Centro Nacional Referencia Virología

Centro Nacional Referencia Virología

Instituto Costarricense de Investigación y Enseñanza en Nutrición y Salud (INCIENSA)

Tres Ríos, La Unión, Cartago, Costa Rica, Centroamérica / Tel. (506) 2279-9911 / Fax. (506) 2279-0304/ www.inciensa.sa.cr

Informe de la Primera Ronda del Programa de Ensayos de Aptitud para el

Diagnóstico de COVID-19 (PEA-COVID19)

MSc. Hebleen Brenes Porras. MQC MSc. Claudio Soto Garita. MQC

Centro Nacional de Referencia de Virología INCIENSA, noviembre 2020

http://www.inciensa.sa.cr/




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Tabla de contenido

Abreviaturas ............................................................................................................................... 3

Introducción ............................................................................................................................... 4

Participantes .............................................................................................................................. 4

Descripción del panel ................................................................................................................ 5

Métodos utilizados por los participantes ................................................................................... 5

Desempeño de los participantes................................................................................................ 7

Análisis de los resultados .......................................................................................................... 7

Conclusiones ............................................................................................................................. 7





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Abreviaturas

DE: Desviación Estándar

E: Envoltura

RdRp: ARN Polimerasa ARN Dependiente

N: Nucleocápside

S: Espícula

M: Membrana

ORF1ab: Marco Abierto de Lectura 1ab

PEA: Programa de Ensayos de Aptitud

CNRV: Centro Nacional de Referencia de Virología

CCSS: Caja Costarricense de Seguro Social

Ct: Ciclo de Umbral (siglas en inglés para “Cycle Threshold”)

RNP: ARNasa P





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Introducción

El desarrollo del Programa de Ensayos de Aptitud para el Diagnóstico de COVID-19

forma parte del quehacer del Centro Nacional de Referencia de Virología del Instituto

Costarricense de Investigación y Enseñanza en Nutrición y Salud, Inciensa. Este

programa surge en respuesta a la necesidad de monitorear el desempeño de la Red de

establecimientos que cuentan con una plataforma molecular para el diagnóstico de este

nuevo evento. Esta actividad tiene como objetivo evaluar el desempeño de los

laboratorios públicos de la Caja Costarricense de Seguro Social y privados

pertenecientes a la red de diagnóstico de COVID-19. Asimismo, con el programa se

espera fortalecer la comunicación y la colaboración entre los laboratorios de la red y el

CNRV, lo cual permitirá identificar y subsanar necesidades de capacitación, apoyo y

asesoría técnica para las partes involucradas.

El PEA-COVID-2020-001 fue financiado por el Inciensa en su totalidad, y la inversión del

participante radicó exclusivamente en la ejecución de las pruebas requeridas (extracción

de material genético viral, cuando aplica, y pruebas de biología molecular) para reportar

el resultado de los ítems de ensayo que conforman el panel.

Este informe resume la metodología usada y los resultados reportados por los

participantes para este panel, además, será compartido en la página web de Inciensa y

con las autoridades de salud correspondientes.

Participantes

Como parte de este programa, el CNRV envió en

junio pasado la invitación para participar de la

primera ronda del PEA para el diagnóstico de

COVID-19 del 2020 (PEA-COVID-2020-001) a 17

laboratorios, tanto públicos como privados, de los

cuales 14 aceptaron participar. Las incógnitas de

este panel se empezaron a distribuir durante el

mes de julio y para agosto se recibieron los

resultados de todos los laboratorios inscritos.

De los 14 laboratorios inscritos, 6

correspondieron a establecimientos privados y 8

a establecimientos públicos, y todos enviaron resultados para las incógnitas del PEA-

COVID-2020-001. Asimismo, tal y como se muestra en la figura 1, estos laboratorios

están distribuidos en 3 provincias, con una representación mayoritaria de la provincia

de San José.

San José86%

Cartago7%

Alajuela7%

Figura 1. Distribución de los laboratorios

participantes por provincia





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Descripción del panel

El panel estuvo constituido por 5 lotes de incógnitas, las cuales correspondieron a

“pooles” de muestras enviadas al CNRV-Inciensa para diagnóstico o confirmación

diagnóstica de COVID-19. Cada lote fue debidamente caracterizado por el CNRV-

Inciensa, en lo que se refiere al parámetro a evaluar (presencia o ausencia del ARN del

virus SARS-CoV-2, Cuadro 1), tanto por el protocolo del Hospital Universitario Charité

(Berlín, Alemania) como por el protocolo de los Centros para el Control y la Prevención

de Enfermedades (CDC, Estados Unidos de América). El material genético fue extraído

y purificado mediante QIAamp 96 Virus QIAcube HT Kit y QIAamp Viral RNA Mini Kit,

según las especificaciones del fabricante. Se realizaron alícuotas de 500 µL de cada

lote, las cuales se mantuvieron a –80 °C hasta la distribución. La entrega del panel se

realizó mediante un servicio especializado de mensajería en condiciones controladas de

refrigeración, y se les indicó a los participantes que las muestras se debían procesar en

un tiempo máximo de hasta 24 horas después de recibidas.

Cuadro 1. Caracterización de los lotes de incógnitas mediante RT-PCR en tiempo real

Numero de lote Protocolo Charité Protocolo CDC

Valor asignado E RdRp N1 N2

2020-001 17,5 21,9 16,2 15,26 SARS-CoV-2 se detectó



2020-010 21 25,25 20,3 19,24 SARS-CoV-2 se detectó

2020-011 NSD NSD NSD NSD SARS-CoV-2 no se detectó

NSD: No se detectó. Los valores corresponden al Ct obtenido para cada marcador.

Métodos utilizados por los participantes

Se le solicitó a cada participante información de las plataformas de extracción y

purificación de ácidos nucleicos, así como de las plataformas utilizadas para la

detección del ARN viral. La información de los métodos de extracción y purificación se

puede observar en el Cuadro 2. Cabe destacar que dos de las plataformas empleadas

(FilmArray y Cobas 6800) incorporan tanto el proceso de extracción de ácidos nucleicos

como la detección del ARN viral en un solo sistema, por lo que la muestra respiratoria

es ingresada en el cartucho o en el equipo directamente, y se obtiene el resultado sin

ningún paso adicional.





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De los métodos de detección de SARS-CoV-2 utilizados por los participantes, 12 (86%)

correspondieron a métodos comerciales y 2 (14%) a métodos “in-house”. En el Cuadro

3 se detallan los métodos utilizados y los marcadores genéticos virales empleados en

cada caso. Los marcadores más frecuentes fueron los basados en el protocolo del

Hospital Universitario Charité (Berlín, Alemania), el cual detecta fragmentos del gen E,

gen RdRP y gen N (Corman et al. 2020). Las plataformas Seegene, GeneFinder y Cobas

utilizan una conformación de RT-PCR “multiplex”, en la que en un mismo pocillo se

detectan de manera simultánea dos o tres marcadores virales, mientras que los

laboratorios que utilizaron el protocolo “in-house” detectaron únicamente el marcador

viral del gen E y el marcador endógeno humano RNP en pocillos distintos, es decir, en

formato “singleplex”.

Cuadro 2. Plataformas de extracción y purificación de ácidos nucleicos usadas por los

participantes

Plataforma de extracción y purificación Cantidad de participantes Porcentaje

MagCore Viral Nucleic Acid Extraction Kit

(High Sensitivity) 3 21%

QIAmp Viral Mini Kit 3 21%

Maxwell RSC Viral TNA 2 15%

Cobas 6800 1 7%

MPure-12 Automated Nucleic Acid

Purification System 1 7%

FilmArray Respiratory Panel 2.1 2 15%

NucleoSpin TriPrep Mini kit 1 7%

Seegene Nimbus 1 7%

Total 14 100%

Cuadro 3. Métodos de detección del ARN de SARS-CoV-2 utilizados por los laboratorios

participantes

Método de detección

Esquema de

marcadores

genéticos virales

Cantidad de

participantes Porcentaje

Seegene Allplex 2019-nCoV E, RdRp, N 6 43%

GeneFinder COVID-19 Plus

RealAmp Kit E, RdRp, N 3 21%

Charité (Berlín) “in-house” E 2 14%

FilmArray Respiratory Panel 2.1 S, M 2 14%

Cobas SARS-CoV-2 Test (Sistema

Cobas 6800) ORF1ab, E 1 7%

Total 14 100%





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Desempeño de los participantes

Como criterio de evaluación se estableció que cada incógnita tendría un valor de 20

puntos (100 puntos en total). Partiendo de la sumatoria del puntaje por incógnita se

obtuvo una calificación final que muestra el desempeño de cada laboratorio participante,

misma que se observa en el cuadro 4. Se consideró como desempeño satisfactorio

cuando se obtiene una evaluación igual o mayor al 80%. En el cuadro 4 se aprecia que

todos los participantes obtuvieron la puntuación máxima posible, por lo que todos

tuvieron un desempeño satisfactorio. Además, hubo una concordancia completa tanto

con el valor consenso como con el valor asignado por el CNRV-Inciensa.

Análisis de los resultados

Se les solicitó a los participantes incluir en el reporte de resultados los valores de Ct

para cada marcador genético ensayado, según la técnica utilizada, y si la plataforma

diagnóstica lo permitía. De las metodologías empleadas, sólo tres posibilitaban obtener

dicha información en el momento de la distribución de las incógnitas: Seegene Allplex

2019-nCoV, GeneFinder COVID-19 Plus RealAmp Kit y Charité (Berlín) “in-house”. El

detalle de los resultados de cada participante que reportó este valor se encuentra en los

cuadros 5, 6 y 7 del Anexo I.

El valor de Ct permite hacer un análisis descriptivo para cada lote de incógnita de

acuerdo a la plataforma utilizada, y con ese fin la Figura 2 muestra los valores del Ct de

cada marcador genético utilizado por los participantes, el promedio y desviación

estándar según el método de detección y el lote de incógnita. Cabe destacar que en el

lote 2020-006 se observó un valor alto del Ct para el marcador del gen RdRp en la

plataforma GeneFinder para un participante (en comparación con las demás plataformas

de detección), y el marcador no fue detectado del todo por los otros laboratorios que

emplearon el mismo método.

Los resultados de las plataformas que no indicaron el valor del Ct se detallan en los

cuadros 8 y 10 del Anexo I.

Conclusiones

El PEA-COVID19 tiene como objetivo evaluar el desempeño de los laboratorios públicos

y privados pertenecientes a la red de diagnóstico molecular de COVID-19. Con base en

el alcance de participación en esta primera ronda, se puede concluir que el país cuenta

con múltiples plataformas de extracción y detección del ARN del virus SARS-CoV-2 las

cuales resultan efectivas para el diagnóstico de COVID-19. Dicho resultado refleja la

amplia capacidad de los laboratorios a nivel nacional para realizar el diagnóstico





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molecular de COVID-19 y la buena calidad de resultados emitidos por los miembros de

la red para la detección de SARS-CoV-2. El resultado de las evaluaciones hechas

mediante un PEA podría servir como insumo para formular acciones (cuando aplique)

para la mejora del diagnóstico de COVID-19.

Cuadro 4. Evaluación global de los participantes

Código del

participante

Resultado de

la evaluación

(%)

Resultado de la incógnita

2020-001 2020-003 2020-006 2020-010 2020-011

19 100 SARS-CoV-2

detectado

SARS-CoV-2

detectado

SARS-CoV-2

detectado

SARS-CoV-2

detectado

SARS-CoV-2

no detectado

146 100 SARS-CoV-2

detectado

SARS-CoV-2

detectado

SARS-CoV-2

detectado

SARS-CoV-2

detectado

SARS-CoV-2

no detectado

178 100 SARS-CoV-2

detectado

SARS-CoV-2

detectado

SARS-CoV-2

detectado

SARS-CoV-2

detectado

SARS-CoV-2

no detectado

2105 100 SARS-CoV-2

detectado

SARS-CoV-2

detectado

SARS-CoV-2

detectado

SARS-CoV-2

detectado

SARS-CoV-2

no detectado

2103 100 SARS-CoV-2

detectado

SARS-CoV-2

detectado

SARS-CoV-2

detectado

SARS-CoV-2

detectado

SARS-CoV-2

no detectado

178 100 SARS-CoV-2

detectado

SARS-CoV-2

detectado

SARS-CoV-2

detectado

SARS-CoV-2

detectado

SARS-CoV-2

no detectado

123 100 SARS-CoV-2

detectado

SARS-CoV-2

detectado

SARS-CoV-2

detectado

SARS-CoV-2

detectado

SARS-CoV-2

no detectado

2101 100 SARS-CoV-2

detectado

SARS-CoV-2

detectado

SARS-CoV-2

detectado

SARS-CoV-2

detectado

SARS-CoV-2

no detectado

430 100 SARS-CoV-2

detectado

SARS-CoV-2

detectado

SARS-CoV-2

detectado

SARS-CoV-2

detectado

SARS-CoV-2

no detectado

2033 100 SARS-CoV-2

detectado

SARS-CoV-2

detectado

SARS-CoV-2

detectado

SARS-CoV-2

detectado

SARS-CoV-2

no detectado

2401 100 SARS-CoV-2

detectado

SARS-CoV-2

detectado

SARS-CoV-2

detectado

SARS-CoV-2

detectado

SARS-CoV-2

no detectado

755 100 SARS-CoV-2

detectado

SARS-CoV-2

detectado

SARS-CoV-2

detectado

SARS-CoV-2

detectado

SARS-CoV-2

no detectado

98 100 SARS-CoV-2

detectado

SARS-CoV-2

detectado

SARS-CoV-2

detectado

SARS-CoV-2

detectado

SARS-CoV-2

no detectado

651 100 SARS-CoV-2

detectado

SARS-CoV-2

detectado

SARS-CoV-2

detectado

SARS-CoV-2

detectado

SARS-CoV-2

no detectado

Valor consenso SARS-CoV-2

detectado

SARS-CoV-2

detectado

SARS-CoV-2

detectado

SARS-CoV-2

detectado

SARS-CoV-2

no detectado

Valor asignado por el CNRV-

Inciensa

SARS-CoV-2

detectado

SARS-CoV-2

detectado

SARS-CoV-2

detectado

SARS-CoV-2

detectado

SARS-CoV-2

no detectado

Porcentaje de concordancia

(%) 100 100 100 100 100





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Figura 2. Valor de Ct de cada marcador genético en las plataformas basadas en el

protocolo de Charité. Las barras representan el promedio y la desviación estándar.





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Expectativas para programas futuros

Es importante ampliar el alcance del PEA-COVID19 mediante la incorporación de más

laboratorios en futuras rondas, con una mayor cobertura del territorio nacional, así como

nuevas metodologías que surjan para la detección del SARS-CoV-2.

Referencias

Corman VM, Landt O, Kaiser M, Molenkamp R, Meijer A, Chu DKW, Bleicker T, Brünink

S, Schneider J, Schmidt ML, Mulders DGJC, Haagmans BL, van der Veer B, van den

BS, Wijsman L, Goderski G, Romette JL, Ellis J, Zambon M, Peiris M, Goossens H,

Reusken C, Koopmans MPG, Drosten C. Detection of 2019 novel coronavirus (2019-

nCoV) by real-time RT-PCR. Euro Surveill. 2020; 25(3): pii=2000045.

(https://doi.org/10.2807/1560-7917.ES.2020.25.3.2000045)


https://doi.org/10.2807/1560-7917.ES.2020.25.3.2000045




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Anexo I. Detalle del valor de los resultados reportados por los participantes por método

y plataforma de detección.

Cuadro 5. Valor del Ct por incógnita y marcador genético para las incógnitas positivas

procesadas por Seegene Allplex 2019-nCoV

Lote 2020-001 2020-003 2020-006 2020-010

Participante E RdRp N E RdRp N E RdRp N E RdRp N

19 12.48 17.81 18.09 26.23 28.37 29.21 29.23 33.66 32.70 17.55 19.76 20.51

146 14.38 18.28 18.96 26.88 28.60 30.01 29.35 32.23 32.86 18.56 20.53 22.31

178 15.36 17.79 17.91 27.59 29.60 29.76 29.75 32.75 32.00 18.51 21.04 21.03

2105 13.98 18.23 20.07 27.10 29.37 30.45 29.21 32.02 33.12 17.78 20.04 21.98

652 15.32 18.88 18.45 27.23 29.25 29.59 29.25 32.18 31.85 18.51 20.89 21.09

2103 16.50 18.23 20.07 28.20 30.40 31.50 31.10 34.80 34.50 19.40 22.70 23.40

Promedio 14.67 18.20 18.93 27.21 29.27 30.09 29.65 32.94 32.84 18.39 20.83 21.72

DE 1.27 0.36 0.87 0.61 0.67 0.74 0.67 1.00 0.87 0.60 0.95 0.96


procesadas por GeneFinder COVID-19 Plus RealAmp Kit

Lote 2020-001 2020-003 2020-006 2020-010

Participante RdRp E N RdRp E N RdRp E N RdRp E N

123 19.39 15.40 16.86 30.36 27.02 27.38 41.00 29.81 29.83 21.42 18.29 19.43

2101 20.80 18.30 20.10 31.30 29.70 30.40 - 35.30 33.80 23.70 21.20 22.70

430 18.68 16.29 19.79 30.31 27.89 30.56 - 31.47 33.25 21.22 19.21 22.53

Promedio 19.62 17.26 18.32 30.66 28.44 29.21 - 31.69 32.79 22.11 20.07 21.05

DE 0.88 2.04 1.20 0.46 1.43 1.34 - 1.64 2.26 1.12 1.90 1.27


procesadas por Charité In house

Lote 2020-001 2020-003 2020-006 2020-010

Participante E E E E

98 18.87 30.29 32.60 21.79

651 16.90 28.90 31.60 19.40

Promedio 17.89 29.60 32.10 20.60

DE 1.39 0.98 0.71 1.69





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Cuadro 8. Resultados obtenidos por incógnita y marcador genético para las incógnitas

procesadas por FilmArray Respiratory Panel 2.1

Participante Resultado por lote y marcador genético

Incógnita Lote 2020-001 Lote 2020-003 Lote 2020-006 Lote 2020-

010 Lote 2020-011

Participante S M S M S M S M S M

2033 Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Neg Neg


Pos: positivo; Neg: negativo

Cuadro 9. Otros virus respiratorios detectados en las incógnitas mediante el FilmArray

Respiratory Panel 2.1

Participante Resultado por lote

Lote 2020-003 Lote 2020-010 Lote 2020-011

2033 Rhinovirus/Enterovirus

humano -

Rhinovirus/Enterovirus

humano

2401 Rhinovirus/Enterovirus

humano

Metapneumovirus y


humano


humano

Cuadro 10. Resultados obtenidos por incógnita y marcador genético para las incógnitas

procesadas por Cobas SARS-CoV-2 Test

Participante

Resultado por incógnita y marcador genético

Lote 2020-001 Lote 2020-003 Lote 2020-006 Lote 2020-010 Lote 2020-011

ORF1a/b E ORF1a/b E ORF1a/b E ORF1a/b E ORF1a/b E


Pos: positivo; Neg: negativo


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