Carlos Moina

PLATAFORMA DE NANOSENSORES Y BIONANOINSUMOS PARA DIAGNÓSTICO POC DE

ENFERMEDADES INFECCIOSAS (NANOPOC)

Fondo Sectorial FSNano 2010

Aplicar la nanotecnología al desarrollo de una plataforma tecnológica para la detección “point-of-care” (POC) de enfermedades de importancia en seres humanos y animales

Objetivo General

Objetivo GeneralGeneración de

Innovación

Formación de RRHH

Desarrollo de una Amplia Gama de Productos

Facilidades de Micro y Nano Fabricación a Terceros

Alto impacto tecnológico

Plataforma Nano Plataforma Nano para diagnpara diagnóóstico stico

POCPOC

Alto Impacto Social

Composición Dinámica

Nuevas herramientas para política sanitaria

Formación de RRHH multidisciplinarios

Introducción de NT en el sector productivo

Asociación P+P

Plataforma

NANO POC

Organización del CAPP

Tratamiento de los derechos de Propiedad Intelectual (PI)

- Desarrollos previos al CAPP: PI compartida entre INTI y UNSAM

(convenio existente).

- Desarrollos dentro del CAPP: PI compartida entre los miembros del

consorcio.

Conformación del CAPP:

- Presidente: director del proyecto (INTI)

- Un director por UNSAM

- Un director por AGROPHARMA

- Un director por Biochemiq

- Un director por AADEE S.A.

- Un RAP (FIIB)

Objetivo específico• Desarrollar plataformas versátiles de detección de enfermedades que puedan ser utilizadas localmente.

Centro de Atención Primaria en Formosa Atención de pueblos originarios en Chaco

¿Por qué Nano-Micro-Bio?

La Nanotecnología permite obtener alta sensibilidad aún con pequeñas cantidades de muestra

La Microtecnología permite la fabricación de detectores portátiles, robustos y de bajo costo aún en series cortas de producción

La Biotecnología permite la detección de una gran variedad de patógenos con alta especificidad

¿Por qué sistemas de diagnóstico POC?

Diagnóstico rápido y en paralelo de múltiples agentes infecciosos

Identificación inequívoca del tipo y subtipo de patógeno

Seguimiento preciso de la enfermedad y pronóstico

Detección rápida y mejor respuesta frente a brotes epidémicos

Mejora de la competitividad frente a sistemas vigentes

Características Generales

� Fase I: Desarrollo de un Sistema de Diagnóstico Rápido basado en la utilización de nanopartículas magnéticas y detección electroquímica.

�Fase II: Desarrollo de un Sistema de Diagnóstico POC basado en Lab-on-a-Chip electroquímicos y minifluorimétricos

� Fase III: Desarrollo de un Sistema de Diagnóstico POC basado en MEMS- MOEMS utilizando NPM y marcadores fluorescentes

Desarrollo de la Plataforma

Vinculación entre Actores del Consorcio

DetecciDeteccióón n ElectroquElectroquíímicamicaCon NPMCon NPM

DetecciDeteccióón n FluorimFluoriméétrica con trica con NPMNPM

Modos de Medición

DetecciDeteccióón n ElectroquElectroquíímicamicaCon Electrodo Con Electrodo FuncionarizadoFuncionarizado

Imán

Ag

Au

HRP

H2O2

Red

H2O

Ox

Red

e-

DetecciDeteccióón Electroqun Electroquíímica con Electrodo Funcionalizadomica con Electrodo Funcionalizado

-0.25 -0.20 -0.15 -0.10 -0.05 0.00

-1.00

-0.75

-0.50

-0.25

0.00

b

c

i / µA

E / V

a

Detección Electroquímica mediante nanopartículas magnéticas

Reducido

Reducido

Oxidado

DetecciDeteccióón n ElectroquElectroquíímicamicaCon NPMCon NPM

1) Suero1) Suero

2) Lavados2) Lavados

3) Anticuerpo 3) Anticuerpo SecundarioSecundario

4) Lavados4) Lavados

5) Medici5) Medicióón n ElectroquElectroquíímicamica

e-

H2O2

H2O

Corriente (I) vs Tiempo (t)

-2,5

-2

-1,5

-1

-0,5

0

0 10 20 30 40 50 60

Tiempo (s)

Corriente (uA)

� Nanocomponentes

� Inmunosensores

� Inmunodiganósticos

Antecedentes

Antecedentes

Desarrollo de Nanocomponentes

SiO2/maghemita Alginato/Maghemita Nanoflores Au/Maghemita

Procesamiento de las muestras Medición de las muestras

Cubetas de procesamiento de las muestras

Celdas de mediciónelectroquímica

AntecedentesPrueba de concepto de prototipado

1er Prototipo Funcional

BUFFER

SUEROLAVADO

ANTIGENO

LAVADO

MEDICIÓN

Fluídica integrada

Manipulación de NP:

Desplazamiento por magneto y

dielectroforesis,

concentración

electromagnética

Diagrama del Lab-on-a-Chip

BUFFER

SUEROLAVADO

ANTIGENO

LAVADO

MEDICIÓN

Fluídica integrada

Manipulación de NP:

Desplazamiento por magneto y

dielectroforesis,

concentración

electromagnética

Diagrama del Lab-on-a-ChipFase II

Microbobinas:microconcentrador magnetico de NP

Detalles las bobinas y los microcanales

Die 5mm2

Microbobina de Al sobreSi+SiO2 5µm x 100nm

Moldeo de los microcanales en SU-8

Diagrama del MOEMS espectroscópico

Fase III

Diseño del MEMS

Estadoinicial

Estadoestresado

Fuente de luzColector de luz

Sintonizador

MEMS

Fotodetector

Cartucho con

Microfluídica

Diagrama del MOEMS espectroscópico

Diseño del MEMS

Estadoinicial

Estadoestresado

Fuente de luzColector de luz

Sintonizador

MEMS

Fotodetector

Cartucho con

Microfluídica

Enfermedades ViralesEnfermedades Virales Enfermedades ParasitariasEnfermedades ParasitariasEnfermedades BacterianasEnfermedades Bacterianas

Virus AftosaVirus Aftosa

Fiebre AftosaFiebre Aftosa

BrucellaBrucella abortus abortus

BrucelosisBrucelosis

TrypanosomaTrypanosoma cruzi cruzi

Enfermedad de ChagasEnfermedad de Chagas

AntAntíígeno: 3ABCgeno: 3ABC--C163AC163A

Sueros: 270 (Negativos), 9 Sueros: 270 (Negativos), 9 (Positivos), 252 (Vacunados)(Positivos), 252 (Vacunados)

Fase: ValidaciFase: Validacióónn

AntAntíígenos: Ag1, TSSA, genos: Ag1, TSSA, SAPA, Ag13, Ag36SAPA, Ag13, Ag36

Sueros: 32 (Negativos), 36 Sueros: 32 (Negativos), 36 (Positivos)(Positivos)


0

20

40

60

80

100

120

% PP

Ag1

TSSA

SAPA

Ag13

Ag36

Ag1

TSSA

SAPA

Ag13

Ag36

Negativo Positivo

0

20

40

60

80

100

% PP

Nega

t ivo

Posit

ivo

Vacu

nado

0

20

40

60

80

100

120

% PP

Neg

ativos

Posit

ivos

Vac

unad

os

Enfermedades Detectadas

AntAntíígeno: AcrAgeno: AcrA--AgOAgO

Sueros: Prueba Sueros: Prueba experimental de experimental de infecciinfeccióón y vacunacin y vacunacióónn


Diagnóstico de Fiebre aftosa: detección fluorométrica

0

20

40

60

80

100

120

140

160

325

752

4 107680.3

107680.6

107964.2

107964.3

107964.5

107964.8

915

0 1 2 6 1256

1257

1258

1259

1260

Denominación del suero

% de la señal con respecto al

control p

ositivo

Sueros animales infectados

Sueros animales no-infectados

Sueros animales vacunados

Cut-off (media + 3DS): 50 % Sensibilidad (S): 100 % Especificidad (E): 99,2 %

Diagnóstico de Fiebre aftosa: detección electroquímica

-20

0

20

40

60

80

100

120

140

160

325

752

4 915

0 1 2 6 1256

1257

1258

1259

1260

Denominación de l suero

% de la señ

al con respecto al co

ntrol

positivo




Diagnóstico Brucelosis Humana

Diagnóstico Brucelosis Bovina

Diagnóstico Síndrome Urémico Hemolítico: EHEC O157

Diagnóstico de Enfermedad de Chagas

En nombre del grupo de trabajo NANOPOCGracias!!!

Factibilidad comercial

De la evaluación comercial efectuada surgen dos mercados

potenciales para las Plataformas de Diagnóstico POC:

Mercado de Salud Humana

Mercado de Sanidad Animal

Dentro de cada uno de los dos mercados se identificaron varios segmentos y nichos de mercado potenciales

NICHOS DE MERCADO

POTENCIALES

SEGMENTOS DE MERCADO

POTENCIALES

MERCADO POTENCIAL

Salud Humana

Centros de Atención de la

Salud

Centros de Atención

Primaria de la Salud

Laboratorios

Laboratorios de Hospitales Públicos y

Laboratorios Privados Pequeños

/ Medianos

Mercado potencial en Salud Humana

- La dimensión del mercado potencial en Salud Humana es de $37.200.000.

- Esta cifra surge de tomar en cuenta un valor de venta estimado para las Plataformas de Diagnóstico POC de U$S1.500 cada una; un tipo de cambio $/U$S 4,00 y una cantidad de unidades igual a la cantidad de CAPS (Centros de Asistencia Primaria de la Salud) en el país (6.200).

Mercado potencial en Sanidad Animal

NICHOS DE MERCADO

POTENCIALES

SEGMENTOS DE MERCADO POTENCIALES

MERCADO POTENCIAL

Sanidad Animal

Sanidad Animal Privada

Empresas / Productores

Sanidad Animal Pública

Centros de Zoonosis y Bienestar Animal

- La dimensión del mercado potencial en Sanidad Animal es de $330.000.000.

- Esta cifra surge de tomar en cuenta un valor de venta estimado para las Plataformas de Diagnóstico POC de U$S1.500 cada una; un tipo de cambio $/U$S 4,00 y una cantidad de unidades igual a la cantidad de Grandes Explotaciones Agropecuarias con Ganado Bovino (unidades con más de 500 cabezas) más 2.000 Centros de Zoonosis y Bienestar Animal en el país.

Año 1 Año 2 Año 3 Año 4

1er Sem. 2do Sem. 1er Sem. 2do Sem. 1er Sem. 2do Sem. 1er Sem. 2do Sem.

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

1819

20

21

22

23

24

25

26

27

FASE 1

FASE 2

FASE 3

Reunión CAPP

Equipo CAPP

Muchas Gracias!!

Plataforma NANO POC

Diagnóstico de Fiebre aftosa: detección fluorométrica

0

20

40

60

80

100

120

140

160

325

752

4 107680.3

107680.6

107964.2

107964.3

107964.5

107964.8

915

0 1 2 6 1256

1257

1258

1259

1260

Denominación del suero

% de la señal con respecto al

control p

ositivo




Cut-off (media + 3DS): 50 % Sensibilidad (S): 100 % Especificidad (E): 99,2 %

AntecedentesPruebas de concepto

NanoparticulaSPM

Diagnóstico de Fiebre aftosa: detección electroquímica

-20

0

20

40

60

80

100

120

140

160

325

752

4 915

0 1 2 6 1256

1257

1258

1259

1260

Denominación de l suero

% de la señ

al con respecto al co

ntrol

positivo




AntecedentesPruebas de concepto

NanoparticulaSPM

Pruebas de concepto Diagnóstico de Brucelosis bovina

0

1000

2000

3000

4000

5000

Blanco

56 / No-infectado

23 / Pre-Infeccion 2308

23 / Post-infeccion 2308

1086 / Pre-vacunacion S19



1086 / Post-vacunación S19



1113 / Pre-vacunacion ∆pgm



1113 / Post-vacunación ∆pgm



Animal N° / Status

Unidades de fluorescencia

Antecedentes

NanoparticulaSPM

Pruebas de concepto

Diagnóstico de Brucelosis humana

72 209

9714,5

14197

21891

23625

7175,5

2711,5

0

5000

10000

15000

20000

25000

PBS

Twee

n 1%

Blan

coNo

-infe

ctad

o

1143

1314

1149

1286

1213

Unidad

es de fluorescen

cia

Antecedentes

NanoparticulaSPM

-0.25 -0.20 -0.15 -0.10 -0.05 0.00

-1.00

-0.75

-0.50

-0.25

0.00

b

c

i / µA

E / V

a

Detección Electroquímica mediante nanopartículas magnéticas

Aportes de cada una de las partes que conforman el Consorcio Asociativo Público Privado (CAPP)

• INTI: desarrollo y prototipeado de plataformas biosensoras

• IIB-UNSAM: producción de antígenos recombinantes. Desarrollo, puesta

a punto y validación de nuevos y mejores métodos de diagnóstico.

• PYMES electrónicas: adaptación, fabricación y comercialización de

plataformas biosensoras (AADEE S. A)

• PYMES biotecnológica: producción, comercialización y distribución de

los insumos biológicos de la plataforma de diagnóstico (AGROPHARMA y BIOCHEMIQ).

INTI – E & I

Microfabricación

del Lab on a Chip

INTI – PS

Síntesis NP

Desarrollo el método

de medición

INMUNO –

BIO -

SENSOR

UNS -

Circuito Integrado

- Potenciostato

UNSM-IIB

Producción de

Proteínas

recombinantes

Conformación del grupo de trabajo

Antecedentes

Convenio INTI-IIB (año 2008)

NanoparticulaSPM

Diagnóstico de Enfermedad de Chagas

AntecedentesEnfermedades Detectadas

INTI (Procesos Superficiales y Electrónica e Informática):aportará sus capacidades y medios técnicos en las áreas de síntesis y caracterización de nanopartículas funcionalizadas, de sistemas electroquímicos de microelectrodos y ultra microelectrodos funcionalizados con monocapas autoensambladas; informática; diseño, fabricación y caracterización de microsistemas basados en silicio; tratamiento de materiales, superficies y recubrimientos

El IIB-UNSAM aportará sus capacidades y medios técnicos en las áreas de desarrollo de proteínas recombinantes y sistemas de diagnóstico; así como de el estudio de agentes patógenos

Instituciones

AGROPHARMA: aportará sus capacidades y medios técnicos y económicos para la producción de los antígenos recombinantes a escala piloto, más su conocimiento y capacidades para la producción, comercialización y distribución de los futuros insumos biológicos de la plataforma de diagnóstico.

AADEE S.A.: aportará sus capacidades y medios técnicos y económicos para el desarrollo y producción de los inmunobiosensores derivados del proyecto.

Biochemiq S.A.: aportará sus capacidades y medios técnicos y económicos para la producción de los bionanoinsumos necesarios para Los ensayos piloto y posterior producción de los sistemas inmunobiosensores.

Empresas

Excitación

Emisión

DetecciDeteccióón n

FluorimFluoriméétricatrica

1) Suero

2) Lavados

3) Anticuerpo Secundario

4) Lavados

5) Medición Fluorescencia

Micro red de difracción sintonizada por estrés mecánico

Principio de funcionamiento:

• Paso de la red variable.

• La red es actuada por estrés mecánico.

• El estrés mecánico es manejado

por un MEMS actuador

controlado por tensión.• Las señales fluorescentes son

escaneadas en frecuencia.

• La introducción de tensiones

alternas en el actuador, permite el escaneo de las señales

fluorescentes en el tiempo.

Adquisición de datos espectrales

Características y fabricación de la micro red

La micro red es una estructura ondulada y

ordenada, la cual se consigue depositando un nano film rígido sobre un sustrato elastomérico

pretensado (pasos 1, 2 y 3).

Ejemplo de aplicación:Espesor del PDMS .....…...1mmEspesor del film Au/Pd …10 nm

Pretensión en PDMS ……..30%

Permiten obtener un

ondulado micrométrico característico para la red

con 85 nm de excursión en sintonía del espectro

Carlos Moina

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