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30/07/2015

Dx. Bacteriológico - mód 6 - Dr. Esteban Riera [email protected] 1

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Procesamiento bacteriológico de muestra de piel

Esteban RieraDisertante

Avalado porOrganizado por

Charla 02

Curso Diagnóstico BacteriológicoMód. 6:“COMO PROCESAR E INTERPRETAR UN CULTIVO DE PIEL Y PARTES BLANDAS”

Procesamiento de muestra

• Guías Generales:1) Muestras en hisopos:_ Homogeneizar en solución salina estéril y

sembrar en medios de cultivo; hacer frotis;2) Muestras en jeringa:_ inocular directo en medios; hacer frotis;_ Inocular en medios para anaerobios:

Agar Brucella al 5% sangre oveja, vitamina K, Hemina; agregado amica y vanco;

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Toma de muestra

• Guías Generales:3) Biopsias y tejidos: _ macerar la Bx. o tejido en mortero con arena

estéril;

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• GRAM_ para todas las muestras;_ presencia de PMN indica infección;_ presencia de CEP sugiere contaminación

superficial;_ cantidades relativas de m.o.;_ Correlacionar el Gram con el cultivo;

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• CULTIVO en aerobiosis:_ Agar Sangre al 5% s. oveja;_ Agar Chocolate;_ Caldo BHI;_ Mc Conkey

Medios especiales:_ Anaerobios;_ Listeria (Oxford con supl atb);_ Micobacterias (Lowesten Jensen);

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_ Evaluar cultivos a las 24 y 48 h;_ Cultivos para fastidiosos incubar hasta 5 días

adicionales;_ Informe preliminar a las 24 h, e informes

parciales y finales;_ Caldos incubar hasta 7 días;

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Interpretación del cultivoMedios de cultivo

Placas +Cdo -/+

Placas -Cdo +

Placas -Cdo -

Registrar tipo y cantidad de col

Gramdel cdo

Inf. Preliminar:estéril ≤ 24 h

Gram, ID preliminar Inf. Preliminar:“Escaso crec de…….aislado del cdo de enriquecimiento

Re-incubar

Inf. preliminar

ID y ATB

Inf. Final

Sub-cultivo en medios cultivo sólidos

negativoPositivo

MÉTODOS PARA IDENTIFICACIÓN_ PRUEBAS RÁPIDAS:

o Gram;o Catalasa;o Coagulasa en lámina;o Látex para S. aureus;o Oxidasa;o PYR (L-pyrrolidonyl-β-naftilamina);o Serología para Streptococcus β-hemolíticos;

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Procedimiento de Identificación

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MÉTODOS PARA IDENTIFICACIÓN_ PRUEBAS CONFIRMATORIAS:

o Coagulasa en tubo;o Bilis-esculina;o NaCl 6,5%;o P. bioquímicas para ID de Enterobacterias:

(TSI, Citrato, SIM, MIO, LIA, UREA, VP, PHE)oMétodos comerciales (API, Vitek…);

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Procedimiento de Identificación Cocos gram-positivos catalasa positivos

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CATALASA

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• Gro. Staphylococcus• Gro. Micrococcus• Gro. Planococcus• Gro. Stomatococcus• Gro. Rothia• Gro. Alloiococcus

• Gro. Streptococcus• Gro. Enterococcus• Gro. Gemella• Gro. Leuconostoc• Gro. Pediococcus• Gro. Aerococcus

+ -

GRO STAPHYLOCOCCUS

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Catalasa +(excepciones: S. aureus subsp anaerobius y

S. saccharolyticus) Oxidasa - Gram: cocos gram-positivos; racimos irregulares >>

aislados,duplos> cortas cadenas; inmóvil, no esporulado, no capsulado;

No producen gas a partir de azúcares; Anaerobio facultativo

Excepto S. saccharolyticus y S. aureus subsp anaerobios (aerotolerantes)

37 especies; 16 especies de interés clínico

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Morfología de la colonia:_ 1-3 mm diám. en 24 h;_ 3-8 mm en 3 días;Excepciones:

24 a 36 h para detectar colonias de:S. aureus subsp anaerobios, S. lentus, S. auricularis, S. saccharolyticus, S. equorum, S. vitulus;

S. aureus variante pequeña: ¡48 h para ser visibles!

GRO STAPHYLOCOCCUS

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• GRO STAPHYLOCOCCUSMorfología de la colonia del S. aureus:_ pigmentadas (amarillo, dorado) o blanquecinas;_ lisa, borde entero, lig. elevadas;_ brillantes; apariencia cremosa;_ beta- o no-hemolíticas;

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• GRO STAPHYLOCOCCUSMorfología de la colonia de SCN:_ no pigmentadas; blanquecinas;_ lisa, borde entero, lig. Convexa, opaca;_ 2,5 a 6 mm diám. en 3 días;

Cocos gram-positivos catalasa positivos

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GRO MICROCOCCUS:Micrococcus luteus_ saprófito, frec. Contaminante de cultivos

(Staph aureus, oportunista);_ morfología gram: racimos irregulares, tetradas

o pares (= S. aureus);_ oxidasa + (S. aureus ox -);_ pigmento amarillo limón;

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Cocos gram-positivos catalasa positivos

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Rothia muscilaginosa:(ex Stomatococcus muscilaginosus)_ bacteremias, endocarditis, endoftalmitis, inf.

Relacionadas a cateter, peritonitis, neumonías, SNC, septicemias.

_ Gram: racimos (≈ Staphylococcus y Micrococcus)_ no crece en caldo NaCl 5% (dif. Con Staph y

Micrococcus);_ se adhiere al agar;_ difícil de hacer suspensión homogénea;

Cocos gram-positivos catalasa positivos:

Familia Micrococcaceae:o Staphylococcus: oportunista humano

y animal importante;oMicrococcus: predominan tetradas (gram);

colonias pigm. amarillo limón en agar sangre;o Rothia (ex-Stomatococcus) mucilaginosa;

colonias mucosas que se adhieren al agar;o Planococcus (cocos móviles);

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GRO STAPHYLOCOCCUS

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HÁBITAT:_ piel y mucosas de mamíferos y aves;_ boca, glándulas mamarias, intestino; tracto genito-

urinario; tracto respiratorio superior;

_ simbiosis a patógeno cuando atraviesa barrera piel: por traumas, implantación prótesis…

GRO STAPHYLOCOCCUS

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Especies muestran preferencia por huésped:

_ S. capitis subsp capitis en c. cabelludo de adultos;_ S. auricularis en meatus oido externo;_ S. haemolyticus en piel con glándulas apócrinas

(axilas, pubis);_ S. aureus (narinas);_ S. cohnii (pie);_ S. saprophyticus (t. genital femenino);

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Staphylococcus aureus

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Significado clínico:

a) INFECCIONES ADQUIRIDAS EN LA COMUNIDAD:

enf. mediadas por toxinas:_ ETAs; sdme piel escaldada; sdme shock séptico;

inf piel y partes blandas:forúnculos, celulitis, impétigo;

inf. Profundas:hueso, articulaciones, válvula cardiaca, bazo, hígado…

inf. Pulmonares; inf. Urinarias; bacteremias: diseminación a distancia.

Staphylococcus aureus

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Significado clínico:

b) INFECCIONES NOSOCOMIALES: heridas quirúrgicas; neumonías asociadas a ventiladores; bacteremias asociado a catéteres;

Staphylococcus coagulasa negativos (SCN)

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Significado clínico de SCN: endocarditis y bacteremias:

S. caprae, S. saccharolyticus, S. simulans, S. warneri; Meningitis: S. epidermidis, S. haemolyticus Osteomielitis: S. warneri, S. simulans; ITU: S. xylosus, S. schleiferi; S. hominis, S. caprae. S. cohnii Inf. Heridas y articulaciones: S. scheliferi, S. caprae; Inf. Relacionada a cateter: S. schleiferi, S. warneri; Inf. Heridas y marcapasos: S. schleiferi;

Staphylococcus coagulasa negativos (SCN)

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Significado clínico de SCN en Veterinaria: S. intermedius: infecciones en perros

celulitis, otitis externa, pioderma, abcesos, tracto reproductor, mastitis, inf. Heridas;en el hombre: asociado a mordedura de animales

S. hyicus en cerdos, animales acuáticos;mastitis en bovinos;

S. schleiferi: pioderma en perros;

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MÉTODOS PARA IDENTIFICACIÓN de Staphylococcus spp.o Gram;o Catalasa;o Coagulasa en lámina;o Coagulasa en tubo;o Látex para S. aureus;o DNasa;

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Procedimiento de Identificación Staphylococcus spp.

Gram: cocos aislados, en duplos, tetradasy en racimos (Staphylé);

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Staphylococcus spp. Cultivo:

S. aureus: colonias blancas, cremosas, convexas,brillantes y lisas;

Colonias típicas de S. aureus en ASO:β-hemolíticas, color crema-doradas (aureus!);Proteína A de pared: aglutinación con látex(reacción cruzada con S. saprophyticus);

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Staphylococcus spp.

Cultivo:Staphylococcus coagulasa negativos (SCN),

16 especies de importancia clínica; diferenciar S. epidermidis de los demás SCN en muestras de sitios estériles (ej. LCR, sangre, abcesos cerrados, etc.);S. saprophyticus patógeno urinario en la mujer;(Novobiocina 5 µg – resistente)

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Sangre de oveja anticoagulada

Hemólisis en AGAR SANGRE DE OVEJA

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Hemólisis en ASO

Alfa hemólisisZona parcial de hemólisis o coloración verdosa alrededor de la colonia. La membrana del GR intacta;

Beta hemólisisZona de hemólisis total, anillo incoloro alrededor de la colonia o debajo de la colonia. La membrana del GR está lisada;

Gamma hemólisis o no- hemólisisNo hay lisis de los GR, sangre sin cambio de color.

HEMÓLISIS

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β-hemólisis α-hemólisis

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Staphylococcus spp.

cultivo

Cepa con β-hemólisisCepa no-hemolítica

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Staphylococcus spp.

Catalasa

>> bacterias aeróbicas y anaeróbicas facultativas, excepto Streptococcus; son hidroxiperoxidasas; hemo-proteínas con 4 Fe+++/molécula;

catalasaFlavo-Prot (red) + O2 = Flavo-Prot (Ox) + H2O2 = H2O + O2

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Staphylococcus spp. Catalasa

Reactivo: Peróxido de hidrógeno al 30%(superoxol)

Conservar en frasco color caramelo (evitar exposición a la luz);

Mantener refrigerado; CONTROL DE CALIDAD ANTES DE USAR: control positivo: Staphylococcus spp control negativo: Streptococcus spp

realizar catalasa en cultivos de 18 – 24 h (cultivos viejos pueden perder capacidad enzimática!);

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CatalasaPrueba de catalasaMétodo en porta-objetos_ con ansa en punta recoger de la colonia sospechosa de Staphylococcus y colocar en un porta limpio; Nota: No arrastrar agar sangre con la colonia pues

¡la sangre es catalasa +!_ Agregar una gota de H2O2 al 30%;_ Interpretación: inmediata formación de burbuja

(gas de O2) es catalasa positivo;

Staphylococcus spp.

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Staphylococcus spp.

Coagulasa

o capacidad de un m.o. de coagular el plasma;o enzima termo-estable: coagulasa;o factor de virulencia;o Diferencia Staphylococcus coagulasa positivos

de los SCN;o Tipos de coagulasa:

coagulasa ligada (endo-enzima) y(prueba en lámina)coagulasa libre (exo-enzima)(prueba en tubo);

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Staphylococcus spp.

Coagulasa +

Staphylococcus aureus humano y vet.S. schleiferi subsp coagulansS. intermedius VeterinarioS. hyicusS. dephini

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Staphylococcus sp. Coagulasa libre(en tubo)

Coagulasa ligada(en lámina)

S. aureussubsp aureus

+ +

S. aureussubsp anaerobius

+ -

S. lugdunensis - +S. schleiferi

subsp schleiferi- +

S. schleiferisubsp coagulans

+ -

S. intermedius + dS. delphini + -S. hyicus d -

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Staphylococcus spp.

Coagulasa

Reactivo: PLASMA de conejo

o Plasma comercial deshidratado;o Plasma fresco obtenido en el lab.:_ Centrifugar sangre entera y separar el sobrenadante (plasma) asépticamente en tubos estériles;_ Conservar plasma líquido refrigerado (4°C) hasta 1 semana o congelado (3 meses);

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CoagulasaReactivo: PLASMA¿qué tipo de sangre usar?Factor plasmático y la sensibilidad para detectar la coagulasa del Staphylococcusvaría con especia animal;

_ plasma conejo (recomendado): coágulo más firme y mayor velocidad de coagulación;_ plasma humano (aceptable);_ Otros plasmas menos sensibles: de cerdo, caballo, bovino, pollo y carnero;

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Coagulasa

Reactivo: PLASMA¿qué tipo de anticoagulante usar?o la enzima coagulasa coagula el plasma con oxalato, citrato, EDTA o heparina

(¡no usar con floruro de sodio!);

o Uso de citrato pueden dar falsos positivos con cultivos mixtos con bacterias que consumen el anticoagulante citrato como fuente de energía;

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Coagulasa

Reactivo: PLASMA

Control de calidad

¡TODO PLASMA debe usarse con un control positivo (S. aureus) y control negativo (SCN) en simultáneo a la cepa incógnita!

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CoagulasaoMétodo en porta-objeto

Detecta coagulasa ligada:# convierte directamente Fibrinógeno en Fibrina;# no requiere de Factores del plasma;# 96% de correlación con método en tubo;

S. schleiferi subsp schleiferi yS. lugdunensis dan (+) pero coagulasa libre (-)!

# valor presuntivo;o Procedimiento:

_ suspensión densa de germen en A.D.;_ homogeneizar;_ agregar 1 gota de plasma;_ Observar aglutinación dentro de 10 seg.; 44

CoagulasaoMétodo en porta-objeto

Procedimiento:_ suspensión densa de germen en A.D.;_ homogeneizar;_ agregar 1 gota de plasma;_ Observar aglutinación dentro de 10 seg.;

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oMétodo en tuboDetecta coagulasa ligada y coagulasa libre (o extracelular):

Coagulasa libre + F. plasmático ≈ trombina;trombina

Fibrinógeno Fibrina;

Coagulasa

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Método en tubo:

PROCEDIMIENTO:o Inocular Staph en un tubo hemólisis con 0,5 mL

de plasma (conejo, humano);o incubar a 35° - 37°C y examinar a las 4 h;o Si negativo a 4 h, re-incubar a temp. Ambiente el tubo

(evita lisis del coágulo por actividad de stafilokinasa);o observar a las 24 h.

Coagulasa

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Método en tubo:

INTERPRETACIÓN:_ Coagulasa positivo: plasma se vuelve gelatina (semisólido) o cualquier grado de formación de coágulo a las 4h ó 24 h (S. aureus);

_ Coagulasa negativo: sin formación de coágulo; el plasma se mantiene líquido en el tubo; Staphylococcus sp. (coagulasa negativo) (SCN);

Coagulasa NEG

POS

COAGULASA EN TUBO

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Método en tubo:

LIMITACIONES.

o Falsos positivos: en plasmas con citrato como anticoagulante;

cultivos mixtos de Staphylococcus y bacterias que utilizan citrato;o Falsos negativos: cepas de S. aureus productores de grandes cantidades de estafilokinasas:

Lisis del coágulo;

Coagulasa

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o para cepas autoaglutinantes o adherentes;oMayoría S. aureus producen Proteína A, independientemente de coagulasa;o Látex recubierto con IGG + proteína A = aglutinación;o S. intermedius y S. hyicus pueden dar positivo

(raro en aislamientos clínicos);o S. saprophyticus puede dar positivo; pruebas adicionales en aislamientos de orina;o reactivos comerciales;o prueba rápida para definir S. aureus en muestras

clínicas;o costoso;

Proteína A

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o Para diferenciar S. saprophyticus de otros SCN;o reactivo: discos de Novobiocina (5 µg);o antibiograma a Novobiocinao Interpretación: diámetro halo inhibición ≤ 15 mm inidica resistencia e identificación presuntiva de S. saprophyticus;

Novobiocina

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o Para diferenciar S. epidermidis del resto de SCN;o S. epidermidis no fermenta ni trehalosa ni manitol al 2% en Caldo púrpura;o Resto de SCN fermentan la trehalosa o manitol o ambos;o ≥ 95% de exactitud;

Prueba de Trehalosa-Manitol

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Staphylococcus spp.

PROCEDIMIENTOo 200 µL de caldo trehalosa-manitol (al 2%) en tubos hemólisis;o inocular un inóculo denso de Staphylococcuscoagulasa negativa;o incubar a 35°C, 4-6 h(con agitación) o 24 h sin agitación;


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Staphylococcus spp.

INTERPRETACIÓN

• Reacción positiva:Amarillo indica fermentación de trehalosa

y/o manitol: Staphylococcus no epidermidis;• Reacción negativa:

Púrpura indica no fermentación de trehalosani manitol: Staphylococcus presuntivamente epidermidis;


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o Los Staphylococcus coagulasa positivo producen: una DNAsa y una endonucleasa termoestable (termonucleasa).

Ambos desdoblan el DNA;

Prueba de DNAsa

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oAgar DNA;o estriar la cepa incógnita

con un control positivo;o incubar 24 h a 35°C;o Agregar HCL al 40%;

INTERPRETACIÓN: Reacción positiva para S. aureus: presencia de halo claro alrededor de la estría indica producción de Dnasa;

Prueba de DNAsa

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o Todos los Staphylococcus coagulasa positivo producen termonucleasa (Dnasa termo-estable)

Método:o Hervir una suspensión de Staphylococcus

en BHI caldo durante 15 min.;o Enfriar y sembrar hoyos en Agar DNA;o Incubar a 35°C durante 1 a 2 h

Prueba de termonucleasa

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Método:o Hervir una suspensión de Staphylococcus en BHI caldo durante 15 min.;o Enfriar y sembrar hoyos en Agar DNA;o Incubar a 35°C durante 1 a 2 ho Interpretación:

Reacción positiva: halo rosado o rojoalrededor el hoyo. El germen es S. aureus;Reacción negativa: halo claro, pequeño,alrededor el hoyo.

Prueba de termonucleasa Algoritmo de Diferenciación de Staphylococcus spp

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catalasa

StaphylococcusCGP pares y racimos

Pigmento amarillo Streptococcus

EnterococcusLactococcusPediococcusLeuconostocGemella…

-

+

+

Coagulasaen tubo

Micrococcus

-

S. aureus

DNAsaCoagulasaen porta

Látex

+ +

+

+-

Algoritmo de Diferenciación de Staphylococcus spp

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Coagulasa en tubo oLátex óDNAsa

Novobiocina (5 µg)

+

SCN-

Presuntivo S. epidermidis

S. saprophyticusCdo Trehalosa-Manitol

-

≤ 15 mm= R ≥ 16 mm= S

SCN (no epidermidis)60

Algoritmo para identificar Staphylococcus spp.

Coagulasa ó DNAsa

S. aureus SCN

Novobiocina

S. saprophyticus Trehalosa-Manitol

R S

S. epidermidis SCN-

+

+

-

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Antibiograma del Staphylococcus

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COCOS GRAM-POSITIVOS

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(-) (+)

catalasa

Streptococcus sppEnterococcus spp

Staphylococcus spp

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