CEBI E1b: Electroforesis capilar · 2015. 8. 21. · Los analitos con carga neta negativa son...

CARRERA DE ESPECIALIZACION EN CARRERA DE ESPECIALIZACION EN BIOTECNOLOGIA INDUSTRIALBIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL

FCEyNFCEyN--INTIINTI

Materia de Especialización CEBI_E1bMateria de Especialización CEBI_E1bTécnicas de análisis en biotecnología

Macromoléculas

Docente a cargo: SANTAGAPITA, Patricio

CEBI_E1b: Electroforesis capilar

Electroforesis capilar

Técnicas de Análisis-Macromoléculas

La electroforesis capilar (CE) es una familia de técnicas que emplean capilares estrechos (entre 20-200 µm de diam. int.) tanto para separar moléculas grandes como pequeñas. Introducción comercial: fin 1980.

Patricio Santagapita_CEBI_E1b

Las separaciones se facilitan por el uso de voltajes altos, lo que generan dos flujos,el electroosmótico (EOF) y el electroforético, de las especies del buffer y de las especies iónicas, respectivamente.



Las propiedades de separación así como el resultado obtenido (electroferograma) recuerda a una mezcla entre HPLC y CG con PAGE.

Ventajas principales


Ventajas principales

-requiere poca muestra (nL)-eficiencias elevadas (simil GC o +)-cuantificación-automatización -> repetitibilidad-admite muchos analitos -usa poco reactivo



El siguiente es un diagrama del funcionamiento básico de unequipo de CE.




Cómo y por qué migran los solutos si…(o por qué se mueve la fase móvil…)

-No hay bomba, como en HPLC


-No hay gas presurizado, como en CG

-No hay capilaridad (como cromatografía en papel)

VER: http://www.shsu.edu/~chm_tgc/sounds/flashfiles/CE.swf



El flujo electroosmótico (EOF) es el proceso impulsor fundamental en CE. Se produce por la superfice cargada en la pared del capilar.

Se debe a la formación de una doble capa eléctrica, en la interfase entre el líquido y la superficie interna del capilar.Habitualmente, el interior de los capilares es de sílica, que

‐


Habitualmente, el interior de los capilares es de sílica, quepresenta grupos silanoles (Si‐OH) libres en la superficie interna.

El pI de la silica fundida es > 1,5. Por encima de ese pH (normalmente > 3 para estar seguros), los silanoles permanecen cargados y confieren a la superficie interna del capilar una carga neta negativa.

Como se origina el EOF?



Ánodo+

Cátodo-

Detector



El EOF se produce por el sentido de flujo de los cationes adyacentes al capilar



Los cationes del buffer migran hacia la pared del capilarcargada negativamente, lo que termina formando una doblecapa eléctrica.

Al aplicar el campo eléctrico, los cationes tenderán a migrarhacia el cátodo (de carga opuesta) y los aniones hacia el


hacia el cátodo (de carga opuesta) y los aniones hacia elánodo.

Como los cationes se encuentran solvatados con las cargasnegativas de los silanoles de la pared del capilar, ellosterminan arrastrando incluso los aniones y el resto de lasolución con ellos.




A pH elevados (en capilar de 50 um i.d.): 4 nL/sA pH bajos: 0,5 nL/s.



La intensidad del flujo electroosmótico depende de las cargas de la pared y de la intensidad del campo eléctrico.La intensidad de la carga neta negativa de las paredes

El grado de ionización depende el pH


negativa de las paredesdepende también del pH (cuanto más alcalino, mas ionizadoslos silanoles).Se grafica la velocidad de EOF en función del pH.



La velocidad de migración real de un analito en CE depende también del flujo electroosmótico, que fluye hacia el cátodo (carga negativa). EOF se mide inyectando un analito patrón (y neutro) y evaluando el tiempo que demora en llegar al detector.


Por lo tanto, la migración real depende del resultado neto entre la atracción de cargas hacia el electrodo de carga opuesta y el flujo electroosmótico.



Los analitos con carga neta positiva son atraídos hacia el cátodo (‐), en el mismo sentido que el flujo electroosmótico.

Los analitos con carga neta negativa son atraídos hacia el ánodo (+), en contra del flujo electroosmótico.


En condiciones de capilaridad, la fuerza del flujo electroosmótico es mucho mayor que la atracción hacia el ánodo, por lo que los analitos con carga negativa también migran hacia el cátodo (‐), pero con una velocidad mucho menor.

Incluso aniones con triple carga negativa terminan migrando hacia el cátodo (‐), por la fuerza del flujo electroosmótico.

Velocidades aparentes

Analitos con carga neta + se mueven más rápido que EOF

EOF



Analitos sin carga neta se moverán igual que el EOF. Útil para determinar la velocidad del EOF

EOF

Analitos con carga – se mueven más lentamente que EOF

EOF



El tiempo de migración (tm) es uno de los parámetros prácticos claves, y es el tiempo que tarda el soluto en moverse por el capilar desde su inicio hasta el detector.

La movilidad electroforética (up) se calcula a partir de la velocidad de migración o electroforética (vp) y la fuerza del campo eléctrico (V/cm).


(V/cm).

Ld: distancia capilar- detectorLt: distancia total capilar

La movilidad electroforética es proporcional a la carga netade la molécula, e inversamente proporcional a las fuerzas defricción presentes en el buffer.



Movimientos y ecuaciones asociadas:

- Analitoν = µ E ν = velocity µ = electrophoretic mobility E = Electric field- Movilidad electrofóreticaµ = q/[6πηr]


µ = q/[6πηr]q = charge η = solution viscosity r = Stoke's radius (analito)- Flujo electroosmoticoνEOF = [ε/4πη]ζEε = dielectric Constant ζ = Zeta potential- Flujo de migraciónν = [(µEO + µe)V]/LV = potential L = length of capillary



Además, el perfil de avance del flujo en los sistemas basadosen el flujo electroosmótico, es plano, a diferencia del flujolaminar, perfil característico de los sistemas impulsados porpresión (HPLC).Por lo tanto, el flujo no contribuye al ensanchamiento debandas, como si ocurre en HPLC.


bandas, como si ocurre en HPLC.La CE puede tener cientos de miles de platos teóricos.



El número de platos teóricos (Eficiencia de separación) estádado por:


N: Número de platos teóricosµ: Movilidad aparenteDm: Coeficiente de difusión del analito

Por lo tanto, la eficiencia solo estaría limitada por la difusión,y acrecentada por la fuerza del campo eléctrico.¡Y no depende del largo del capilar!



Problemas principales

Joule heating (calentamiento por la corriente). Se debe a la resistencia que muestra el buffer a fluir con la corriente.Hoy en día no se pueden aplicar corrientes mayores a 30 kV.


Difusión del calor dentro del capilar. Genera gradiente, que afecta a la viscosidad. Solución: capilares más estrechos y efectiva remoción del calor (por diseño de equipo).



Inyección de la muestraLos viales de origen, destino y el capilar contienen un buffer salino acuoso (electrolito).

2 métodos más difundidos


2 métodos más difundidos

- por presión.

- eléctrocinética. Aplicación de un voltaje a la muestra para que ingrese.



DetecciónPueden usarse varios métodos de detección.Lo más común es absorbancia UV o UV-Visible.Habitualmente una parte del mismo capilar (cercana al extremo de salida) se usa como celda de detección.La detección en el mismo tubo evita una pérdida en resolución.


La detección en el mismo tubo evita una pérdida en resolución.Los capilares habitualmente están cubiertos por un polímero, que debe ser transparente en la ventana de detección, o debe removerse.



El recorrido del haz de luz en la detección de CE (50 um) esmucho menor que en una celda UV tradicional (1 cm).

Como la sensibilidad es directamente proporcional a lalongitud del recorrido del haz, es necesario encontrar formasde aumentar el recorrido en la CE, a pesar de una segura


de aumentar el recorrido en la CE, a pesar de una segurapérdida de resolución.

El mismo capilar puede ser expandido formando una burbuja(Fig. a), o puede agregarse un fragmento perpendicular alcapilar (Fig. b) para aumentar el recorrido en el lugar dedetección.




La detección del analito puede ser directa o indirecta (se coloca un analito patrón que absorba mucho, y se registra la bajada en la Abs como señal; claramente, esta metodología tiene sus limitaciones)(detalle en animación, en diapositiva siguiente)



Los conceptos principales de CE se pueden observar en la siguiente animación:

http://www.shsu.edu/~chm_tgc/sounds/flashfiles/CE.swf

- Componentes del sistema


- Componentes del sistema- Inyección de muestra- EOF- Detección



Modos de CE

• Capillary zone electrophoresis (CZE)

• Capillary Isoelectric focusing (CIEF)

• Capillary gel electrophoresis (CGE)

• Capillary Isotachophoresis (CITP)


• Capillary Isotachophoresis (CITP)

• Micellar electrokinetic capillary chromatography (MECC)

Algunas de las técnicas (CZE, CIEF y CITP) están descriptas en

la siguiente animación, con sus diferencias y similitudes

http://www.shsu.edu/~chm_tgc/sounds/flashfiles/CEs.swf



Selección de técnica según muestra


Introduction to CE, Beckman Handbook



Capillary Zone Electrophoresis - CZE

Es la más común entre las CE.

Las moléculas son separadas por su relación carga/masa, dentro


de un capilar, sometidas también a un campo eléctrico.

Es clave: homogeneidad de los buffers (mantener pH exacto), fuerza eléctrica constante a lo largo del capilar.

Se pueden separar tanto moléculas grandes como pequeñas.



CZELos componentes se separan en zonas discretas:


Inicio

durante




La movilidad electroforética de un analito a un pHdeterminado se puede aproximar por la teória Debye-Huckel-Henry (ya vista antes):


Siendo z la carga neta de la molécula y r el radio de Stokes delanalito, y η viscosidad del medio



CZEEn muchos casos, y especialmente los que involucran a macromoléculas, la carga neta de una molécula: DEPENDE DEL pH.

Capilar típico:


De sílica fundida, de 25-75 um. Son transparentes al UV, alta durabilidad y potencial zeta adecuado.

Importante: debe ser acondicionado antes del primer uso (0,1M NaOH 10'; H2O, 5'; buffer de corrida, 10'). Objetivo: asegurarse que la superficie del mismo se encuentre uniformemente cargada.



Efecto del pH: cambio en la migración- pH elevado → EOF es importante → orden migración: cationes, neutros, aniones. Estos últimos igual migran hacia el cátodo, dada la magnitud de EOF (EOF > migración electroforética).


OJO: los compuestos neutros no se separan entre si dado que su carga neta es 0.

- pH bajo → EOF es pequeño → puedo medir cationes y aniones en diferentes corridas, pero NO juntos. Se cambia la posición del cátodo (si mido cationes, configuración std) o ánodo (mido aniones) respecto al detector, revirtiendo la polaridad de los electrodos.



Efecto del pH: cambio en la migraciónPor lo tanto, el cambio de pH influye en las proteínas y péptidos y en su migración! Afectando la sensibilidad en su separación.

Regla: elegir un pH al menos 2 unidades > que el pKa para asegurarnos una completa ionización.


asegurarnos una completa ionización.

Cuidados- en pH muy alcalinos, ya que EOF es muy grande y podría no separar mis compuestos de interés por su velocidad.

- en pH muy ácidos, pared del capilar sin carga. No hay interacción, pero la proteínas pueden precipitar.



CZE



Ideales para proteínas!

(reducen calentamiento)



CZE – selección de buffers

- concentración típica: 50-100 mM.- filtrado a 0,45 um para evitar obstruir capilar.


Problema de capilares y coating:- pegado de sustancias + a las paredes. - coating puede evitarlo. Hay varios tipos. También se utiliza para evitar el pegado hidrofóbico de proteínas.



CZE Ojo: alteran la movilidad electroforética de las protreínas





CZE - aplicacionesProteínas y péptidos . Diferencias de hasta 1 aminoácido son detectables. Ejemplo: separación de BSA reducida, desnaturalizada y digerida. Realizada a pH bajo con 1,5 M Urea.





CZE - aplicaciones





Capillary Isoelectrofocusing - CIEFSe usan anfolitos carriers, y se forma un gradiente de pH similar al visto para IEF una vez aplicado el voltaje. Contraste con CZE, en donde el buffer debía mantenerse lo más estable posible, mientras aquí es discontínuo.





CIEFLas moléculas migrarán mientras estén cargadas.

El EOF debe ser suprimido (momentaneamente) para que el IEF sea efectivo (sino, no se forma un gradiente y “corre” todo). Se


realiza un coating de metilcelulosa o poliacrilamida. Esto suprime tanto el EOF como la adsorción de proteínas.

Uso principal: separación de alta resolución de proteínas y polipéptidos. Se resuelven hasta 0,02 unidades de pH.



CIEFImportante: pH del buffer anódico debe ser menor que el pI del anfolito más acídico, mientras que el pH del buffer básico debe ser mayor que el del anfolito más básico, para evitar sus migraciones en los mismos.


3 pasos para su aplicación: - cargado- enfocado- mobilización



CIEFCargado. Mezcla muestra + anfolitos (1-2 %). Inyección más común por presión o vacío.

Enfoque. Buffer cátodo: NaOH; buffer ánodo: H3PO4. Campo:


3 4

500-700 V/cm. Ojo: precipitación: uso de aditivos.

Movilización. Etapa necesaria, ya que si quedan fijos en el capilar, ¿cuándo los detecto? Se puede realizar para el cátodo o ánodo, depende de que buffer se reemplace, para que se reinicie el EOF. Detección a 280 nm dado que los anfolitos absorben a 214 nm.



CIEF -Aplicaciones

Determinación de pI de proteínas, separación de


Mezcla de proteínas (1-5);1: pI >;



separación de mezclas Ig, variantes Hb, modificaciones post-traduccionales

1: pI >; 5: pI <



Capillary Gel Electrophoresis - CGE

- EOF está suprimido (el mismo gel lo suprime), al igual que en CIEF (previo a movilización).- Aplicación de CE a electroforesis en geles para separación de ADN. Tendremos separación por tamaño como en PAGE.


ADN. Tendremos separación por tamaño como en PAGE.- Se usan capilares rellenos de poliacrilamida (más usual, pero veremos otros). Agarosa no se puede utilizar dado que no soporta el calentamiento excesivo por los altos voltajes.




CGEDos clases de relleno de geles: geles físicos (hidroxipropilmetil celulosa) o químicos (poliacrilamida).

Capilares de 50 a 100 µm, y entre 10 y 100 cm.


A mayor largo, mejor resolución, pero más calentamiento.Puedo cambiar el rango de PM a resolver cambiando la concentración en el gel (= PAGE).

Ojo con el calentamiento! Puede ocasionar poros en el gel. Los geles físicos son más sensibles que los químicos.



CGEMuy utilizado para proteínas y ADN.

Proteínas: se suelen desnaturalizar (calor, SDS, ß-mercaptoetanol). Ventaja: igualdad de carga/masa y forma (todas


rod-like).

Buffer típico: 90 mM Tris-fosfato pH 8,6 con 0,1 % SDS.

Se debe realizar calibración con marcador de PM (= PAGE).

Inyección: electrocinética (por presión se obstruye el gel).



CGEEj. separación homopolímero sintético de 50 timidinas. Se logra resolución de separación de 1 unidad.





CGEEj. separación doble hebra de ADN. Resolución de 3 pb!

También es útil para


separación de fragmentos ADN por PCR y digestiones con enzimas de restricción (caso en la figura de al lado).




Capillary Isotachophoresis - CITPAl igual que CIEF, se debe eliminar el EOF (así nació, pero hoy en día tb se usa) y se posee un sistema heterogéneo en el buffer.Se usa un electrolito iniciador (alta movilidad) y uno finalizador (baja movilidad), y la separación de la muestra ocurre en el


medio.




CITPEl electrolito líder se coloca tanto en capilar como en el reservorio “catódico” (cerca del detector). Debe poseer mayor movilidad que el analito más móvil que yo quiera separar. Por ej: Cl- (si separo especies cargadas negativamente).


En el otro reservorio, se pone al electrolito finalizador (posee una movilidad menor a cualquiera de los analitos).

Como es un sistema heterogéneo: la fuerza eléctrica en cada zona será diferente, y será inv. proporcional a la conductividad (depende de movilidad y concentración)



CITPComo se logran zonas muy delimitadas, la separación por movilidad es muy elevada.

Todas las bandas se mueven a la misma velocidad (único en CE),


una vez que se enfocaron. Esto es pq:- Si muy móvil: alta conductividad, por lo que E baja, y por lo tanto la velocidad se reduce;- Si poco móvil, baja conductividad (alta resist), generando mayor E y por lo tanto aumentan su velocidad.

Al final, la velocidad de todos será igual.



CITPComo consecuencia de esto, existe entonces un efecto de enfoque, al igual que en CIEF, debido al juego entre conductividad y caída del voltaje, que son indirectamente proporcionales. Movilidad = conductividad x caída de voltaje


No se pueden determinar cationes y aniones en la misma corrida(Cationic CITP y Anionic CITP).



CITP

El orden de migración

El orden de migración es inverso


migración es el mismo con y sin EOF

inverso con y sin EOF!



CITP – selección de buffer




CITPAsí se ve un electroferograma por CITP. Se utilizan spacers para que se asemeje a los obtenidos por CZE (detección UV). Son compuestos de movilidad intermedia que no absorben. Así se obtiene separación entre bandas! (sino no la habría).

Patricio Santagapita_CEBI_E1bIntroduction to CE, Beckman Handbook

Grafico conductividad



CITPContras respecto a CZE: Es más compleja la elección de buffers.Uso de spacers para evitar superposición de bandas.

Capilares de silica


0,25% de metilcelulosa suprime el EOF.

Electrolito lider: ácido fosfórico.Electrolito finalizador: valina (100 mM, ajustado a pH con amina primaria).



CITP – selección de buffer




CITP –comparaciones

Anionic CITP: capilar con cobertura (SIN EOF)


Capilar sin cobertura (CON EOF)



CITP –comparacionesCon spacers, mejor separación

Anionic CITP: capilar con cobertura (SIN EOF)




Micellar electrokinetic Capillary cromatography - MECCIdeal para determinación de moléculas pequeñas.Se usan micelas que forman soluciones surfactantes, similares a cromatografía líquida en fase reversa, pero con los beneficios de la CE.





MECCPara profundizar: apunte adjunto Introduction to capillary electrophoresis – Beckman handbook.

Fundamento:

EOF (fuerte)


(caso pH neutroa básico)


EOF (fuerte)

Los analitos se particionaentre bulk y micela ; si en micela, tiene menor vel.; sino, es la v del EOF



MECC - aplicaciones

Patricio Santagapita_CEBI_E1bIntroduction to CE, Beckman Handbook



Aplicaciones:Secuenciación automática de ADNVer:http://www.sealund.com/forensicdna/images/module4/DNACD_mod04-2-08.swfEquipo automatizado:https://www.jenck.com/productos/producto/mce-202-multina

Detalle: DNA Sequencing, Applied Biosystems


https://www.jenck.com/productos/producto/mce-202-multina

Ladder-500

Electroforesis capilar-Problemas


Problema 1.Los siguientes electroferogramas corresponden a muestras de proteínas de suero lácteo nativa (a) y almacenadas con lactosa a 37ºC durante 5 y 10 horas (b y c, respectivamente) obtenidos por electroforesis de zona (CZE) en capilares de sílice sin recubrir en buffer borato 50 mM a pH 9,25. La detección se realizó en el UV a 214 nm. Se grafica el tiempo de inyección (X) vs. Intensidad de señal detectada (Y).


inyección (X) vs. Intensidad de señal detectada (Y).

a) Indique a que corresponden los picos en el gráfico a.b) Analice que sucede en los electroferogramas b y c. Indique si las proteínas ganaron o perdieron peso. ¿Se debe tener en cuenta cambios en el pI?c) El EOF, ¿es mayor o menor a pH 9 que a pH 3?



a b


c



Problema 2.

Calcular el n° de platos teóricos si se conoce que una proteína (mioglobina) pesa 13,9 kDa y posee una movilidad de 0,65 10-4 cm2/V s (20 mM bicine/TEA buffer, pH 8,5) con un D = 1 10-6 cm2/s a 30.000 V.




Problema 3.

El siguiente es un electroferograma obtenido de ADN amplificado por PCR obtenido por digestión, realizado por CGE.Indique: a) como es el peso comparable de los picos A-D; b) a que puede corresponder el pico A.


http://www.nature.com/nprot/journal/v1/n1/fig_tab/nprot.2006.8_F1.html

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