CARMEN LUCÍA CONTRERAS HURTADO LYDA MARCELA …

DETERMINACIÓN FENOTÍPICA DE SUBPOBLACIONES DE CÉLULAS MADRE DERIVADAS DE

SANGRE DE CORDÓN UMBILICAL

CARMEN LUCÍA CONTRERAS HURTADO

LYDA MARCELA CUSPOCA CHAPARRO

TRABAJO DE GRADO

Presentado como requisito parcialPara optar al título de

BACTERIOLOGA

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANAFACULTAD DE CIENCIAS

CARRERA DE BACTERIOLOGÍABogotá, D. C.

2004

http://www.llion.net






NOTA DE ADVERTENCIA

Artículo 23 de la Resolución N° 13 de Julio de 1946

“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos detesis. Solo velará por que no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica y por que las tesisno contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar laverdad y la justicia”.

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APROBADO

3











APROBADO

4











APROBADO

5











APROBADO

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“A nuestros padres y hermanos quienes con su

apoyo y ejemplo fueron motivo de inspiración para seguir

adelante enseñándonos el valor del esfuerzo y la

responsabilidad para alcanzar nuestras metas”

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AGRADECIMIENTOS

La realización de este trabajo fue posible gracias a la Vicerrectoría Académica por el apoyo financiero, al

Departamento de Gineco-Obstetricia del Hospital Universitario San Ignacio por su colaboración en la toma

de las muestras, al Instituto de Genética Humana de la Pontificia Universidad Javeriana, al personal del

Laboratorio de Inmunología y en especial a la Dra. Adriana Cuellar y a Natalia Bolaños por su asesoría en

el área de Citometría, a la Dra. Marcela Mercado por su colaboración en el análisis estadístico y a la Dra.

Viviana Marcela Rodríguez Pardo por su dedicación y apoyo incondicional en la realización de este trabajo.

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LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1: Plasticidad de las Células Madre Adultas..................................10

FIGURA 2: Modelos de diferenciación de las Células Madre Adultas.........12

FIGURA 3: Fecundación..............................................................................14

FIGURA 4: Segmentación............................................................................15

FIGURA 5: Blastocisto..................................................................................16

FIGURA 6: Gástrula.....................................................................................16

FIGURA 7: Capas Embrionarias..................................................................18

FIGURA 8: Estructura Química del SSEA-4.................................................21

FIGURA 9: Hematopoyesis..........................................................................26

FIGURA 10: Factores de Transcripción en la Hematopoyesis.......................31

FIGURA 11: Identificación de Moléculas de Superficie utilizando Anticuerpos

Monoclonales marcados con Fluorocromos.............................39

FIGURA 12: Recolección de muestras de Sangre de Cordón Umbilical........49

FIGURA 13: Inmunofenotipificación de Células Madre Hematopoyéticas y

Células Madre Embrionarias derivadas de Sangre de Cordón

Umbilical....................................................................................53

FIGURA 14: Población Analizada (Región 1) para Células Madre derivadas

de Sangre de Cordón Umbilical................................................55

FIGURA 15: Población Analizada (Región 2) para Células Madre

Hematopoyéticas derivadas de Sangre de Cordón Umbilical...56

FIGURA 16: Co-expresión de los Antígenos CD38 y HLA-DR en Células

Madre Hematopoyéticas CD34+ derivadas de Sangre de Cordón

Umbilical.......................................................................57

FIGURA 17: Población Analizada (Región 3) para Células Madre

Embrionarias derivadas de Sangre de Cordón Umbilical.........58

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FIGURA 18: Expresión del Antígeno CD13 en Células Madre Embrionarias

SSEA-4+ CD34- derivadas de Sangre de Cordón Umbilical....59

FIGURA 19: Subpoblaciones de Células Madre Hematopoyéticas de Sangre

de Cordón Umbilical..................................................................60

FIGURA 20: Rango de Subpoblaciones de Células Madre Hematopoyéticas

derivadas de Sangre de Cordón Umbilical................................61

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LISTA DE ABREVIATURAS

b-HLH Helix Loop Helix básico

Bmp4 Proteína Morfogenética Ósea 4

CME Célula Madre Embrionaria

CHM Complejo Mayor de Histocompatibilidad

CMH Célula Madre Hematopoyética

CMN Células Mononucleares

FACS Selección de Células por Fluorescencia

G-CSF Factor estimulador de Colonias Granulocíticas

GM-CSF Factor estimulador de colonias Granulo- Monocíticas

IL Interleuquina

LIF Factor Inhibidor de Leucemia

LT-CMH Célula Madre Hematopoyética a Largo Plazo

MAC Moléculas de Adhesión Celular

MAPCs Células Madre Adultas Pluripotenciales

MCI Masa Celular Interna

MIP-1α Proteína Inhibidora de Macrófagos-1α

MO Médula Ósea

PDGF Factor de Crecimiento Derivado de Plaquetas

PECAM Molécula de Adhesión Celular a Plaquetas/Endotelio

POU Factor de Transcripción Pit-1/GHF-1,Oct-2, Unc-86

SCF Factor Stem Cell

SCU Sangre de Cordón Umbilical

SDF-1 Factor derivado del Estroma-1

SP Sangre Periférica

SSEA Antígeno Específico del Estadío Embrionario

ST-CMH Célula Madre Hematopoyética a Corto Plazo

TGF-β Factor Transformador de Crecimiento β

UFB-E Unidad Formadora de Brotes Eritroides

UFC Unidades Formadoras de Colonias

UFC-E Unidades Formadoras de Colonias Eritroides

UFC-GEMM Unidad Formadora de Colonias Granulocítica-Eritroide-

Monocítica-Megacariocítica

VLA Antígeno Muy Tardío

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TABLA DE CONTENIDOS

RESUMEN

ABSTRACT

1. Introducción...........................................................................................1

2. Marco Teórico y Revisión de Literatura.................................................3

2.1 Generalidades de las Células Madre.....................................................3

2.2 Células Madre Embrionarias: Microambiente e Inmunofenotipo.........14

2.3 Células Madre Hematopoyéticas: Microambiente y Organización

Ontogénica...........................................................................................24

2.4 Células Madre Hematopoyéticas: Inmunofenotipo..............................34

2.5 Células Madre Hematopoyéticas derivadas de Sangre de Cordón

Umbilical..............................................................................................40

2.6 La Sangre de Cordón Umbilical como Alternativa Terapéutica de

Reemplazo Medular.............................................................................42

3. Justificación.........................................................................................45

4. Objetivos..............................................................................................46

4.1 Objetivo General..................................................................................46

4.2 Objetivos Específicos...........................................................................46

5. Materiales y Métodos...........................................................................47

5.1 Tipo de Diseño.....................................................................................47

5.1.1 Población.............................................................................................47

5.1.2 Tamaño de la Muestra.........................................................................48

5.1.3 Variables del Estudio...........................................................................48

5.2 Métodos...............................................................................................48

5.2.1 Recolección de la Muestra...................................................................49

5.2.2 Determinación Automatizada del Número de Leucocitos en Sangre de

Cordón Umbilical..................................................................................50

5.2.3 Corrección del Número de Leucocitos en Sangre de Cordón

Umbilical..............................................................................................50

5.2.4 Inmunofenotipificación de Células Madre Hematopoyéticas y Células

Madre Embrionarias derivadas de Sangre de Cordón Umbilical.........50

Aspectos Éticos...................................................................................54

6. Análisis de datos..................................................................................54

6.1 Análisis Gráfico de los Resultados obtenidos en el Citómetro FACS Calibur Becton

Dickinson Programa Cell Quest..............................54

6.2 Análisis Numérico de los Resultados obtenidos en el Citómetro FACS Calibur Becton

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Dickinson Programa Cell Quest..............................60

7. Resultados...........................................................................................61

8. Discusión.............................................................................................63

9. Conclusiones.......................................................................................66

10. Recomendaciones...............................................................................67

11. Referencias..........................................................................................68

12. Anexos.................................................................................................77

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RESUMEN

La Sangre de Cordón Umbilical Humana (SCU) es una de las fuentes alternativas a la Médula Ósea (MO) y

Sangre Periférica (SP) para la obtención de Células Madre hematopoyéticas (CMH). Estas células han

sido caracterizadas fenotípicamente encontrándose que la mayoría de éstas expresan el antígeno CD34 y

pueden o no expresar los antígenos CD38 y HLA-DR. Con este estudio se esperaba encontrar una

proporción de CMH mayor al 0.2%, determinar las Subpoblaciones de éstas células presentes en SCU y

buscar células con características embrionarias que co-expresaran los antígenos CD13 y SSEA-4. El

estudio se realizó con 80 mujeres en estado de gravidez normal a término que asistían al servicio de

Gineco-Obstetricia del Hospital Universitario San Ignacio previa firma de un consentimiento informado y

que cumplieran ciertos criterios de inclusión. Utilizando anticuerpos monoclonales para los antígenos

CD34, CD38 y HLA-DR se encontró que en la SCU existen cuatro Subpoblaciones de CMH con los

fenotipos CD34+ CD38- HLA-DR-, CD34+ CD38+ HLA-DR-, CD34+ CD38- HLA-DR+ y CD34+ CD38+

HLA-DR+ siendo esta última la de mayor proporción y que el total de células CD34+ era mayor al 0.2%.

Adicionalmente, se determinó la expresión de los antígenos CD13 y SSEA-4 por el mismo método,

encontrándose ocho muestras positivas para estos marcadores lo cual indica que posiblemente se

encuentre en SCU una población celular con características similares a las Células Madre Adultas

(MAPCs) descritas en MO. La caracterización fenotípica de las Células Madre presentes en la SCU es el

primer paso para conocer la distribución de las poblaciones de éstas células y utilizarlas en el futuro como

alternativa terapéutica de reemplazo medular.

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ABSTRACT

Human Umbilical Cord Blood (UCB) is one of alternative sources to Bone Marrow (BM) and Peripheral

Blood (PB) for the obtaining of Hematopoietic Stem Cells (HSC). These cells have been characterized

phenotypically being that most of these they express the CD34 antigen and they can or can not to express

the CD38 and HLA-DR antigens. With this study one hope to find a greater proportion of HSC 0.2%, to

determine the subpopulations of these present cells in UCB and to look cells with embryonic characteristics

that co- expressed the CD13 and SSEA-4 antigens. The study was made with 80 woman in state of normal

pregnancy that they attended in the Gineco-Obstetrics Service of Hospital Universitario San Ignacio

previous signature of an informed consent and who they fulfilled certain inclusion criteria. Using monoclonal

antibodies for antigens CD34, CD38 and HLA-DR it was found four subpopulations of HSC with the

phenotypes CD34+ CD38- HLA-DR -, CD34+ CD38+ HLA-DR -, CD34+ CD38- HLA-DR+ and CD34+

CD38+ HLA-DR+ being this last the one of greater proportion and than the total of cells CD34+ was greater

to the 0.2%. Additionally, the expresión of CD13 and SSEA-4 antigens was determine by the same method,

being eight positive samples for these markers which indicates that in UCB exist a cellular population with

characteristics similar to MAPCs described in BM. The phenotype characterization of the present Stem

Cells in the UCB is the first step to know the distribution of the populations of these cells and to use them in

the future like therapeutic alternative in medular replacement.

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1. INTRODUCCIÓN

Una célula madre es una célula que posee la capacidad de replicarse y diferenciarse dando lugar a

diversos tipos de células especializadas. Las células madre se pueden clasificar según su potencial de

diferenciación en células totipotenciales que son capaces de diferenciarse en tejido embrionario y

extraembrionario; las células pluripotenciales que dan origen a células procedentes de cualquiera de las

tres capas embrionarias, las células multipotenciales, que son capaces de diferenciarse a distintos tipos

celulares procedentes de la misma capa embrionaria y las células unipotenciales que dan origen a células

de un linaje específico (Weissman, I.L. y cols. 2001).

Existen diferentes tipos de células madre presentes en la médula ósea (MO). Una de las células madre

más importantes en la médula ósea son las células madre hematopoyéticas, las cuales poseen

características fenotípicas y procesos de diferenciación celular particulares, ya que además de su potencial

hematopoyético posiblemente pueden contribuir en la angiogénesis, miogénesis y hepatogénesis (Orlic, D.

y cols. 2001).

La mayoría de las HSC en humanos expresan el antígeno CD34, una proteína integral de membrana de

90-120 kD. Esta molécula funciona como regulador en la adhesión de las células madre hematopoyéticas

al estroma medular. La cantidad de células CD34+ en MO adulta ha sido estimada entre 1-3% del total de

las células nucleadas mientras que en la SCU es del 0.2-1% (Mayani, H. y cols. 1998).

Las subpoblaciones de las células CD34+ pueden identificarse gracias a la expresión de marcadores de

superficie diferentes al CD34 como los antígenos CD38 y HLA-DR y de acuerdo a ellos se puede

determinar en que estado de diferenciación se encuentra la célula. (Huang, S., Terstappen, L.. 1994). La

molécula CD38 es una glicoproteína de membrana que juega un papel importante en los procesos de

proliferación y activación celular (Funaro, A. y cols. 1998); por otro lado, la expresión del antígeno HLA-DR,

expresado en casi todas las células de los tejidos y responsable de la respuesta inmune del individuo a

antígenos extraños (Brown, J. y cols. 1993) es diferente para cada tejido, ya que las células madre

hematopoyéticas de la médula ósea que no expresan este marcador constituyen la población celular más

primitiva en estudios in vitro, contrario a lo que sucede con las células madre hematopoyéticas derivadas

de SCU. (Hao, Q.L. y cols. 1995).

Las células madre embrionarias (ES) se derivan de células totipotenciales provenientes de embriones de

diferentes especies (Thomson, J. y cols. 1998) y tienen la capacidad de mantenerse indefinidamente en

cultivos como células indiferenciadas y con la capacidad de formar diferentes tipos celulares. (Kaufman, D.

y cols. 2001). Recientemente se ha identificado en la médula ósea una población celular llamada MAPC

(Multipotent Adult Stem Cells) que han sido descritas como células pluripotenciales con una capacidad de

diferenciación similar a las células madre embrionarias y que expresan altos niveles de CD13

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(característico de progenitores mieloides) y SSEA-4 (característicos de células madre embrionarias) (

Jiang,Y. y cols. 2002).

Las exigencias en los estudios con células madre son cada vez mayores y contribuyen día a día a unificar

más los criterios científicos para ayudar al rápido avance en este campo y a desarrollar el potencial de las

células madre, contribuyendo a las expectativas por parte de pacientes con enfermedades consideradas

incurables.

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2. MARCO TEÓRICO Y REVISIÓN DE LITERATURA

GENERALIDADES DE LAS CÉLULAS MADRE

Una célula madre es una célula que tiene la capacidad de dividirse (autoreplicarse) por períodos

indefinidos durante toda la vida de un organismo y que bajo las condiciones apropiadas o señales

correctas puede dar origen (diferenciarse) a los diferentes tipos de células que conforman un organismo,

estas células madre tienen el potencial de desarrollarse y convertirse en células maduras que tienen

características y funciones especializadas como por ejemplo las células cardíacas, células de la piel o

células nerviosas (Donovan, P., Gearhart, J. 2001).

Muchos de los términos usados para definir una célula madre dependen del comportamiento de estas en

condiciones in vivo e in vitro (Weissman, I.L. y cols. 2001). De acuerdo al tipo de tejido que originan,

existen cuatro tipos de células madre: totipotentes, pluripotentes, multipotentes y unipotentes. El término

Totipotencial, del latín totus que significa completo, hace referencia al potencial que tienen las células

madre de generar todas las células y tejidos que forman un embrión (tejido embrionario y

extraembrionario) y que contribuyen a su desarrollo en el útero. “Pluri”, del latín plures, significa muchos o

varios; los científicos utilizan el término pluripotencial para describir las células madre que pueden dar

origen a células que pueden formar cualquiera de las tres capas germinales embrionarias (mesodermo,

endodermo y ectodermo) ya que todos los diferentes tipos de células especializadas provienen de alguna

de estas tres capas germinales (Slack, J.M. 2000). Es importante destacar que para que una célula madre

pueda considerarse pluripotencial tiene que cumplir las siguientes condiciones: en primer lugar, una única

célula debe ser capaz de diferenciarse a células especializadas procedentes de cualquier capa

embrionaria; en segundo lugar, demostrar la funcionalidad in vitro e in vivo de las células a las que se han

diferenciado y, finalmente, que se produzca un asentamiento claro y persistente de estas células en el tejido

diana, tanto en presencia o ausencia de daño en los tejidos en cuales se injerta (Prosper, F. 2002).

Las células madre multipotenciales son aquellas que pueden dar origen a células procedentes de tan sólo

una capa embrionaria, por ejemplo, dar origen a células provenientes del mesodermo. La célula madre

unipotencial es un término que se refiere a una célula de un organismo adulto que solo puede generar

células hijas que se diferencian a lo largo de una sola línea celular, tal como su nombre lo refiere (del latín

unus = uno). La mayoría de las células madre de un tejido específico que no ha sufrido ningún tipo de

agresión o daño son del tipo unipotencial y son las responsables del estado estacionario de

auto-renovación tisular, donde la cantidad de células perdidas es igual al número de nuevas células. Sin

embargo, si el tejido es alterado en su estructura básica a través de un fenómeno lesivo y se requiere de

diversos tipos celulares para su reparación se pueden activar células del tipo pluripotencial para reparar el

daño (Weissman, I.L. y cols. 2001).

Ahora, si las células madre se clasifican de acuerdo al tejido de donde se obtienen, las células madre

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pueden proceder del embrión o del organismo adulto, de ahí que se hable de células madre embrionarias y

de células madre adultas. Las células madre embrionarias pueden ser obtenidas a partir del cigoto

humano, conformado por células totipotenciales, capaces de dar origen a todo el organismo. Durante las

primeras divisiones, después de la fertilización, el embrión es una esfera compacta (mórula), en la que

todas las células son totipotenciales; a los pocos días comienza una primera especialización, de modo que

se produce un blastocisto. Las células madre embrionarias son derivadas del estadío de blastocisto del

embrión; el blastocisto es la etapa del desarrollo embrionario anterior a la implantación en la pared uterina,

consta de por lo menos 150 células que forman una capa superficial que dará origen al trofoblasto, del que

deriva la placenta, y una cavidad casi “hueca” (llena de fluido) en la que está la masa celular interna (MCI).

Las células de la MCI son pluripotentes, porque aunque por sí solas no pueden dar origen al feto completo

(necesitan el trofoblasto), son el origen de todos los tejidos y tipos celulares que forman al adulto (tejido

embrionario) (Verfaillie, C. y cols. 2002).

Las células madre embrionarias son células totipotenciales con capacidad de proliferar indefinidamente in

vitro. El primer reporte acerca del aislamiento de células madre embrionarias, provenientes de blastocistos

humanos data de 1994; desde entonces las técnicas para la obtención y el cultivo de las células madre

embrionarias han mejorado. (Thomson, J.A. y cols. 1998). Las células madre embrionarias in vitro se

diferencian espontáneamente en estructuras multicelulares conocidas como cuerpos embrionarios, que

contienen elementos de las tres capas germinales embrionarias, a partir de las cuales se forman varios

tipos celulares incluyendo: cardiomiocitos, neuronas, eritrocitos, entre otros. (Xiaoxia, G., Fuchu, H. 2000).

Una de las ventajas del uso de células madre embrionarias en investigación es su habilidad de proliferar

indefinidamente ya que son capaces de generar una gran variedad de tipos celulares, lo que permite que

bajo ciertas condiciones puedan ser manipuladas in vitro con el fin de producir células de un linaje

específico y contribuir así al tratamiento de enfermedades como Diabetes y Parkinson, entre otras (

Lovell-Badge, R. 2001). También pueden ser utilizadas para estudios acerca de enfermedades

producidas durante el desarrollo embrionario humano e identificar su bases genéticas, celulares y

moleculares para ayudar a prevenirlas, además de su uso como alternativa en terapias de reemplazo

celular (Weissman, I.L. 2000); sin embargo, al tratarse de células muy indiferenciadas, estas pueden

inducir la formación de tumores (teratomas) los cuales en su mayoría son benignos. (Pera, M.F. y cols.

2000).

Las células madre embrionarias (derivadas del blastocisto) y las células embrionarias germinales

(derivadas post-implantación del cigoto) son similares en muchos aspectos; ambos tipos de células son

capaces de replicarse y dividirse en cultivos por largos períodos de tiempo sin mostrar alteraciones

cromosómicas, además expresan una serie de marcadores característicos de células pluripotenciales que

facilitan su identificación. Sin embargo, las células madre embrionarias derivadas del blastocisto humano y

las células germinales difieren no solo del tejido de donde provienen sino también en su comportamiento in

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vivo y en que las células madre embrionarias son capaces de generar teratomas mientras que las células

germinales humanas no (Odorico, J.S. y cols. 2001 y Shamblott, M.J. y cols. 2001).

Además de las células madre embrionarias, se han identificado células madre adultas que se puede

encontrar en la mayoría de los tejidos, incluyendo hematopoyético, neuronal, epidérmico, gastrointestinal,

músculo esquelético, músculo cardiaco, hígado, páncreas y pulmón. En un principio se pensó que las

células madre adultas estaban predeterminadas a diferenciarse a un tipo celular procedente de la misma

capa embrionaria. Sin embargo, esta idea ha sido reevaluada por varios grupos de investigadores cuyos

estudios sugieren que las células madre adultas son capaces de diferenciarse funcionalmente a células

especializadas procedentes de capas embrionarias distintas a las de su propio origen. Incluso, algunos de

estos grupos han sido capaces de probar la pluripotencialidad de células madre adultas procedentes de la

médula ósea o del cerebro. Estos avances han hecho cambiar la idea que se tenía de las células madre

adultas, dándoles un mayor potencial terapéutico del que se pensaba (Jiang, Y. y cols. 2002).

La médula ósea contiene células madre adultas denominadas células madre estromales. En los últimos

años se han descrito distintos marcadores de superficie que han permitido identificar y aislar células madre

estromales, tales como SH2, SH3, CD29, CD44, CD71 y CD90. Las células madre estromales no

expresan antígenos de superficie típicos de las Células Madre Hematopoyéticas (CMH), como el CD34 y

CD45. Experimentos recientes han demostrado in vitro que las células madre estromales son capaces de

diferenciarse a tejidos mesodérmicos funcionales como osteoblastos, condroblastos, adipocitos y

mieloblastos esqueléticos. Las células madre estromales constituyen un modelo muy útil en aplicaciones

clínicas para ciertas enfermedades, tanto en terapia regenerativa como en terapia génica (Jiang,Y. y cols.

2002).

Otro ejemplo de las células madre adultas en médula ósea son las células madre hematopoyéticas, estas

células son responsables de la renovación constante de las células sanguíneas, es decir, de la producción

de billones de nuevas células cada día. La primera evidencia y definición acerca de las células madre

hematopoyéticas proviene de estudios realizados a personas expuestas a dosis letales de radiación en el

año de 1945 (Weissman, I.L. 2000).

Las células madre hematopoyéticas aparecen en el embrión entre la tercera y cuarta semana de gestación,

luego de la quinta a la doceava semana, estas células migran desde el saco vitelino hasta el hígado y el

bazo y por último llegan a la médula ósea a través de la circulación fetal durante el segundo y tercer

trimestre de gestación. Estas células han sido aisladas de la sangre y de la médula ósea; tienen la

capacidad de autorenovarse y diferenciarse a una gran variedad de células especializadas, se movilizan

desde la médula ósea hacia los vasos sanguíneos y llevan a cabo procesos apoptóticos. (Gasparoni, A. y

cols. 2000).

20







El proceso de movilización de las células madre hematopoyéticas está caracterizado por la migración y la

tendencia selectiva de estas células para retornar a la médula ósea. Las capacidades de autorenovación,

proliferación y diferenciación de las células madre hematopoyéticas están reguladas por un complejo

mecanismo en el cual se encuentran involucrados el microambiente medular, citoquinas estimuladoras e

inhibidoras, así como también las interacciones célula-célula y célula-matriz extracelular. Estas

interacciones están mediadas por moléculas de adhesión celular (MAC) las cuales se expresan en las

células madre hematopoyéticas, en las células endoteliales y en las células del estroma medular (Timeus,

F. y cols. 1998).

Durante el desarrollo embrionario, las células madre hematopoyéticas que van a dar lugar a las células

sanguíneas migran desde el hígado fetal hacia la médula ósea a través de los vasos sanguíneos; una vez

ahí repueblan este tejido con altos niveles de células maduras e inmaduras, las cuales son liberadas

nuevamente a la circulación, mientras que un pequeña cantidad de células madre indiferenciadas se

mantiene dentro de la médula ósea y están produciendo de forma continua células maduras e inmaduras

del linaje mieloide y linfoide. Se cree que el papel fisiológico de las células madre que se encuentran en

circulación es repoblar áreas de la médula ósea que han sufrido algún tipo de daño y posiblemente

también se encarguen de repoblar el timo (Lapidot, T., Petit, I. 2002).

Otro criterio de referencia de la clasificación de las célula madre hematopoyéticas ha sido su capacidad de

repoblación in vivo. Los estudios de repoblación in vivo en ratones que emplean anomalías cromosómicas

únicas inducidas por radiación o marcadores retrovirales han demostrado que una, o unas pocas células

madre, son capaces de reconstituir por completo todo el sistema linfo-hematopoyético del ratón; también

han definido clases de células madre con capacidad de repoblación a corto, medio o largo plazo. Estos

son tipos celulares que difieren en la cinética de la reconstitución hematopoyética. Las células repueblan a

corto plazo en las primeras semanas posteriores al trasplante pero no son duraderas; las células a largo

plazo son responsables de una reconstitución prolongada, que empieza unos meses después del

trasplante y duran toda la vida; las células a mediano plazo tienden un puente entre las células a corto plazo

y las células a largo plazo. Las células repobladoras a largo plazo más primitivas, al ser activadas por las

citoquinas, pueden modificar rápidamente su fenotipo y convertirse en células repobladoras a corto plazo (

Ivanova, N. y cols. 2002).

La habilidad de las células de alterar su fenotipo en respuesta a los cambios en su microambiente local, es

lo que se conoce como plasticidad. Esta propiedad fue reconocida por primera vez en estudios realizados

en células madre provenientes de la médula ósea, en donde se observaron cambios en el fenotipo tanto en

células inmaduras como en células diferenciadas bajo condiciones inducidas in vivo e in vitro (Robey, P.G.

2000).

Los mecanismos moleculares que llevan a los cambios de linaje celular dentro del sistema hematopoyético

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están siendo estudiados, los resultados más recientes acerca de la plasticidad de las células madre adulta

contradicen el dogma de que la diferenciación de las células madre adultas estaba restringida a su tejido

de origen. Evidencias obtenidas tanto in vivo como in vitro muestran que las células madre adultas,

originadas en un tejido determinado, son capaces de producir células con una expresión genética

característica de otros tejidos, cuando se transfieren al ambiente de otro tejido diferente. De una forma muy

particular se ha prestado atención a la capacidad de las células madre adultas de la médula ósea (células

madre hematopoyéticas) de producir células con las propiedades de hepatocitos, neuronas y

cardiomiocitos, esto es lo que se conoce como plasticidad por ejemplo una célula madre de la médula

ósea puede dar origen a tejido hepático, músculo esquelético, células neuronales, entre otras. (Figura 1) (

Körbling, M., Estrov, Z. 2003).

Figura 1: Plasticidad de las células madre adultas. Tomado de stemcells.nih.gov/infoCenter/ stemCellBasics.asp

Como se mencionó antes existe una generación de células en el adulto con una cierta plasticidad en cuanto

a su fenotipo, refiriéndose dicho término no sólo a las características externas observables de un

organismo o célula, sino a las propiedades que definen las interacciones con otras células y productos

extracelulares, a las proteínas de superficie y al proceder funcional del conjunto (Körbling, M., Estrov, Z.

2003).

Existe cuatro modelos que explican los posibles mecanismos que llevan a las células madre adultas a

diferenciarse a células de un tejido diferente al que les dio origen en respuesta a cambios en su

microambiente o para la reparación y el reemplazamiento de células y tejidos del organismo cuando sean

necesarios: El primer modelo es la “clásica” diferenciación celular en el que una célula progenitora

restringida hacia un solo linaje da origen a células de su misma estirpe. El segundo modelo nos habla de la

capacidad que tiene las células madre adultas de diferenciarse a varios tejidos especializados. En el tercer

22







modelo, conocido como transdiferenciación, células madre que se van a diferenciar hacia un linaje

predeterminado, bajo ciertas circunstancias como por ejemplo daño tisular u otros estímulos diferentes,

causan que esa célula madre cambie su proceso de diferenciación ya predeterminado y vaya a generar

células de un tejido diferente. El último modelo hace referencia a que una célula madura puede adquirir

características de una célula madre, es decir, se dediferencia y, eventualmente, puede rediferenciarse a

células del mismo tejido que le dio origen o a un tejido diferente (Figura 2) (Körbling, M., Estrov, M. D.

2003).

Figura 2: Modelos de diferenciación de las células madre adultas. Tomado de

http://content.nejm.org/cgi/content/extract/349/6/570

Aunque este fenómeno de plasticidad que tienen las células madre del adulto a permitido que hoy en día se

puedan cultivar estas células tanto en el laboratorio (in vitro) como en un modelo animal (in vivo) con el

objetivo de utilizarlas para la reparación de tejidos dañados, la aplicación de estas técnicas de trasferencia

de células madre adultas para el recambio y reparación de tejidos dañados está aún por establecerse.

Aunque los primeros estudios con células madre datan de la década de los setenta, los avances realizados

en los últimos años han despertado el interés en la comunidad científica. Las implicaciones éticas con el

uso de las células madre embrionarias y las nuevas evidencias que demuestran un mayor potencial de las

células madre adultas que el inicialmente esperado, han revivido aún más el debate sobre las posibles

aplicaciones terapéuticas de las células madre.

23







http://content.nejm.org/cgi/content/extract/349/6/570

2.2 CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS: MICROAMBIENTE E INMUNOFENOTIPO

Como se mencionó en las generalidades sobre las células madre, las células madre embrionarias pueden

obtenerse a partir del blastocisto o post-implantación del cigoto. A continuación se presenta un breve

resumen sobre el proceso de embriogénesis humana.

El proceso de fertilización en humanos ocurre en el oviducto, cerca del ovario. El espermatozoide entra al

ovocito secundario liberando su núcleo haploide, originándose de esta manera dos pronúcleos en el

interior del ovocito. Posteriormente, el ovocito secundario concluye su segunda división meiótica y se

transforma en una ovótida y los dos pronúcleos se fusionan formando al cigoto. Esta etapa ocurre entre las

12 y 24 horas después de la ovulación (Figura 3) (García-Peláez, I. y cols. 1993).

Fig. 3: Fecundación. Tomado de http://mx.geocities.com/avolaje2/apuntes/desarrolloembrionario_b2.html

El cigoto formado, se desplaza por el oviducto hacia el interior del útero. Mientras realiza este viaje, inicia

una serie de divisiones celulares mitóticas que lo llevarán a transformarse en una esfera hueca. La primera

división se presenta 30 horas después de la fecundación, durante esta, el cigoto se divide en dos células o

blastómeros. La segunda división ocurre entre las 40 y 50 horas posteriores a la fecundación y se forman

cuatro blastómeros; después de 60 horas ya se observan 8 células. Conforme avanza por el oviducto, el

cigoto continúa su segmentación y hacia el cuarto día ya se observa una esfera formada por 32 células; a

esta estructura se le conoce como mórula avanzada (Figura 4) (García-Peláez, I. y cols. 1993).

Fig. 4: Segmentación. Tomado de http://mx.geocities.com/avolaje2/apuntes/desarrolloembrionario_b2.htm

Hacia el quinto día, el embrión ingresa al útero en su fase de blástula o blastocisto; el blastocisto es una

esfera hueca de aproximadamente unos 100 a 120 blastómeros, en cuyo interior se ha formado un espacio

hueco llamado blastocele, el cual está lleno de un fluido. El blastocisto tiene la forma de un anillo cuya

piedra se encuentra en la parte interna del “aro”; el "anillo" recibe el nombre de trofoblasto (trophe = nutrir) y

la "piedra" es el embrioblasto (García-Peláez, I. y cols. 1993).

A partir del trofoblasto se formará el corión, membrana que posee una serie de vellosidades similares a

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http://mx.geocities.com/avolaje2/apuntes/desarrolloembrionario_b2.html

http://mx.geocities.com/avolaje2/apuntes/desarrolloembrionario_b2.htm

pequeños dedos, los cuales penetran en los tejidos del endometrio iniciando así la implantación del

embrión. El trofoblasto, además de fijar el embrión a las paredes del útero, lo nutre, ya que participa en la

formación de la placenta y del cordón umbilical (García-Peláez, I. y cols. 1993).

El embrioblasto, es la masa celular interna a partir de la cual se va a desarrollar el embrión (Figura 5) (

García-Peláez, I. y cols. 1993).

Fig. 5: Blastocisto. Tomado de http://mx.geocities.com/avolaje2/apuntes/desarrolloembrionario_b2.html

La formación de la gástrula se caracteriza por un aumento en el tamaño del embrión y una reorganización

de las células de la blástula, las cuales se invaginan para dar lugar a la aparición de las tres capas

germinales primarias: ectodermo, mesodermo y endodermo (García-Peláez, I. y cols. 1993).

La formación de la gástrula se presenta entre los días 15-18 después de la fecundación (Figura 6) (

García-Peláez, I. y cols. 1993).

Fig. 6: Gástrula. Tomado de http://mx.geocities.com/avolaje2/apuntes/desarrolloembrionario_b2.html

Una vez formada la gástrula se inicia un proceso de diferenciación en las células de las tres capas

embrionarias primarias, este proceso llevará a la formación de las estructuras orgánicas características del

nuevo ser humano.

Para la octava semana ya se han manifestado, de forma primitiva, todos los órganos y a partir de entonces

se inicia el desarrollo fetal. A través del proceso de diferenciación de las tres capas embrionarias, se

formarán, entre otras, las siguientes estructuras (Figura 7) (García-Peláez, I. y cols. 1993):

Ectodermo: Piel, glándulas epiteliales, pelo, uñas, esmalte dental, revestimiento de la boca y faringe, parte

del recubrimiento del recto, oído interno, epitelio nasal y olfativo, sistema nervioso y cráneo.

Mesodermo: La mayoría de los órganos internos, revestimiento de la cavidad torácica y abdominal,

sistema urogenital (gónadas, riñones, uréteres, conductos reproductores), sistema circulatorio, sangre,

médula ósea, huesos, tejido muscular, tejido adiposo y la mayoría de los cartílagos.

Endodermo: Tubo digestivo primitivo y glándulas anexas, faringe, tiroides, hígado, páncreas, tráquea,

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pulmones y epitelio del tracto respiratorio.

El término “célula madre embrionaria” (CME) fue introducido para distinguir a las células pluripotenciales

derivadas de embriones de las células pluripotenciales derivadas del carcinoma embrionario (Thomson,

J.A. y cols. 1998).

Aunque los procesos de diferenciación de las células madre embrionarias han sido establecidos, los

mecanismos moleculares por los cuales estas células se mantienen indiferenciadas aún son desconocidos

(Xiaoxia, G., Fuchu, H. 2000). Sin embargo se han realizando estudios con el fin de establecer los genes y

factores involucrados en el mantenimiento, proliferación e indiferenciación de las CME para obtener

información acerca de los mecanismos moleculares que regulan la maduración de las células madre

durante la embriogénesis (Xiaoxia, G., Fuchu, H. 2000).

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Figura 7: Capas Embrionarias. Tomado de stemcells.nih.gov/stemcell/pdfs/

Las señales externas que regulan el destino de las células madre forman parte de lo que se conoce como

el microambiente celular o “nicho”. El concepto de “nicho” fue utilizado por primera vez al describir el

proceso hematopoyético cuando encontraron que la proliferación, diferenciación y el mantenimiento de los

distintas poblaciones de progenitores en la médula ósea (MO) dependían de factores secretados por otros

tipos de células (Watt, F.M. y Hogan, B.L.M. 2000).

Se sabe que el dominio POU (acrónimo formado por las iniciales de los factores de transcripción:

Pit-1/GHF-1, Oct-2 y Unc-86) y el factor de transcripción Oct4 son esenciales para la formación de las

células de la MCI y de la línea germinal. Para el mantenimiento de la pluripotencialidad de las CME se ha

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descrito varias citoquinas como el Factor Inhibidor de Leucemia (LIF) que estimula una tirosin quinasa, esta

señal se traduce en la activación del factor de transcripción Stat3. Se ha encontrado una relación entre los

niveles de Stat3 y el fenotipo de las ES aunque la variación de su actividad no afecta la proliferación de las

ES (Xiaoxia, G., Fuchu, H. 2000).

Otro de los mecanismos que forman parte del nicho son las interacciones entre las células. Muchas señales

que regulan a las células madre están relacionadas con el contacto directo de célula-célula, esto ha sido

demostrado en estudios realizados con el receptor Notch y su ligando Delta que son proteínas

transmembranales requeridas para la formación de órganos sensoriales a partir de células precursoras en

modelos con Drosophila. También se ha estudiado que la señalización mediada por Notch es importante

en el origen de tejidos embrionario y adulto en los vertebrados (neuroepitelio, músculo esquelético y

sangre) (Watt, F.M. y Hogan, B.L.M. 2000). La adhesión de las células a la matriz celular es mediada por

receptores. Los más estudiados y caracterizados son las integrinas como por ejemplo las β1 integrinas

que se requieren para el mantenimiento de las células madre epiteliales y para regular la diferenciación de

los queratinocitos. Las proteínas de la matriz extracelular modulan la expresión y activación de las β1

integrinas y también regulan la concentración de los factores de secreción que forman parte del nicho de la

célula madre (Watt, F.M. y Hogan, B.L.M. 2000).

El nicho de las células del epiblasto está conformado por los tejidos extraembrionarios, el trofoblasto,

derivado del ectodermo extraembrionario y del endodermo primitivo. El endodermo anterior secreta el

Factor Transformador de Crecimiento β (TGFβ) que controla la diferenciación de los linajes embrionarios

mientras que las células del mesodermo ventral y las células germinales primordiales son inducidas por la

proteína morfogenética ósea 4 (Bmp4) la cual es producida por el trofoblasto (Watt, F.M. y Hogan, B.L.M.

2000).

Las CME expresan altos niveles de telomerasa, lo cual podría explicar su capacidad de mantenerse por

largos períodos en cultivos (Cheng, L. y cols. 2003. Odorico, J.S. y cols. 2001. Thomson, J.A. y cols. 1998.

Verfaillie, C.M. y cols. 2002).

Los antígenos específicos del estadío embrionario (SSEA: Stage-Specific Embryonic Antigens) se

desarrollan durante la embriogénesis temprana y son utilizados como marcadores de diferenciación tanto

de células madre embrionarias humanas y de ratón. Las ES se caracterizan por la expresión de los

antígenos de superficie: TRA-1-60 y TRA-1-81 (asociados a proteoglicanos), SSEA-3 y SSEA-4

(asociados a glicolípidos), CD90 (thy-1), CD133 (AC133), CD117 (c-kit) y por la actividad de la telomerasa

y la fosfatasa alcalina (Henderson, J.K y cols. 2002).

Los antígenos SSEA-3 y SSEA-4 son expresados por las células germinales no fecundadas y por las

células que se forman en las primeras etapas del desarrollo embrionario; estos antígenos también son

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expresados por las células del endodermo primitivo (Henderson, J.K y cols. 2002).

El glicolípido de la serie globo GL7, que lleva consigo al epítope SSEA-4 en humanos, se forma por la

unión de ácido sialico al glicolípido de la serie globo Gb5, la cual lleva consigo al epítope SSEA-3 (

Thomson, J.A. y cols. 1998). Los glicolípidos de la serie globo son antígenos asociados a la membrana

que poseen como estructura principal un enlace Galα1→4Gal el cual es responsable de las funciones de

reconocimiento y diferenciación celular (Figura 8).

Figura 8. Estructura Química del SSEA-4. Tomado de www.mariecurie.org/annals/volume1/lassam.pdf

El descubrimiento de una población celular de la médula ósea que expresa el antígeno SSEA-4 ha

suscitado la atención del mundo científico ya que se han descrito como auténticas células pluripotenciales

con una capacidad de diferenciación muy similar a la de las CME. Estas células, conocidas como células

madre adultas pluripotenciales (MAPCs) han sido aisladas tanto de médula ósea humana como murina.

Estas MAPCs son capaces de proliferar in vitro más de 120 divisiones celulares sin un aparente

envejecimiento ya que mantienen altos niveles de telomerasa durante todo el tiempo de cultivo. Para

caracterizar las células madre adultas resulta muy importante definir marcadores que puedan informar

acerca de su estado de diferenciación, ya que la observación de su morfología es un criterio insuficiente.

Entre estos marcadores cabe destacar a las proteínas de superficie que actúan como receptores, ya que

pueden aportar información acerca de la singularidad de cada tipo de célula madre. Se ha descrito que

estas células no expresan los marcadores CD34, CD44, Complejo Mayor de Histocompatibilidad (CHM)

de clase I y clase II, CD45 y c-kit; expresan niveles bajos de Flk-1, Sca-1 y Thy-1, y altos niveles de CD13,

SSEA-1 (ratón / rata) y SSEA-4 (humana). Aunque el antígeno CD13, una glicoproteína de membrana de

150 Kd, es característico de progenitores mieloides; se ha encontrado que las células madre adultas

expresan altos niveles de este antígeno por lo que se ha convertido es uno de los marcadores empleados

para la identificación de estas células (Jiang, Y. y cols. 2002).

Al igual que en las CME humanas, en las MAPCs se detecta la activación de los factores de transcripción

Oct4 y Rex-1, factores que son necesarios para mantener la célula en un estado proliferativo e

indiferenciado. Además se han realizado experimentos de clonaje que prueban que es una única célula la

que es capaz de diferenciarse a tejidos procedentes de cualquiera de las tres capas embrionarias

(endodermo, mesodermo o ectodermo) (Jiang, Y. y cols. 2002).

In vitro, las MAPCs pueden ser inducidas para diferenciarse a tejidos derivados del mesodermo como

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hueso, cartílago, adipocitos, músculo esquelético, estroma hematopoyético o endotelio; pero de momento

no se han podido diferenciar a tejido hematopoyético maduro o cardiomiocitos. Estas células también han

sido capaces de diferenciarse a hepatocitos y funcionar como tales, ya que son capaces de producir urea,

albúmina, inducir el citocromo p450 con fenobarbital y almacenar glucógeno. La diferenciación de las

MAPCs a tejidos derivados del ectodermo como neuronas, astrocitos y oligodendrocitos también ha sido

demostrada in vitro (Prosper, F. 2002).

Aunque el proceso de aislamiento de las MAPCs todavía es largo y laborioso, experimentos con las

MAPCs demuestran la existencia de células madre pluripotenciales en el adulto, mostrando su

potencialidad no solo en el campo terapéutico, sino como un instrumento para poder comprender mejor los

eventos que inducen a las células madre a diferenciarse.

30







2.3 CÉLULAS MADRE HEMATOPOYÉTICAS: MICROAMBIENTE Y ORGANIZACIÓN ONTOGÉNICA

Las células sanguíneas circulantes derivan de un número limitado de células madre localizadas en la

médula ósea, las cuales tienen la capacidad de auto-renovarse y diferenciarse en las distintas líneas

celulares hematopoyéticas. En el proceso de diferenciación, estas células primitivas dan origen a otras

más evolucionadas, denominadas unidades formadoras de colonias (UFC), las cuales son las progenitoras

de los distintos clones que van a generar megacariocitos, linfocitos, monocitos, granulocitos y eritrocitos (

Shivdasani, R.A., Orkin, S.H. 1996).

A partir de las UFC, el proceso de diferenciación depende de la integridad de varias proteínas reguladoras

del ciclo celular, entre las cuales se destacan algunas interleuquinas, conocidas como factores de

crecimiento. Dichos factores son liberados por monocitos, macrófagos y linfocitos activados y su acción es

promover la proliferación y viabilidad de una o varias de las colonias de células progenitoras (Cairo, M.S.,

Wagner, J.E. 1997).

Durante las primeras etapas de la vida embrionaria la hematopoyesis tiene lugar en el saco vitelino donde

se localizan las primeras células madre hematopoyéticas, las cuales migran posteriormente hacia los

órganos hematopoyéticos fetales como hígado. Desde el segundo al séptimo mes de vida intrauterina, la

producción de células sanguíneas tiene lugar principalmente en el hígado y en menor escala a nivel del

bazo y, luego, a medida que avanza la gestación, el proceso de la hematopoyesis se establece casi por

completo en la médula ósea (Timeus, F. y cols. 1998).

Las células hematopoyéticas maduras se forman a partir de una célula progenitora unipotencial común. Por

ejemplo la célula madre linfoide que dará origen finalmente a linfocitos T, B y células natural killer; la serie

mieloide deriva de una célula multipotencial, de la que derivan a su vez las diferentes células madre

comprometidas que solo darán origen a un tipo celular. Con respecto a las células madre comprometidas,

deben destacarse tres hechos particulares:

Existen células madre comprometidas para hematíes, granulocitos, monocitos, plaquetas, eosinófilos y

basófilos.

Para las series granulocítica y monocítica, son dos las células madre comprometidas: la primera es una

célula común granulo-monocítica, mientras que la segunda aparecerá comprometida para cada una de

estas líneas.

La línea eritroide posee dos tipos de células madre comprometidas: la Unidad Formadora de Colonias

Eritroides (UFC-E) y la Unidad Formadora de Brotes Eritroides (UFB-E). La UFB-E, más primitiva, es

menos sensible y es estimulada por factores de crecimiento distintos a los de la UFC-E; ambos

progenitores eritroides se diferencian también por presentar distintos antígenos de superficie.

El origen de las plaquetas reconoce también una primera célula con significado e implicaciones similares a

las de las UFB-E para la eritropoyesis (Zon, L. I. 1995).

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A partir de las células madre comprometidas o unipotenciales se producen células morfológicamente

reconocibles de cada línea: básicamente precursores eritroides o eritroblastos, precursores granulocíticos

o granulocitos inmaduros y precursores plaquetarios o megacariocitos (Figura 9).

Figura 9: Hematopoyesis. Tomado de stemcells.nih.gov/stemcell/pdfs/chapter5.pdf

32







Además de la presencia de las células progenitoras que se han mencionado se necesita de un

microambiente hematopoyético para una hematopoyesis eficaz. El llamado microambiente constituye un

“nicho” adecuado para el desarrollo del proceso hematopoyético. El microambiente hematopoyético tiene

un papel importante en el control de la proliferación y diferenciación hacia un linaje específico durante la

hematopoyesis. Muchos estudios han demostrado que la actividad de los progenitores hematopoyéticos

está regulada por múltiples interacciones entre receptor-ligando, proteínas de superficie, la matriz

extracelular y las citoquinas; estas interacciones están mediadas por moléculas de adhesión expresadas

sobre la superficie de los progenitores hematopoyéticos, las células endoteliales y las células del estroma (

Madihally, S.V. y cols. 1999. Timeus, F. y cols. 1998).

Tanto en los seres humanos como en algunas especies murinas, se han identificado diferentes tipos de

células que forman el estroma, como son los macrófagos de origen hematopoyético y los fibroblastos

preadipocitarios, las células endoteliales y las células musculares lisas vasculares no hematopoyéticas.

Este sistema es capaz de soportar en médula ósea a las células madre más primitivas y controlar su

proliferación y autorregeneración. Los contactos célula a célula son vitales para determinar el estímulo

microambiental. Las células madre se unen íntimamente al estroma, mientras que los precursores en

maduración y las células con diferenciación terminal no son adherentes (Madihally, S. y cols.1999).

El proceso de unión de las células madre hematopoyéticas (CMH) en la médula es complejo y en él

participan algunas proteínas de adhesión. Se ha demostrado que las CMH que intervienen en el

alojamiento en la médula ósea, expresan VLA (Very Late Antigen) 4, 5 y 6, PECAM (Platelet/Endotelial Cell

Adhesion Molecule), selectina P y selectina E, CD44, el receptor CXCR y un receptor para los residuos

galactosil y manosil portadores de ligando. Las integrinas α-4 y α-5, o ambas, se expresan sobre los

blastos, progenitores eritroides, monocitos y células CD34+; en general, la expresión de α-4 parece

disminuir con la maduración. (Lapidot,T., Petit,I. 2002). La molécula CD34 además de ser el antígeno

característico de las CMH tiene una función importante en la adhesión celular al regular las interacciones de

las células hematopoyéticas con el microambiente de la MO (Healy, L. y cols.1995).

En MO, las citoquinas inducen sus efectos a través de la interacción con los receptores de la membrana de

la célula. Se han identificado varias familias de receptores de citoquinas en progenitores hematopoyéticos

como: receptores para interleuquina (IL)-3, IL-4, IL-5, IL-7, IL-9, Factor Estimulador de Colonias

Granulocíticas (G-CSF) Factor Estimulador de Colonias Granulo-Monocíticas (GM-CSF) y eritropoyetina.

Los receptores del ligando FLT-3, c-kit, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), Factor

Derivado del Estroma-1 (SDF-1) y trombopoyetina constituyen la familia del receptor de la tirosin-quinasa (

Cairo, M.S., Wagner, J.E. 1997).

Generalmente, las citoquinas producen la oligomerización de los receptores sobre las CMH, lo que va

seguido de la activación de las tirosin-quinasas intrínsecas (del receptor) o extrínsecas; los pasos

siguientes varían con las distintas citoquinas pero esencialmente representan una serie de procesos de

fosforilación-desfosforilación, con la activación final o la translocación nuclear de una proteína o complejo

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proteico que se une a regiones específicas del DNA e inicia diversos programas genéticos (es decir, actúa

como un factor de transcripción) (Cairo, M.S., Wagner, J.E. 1997).

Al respecto, las evidencias experimentales indican que gran parte del proceso hematopoyético es el

resultado de la activación de genes específicos, ya que cada tipo celular expresa una gama diferente de

ellos. La activación génica se encuentra controlada por proteínas nucleares que se ligan a secuencias

específicas del DNA y de esta forma regulan la transcripción. Dichas proteínas, denominadas factores de

transcripción, están controladas, a su vez, por señales químicas provenientes de la misma célula o de otras.

El conocimiento de cómo actúan los factores de transcripción, hasta ahora identificados, es esencial para

comprender el proceso de diferenciación (Orkin, S. H. 1995).

Recientemente se han efectuado grandes progresos en este campo gracias a los experimentos con células

embrionarias de ratones, derivadas de blastocistos y manipuladas mediante recombinación genética, que

hace posible inactivar ciertos genes específicos, con un alto grado de selectividad (proceso denominado

en inglés knockout). En esta línea de investigación, el gen inactivo es incorporado a un blastocisto, el cual

es implantado en un ratón hembra, dando origen a animales quimera, que expresan, en forma hetero u

homocigota, el gen inactivado (Blobel, G. A. y cols. 1995).

De esta manera ha sido posible la identificación de un gen conocido como tal-1/SCL, que codifica para un

factor de transcripción perteneciente a la familia de los compuestos “basic Helix Loop-Helix” (bHLH) cuya

deleción homocigótica es incompatible con la vida, pues los animales afectados no pueden formar ningún

tipo de células sanguíneas. Esto sugiere, que esta molécula desempeña una función crítica en etapas muy

tempranas de la diferenciación hematopoyética, quizá relacionada con la génesis y persistencia de las

células progenitoras multipotenciales (Blobel, G. A. y cols. 1995).

Por otra parte, los animales que carecen de la proteína nuclear rbnt2/Tgt2/LMO2, la cual forma dímeros con

el factor tal-1/SCL, también mueren in utero y al parecer por las mismas razones que los ratones que no

producen la proteína tal-1/SCL, por lo que es muy probable que el complejo formado por las dos sustancias

mencionadas tenga una importante función fisiológica, estimulando el crecimiento celular en etapas

tempranas del proceso hematopoyético (Blobel, G. A. y cols. 1995).

Otros elementos importantes en la hematopoyesis son las secuencias GATA del ADN, las cuales hacen

parte de varios elementos reguladores cis de los genes vinculados con la diferenciación de las líneas

celulares (Peuny, L. y cols. 1995). La proteína GATA-1 desempeña un papel destacado en la eritropoyesis

y su ausencia no sólo detiene la maduración de los precursores de la línea eritroide en el estadío de

pro-eritroblasto, sino que facilita la apoptosis o muerte celular programada. El efecto de GATA-1 parece

depender en gran medida de sus concentraciones locales, pues cuando éstas son elevadas, las células

manifiestan características megacariocíticas, en tanto que a bajas concentraciones expresan rasgos

propios de los eosinófilos (Weiss, M. J., Orkin, S. H. 1995).

Puesto que la carencia del factor GATA-2 afecta la formación de todas las líneas celulares en conjunto, se

34







ha postulado que dicha proteína es fundamental para la expansión adecuada de las células

hematopoyéticas primitivas, mediando el efecto de diversos factores de crecimiento, entre ellos el ligando

c-kit. La expresión de GATA-2 disminuye progresivamente a medida que las células maduran y aumenta la

síntesis correspondiente de GATA-1 (Peuny, L. y cols. 1995)(Figura 10).

Figura 10: Factores de transcripción en la hematopoyesis. Tomado de

www.iladiba.com.co/revista/1996/09/achemat.asp - 21k

Varias evidencias señalan que las distintas etapas de la hematopoyesis (mesoblástica y hepática),

responden de manera diferencial a los factores reguladores, pues los ratones con deficiencia completa de

la proteína c-myb poseen una hematopoyesis normal en el saco vitelino, pero el proceso se interrumpe

bruscamente y por completo en el hígado; tal evento parece reflejar una anormalidad específica de la

proliferación de células madre multipotenciales en el microambiente hepático. Esto se relaciona con otras

35







evidencias que indican un alto grado de especialización de las líneas celulares multipotenciales, como

resultado de la acción de factores microambientales poco conocidos, presentes en los órganos

hematopoyéticos (Blobel, G. A. y cols. 1995).

Por otro lado, el factor AML-1 interviene en el desarrollo temprano de todas las líneas celulares y se ha

sugerido que, adicionalmente, puede intervenir activamente en los procesos de angiogénesis (Shivdasani,

R. A., Orkin, S. H. 1996). La secuencia de nucleótidos CACCC, que también hace parte de los

componentes reguladores cis, es esencial para la transcripción de varios de los genes de la línea eritroide,

tales como aquellos vinculados con la transcripción de la globina (Weiss, M. J., Orkin, S. H. 1995).

En etapas más avanzadas de la diferenciación celular, y como ya es bien conocido, juegan un papel

importante otros factores de transcripción, como es el caso de la proteína PU1 que contribuye en gran

medida a la proliferación de los precursores de monocitos/macrófafos, granulocitos y linfocitos T y B y

actúa en menor grado sobre las células progenitoras de la línea eritroide (Shivdasani, R. A., Orkin, S. H.

1996). El factor de transcripción NF-E2, codificado por una secuencia de nucleótidos dispuesta entre las

regiones GATA y CACCC del ADN, es un heterodímero compuesto por dos subunidades: p18 y p45 cuya

expresión diferencial, está restringida a ciertos tipos celulares; es así que la porción p45-NF-E2 está

limitada a los precursores multipotenciales, las células de la línea eritroide, los mastocitos y los

megacariocitos (Shivdasani, R. A., Orkin, S. H. 1995).

Por último, los genes esenciales en la organogénesis temprana, también cumplen grandes funciones en la

diferenciación de las células sanguíneas y existen así mismo otros factores de transcripción que actúan de

manera coordinada sobre líneas celulares específicas, entre los cuales están las moléculas Ikaros, E2A,

Pax5/BSAP, Oct-2, TCF-1 y LEF-1, todos ellos relacionados con la producción de linfocitos maduros (

Orkin, S. H. 1995). En consecuencia, las primeras fases de la hematopoyesis se pueden entender como

una secuencia de eventos a través de los cuales la célula adquiere un fenotipo definido como producto de

una coordinada expresión genética.

36







2.4 CÉLULAS MADRE HEMATOPOYÉTICAS: INMUNOFENOTIPO

Las Células Madre Hematopoyéticas se caracterizan por su gran capacidad de proliferación y

diferenciación en progenitores hematopoyéticos comprometidos. De acuerdo al modelo de la

hematopoyesis, el proceso de maduración de las células sanguíneas en médula ósea comienza con una

hematopoyéticas funcional de largo plazo (LT-CMH). Las LT-CMH son necesarias para el mantenimiento

del sistema hematopoyético durante toda la vida de un organismo. Estas células dan origen a las llamadas

células madre hematopoyéticas a corto plazo (ST-CMH), las cuales se caracterizan por entrar más

fácilmente a ciclo celular; sin embargo estas células son las que dan origen a los progenitores

comprometidos (Ivanova, N. B. Y cols. 2002).

La mayoría de las CMH expresan el antígeno CD34, que también se expresa en progenitores

comprometidos. Se ha sugerido que esta molécula funciona como regulador de la adhesión celular de

células hematopoyéticas al microambiente hematopoyético. El antígeno CD34 es una glicoproteína de

membrana la cual se expresa en la superficie de las células progenitoras hematopoyéticas, algunas células

endoteliales y del estroma medular. Estudios recientes acerca de la composición bioquímica y estructural

de la molécula CD34, incluyendo la secuencia de los aminoácidos y carbohidratos que la componen, han

revelado que este antígeno es una molécula altamente glicosilada y acídica (punto isoeléctrico < 4.0) y que

su peso es de 110.000 daltons. Otros experimentos indican que el CD34 es una fosfoproteína, puesto que

los procesos de fosforilación están involucrados como un mecanismo que regula el funcionamiento de las

glicoproteínas de superficie, de los receptores de los factores de crecimiento, esto podría dar una clave del

papel del CD34 como un regulador de los procesos hematopoyéticos (Fackler, M. J. y cols. 1990. Burn, T.

C. y cols. 1992. Healy, L. y cols. 1995. Mayani, H., Lansdorp, P. M. 1998).

Otro de los marcadores que se expresa en los progenitores hematopoyéticos comprometidos es la

molécula CD38, una glicoproteína expresada por muchos tipos celulares y que desempeña un papel

importante en los procesos de activación y proliferación en los linfocitos maduros además de estar

involucrada en los procesos de interacción entre las células (Funaro, A. y cols 1998).

Algunos investigadores han documentado que las CMH de ratones fetales y adultos expresan el antígeno

CD38; sin embargo no hay suficiente información acerca de la expresión de este antígeno en ratones

recién nacidos y jóvenes. En un estudio realizado con ratones se encontró que en la MO de ratones recién

nacidos no se expresaba el CD38, además, que en la MO de ratones de 5 semanas de nacidos tampoco

expresaban este antígeno. Esto indica que la población de CMH CD38+ aparecen después de la 5

semana del nacimiento y que su expresión se mantiene durante las siguientes etapas del desarrollo(

Higuchi, Y. y cols. 2003).

Además de la expresión de CD34 y CD38, se ha encontrado que la expresión del antígeno HLA-DR, una

de las tres glicoproteínas de membrana asociadas al MHC de clase II se encuentra relacionada con la

diferenciación de las células hematopoyéticas. Aunque recientes estudios han documentado que existen

37







diferencias en la expresión del HLA-DR entre células progenitoras hematopoyéticas fetales y adultas, los

investigadores sugieren que el antígeno HLA-DR se encuentra asociado con el potencial de proliferación

de los progenitores hematopoyéticos. Caux y sus colaboradores han demostrado que la expresión de los

antígenos CD34 y HLA-DR se pierden gradualmente en respuesta a la IL-3 y que la pérdida en la expresión

del HLA-DR se encuentra asociada con la pérdida de la capacidad proliferativa de las células progenitoras

hematopoyéticas. Como un inhibidor de la expresión del HLA-DR se ha postulado al factor IK, el cual regula

la proliferación y diferenciación de los progenitores hematopoyéticos. El factor IK es expresado en

progenitores hematopoyéticos CD34+ y ésta expresión parece estar regulada durante la diferenciación de

las células inducidas con factores de crecimiento. La inhibición específica de la expresión del factor IK por

oligonucleótidos resulta en un incremento de la expresión del HLA-DR, lo que indica que la expresión del

factor IK es requerida in vitro para la proliferación y diferenciación de los progenitores CD34+ (Cao, L-X. y

cols. 1997).

El MHC del ser humano, que habitualmente se denomina HLA, es una región de 4 megabases situada en

el cromosoma 6 que contiene gran cantidad de genes expresados. De estos genes, los más conocidos

son los del HLA de clases I y II, cuyos productos resultan esenciales para la especificidad inmunitaria y la

histocompatibilidad de los trasplantes. La segunda familia del MHC es la denominada clase II. Las

moléculas de esta familia están compuestas por heterodímeros glicoprotéicos, con una cadena α y una

cadena β de 33 y 27 kD, respectivamente. Estas moléculas se expresan en la superficie celular de las

células presentadoras de antígeno incluyendo macrófagos, linfocitos B y células dendríticas y bajo algunas

circunstancias también pueden expresarse en otros tipos celulares, como en las Células Madre

Hematopoyéticas (Brown, J. H. y cols. 1993).

En el humano se han definido bioquímicamente tres clases de las moléculas clase II (DR, DQ y DP) que son

coexpresadas en la superficie de las células presentadoras de antígeno. La expresión de las moléculas

clase II es estrictamente regulada, en los linfocitos B por ejemplo, la expresión varía dependiendo del

estado de maduración: en estado temprano de diferenciación expresan estas moléculas, maduros tienen la

mayor expresión y cuando llegan al estado de plasmocitos pierden esta capacidad (Brown, J. H. y cols.

1993).

La expresión de estos tres antígenos asociados con estadíos específicos de diferenciación y linajes

hematopoyéticos han sido utilizados para caracterizar las CMH en MO de adultos, en sangre periférica

(SP), y en Sangre de Cordón Umbilical (SCU), (Opie, T. M. y cols. 1998).

La frecuencia de las CMH CD34+ en MO se ha estimado entre 1-3% de las células mononucleares (CMN)

mientras que en SCU esta población oscila entre 0.2-1% (Mayani, H., Lansdorp, P. M. 1998). La expresión

del antígeno CD38 en las CMH de MO y SCU aumenta con la diferenciación. El inmunofenotipo CD34+

CD38- define a una población altamente primitiva tanto en MO como en SCU; sin embargo, existen

diferencias funcionales entre estas dos poblaciones. Las células CD34+ CD38- derivadas de SCU tienen

una mayor capacidad clonogénica, proliferan más rápido en respuesta a la estimulación con citoquinas y

38







generan aproximadamente siete veces más progenitores que la misma población en MO bajo condiciones

in vitro.

El inmunofenotipo comúnmente caracterizado para identificar las CMH en MO de adultos se ha encontrado

que no aplica para las CMH de SCU. Las células CD34+ de la MO con baja o ausente expresión del

antígeno HLA-DR son las más primitivas y las que más proliferan en cultivo. Sin embargo, en la SCU las

células CD34+ HLA-DR+ representan la población más primitiva por ser las que tienen un mayor potencial

de proliferación en cultivo (Hao, Q-L. y cols. 1995. Traycoff, C. M. y cols. 1994).

Estudios han demostrado que los progenitores más primitivos de la MO que expresan el antígeno CD34,

no expresan los antígenos HLA-DR y CD38, la mayoría de las células CD34+CD38- son DR+ y las

CD34+DR- son CD38+; aunque ambas subpoblaciones son ricas en progenitores hematopoyéticos, se

han encontrado diferencias funcionales entre ellas ya que las células CD34+ CD38- HLA-DR+ derivadas

de la médula ósea son CMH que pueden dar origen a todos los linajes hematopoyéticos in vitro, mientras

que las células CD34+ CD38+ HLA-DR- no lo pueden hacer (D Arena, G. y cols. 1996. Opie, T. M. y cols.

1998. Hao, Q-L. y cols. 1995. Sakabe, H. y cols. 1997).

La separación celular a permitido obtener poblaciones basados en la co-expresión de antígenos de

superficie. Los investigadores utilizan las moléculas que se adhieren selectivamente a los receptores y que

se encuentran en la superficie de las células como una herramienta para identificar las distintas

poblaciones de las CMH (Mayani, H., Lansdorp, P. M. 1998). Hace algunos años se desarrolló una técnica

para documentar los procesos de señalización utilizando otra molécula que tuviese la habilidad de

“fluorecer” o emitir energía al ser activado por la luz UV o un rayo láser; ésta técnica es una combinación de

las propiedades químicas de la fluorescencia con receptores específicos de la superficie celular para

identificar las diferentes poblaciones de las células madre. Una aproximación acerca del uso de

marcadores como una herramienta de investigación se lleva a cabo con una técnica conocida como FACS

(FACS: Fluorescence-Activated Cell Sorting) (Figura 11) (Boghb, L. D., Duling, T. A. 1993).

39







Figura 11: Identificación de moléculas de superficie utilizando anticuerpos monoclonales marcados con

fluorocromos. Tomado de stemcells.nih.gov/stemcell/pdfs/appendixe.pdf

40







2.5 CÉLULAS MADRE HEMATOPOYÉTICAS DERIVADAS DE SANGRE DE CORDÓN UMBILICAL

La fuente de células madre hematopoyéticas se ha ido ampliando en estos últimos años, obteniéndose de

MO, SP movilizada y mas recientemente de Sangre de Cordón Umbilical. Broxmeyer y cols, desde la

década de los 80 demostraron la presencia de CMH en la sangre del cordón umbilical con capacidad de

regeneración de la hematopoyesis en pacientes con enfermedades hematológicas (Rubinstein, P. 2000).

El número de CMH existentes en la sangre de cordón guarda relación con el volumen de la sangre que se

obtiene de la placenta, su viabilidad y capacidad funcional están condicionadas al manejo durante los

procedimientos de congelación, descongelación y conservación (Córdova-Caballero, M. 2002).

Estudios realizados demuestran que la SCU de recién nacidos a término y pretérmino, contiene un número

significativo de células progenitoras con un mayor potencial de formar colonias in vitro que la SP de

adultos. El número de las GM-UFC en SCU obtenidas de neonatos a término es mucho mayor que la

obtenida de SP de adultos, el potencial de diferenciación y proliferación de las UFC-GEMM (CFU-GEMM:

Colony Forming Unit-Granulocyte, Erithroid, Monocyte, Megakaryocyte) también es mayor en la SCU de

recién nacidos que en la SP de adultos. La frecuencia de progenitores clonogénicos en SCU es del 0.1% -

0.5% de las células mononucleares, mientras que en la SP de adultos es del 0.001% - 0.025% de las

células mononucleares (Piacibello, W. y cols. 1997).

Las células CD34+ derivadas de SCU son capaces de generar gran cantidad de células maduras en

cultivo sin reducir el número de células CD34+ en el mismo, mientras que las células CD34+ de MO adulta

disminuyen en el cultivo a medida que producen células maduras, lo que indica que las células primitivas

que provienen de la MO pierden su capacidad de autorenovación (Emerson, S. 1996).

La capacidad de expansión de las células progenitoras hematopoyéticas de la SCU es mayor que las de la

MO. Estudios in vitro acerca de la expansión en SCU utilizando combinaciones de interleuquinas como

IL-1, IL-3, IL-6, factores estimuladores de colonias (G-CSF, GM-CSF), SCF (SCF: Stem Cell Factor), c-kit,

Flt-3 y trombopoyetina han demostrado producir un aumento en la expansión celular por encima de cien

millones de progenitores (Moore, M. A. S. 2000).

La hematopoyesis y la respuesta inmunitaria en neonatos es más inmadura que la del adulto. La

disregulación de la hematopoyesis y la respuesta inmune neonatal es un factor significativo que contribuye

a incrementar la susceptibilidad del recién nacido a sufrir infecciones. Estudios recientes han demostrado

que existe una baja producción de citoquinas y linfoquinas en la SCU comparado con la SP de adultos.

Citoquinas específicas para el linaje hematopoyético como son el G-CSF, GM-CSF e IL-3 y reguladores de

la hematopoyesis como TGF-β1 y la Proteína Inhibidora de Macrofagos 1α (MIP-1α) tienen niveles de

actividad muy disminuidos en la SCU comparados con la SP de adultos. La expresión y producción de la

IL-11, SCF y trombopoyetina están muy aumentados en SCU comparada con fibroblastos y células

endoteliales (Cairo, M. S. Wagner, J. E. 1997).

41







42







2.6 LA SANGRE DE CORDÓN UMBILICAL COMO ALTERNATIVA TERAPÉUTICA DE REEMPLAZO

MEDULAR

La sangre del cordón umbilical es aquella que circula en la vena umbilical y la placenta conectando a la

madre con el bebé. En el pasado, esto se desechaba normalmente después del parto; sin embargo, ahora

se sabe que la sangre del cordón umbilical es una fuente rica en células progenitoras, las cuales se pueden

recolectar, procesar y criopreservar para aprovecharlas en un futuro (Stevens, C. E. y cols. 2002).

Desde hace algunos años se conoce cómo aislar las células madre de la sangre del cordón umbilical del

recién nacido. Estas células son similares a las células madre de la médula ósea del adulto y tienen la

ventaja de que son más fáciles de obtener, expandir y almacenar (Barker, J. N. y cols. 2002). En estudios

realizados en modelos animales se ha demostrado que la sangre de los animales recién nacidos contenía

altas concentraciones de células hematopoyéticas en la SCU que al ser trasplantadas eran capaces de

recuperar a los animales luego de haber recibido dosis de irradiación letal. Este trabajo se extendió a la

sangre del cordón umbilical humana, y se observó que las células del cordón humano tenían un potencial

para ser usadas en trasplantes (Rubinstein, P. y cols 1998).

La presencia de progenitores hematopoyéticos en la SCU se demostró por primera vez en 1974, gracias a

los estudios in vitro realizados por Knudtzon. Sin embargo, fue hasta el año de 1988 cuando se realizó el

primer trasplante de células progenitoras hematopoyéticas de sangre de cordón en un niño con anemia de

Fanconi utilizando la SCU de su hermana, la cual era compatible con el HLA de su hermano (Gluckman, E.

2001). Basados en el éxito de este trasplante, y en la duración del injerto, se comenzó a investigar la

posibilidad de usar células madre hematopoyéticas derivadas de SCU para trasplantar pacientes

emparentados y no-emparentados con el donante (Indrikaovs, A.J. 2002).

En comparación con la SCU, las principales limitaciones de los trasplantes de MO alogénicos son la falta

de un donante HLA compatible disponible y las complicaciones debidas a la enfermedad injerto contra

huésped que son más severas cuando hay incompatibilidad de este antígeno. Esta enfermedad, que

ocurre en el 60 a 80% de los pacientes trasplantados, es de origen inmunitario y suele ocasionar una

mortalidad del 25% asociada a infecciones. Un gran número de los pacientes trasplantados con SCU no

son completamente idénticos para los antígenos HLA. Casi un 85% de los pacientes no comparten 1 ó 2

antígenos y, sin embargo, el injerto exitoso se produce en más del 90% de este grupo. Cuando existen 3 ó

4 antígenos dispares el porcentaje de injerto disminuye; pero aún es muy alto para el grado de disparidad (

Lennard, A.L. Jackson., G.H. 2000).

Comparado con los trasplantes de MO de donantes no emparentados que necesitan una completa

identidad del HLA de los antígenos de clase I y clase II, la mayoría de los trasplantes de CMH de SCU se

han hecho con donantes que no comparten uno o dos antígenos. Los análisis clínicos muestran que, de

hecho, el factor más importante para predecir una recuperación positiva después de un trasplante de CMH

43







de SCU es que el número de células nucleadas trasplantadas sea mayor de 3 x 107 células/kg de peso (

Gluckman, E. y cols. 2001).

Las principales ventajas prácticas del uso de SCU como una fuente alternativa de células madre son: la

facilidad de obtención de la muestra, la ausencia de riesgo para los donantes, el bajo riesgo de

transmisión de enfermedades infecciosas y la disponibilidad de muestras criopreservadas en los centros

de trasplantes. Estas ventajas se reconocieron en trasplantes de SCU realizados con donantes

emparentados; luego, se establecieron bancos de SCU los cuales ya habían estandarizado el método de

recolección de la muestra, su almacenamiento, procesamiento y criopreservación para realizar trasplantes

de CMH de SCU en donantes no emparentados para el tratamiento de algunas enfermedades

hematológicas malignas y no malignas (Wadlow, R. C., Porter, D. L. 2002).

En conclusión, la SCU ha demostrado ser una fuente importante de células madre hematopoyéticas y los

resultados de los trasplantes confirman su uso como alternativa a la médula ósea. No hay riesgo para el

donante, no se produce su agotamiento y la posibilidad de transmisión de enfermedades infecciosas, es

muy baja. Por otra parte, el menor riesgo de enfermedad aguda del injerto contra el huésped podría permitir

ampliar el número disponible de donantes. Asimismo, los bancos de SCU tienen muchas ventajas

prácticas. En lugar de almacenar simplemente el tejido de un donante potencial, un banco de SCU

almacena el propio injerto. Por lo tanto, la SCU está lista para trasplantar una vez confirmada la tipificación

del HLA, pudiéndose disponer de las células según la demanda y eliminándose los retrasos que ahora

complican la búsqueda de un donante de médula ósea. Además, los bancos de SCU no dependerían de la

colaboración continua de grandes cantidades de donantes potenciales voluntarios. En el futuro, estos

bancos podrían ser un complemento para los registros de donantes de médula ósea y la SCU convertirse

en la principal fuente de CMH como alternativa al reemplazo medular.

44







3. JUSTIFICACIÓN

La sangre del cordón umbilical contiene un número apreciable de precursores hematopoyéticos

detectables por ensayos in vitro. Por esto, las células madre hematopoyéticas contenidas en la sangre de

cordón umbilical son consideradas como una fuente de progenitores hematopoyéticos en el tratamiento de

ciertas enfermedades hematológicas: Leucemias, Anemia de Fanconi, Anemia aplásica, Síndrome de

Hunter, β-talasemia, entre otras. Debido a esto, utilizar células madre hematopoyéticas derivadas de

cordón umbilical permitirá establecer líneas celulares con aplicación en investigaciones como la selección

de linaje celular y la estandarización de cultivos para reemplazo de medula ósea. Aunque la utilización de

progenitores derivados de sangre de cordón umbilical es cada vez más popular en terapias de reemplazo

medular, aún se desconoce gran parte de la distribución fenotípica de las subpoblaciones de progenitores

celulares tempranos en este tipo de tejido.

La identificación de las subpoblaciones de acuerdo a su fenotipo puede contribuir a determinar el tipo de

linaje al cual corresponde una u otra población, lo que facilitaría su manipulación para inducir procesos de

diferenciación celular y obtener cultivos ricos en progenitores unipotenciales que puedan facilitar terapias

de reemplazo medular específicas de determinadas patologías. Las características fenotípicas,

relacionadas con estados de madurez y tendencia de linaje, han sido reconocidas en médula ósea pero no

en sangre de cordón umbilical; por medio de este proyecto se esperaba determinar la distribución de

subpoblaciones de células madre más primitivas con base en la expresión de los antígenos CD34, CD38,

HLA-DR, CD13 y SSEA-4 y de esta forma iniciar la posible clasificación de subpoblaciones de

progenitores de sangre de cordón umbilical para futuros estudios de proliferación y diferenciación celular.

45







4. OBJETIVOS

4.1 OBJETIVO GENERAL:

Determinar el rango de las subpoblaciones de células madre hematopoyéticas y células madre

embrionarias a partir de sangre de cordón umbilical.

4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS:

Detectar la expresión de los antígenos de las células madre hematopoyéticas mediante anticuerpos

monoclonales para células CD34, CD38 y HLA-DR a partir de sangre de cordón umbilical utilizando

Citometría de flujo.

Identificar la expresión de los antígenos de células madre embrionarias CD13 y SSEA-4 de sangre de

cordón umbilical utilizando Citometría de flujo en células CD34-.

Obtener el recuento relativo (%) y el recuento absoluto (número de células/mL) de las subpoblaciones

de células madre hematopoyéticas y embrionarias a partir de sangre de cordón umbilical.

46







5. MATERIALES Y MÉTODOS

5.1 TIPO DE DISEÑO: Estudio descriptivo.

5.1.1 POBLACIÓN

Universo: Mujeres entre 18 y 37 años de edad en estado de gravidez normal a término (38-40 semanas

de gestación).

Estudio: 80 mujeres entre 18 y 37 años de edad en estado de gravidez normal a término (38-40

semanas de gestación) que asistían al servicio de Gineco-Obstetricia del Hospital Universitario San

Ignacio y que cumplían con las siguientes condiciones:

Edad entre 18 y 37 años.

Participación voluntaria con aceptación y firma del consentimiento informado para la donación

voluntaria de sangre de cordón umbilical en el que se explicaba que la toma de la muestra no

representaba ningún riesgo ni para la madre ni para el recién nacido y que esta muestra sería

utilizada con fines de investigación, bajo las normas éticas pertinentes (Ver Anexo 1).

Ausencia de embarazos ectópicos *.

Ausencia de abortos o embarazos de alto riesgo según clasificación del Gineco-obstetra *.

Ausencia de diabetes gestacional *.

Ausencia de marcadores positivos para TORCH (Toxoplasma, Rubéola, Citomegalovirus,

Herpes), sífilis y otras enfermedades infecciosas (HIV, Hepatitis B, Hepatitis C) *.

Ausencia de antecedentes de enfermedades congénitas en embarazos previos *.

*Datos obtenidos a partir de las Historias Clínicas de las pacientes.

5.1.2 TAMAÑO DE LA MUESTRA

Se recogieron 80 muestras de sangre de cordón umbilical. Para el cálculo del tamaño de la muestra se

utilizó una fórmula para la estimación puntual de la media con un error tipo I de 0.05 y un error tipo II de 0.20.

La desviación estándar de la población conocida era 6 (Mayani, H., Lansdorp, P. M. 1998).

5.1.3 VARIABLES DEL ESTUDIO

Las variables que se tuvieron en cuenta en este estudio fueron los antígenos de superficie CD34, CD38 y

HLA-DR para las células madre hematopoyéticas y los antígenos CD34, CD13 y SSEA-4 para las células

madre embrionarias a partir de la población de células que tienen baja complejidad y tamaño variable.

5.2 MÉTODOS

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FLUJOGRAMA SECUENCIA METODOLÓGICA

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5.2.1 RECOLECCIÓN DE LA MUESTRA

Para recolectar las 80 muestras de sangre de cordón umbilical, se utilizó el procedimiento descrito a

continuación: Después del parto y antes de la expulsión de la placenta, el médico pinzaba el cordón

umbilical a 5 cm del ombligo del recién nacido con dos pinzas para luego cortar el cordón umbilical entre

las pinzas. La pinza que quedaba en el cordón umbilical unido a la placenta se abría dejando que la sangre

fluyera espontáneamente para recolectar un (1) tubo con anticoagulante EDTA hasta obtener 5 mL

(volumen indicado) de la sangre del cordón umbilical (Figura 12). Las muestras de sangre de cordón

umbilical de los partos por cesárea fueron tomada bajo estrictas condiciones de esterilidad. Estas

muestras eran transportadas a temperatura ambiente y en oscuridad hasta el Laboratorio de Hematología

para su procesamiento.

49







5.2.2 DETERMINACIÓN AUTOMATIZADA DEL NÚMERO DE LEUCOCITOS EN SANGRE DE

CORDÓN UMBILICAL

Con el fin de obtener el recuento absoluto de las subpoblaciones de células madre de sangre de cordón

umbilical, se realizó el recuento total de leucocitos de las muestras por medio del analizador hematológico

Coulter Microdiff 18.

5.2.3 CORRECCIÓN DEL NÚMERO DE LEUCOCITOS EN SANGRE DE CORDÓN UMBILICAL

Para obtener el recuento real de leucocitos y así utilizar este resultado para obtener recuentos absolutos de

las subpoblaciones de células madre de sangre de cordón umbilical, se realizó un extendido y coloración

de Wright de cada una de las muestras para eliminar el número de normoblastos. El número real de

leucocitos se calculó por la fórmula:

Recuento de leucocitos X 100

Leucocitos Reales = ___________________________________

Normoblastos (en 100 leucocitos) + 100

5.2.4 INMUNOFENOTIPIFICACIÓN DE CÉLULAS MADRE HEMATOPOYÉTICAS Y CÉLULAS

MADRE EMBRIONARIAS DERIVADAS DE SANGRE DE CORDÓN UMBILICAL

La citometría de flujo es una técnica que utiliza anticuerpos monoclonales marcados con fluorocromos,

capaz de proporcionar resultados de forma rápida que pueden ser aplicables en investigación. Gracias a

su especificidad es capaz de distinguir entre varias poblaciones celulares diferentes y detectar una

población celular determinada en una muestra en la que predominan otras poblaciones celulares teniendo

como base las características intrínsecas (tamaño y complejidad) y antigénicas (inmunofenotipo) de las

células (Current Protocols in Cytometry. 1999).

Los anticuerpos monoclonales utilizados en este estudio se relacionan a continuación:

PANEL DE ANTICUERPOS PARA CÉLULAS MADRE HEMATOPOYÉTICAS

ANTICUERPOS

Mouse Anti-Human CD34-FITC MoAb Catálogo 555821 (BD-PhM)

Mouse Anti-Human CD38-Cy5 MoAb Catálogo 555461 (BD-PhM)

Mouse Anti-Human HLA-DR-PE MoAb Catálogo 347367 (BD)

CONTROL DE ISOTIPO

FITC Mouse IgG1 MoAb Catálogo 555748 (BD-PhM)

Cy-Chrome5 Mouse IgG1 MoAb Catálogo 555750 (BD-PhM)

PE Mouse IgG2a MoAb Catálogo 349053 (BD)

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PANEL DE ANTICUERPOS PARA CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS

ANTICUERPO

Mouse Anti-Human CD34-FITC MoAb Catálogo 555821 (BD-PhM)

Mouse Anti-Human CD13-APC MoAb Catálogo 557454 (BD-PhM)

Mouse Anti-Human SSEA-4(R&D)-Rat Anti-Mouse IgG1-PE MoAb Catálogo 340270

(BD)

CONTROL DE ISOTIPO

FITC Mouse IgG1 MoAb Catálogo 555748 (BD-PhM)

APC Mouse IgG1 MoAb Catálogo 555751 (BD-PhM)

PE Rat Anti-Mouse IgG1 MoAb Catálogo 340270 (BD)

BD: Becton Dickinson PhM: PharMingen R&D: R&D System

Para cada muestra de sangre de cordón umbilical se utilizaron 3 tubos de citometría marcados como: tubo

No 1 (Control de Isotipo), tubo de No 2 (Células Madre Hematopoyéticas), tubo No 3 (Células Madre

Embrionarias). El procedimiento inició adicionando al tubo No 3: 70µL de sangre de cordón umbilical y

10µL del anticuerpo anti-SSEA-4, se incubó por 30 minutos a 4°C en oscuridad, luego de este tiempo al

tubo No 3 se agregó 20µL del anticuerpo Rat-AntiMouse IgG1 (PE) y simultáneamente al tubo No1 (Control

de Isotipo) se adicionó 70µL de sangre de cordón umbilical más 5µL del anticuerpo Rat-AntiMouse IgG1

(PE), se llevaron a incubar en las mismas condiciones que el anterior; transcurrido este tiempo se lavaron

las células con 2mL de PBS 1X por 5 minutos a 1800 rpm. Después del lavado al tubo No 1 se adicionaron

5µL de los controles de isotipo: FITC Mouse IgG1, Cy-Chrome5 Mouse IgG1, PE Mouse IgG2a y APC

Mouse IgG1. En el tubo No 2 se adicionaron 70µL de sangre de cordón umbilical y 10µL del anticuerpo

anti-CD34 (FITC), 5µL de anti-CD38 (Cy5) y 5µL de anti-HLA-DR (PE). En el tubo No 3 se adicionaron

10µL del anticuerpo anti-CD34 (FITC) y 5µL del anticuerpo anti-CD13 (APC), se llevaron a incubación por

30 minutos a 4°C en oscuridad. Al cumplirse el tiempo de incubación, se preparaba el buffer de lisis (50µL

de solución de lisis 10X + 450µL de agua MiliQ para cada tubo), luego se agregaban 500µL del buffer en

cada uno, se realizaba vórtex y se llevaban a incubación por 15 minutos a temperatura ambiente en

oscuridad; luego de la lisis, se realizaban 2 lavados de las células con 4 y 3mL de buffer de citometría (PBS

Azida de Sodio al 0.1% pH: 7.2 - 7.4) respectivamente y se procedía a fijar las células con 500µL de buffer

de fijación (PBS Paraformaldehído 0.5% pH: 7.2 - 7.4) . Por último, se realizaba la lectura y análisis de las

muestras en el citómetro de flujo FACS Calibur Becton Dickinson Software Cell Quest (Figura 13).

51







5.3 ASPECTOS ÉTICOS

El estudio se realizó teniendo en cuenta la normatividad ética enunciada en la resolución 008430 capítulo

IV de 1993 expedida por el Ministerio de Salud sobre “LA INVESTIGACIÓN EN MUJERES EN EDAD

FÉRTIL, EMBARAZADAS, DURANTE EL TRABAJO DE PARTO, PUERPERIO, LACTANCIA Y RECIÉN

NACIDOS; DE LA UTILIZACIÓN DE EMBRIONES, OBITOS Y FETOS Y DE LA FERTILIZACIÓN

ARTIFICIAL”.

6. ANÁLISIS DE DATOS

Hipótesis

La proporción mediana de las Subpoblaciones de células madre hematopoyéticas en las muestras

analizadas es mayor al 0.2%.

Ho: Mediana <= 0.2

Hi: Mediana > 0.2

Para poder realizar la prueba de hipótesis se debía probar la normalidad de los datos con el test de

52







Shapiro WilK; según este test los datos no se distribuyeron normalmente (p<0.05), por esto fue necesario

aplicar una prueba de hipótesis no paramétrica, en este caso se aplicó el test de la mediana en el

programa Statistix 6.0.

6.1 ANÁLISIS GRÁFICO DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS EN EL CITÓMETRO FACS CALIBUR

BECTON DICKINSON PROGRAMA CELL QUEST

Para determinar el rango de las subpoblaciones presentes en cada muestra de sangre de cordón umbilical

fueron adquiridos 50.000 eventos en el programa Cell Quest. La población analizada se escogió con base

en las características de tamaño y complejidad de las células (Forward y Side Scatter) siendo ésta la de

tamaño variable y baja complejidad (Región 1) Los cuadrantes fueron definidos usando controles de

isotipo. (Hao, Q. L. y cols. 1995. D´Arena, G. y cols. 1996) (Figura 14).

La co-expresión de los antígenos CD34, CD38 y HLA-DR para las células madre hematopoyéticas se

determinó así: el antígeno CD34 junto con el SSC (Región 2 Figura 15) se tomaron como referencia para

mirar la co-expresión de los antígenos CD38 y HLA-DR en las células madre hematopoyéticas (Figura 16).

53







54







Para las células madre embrionarias se tomó como referencia la expresión del antígeno SSEA-4 junto con

el SSC (región 3 - Figura 17) para determinar si en la sangre de cordón umbilical se encontraban células

que co-expresaran los antígenos SSEA-4 y CD13 pero que no expresaran el antígeno CD34 (Figura 18).

55







56







6.2 ANÁLISIS NUMÉRICO DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS EN EL CITÓMETRO FACS

CALIBUR BECTON DICKINSON PROGRAMA CELL QUEST

De acuerdo a la expresión de los antígenos CD34, CD38 y HLA-DR se encontraron cuatro subpoblaciones

de células madre hematopoyéticas similares a las que se han reportado en la médula ósea con los

siguientes inmunofenotipos (Figura 19):

Subpoblación 1: CD34+ CD38- HLA-DR-

Subpoblación 2: CD34+ CD38+ HLA-DR-

Subpoblación 3: CD34+ CD38- HLA-DR+

57







Subpoblación 4: CD34+ CD38+ HLA-DR+

Figura 19: Subpoblaciones de Células Madre Hematopoyéticas de Sangre de Cordón Umbilical

Para cada una de las subpoblaciones de células madre hematopoyéticas se calcularon los intervalos de

confianza obteniéndose:

IC 95% Subpoblación CD34+ CD38- HLA-DR- : (0.0153 ; 0.0234)

IC 95% Subpoblación CD34+ CD38+ HLA-DR- : (0.0191 ; 0.0296)

IC 95% Subpoblación CD34+ CD38- HLA-DR+ : (0.0427 ; 0.0676)

IC 95% Subpoblación CD34+ CD38+ HLA-DR+ : (0.2427 ; 0.5117)

7. RESULTADOS

El total de muestras analizadas fue de 78, ya que dos de ellas se coagularon al momento de la toma. El

valor mínimo de la proporción de las subpoblaciones de células madre hematopoyéticas en sangre de

cordón umbilical fue de 0.03% y el valor máximo de 1.82% con una mediana de 0.28% (Pt25; 75).

A partir de los datos obtenidos, se puede afirmar que existe evidencia estadísticamente significativa para

decir que la mediana de la proporción de las subpoblaciones de células madre hematopoyéticas en las

muestras analizadas es mayor a 0.2%. p=0.0010 (Figura 20).

RANGO DE SUBPOBLACIONES DE CÉLULAS MADRE HEMATOPOYÉTICAS DERIVADAS DE SANGRE DE CORDÓN

UMBILICAL

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

CD34 + CD38 - HLA-DR -

CD34 + CD38 + HLA-DR -

CD34 + CD38 - HLA-DR +

CD34 + CD38 + HLA-DR +

SUBPOBLACIONES

INT

ER

VA

LO

S %

Figura 20: Rango de Subpoblaciones de Células Madre Hematopoyéticas derivadas de Sangre de Cordón Umbilical

En cuanto a la expresión de los antígenos CD13 y SSEA-4 de las 78 muestras de Sangre de Cordón

Umbilical analizadas solo se encontraron 8 muestras que mostraron resultado positivo para la expresión de

estos marcadores, sin embargo como aún no existen datos con respecto a esta población de células en

Sangre de Cordón Umbilical no se puede descartar la posibilidad de encontrar células con características

embrionarias en este tejido.

58







8. DISCUSIÓN

La presencia de Células Madre Hematopoyéticas en Sangre de Cordón Umbilical fue demostrada en 1974

por Knutzon. Sin embargo, fue diez años más tarde que Ogawa y sus colaboradores documentaron la

presencia de progenitores hematopoyéticos en Sangre de Cordón Umbilical. Desde entonces, se ha

incrementado el interés en el uso de la Sangre de Cordón Umbilical como un recurso alternativo para

obtener Células Madre Hematopoyéticas diferente a la Médula Ósea que es la fuente tradicional (Mayani,

H., Lansdorp, P. M. 1998).

Se ha encontrado que la molécula CD34 es expresada en la mayoría de las Células Madre

Hematopoyéticas, por lo que se ha convertido en el principal marcador para su caracterización. La

frecuencia de este antígeno en SCU ha sido estimada entre el 0.2% y el 1% del total de las células de la

SCU (D´Arena, G. y cols. 1996), lo que concuerda con los resultados obtenidos en este estudio en donde

la proporción es mayor del 0.2% (p= 0.0010).

Muchos estudios han demostrado que las células CD34+ de MO y de SCU son heterogéneas y contienen

una gran variedad de células madre que se encuentran en diferentes estadíos. Hao y sus colaboradores

encontraron que la subpoblación de CMH CD34+ CD38- es muy primitiva teniendo como base el estado

del ciclo celular en el que se encuentran las células y en su capacidad de proliferación in vitro. Traycoff

reportó que la población CD34+ HLA-DR+ en SCU es más primitiva que la población CD34+ HLA-DR-, en

contraste con los hallazgos en MO adulta en donde las células más primitivas son las células CD34+

HLA-DR- (Hao, Q. L. y cols. 1995). Existe controversia acerca de la co-expresión de los antígenos CD34 y

HLA-DR ya que aunque la población de CMH más primitiva en SCU son las que co-expresan CD34 y

HLA-DR, se ha encontrado una población de células con el fenotipo CD34+ HLA-DR (Thoma, S. J. y cols.

1994).

A pesar de que se han realizado varios estudios acerca del inmunofenotipo de las CMH con base en la

expresión de los antígenos CD34/CD38 y CD34/HLA-DR; hasta el momento se desconocían los fenotipos

de las CMH de SCU que relacionaran los tres antígenos. Siendo éste el primer estudio acerca de las

Subpoblaciones de CMH en SCU con base en la expresión de los antígenos CD34, CD38 y HLA-DR, se

encontraron cuatro Subpoblaciones de CMH, similares a las que se reportan en la MO y que corresponden

a los fenotipos: CD34+ CD38- HLA-DR-, CD34+ CD38-HLA-DR+, CD34+ CD38+ HLA-DR- y CD34+

CD38+ HLA-DR+. El rango de cada una de estas Subpoblaciones es diferente, encontrándose que las

células con el fenotipo CD34+ CD38+ HLA-DR+ están en mayor proporción con relación a las otras tres

Subpoblaciones. Debido a que para este estudio se calcularon los intervalos de confianza de cada una de

las Subpoblaciones y siendo los datos muy variables, no se determinaron los recuentos relativos (%) y

absolutos (células/mL) de cada una de las Subpoblaciones encontradas.

59







Los estudios sobre Células Madre Embrionarias sólo se pueden realizar a partir de las células

provenientes de la etapa de blastocisto, lo que implica la manipulación de embriones; esto tiene una gran

connotación ética, razón por la cual los investigadores están tratando de encontrar otras fuentes de estas

células como la MO. Verfaillie recientemente documentó la presencia de una población de células madre

en MO con un comportamiento similar al de las CME, las cuales expresan altos niveles de los antígenos

CD13 y SSEA-4, a las cuales denominaron “MAPCs”. Hasta el momento no existen reportes acerca de la

existencia de estas células en SCU, lo que motivó la búsqueda de células madre con características

embrionarias conjuntamente con la identificación de cada una de las Subpoblaciones de CMH derivadas

de SCU, por ser ésta una muestra de fácil obtención que puede manejarse con menos implicaciones éticas

y por lo que permitiría avanzar más en las investigaciones acerca de las células progenitoras de SCU como

alternativa en tratamientos relacionados con terapia génica. En este estudio sólo se encontró la expresión

de los antígenos CD13 y SSEA-4 en 8 de las 78 muestras analizadas, lo cual indica que posiblemente esta

población si se encuentre en SCU pero es necesario explorar la expresión de otros antígenos y aumentar la

cantidad mínima de eventos leídos en Citometría para conseguir resultados más representativos.

La caracterización fenotípica de las Subpoblaciones de Células Madre Hematopoyéticas y el hallazgo de

Células Madre Embrionarias en Sangre de Cordón Umbilical es el estudio que da inicio a la línea de

investigación sobre la biología de las Células Madre que permitirá establecer protocolos para el

aislamiento, purificación y cultivo de estas poblaciones celulares que más adelante podrán ser utilizadas

en como alternativa terapéutica de reemplazo medular.

60







9. CONCLUSIONES

El rango de las células madre hematopoyéticas CD34+ se encuentra entre el 0.2% y 1% del total de células

en sangre de cordón umbilical, lo que coincide con lo reportado en la literatura.

En sangre de cordón umbilical se presentan cuatro Subpoblaciones de células madre hematopoyéticas

que corresponden a los fenotipos: CD34+ CD38- HLA-DR-; CD34+ CD38+ HLA-DR-; CD34+ CD38-

HLA-DR+; CD34+ CD38+ HLA-DR+ similares a los que se encuentran reportados en médula ósea.

La subpoblación de células madre hematopoyéticas que se encuentra en mayor proporción en sangre de

cordón umbilical corresponde al fenotipo CD34+ CD38+ HLA-DR+.

Es posible que exista en sangre de cordón umbilical una población de células primitivas que expresan

antígenos embrionarios.

61







10. RECOMENDACIONES

Para estudios posteriores se recomienda para las células madre embrionarias ampliar el tamaño de la

muestra, realizar el cálculo para obtener el número mínimo de células que se deben leer en Citometría para

antígenos embrionarios y ampliar el panel de anticuerpos para la detección de antígenos embrionarios

(TRA-1-60, TRA-1-81, CD133 y CD90).

62







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12. ANEXOS

Anexo 1: Consentimiento Informado para la Donación Voluntaria de Sangre de Cordón Umbilical.

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CONSENTIMIENTO INFORMADO PARA LA DONACIÓN VOLUNTARIA DE SANGRE DE CORDÓNUMBILICAL

Todos los años, miles de personas desarrollan una enfermedad grave de la médula ósea como leucemiaso nacen con alteraciones genéticas que comprometen su capacidad y calidad de vida. Para ellos, laterapia más frecuente es un trasplante de médula ósea, sin embargo, la realización de un trasplante demédula es económicamente costoso y es muy difícil de encontrar donantes compatibles. En la sangre delcordón umbilical se encuentran células primitivas de las cuales se pueden obtener células sanguíneas quepodrían llegar a utilizarse en futuros trasplantes después de realizar investigaciones exhaustivas sobre sucomportamiento.

Para llevar a cabo esta tarea se necesita la colaboración de muchas personas, por lo que les proponemossu participación, aceptando donar desinteresadamente sangre del cordón umbilical, después delnacimiento de su hijo, esto con el fin de contribuir a las investigaciones de interés terapéutico acerca de lasangre de cordón umbilical.

La sangre del cordón umbilical se recoge después del nacimiento del niño y tras el corte del cordónumbilical; este procedimiento es de rutina durante el parto y será realizado por personal especializado(médico y/o enfermera jefe). Es muy importante que tenga en cuenta que LA TOMA DE LA MUESTRA DESANGRE DE CORDÓN UMBILICAL NO REPRESENTA NINGÚN PELIGRO NI PARA LA MADRE NIPARA EL BEBE.

La sangre del cordón umbilical será empleada con fines de investigación y será manipulada bajo lanormatividad ética enunciada en la resolución 008430 capítulo IV de 1993 expedida por el Ministerio deSalud.

CONFIDENCIALIDAD: Los registros médicos de cada individuo permanecerán archivados en el Institutode Genética Humana y el Laboratorio de Hematología. Las historias médicas, los resultados de exámenesy la información que usted nos ha dado son de carácter absolutamente confidencial, de manera que,solamente usted y el equipo de atención clínica tendrán acceso a estos datos. Por ningún motivo sedivulgará esta información sin su consentimiento.

Cualquier información adicional usted puede obtenerla de los investigadores, o directamente con:

_____________________________ ______________________Instituto de Genética Humana Laboratorio de HematologíaTel. (91)3208320 Ext. 27__ ó 27__ Tel. (91)3208320 Ext. 4025

PROCEDIMIENTO:

Se realizará una entrevista clínica inicial y se procederá a tomar una muestra de sangre deaproximadamente 30 mL luego del corte del cordón umbilical. Estas muestras serán manejadasúnicamente por personas involucradas en el equipo de atención clínica.

CONSENTIMIENTO INFORMADO PARA LA DONACIÓN VOLUNTARIA DE SANGRE DE CORDÓNUMBILICAL

Yo ________________ (madre) identificada con número de cédula de ciudadanía _________ y mi esposo__________ (padre) identificado con número de cédula de ciudadanía _________ declaramos que:

Entendemos que la sangre de cordón umbilical será utilizada con fines de investigación y serámanejada bajo las normas éticas pertinentes.

Entendemos que la información referente a nosotros y a la de nuestro hijo(a) será manejada de formaconfidencial para proteger nuestra identidad.

Entendemos que no recibiremos ninguna compensación económica ni de ningún otro tipo por ladonación.

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Entendemos que la donación de sangre de cordón umbilical NO representa ningún peligro ni para lamadre ni para el bebe.

Hemos leído y comprendido toda la información entregada, estamos satisfechos de la informaciónrecibida, hemos podido formular todas las preguntas que hemos creído convenientes y nos hanaclarado todas las dudas planteadas.

En consecuencia, damos nuestro consentimiento para la donación voluntaria de la sangre del cordónumbilical de nuestro hijo/a en el momento del parto:

Madre Padre

____________ ___________Nombre: Nombre:CC: CC:Huella de la Madre Huella del Padre

Teléfono del domicilio: _______________

FECHA: _________________

BENEFICIOS ADICIONALES:

La utilización de la muestra en estudios posteriores nos podría ayudar en el futuro a entender las causas y/oel comportamiento de la(s) entidad(es) anteriormente mencionada(s). Se puede dar el caso en dondeusted y su familia no se beneficien directamente de estos estudios, pero tanto su familia como otrosindividuos afectados podrían beneficiarse. Por lo tanto, por favor marque su decisión con respecto alalmacenamiento de la muestra y su utilización en estudios de investigación posteriores:

ð Deseo que la muestra que me fue extraída sea DESECHADA una vez completado el estudio.

ð Autorizo conservar la muestra que me fue extraída con la posibilidad de emplearla junto con el resultadodel estudio, en las situaciones señaladas a continuación:

En estudios complementarios de diagnóstico para mi o algún miembro de mi familia: ð SI NO

En estudios de investigación específicos para la(s) entidad(es), objeto de esta toma de muestra,siempre y cuando se conserve en anonimato mis datos de identificación: ð SI NO

En estudios de investigación de entidades distintas a la(s) entidad(es) objeto de esta toma de muestra,siempre y cuando se conserve en anonimato mis datos de identificación: ð SI NO

En estudios de investigación colaborativos con otras instituciones nacionales y/o internacionales,siempre y cuando exista acuerdo interinstitucional previo, aprobación del comité de ética y seconserve en anonimato mis datos de identificación: ð SI NO

AUTORIZACIÓN PARA LA TOMA DE MUESTRAS Y REALIZACIÓN VOLUNTARIA DEL ESTUDIO:

Yo, ____________________ identificado con documento de identificación: No. ___________ de___________, acepto voluntariamente que se me tome una muestra de ____________, con el fin derealizar análisis de ______________________________________.Así mismo, declaro que se me ha explicado la no presencia de riesgos mayores y el manejo que se le dará

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al material de muestra.Firma ______________________ Acudiente______________ CC (Testigo) CC.

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DETERMINACIÓN FENOTÍPICA DE SUBPOBLACIONES DE CÉLULAS MADRE DERIVADAS DE SANGRE DE CORDÓNUMBILICAL

Contreras, Lucía*. Cuspoca, Lyda*. Cuellar, Adriana**. Mercado, Marcela**. Rodríguez, Viviana**.

*Estudiantes X Semestre Bacteriología. **Docentes Departamento MicrobiologíaPontificia Universidad Javeriana

RESUMENLa Sangre de Cordón Umbilical Humana (SCU) es una de las fuentes alternativas a la Médula Ósea (MO) y Sangre Periférica(SP) para la obtención de Células Madre hematopoyéticas (CMH). Estas células han sido caracterizadas fenotípicamenteencontrándose que la mayoría de éstas expresan el antígeno CD34 y pueden o no expresar los antígenos CD38 y HLA-DR. Coneste estudio se esperaba encontrar una proporción de CMH mayor al 0.2%, determinar las Subpoblaciones de éstas célulaspresentes en SCU y buscar células con características embrionarias que co-expresaran los antígenos CD13 y SSEA-4. Elestudio se realizó con 80 mujeres en estado de gravidez normal a término que asistían al servicio de Gineco-Obstetricia delHospital Universitario San Ignacio previa firma de un consentimiento informado y que cumplieran ciertos criterios de inclusión.Utilizando anticuerpos monoclonales para los antígenos CD34, CD38 y HLA-DR se encontró que en la SCU existen cuatroSubpoblaciones de CMH con los fenotipos CD34+ CD38- HLA-DR-, CD34+ CD38+ HLA-DR-, CD34+ CD38- HLA-DR+ y CD34+CD38+ HLA-DR+ siendo esta última la de mayor proporción y que el total de células CD34+ era mayor al 0.2%. Adicionalmente,se determinó la expresión de los antígenos CD13 y SSEA-4 por el mismo método, encontrándose ocho muestras positivas paraestos marcadores lo cual indica que posiblemente se encuentre en SCU una población celular con características similares alas Células Madre Adultas (MAPCs) descritas en MO. La caracterización fenotípica de las Células Madre presentes en la SCUes el primer paso para conocer la distribución de las poblaciones de éstas células y utilizarlas en el futuro como alternativaterapéutica de reemplazo medular.

Palabras Clave. Célula Madre Hematopoyética, Célula Madre Embrionaria, Célula Madre Adulta (MAPCs), Sangre de CordónUmbilical.

ABSTRACTHuman Umbilical Cord Blood (UCB) is one of alternative sources to Bone Marrow (BM) and Peripheral Blood (PB) for theobtaining of Hematopoietic Stem Cells (HSC). These cells have been characterized phenotypically being that most of these theyexpress the CD34 antigen and they can or can not to express the CD38 and HLA-DR antigens. With this study one hope to finda greater proportion of HSC 0.2%, to determine the subpopulations of these present cells in UCB and to look cells withembryonic characteristics that co- expressed the CD13 and SSEA-4 antigens. The study was made with 80 woman in state ofnormal pregnancy that they attended in the Gineco-Obstetrics Service of Hospital Universitario San Ignacio previous signature ofan informed consent and who they fulfilled certain inclusion criteria. Using monoclonal antibodies for antigens CD34, CD38 andHLA-DR it was found four subpopulations of HSC with the phenotypes CD34+ CD38- HLA-DR -, CD34+ CD38+ HLA-DR -,CD34+ CD38- HLA-DR+ and CD34+ CD38+ HLA-DR+ being this last the one of greater proportion and than the total of cellsCD34+ was greater to the 0.2%. Additionally, the expresión of CD13 and SSEA-4 antigens was determine by the same method,being eight positive samples for these markers which indicates that in UCB exist a cellular population with characteristics similarto MAPCs described in BM. The phenotype characterization of the present Stem Cells in the UCB is the first step to know thedistribution of the populations of these cells and to use them in the future like therapeutic alternative in medular replacement.

Key Words. Hematopoietic Stem Cell, Embryonic Stem Cell, Adult Stem Cell (MAPCs), Umbilical Cord Blood.

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INTRODUCCIÓN

Una célula madre es una célula que posee la capacidad de replicarse y diferenciarse dando lugar a diversos tipos de célulasespecializadas. Las células madre se pueden clasificar según su potencial de diferenciación en células totipotenciales que soncapaces de diferenciarse en tejido embrionario y extraembrionario; las células pluripotenciales que dan origen a célulasprocedentes de cualquiera de las tres capas embrionarias, las células multipotenciales, que son capaces de diferenciarse adistintos tipos celulares procedentes de la misma capa embrionaria y las células unipotenciales que dan origen a células de unlinaje específico1.

Existen diferentes tipos de células madre presentes en la médula ósea (MO). Una de las células madre más importantes en lamédula ósea son las células madre hematopoyéticas, las cuales poseen características fenotípicas y procesos dediferenciación celular particulares2.

La mayoría de las HSC en humanos expresan el antígeno CD34, una proteína integral de membrana de 90-120 kD. Estamolécula funciona como regulador en la adhesión de las células madre hematopoyéticas al estroma medular. La cantidad decélulas CD34+ en MO adulta ha sido estimada entre 1-3% del total de las células nucleadas mientras que en la SCU es del0.2-1% 3.

Las subpoblaciones de las células CD34+ pueden identificarse gracias a la expresión de marcadores de superficie diferentes alCD34 como los antígenos CD38 y HLA-DR y de acuerdo a ellos se puede determinar en que estado de diferenciación seencuentra la célula4. La molécula CD38 es una glicoproteína de membrana que juega un papel importante en los procesos deproliferación y activación celular5; por otro lado, la expresión del antígeno HLA-DR es expresado en casi todas las células de lostejidos y es responsable de la respuesta inmune del individuo a antígenos extraños6.Las células madre embrionarias (ES) se derivan de células totipotenciales provenientes de embriones de diferentes especies7 ytienen la capacidad de mantenerse indefinidamente en cultivos como células indiferenciadas y con la capacidad de formardiferentes tipos celulares8. Recientemente se ha identificado en la médula ósea una población celular llamada MAPC(Multipotent Adult Stem Cells) que han sido descritas como células pluripotenciales con una capacidad de diferenciación similara las células madre embrionarias y que expresan altos niveles de CD13 (característico de progenitores mieloides) y SSEA-4(característicos de células madre embrionarias)9.

MATERIALES Y MÉTODOS

La población de estudio fueron 80 mujeres en estado de gravidez normal a término que asistían al servicio de Gineco-Obstetriciadel Hospital Universitario San Ignacio y que cumplían con las condiciones: Edad entre 18 y 37 años, participación voluntaria conaceptación y firma del consentimiento informado para la donación voluntaria de SCU, ausencia de embarazos ectópicos ,ausencia de abortos o embarazos de alto riesgo*, ausencia de diabetes gestacional*, ausencia de marcadores positivos paraTORCH, sífilis y otras enfermedades infecciosas (HIV, Hepatitis B, Hepatitis C)*, ausencia de antecedentes de enfermedadescongénitas en embarazos previos *. (*Datos obtenidos a partir de las Historias Clínicas de las pacientes). Las variables que setuvieron en cuenta en este estudio fueron la expresión de los antígenos de superficie CD34, CD38 y HLA-DR para las célulasmadre hematopoyéticas y los antígenos CD34, CD13 y SSEA-4 para las células madre embrionarias a partir de la población decélulas que tenían baja complejidad y tamaño variable.

Para recolectar las 80 muestras de sangre de cordón umbilical, se utilizó el procedimiento descrito a continuación: Después delparto y antes de la expulsión de la placenta, el médico pinzaba el cordón umbilical a 5 cm del ombligo del recién nacido con dospinzas para luego cortar el cordón umbilical entre las pinzas. La pinza que quedaba en el cordón umbilical unido a la placenta seabría dejando que la sangre fluyera espontáneamente para recolectar un (1) tubo con anticoagulante EDTA hasta obtener 5 mL(volumen indicado) de la sangre del cordón umbilical. Las muestras de sangre de cordón umbilical de los partos por cesáreafueron tomadas bajo estrictas condiciones de esterilidad. Estas muestras eran transportadas a temperatura ambiente y enoscuridad para su procesamiento en el laboratorio.

Con el fin de obtener el recuento absoluto de las subpoblaciones de células madre de sangre de cordón umbilical, se realizó elrecuento total de leucocitos de las muestras por medio del analizador hematológico Coulter Microdiff 18. Para obtener elrecuento real de leucocitos y así utilizar este resultado para obtener recuentos absolutos de las subpoblaciones de célulasmadre de sangre de cordón umbilical, se realizó un extendido y coloración de Wright de cada una de las muestras para eliminarel número de normoblastos.

Para cada muestra de SCU se utilizaron 3 tubos de citometría marcados como: tubo No 1 (Control de Isotipo), tubo de No 2(Células Madre Hematopoyéticas), tubo No 3 (Células Madre Embrionarias). El procedimiento inició adicionando al tubo No 3:70µL de SCU y 10µL del anticuerpo anti-SSEA-4, se incubó por 30 minutos a 4°C en oscuridad, luego de este tiempo al tubo No3 se agregó 20µL del anticuerpo Rat-AntiMouse IgG1 (PE) y simultáneamente al tubo No1 (Control de Isotipo) se adicionó 70µLde SCU más 5µL del anticuerpo Rat-AntiMouse IgG1 (PE), se llevaron a incubar en las mismas condiciones que el anterior;transcurrido este tiempo se lavaron las células con 2mL de PBS 1X por 5 minutos a 1800 rpm. Después del lavado al tubo No 1se adicionaron 5µL de los controles de isotipo: FITC Mouse IgG1, Cy-Chrome5 Mouse IgG1, PE Mouse IgG2a y APC MouseIgG1. En el tubo No 2 se adicionaron 70µL de SCU y 10µL del anticuerpo anti-CD34 (FITC), 5µL de anti-CD38 (Cy5) y 5µL deanti-HLA-DR (PE). En el tubo No 3 se adicionaron 10µL del anticuerpo anti-CD34 (FITC) y 5µL del anticuerpo anti-CD13 (APC),se llevaron a incubación por 30 minutos a 4°C en oscuridad. Al cumplirse el tiempo de incubación, se preparaba el buffer de lisis(50µL de solución de lisis 10X + 450µL de agua MiliQ para cada tubo), luego se agregaban 500µL del buffer en cada uno, se

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realizaba vórtex y se llevaban a incubación por 15 minutos a temperatura ambiente en oscuridad; luego de la lisis, se realizaban2 lavados de las células con 4 y 3mL de buffer de Citometría (PBS Azida de Sodio al 0.1%) respectivamente y se procedía a fijarlas células con 500µL de buffer de fijación (PBS Paraformaldehído 0.5%). Por último, se realizaba la lectura y análisis de lasmuestras en el Citómetro de flujo FACS Calibur Becton Dickinson Software Cell Quest.

El estudio se realizó teniendo en cuenta la normatividad ética enunciada en la resolución 008430 capítulo IV de 1993 expedidapor el Ministerio de Salud sobre “LA INVESTIGACIÓN EN MUJERES EN EDAD FÉRTIL, EMBARAZADAS, DURANTE ELTRABAJO DE PARTO, PUERPERIO, LACTANCIA Y RECIÉN NACIDOS; DE LA UTILIZACIÓN DE EMBRIONES, OBITOS YFETOS Y DE LA FERTILIZACIÓN ARTIFICIAL”.

Para determinar el rango de las subpoblaciones presentes en cada muestra de sangre de cordón umbilical fueron adquiridos50.000 eventos en el programa Cell Quest en el Citómetro FACS Calibur Becton Dickinson. La población analizada se escogiócon base en las características de tamaño y complejidad de las células (Forward y Side Scatter) siendo ésta la de tamañovariable y baja complejidad (Región 1) Los cuadrantes fueron definidos usando controles de isotipo10,11 (Figura 1).

Figura 1: Región 1La co-expresión de los antígenos CD34, CD38 y HLA-DR para las células madre hematopoyéticas se determinó así: loscuadrantes se determinaron usando controles de isotipo (Figura 2A-2C), el antígeno CD34 junto con el SSC (Región 2 Figura2B) se tomaron como referencia para mirar la co-expresión de los antígenos CD38 y HLA-DR en las células madrehematopoyéticas (Figura 2D).

A B C DFigura 2. A: Control Isotipo FITC.

B: Región 2. C: Control Isotipo Cy-PE. D: Co-expresión de Antígenos CD38/HLA-DRPara las células madre embrionarias se tomó como referencia la expresión del antígeno SSEA-4 junto con el SSC (región 3Figura 3B) para determinar si en la sangre de cordón umbilical se encontraban células que co-expresaran los antígenos SSEA-4y CD13 pero que no expresaran el antígeno CD34 (Figura 3D). Los cuadrantes se determinaron usando controles de isotipo(Figura 3A- 3C).

A

B

C

D

Figura 3. A: Control Isotipo PE. B: Región 3. C: Control Isotipo FITC-APC. D: Expresión CD13.RESULTADOSDe acuerdo a la expresión de los antígenos CD34, CD38 y HLA-DR se encontraron cuatro subpoblaciones de células madrehematopoyéticas similares a las que se han reportado en la médula ósea con los siguientes inmunofenotipos (Figura 4)

Figura 4: Subpoblaciones de CMH de SCUSubpoblación 1: CD34+ CD38- HLA-DR-Subpoblación 2: CD34+ CD38+ HLA-DR-Subpoblación 3: CD34+ CD38- HLA-DR+Subpoblación 4: CD34+ CD38+ HLA-DR+

Se probó la normalidad de los datos obtenidos en el programa Cell Quest con el test de Shapiro WilK; según este test los datosno se distribuyeron normalmente (p<0.05), por esto fue necesario aplicar una prueba de hipótesis no paramétrica, en este casose aplicó el test de la mediana con el programa Statistix 6.0. Para cada una de las subpoblaciones de células madrehematopoyéticas se calcularon los intervalos de confianza obteniéndose: IC 95% Subpoblación CD34+ CD38- HLA-DR- :(0.0153 ; 0.0234), IC 95% Subpoblación CD34+ CD38+ HLA-DR- : (0.0191 ; 0.0296), IC 95% Subpoblación CD34+ CD38-HLA-DR+ : (0.0427 ; 0.0676), IC 95% Subpoblación CD34+ CD38+ HLA-DR+ : (0.2427 ; 0.5117).

El total de muestras analizadas fue de 78, ya que dos de ellas se coagularon al momento de la toma. El valor mínimo de laproporción de las subpoblaciones de células madre hematopoyéticas en sangre de cordón umbilical fue de 0.03% y el valormáximo de 1.82%. con una mediana de 0.28% (Pt25 ; 75).

A partir de los datos obtenidos, se puede afirmar que existe evidencia estadísticamente significativa para decir que la medianade la proporción de las subpoblaciones de células madre hematopoyéticas en la muestra analizada es mayor a 0.2%. p=0.0010.

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En cuanto a la expresión de los antígenos CD13 y SSEA-4 de las 78 muestras de Sangre de Cordón Umbilical analizadas solose encontraron 8 muestras que mostraron resultado positivo para la expresión de estos marcadores, sin embargo como aún noexisten datos con respecto a esta población de células en Sangre de Cordón Umbilical no se puede descartar la posibilidad deencontrar células con características embrionarias en este tejido.

DISCUSIÓN

La presencia de Células Madre Hematopoyéticas en Sangre de Cordón Umbilical fue demostrada en 1974 por Knutzon. Sinembargo, fue diez años más tarde que Ogawa y sus colaboradores documentaron la presencia de progenitores hematopoyéticosen Sangre de Cordón Umbilical. Desde entonces, se ha incrementado el interés en el uso de la Sangre de Cordón Umbilicalcomo un recurso alternativo para obtener Células Madre Hematopoyéticas diferente a la Médula Ósea que es la fuentetradicional3.

Se ha encontrado que la molécula CD34 es expresada en la mayoría de las Células Madre Hematopoyéticas, por lo que se haconvertido en el principal marcador para su caracterización. La frecuencia de este antígeno en SCU ha sido estimada entre el0.2% y el 1% del total de las células de la SCU11 lo que concuerda con los resultados obtenidos en este estudio en donde laproporción es mayor del 0. 2% (p= 0.0010).

Muchos estudios han demostrado que las células CD34+ de MO y de SCU son heterogéneas y contienen una gran variedad decélulas madre que se encuentran en diferentes estadíos. Hao y sus colaboradores encontraron que la subpoblación de CMHCD34+ CD38- es muy primitiva teniendo como base el estado del ciclo celular en el que se encuentran las células y en sucapacidad de proliferación in vitro. Traycoff reportó que la población CD34+ HLA-DR+ en SCU es más primitiva que la poblaciónCD34+ HLA-DR-, en contraste con los hallazgos en MO adulta en donde las células más primitivas son las células CD34+HLA-DR-10. Existe controversia acerca de la co-expresión de los antígenos CD34 y HLA-DR ya que aunque la población de CMHmás primitiva en SCU son las que co-expresan CD34 y HLA-DR, se ha encontrado una población de células con el fenotipoCD34+ HLA-DR 12.

A pesar de que se han realizado varios estudios acerca del inmunofenotipo de las CMH con base en la expresión de losantígenos CD34/CD38 y CD34/HLA-DR; hasta el momento se desconocían los fenotipos de las CMH de SCU que relacionaranlos tres antígenos. Siendo éste el primer estudio acerca de las Subpoblaciones de CMH en SCU con base en la expresión delos antígenos CD34, CD38 y HLA-DR, se encontraron cuatro Subpoblaciones de CMH, similares a las que se reportan en la MOy que corresponden a los fenotipos: CD34+ CD38- HLA-DR-, CD34+ CD38-HLA-DR+, CD34+ CD38+ HLA-DR- y CD34+ CD38+HLA-DR+. El rango de cada una de estas Subpoblaciones es diferente, encontrándose que las células con el fenotipo CD34+CD38+ HLA-DR+ están en mayor proporción con relación a las otras tres Subpoblaciones. Debido a que para este estudio secalcularon los intervalos de confianza de cada una de las Subpoblaciones y siendo los datos muy variables, no se determinaronlos recuentos relativos (%) y absolutos (células/mL) de cada una de las Subpoblaciones encontradas.

Los estudios sobre Células Madre Embrionarias sólo se pueden realizar a partir de las células provenientes de la etapa deblastocisto, lo que implica la manipulación de embriones; esto tiene una gran connotación ética, razón por la cual losinvestigadores están tratando de encontrar otras fuentes de estas células como la MO. Verfaillie recientemente documentó lapresencia de una población de células madre en MO con un comportamiento similar al de las CME, las cuales expresan altosniveles de los antígenos CD13 y SSEA-4, a las cuales denominaron “MAPCs”. Hasta el momento no existen reportes acerca dela existencia de estas células en SCU, lo que motivó la búsqueda de células madre con características embrionariasconjuntamente con la identificación de cada una de las Subpoblaciones de CMH derivadas de SCU, por ser ésta una muestra defácil obtención que puede manejarse con menos implicaciones éticas y por lo que permitiría avanzar más en las investigacionesacerca de las células progenitoras de SCU como alternativa en tratamientos relacionados con terapia génica. En este estudiosólo se encontró la expresión de los antígenos CD13 y SSEA-4 en 8 de las 78 muestras analizadas, lo cual indica queposiblemente esta población si se encuentre en SCU pero es necesario explorar la expresión de otros antígenos y aumentar lacantidad mínima de eventos leídos en Citometría para conseguir resultados más representativos.

La caracterización fenotípica de las Subpoblaciones de Células Madre Hematopoyéticas y el hallazgo de Células MadreEmbrionarias en Sangre de Cordón Umbilical es el estudio que da inicio a la línea de investigación sobre la biología de lasCélulas Madre que permitirá establecer protocolos para el aislamiento, purificación y cultivo de estas poblaciones celulares quemás adelante podrán ser utilizadas en como alternativa terapéutica de reemplazo medular.

AGRADECIMIENTOS

La realización de este trabajo fue posible gracias a la Vicerrectoría Académica por el apoyo financiero, al Departamento deGineco-obstetricia del Hospital Universitario San Ignacio por su colaboración en la toma de las muestras, al Instituto deGenética Humana de la Pontificia Universidad Javeriana y al personal del Laboratorio de Inmunología.

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