esta enzima está intrínsecamente relacionada con la cadena electrónica. Por esta enzima es que el ciclo de Krebs no se desarrolla exclusivamente en el citosol.La succinato deshidrogenasa es, al igual que la aconitasa, una proteína ferrosulfurada.El FAD está covalentemente unido a ese complejo ferrosulfurado. El acarreo de electrones está, por lo tanto, dirigido inmediatamente a la cadena transportadora de electrones en la membrana mitocondrial.

El malonato es un inhibidor competitivo de la succinato deshidrogenasa, al que es análogo. La adición de este compuesto a la mitocondria genera una detención tanto del ciclo de Krebs como de la cadena respiratoria (ya que el complejo II de dicha cadena es precisamente una succinato deshidrogenasa).Esta sal puede estar presente en el cuerpo si se consumen ciertas raíces (como las de la remolacha) y un derivado, el malonil-CoA, es importante en el anabolismo de lípidos.

Reacción : Hidratación del fumaratoLa conversión de fumarato a L-malato esta catalizada por la fumarato hidratasa (o fumarasa), y es una hidratación reversible.La principal característica de esta enzima es su alta estereoespecificidad. Cataliza la hidratación del doble enlace en trans del fumarato, pero no en cis del maleato. En dirección inversa, la fumarasa no puede utilizar D-malato.

Reacción : Oxidación del L-malato a oxalacetatoEn la última reacción del ciclo una L-malato deshidrogenasa cataliza una oxidación del L-malato a oxalacetato.

El equilibrio de esta reacción está altamente desplazado hacia la izquierda en condiciones termodinámicas estables; en células intactas, el oxalacetato es rápidamente desechado por la citrato sintasa (reacción altamente exergónica)Esto mantiene la concentración de oxalacetato muy baja en la célula, favoreciendo la producción de este compuesto.

En síntesis, las reacciones del ciclo de Krebs consisten de lo siguiente:1. En la condensación de una unidad de acetilo (del acetil-CoA) con

oxalacetato entran en el ciclo dos átomos de carbono. Por las descarboxilaciones sucesivas catalizadas por la isocitrato deshidrogenasa y la α-cetoglutarato deshidrogenasa salen del ciclo otros dos carbonos en forma de CO2. Los dos átomos de carbono que salen del ciclo son diferentes de los que han entrado en la misma vuelta.

2. En las cuatro reacciones de oxidación salen del ciclo cuatro pares de átomos de hidrógeno. En las descarboxilaciones oxidativas del isocitrato y del a-cetoglutarato se reducen dos moléculas de NAD+, en la oxidación del succinato se reduce una molécula de FAD y en la oxidación del malato se reduce otra de NAD+.

3. A partir del enlace tioéster altamente energético del succinil-CoA se genera un enlace fosfato de alta energía (en forma de GTP).

4. Se consumen dos moléculas de agua: una en la síntesis del citrato, por la hidrólisis del citril-CoA, y la otra en la hidratación del fumarato.

5. El FADH2 y el NADH+H+ producidos son rápidamente aprovechados como cofactores en la cadena transportadora de electrones.

Carácter anfibólico del ciclo de KrebsAlgunos procariontes utilizan esta ruta no como fuente de energía sino como de precursores biosintéticos. Para ello se valen de las reacciones que integran el ciclo de Krebs, pero al carecer de una α-cetoglurato deshidrogenasa deben ocupar el α-cetoglurato como precursor de aminoácidos, nucleótidos o grupos prostéticos. Del mismo modo, la ausencia de esta enzima hace que se aproveche el succinil-CoA.

En los eucariontes esta ruta tiene carácter anfibólico, ya que puede ser usado tanto como parte de un catabolismo constante para la glucosa, pero también anabólicamente al producir intermediarios.

Ahora, conforme los intermediarios del ciclo de Krebs son empleados para otras rutas existen mecanismos que permiten reponer estos intermediarios para que el ciclo de Krebs continúe. Estos mecanismos se conocen como reacciones anapleróticas.La toma de intermediarios está en equilibrio dinámica con estas reacciones anapleróticas. De este modo, los sustratos que requieren las enzimas del ciclo de Krebs se mantienen en cantidades constantes.

Control del ciclo del ácido cítricoEl ciclo de Krebs está regulado por las concentraciones bajas de FAD y NAD que indican un nivel bajo de energía.El ciclo está regulado en los tres sitios altamente exergónicos: la citrato sintasa, la isocitrato deshidrogenasa y el complejo α-cetoglutarato deshidrogenasa.

La citrato sintasa es controlada por la cantidad de ATP, que es un inhibidor alostérico de la enzima.

La isocitrato deshidrogenasa es estimulada alostéricamente por el ADP, que aumenta la afinidad por el sustrato. La unión de isocitrato, NAD+, Mg+2 y ADP es mutuamente cooperativa. Por el contrario, el NADH actúa como un inhibidor alostérico inhibiendo la enzima, tal y como también lo hace el ATP.

Finalmente, el complejo α-cetoglutarato deshidrogenasa. Algunos aspectos de su control son análogos a los del complejo piruvato deshidrogenasa. La a-cetoglutarato deshidrogenasa se inhibe por el succinil-CoA y el NADH, los productos de la reacción que cataliza. También se inhibe la a-cetoglutarato deshidrogenasa por una alta carga energética. La utilización de fragmentos dicarbonados en ciclo del ácido cítrico y la velocidad del ciclo se reducen cuando la célula tiene un nivel alto de ATP.

Tres factores son los que regulan el flujo de metabolitos en el ciclo de Krebs:1. La disponibilidad de sustratos;2. La inhibición por los productos acumulados;3. La regulación alostérica de los tres puntos control

(exergónicos) del ciclo.

Cada reacción exergónica puede, en un momento dado, ser la limitante en la velocidad de la reacción.

La disponibilidad de los sustratos para la citrato sintasa varía con el estado metabólico de la célula. Y, tanto la isocitrato deshidrogenasa como la α-cetoglutarato deshidrogenasa, se ven reguladas por el coeficiente de [NADH]/[NAD+]

En el músculo de vertebrados, el Ca+2, la señal para la contracción y para un aumento concomitante en la demanda de ATP, activa tanto la isocitrato deshidrogenasa como la a-cetoglutarato deshidrogenasa, así como el complejo de la piruvato deshidrogenasa.

En resumen, las [sustrato e intermediarios] del ciclo del ácido cítrico hacen que el flujo a través de esta vía se mantenga a una velocidad que permite mantener concentraciones óptimas de ATP y NADH.

En condiciones normales, la velocidad de la glucólisis y del ciclo del ácido cítrico están integradas de manera que sólo se metaboliza a piruvato la glucosa necesaria para suministrar al ciclo del ácido cítrico su combustible, los grupos acetilo del acetil-CoA.

Piruvato, lactato y acetil-CoA se mantienen normalmente a concentraciones de estado estacionario.

El citrato es un inhibidor alostérico importante de la fosfofructoquinasa-1 en la vía glucolítica.

El ciclo del glioxilatoEn las plantas, algunos invertebrados y ciertos microorganismos, el acetato (acetil-CoA) puede ser utilizado como una fuente de fosfoenolpiruvato que se dirige a la síntesis de glúcidos.Esto se logra mediante un ciclo conocido como ciclo del glioxilato, en el que el acetil-CoA se convierte en succinato u otro intermediario del ciclo del ácido cítrico.

2Acetil-CoA + NAD+ + 2H2O succinato + 2CoA +

NADH + H+

El acetil-CoA se condensa con el oxalacetato para formar citrato mediante una citrato sintasa. Luego el citrato pasa a isocitrato, donde participa la aconitasa. Pero en el siguiente paso, en lugar de que participe una isocitrato deshidrogenasa, el isocitrato es cortado en dos moléculas: succinato y glioxilato.

Esta última reacción es catalizada por una citrato liasa. El glioxilato producido en esta reacción, entonces, se condensa con otro acetil-CoA mediante una malato sintasa, y se produce malato. De este modo, el malato pasa a una malato deshidrogenasa que vuelve a producir oxalacetato (y con esto nos hemos “comido” buena parte del ciclo).

Como el succinato no se ocupa para regenerar al oxalacetato, está disponible enteramente para otras biosíntesis.

El acetil-CoA puede estar disponible en los invertebrados gracias a la degradación de lípidos. En los vertebrados esto no es posible porque no existen ni la citrato liasa ni la malato sintasa, de modo que no es posible la producción de glúcidos a partir de lípidos (sin embargo, sí de energía).

Las plantas tienen secuestradas estas dos enzimas en unos organelos adosados a la membrana que se conocen como glioxisomas.

El TCA inversoLas bacterias verdes sulfurosas y no sulfurosas usan un ciclo del ácido cítrico inverso que permite fijar CO2. Este ciclo inverso del ácido cítrico se logra manteniendo que la dirección de las enzimas sea siempre en el sentido contrario en que se hacen en el ciclo normal del ácido cítrico. En Chlorobium se encontraron dos enzimas unidas a ferredoxina que catalizan la fijación del CO2.

Las dos reacciones ligadas a ferredoxina comportan la carboxilación de succinil-CoA a α-cetoglutarato y la carboxilación de acetil-CoA a piruvato.

Todas las enzimas de este ciclo tienen una preferencia catalizadora invertida. En estos procariontes existe también la citrato liasa, que corta el citrato en acetil-CoA y oxalacetato. Esto se observa en las bacterias verde sulfurosas.

El inicio del ciclo ocurre con una primera fijación de CO2 en la que el fosfoenolpiruvato se condensa con esta molécula para producir oxalacetato. Este oxalacetato viene de la escisión de la citrato liasa.

Esta ruta no está acoplada a una cadena transportadora de electrones pues únicamente es anabólica.