CCAYAC-P-062-1 (1)

"DEBE CONFIRMARSE SU VIGENCIA ANTES DE HACER USO DE STA VERSIN, POR SI HA SIDO MODIFICADA"

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COMISIN DE CONTROL ANALTICO Y AMPLIACIN DE COBERTURA

Clave: CCAYAC-P-062

GUA PARA LA EVALUACIN DEL DESEMPEO DE MTODOS DE PRUEBA MICROBIOLGICOS PARA EL ANLISIS DE

ALIMENTOS

Rev. 1

Hoja: 2 de 17

VIGENTE A PARTIR DE: 2012-10-15

FECHA DE PRXIMA REVISIN: 2015-10-15

SUBSTITUYE A: CCAYAC-P-062 DE FECHA 2011-03-28

3.1.8. Los microorganismos de prueba debern ser obtenidos colecciones nacionales o internacionales certificados o en su defecto microorganismos obtenidos a partir de aislamientos en el mismo laboratorio, siempre que estos estn perfectamente bien identificados en su identidad, pereza y viabilidad.

3.2. Estrategia para la evaluacin del desempeo del los mtodos de prueba microbiolgicos.

3.2.1. Para cada mtodo de anlisis que se implemente en el laboratorio, es necesario realizar la evaluacin del desempeo del mismo, por lo que el laboratorio debe contar con un plan general o documento maestro de validacin donde se incluya la evaluacin del desempeo de los mtodos de anlisis microbiolgicos, en el que se debern describir las estrategias para alcanzar la validacin en las matrices de inters del laboratorio.

3.2.2. Cada evaluacin del desempeo debe documentarse mediante un protocolo, en el que se deben mencionar los parmetros y mtodos estadsticos utilizados para evaluar el desempeo de un mtodo microbiolgico, ademas de un Informe de la evaluacin en el cual se debera incluir la descripcin de las actividades realizadas, la enumeracin de los materiales, medios, reativos y equipos utilizados, su rastreabilidad y los resultados obtenidos, la aplicacin de los parametros definidos y la conclucin de la evaluacin del desempeo.

3.3. Lineamientos 3.3.1. Siguiendo el plan de validacin, cada mtodo de prueba debe evaluarse para demostrar

que es adecuado para el analisis en cada uno de los grupos de alimentos de interes, evaluando almenos una de las matrices que lo conforman.

3.3.2. Las muestras utilizadas preferentemente deben ser ausentes del microorganismo de inters, pero no limitarse estos, en la presente gua se describen los criterios para el uso de muestras no contaminadas.

3.3.3. El uso de muestras naturalmente contaminadas debe describirse en cada protocolo y no contra decir lo descrito en la presente gua, los criterios estadsticos y las referencias utilizadas debern incluirse como anexos en el protocolo de validacin.

3.3.4. Para el alacence del este documento se ha propuesto la siguiente clasificacin del productos de interes sanitario, basada en la experiencia de la RNLSP y lo sealado en la ISO 16140.

Grupos de inters

Crnicos Aves Productos de la pesca

Frutas y Vegetales

Productos Lcteos

Tipos de alimentos

Crudos Procesados Congelados Otros

Crudos Procesados Congelados Otros

Crudos Procesados Congelados Secos Otros



Ejemplos de matriz:

Carne molida Guisados Carne congelada

Pollo Nugets Milanesas de pollo congelado

Moluscos Pescado Filete Camarn

Mango Coctel

Leche Queso Leche en polvo


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3.3.5. Los criterios de seleccin de una matriz deben estar descritos y justificados en cada

protocolo. Se debern elegir las matrices representativas que tenga el alcance de la

metodologa a evaluar, una vez elegida, se deben hacer pruebas previas de ella para conocer su microbiota. Se deber contar con cantidad suficiente de muestra para hacer todos los anlisis. Las matrices elegidas y su justificacin deben mencionarse en el protocolo de validacin.

3.3.6. Cuando se indique dos analistas diferentes, deber entenderse como dos analistas diferentes o un mismo analista en condiciones de trabajo diferentes, por ejemplo, fechas de anlisis diferentes, lotes de medios de cultivo diferentes etc.

3.3.7. Las cepas empleadas debern proceder de colecciones nacionales o internacionales certificadas o en su defecto, cepas aisladas en el laboratorio siempre que se demuestre su identidad, pureza y viabilidad.

3.3.8. Para mtodos cualitativos debern emplearse cepas control negativo y control positivo. 3.3.8.1. Las cepas control positivo debern ser aquellas de propsito de inters del

mtodo 3.3.8.2. Las cepas control negativo debern ser aquellas indicadas en el mtodo de

prueba o en su defecto las que puedan mencionarse biota acompaante o que se puedan considerar como interferentes del microorganismo control positivo.

3.3.9. Para mtodos cuantitativos: 3.3.9.1. Para los mtodos de grupos microbianos, pueden utilizarse mezclas de

microorganismos. 3.3.9.2. La verificacin puede realizarse por vaciado en placa utilizando un medio como

agar cuenta estndar para los mtodos cualitativos y el mismo medio que se describa para cuenta para los mtodos cuantitativos, por ejemplo: Agar Rojo Bilis Violeta, Agar Baird Parker, etc.

3.3.10. Criterios de Aceptacin 3.3.10.1. Mtodos Cualitativos

Parmetro Criterio de aceptacin Mtodos Cuantitativos

Verificacin del tamao del

inoculo

Al verificar el tamao del inoculo por lo menos seis veces en promedio se obtienen cuentas de menos de 10 UFC* y ninguna de 10 UFC o mas.

Verificacin de la muestra. Numero de repeticiones: 3 Analistas: uno Resultados positivos: 0%

Verificacin del lmite de

deteccin.

Numero de repeticiones: al menos 10 por analista Analistas: al menos dos Resultados positivos: al menos el 80 % Tamao del inoculo: menos de 10 UFC

Falsos positivos

Numero de repeticiones: al menos 10 por analista Analistas: al menos dos Resultados positivos: 100 % Tamao del inoculo: mas de 100 UFC


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Parmetro Criterio de aceptacin Mtodos Cuantitativos

Incertidumbre Mencionar las fuentes de incertidumbre asociadas a las mediciones. * Preferentemente menores o iguales a 5 UFC

3.3.10.2. Mtodos Cuantitativos

Parmetro Criterio de aceptacin Metodos cuantitativos

Repetibilidad

Muestras no contaminadas: Nmero de repeticiones: 10 Nmero de analistas: uno Nivel de fortificacin: Al menos uno (valor medio) Clculo: Resultado: r < 3

Muestras naturalmente contaminadas: Nmero de repeticiones: 10 Nmero de analistas: uno Nivel de fortificacin: no aplica Clculo: Resultado: r < 3

Reproducibilidad

Muestras no contaminadas: Nmero de repeticiones: por lo menos 10 por analista Nmero de analistas: por lo menos 2 Nivel de fortificacin: Al menos 1 (medio) Clculo: Resultado: R < 3

Muestras contaminadas: Nmero de repeticiones: por lo menos 10 por analista Nmero de analistas: por lo menos 2 Nivel de fortificacin: no aplica Clculo: Resultado: R < 3

Recuperacin

Solo muestras no contaminadas: Numero de repeticiones: por lo menos 10 Nmero de analistas: uno Nivel de fortificacin: por lo menos uno (medio) Clculo: Resultado: Entre el 90% y el 110% log

Sesgo

Solo muestras no contaminadas: Numero de repeticiones: por lo menos 10 Nmero de analistas: uno Nivel de fortificacin: por lo menos uno (medio) Clculo:

Resultado: La diferencia absoluta de lo recuperado y lo inoculado es < 0.3 log

Incertidumbre a) Especificar el mensurando. b) Identificar las fuentes de incertidumbre. c) Realizar clculos para la incertidumbre global

4. DESCRIPCIN DE LA ACTIVIDAD.

Etapa Actividad Responsable

4.1 Elaboracin del protocolo

Elabora el protocolo, cumpliendo con los requerimientos mnimos indicados en el anexo: Elaboracin del protocolo

Responsable de la validacin


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4.2 Seleccin de la Matriz

Selecciona la muestra con base en criterios definidos en el plan de validacin. Preferentemente muestras no contaminadas. Se asegura de contar con la cantidad de muestra necesaria para completar la evaluacin del desempeo. Verifica la presencia o ausencia del microorganismo(s) de inters en la muestra.

Responsable de la Validacin

4.3 Preparacin del inoculo

Realiza los clculos para determinar el tamao del inculo. Siguiendo un mtodo comnmente utilizado por el laboratorio realiza la estandarizacin del inoculo (puede consultarse el anexo 1 de la presente gua como referencia). Verifica en tres ocasiones distintas la preparacin del inoculo. Durante la evaluacin del desempeo verifica el inoculo empleado y lo identifica como valor de referencia. Nota: La verificacin del tamao de inoculo debe comprobarse durante la ejecucin del protocolo para cada suspensin de microorganismos empleada. Dicha verificacin deber realizarse por lo menos por sextuplicado.

Responsable de la validacin.

4.4 Preparacin de la muestras

Homogeniza la muestra perfectamente. Nota: se recomienda que las muestras perecederas sean analizadas de inmediato o en su defecto mantenerse en refrigeracin.

Fortificacin de la muestra. En condiciones aspticas pesa la muestra conforme al mtodo de prueba he inocula la muestra con el microorganismo de prueba. Alternativamente puede inocularse la muestra antes de realizar los sub muestreos, procurando homogenizar perfectamente. La fortificacin de la muestra debe realizarse conforme se describe para cada tipo de mtodo.


4.5 Ejecucin del protocolo.

Siguiendo el mtodo de prueba analiza la muestra el numero de veces que corresponde, segn los criterios de aceptacin Ejemplo 1: Mtodos cualitativos Se desea validar el mtodo cualitativo para aislamiento de un patgeno; para la verificacin del lmite de deteccin deber prepararse un inculo de menos de 10 UFC, preferente mente 5 UFC del microorganismo control positivo y para verificacin de los falsos positivos las muestras debern inocularse con mas 100 UFC del microorganismos control negativo



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Al realizar las pruebas para la preparacin del inoculo control positivo se determina que en la dilucin 10-7, se obtienen 820 UFC/mL. El da de la prueba se deber preparar una suspensin de microorganismos de la misma forma que en las pruebas anteriores y realizar diluciones decimales hasta 10-9, en teora en esta dilucin deberan encontrase aproximadamente 8 UFC, a partir de esta dilucin, transferir 0.5 ml a cada una de las muestras (10), inmediatamente despus de cada inoculo colocar 0.5 ml de la suspensin del microorganismo en una placa de Petri para realizar la verificacin del inoculo. Para la verificacin del inculo, incubar en condiciones adecuadas y hacer los clculos para determinar la cantidad de microorganismos inoculados a la muestra. La prueba es vlida si en promedio se encuentran menos de 10 UFC, ya que los inculos idealmente deben ser menores de 5 UFC, podran encontrarse cuentas


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4.6 Clculos. Mtodos cuantitativos Repetibiliad Calcular las unidades formadoras de colonias en cada repeticin y calcular el log.

Repeticin Placa 1 Placa 2 Promedio Cuenta log

Repeticin 1 70 90 80 8000 3.90

Repeticin 2 71 91 81 8100 3.91

Repeticin 3 80 80 80 8000 3.90

Repeticin 4 76 82 79 7900 3.90

Repeticin 5 78 82 80 8000 3.90

Repeticin 6 77 88 83 8300 3.92

Repeticin 7 56 80 68 6800 3.83

Repeticin 8 87 80 84 8400 3.92

Repeticin 9 77 86 82 8200 3.91

Calcular la desviacin estndar relativa, como el cociente de la desviacin estndar sobre la media. Calcular el valor de r

Desviacin estndar 0.03 Promedio 3.90 DSR 0.007 n 10 r 1%

Reproducibilidad

Utilizando el mtodo de referencia, al menos dos analistas en momentos diferentes procedern como se describi antes, considerando la aplicacin de la siguiente formula.

Recuperacin Con los datos obtenidos en repetibilidad en muestras fortificadas calcular la cantidad de UFC, en cada repeticin y calcular el logaritmo de cada cuenta, promediar los logaritmos. Calcular el logaritmo del inculo verificado.

Finalmente calcular el % de recuperacin

% Recuperacin= Media de la cuenta de logaritmo de las cuentas x100

Logaritmo de las UFC inoculadas Sesgo A partir de los clculos de recuperacin, calcular la diferencia de la media de los logaritmos de las cuentas menos el logaritmo del inculo utilizado.

| | Donde:

Ve= valor esperado

Vo= valor obtenido

RSD =s

x


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4.7 Definicin de la incertidumbre

Para mtodos cualitativos menciona las fuentes de incertidumbre Distribucin de los microorganismos en la muestra; Efecto de la matriz; Personal operativo; Mediciones (pesada o medicin de la muestra); Diluciones y volmenes; Homogeneizacin; Calidad de los medios; Tiempo hasta la inoculacin; Temperatura de incubacin;

Para mtodos cuantitativos mencionar las fuentes de incertidumbre, adems considerar que: La Naturaleza de los Mtodos Microbiolgicos de Recuento Dado el carcter de los ensayos microbiolgicos, mtodos empricos, donde es difcil construir un modelo apropiado que permita cuantificar las contribuciones de cada paso a la incertidumbre del proceso de medida y, la poca disponibilidad de materiales de referencia certificados que representen al microorganismo en su hbitat natural, el consenso actual sobre la estimacin de la incertidumbre en los ensayos microbiolgicos cuantitativos es que la precisin es el componente ms importante y el nico que puede determinarse de una manera prctica, mediante la utilizacin de datos experimentales. Un Mtodo emprico: Es un mtodo que determina un valor al que slo se puede llegar en trminos del mtodo en cuestin y que, por definicin, sirve como el nico mtodo para establecer el valor aceptado del parmetro medido (AOAC). Un mtodo de ensayo diferente (a menudo para el mismo analito) puede dar un resultado diferente, dado que el mensurando se define en los trminos del mtodo. Por esta razn, en los mtodos microbiolgicos cuantitativos, el sesgo o bia n c ntribuy a la incertidumbre del mtodo, dado que los resultados dependen de las condiciones definidas en el mtodo, tales como, la temperatura y tiempo de incubacin, los medios de cultivo, etc. A partir de muestras naturalmente contaminadas o inoculadas. Dos analistas, analizan simultneamente 10 muestras, y se realiza el siguiente calculo.

Responsable de la validacin.


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Donde yij :son los datos transformados a logaritmo, en log10 (ufc / g) o log10 (ufc / ml); i :es el ndice de la muestra, i = 1 a n (n > 10); j :es el ndice de la condicin de reproducibilidad, j = A o B.

La incertidumbre expandida U tal como se define por GUM, se deriva de la incertidumbre estndar combinada uc(y), con un factor de cobertura k elegido en esta Especificacin Tcnica como un valor de 2 (como para corresponder aproximadamente a un nivel de confianza del 95%):

U = 2uc(y) = 2 sR

4.8 Elaboracin del informe

Elabora informe conforme a lo descrito en el anexo: Elaboracin del Informe



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5 Diagrama de flujo Etapa Responsable de la valiacin

4.1 Elaboracin del protocolo

. Inicio .

Elabora el protocolo. .

4.2 Seleccin de la Matriz

Selecciona la muestra

Se asegura de contar con la cantidad

de muestra necesaria

Verifica la presencia o ausencia del microorganismo(s) de inters en la muestra

4.3 Preparacin del inoculo

Realiza los clculos para el inoculo

Estandariza inoculo

Verifica el inoculo por triplicado .

Registra como valor de referencia.

4.4 Preparacin de la muestras

Homogeniza la muestra Perfectamente .

Fortifica la Muestra

4.5 Ejecucin del protocolo.

Analizar la muestra .

Repetir segn criterios

4.6 Clculos.

Realiza los clculos para:

Mtodos Cuantitativos: Repetibilidad, Reproducibilidad, Recuperacin y Sesgo

Verifica el inoculo por triplicado .

Registra como valor de referencia.

4.7 Definicin de la incertidumbre

Mtodos cualitativos: Menciona fuentes de incertidumbre.

Mtodos Cualitativos Determina Incertidumbre expandida:

4.8 Elaboracin del informe

Elabora informe .

FIN


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6 Glosario.

Analito: Componente medido por el mtodo de anlisis, puede ser un microorganismo o un grupo microbiano. Microorganismo de prueba. Blanco: Es el alimento usado como matriz, en el que no est el analito de inters.

Coeficiente de Variacin (CV): Es la relacin entre la desviacin estndar y la media multiplicada por 100.

Exactitud relativa recuperacin: Es la aproximacin entre un resultado de la prueba y el valor de referencia aceptado. Para el propsito de esta gua, es la cantidad de microorganismo recuperado entre la cantidad de microorganismo inoculado o nivel de fortificacin. Fase estacionaria.- Es el intervalo de tiempo en donde la curva de crecimiento microbiana se hace constante y antecede a la muerte microbiana. En esta etapa se puede conocer con cierta seguridad y durante un lapso corto de tiempo la concentracin microbiana. Fortificacin de la muestra. Inoculacin de una cantidad conocida del o los microorganismos de prueba. Incertidumbre de medida: Parmetro, asociado al resultado de una medicin, que caracteriza la dispersin de los valores que podran ser razonablemente atribuidos al mesurando. Intervalo de trabajo: Intervalo comprendido entre las concentraciones superior e inferior, en el cual el analito puede cuantificarse con un nivel satisfactorio de repetibilidad y recuperacin. Lmite de deteccin: Es el numero ms pequeo de microorganismos en una muestra que puede ser detectado bajo las condiciones de anlisis. El limite microbiolgico de una prueba determina la presencia o ausencia de microorganismos por ejemplo ausencia de Salmonella spp. en 25 g de muestra. Matriz: Es la muestra de alimento en la que potencialmente se encuentra el analito.

Mtodo Normalizado: Proceso de medicin robusto donde pequeas variaciones en el procedimiento no deben producir de forma imprevista grandes variaciones en los resultados. Mtodos internacionalmente aceptados y validados.

CV=s

x100


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Nivel de fortificacin o tamao del inculo: Es la cantidad conocida de microorganismos inoculados a una muestra. Protocolo para la evaluacin del desempeo: Documento que describe los pasos a seguir durante la evaluacin del desempeo de un mtodo analtico microbiolgico, cuyo fundamento se encuentra descrito en el presente documento. Resultado Aberrante: Corresponde a cualquier valor extremo que ocurra durante la ejecucin de la prueba. En menos de 1% de las pruebas esos resultados pueden ocurrir aleatoriamente en situaciones normales. Evaluacin del desempeo: Es el proceso que realiza un laboratorio para demostrar que un mtodo normalizado produce consistentemente resultados confiables en las condiciones particulares del laboratorio. Confirmacin mediante la aportacin de evidencia objetiva de que un mtodo analtico validado internacionalmente cumple con su propsito en las condiciones particulares del laboratorio donde se realiza el anlisis. Repetibilidad: Es el grado de concordancia entre los resultados analticos individuales obtenidos por la aplicacin de un mismo procedimiento analtico, a diferentes porciones de la misma matriz, en las mismas condiciones de anlisis (analista, equipamientos, laboratorio) en intervalos cortos de tiempo. Reproducibilidad: Es el grado de concordancia entre los resultados analticos individuales obtenidos por la aplicacin de un mismo procedimiento analtico, a diferentes porciones de la misma matriz, realizadas bajo distintas condiciones de medicin (personal) y en diferentes tiempos (o a intervalos de tiempos ms largos).

7 Documentos de referencia.

Documento Cdigo

Criterios de aplicacin de la norma 17025 de la EMA No aplica

USP 32, Validation of Alternative Microbiological Methods. No aplica

USP 32, Validation of Compendial Procedures No aplica

USP 32, Validation of Microbiological Recovery from Pharmacopeical Articles

No aplica

Dulce Toccheto S. Curso-terico-prctico Validacin de Mtodos Microbiolgicos bajo un Sistema de Aseguramiento de la Calidad. Santa Cruz de la Sierra Bolivia. Proyecto TCC/ Bolivia-Mxico. 2007.

No aplica

European Cooperation for Accreditation EA-04/10 Accreditation for Microbiological laboratories. 2002.

No aplica


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Documento Cdigo

G.A. Leotta, I. Chinen. Validacin de una tcnica de PCR mltiple para la deteccin de Escherichia coli productor de toxina shiga. Revista Argentina de Microbiologa. Vol.37, No. 1 2005.

No aplica

Gua de Validacin de Mtodos Analticos. Colegio Nacional de Qumicos Farmacuticos Bilogos de Mxico, A.C. Edicin 2002.

No aplica

ISO/IEC. 2003. International Standard ISO 16140:2003 (E). Microbiology of food and animal feeding stuffs Protocol for the validation of alternative methods. First Edition.

No aplica

ISO/TR 13843:2000 - Water Quality Guidance on Validation of Microbiological methods. First Edition.

No aplica

ISO 17994:2004 Water QualityCriteria for Establishing Equivalence between Microbiological methods. First Edition.

No aplica

The Fitness for Purpose of Analytical Methods. A Laboratory Guide to Method Validation and Related Topics. Eurachem Guide. 1998. Disponible en http://www.eurachem.org/guides/pdf/valid.pdf (febrero 2011)

No aplica

Philip Feldsine, Carlos Abeyta, Wallace H. Andrews. AOAC International Methods Committee Guidelines for Validation of Qualitative and Quantitative Food Microbiological Official Methods of Analysis. 2002. Disponible en http://www.aoac.org/vmeth/omamanual/Microbiology-Guidelines-Appendix-X.pdf (febrero 2011)

No aplica

8 Registros:

Registro Tiempo de

conservacin Responsable de

conservarlo Cdigo de registro e identificacin nica

Protocolo Permanente Cada Laboratorio CCAYAC-PV-Nmero

asignado por GGC

Informes Permanente Cada Laboratorio CCAYAC-IV-Nmero asignado por GGC

Generados por la evaluacin del desempeo.

Permanente Cada Laboratorio No aplica

9 Anexos

9.1 Elaboracin del protocolo 9.2 Elaboracin del informe 9.3 Anexo Informativo: Preparacin y ajuste del inculo 9.4 Gua Informativa para la fortificacin de una matriz.


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9.1 Elaboracin del protocolo Estructura para el protocolo para la evaluacin del desempeo de mtodos de anlisis microbiolgicos:

Ttulo Protocolo para la evaluacin del desempeo del mtodo: el nombre y clave del mtodo que se pretende evaluar.

1.Objetivo Considerar los parmetros de desempeo a evaluar y el analito a determinar

2. Campo de aplicacin Indicar el tipo de producto (s) para los cuales aplica la validacin

3. Mtodo de ensayo Elaborar un diagrama de flujo del mtodo en cuestin

4. Equipo Mencionar el equipo a utilizar y las condiciones que requiere (verificacin y/o calibracin, si aplica)

5. Materiales Indicar los materiales a utilizar

6. Reactivos y Medios de Cultivo

a) Indicar el nombre de los reactivos a utilizar y su grado. b) Indicar los medios de cultivo a utilizar c) Indicar las cepas que se usaran y la forma de preparar los inculos

7. Muestras Indicar las caractersticas, forma de almacenamiento y cantidades de muestra estimadas para llevar a cabo la validacin. Detallar la preparacin de los blancos de muestra o muestras adicionadas.

8. Desarrollo experimental

Detallar las instrucciones para cada uno de los parmetros de desempeo a ensayar.

9. Resultados Formato para el registro de resultados

10. Anlisis estadstico Establecer para cada parmetro de desempeo la herramienta estadstica a utilizar para su evaluacin.

11. Criterios de aceptacin

Establecer los criterios de aceptacin que deben cumplirse con su respectiva referencia bibliogrfica.

Nota: El protocolo debe incluir firmas de quien elabor, revis y aprob.


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9.2 Elaboracin del Informe Estructura del informe de evaluacin del desempeo:

Ttulo Informe de resultados de la evaluacin del desempeo del mtodo: el nombre y clave del mtodo que se evalo.

1.Objetivo Considerar los parmetros de desempeo evaluados y el analito determinado.

2. Campo de aplicacin Indicar el tipo de producto (s) para los cuales aplic la validacin

4. Equipo Listado de los equipos utilizados y su estado de calibracin/verificacin/mantenimiento

5. Materiales Listado de los materiales utilizados.

6. Reactivos y Medios de cultivo

Listar los reactivos y medios utilizados y su estado de calidad.

7. Muestras

Indicar las caractersticas, forma de almacenamiento, marca, presentacin, caducidad y cantidades de muestra utilizadas para llevar a cabo la validacin. Detallar la preparacin de los blancos de muestra o muestras adicionadas utilizadas.

8. Mtodo de ensayo Incluir el diagrama de flujo del mtodo.

9. Desarrollo experimental

Detallar como se llevaron a cabo los ensayos de cada uno de los parmetros de desempeo.

10. Resultados Presentacin de resultados en forma de tablas, sealando fechas de inicio y trmino, analistas, laboratorio, microorganismo(s) de prueba, matriz, unidades y clave de bitcora o registro primario

11. Anlisis de resultados Presentar en forma de tabla los criterios de aceptacin considerados y los resultados obtenidos y hacer las observaciones correspondientes.

12. Conclusin Efectuar una conclusin final en donde se seale que el mtodo se ajusta al uso propuesto (Numeral 5.4.3 17025)

13. Bibliografa Referencias utilizadas.

14. Anexos

Los que aplique:

Registros primarios,

Bases de datos utilizadas

Certificados de equipos,

Medios de cultivo

Cepas

Formatos de verificacin,

Grficos de control, etc.

Nota: El informe de resultados debe incluir firmas de quien elabor, revis y aprob.


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9.3 Anexo Informativo: Preparacin y ajuste del inculo. Este procedimiento es general y adecuado para la mayora de los microorganismos de prueba, pueden aplicarse variaciones en este, siempre que se obtengan inculos constantes. Inocular una colonia tomada a partir de un cultivo puro del microorganismo de prueba en 9ml de caldo BHI o cualquier otro caldo de enriquecimiento, incubar a 35C +/- 2C, por 22h a 24h, (este tiempo puede ser diferente dependiendo de la experiencia en el laboratorio y el tipo de microorganismo del que se trate) del cultivo transferir un mililitro a 90ml de BHI e incubar a 35C +/- 2C, por 22h a 24h, a partir del cultivo hacer diluciones decimales, de cada una de ellas transferir por duplicado un mililitro a cajas de Petri y adicionar agar cuenta estndar, incubar a 35C +/- 2C, por 18h a 24h, realizar el conteo en cada dilucin para conocer la concentracin de microorganismos. Registrar los resultados indicando la concentracin de microorganismos en cada dilucin. Estos resultados servirn de referencia para la estimacin de la dilucin adecuada a utilizar durante la fortificacin de las muestras en la evaluacin del desempeo del mtodo de prueba. Antes de cada prueba deber repetirse la preparacin del inculo de forma idntica que en la determinacin de concentracin de la cuenta bacteriana en la fase estacionaria y cada inculo deber ser verificado por vaciado en placa utilizado al menos dos cajas.

Nota 1: Con la prueba previa de fase estacionaria se fija el tiempo de incubacin, volumen necesario que lleve la concentracin microbiana, para fortificar cada una de las alcuotas de acuerdo al protocolo de evaluacin de desempeo del mtodo en particular. Durante su manipulacin se recomienda sumergir el recipiente que contiene la FE en agua fra. Nota 2: Cuando la matriz sea slida, fortificar las alcuotas. Si es lquida se puede fortificar la matriz completa o las alcuotas.


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9.4 Gua Informativa para la fortificacin de una matriz La fortificacin de muestras se hace por medio de la adicin de diluciones conocidas del microorganismo a prueba, a partir de un inoculo conocido, en la matriz en cuestin, como sigue: Estimacin de la dilucin de trabajo A partir de un cultivo del microorganismo de inters en BHI (o cualquier otro medio de enriquecimiento). Hacer diluciones decimales hasta 10-9 en agua peptonada amortiguada al 0.1%; o el diluyente que utilice el laboratorio. Hacer recuento por triplicado de las diluciones, 10-6, 10-7, 10-8 y 10-9 en agar soya tripticaseina o Agar cuenta estndar. Realizar las lecturas y clculos de los nmeros de clulas en cada una de las diluciones para establecer la dilucin que ser usada en la fortificacin de la matriz y registrar los resultados de los recuentos y clculo. Preparacin del Inculo Preparar un nuevo cultivo en caldo BHI, preparar las diluciones necesarias con base en los resultados obtenidos en la estimacin de la dilucin de trabajo, verificar la concentracin del inculo por sextuplicado.


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CONTROL DE CAMBIOS DE DOCUMENTOS DEL SISTEMA DE

GESTIN DE LA CALIDAD

Revisin No: 1

Fecha de emisin: 2012-10-15

GUIA PARA LA EVALUACIN DEL DESEMPEO DE MTODOS DE PRUEBA MICROBIOLGICOS PARA EL

ANALISIS DE ALIMENTOS

CLAVE:

CCAYAC-P-062

CCAYAC-F-001/3

FECHA: 2011-03-28 REVISIN: 0 CLAVE: CCAYAC-P-062

PGINA NUMERAL O PRRAFO

CAMBIOS:

Todo el documento

Titulo Se especifica el alcance a alimentos

De 1 a 17 Todo el

documento

Se organizo toda la informacin, para cumplimiento del nuevo formato de procedimientos. Se modifican los criterios de aceptacin: Se reduce el nmero de repeticiones para mtodos cualitativos y se incluye el uso de cepas control positivo y negativo. Se eliminan los anexos informativos de formatos y guas para hojas de calculo. Se incluyen los clculos para incertidumbre de mtodos cuantitativos.

1/17 2 Se especifica el alcance a alimentos y agua. Cambio de redaccin.


DOCU

MENT

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ONSU

LTA

CCAYAC-P-062-1 (1)

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