Autor: Kenneth WalkerUniversidad de ChileFacultad de MedicinaEscuela de Tecnología MédicaCurso de Microscopía Electrónica

Caso clínico

Antecedentes entregados

En la mayoría de los pacientes que padecen úlcera péptica, se ha descrito la infección del antro gástrico por parte del microorganismo Helicobacter pylori.

Una vez adherido este microorganismo a la mucosa gástrica, es capaz de reducir la capacidad ácido-neutralizante del mucus.

En el último tiempo se ha descrito que ciertos probióticos naturales no inmunogénicos, pueden competir con el Helicobacter pylori por los nichos de la mucosa gástrica, siendo capaces de erradicar la infección reduciendo la ocurrencia de úlceras pépticas.

Kéfir

Es un producto lácteo fermentado probiótico originado en la región del Cáucaso. También reciben este nombre los gránulos utilizados para su producción.

Los principales microorganismos en el kéfir son la bacteria Lactobacillus acidophilus y la levadura Saccharomyces kefir, aunque varían según las regiones y métodos de cultivo.

Problema

Investigadores del Instituto de Biotecnología de la Universidad de Madagascar desean saber si el microorganismo Helicobacter pylori y el probiótico “Kéfir” coexisten en un mismo nicho o si se excluyen mutuamente.

Metodología

Los investigadores proponen un estudio comparativo entre biopsias de pacientes que consumen diariamente Kéfir y pacientes que no lo consumen.

Resultados esperados

Que la colonización de la región antral gástrica por parte de la microflora que contiene el probiótico Kéfir desplace y erradique a la Helicobacter pylori.

Se nos solicita la realización de un protocolo para manejo y visualización

de la muestra.

Generalidades

H. pylori es una bacteria Gram negativa de forma espiralada, de alrededor de 3um de largo y con un diámetro aproximado de 0,5um. Tiene de 4 a 6 flagelos.

Es microaerófila. Usa hidrógeno y metanogénesis como fuente de energía. Es oxidasa y catalasa positiva.

Surgen las siguientes interrogantes…

¿Ambos grupos de pacientes están infectados por H. pylori? ¿Qué cepa de H. pylori?

Respecto al grupo consumidor de Kéfir. ¿Cuánto tiempo llevan consumiendo el probiótico?

¿Se espera que Kéfir desplace todas las cepas de Helicobacter?

Asumiendo que…

Ambos grupos de pacientes están infectados con H. pylori. Los grupos se crearon de tal manera que existe la misma posibilidad teórica de que la H. pylori les pueda producir una úlcera.

Los pacientes del grupo consumidor de Kéfir llevan el tratamiento con el probiótico durante 1 a 6 meses .

Se espera que Kéfir desplace indistintamente a las cepas de H. pylori que estén presentes en el antro gástrico de los pacientes consumidores del probiótico.

Confirmación de la presencia de H. pylori

Para crear los grupos se debe:

Tomar muestra por endoscopía dirigida a la región antral.

Fijación en formalina tamponada al 4% p/v, 0.1M.

Deshidratación en etanoles de concentración creciente.

Impregnación e inclusión en Paraplast.

Tinción de H/E.

H/E

Luego, confirmar presencia de H. pylori por IHQ

Desparafinación en xilol

Rehidratación en etanoles de concentración decreciente

Recuperación antigénica

Bloqueo peroxidasa endógena con H2O2 3% en PBS.

Bloqueo con suero fetal bovino durante 15min a Tº ambiente.

Incubación Ac. 1º anti-H. pylori

Incubación Ac. 2º biotinilado

Detección con Streptavidina-DAB

Contratinción con hematoxilina

Controles negativos: Cortes tratados del mismo modo sin Ac. Secundario.

IHQ

Una vez creados los grupos, se sugiere al cabo de 1 mes…

Muestras endoscópicas

Parafina

Antro Gástric

o

Resina Lowicryl

Desecado

H/E e IHQ ImmunoGold Metalizado

M.O MET MEB

Usos de cada muestra

IHQ y H/E en parafina • Detección de H. pylori en ambos grupos de individuos. • Comparar resultados con los de la IHQ inicial. • Conocer efectos del Kéfir.

MET ImmunoGold • Analizar la biopelícula formada por los microorganismos del Kéfir y

su relación con la H. pylori para los casos en que hubiese presencia de la bacteria. Marcar H. pylori para distinguirla.

MEB con metalizado • Complementar la información obtenida por MET para comprender

de mejor forma la disposición de los microorganismos en la superficie gástrica y ayudar en la obtención de conclusiones.

Muestras para MO

IHQ

Muestras para MET

Procesamiento para MET

Usar Paraformaldehido al 4% p/v + Glutaraldehído 1% + 0.5 mM clorhidrato de calcio por 3hrs a T° ambiente o 24hrs a 4°C.

Lavado en frío con una solución de sucrosa al 3.5% en buffer fosfato salino 0.1M por 2hrs.

Lavado en una solución de clorhidrato de amonio 50 mM en buffer sucrosa-fosfato + clorhidrato de calcio 0.5mM a pH 7.4 por 1hr a 0°C.

Lavar en frío con buffer maleato 0,1M con sucrosa al 3.5%. Utilizado para la remoción de iones fosfato pH 6.5.

Luego, deshidratar en acetonas ascendentes.

La infiltración y polimerización a baja T°.

Lowicryl: Resina de baja viscosidad a baja T°

La polimerización con radiación UV es independiente de la T° lo que le permite polimerizar a la T° de infiltración en un tiempo mayor o igual a 24hrs.

ImmunoGold

Bloqueo con suero de cabra o fetal bovino al 5% por 10 min, diluido en TBS

Ac primario contra H. Pylori en TBS + NGS (2.5% suero de cabra, 2 mM HEPES, pH 7.2) al 1%

Ac secundario contra FC conjugado con Au en TBS

Pasar por GA al 2% por 5 minutos para estabilizar los complejos Ag-Ac.

Acs. Hechos en especies distintas para evitar reacciones cruzadas.

Nunca olvidar los tejidos controles a lo largo del procedimiento que son necesarios para validar la técnica y el estudio mismo.

Contraste

Acetato de uranilo al 4% por 10 min. y citrato de plomo de

Reynolds 5 min.

Tetróxido de osmio 2% por 15min. Y citrato de plomo de Reynolds 3min

Montaje

Los cortes siempre son sensibles al haz de electrones. Para mejorar su resistencia, cubrirlos con FORMVAR en una etapa final. Esto permitirá el mejor acceso de los anticuerpos por ambos lados del corte.

MET

Muestras para MEB

Procesamiento para MEB

Fijación Glutaraldehído 2,5% en PBS 1-2hrs a tº ambiente.

3 lavados en PBS por 10min cada uno a tº ambiente.

Post fijación en OsO4 en PBS1-2 hrs a tº ambiente.

3 lavados en PBS 3 por 10min cada uno a tº ambiente.

Deshidratación en acetonas de concentración ascendente.

Secado por Punto Crítico

Montaje del espécimen en platina de grafito.

Metalizado con Oro/Paladio.

http://jmm.sgmjournals.org/

Ultrastructure of spiral and types A and B coccoid forms of H. pylori. (a) SEM of spiral forms on day 1. Flagella are seen on one side of the cells (arrows). A spherical organism is visible (asterisk). Bar, 2 μm. Inset: TEM of a spiral form. A flagellum (arrow) and an intracytoplasmic granule (arrowhead) are visible. Bar, 0.5 μm. (b) SEM of type A coccoid forms on day 3 in CLM. Cells are spherical with an irregular surface and possess few flagella. They have a tendency to adhere to each other. Bar, 2 μm. Inset: TEM of type A coccoid form. The surface is sunken (arrowhead). Membrane and intracytoplasmic structures are not clearly visible. Bar, 0.5 μm. (c) SEM of type B coccoid forms on day 3 in 300 mM-LM. The smooth surface is tightly encircled by flagella (arrowheads). Bar, 2 μm. Inset: TEM of type B coccoid form. The membrane structure is well preserved and a flagellum is also visible (arrowhead). Bar, 0.5 μm.

Methods Cell Biol. 2008;88:367-87. doi: 10.1016/S0091-679X(08)00419-6.

A protocol for isolation and visualization of yeast nuclei by scanning electron microscopy.

Murray S, Kiseleva E.

Source

TEM Service Facility, Paterson Institute for Cancer Research, University of Manchester, Manchester M20 4BX, United Kingdom.

Abstract

This article describes a protocol that details methods for the isolation of yeast nuclei from budding yeast (Saccharomyces cerevisiae) and fissionyeast (Schizosaccharomyces pombe), immunogold labelling of proteins, and visualization by Field Emission Scanning Electron Microscopy (FESEM). This involves the removal of the yeast cell wall and isolation of the nucleus from within, followed by subsequent processing for high resolution microscopy. The nuclear isolation step is performed by enzymatic treatment of yeast cells to rupture the cell wall and generate spheroplasts (cells that have partially lost their cell wall and their characteristic shape), followed by isolation of nuclei by centrifugation. This protocolhas been optimized for the visualization of the yeast nuclear envelope (NE), nuclear pore complexes (NPCs), and associated cytoskeletal structures. Samples, once processed for FESEM, can be stored under vacuum for weeks, allowing considerable time for image acquisition.