CèL·Lules Mare Sunion
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CÈL·LULES MARE I MEDICINA REGENERATIVA
Begoña AranBanc de Línies Cel·lulars
Centre de Medicina Regenerativa de Barcelona
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CÉLULAS MADRE
Se trata de células indiferenciadas que se han localizado en la masa celular interna del blastocisto, en algunos tejidos fetales, en el cordón umbilical y la placenta y en varios tejidos adultos.
Son células pluripotentes (o en algunos casos totipotentes) que dan lugar a células y tejidos especializados.
Su utilidad estriba en la utilización para tratamientos de patologías con pérdida de función celular
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células madre adultas
• son células indiferenciadas que se hallan en tejidos adultos diferenciados y que son capaces de renovarse a sí mismas y diferenciarse en todos los tipos celulares del tejido del que provienen.
• algunas pueden ser pluripotentes.
• se encuentran en hígado, médula osea, pancreas, piel, cerebro, sangre…
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células madre adultas
su frecuencia es baja, son difíciles de identificar y purificar, su proliferación es limitada y son difíciles de mantener en un estado indiferenciado.
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células madre fetales
• se trata de tipos celulares primitivos que se hallan en el feto y que pueden desarrollarse en células madre neuronales, células madre hematopoyéticas (cordón umbilical y placenta), progenitores
de islotes pancreáticos.
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células madre embrionarias
son las que derivan de la masa celular interna (MCI) de un blastocisto (día +5/6 de desarrollo,
150 células). Las células de la MCI dan lugar a las 3 líneas del embrión: ectodermo, mesodermo y endodermo. MCI
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In vitro
In vivo
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HISTORIA
1878 Intentos de Fecundación in Vitro ovocitos de mamífero
1959 1º éxito de Fecundación in Vitro (FIV) (conejo) en USA
1968 1º intento de FIV en humanos
1978 1º nacimiento de FIV en humanos (Edwards y Steptoe-Louise Brown)
1984 Nacimiento España (Victoria Anna)
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250
500
750
1000
1250
1980 1985 1990 1995 2000 2005
CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS
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Células madre embrionarias: autorenovación y pluripotencialidad
Autorenovación DiferenciaciónDivisionasimétrica
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Modelo de enfermedadesy desarrollo de fármacos
Terapia celular
Estudio del desarrollo y organogénesis
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ENFERMEDADES CON PÉRDIDA DE FUNCIÓN CELULAR POTENCIALMENTE TRATABLES MEDIANTE TERAPIA BASADA EN CM
Alteraciones neurodegenerativas
Accidentes vasculares
Lesiones medulares
Fallo cardíaco
Diabetes mellitus
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• Consentimiento informado de las parejas• Aprobación del Comité Ético• Aprobación de la Comisión de Seguimiento y Control de la Donación de Células y Tejidos Humanos del Instituto de Salud Carlos III (Madrid)
Centro de Medicina Regenerativa de Barcelona CMR[B]
Centros de Reproducción Asistida
Proyecto: Derivación de CME en condiciones libres de xenobiòticos y caracterización in vivo de su pluripotencialidad
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Eliminación de la zona pellucida
- 5mg/ml pronasa- Ac. Tyrode’s
Eliminación del trofectodermo medianteinmunocirugía (anticuerpos)
Monocapa de fibroblastos humanos (HFF-1) irradiados (CCD1112SkATCC), en placas cubiertas de gelatina (0.1%)Feeders cells
Descongelación embriones
Cultivo hasta blastocisto
D+5/6
Derivación células madre embrionarias
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Siembra y cultivo del blastocisto o MCI sobre monocapa de fibroblastos humanos (HFF-1) irradiados, en placas cubiertas de gelatina (0.1%)
Derivación células madre embrionarias
CULTIVO
KO-DME Medium supplementado con: 2 mmol/l Glutamax
0,05 mmol/l 2-mercaptoethanol 8 ng/ml basic fibroblast growth factor (FGF)
1% non-essential amino acids 20% KO-Serum Replacement 0,5% penicillin-streptomycin
37ºC y 5%CO2
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Derivación ES[2]
p0 d4 (10x) p0 d7 (20x) p0 d9 (20x)
p1 d2 (4x) p1 d6 (4x)p0 d12 (10x)
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CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS
CULTIVO Bajo condiciones
adecuadas de cultivo (cultivo sobre fibroblastos de ratón - humanos, Matrigel, Fibronectina), las CME mantienen su estado indiferenciado indefinidamente.
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CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS
DERIVACIÓN Y CULTIVO
• Es imprescindible para poder utilizar las líneas celulares establecidas que los cultivos se lleven a cabo con métodos libres de soporte animal (anticuerpos y complemento inmunocirugia, feeders, suero, etc)
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Fosfatasa alcalina
cariotipo
Microsatélites & HLA
Actividad Telomerasa
Immunocitoquimica para marcadores de diferenciación In vitro
Formación de cuerpos embrioideos
Inmunohistoquímica para marcadores de diferenciación In vivo (formación teratomas)
Caracterización
Inmunocitoquimica para marcadores de pluripotencialidad
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cariotipo
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CARACTERIZACIÓN: Diferenciación in vitro
Embryoid bodies
3 líneas germinales:
- Ectodermo: neuronas
- Endodermo: miocardiocitos
- Mesodermo: tejido glandular
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CARACTERIZACIÓN: Diferenciación in vitro
Ectodermo: beta-tubulina
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CARACTERIZACIÓN: Diferenciación in vitro
Endodermo: Alfa-feto proteina
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CARACTERIZACIÓN: Diferenciación in vitro
Mesodermo: alfa-actinina
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CARACTERIZACIÓN: Diferenciación in vivo
Teratomas Ratones SCID de 8 semanas
1millón células
• intramuscular
• subcutáneo
• en algunos órganos
2 meses
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CARACTERIZACIÓN: Diferenciación in vivo
Mesodermo (Cartilago) Endodermo (epitelio respiratorio)
Endodermo (epitelio respiratorio)
Mesodermo (Cartilago)
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CARACTERIZACIÓN: Diferenciación in vivo
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DIFERENCIACIÓN Quedan por establecer los factores genéticos y/o ambientales que controlan el desarrollo de las CME y su importancia durante los distintos estadíos de diferenciación
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Diferenciación de las CME
• ADIPOCITOS• ASTROCITOS• CARDIOMIOCITOS• CONDROCITOS• CÉL. HEMATOPOYÉTICAS• CÉL. DENDRÍTICAS• CÉL. ENDOTELIALES• KERATINOCITOS• HEPATOCITOS
• PRECURSORES LINFOCITOS• MASTOCITOS• NEURONAS• OLIGODENDROCITOS• OSTEOBLASTOS• ISLOTES PANCREÁTICOS• MÚSCULO LISO• MÚSCULO ESTRIADO• TROFECTODERMO
*gametos (ratón)
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PROBLEMAS TÉCNICOS
• Diferenciación, desdiferenciación y transdiferenciación: control del crecimiento, migración, destino y diferenciación celular para asegurar procesos estables
• Desarrollo tisular inadecuado• Aparición de tumores• Aislamiento y purificación• Rechazo inmunológico• Funcionalidad y viabilidad• Condiciones de cultivo (GMP)
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TERAPIA CON CME Y RECHAZO INMUNOLÓGICO
Como evitarlo?• Uso de fármacos inmunosupresores• Uso de células HLA compatibles: bancos de CM• Inducción de inmunotolerancia: administración previa
de material embrionario o hematológico del donante• CM procedentes de embriones clonados mediante
transferencia nuclear
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CLONACIÓN POR TRANSFERENCIA DE NÚCLEO
Producción de un individuo genéticamente idéntico por transferencia del núcleo de una célula somática a un ovocito del cual se ha eliminado el núcleo
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Nacimiento del primer mamífero superior a partir de una célula de un individuo adulto
Oveja, macaco, cerdo, vaca, gato, ratón, conejo, mula, ciervo, caballo, cabra, perro
Dolly y su madre portadora
TRANSFERENCIA NUCLEAR
Nature 385, 810 - 813 (27 February 1997)
Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cellsI. Wilmut, A. E. Schnieke*, J. McWhir, A. J. Kind* & K. H. S. CampbellRoslin Institute (Edinburgh), Roslin, Midlothian EH25 9PS, UK*PPL Therapeutics, Roslin, Midlothian EH25 9PP, UK
![Page 39: CèL·Lules Mare Sunion](https://reader036.fdocuments.ec/reader036/viewer/2022062300/55916e7d1a28ab1e028b45ed/html5/thumbnails/39.jpg)
CLONACIÓNTRANSFERENCIA DE NUCLEAR (SCNT)
embriónTransferencia a oveja portadora
Dolly
célula de glándula mamária
Transferencia a ovocito enucleado
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Transferencia nuclear
• Pluripotentes• Paciente-compatibles (mitocondria?)• No aún en humanos • Problemas éticos
Ovocito MII
Enucleación
Transferencia nuclear y activación
Blastocisto
Derivacion CMEByrne et al., 2007
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![Page 42: CèL·Lules Mare Sunion](https://reader036.fdocuments.ec/reader036/viewer/2022062300/55916e7d1a28ab1e028b45ed/html5/thumbnails/42.jpg)
Transferencia nuclear para el estudio de los mecanismos celulares y moleculares de la enfermedad
![Page 43: CèL·Lules Mare Sunion](https://reader036.fdocuments.ec/reader036/viewer/2022062300/55916e7d1a28ab1e028b45ed/html5/thumbnails/43.jpg)
Transferencia nuclear para el estudio de los mecanismos celulares y moleculares de la enfermedad
![Page 44: CèL·Lules Mare Sunion](https://reader036.fdocuments.ec/reader036/viewer/2022062300/55916e7d1a28ab1e028b45ed/html5/thumbnails/44.jpg)
Transferencia nuclear para el estudio de los mecanismos celulares y moleculares de la enfermedad
![Page 45: CèL·Lules Mare Sunion](https://reader036.fdocuments.ec/reader036/viewer/2022062300/55916e7d1a28ab1e028b45ed/html5/thumbnails/45.jpg)
Transferencia nuclear para el estudio de los mecanismos celulares y moleculares de la enfermedad
![Page 46: CèL·Lules Mare Sunion](https://reader036.fdocuments.ec/reader036/viewer/2022062300/55916e7d1a28ab1e028b45ed/html5/thumbnails/46.jpg)
Reprogramación de células somáticas (IPS)
• Paciente-compatible• No problemas éticos• Disponible en humanos• Pluripotentes ?• Integración medianter vector
(virus)• Segura? Activación oncogenes,
transmisión línea germinal?)
Fibroblastos
Células ES-like
Takahashi et al., 2007Nakagawa et al., 2007Park et al., 2007
Integración genes (virus)
![Page 47: CèL·Lules Mare Sunion](https://reader036.fdocuments.ec/reader036/viewer/2022062300/55916e7d1a28ab1e028b45ed/html5/thumbnails/47.jpg)
KeratinocitosDia 0
Pequeña colonia ES-like10 días post-infección
Típica colonia iPS20 días post-infección
Colonias iPSAP positivas
KIPS: Generación a partir de keratinocitos
Aasen, 2008 Nat Biotech.
![Page 48: CèL·Lules Mare Sunion](https://reader036.fdocuments.ec/reader036/viewer/2022062300/55916e7d1a28ab1e028b45ed/html5/thumbnails/48.jpg)
BANCOS DE IPS
Daley Q. et al. Cell 2008
• Las iPS paciente-específicas podrían representar modelos experimentales para estudiar distintas enfermedades, ensayar tratamientos y posibles terapias génicas.
• Se han generado ya 11 líneas distintas de iPS procedentes de pacientes con enfermedades graves: enfermedades neurodegenerativas, metabólicas, cardiovasculares, diabetes.
![Page 49: CèL·Lules Mare Sunion](https://reader036.fdocuments.ec/reader036/viewer/2022062300/55916e7d1a28ab1e028b45ed/html5/thumbnails/49.jpg)