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CARACTERIZACIÓN GÉNICA Y BIOQUÍMICA DE UNA CICLODEXTRIN GLUCANOTRANSFERASA, ENZIMA IMPLICADA EN EL METABOLISMO DEL ALMIDÓN EN Haloferax mediterranei Vanesa Bautista Saiz
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CARACTERIZACIÓN GÉNICA Y BIOQUÍMICA DE UNA CICLODEXTRIN GLUCANOTRANSFERASA, ENZIMA IMPLICADA EN EL METABOLISMO DEL ALMIDÓN EN Haloferax mediterranei
Vanesa Bautista Saiz
UNIVERSIDAD DE ALICANTE
FACULTAD DE CIENCIAS
CARACTERIZACIÓN GÉNICA Y BIOQUÍMICA DE
UNA CICLODEXTRIN GLUCANOTRANSFERASA,
ENZIMA IMPLICADA EN EL METABOLISMO DEL
ALMIDÓN EN Haloferax mediterranei
Vanesa Bautista Saiz
Alicante, 2010
DÑA. MARÍA JOSÉ BONETE PÉREZ, DIRECTORA DEL DEPARTAMENTO DE
AGROQUÍMICA Y BIOQUÍMICA DE LA FACULTAD DE CIENCIAS DE LA
UNIVERSIDAD DE ALICANTE
CERTIFICA: Que la memoria adjunta titulada “Caracterización génica y bioquímica
de una ciclodextrin glucanotransferasa, enzima implicada en el
metabolismo del almidón en Haloferax mediterranei” presentada por
Dña. Vanesa Bautista Saiz, ha sido realizada en este Departamento
bajo su dirección y de la Dra. Julia Mª Esclapez Espliego. Y para que
conste a los efectos oportunos expide el siguiente certificado en:
Alicante, Abril de 2010
Dra. Mª José Bonete Pérez
Memoria presentada para optar al grado de Doctora en Biología por la Universidad
de Alicante.
Dña. Vanesa Bautista Saiz
DIRECTORES:
Dra. Mª José Bonete Pérez
Catedrática en Bioquímica y
Biología Molecular de la
Facultad de Ciencias de la
Universidad de Alicante.
Dra. Julia Mª Esclapez Espliego
Profesora Ayudante Doctor en
Bioquímica y Biología Molecular
de la Facultad de Ciencias de la
Universidad de Alicante.
La firmante de esta memoria ha disfrutado de una beca de adjudicación
directa a proyecto otorgada por la Universidad de Alicante desde 2004-2007.
El presente trabajo ha sido subvencionado por los proyectos de investigación:
Proteínas de extremófilos. Ayudas a grupos de investigación. Universidad de
Alicante VIGROB-016.
Análisis de los determinantes estructurales de la estabilidad de proteínas
halofílicas. Ministerios de Educación y Ciencia BIO2005-08991-C02-01.
Modificación de enzimas extremófilas. Ministerio de Ciencia y Tecnología
BIO200203179.
Parte de los resultados que se presentan en esta memoria han dado lugar a
los siguientes capítulos de libro y artículos en revistas internacionales:
M. José Bonete, Juan Ferrer, Mónica Camacho, Carmen Pire, Julia
Esclapez, Frutos Marhuenda-Egea, Rosa M. Martínez-Espinosa, Susana
Díaz, Francisco Llorca, Francisco Pérez-Pomares, Vanesa Bautista
(2005). Enzymes from halophilic Archaea. En Microorganisms for
industrial Enzymes and Biocontrol, pp 1-24. Encarnación Mellado Durán
y Jose Luís Barredo (Ed.).
Vanesa Bautista, Julia Esclapez, Rosa M. Martínez-Espinosa, Francisco
Pérez-Pomares, Mónica Camacho, M. José Bonete (2006). Heterologous
overexpression of a halophilic -amylase. Microbial Cell Factories 5
(Suppl. 1), P13.
Julia Esclapez, M. José Bonete, Mónica Camacho, Carmen Pire, Juan
Ferrer, Vanesa Bautista, Rosa M. Martínez-Espinosa, Basilio Zafrilla,
Francisco Pérez-Pomares, Susana Díaz (2006). An optimized method to
produce halophilic proteins in Escherichia coli. Microbial Cell Factories 5
(Suppl. 1), S22.
M. José Bonete, Mónica Camacho, Rosa M. Martínez-Espinosa, Julia
Esclapez, Vanesa Bautista, Carmen Pire, Basilio Zafrilla, Susana Díaz,
Francisco Pérez-Pomares, Francisco Llorca (2007). In the light of the
haloarchaea metabolism. En Communicating Current Research and
Educational Topics and Trends in Applied Microbiology, pp 170-183. A.
Méndez-Vilas (Ed.).
A mis padres y hermano
RESUMEN
RESUMEN
Haloferax mediterranei es un microorganismo halófilo extremo clasificado
dentro del Domino Archaea. Este microorganismo es capaz de crecer en medio
mínimo con acetato amónico como única fuente de carbono y nitrógeno. Cuando
este medio es suplementado con almidón, Hfx. mediterranei secreta al medio
extracelular una enzima con actividad amilolítica. Tras purificar y caracterizar esta
enzima, se ha comprobado que se trata de una ciclomaltodextrin glucanotransferasa
(CGTasa). Hasta el momento es la única CGTasa secuenciada y caracterizada en
un halófilo extremo del Dominio Archaea.
Las CGTasas (EC 2.4.1.19) son enzimas capaces de degradar almidón
convirtiéndolo principalmente en ciclodextrinas (CDs). Estas CDs son oligosacáridos
cíclicos no reductores constituidos por 6 ( -CD), 7 ( -CD) u 8 ( -CD) unidades de
glucosa unidas por enlaces glucosídicos -1,4. Además de esta actividad de
ciclación, estas enzimas catalizan otras tres reacciones bien diferenciadas:
acoplamiento, transferencia e hidrólisis. En la actualidad las CDs son ampliamente
estudiadas por su potencial biotecnológico, ya que debido a su estructura pueden
formar complejos de inclusión con gran variedad de moléculas. Debido a esta
propiedad, las CDs han sido utilizadas para la estabilización y solubilización de un
gran número de sustancias de interés en la industria farmacéutica, cosmética o
alimentaria, así como en procesos de bioconversión y separación.
Mediante la digestión con tripsina de la enzima purificada, se obtuvieron una
serie de péptidos que se emplearon como sonda en la búsqueda del gen en una
librería genómica de Hfx. mediterranei en fago Una vez aislado el gen, se
secuenció y analizó bioinformáticamente. Además, se han secuenciado y analizado
cuatro genes adyacentes que forman parte de un transportador de maltosa tipo ABC
(malE, malF, malG y malK).
Con el fin de estudiar en el futuro sus propiedades estructurales, se expresó
el gen de la CGTasa de Hfx. mediterranei en el huésped mesófilo E. coli,
obteniéndose la proteína activa en la fracción citoplasmática soluble. El proceso de
purificación desarrollado es rápido y eficaz, consiguiéndose la enzima pura y
concentrada en un solo paso cromatográfico. La caracterización de la CGTasa
recombinante reveló que las propiedades moleculares y cinéticas de esta enzima son
prácticamente idénticas a las que presenta la CGTasa aislada de Hfx. mediterranei.
ÍNDICE
ÍNDICE
1.- Introducción 3-40
1.1.- Filogenia ...................................................................................... 3
1.2.- Familia Halobacteriaceae .............................................................. 7
1.2.1.- Características generales ....................................................... 8
1.2.2.- Adaptaciones halofílicas al medio .......................................... 12
1.3.- Haloferax mediterranei ................................................................... 14
1.4.- Glicosiltransferasas ........................................................................ 16
1.5.- Ciclomaltodextrin glucanotransferasa (CGTasa) ............................... 17
1.5.1.- Función celular de las CGTasas ............................................. 18
1.5.2.- Actividad catalítica ................................................................ 19
1.5.3.- Estructura y mecanismo ......................................................... 20
1.5.4.- Aplicación biotecnológica de las CGTasas ............................. 26
1.6.- Sistemas de transporte de proteínas extracelulares ............................ 29
1.6.1.- Sistema Sec .......................................................................... 30
1.6.2.- Sistema Tat (Twin Arginine Translocation) ……………………… 31
1.7.- Transportadores tipo ABC (ATP-binding cassette) .............................. 34
1.7.1.- Organización en dominios de los transportadores ABC ............ 34
1.8.- Objetivos ...................................................................................... 40
2.- Materiales y métodos 43-84
2.1.- Microorganismo ............................................................................ 43
2.2.-Purificación y caracterización de la ciclomaltodextrin
glucanotransferasa (CGTasa) de Hfx. mediterranei ...........................
43
2.2.1.- Condiciones de cultivo .......................................................... 43
2.2.2.- Obtención del extracto enzimático ......................................... 43
2.2.3.- Determinación de la concentración de proteínas ..................... 43
2.2.4.- Medidas de actividad catalítica de la CGTasa ......................... 44
2.2.4.1.- Actividad de ciclación ................................................ 44
2.2.4.2.- Actividad de acoplamiento ......................................... 46
2.2.4.3.- Actividad de transferencia .......................................... 48
2.2.4.4.- Actividad de hidrólisis ................................................ 49
2.2.5.- Purificación de la CGTasa ..................................................... 50
2.2.6.- Electroforesis en gel de poliacrilamida .................................... 52
2.2.7.- Efecto del tiempo en la medida de actividad enzimática ........... 52
2.2.8.- Efecto de la concentración de sal sobre la actividad enzimática 53
2.2.9.- Efecto de la concentración de los iones hidrógeno (pH) sobre
la actividad enzimática .........................................................
53
2.2.10.- Efecto de la temperatura en la medida de actividad
enzimática .......................................................................... 53
2.2.11.- Efecto de la temperatura y de la concentración de sal sobre la
estabilidad enzimática ..........................................................
53
2.2.12.- Efecto de la concentración de EDTA y de iones divalentes en
la actividad enzimática .........................................................
54
2.2.13.- Análisis de especificidad de sustratos .................................... 54
2.2.14.- Determinación de parámetros cinéticos ................................ 55
2.2.15.- Análisis de los productos de reacción ................................... 55
2.2.16.- Estudios de glicosilación de la enzima .................................. 56
2.2.17- Análisis mediante nanoelectrospray LC/MS de la CGTasa
purificada ...........................................................................
57
2.3.- Secuenciación del gen de la CGTasa de Hfx. mediterranei ................ 58
2.3.1.- Aislamiento de DNA genómico de Hfx. mediterranei ................ 58
2.3.2.- Medida de la concentración del DNA genómico ..................... 58
2.3.3.- Electroforesis en gel de agarosa ............................................. 59
2.3.4.- Obtención de la sonda para la CGTasa ................................. 59
2.3.5.- Localización del gen de la CGTasa de Hfx. mediterranei en
una genoteca en fago .......................................................
62
2.3.6.- Aislamiento de DNA y análisis de las secuencias ..................... 66
2.4.- Clonaje y expresión heteróloga de la CGTasa de Hfx. mediterranei ... 72
2.4.1.- Inserción del gen de la CGTasa de Hfx. mediterranei en el
vector de clonaje pSTBlue-1 (Novagen) ...................................
72
2.4.2.- Inserción del gen de la CGTasa de Hfx. mediterranei en el
vector de expresión pET-3a (Novagen) ....................................
76
2.4.3.- Transformación en el huésped de expresión E. coli BL21(DE3) .. 78
2.4.4.- Expresión heteróloga de la CGTasa de Hfx. mediterranei ......... 79
2.5.- Purificación y caracterización de la CGTasa recombinante de
Hfx. mediterranei ...........................................................................
81
2.5.1.- Solubilización de los cuerpos de inclusión y renaturalización .... 81
2.5.2.- Purificación de la CGTasa recombinante de Hfx. mediterranei .. 81
2.5.3.-Caracterización de la CGTasa recombinante
de Hfx. mediterranei ..............................................................
82
2.6.- Cristalización de la CGTasa recombinante de Hfx. mediterranei ........ 83
3.- Resultados y discusión 87-246
3.1.- Purificación y caracterización de ciclomaltodextrin glucanotransferasa
(CGTasa) de Hfx. mediterranei ................................................................
87
3.1.1.- Purificación de CGTasa de Hfx. mediterranei .......................... 87
3.1.2.- Caracterización de CGTasa de Hfx. mediterranei .................... 91
3.1.2.1.- Efecto del tiempo de ensayo en la medida de actividad
enzimática ................................................................
91
3.1.2.2.- Efecto de la concentración de sal sobre la actividad
enzimática ................................................................
92
3.1.2.3.- Efecto de la concentración de los iones hidrógeno (pH)
sobre la actividad enzimática ......................................
93
3.1.2.4.- Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática 94
3.1.2.5.- Efecto de la temperatura y la concentración de sal
sobre la estabilidad enzimática ...................................
96
3.1.2.6.- Efecto de la concentración de EDTA y de iones
divalentes en la actividad enzimática ...........................
101
3.1.2.7.- Determinación de actividades catalíticas específicas
de CGTasa ...............................................................
104
3.1.2.7.1.- Actividad de ciclación ................................. 104
3.1.2.7.2.- Actividad de acoplamiento .......................... 105
3.1.2.7.3.- Actividad de transferencia ........................... 107
3.1.2.8.- Especificidad de sustratos de la CGTasa ..................... 108
3.1.2.9.- Determinación de parámetros cinéticos ....................... 109
3.1.3.- Análisis de los productos de reacción por capa fina ................. 111
3.1.4.- Estudios de glicosilación de la enzima .................................... 112
3.1.5.- Análisis mediante nanoelectrospray LC/MS de la CGTasa
de Hfx. mediterranei ..............................................................
113
3.2.- Secuenciación del gen de CGTasa de Hfx. mediterranei ................... 117
3.2.1.- Obtención de la sonda para CGTasa de Hfx. mediterranei ...... 117
3.2.2.- Localización del gen de CGTasa de Hfx. mediterranei en una
genoteca en fago ................................................................
122
3.2.3.- Obtención del DNA viral y secuenciación ............................... 124
3.2.4.- Análisis de las secuencias ...................................................... 153
3.3.- Expresión heteróloga del gen de ciclomaltodextrin glucanotransferasa
(CGTasa) de Hfx. mediterranei ........................................................ 211
3.3.1.- Clonaje de CGTasa de Hfx. mediterranei en el vector pSTBlue-1 .. 212
3.3.2.- Clonaje de CGTasa de Hfx. mediterranei en el vector
de expresión pET-3a .............................................................. 215
3.3.3.- Expresión y localización de la CGTasa recombinante .............. 217
3.3.4.- Solubilización de los cuerpos de inclusión y renaturalización
de la CGTasa recombinante ................................................... 220
3.4.- Purificación y caracterización de la CGTasa recombinante
de Hfx. mediterranei ....................................................................... 224
3.4.1.- Purificación de la CGTasa recombinante de Hfx. mediterranei .. 224
3.4.2.- Electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones
desnaturalizantes y nativas ...................................................... 227
3.4.3.- Caracterización de CGTasa recombinante de Hfx. mediterranei
228
3.4.3.1.- Efecto de la concentración de sal, de los iones
hidrógeno (pH) y de la temperatura sobre la actividad
enzimática ................................................................ 228
3.4.3.2.- Efecto de la temperatura y la concentración de sal
sobre la estabilidad enzimática ................................... 230
3.4.3.3.- Efecto de la concentración de EDTA y de iones
divalentes en la actividad enzimática ........................... 234
3.4.3.4.- Determinación de actividades catalíticas específicas
de CGTasa ............................................................... 236
3.4.3.4.1.- Actividad de ciclación ................................. 236
3.4.3.4.2.- Actividad de acoplamiento .......................... 238
3.4.3.4.3.- Actividad de transferencia ........................... 240
3.4.3.5.- Especificidad de sustratos de la CGTasa ..................... 241
3.4.3.6.- Determinación de parámetros cinéticos ....................... 242
3.4.3.7.- Análisis de los productos de reacción por capa fina ..... 244
3.5.- Cristalización de la CGTasa recombinante de Hfx. mediterranei ........ 245
4.- Discusión general 249-256
5.- Conclusiones 259-260
6.- Bibliografía 263-294
7.- Apéndice I: Medios de cultivo y soluciones 297-299
8.- Apéndice II: Genotipos de las células empleadas 300-302
9.- Apéndice III: Abreviaturas 303-305
10.- Apéndice IV: Índice de figuras 306-311
11.- Apéndice V: Índice de tablas 312-313
INTRODUCCIÓN
Introducción
3
1.1.- Filogenia
Hasta el año 1977 todos los organismos vivos se clasificaban dentro de dos
grupos: eucariotas (células con núcleo) y procariotas (células sin núcleo). En ese
mismo año, Woese y Fox, basándose en la comparación de fragmentos de RNA
ribosómico (rRNA) 16S o 18S generados por tratamiento con ribonucleasa,
propusieron que los procariotas no constituyen un grupo homogéneo, sino que hay
dos linajes claramente diferenciados: eubacterias y arqueobacterias (Woese y col.,
1977). Cada uno de estos dos grupos poseía tanta entidad como el grupo de los
eucariotas.
En 1990, Woese y colaboradores, basándose en dichas secuencias de rRNA,
realizaron una nueva clasificación. En ella proponen un valor taxonómico de mayor
rango que el Reino, que denominaron Dominio (Woese y col., 1990). Se eligió el
nombre de cada Dominio según las siguientes consideraciones: mantener la
continuidad con los nombres existentes, sugerir las características básicas del grupo,
y evitar cualquier connotación que señale una relación entre bacterias y arqueas.
Los Dominios propuestos, cuya nomenclatura se sigue empleando actualmente,
fueron: Bacteria, Eukarya y Archaea (Figura 1), que sustituyeron a eubacterias,
eucariotas y arqueobacterias, respectivamente.
Figura 1: Representación esquemática del árbol filogenético universal de Woese y col.,
1990, tomado de Lecompte y col., 2002.
Introducción
4
La secuenciación completa de genomas de diferentes organismos ha
permitido confirmar la distribución filogenética de los seres vivos en Dominios, tal y
como propone Woese (Lecompte y col., 2002). Aunque la existencia de los tres
Dominios es clara, existe una gran controversia sobre la relación que hay entre ellos
(Woese, 2000; Caetano-Anolles, 2002). Por comparación de secuencias de rRNA,
el Dominio Archaea parece estar más estrechamente relacionado con Eukarya que
con Bacteria (Woese, 2000). De hecho, comparten elementos básicos de la
maquinaria transcripcional y replicativa, mecanismos imprescindibles para el
funcionamiento celular (Dionne y col., 2003). Sin embargo, existen datos que
contradicen esta aparente cercana relación entre Archaea y Eukarya, como es la
elevada homología de secuencias de la mayoría de las enzimas de arqueas con sus
homólogas de bacterias (Ouhammouch, 2004), así como las bases del mecanismo
de regulación de la expresión génica (Brinkman y col., 2002). En función del criterio
elegido para establecer similitudes entre bacterias, arqueas y eucariotas, las
conclusiones pueden ser diversas, siendo difícil establecer cuál fue el origen de los
tres Dominios.
Dominio Archaea
El Dominio Archaea está formado por un grupo heterogéneo de
microorganismos con propiedades fisiológicas únicas, muchas de las cuales
aparecen pronto en la historia evolutiva (Forterre y col., 2002):
Ecología: Son capaces de habitar ambientes extremos.
Morfología: Se han encontrado formas únicas, como por ejemplo las
formas poligonales que tienen algunas arqueas halófilas o los cocos
irregulares que presentan ciertos hipertermófilos.
Envoltura: Sus membranas lipídicas contienen cadenas laterales de
isoprenoide con enlaces éter, en contraste con los hidrocarburos con
enlaces éster de todos los demás sistemas biológicos. Carecen de
peptidoglicano como constituyente de la pared celular.
Introducción
5
Metabolismo: No emplean la glucólisis como vía catabólica de la
glucosa, sino una vía de oxidación simple. Su maquinaria replicativa y
transcripcional es muy similar a la que poseen los microorganismos
pertenecientes al Dominio Eukarya.
De acuerdo con la última edición del Manual Bergey (Garrity y col., 2001) y
los recientes estudios basados en la comparación de las proteínas implicadas en la
transcripción y transducción (Brochier y col., 2004), el Dominio Archaea se divide en
dos phyla:
Phylum Crenarchaeota. Comprende microorganismos que han sido
denominados hipertermófilos y termoacidófilos. En este phylum se
supone que se encuentra el fenotipo del ancestro del Dominio Archaea
(Cavalier-Smith, 2002).
Phylum Euryarchaeota. Abarca un amplio rango ecológico,
comprendiendo microorganismos hipertermófilos, metanógenos,
halófilos e incluso metanógenos termofílicos (Brown y Doolittle, 1997).
Mediante la amplificación por PCR de secuencias de rRNA 16S procedentes
de organismos no aislados, se han detectado nuevas especies de arqueas que no se
encuadran dentro de los dos phyla propuestos, y que parecen estar más cercanas al
Dominio Eukarya. Estas secuencias se clasifican provisionalmente en otro phylum
dentro del Dominio Archaea denominado Korarchaeota (Barns y col., 1996).
Recientemente se ha caracterizado parcialmente un microorganismo perteneciente a
este phylum, “Candidatus Korarchaeum cryptofilum”. A partir de su genoma se
deduce que realiza una fermentación de péptidos para obtener energía y fuentes de
carbono, careciendo de la capacidad de sintetizar purinas de novo, CoA y muchos
otros cofactores (Elkins y col., 2008).
Introducción
6
En 2002, Huber y col. propusieron un nuevo phylum, Nanoarchaeota,
representado únicamente por la especie Nanoarchaeum equitans. N. equitans es un
microorganismo simbionte hipertermófilo de tan sólo 400 nm de diámetro que se ha
encontrado en chimeneas submarinas. Este microorganismo crece adherido a la
superficie de Igniococcus hospitalis, arquea perteneciente al phylum Crenarchaeota,
siendo el primer caso conocido de simbiosis entre dos arqueas (Jahn y col., 2008).
No se ha podido obtener ningún cultivo puro del mismo, por lo que el contacto
directo célula-célula con el huésped parece ser un requisito imprescindible para su
crecimiento (Burghardt y col., 2009). Los estudios filogenéticos basados en
secuencias de rRNA sitúan a este phylum en una rama aislada, pero la ubicación
exacta no se podrá determinar hasta que se descubran más miembros de este grupo
y se amplíen los estudios (Huber y col., 2003) (Figura 2).
Recientemente se ha propuesto un nuevo phylum, Thaumarchaeota, en el
que se engloba Cenarchaeum symbiosum y otras arqueas mesofílicas relacionadas
con esta especie que hasta el momento se incluían en el phylum Crenarchaeota
(Brochier-Armanet y col., 2008a). Esta nueva clasificación se ha realizado en base a
la presencia en el genoma de C. symbiosum de la topoisomerasa IB (Topo IB),
específica hasta la fecha de eucariotas, y la ausencia de la topoisomerasa IA (Topo
IA) (Brochier-Armanet y col., 2008b). Esta Topo IB también se ha encontrado en el
genoma de la crenarqueota mesófila Nitrosopumilus maritimus, por lo que podría
clasificarse dentro de este nuevo phylum. Los análisis filogenéticos sugieren que la
Topo IB estuvo presente en el ancestro común de los Dominios Archaea y Eukarya.
Introducción
7
Figura 2: Árbol filogenético con los reinos del Dominio Archaea (Allers y col., 2005).
1.2.- Familia Halobacteriaceae
La familia Halobacteriaceae es el único componente del orden
Halobacteriales. Los microorganismos que constituyen esta familia muestran una
estricta dependencia por altas concentraciones de sal para su crecimiento y
estabilidad estructural, por ello son considerados como halófilos por excelencia.
Filogenéticamente, la familia Halobacteriaceae está clasificada dentro del
phylum Euryarchaeota, y se encuentra muy relacionada con los microorganismos
Introducción
8
metanógenos pertenecientes a los órdenes Methanomicrobiales y Methanosarcinales
(Oren, 2002). En la actualidad dicha familia está dividida en 29 géneros (abril
2010), siendo Halogranum y Halarchaeum los últimos géneros descritos (Cui y col.,
2009; Minegishi y col., 2009). En las bases de datos aparece un género más,
denominado Haloalcalophilium, cuya descripción todavía está pendiente de
publicación.
1.2.1.- Características generales
Los microorganismos pertenecientes a la familia Halobacteriaceae abundan
en salinas y lagos hipersalinos, ambientes en los que muy pocos seres vivos son
capaces crecer. Hasta hace sólo unos años se pensaba que únicamente las arqueas
eran capaces de habitar dichos ambientes. Sin embargo, empleando técnicas de
hibridación in situ con fluorescencia (FISH) se ha demostrado que las bacterias
constituyen una parte significativa de la microbiota del hábitat de las salinas, como
es el caso de Salinibacter ruber (Antón y col., 2000) y Salicola marasensis
(Maturrano y col., 2006).
Una característica fundamental de los miembros de esta familia es que son
halófilos obligados, requiriendo en general concentraciones de NaCl mayores de
1,5 M para crecer. La concentración de NaCl media óptima de crecimiento se sitúa
entre 2 y 4,5 M dependiendo de las especies, pudiendo crecer algunas de ellas
incluso a concentraciones saturantes de sal. Además, toleran bastante bien
temperaturas elevadas, ya que los ambientes que habitan, debido a la posición
geográfica y al estancamiento de aguas, suelen ser lugares muy cálidos (con
temperaturas que pueden superar los 50 ºC). Su temperatura óptima de crecimiento
se sitúa en torno a 40-45 ºC, pudiendo llegar a crecer incluso a 60 ºC como por
ejemplo Haloterrigena thermotolerans (Montalvo-Rodríguez y col. 2000).
La morfología de las arqueas halófilas está determinada por las propiedades
de su pared celular. Dentro de la familia Halobacteriaceae nos encontramos con
gran variedad de formas: cocos, bacilos, formas cuadradas o rectangulares,
romboides y triangulares.
Introducción
9
La pared celular de los miembros de la familia Halobacteriaceae está
formada por subunidades de glicoproteínas que requieren altas concentraciones de
NaCl para mantener su estabilidad estructural (Oren, 2002). Así mismo, se
requieren elevadas concentraciones de magnesio u otros cationes divalentes para el
correcto ensamblaje de las subunidades que forman la pared celular (Oren, 2002).
Los miembros de la familia Halobacteriaceae poseen una membrana
plasmática propia de los organismos del Dominio Archaea. Destaca su coloración
rojiza debida a los carotenoides encargados de proteger a la célula de la radiación
solar (Kates, 1992). Algunas haloarqueas producen además otro tipo de pigmentos,
las proteínas asociadas al retinal, entre las cuales destaca la bacteriorrodopsina por
su elevado potencial biotecnológico (Grout, 2000). Este pigmento permite al
microorganismo emplear la energía luminosa para generar gradientes de protones
a lo largo de la membrana que participan en la síntesis de ATP. Algunas especies se
rodean también de cápsulas polisacarídicas. Grandes cantidades de
exopolisacáridos son excretadas y depositadas alrededor de su pared celular. Los
principales componentes son glucosa, galactosa, amino-azúcares y ácidos urónicos.
Metabolismo
Las arqueas halófilas son quimioheterótrofos aerobios. Sin embargo, en su
hábitat natural, debido a la elevada concentración salina y a las elevadas
temperaturas, la solubilidad del oxígeno en el agua puede llegar a ser muy baja,
convirtiéndose en un factor limitante para el desarrollo de estos microorganismos.
Debido a este hecho, han desarrollado diferentes estrategias para poder vivir en
medios microaerófilos o anaerobios. Especies como Haloferax mediterranei,
Halobacterium salinarum o Natronobacterium vacuolatum, forman vesículas de gas
que les permiten flotar hasta la superficie donde la concentración de oxígeno es
mayor (Pfeifer y col., 1997). Recientemente se ha comprobado que en anaerobiosis
la formación de estas vesículas puede verse reducida o inhibida, además de reducir
su tamaño y formar agregados (Hechler y col., 2009). Otras especies son capaces
de utilizar aceptores de electrones alternativos en la respiración, como el nitrato
Introducción
10
(Mancinelli y Hochstein, 1986; Hochstein y Lang, 1991), dimetilsulfóxido (DMSO)
(Oren y Trüpper, 1990), N-óxido de trimetilamina (TMAO) (Müller y DasSarma,
2005), fumarato (Oren, 1991), tiosulfato o azufre (Tindall y Trüpper, 1986). E
incluso, algunas especies como Hbt. salinarum pueden crecer anaeróbicamente por
fermentación de algunos aminoácidos como L-arginina (Hartmann y col., 1980).
Este último microorganismo también puede comportarse como fotoheterótrofo al
obtener energía en forma de ATP mediante la fosforilación de ADP mediada por la
bacteriorrodopsina que se activa por efecto de la luz (Stoeckenius y col., 1979). Por
último, cabe destacar que aunque los halófilos son organismos quimioheterótrofos,
se han descrito diversos casos de fijación de CO2 que implican la carboxilación
reductiva de propionato, la reacción de la enzima glicina sintasa o el intercambio de
CO2 con el grupo carboxílico del piruvato (Oren, 2002).
Las haloarqueas llevan a cabo la degradación de los compuestos
carbonados mediante el ciclo de los ácidos tricarboxílicos (CAT) y la cadena
transportadora de electrones en combinación con el ciclo del glioxilato y las
reacciones de la vía Embdem-Meyerhof y de la vía modificada de Entner-Doudoroff
(Oren, 2002).
Se han encontrado genes implicados en la -oxidación en el genoma de
algunas arqueas como por ejemplo Natronomonas y Haloarcula. N. pharaonis es
capaz de crecer en un medio con ácidos grasos de diferente longitud como fuente
de carbono, mientras que el crecimiento de Hbt. salinarum se ve disminuido cuando
se trata de ácidos grasos de cadena media o larga (Falb y col., 2008).
Muchas de estas especies pueden crecer en medios inorgánicos con un solo
compuesto orgánico como fuente de carbono, como por ejemplo Hfx. mediterranei
que es capaz de crecer en medio mínimo en presencia de glucosa (Rodríguez Valera
y col., 1980a).
Introducción
11
Genoma
Las arqueas halófilas al igual que todos los organismos de este Dominio y a
semejanza de los microorganismos del Dominio Bacteria, poseen un cromosoma
circular con un tamaño de 2000 a 3000 kilobases (Kb). Una característica
importante es la presencia de varios plásmidos, algunos de gran tamaño (40-700
Kb) que reciben el nombre de megaplásmidos o minicromosomas (Ng y col., 1998).
Dichos plásmidos poseen abundantes elementos de inserción, que son secuencias
de DNA que contienen información únicamente para promover su propia inserción
en otros lugares del genoma. En halófilos, se han secuenciado varios de estos
elementos, generalmente son secuencias ricas en pares de nucleótidos AT y con
tamaño entre 0,5 pb y 2 Kb (Brügger y col., 2002). Por ejemplo, en el genoma de
Halobacterium NRC-1 se han encontrado 24 secuencias de inserción en el
cromosoma y 58 en los dos megaplásmidos (Ng y col., 2000). Como consecuencia
del elevado número de elementos de inserción en el genoma, estos
microorganismos presentan tasas de mutación espontánea muy elevadas pudiendo
llegar a alcanzar valores entre 10-2
–10-4
. Asimismo, se han identificado en el
genoma de Hfx. mediterranei modificaciones dependientes de la concentración
salina del medio de cultivo. A bajas concentraciones de sal (10 %) se modifican
algunas secuencias de reconocimiento de la enzima de restricción PstI, pero cuando
las células crecen de nuevo en condiciones óptimas (25 %) se vuelve a observar la
secuencia original, obteniéndose patrones de digestión diferentes. Tales
modificaciones no son ni inserciones ni delecciones sino modificaciones puntuales
en secuencias específicas (Juez y col., 1990), que provocan una expresión regulada
de genes adyacentes dependiente de la salinidad (Mojica y col., 1993).
En cuanto a la organización del genoma, las arqueas halófilas, al igual que
los organismos del Dominio Bacteria, poseen los genes agrupados en operones que
se transcriben en mRNA policistrónicos. Sin embargo, el mecanismo de transcripción
posee gran similitud con el de Eukarya pero interviniendo un menor número de
factores de transcripción (Bell y Jackson, 1998). La regulación de la transcripción se
viene estudiando desde hace tiempo, el análisis más detallado se ha llevado a cabo
con los genes gvp que participan en la formación de vesículas de gas en algunos
Introducción
12
microorganismos (Hofacker y col., 2004). Respecto al mecanismo de replicación de
DNA, en las arqueas es una versión simplificada de la maquinaria replicativa
eucariótica (Dionne y col., 2003), aunque presentan características únicas que no se
dan en ninguno de los otros Dominios (Cann y Ishino, 1999).
De todas las arqueas, los halófilos son los más fáciles de manipular en el
laboratorio. Organismos como Hbt. salinarum y Hfx. volcanii se han utilizado como
modelos óptimos de estudio de numerosos procesos biológicos como expresión y
regulación génica, transporte y degradación de proteínas, motilidad y mecanismos
de transducción de señales (Soppa, 2006).
1.2.2.- Adaptaciones halofílicas al medio
Los microorganismos que viven en medios con elevadas concentraciones de
sal se encuentran sometidos a un importante estrés salino. Con el fin de hacer frente
a este estrés osmótico, los halófilos han desarrollado diferentes estrategias. Las
bacterias halófilas y halotolerantes, los microorganismos halófilos pertenecientes al
Dominio Eukarya y las arqueas metanógenas halofílicas, acumulan en su citoplasma
solutos compatibles, que son compuestos orgánicos de bajo peso molecular como
el glicerol, la ectoína o la sacarosa.
Las arqueas halófilas de la familia Halobactericeae, un grupo de bacterias
halofílicas anaeróbicas y la bacteria halófila S. ruber acumulan grandes
concentraciones intracelulares de sales inorgánicas en el citoplasma (Oren, 2002).
Todas las proteínas y componentes celulares estructurales de estos
microorganismos, están adaptados a la presencia de elevadas concentraciones de
sal para asegurarse el funcionamiento de la maquinaria enzimática intracelular (Ebel
y col., 1999). El K+
es el catión intracelular dominante (hasta 5,2 M en Hbt.
salinarum), y en menor medida Na+
(hasta 1 M). Esto contrasta con la
concentración de iones en el medio, donde el Na+
es dominante y la concentración
de K+
es muy pequeña. Para mantener este gradiente entre el medio intracelular y
extracelular, existen bombas en la membrana citoplasmática (Madigan y Oren,
1999). En este ambiente intracelular, la elevada concentración de cargas positivas
Introducción
13
se compensa con los iones de Cl-
y con cargas negativas de residuos de
aminoácidos de sus proteínas, que poseen una mayor proporción de residuos
glutámico y aspártico (Danson y Hough, 1997).
En las membranas de las arqueas halófilas extremas se encuentra presente
como lípido mayoritario el arquetidilglicerol metilfosfato (PGP-Me), análogo en
arqueas del fosfatidilglicerol metilfosfato. Este lípido representa entre el 50-80 % de
los lípidos presentes en las membranas de arqueas halófilas extremas, pero está
ausente o es reemplazado por otros lípidos en las halófilas moderadas o en las no
halófilas. Se ha demostrado que el PGP-Me contribuye de manera esencial a la
estabilidad de la membrana en medios hipersalinos (Tenchov y col., 2006).
Las proteínas de los microorganismos halófilos requieren en general altas
concentraciones salinas para su correcto funcionamiento, entre 2 y 4 M de sal para
alcanzar su máxima actividad, desnaturalizándose a concentraciones de sal
inferiores a 1 M (Lanyi, 1974), aunque existen excepciones según especies. Para
poder ser solubles y estables a tan altas concentraciones salinas, las proteínas han
desarrollado mecanismos específicos como la modificación de su composición
aminoacídica (Madern y col., 2000). Se caracterizan por presentar un aumento de
residuos ácidos (Asp y Glu), un bajo contenido de residuos básicos (Lys y Arg), un
incremento de los residuos hidrofóbicos (Gly, Ala y Val) y una disminución de los
residuos alifáticos (Lanyi, 1974; Madern y col., 2000).
Las enzimas de organismos halófilos mantienen su estructura y función a
concentraciones de sal cercanas a la saturación, en las que la mayoría de las
proteínas no halofílicas precipitan en disolución. La elevada carga negativa
encontrada en la superficie de estas proteínas sirve para mantener una capa de
hidratación en la forma de cationes sodio y potasio hidratados. Además, es evidente
que no sólo la densidad de carga es importante, sino que la hidratación, y por tanto
la solubilidad, alivia la interacción coordinada de estas cargas en el espacio
tridimensional (Dyall-Smith y Danson, 2001). Estudios recientes han demostrado que
el carácter halofílico de la glucosa deshidrogenasa de Hfx. mediterranei varía
Introducción
14
cuando se mutan residuos de Asp, que se encuentran en superficie, por Lys (Esclapez
y col., 2007).
Por último, se ha demostrado que bajo condiciones hiposalinas las arqueas
halofílicas pueden sintetizar enzimas similares a chaperoninas que reparan las
proteínas dañadas como resultado de la pérdida de sal (Franzetti y col., 2001).
1.3.- Haloferax mediterranei
Hfx. mediterranei es una arquea halófila extrema que se aisló por primera vez
en las aguas de las salinas de Santa Pola (Alicante, España). Fue descrita en 1983
por Rodríguez-Valera como Halobacterium mediterranei (Rodríguez-Valera y col.,
1983), género de arqueas halófilas que se propuso en la 7ª edición del Manual
Bergey (Elazari-Volcani, 1957). Posteriormente, en 1986, Torreblanca y col.
propusieron una nueva clasificación junto con Halobacterium volcanii y
Halobacterium denitrificans, para formar el nuevo género Haloferax. Esta distinción
se hizo en base a diferencias en los lípidos polares de la membrana celular y a otras
características morfológicas y fisiológicas (Torreblanca y col., 1986). En el 2009
Oren y col., modificaron la descripción de este género en base a las nuevas
especies descritas (Oren y col., 2009). Actualmente Haloferax engloba 11 especies:
Hfx. alexandrinus (Asker y Ohta, 2002), Hfx. denitrificans (Tindall y col., 1989), Hfx.
elongans (Allen y col., 2008), Hfx. gibbonsii (Juez y col., 1986), Hfx. larsenii (Xu y
col., 2007), Hfx. lucentense (Gutierrez y col., 2002), Hfx. mediterranei (Rodríguez-
Valera y col., 1983; Euzebi y Kudo, 2001), Hfx. mucosum (Allen y col., 2008), Hfx.
prahovense (Enache y col., 2007), Hfx. sulfurifontis (Elshahed y col., 2004) y Hfx.
volcanii (Mullakhanbhai y Larsen, 1975; Euzebi y Kudo, 2001). En las bases de
datos aparecen cinco especies más, cuya descripción todavía está pendiente de
publicación: Hfx. antrum, Hfx. berberensis, Hfx. opilio, Hfx. rutilus y Hfx. viridis.
Hfx. mediterranei presenta una amplia variedad morfológica, siendo el bacilo
la forma predominante, y su tinción es Gram (-). Su tamaño se encuentra entre 0,5 y
2 m, presenta una débil motilidad durante la fase exponencial de crecimiento y son
Introducción
15
capaces de formar vacuolas de gas (Pfeifer y col., 1997). Tanto la concentración
óptima como mínima de sal que requiere para crecer son menores que las
correspondientes a otros miembros de su familia.
A diferencia de los organismos del mismo género, Hfx. mediterranei presenta
un mayor espesor en la pared celular, 25-35 nm. En cuanto a su membrana, posee
una monocapa lipídica menos densa en la parte externa.
Posee un metabolismo quimioheterótrofo, utilizando carbohidratos, ácidos
carboxílicos, alcoholes y aminoácidos. Es capaz de crecer en medio mínimo en
presencia de glucosa como única fuente de carbono empleando la vía modificada
de Entner-Doudoroff (Bonete y col., 1996), y nitrato o nitrito como única fuente de
nitrógeno a través de la vía de asimilación mediante las nitrato y nitrito reductasas
asimilativas (Martínez-Espinosa y col., 2001a, 2001b). Puede crecer en condiciones
de microaerófilas empleando el nitrato como aceptor final de la cadena de
transporte de electrones (Álvarez-Osorio y col., 1992; Martínez-Espinosa y col.,
2006).
La organización de su genoma se determinó mediante el uso de
electroforesis de campo pulsante (PFGE) y el análisis de patrones de restricción
obtenidos con varias endonucleasas. Estas técnicas revelaron la presencia de un
cromosoma circular de 2,9 Mpb, el cual es muy parecido al de Hfx. volcanii, y tres
plásmidos de 490, 320 y 130 Kb (López-García y col., 1992).
Por último, cabe destacar dos propiedades que hacen de Hfx. mediterranei
un microorganismo muy interesante desde el punto de vista biotecnológico. La
primera consiste en la acumulación de cantidades considerables de
polihidroxialcanoato (PHA) (Figura 3), que se emplea para la producción de
plásticos biodegradables, aunque todavía no se ha comercializado (Rodríguez-
Valera y Lillo, 1992; Luengo, 2003). Y la segunda de ellas se basa en la producción
de exopolisacáridos (Antón y col. 1988) que pueden ser empleados como agentes
gelatinizantes, emulsionantes, espesantes, etc. (Oren, 2002). Así mismo, al igual
Introducción
16
que el resto de organismos extremófilos, el carácter estable de sus enzimas en
ambientes extremos también es una característica interesante para la industria
biotecnológica (Margesin y Schinner, 2001).
Figura 3: Fotografía tomada en los Servicios Técnicos de Investigación de la Universidad de
Alicante con microscopio electrónico, en la que se aprecian los gránulos de PHB en el
citoplasma de Hfx. mediterranei.
1.4.- Glicosiltransferasas
Durante los últimos años, la biotecnología de carbohidratos ha despertado
un gran interés debido a la versatilidad que ofrece en campos como la cosmética, la
alimentación y la industria farmacéutica. Los oligosacáridos, además de su uso
tradicional como edulcorantes, presentan nuevas aplicaciones en la industria
alimentaria como estabilizantes o emulsionantes. De especial interés, son las
investigaciones dirigidas hacia la utilización de carbohidratos como sustancias
glicoterapéuticas, en la terapia contra el cáncer y formando parte de antibióticos en
general (Luzhetskyy y col., 2008).
Las glicosiltransferasas (EC 2.4.) constituyen una gran familia de enzimas
implicadas en la biosíntesis de oligosacáridos, polisacáridos y glicoconjugados.
Constituyen un grupo muy heterogéneo respecto a sus funciones, aunque su
principal actividad es la transferencia de un residuo de azúcar desde un donador a
un aceptor formando enlaces glucosídicos. La transferencia del residuo de azúcar
ocurre tanto por retención como por inversión de la configuración del carbono
Introducción
17
anomérico. Estas enzimas están presentes tanto en eucariotas como en procariotas,
y generalmente demuestran una elevada especificidad tanto por la molécula
donadora como por el sustrato aceptor (Breton y col., 2006). Dentro de las
glicosiltransferasas existen tres tipos diferentes en base a la naturaleza del residuo de
azúcar que transfieren:
Hexosiltransferasas (EC 2.4.1.)
Pentosiltransferasas (EC 2.4.2.)
Otras enzimas que transfieran restos distintos a hexosas y pentosas (EC
2.4.99.)
1.5.- Ciclomaltodextrin glucanotransferasa (CGTasa)
Las ciclomaltodextrin glucanotransferasas (EC 2.4.1.19) son miembros de la
familia 13 de las glicosil hidrolasas (base de datos CAZy (Carbohydrate-Active
enZymes) en http://www.cazy.org/index.html; Henrissat, 1991; Bourne y Henrissat,
2001; Cantarel y col., 2009). Esta familia engloba una gran variedad de enzimas
( -amilasas, isoamilasas, pululanasas, amilopululanasas, neopululanasas, etc.) que
comparten el mismo mecanismo de catálisis. A pesar de tratarse de una
glicosiltransferasa, concretamente una hexosiltransferasa, las CGTasas se incluyen
dentro de esta familia ya que se encuentran más relacionadas con las glicosidasas
en cuanto a su estructura, mecanismo de reacción y evolución (Coutinho y col.,
2003). Recientemente, debido a la gran variedad que presenta, se ha subdividido
esta familia 13 en 35 subfamilias tras analizar sus secuencias, quedando las
CGTasas englobadas en la subfamilia GH13_2 (Stam y col., 2006).
En la última revisión (febrero 2010) en la base de datos CAZy (Cantarel y
col., 2009) se han incluido un total de 36 CGTasas, de las cuales sólo 3 han sido
descritas en Archaea.
Introducción
18
1.5.1.- Función celular de las CGTasas
Muchos microorganismos secretan enzimas al medio extracelular para
degradar el almidón presente y facilitar así el suministro de carbohidratos al interior
celular. Entre estas enzimas se encuentran las CGTasas, que son capaces de
convertir el almidón en ciclodextrinas mediante una transglicosilación molecular. Las
ciclodextrinas son oligosacáridos cíclicos no reductores de 6 ( -ciclodextrina), 7 ( -
ciclodextrina), 8 ( -ciclodextrina) o más unidades de glucosa unidas por enlaces
glucosídicos -1,4. Estas ciclodextrinas sintetizadas en el exterior celular pueden
desempeñar dos funciones muy diferentes:
a) Mediante la producción de ciclodextrinas el organismo dispone de una
reserva externa de glucosa, que no suele ser accesible para otras células
debido a que no se pueden metabolizar fácilmente. Cuando el
microorganismo requiera energía adicional, hidrolizará las ciclodextrinas
extracelulares transformándolas en fuente de energía para su crecimiento.
Las ciclodextrinas atraviesan la membrana celular con un sistema de
transporte específico y son hidrolizadas a glucosa y maltosa por una
ciclomaltodextrinasa intracelular (EC 3.2.1.54) (Park y col., 2000).
b) Las ciclodextrinas sintetizadas por estos microorganismos pueden formar
complejos de inclusión con sustancias tóxicas que se encuentren próximas a
ellos para eliminarlas o con compuestos necesarios para el crecimiento
transportándolos al interior celular.
Aunque todas las CGTasas descritas tienen similitudes en la composición de
aminoácidos, sus características enzimáticas son bastante diferentes. La relación
molar de -, - y -ciclodextrina obtenida, así como sus propiedades físico-químicas
varían dependiendo del microorganismo que la genere. Pueden ser clasificadas
como -, - y -CGTasas en función de cuál sea el producto principal que sinteticen
(Qi y Zimmermann, 2005). Existen numerosas - y -CGTasas caracterizadas,
aunque muy pocos casos de -CGTasas. Por ejemplo, la CGTasa de Pyrococcus
Introducción
19
furiosus es una -CGTasa (Lee y col., 2006), la CGTasa de Thermococcus sp. (cepa
B1001) es una -CGTasa (Hashimoto y col., 2001), mientras que la de Bacillus
clarkii es una -CGTasa (Takada y col., 2003).
1.5.2.- Actividad catalítica
La CGTasa es la única glicosiltransferasa que cataliza de forma reversible
transglicosilaciones -1,4 inter e intramoleculares a partir de almidón, presentando
cuatro actividades bien diferenciadas (van der Veen y col., 2000; Qi y
Zimmermann, 2005):
Ciclación: transferencia intramolecular de un extremo reductor (donador) del
azúcar, a un extremo no reductor de la misma cadena (aceptor), formándose
un compuesto cíclico (ciclodextrina) (Figura 4A).
Acoplamiento: es la reacción en la que una molécula de ciclodextrina
(donador) se combina con oligosacáridos lineales (aceptor) para producir
una cadena más larga que la del oligosacárido inicial (Figura 4B).
Transferencia: transferencia intermolecular entre dos cadenas de
oligosacáridos lineales, una de ellas actúa como donador y la otra como
aceptor (Figura 4C).
Hidrólisis: transferencia del extremo reductor del azúcar al agua (aceptor)
(Figura 4D).
Introducción
20
Figura 4: Representación esquemática de las diferentes actividades de la ciclomaltodextrin
glucanotransferasa.
1.5.3.- Estructura y mecanismo
Las CGTasas y las -amilasas comparten alrededor de un 30 % de sus
secuencias. Sus estructuras tridimensionales muestran una clara similitud en la
región N-terminal de aproximadamente 400 residuos, los cuales se presentan en
forma de estructura barril ( / )8 y comprende los dominios A, B, y C (MacGregor y
col., 2001). Esta estructura se organiza mediante 8 hebras paralelas rodeadas por
8 -hélices (Figura 5), y fue por primera vez descrita en la estructura de la isomerasa
triosafosfato de músculo de pollo, denominándose TIM-barrel (del inglés
triosephosphate isomerase) (Alber y col., 1981). En el dominio A se localiza la tríada
catalítica formada por tres residuos ácidos mientras que la función de los otros dos
dominios todavía no está clara, es posible que el dominio B participe en la unión
del sustrato o del Ca+2
.
A
B
C
D
Introducción
21
Figura 5: Estructura barril ( / )8 (TIM-barrel) (Alber y col., 1981).
Sin embargo, en contraste con las -amilasas, las CGTasas poseen dos
dominios C-terminal adicionales implicados en la unión del almidón, dominios D y
E, que se pliegan formando hojas (Figura 6). Por eso la masa molecular de las
CGTasas es mayor, está en torno a 70-75 kDa mientras que la de las -amilasas es
de 45-55 kDa (MacGregor y col., 2001).
Figura 6: Estructura terciaria de una -amilasa (A) de B. stearothermophilus (Suvd y col.,
2001) y una CGTasa (B) de Bacillus sp. 1011 (Harata y col., 1996).
Introducción
22
En el dominio D se han descrito dos sitios de unión de maltosa que forman
parte de una estructura superior, el sitio de unión de almidón (SBD), que se localiza
en una zona alejada del centro activo en la región C-terminal. Dicha región,
comprende una secuencia limitada de gran homología en toda la familia -amilasa
(Svensson y col., 1989). Este SBD permite que la enzima interaccione con el
sustrato, que el sustrato se oriente hacia el centro activo en el dominio catalítico y
altere la superficie del gránulo de almidón (Janecek y col., 2003). En la clasificación
de los sitios de unión de carbohidratos (CBM), se considera que este dominio de
unión a almidón pertenece a la familia 20 (CBM 20) (Machovic y Janecek, 2006).
El SBD está constituido por 90-130 residuos, de los cuales 11 están
estrictamente conservados (Svensson y col., 1989; Machovic y Janecek, 2006) y sus
posiciones aproximadas, tomando como referencia la CGTasa de B.
stearothermophilus (Fujiwara y col., 1992), son las siguientes:
Cuatro de estos 11 residuos, Trp609, Lys644, Trp656 y Asn661, forman
parte del primer sitio de unión de maltosa, mientras que Thr591, Gly594 y Trp629
son parte del segundo sitio de unión. Los residuos restantes, Gly601, Leu606,
Gly607 y Pro627, no se encuentran directamente involucrados en la unión, pero
probablemente son necesarios como soporte estructural de este dominio de unión
de almidón.
Mediante estudios estructurales, se ha descubierto la existencia de un largo
canal que enlaza el centro activo con el sitio de unión de almidón, y en el que se
pueden acomodar de 9 a 10 residuos de glucopiranosa. La cadena de amilosa se
dispone de manera que interacciona con ambos sitios de unión a maltosa
(MacGregor y col., 2001).
La tríada catalítica y los subsitios de unión del sustrato
El centro activo de la CGTasa está compuesto por tres residuos ácidos:
Asp225, Glu253 y Asp321. Esta tríada catalítica está localizada en el fondo de una
Thr591 Gly594 Gly601 Leu606 Gly607 Trp609 Pro627 Trp629 Lys644 Trp656 Asn661
Introducción
23
cavidad situada al final de la estructura TIM ( / )8 en el dominio A. El Glu253 está
rodeado por la mayoría de los residuos hidrófobos del centro activo (Tyr267,
Leu289 y Phe299), mientras que el Asp329 y el Asp230 se encuentran en un
ambiente más polar. En este dominio están presentes otros cuatro residuos
conservados (His136, Arg223, His323 y Asp324) que participan de algún modo en
la unión del sustrato y en la estabilización del estado de transición (Lawson y col.,
1994; Leemhuis y col., 2003a).
El centro activo de la enzima está constituido por una serie de subsitios,
siendo cada uno de ellos capaz de interaccionar con un residuo de glucosa del
sustrato (Figura 7). Cada uno de estos subsitios está formado por las cadenas
laterales de los aminoácidos situados en los lazos que conectan el extremo C-
terminal de las -hélices con el extremo N-terminal de las hélices adyacentes en el
barril ( / )8 del dominio catalítico (MacGregor y col., 2001). Cada residuo de
glucosa del sustrato se une a su subsitio con una alta especificidad mediante
puentes de hidrógeno, fuerzas de van der Waals, o interacciones hidrófobas
(Knegtel y col., 1995).
Figura 7: Esquema de la interacción del sustrato con los subsitios del centro activo. El
oligosacárido ocupa desde el subsitio -5 al +3, la ruptura del enlace tiene lugar entre los
subsitios -1 y +1. El extremo reductor queda unido en el subsitio +3.
La acción de la tríada catalítica
En la CGTasa existe un fuerte puente de hidrógeno (2,5 Å) entre los grupos
Glu253 y Asp321, indicando que uno de los dos carboxilatos está protonado,
probablemente el Glu253. Cuando la amilosa se une al centro activo, el Asp321 se
mueve hacia el azúcar y se forma un puente de hidrógeno entre la cadena lateral
del Asp321 y el hidroxilo del C2 de la glucosa del subsitio 1. Por lo tanto, el puente
de hidrógeno entre el Asp321 y el Glu253 se rompe. A continuación, la cadena
lateral del Glu253 se desplaza hacia una nueva posición, estableciendo un puente
Introducción
24
de hidrógeno con respecto al oxígeno de la unión glicosídica entre los residuos de
los subsitios 1 y -1. De esta manera, escinde la unión entre ambas glucopiranosas
dando comienzo la reacción (MacGregor y col., 2001).
El eje de ciclación
La tríada catalítica del centro activo aparece tanto en las CGTasas como en
las -amilasas, por lo que la diferencia en el comportamiento de ambas enzimas
debe atribuirse a otras razones. A partir de la resolución de las estructuras
tridimensionales de las CGTasas, se ha comprobado que el aminoácido aromático
Phe191 está presente en una situación dominante en la zona central del sitio activo.
Este residuo es la clave que diferencia la actividad CGTasa de la -amilasa, está
presente en el lazo 3 del barril ( / )8 de las CGTasas y ausente en ese mismo lazo
en las -amilasas. Dicha posición se conoce con el nombre de eje ciclación
(MacGregor y col., 2001). Todas las -amilasas poseen un pequeño residuo en ese
lugar (Gly, Leu, Ser, Thr, Val) en contraste con las CGTasas que tienen un
voluminoso residuo aromático en posición equivalente (Tyr o Phe) (Wind y col.,
1998). De esta manera, la actividad de la CGTasa es modulada por el eje de
ciclación que interacciona especialmente con sustratos cíclicos (en reacciones de
acoplamiento) y con sustratos lineales que van a ser convertidos en productos
cíclicos. El tamaño del residuo en la posición 191 es fundamental para la
selectividad de la reacción (Nakamura y col., 1994a).
El mecanismo de la reacción
De las actividades descritas en las CGTasas, la reacción de ciclación es la
más característica que llevan a cabo. En la figura 8C se representa el mecanismo de
acción de la enzima para esta reacción. La cadena de amilosa se une a la CGTasa
en forma de espiral, debido a la capacidad de la Phe191 para formar un complejo
de inclusión con ella. La CGTasa escinde la unión glicosídica -1,4 de la amilosa
gracias a la acción de la tríada catalítica. La ciclodextrina se forma cuando el
extremo no reductor se sitúa en los subsitios anteriormente ocupados por el extremo
reductor de la amilosa (van der Veen y col., 2000). Como se muestra en la figura
8B, los compuestos lineales y cíclicos pueden unirse cerca los unos de los otros en el
Introducción
25
centro activo. Así, el almidón unido en los sitios de unión de maltosa, no tiene que
desplazarse mucho para permitir que se cierre el anillo de la ciclodextrina.
Figura 8: Esquema de las reacciones de transferencia (A), acoplamiento (B) y ciclación (C).
Los dominios se indican como A, B, C, D y E. 1 y 2 indican los sitios de unión a maltosa en
el dominio E. El triángulo señala el sitio de corte en el centro activo. Los círculos son los
residuos de glucosa; en negro los extremos reductores (Van der Veen y col., 2000).
Introducción
26
La reacción de transferencia de la CGTasa (Figura 8A) opera mediante un
mecanismo ping-pong bi bi (Nakamura y col., 1994b), el cual establece que la
transglicosilación ocurre después de que el extremo reductor de la amilosa
escindida (donador) haya sido liberado de la enzima. La transglicosilación
intermolecular tendrá lugar cuando otro aceptor se una a los subsitios S1 y S
2. Si el
agua actúa como aceptor tendrá lugar la reacción de hidrólisis. Sin embargo, si el
aceptor es una cadena de oligosacárido, se producirá la reacción de transferencia.
Por último, la reacción de acoplamiento (Figura 8B) puede explicarse del
siguiente modo. Si en el centro activo se acomoda una ciclodextrina, se producirá la
ruptura de ésta mediante el ataque de la tríada catalítica, abriendo la molécula. A
continuación, se unirá a los subsitios S1 y S
2 un maltooligosacárido, liberándose
como producto final una cadena de dextrina con mayor número de unidades de
glucosa que la ciclodextrina de partida.
1.5.4.- Aplicación biotecnológica de las CGTasas
Desde el inicio de su descubrimiento, se han realizado numerosos estudios
dirigidos hacia la aplicación de las ciclodextrinas en todos los campos de la
industria, basándose en la capacidad que poseen para formar complejos de
inclusión con otras moléculas. A partir de los análisis de las estructuras obtenidas
por difracción de rayos X, se deduce que en las ciclodextrinas los hidroxilos
secundarios (C2 y C3) están localizados en la cara interna del anillo y los hidroxilos
primarios (C6) en la cara externa. Además, los hidrógenos apolares C3 y C5 así
como los oxígenos de las uniones glicosídicas se encuentran en la región interna del
anillo (Van der Veen y col., 2000b) (Figura 9). Como resultado de esto, se tiene una
molécula con una zona externa hidrófila, que puede disolverse en agua, y una
cavidad hidrófoba que proporciona una matriz apolar.
Debido a su estructura, son capaces de formar complejos de inclusión con
gran variedad de moléculas (ácidos grasos, aminas, hidrocarburos alifáticos o
aromáticos, etc.). Estas microencapsulaciones moleculares favorecen la solubilidad
Introducción
27
de moléculas hidrófobas en agua o confieren estabilidad a sustancias volátiles o
lábiles (Singh y col., 2002).
Figura 9: Estructuras de las -, - y -ciclodextrinas.
Las moléculas encapsuladas en ciclodextrinas presentan ventajosos cambios
en sus propiedades químicas y físicas, como por ejemplo:
Estabilización de sustancias lábiles frente a la oxidación, luz visible o
ultravioleta, y calor.
Modificación de la reactividad química de las moléculas encapsuladas.
Fijación de sustancias muy volátiles.
Aumento de la solubilidad de moléculas altamente insolubles.
Aislamiento físico de sustancias incompatibles.
Protección contra la degradación por microorganismos.
Enmascaramiento de los malos olores y sabores, y de los pigmentos o
colores de las sustancias.
Todas estas propiedades, que las ciclodextrinas o sus derivados confieren a
las moléculas que albergan, las hacen apropiadas para sus aplicaciones en muchos
campos de la industria.
Alimentación
La principal aplicación de las ciclodextrinas en alimentos se desarrolla en la
estabilización de aromas, incluso a elevadas temperaturas y durante largos períodos
Introducción
28
de tiempo. Del mismo modo, las ciclodextrinas pueden estabilizar y proteger
ingredientes de los alimentos frente a descomposición por luz o calor, o frente a
oxidación (Szente y Szejtli, 2004). Otra importante aplicación alimentaria es la
eliminación o disminución de olores o sabores no deseados como el amargor de los
zumos de cítricos (Singh y col., 2002; Szente y Szejtli, 2004; Szejtli y Szente, 2005).
Además, las ciclodextrinas son empleadas con emulsiones y cremas batidas al
provocar cambios en las interacciones de los complejos lípido-proteína de las
sustancias que encapsulan (Comini y Mentink, 1991; Szente y Szejtli, 2004).
La ingestión de ciclodextrinas no es perjudicial para el ser humano. Las
ciclodextrinas presentes en los productos alimentarios son bastante resistentes a las
enzimas que degradan el almidón, aunque pueden ser hidrolizadas con bajos
rendimientos por -amilasas. La -ciclodextrina prácticamente no es degradada,
mientras que la -, y sobre todo la -ciclodextrina son hidrolizadas con mayor
facilidad debido a su tamaño y flexibilidad. Dicha descomposición no se lleva a
cabo a través de las amilasas presentes en la saliva o en el páncreas, sino mediante
-amilasas de microorganismos de la flora del colon. Los estudios de absorción
revelan que únicamente el 2-4 % de las ciclodextrinas ingeridas se absorben en el
intestino delgado, y que el resto es degradado y recuperado como glucosa en el
colon. Esto explica la baja toxicidad encontrada tras la ingestión de ciclodextrinas y
sus derivados (Stella y He, 2008).
Farmacia
Existen numerosas aplicaciones de las ciclodextrinas en la industria
farmacéutica (Loftsson y Masson, 2001; Challa y col., 2005; Brewster y Loftsson,
2007). En algunos casos, esto supone una mayor vida media del medicamento,
incrementando sus efectos farmacológicos y permitiendo una reducción en la
dosificación de la droga suministrada (Carrier y col., 2007). Los complejos de
inclusión pueden también facilitar la manipulación de productos volátiles,
proporcionando diferentes vías de administración de drogas, como por ejemplo en
forma de tabletas o grageas y de forma parenteral (Miller y col., 2007; Estella y He,
2008). Debido a la capacidad que ofrecen las ciclodextrinas de encapsular no sólo
Introducción
29
drogas sino también péptidos, proteínas, oligosacáridos y oligonucleótidos, un gran
número de investigaciones van dirigidas hacia el empleo de las ciclodextrinas en el
tratamiento del cáncer y en terapia génica (Singh y col., 2002; Dass, 2004).
Cosmética
La industria cosmética es otra área que emplea gran cantidad de
ciclodextrinas, principalmente para disminuir la volatilidad de los aromas en los
perfumes, desodorantes y ambientadores, produciendo fragancias de larga duración
(Buschmann y Schollmeyer, 2001; Numanoglu y col., 2007). Las ciclodextrinas
presentes en detergentes y lavavajillas enmascaran los olores en los artículos
lavados (Foley y col., 2000; Angell y France, 2001). En los dentífricos aumentan la
disponibilidad de triclosán, un potente agente antimicrobiano (Loftsson y col.,
1999).
Otras aplicaciones interesantes se dan en la industria textil (Singh y col.,
2002), en química analítica (Singh y col., 2002), en procesos de bioconversión y
fermentación (Singh y col., 2002), en tecnología enzimática (Villalonga y col.,
2007), y en la agricultura y medio ambiente (Singh y col., 2002).
1.6.- Sistemas de transporte de proteínas extracelulares
Hfx. mediterranei secreta proteínas fuera del espacio celular. Estas proteínas
se sintetizan normalmente con una extensión N-terminal llamada péptido señal que
dirige su translocación. Este proceso implica la participación de componentes
citoplásmicos o de membrana, como las peptidasas que hidrolizan este péptido
señal de las proteínas precursoras (Ring y Eichler, 2004; Ng y col., 2007). En
arqueas las proteínas extracelulares son exportadas por dos mecanismos
principalmente, el sistema Sec y el Tat (Twin-arginine translocation). Ambos se
diferencian básicamente en que en el primero de ellos las proteínas son
translocadas en forma lineal y en el segundo plegadas (Pohlschroder y col., 2005b).
Introducción
30
1.6.1.- Sistema Sec
El sistema Sec es el principal sistema de transporte en los tres Dominios,
Bacteria, Eukarya y Archaea. Está constituido por componentes solubles y
componentes ligados a la membrana (Figura 10). Las proteínas secretadas por este
sistema se translocan en una conformación lineal gracias a una chaperona, SecB,
que retrasa su plegamiento. SecB forma un complejo con la proteína que va a ser
translocada y se dirige hacia la membrana donde la proteína precursora es
liberada. El núcleo del translocón está constituido por las proteínas integrales de
membrana, SecY y SecE, que interaccionan con las proteínas SecG y la subunidad
periférica SecA. SecA es esencial para la translocación, es una proteína citosólica
que se puede encontrar asociada tanto a la membrana como a los ribosomas,
permitiéndole interaccionar con las proteínas dianas en el citoplasma, en los
ribosomas y en la membrana interna. SecA junto con SecYEG utilizan la fuerza
protón-motriz y la hidrólisis de ATP (mediada por SecA) para translocar la proteína
diana (Driessen y Nouwen, 2008). La hidrólisis de ATP promueve las primeras
etapas de la translocación, mientras que la fuerza protón-motriz completa el
proceso. Las proteínas SecD y SecF corresponden a subunidades accesorias que no
son esenciales para la translocación, están implicadas en procesos de liberación de
las proteínas transportadas o en el mantenimiento de la fuerza protón motriz a
través de la membrana interna (Bolhuis, 2004).
El sistema Sec reconoce proteínas que contienen un péptido señal
característico en el extremo N-terminal. Este péptido tiene de 18 a 26 residuos y
contiene tres dominios diferenciados: una región N-terminal cargada positivamente,
un núcleo hidrofóbico y una región C-terminal que contiene el sitio de corte de la
peptidasa señal (Pohlschroder y col., 2005b).
Introducción
31
Figura 10: Esquema de los componentes del sistema Sec (Pohlschroder y col., 2005b).
1.6.2.- Sistema Tat (Twin Arginine Translocation)
Paralelamente al sistema Sec, se ha encontrado un sistema de transporte
independiente de ATP, sin componentes solubles y dependiente de gradiente de pH
(Pohlschroder y col., 2004). Este sistema alternativo, reconoce proteínas que
presentan péptidos señales con una secuencia muy conservada en la que se
incluyen dos argininas, de ahí el nombre que se emplea para denominarlo. Otra
característica importante es su capacidad de transportar proteínas de diferentes
tamaños en conformación plegada, a través de la membrana citoplasmática. En
muchos casos las proteínas transportadas por este sistema llevan un cofactor
metálico que se incorpora en el citoplasma (Berks y col., 2005; Sargent, 2007).
El sistema de transporte Tat está constituido generalmente por tres proteínas
transmembrana, TatA, TatB y TatC. TatA y TatB poseen una estructura similar, están
formadas por una hélice transmembrana en el N-terminal seguida por una hélice
anfipática hacia el lado citoplasmático de la membrana. TatC es una proteína
altamente hidrofóbica constituida por seis hélices transmembrana con las regiones
N- y C-terminal hacia el citoplasma (Pohlschroder y col., 2005a).
El sistema Tat ha sido ampliamente estudiado en Escherichia coli y en
cloroplastos. Se han diferenciado dos complejos de alto peso molecular: un módulo
que contiene múltiples protómeros de TatA (hasta 20 copias) formando un canal
Introducción
32
para el transporte de la proteína hacia el medio extracelular, y un módulo llamado
de reconocimiento constituido por TatB y TatC en cantidades equimolares. Este
segundo módulo es el que se encarga del reconocimiento del péptido señal y de
dirigir la proteína hacia el poro que forma TatA en la membrana. Análisis de las
secuencias de los tres componentes, han puesto de manifiesto que TatC posee una
región altamente conservada con residuos polares que interaccionarían con los
residuos de arginina, mientras que TatB sería compatible con la región hidrófoba
del péptido señal. El transporte depende energéticamente de un gradiente
electroquímico de protones (Sargent, 2007). En la figura 11 se muestra un esquema
del modelo estructural y funcional del sistema Tat.
Figura 11: Esquema del modelo funcional y estructural del sistema Tat (Palmer y col.,
2004).
Los péptidos señal que dependen del sistema Tat son más largos que los del
sistema Sec, están formados por 26-58 residuos. Presentan una secuencia consenso
específica (S/T-R-R-X-F-L-K) en su extremo amino, donde X representa cualquier
aminoácido. Tienen una organización tripartita semejante a la de los péptidos señal
dependientes de Sec, pero con un dominio C-terminal caracterizado por poseer
Introducción
33
residuos aminoacídicos básicos y una región intermedia mucho menos hidrofóbica,
debido a una mayor presencia de residuos de Gly y Thr y una significativa
deficiencia de residuos de Leu (Sargent, 2007). Numerosos experimentos han
demostrado que las dobles Arg del motivo consenso son esenciales para direccionar
las proteínas hacia el sistema Tat, aunque hay algunas excepciones. Así por
ejemplo, en E. coli se ha observado que la sustitución de ambas Arg en el péptido
señal de la proteína TorA por Lys, bloquean su transporte (Cristóbal y col., 1999).
Varias proteínas transportadas por el sistema Tat actúan en cadenas de
transporte de electrones que participan procesos de respiración y fotosíntesis, por lo
que son esenciales para numerosos procesos metabólicos. Estas proteínas
normalmente incorporan cofactores metálicos antes de ser transportadas. En la
biogénesis de los sustratos del sistema Tat, la inserción del cofactor metálico es
asistida por compuestos citoplásmicos de ensamblaje que reconocen y se ligan a la
proteína precursora. En este proceso parece que el péptido señal de la proteína
juega un papel fundamental en la interacción de la proteína que va a ser
translocada y los factores de ensamblaje (Berks y col., 2000). Si la incorporación del
cofactor metálico está bloqueada, las proteínas se acumulan en el citoplasma,
sugiriendo que la presencia del cofactor es un requisito esencial para su transporte
(Maillard y col., 2007) y si se restaura la incorporación del cofactor metálico de
nuevo pueden translocarse (Santini y col., 1998).
Las arqueas halófilas son los únicos organismos conocidos hasta la fecha
que utilizan preferentemente el sistema Tat frente al Sec para el transporte de sus
proteínas. Al menos un 60-70 % de las proteínas secretadas en haloarqueas
contienen el péptido señal característico del sistema Tat, mientras que el resto de
organismos secretan más del 90 % de sus proteínas por el sistema Sec (Kwan y col.,
2008). El sistema Tat es esencial para la viabilidad de estos microorganismos (Dilks
y col., 2005; Thomas y Bolhuis, 2006). Constituye una adaptación a las elevadas
concentraciones salinas en las que habitan, ya que es el único sistema que permite
transportar proteínas plegadas (Dilks y col., 2003). Se han encontrado proteínas que
se transportan por este sistema en Hfx. volcanii (Gimenez y col., 2007),
Introducción
34
Halobacterium sp. NRC-1 (Bolhuis, 2002) y Haloarcula hispanica (Kwan y col.,
2008) entre otros.
1.7.- Transportadores tipo ABC (ATP-binding cassette)
Los sistemas ABC constituyen una de las familias de proteínas más
abundantes (Higgins, 2001; Davidson y col., 2008). Se han identificado en
organismos pertenecientes a los tres Dominios y puede considerarse como el
mecanismo más antiguo por el que los solutos atraviesan la bicapa lipídica en
contra de un gradiente de concentración (Schneider y Hunke, 1998). Estos sistemas
acoplan la energía liberada por la hidrólisis de ATP a la translocación de una
amplia variedad de sustancias a través de las membranas celulares, como iones,
aminoácidos, vitaminas, péptidos, polisacáridos, hormonas, lípidos, etc. Debido a
esta gran variedad de sustancias, los transportadores ABC están involucrados en
diversos procesos celulares como captación de nutrientes esenciales, mantenimiento
de la homeostasis osmótica, protección contra compuestos nocivos, resistencia a
fármacos y antibióticos, etc. (Jones y George, 2004; Davidson y col., 2008). Otra
de sus características es que el movimiento del soluto puede ser hacia el interior o
hacia el exterior de la célula. Los transportadores ABC pueden ser importadores sólo
en el caso de procariotas, o exportadores tanto en procariotas como en eucariotas
(Young y Holland, 1999; Davidson y col., 2008).
1.7.1.- Organización en dominios de los transportadores ABC
A pesar de la variedad de solutos y procesos en los que están involucrados,
los transportadores ABC comparten una estructura principal conservada formada
por cuatro dominios o subunidades proteicas: dos dominios transmembrana (TMD) y
dos dominios de unión a nucleótido (NBD) localizados en la cara citoplasmática de
la membrana. Los TMD forman el canal de translocación a través de la membrana,
y los NBD se consideran los motores moleculares que transforman la energía
química del ATP en cambios conformacionales de la proteína, proporcionando la
energía para el transporte activo. En procariotas, cada uno de los cuatro
Introducción
35
componentes se expresa generalmente como subunidades polipeptídicas
individuales, aunque también se pueden organizar como homo- o heterodímeros
(Driessen y col., 2000; Davidson y col., 2008) (Figura 12).
Estos cuatro dominios principales son suficientes para mediar la translocación
de solutos a través de la membrana. Sin embargo, algunos transportadores ABC
poseen dominios con funciones reguladoras y otras proteínas con funciones
específicas (Boos y Bohm, 2000). Así, los importadores ABC requieren una proteína
extracelular de unión a soluto (SBP) que une el sustrato en el exterior celular y lo
cede al complejo transportador asociado a la membrana (van der Heide y Poolman,
2002; Davidson y col., 2008).
Figura 12: Organización en dominios de los transportadores ABC. (a) corresponde con un
importador formado por cuatro polipéptidos independientes, (b) se trata de un exportador
en el que aparecen fusionados los dominios transmembrana.
Dominios transmembrana (TMD)
Los dominios TMD contienen múltiples segmentos hidrofóbicos que
atraviesan varias veces la membrana (Higgins, 2001). Típicamente se predicen seis
-hélices transmembrana por cada dominio, un total de doce por transportador. Los
TMD forman el canal a través del cual los solutos atraviesan la membrana, y
determinan la especificidad del transportador ya que poseen sitios de unión para el
soluto (Higgins, 2001; Oldham y col., 2007).
Extracelular
Citoplasma
Introducción
36
Los sistemas importadores ABC poseen en los TMD una secuencia
conservada, E-A-A-X-X-X-G-X9-I-X-L-P, donde X representa cualquier aminoácido
(Saurin y Dassa, 1994; Saurin y col., 1994). Este motivo está implicado en
interacciones específicas entre regiones de los TMD y los dominios de unión a
nucleótido (NBD) (Mourez y col., 1997; 1998). La estrecha interacción entre los
dominios NBD y TMD constituiría un mecanismo para señalizar la presencia del
soluto en la cara externa y el acoplamiento de la hidrólisis del ATP, para translocar
el soluto a través de la membrana (Jones y George, 1999). Este motivo no está
presente en los transportadores ABC con función exportadora.
Dominios de unión a nucleótido (NBD). Estructura del ATP-binding cassette.
Los dominios NBD, también denominados ATP-binding cassette, son
hidrofílicos y están localizados periféricamente en la cara citoplasmática de la
membrana. Los NBD proporcionan energía al transportador por unión e hidrólisis
de ATP, que estaría acoplada a cambios conformacionales en los TMD, encargados
de mediar el transporte unidireccional de los sustratos a través de la membrana
(Davidson y col., 2008).
A pesar de la gran diversidad de solutos transportados, las secuencias de los
dominios NBD están muy conservadas entre todos los transportadores ABC,
sugiriendo un mecanismo similar de acoplamiento de la hidrólisis del ATP al
transporte. Se caracterizan por dos motivos en su secuencia primaria que se supone
forman el sitio de unión a nucleótido: el motivo Walker A (G-X-X-G-X-G-K-S/T,
donde X representa a cualquier aminoácido) y el motivo Walker B (h-h-h-h-D, donde
h representa un aminoácido hidrofóbico) (Walker y col., 1982). El motivo Walker B
está inmediatamente precedido por un motivo con una secuencia muy conservada
(L-S-G-G-Q-Q/R/K-Q-R) que es única en los transportadores ABC y que se conoce
como motivo LSGGQ, linker peptide o signature sequence (Schneider y Hunke,
1998) (Figura 13).
Se ha comprobado que mutaciones en los motivos conservados Walker A y
Walker B, reducen severamente o eliminan el transporte y la actividad ATPasa
Introducción
37
(Koronakis y col., 1993). Por otro lado, mutaciones que afectan al motivo LSGGQ
eliminan la actividad ATPasa in vitro pero no la unión de ATP (Schmees y col.,
1999). Este último motivo estaría implicado en la señalización durante el transporte,
probablemente activando la hidrólisis del ATP en el centro catalítico del NBD.
Figura 13: Representación lineal de un dominio ABC típico asignando los sitios funcionales
principales.
Existen otros residuos conservados que contactan con el -fosfato del
nucleótido unido, y constituyen las denominadas switch region, que experimentan
cambios conformacionales durante el ciclo catalítico. Así, en las ATPasas ABC se
encuentra un residuo de Gln seguido de una región flexible conocida como Q-loop
(Hopfner y col., 2000), lid (Diederichs y col., 2000) o phosphate linker (Yuan y
col., 2001). El Q-loop es el punto de contacto con los TMD (Locher y col., 2002) y
está también en contacto con el sitio de unión a ATP (Yuan y col., 2001; Smith y
col., 2002). Por lo tanto, esta región posee la función de acoplar la hidrólisis al
transporte, favoreciendo la comunicación entre los TMD y el centro activo de los
NBD (Hunke y col., 2000; Urbatsch y col., 2000).
El residuo de Asp del motivo Walker B está inmediatamente seguido por un
residuo de Glu muy conservado, y por una región conservada de seis aminoácidos
(A/P-T-S-A-L-D) denominada D-loop (Hopfner y col., 2000). Este residuo de Glu
podría ser la base catalítica de la reacción de hidrólisis, debido a que su mutación
provoca una completa inactivación de la actividad ATPasa (Smith y col., 2002;
Introducción
38
Moody y col., 2002). Por eso, se piensa que esta región influye en la actividad
catalítica y la intercomunicación entre los sitios activos.
Por último, existe una región conocida como H-loop constituida por un
residuo de His seguido de una estructura en -hélice de seis residuos (Hopfner y
col., 2000), que se corresponde con la región inicialmente denominada switch
region (Schneider y Hunke, 1998). Las mutaciones de este residuo de His provocan
una pérdida de la actividad ATPasa en las subunidades NBD purificadas y eliminan
el transporte de la permeasa (Nikaido y Ames, 1999; Davidson y Sharma, 1997),
por lo que se piensa que este residuo tendría función en la catálisis (Smith y col.,
2002).
Proteína de unión a soluto (SBP)
Estas proteínas de unión a soluto, unen específicamente dicho soluto y lo
ceden a las subunidades de membrana del transportador (Ames y col., 1996). Esto
implica una estrecha relación de la proteína SBP con las proteínas de la permeasa,
antes de liberar el sustrato para su transporte al citoplasma a través del canal
formado por las proteínas de membrana. Se piensa que esta SBP actúa como una
señal de transducción que inicia el transporte por una interacción específica con los
dominios transmembrana (Ames y Joshi, 1990; Davidson y col., 1992). En bacterias
Gram-negativas, las SBP difunden libremente en el periplasma, mientras que en
bacterias Gram-positivas y en arqueas, se encuentran frecuentemente ancladas a la
membrana citoplasmática mediante un motivo lipídico, estando algunas incluso
fusionadas al dominio TMD (Obis y col., 1999).
Además de las similitudes estructurales, los sistemas de transporte
dependientes de SBP, poseen varias características en común: son transportadores
de alta afinidad (a escala submicromolar) que utilizan la hidrólisis de ATP como
energía y funcionan de forma unidireccional para conducir los solutos en contra de
elevados gradientes de concentración. Además, los genes que codifican estos
componentes estructurales suelen estar organizados en un operón (Driessen y col.,
2000).
Introducción
39
Acoplamiento de la hidrólisis del ATP al transporte
Todos los modelos actuales para los transportadores ABC resaltan el papel
clave que tiene el cambio conformacional de la proteína en el mecanismo por el
que la hidrólisis de ATP se acopla al transporte (Chen y col., 2001; Urbatsch y col.,
2003; Davidson y col., 2008). Se ha sugerido que los TMD controlan la hidrólisis de
ATP (Smith y col., 2002; Jones y George, 2004), de tal forma que la unión del
soluto a los TMD estimularía la hidrólisis de ATP al interaccionar estos con el motivo
LSGGQ del NBD (Szakacs y col., 2000).
El ciclo del transporte comenzaría con la unión del soluto al transportador
cedido por la proteína de unión al soluto (SBP) en sistemas importadores o bien
tomada directamente del citoplasma en exportadores. La señal de la unión sería
transmitida a los sitios de hidrólisis de nucleótido, donde se cree que provoca un
aumento de la afinidad para el ATP. Las dos subunidades NBD unirían e
hidrolizarían ATP cooperativamente, provocando cambios conformacionales, que se
acoplarían a cambios en los dominios TMD asociados a una translocación
unidireccional del soluto. Una vez que el soluto atraviesa la membrana, el
transportador regresaría al estado de reposo con la disociación del ADP y el fosfato
inorgánico (Hollenstein y col., 2007; Linton, 2007) (Figura 14).
Figura 14: Mecanismo de actuación de un transportador ABC que exporta un soluto al
medio extracelular (Linton, 2007).
Introducción
40
1.8.- Objetivos
El objetivo general de este trabajo consiste en:
Avanzar en el conocimiento de los determinantes moleculares de la
estabilidad de las proteínas halofílicas.
Este propósito comprende los siguientes objetivos específicos:
1. Detectar y caracterizar proteínas extracelulares implicadas en la degradación
de almidón como fuente de carbono en Hfx. mediterranei.
2. Optimizar la producción de enzimas extracelulares, y en concreto la
ciclomaltodextrin glucanotransferasa como modelo de proteína extracelular.
3. Comparar su estructura con las de otras proteínas halofílicas y analizar las
diferencias, si es que las hay, entre proteínas intracelulares y extracelulares.
MATERIALES Y MÉTODOS
Materiales y métodos
43
2.1.- Microorganismo
El microorganismo sobre el cual se centra el presente estudio es Haloferax
mediterranei (ATCC 33500T
), cepa denominada R4 (Tindall, 1992).
2.2.- Purificación y caracterización de la ciclomaltodextrin glucanotransferasa
(CGTasa) de Hfx. mediterranei
2.2.1.- Condiciones de cultivo
Hfx. mediterranei se cultivó hasta fase estacionaria en medio mínimo con agua
de sales al 25 % (p/v) (Apéndice I) (Rodríguez-Valera y col., 1980b), acetato
amónico al 1 % (p/v) como fuente de carbono y nitrógeno, suplementado con un
0,2 % (p/v) de almidón soluble, y pH 7,2. Se inoculó 1 l de medio con 5 ml de
precultivo y se creció aeróbicamente en Erlenmeyers de 2 l a 42 ºC con agitación.
El crecimiento del cultivo se siguió midiendo la densidad óptica a 600 nm en
un espectrofotómetro “Ultraspec 2000” (GE Healthcare).
2.2.2.- Obtención del extracto enzimático
El cultivo se centrifugó durante 1 hora a 9000 rpm en una centrífuga
“Beckman J20-XP” con un rotor angular JLA-9100. Las células se desecharon y el
sobrenadante se empleó como preparación enzimática cruda.
2.2.3.- Determinación de la concentración de proteínas
La cuantificación de la concentración de proteínas se llevó a cabo mediante
el método Bradford (Bradford, 1976), basado en el principio de unión proteína-
colorante, con rectas de calibrado realizadas con albúmina de suero bovino
(Roche).
Materiales y métodos
44
2.2.4.- Medidas de actividad catalítica de la CGTasa
2.2.4.1.- Actividad de ciclación
La determinación de las actividades de formación de -, -, y -ciclodextrina
se basa en la afinidad de cada una de las ciclodextrinas hacia determinados
reactivos:
- Ciclación a -ciclodextrina: la -ciclodextrina puede encapsular el
naranja de metilo produciendo una disminución del color de éste (Hirai y
col., 1981).
- Ciclación a -ciclodextrina: la fenolftaleína, a valores de pH básicos, es
de color púrpura. La -ciclodextrina forma complejos de inclusión con
este reactivo produciéndose una disminución cuantificable del color
(Peninga y col., 1995).
- Ciclación a -ciclodextrina: el verde de bromocresol puede ser
encapsulado por la -ciclodextrina, intensificándose el color de este
reactivo (Kato y Horikoshi, 1984).
Los ensayos se realizaron por triplicado y en todos los casos la mezcla de
reacción se atemperó a 55 ºC durante 10 minutos. Tras añadir la CGTasa, la
reacción transcurrió a 55 ºC durante 20 minutos en los que se extrajeron alícuotas y
se añadieron a los correspondientes reactivos.
Concretamente, los protocolos que se siguieron para medir cada una de las
actividades fueron los siguientes (Alcalde, 1999):
Ciclación a -ciclodextrina: la mezcla de reacción contenía 400 l de la
disolución enzimática, 3,24 ml de almidón al 1 % (p/v) (en tampón A: Bis-Tris
propano 0,1 M pH 7,0, NaCl 1,5 M), 1,08 ml de naranja de metilo 1 mM
(disolución madre de naranja de metilo 30,5 mM en una mezcla de etanol:agua
(1:1)), y 11,48 ml de tampón A (Apéndice I). En los primeros 5 minutos de reacción
se tomaron alícuotas de 840 l cada 30 segundos, para continuar cada 2 minutos
Materiales y métodos
45
hasta completar la reacción. Las alícuotas se mantuvieron en hielo hasta la
finalización de la reacción y se añadieron a cubetas que contenían 60 l de HCl 1,5
M para parar la reacción. Inmediatamente después se midió la absorbancia a 490
nm que corresponde al máximo de absorción del naranja de metilo a pH 1,5. Para
referenciar el valor de esta actividad se realizó una curva de calibrado con -
ciclodextrina.
Ciclación a -ciclodextrina: la mezcla de reacción contenía 50 l de la
disolución enzimática, 500 l de almidón al 1 % (p/v) (en tampón A), y 450 l de
tampón A. Se tomaron alícuotas de 100 l cada 2 minutos y se mantuvieron en
hielo hasta que finalizaron los 20 minutos de la reacción completa. Seguidamente
se añadieron a cubetas que contenían 900 l de disolución de fenolftaleína 0,06
mM en tampón Na2CO
3 0,2 M pH 9,6 (disolución madre de fenolftaleína 3,75 mM
en etanol absoluto). Inmediatamente después se midió la absorbancia a 552 nm,
que corresponde al máximo de absorción de la fenolftaleína a pH 9,6. Para
determinar esta actividad se realizó una curva de calibrado con -ciclodextrina.
Ciclación a -ciclodextrina: la mezcla de reacción contenía 50 l de la
disolución enzimática, 500 l de almidón al 1 % (p/v) (en tampón A), y 450 l de
tampón A. Como en el caso anterior, cada 2 minutos se tomaron alícuotas de 100
l que se mantuvieron en hielo hasta la finalización de la reacción. A continuación
se añadieron a cubetas que contenían 900 l de disolución de verde de
bromocresol 0,125 mM en tampón citrato 0,2 M pH 4,2 (disolución madre de verde
de bromocresol 5 mM en etanol al 20 % (v/v)). Inmediatamente después se midió la
absorbancia a 630 nm, que corresponde al máximo de absorción del verde de
bromocresol a pH 4,2. Se realizó una curva de calibrado con -ciclodextrina para
calcular la actividad.
Una unidad de actividad de ciclación (U) se define como la cantidad de
enzima que produce 1 mol de -, -, o -ciclodextrina (según el ensayo realizado)
por minuto, en las condiciones de reacción.
Materiales y métodos
46
2.2.4.2.- Actividad de acoplamiento
Para determinar la actividad de acoplamiento, se utilizó un protocolo basado
en el empleo de - o -ciclodextrina como donador y metil -D-glucopiranósido
como aceptor (Nakamura y col., 1994a). La actividad de acoplamiento de -
ciclodextrina no puede ser cuantificada por este método ya que esta ciclodextrina
interfiere en el análisis (Alcalde y col., 2003).
En esta reacción se forma un oligosacárido lineal con 6 o 7 residuos de
glucopiranosa, según sea el donador - o -ciclodextrina respectivamente,
finalizado en un residuo adicional de metil -D-glucopiranósido. Este azúcar puede
ser hidrolizado en unidades de glucopiranosa por una amiloglucosidasa
(amiloglucosidasa de Aspergillus niger, Fluka) (Figura 15). La cantidad de glucosa
producida se detecta con el reactivo GOD-PAP (Randox). Este reactivo está
constituido por una glucosa oxidasa, una peroxidasa y 4-aminofenazona. La
glucosa oxidasa oxida la glucosa formada liberando H2O
2 que reacciona con el
colorante en presencia de la peroxidasa, desarrollando una tonalidad rojo-violeta.
El protocolo para la medida de actividad de acoplamiento fue el mismo para
las dos ciclodextrinas. En todos los casos, los ensayos se realizaron por triplicado y
la mezcla de reacción se atemperó a 55 ºC durante 10 minutos. Tras añadir la
CGTasa, la reacción transcurrió a 55 ºC durante 20 minutos en los que se
extrajeron alícuotas a intervalos de 1 minuto y se añadieron a los correspondientes
reactivos.
La mezcla de reacción contenía 100 l de disolución enzimática, 500 l de
- o -ciclodextrina 10 mM (según el ensayo realizado), 500 l de metil -D-
glucopiranósido y 900 l de tampón A (Alcalde, 1999). Cada minuto se tomaron
alícuotas de 100 l que se añadieron a 20 l de HCl 1,2 N y se mantuvieron en
hielo hasta la finalización de la reacción. Las muestras acidificadas se incubaron
durante 10 minutos a 60 ºC. Transcurrido este tiempo, se enfriaron en hielo y se
neutralizaron con 20 l de NaOH 1,2 N. Los oligosacáridos lineales formados se
convirtieron en glucosa mediante la adición de 1 unidad de amiloglucosidasa
diluida en tampón acetato sódico 170 mM pH 4,5. A continuación las muestras se
incubaron en hielo durante 30 minutos. Posteriormente, se añadió 1 ml de reactivo
Materiales y métodos
47
GOD-PAP (Randox) y se incubó 1 hora a temperatura ambiente adquiriendo una
tonalidad rojo-violeta. Se midió la absorbancia a 500 nm. Para referenciar el valor
de esta actividad se realizó una curva de calibrado con glucosa.
Una unidad de actividad - o -acoplamiento (U) se define como la cantidad
de enzima que cataliza la desaparición de 1 mol de - o -ciclodextrina (según el
ensayo realizado) por minuto, en las condiciones de reacción.
Figura 15: Reacción de -acoplamiento. Los azúcares reductores liberados por la acción de
la amiloglucosidasa son fácilmente cuantificables colorimétricamente con el reactivo GOD-
PAP
-ciclodextrina
+
Metil- -D-glucopiranósido
CGTasa
Amiloglucosidasa
O O H
H O O H O
O O H
O H
O H
O
O O H
O H
O H
O O
O H
O H
H O O
O O H
O H H O
O
O O H
H O
H O
O
O
O H H O
O H
O H
O H
H
O M e
C H 2 O H
H O H
H
H
O H
O H
O H
C H 2 O H
H O H
H
H
O H
O
O
H
O H
O H
H
O
C H 2 O H
H O
H
O H
O H
H
O
C H 2 O H
H O
H
O H
O H
H
O
C H 2 O H
H O
H
O H
O H
H
O
C H 2 O H
H O
H
O H
O H
H
O
C H 2 O H
H O
H
O H
O H
H
O
C H 2 O H
H O
H
O H
O H
H
C H 2 O H
H H
O M e
+ 7
7 residuos de glucosa
H
O H
O H
H
C H 2 O H
H H
O H
H
O H
Metil- -D-glucopiranósido
H
O H
H
O M e
C H 2 O H
H O H
H
H
O H
Materiales y métodos
48
Et-G7-pNP + G2 Et-G6 + G3-pNP
G3-pNP pNPOH + 3G1
CGTasa
Amiloglucosidasa
2.2.4.3.- Actividad de transferencia
Para detectar esta actividad es necesario emplear dos azúcares lineales, uno
de ellos actuará como donador y el otro como aceptor. En este ensayo se emplea
maltosa como aceptor y p-nitrofenil- -D-maltoheptaósido-4-6-O-etilideno (EPS)
(Randox) como donador. Este sustrato está bloqueado en su extremo no reductor,
eliminando la posibilidad de que actúe como aceptor. Además, contiene un grupo
p-nitrofenilo en el extremo reductor que permite cuantificar la reacción (Nakamura y
col., 1994b) (Figura 16).
Figura 16: La CGTasa cataliza la ruptura del EPS (Et-G7-pNP), liberando un fragmento de
tres residuos de glucosa finalizados en un grupo p-nitrofenilo (G3-pNP). El intermediario
covalente enzima-maltotetraósido-4-6-O-etilideno reacciona con la maltosa (G2)
produciendo maltohexaósido-4-6-O-etilideno (Et-G6). La reacción se cuantifica gracias a la
acción de una amiloglucosidasa, que ataca por el extremo no reductor al fragmento de
maltotriosa (G3-pNP), desprendiendo finalmente p-nitrofenol (pNPOH).
Como en las medidas anteriores, la actividad se determinó por triplicado y la
mezcla de reacción se atemperó a 55 ºC durante 10 minutos. Tras añadir la
CGTasa, la reacción transcurrió a 55 ºC durante 20 minutos en los que se
extrajeron alícuotas a intervalos de 1 minuto y se añadieron a los correspondientes
reactivos.
La mezcla de reacción contenía 100 l de disolución enzimática, 400 l de
maltosa 50 mM en tampón A, 273 l de EPS 22 mM y 1227 l de tampón A
(Alcalde, 1999). Se tomaron alícuotas de 100 l que se añadieron a 20 l de HCl
1,2 N y se mantuvieron en hielo hasta la finalización de la reacción. Las muestras
acidificadas se incubaron durante 10 minutos a 60 ºC. Seguidamente, se enfriaron
en hielo y se neutralizaron con 20 l de NaOH 1,2 N. La liberación del grupo p-
Materiales y métodos
49
nitrofenilo se produjo mediante la adición de 250 l (1 unidad) de -glucosidasa
(Randox), incubándose las muestras durante 1 hora a 37 ºC. Posteriormente, se
adicionó a cada muestra 1 ml de Na2CO
3 1 M para ajustar el pH por encima de
10. Finalmente, se midió la absorbancia a 401 nm.
Una unidad de actividad de transferencia es la cantidad de enzima que
cataliza la aparición de 1 mol de p-nitrofenol por minuto en las condiciones
descritas.
2.2.4.4.- Actividad de hidrólisis
La actividad hidrolítica se midió por triplicado con dos procedimientos
diferentes dependiendo del tipo de análisis que se quería realizar:
Método de unión de yodo: se empleó en las diferentes etapas
cromatográficas para detectar en qué fracción se encontraba la proteína. En este
método, la hidrólisis del almidón se hace evidente por la disminución de la
formación del complejo almidón-yodo. La actividad de la enzima es inversamente
proporcional a la cantidad de complejo almidón-yodo. La mezcla de reacción
contenía 50 l de almidón soluble al 1 % (p/v) en tampón A y 50 l de disolución
enzimática. La reacción se incubó a 55 ºC durante 5 minutos y se paró enfriando en
hielo. El color se desarrolló por adición de la disolución de yodo (KI al 4 % (p/v), I
al 1,25 % (p/v)), y la pérdida de almidón se midió espectrofotométricamente a 600
nm. La unidad de actividad enzimática (U) se definió como la cantidad de proteína
capaz de hidrolizar 1 mg de almidón en 1 minuto (Haseltine y col., 1996).
Método del dinitrosalicílico (DNS) (Miller, 1959): se utilizó en la
caracterización de la actividad hidrolítica de la CGTasa. Se basa en determinar la
cantidad de azúcares reducidos obtenidos a partir de almidón. La hidrólisis del
almidón supone un aumento en el número de extremos reductores, y este
incremento puede ser determinado por el ácido 3,5-dinitrosalicílico. Se trata de un
compuesto de color amarillo-naranja, que en medio alcalino se transforma en
Materiales y métodos
50
diaminosalicílico, de color rojo, gracias a la acción de azúcares reductores. La
mezcla de reacción contenía 500 l de almidón soluble al 1 % (p/v) en tampón A,
incubado durante 10 minutos a la temperatura de medida y 50 l de la disolución
enzimática. La reacción se incubó durante 20 minutos a 55 ºC y se paró enfriando
en hielo. Transcurrido este tiempo, se añadieron 500 l de reactivo DNS (NaOH
0,4 M, ácido 3,5-dinitrosalicílico al 1 % (p/v), tartrato de sodio y potasio al 30 %
(p/v)) y se desarrolló el color hirviendo las muestras durante 10 minutos. Se
atemperaron durante 15 minutos a temperatura ambiente y se midió
espectrofotométricamente a 540 nm. La unidad de actividad enzimática (U) se
definió como la cantidad de enzima que producía 1 mol de azúcar reducido por
minuto. Para referenciar el valor de esta actividad se realizó una curva de calibrado
con maltosa.
2.2.5.- Purificación de la CGTasa
Tras obtener el extracto enzimático crudo tal y como se explica en el
apartado 2.2.2, la purificación se llevó a cabo mediante tres etapas a temperatura
ambiente, las cuales se describen a continuación:
Paso 1: Filtración tangencial. Se concentró el sobrenadante de 1 l de
medio de cultivo en 60 ml con el sistema “VivaFlow 200” (Vivascience). Este sistema
posee una membrana de polietersulfona que no presenta interacciones hidrofóbicas
ni hidrofílicas con el medio filtrado, soporta un amplio rango de pH y una gran
durabilidad. Se utilizó una membrana con un corte de 30 kDa.
Paso 2: Cromatografía en Sepharosa 6B- -ciclodextrina. Para preparar
esta columna se ligaron 600 mg de -ciclodextrina (Sigma) a 4 g de gel Sepharosa
6B activado con grupos epoxi- (GE Healthcare) según se describe en el manual de
esta casa comercial (GE Healthcare, 2007). La columna se equilibró con tampón
Tris-HCl 20 mM pH 7,5, NaCl 3 M, CaCl2 5 mM, y se cromatografiaron los 60 ml
del paso anterior. Seguidamente, se lavó la columna con el mismo tampón
empleado para el equilibrado. Para la elución de la muestra se aplicó un gradiente
de 500 ml de concentración lineal creciente de -ciclodextrina de 0 a 3 mg/ml en
tampón Tris-HCl 20 mM pH 7,5, NaCl 3 M, CaCl2 5 mM. La velocidad de flujo se
Materiales y métodos
51
Ve = Volumen de elución de la proteína
Vo = Volumen muerto de la columna
Vt = Volumen total de la columna
estableció a 30 ml/h con una bomba peristáltica “LKB Pump P-1” (GE Healthcare) y
se recogieron fracciones de 2 ml/tubo en un colector de fracciones de la misma
casa comercial. Las fracciones con actividad amilolítica se reunieron y se filtraron
con una membrana con un corte de 30 kDa (Millipore), para eliminar la -
ciclodextrina empleada en la elución y evitar así interferencias en las medidas de
actividad.
Paso 3: Cromatografía en Sephacryl S-200. Las fracciones del paso
anterior se cromatografiaron en una columna Sephacryl S-200 (GE Healthcare
HiPrep 10/60) mediante un sistema AKTA Prime (GE Healthcare). La columna
previamente se equilibró con tampón Tris-HCl 20 mM pH 7,5, NaCl 2 M, CaCl2 5
mM, y la muestra se eluyó con este mismo tampón. La velocidad de flujo fue de 0,2
ml/min, la presión de 0,35 MPa y se recogieron fracciones de 2 ml/tubo. Se midió
la actividad amilolítica y la concentración de proteína de cada una de las fracciones
obtenidas, reuniéndose aquellas de mayor actividad específica para los posteriores
estudios de caracterización.
Con esta cromatografía también se estimó la masa molecular de la enzima.
Las proteínas que se emplearon como patrones fueron: -amilasa (200 kDa),
alcohol deshidrogenasa (150 kDa), albúmina bovina (66 kDa), anhidrasa carbónica
(29 kDa) y citocromo c (12,4 kDa), todas ellas de Sigma. Para calcular el volumen
muerto y el volumen total de la columna se emplearon azul dextrano (2000 kDa) y
DNP-Lisina (348,7 Da) respectivamente.
Se calcularon los valores de Kav para las proteínas patrón y para la CGTasa:
Suponiendo una relación lineal entre el logaritmo de la masa molecular de la
enzima nativa y el valor de Kav, los datos de los patrones se ajustaron a la siguiente
ecuación:
av
Ve VoK
Vt Vo
log avMr a bK
Materiales y métodos
52
Se calculó la masa relativa de la CGTasa sustituyendo su valor de Kav en la
ecuación anterior.
2.2.6.- Electroforesis en gel de poliacrilamida
Para la resolución electroforética de proteínas se siguió el método de
electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) discontinua, en presencia del
detergente aniónico dodecilsulfato sódico (SDS), descrito por Laemmli en 1970. Se
prepararon geles separadores al 10 % (p/v) y concentradores al 4 % (p/v). La
electroforesis se realizó en un sistema Mini-protean II (Bio-Rad) con una fuente
“Electrophoresis Power Supplied PS 340” de Apelex.
La visualización directa de las proteínas se realizó mediante tinción con azul
coomassie (Brillant Blue R, Sigma) utilizando el método propuesto por De Moreno y
col. (1985). Los geles se conservaron en papel de celofán “Gel Drying Film”
(Promega), los cuales fueron previamente humedecidos en una disolución
compuesta por metanol al 40 % (v/v) – ácido acético al 10 % (v/v) y deshidratados
en un secador de geles Biometra (Whatman).
La electroforesis en condiciones nativas se realizó mediante un sistema de
geles en discontinuo introducido por Davis (1964) y referenciado en Goldenberg
(1989), adecuado para proteínas cargadas negativamente como es el caso de las
proteínas halofílicas. La concentración de los geles para electroforesis nativa fue la
misma que la descrita en SDS-PAGE. Para detectar la actividad amilolítica tras
realizar la electroforesis, el gel se incubó en una solución de almidón al 1 % (p/v) en
tampón A, durante 20 minutos a 55 ºC. Transcurrido este tiempo se lavó el gel en
el mismo tampón durante 10 minutos a temperatura ambiente y se tiñó con una
disolución de yodo hasta el desarrollo del color.
2.2.7.- Efecto del tiempo en la medida de actividad enzimática
Para comprobar cómo afectaba el tiempo de medida en la actividad
hidrolítica de la enzima, se midió la actividad durante un período de 1 hora,
tomando alícuotas cada minuto en los primeros 10 minutos, y después cada 2
Materiales y métodos
53
minutos hasta completar la hora. Las medidas se realizaron en tampón Tris-HCl 20
mM pH 7,5, NaCl 3 M, durante 20 minutos a 50 ºC.
2.2.8.- Efecto de la concentración de sal sobre la actividad enzimática
Para observar el efecto de la concentración de sal sobre la actividad
hidrolítica de la CGTasa, se realizaron medidas de actividad a 50 ºC durante 20
minutos, empleando el tampón Tris-HCl 20 mM pH 7,5 conteniendo entre 0 y 4 M
de NaCl.
Para las medidas realizadas en ausencia de sal, se emplearon muestras de
proteínas que habían sido dializadas previamente frente a tampón Tris-HCl 20 mM,
pH 7,5.
2.2.9.- Efecto de la concentración de los iones hidrógeno (pH) sobre la actividad
enzimática
Para determinar el efecto del pH en la actividad de hidrólisis de la enzima, se
realizaron medidas de actividad a 50 ºC durante 20 minutos empleando tampones
con NaCl 1,5 M y una escala de pHs comprendida entre 4,5 y 9,0. Se utilizó citrato
sódico 0,1 M para pHs entre 4,5 y 6,5, Bis-Tris 0,1 M para pHs entre 6,0 y 7,0, y
Bis-Tris propano 0,1 M en el intervalo de pH 6,5 a 9,0.
2.2.10.- Efecto de la temperatura en la medida de actividad enzimática
Con el fin de observar el efecto de la temperatura sobre la actividad
hidrolítica, se realizaron medidas de actividad variando este parámetro entre 20 ºC
y 80 ºC, durante 20 minutos en tampón A.
2.2.11.- Efecto de la temperatura y de la concentración de sal sobre la estabilidad
enzimática
Para realizar los ensayos de termoestabilidad se utilizaron muestras de
proteína a tres concentraciones de NaCl distintas (entre 1 y 3 M), las cuales se
Materiales y métodos
54
incubaron a varias temperaturas: 50, 60, 70 y 80 ºC. Las medidas de la actividad
de hidrólisis se realizaron a diferentes intervalos de tiempo tras incubar la enzima en
hielo durante 5 minutos.
2.2.12.- Efecto de la concentración de EDTA y de iones divalentes en la actividad
enzimática
Para comprobar si la enzima requiere iones metálicos que puedan participar
en su estabilidad o en la actividad que desempeña, se incubó la proteína durante 1
hora a temperatura ambiente en presencia de concentraciones crecientes del agente
quelante EDTA (0,5 mM a 50 mM), mezclando 9 volúmenes de enzima con 1
volumen de EDTA. Transcurrido ese tiempo, se midió la actividad de hidrólisis de la
enzima.
Tras determinar la concentración de EDTA a la cual se produce la
inactivación de la enzima, se comprobó si esta actividad se recuperaba en presencia
de iones metálicos. Una vez añadido el EDTA e incubado durante 1 hora a
temperatura ambiente, se dializó la muestra frente a tampón Tris-HCl 20 mM pH
7,5, NaCl 2 M, previamente tratado con chelex con un tamaño de partícula de
200-400 (Sigma) para eliminar los iones que pudieran estar presentes. A
continuación, se incubó la muestra dializada durante diferentes tiempos (15
minutos, 22 horas y 72 horas) a temperatura ambiente en presencia de
concentraciones crecientes de CaCl2, mezclando 9 volúmenes de enzima con 1
volumen de CaCl2. Las concentraciones variaban desde 0,5 a 10 mM, 50 mM, 100
mM y 200 mM. Transcurrido ese tiempo, se midió la actividad hidrolítica de la
enzima. Del mismo modo, se comprobó si tras la adición de MgCl2, MnCl
2, NiCl
2 y
ZnCl2, a una concentración de 10 mM, la enzima recuperaba actividad.
2.2.13.- Análisis de especificidad de sustratos
Para analizar la especificidad de la CGTasa se emplearon los siguientes
sustratos: almidón, pululan, glucógeno, -ciclodextrina, -ciclodextrina y
Materiales y métodos
55
-ciclodextrina. La reacción transcurrió a 55 ºC durante 20 horas y se determinó la
actividad hidrolítica con cada uno de ellos.
2.2.14.- Determinación de parámetros cinéticos
Los parámetros cinéticos Vmax
(velocidad enzimática máxima) y Km (constante
de Michaelis-Menten) se determinaron mediante el estudio de velocidades iniciales,
realizando los ensayos por triplicado. La concentración de almidón se varió desde
10 mM a 150 mM. Las actividades se determinaron por el método de hidrólisis
(Apartado 2.2.4.4) y de -ciclación (Apartado 2.2.4.1).
La determinación de los parámetros cinéticos se llevó a cabo mediante el
ajuste de los datos de las velocidades iniciales obtenidos para cada una de las
concentraciones, utilizando la ecuación de Lineweaver-Burk:
La Kcat
, definida como el número de moles de sustrato transformados por
minuto y mol de enzima bajo condiciones óptimas, se calculó aplicando la siguiente
ecuación:
donde [ET] es la concentración total de enzima.
2.2.15.- Análisis de los productos de reacción
Los productos de la reacción de la CGTasa se analizaron por cromatografía
en capa fina según se describe en Yun y col., 2004.
La mezcla de reacción contenía 500 l de almidón soluble al 1 % (p/v), en
tampón A, atemperado durante 10 minutos a la temperatura de medida y 50 l de
la disolución enzimática. La reacción se incubó a 55 ºC durante diferentes tiempos
para comprobar si variaban los productos.
1 1m
max max
K 1
V V S V
maxcat
T
VK
E
Materiales y métodos
56
Los patrones se emplearon a una concentración de 10 mM y fueron los
siguientes: glucosa, maltosa, maltotriosa, maltotetraosa, maltopentaosa,
maltohexaosa, -ciclodextrina, -ciclodextrina y -ciclodextrina, todos ellos de
Sigma.
La cromatografía en capa fina se realizó en una placa de gel de sílice Partisil
K6F (Whatman) previamente activada por incubación durante 30 minutos a 110 ºC.
Se dispuso 1 l en la placa de cada una de las muestras y de los patrones, y la
cromatografía se desarrolló a temperatura ambiente en una mezcla de isopropanol-
acetato de etilo-agua en una proporción 3:1:1. La placa se secó completamente y
se resolvió en una disolución de metanol conteniendo N-(1-naftil)-etilendiamina al
0,3 % (p/v) y H2SO
4 al 5 % (v/v). Se secó la placa y se incubó durante 60 minutos a
110 ºC para su visualización.
2.2.16.- Estudios de glicosilación de la enzima
Se empleó el protocolo para tinción PAS (Periodic acid-Schiff) de
glicoproteínas según se describe en Leach y col., 1980. En este método el ácido
periódico oxida selectivamente los residuos de glucosa, dando lugar a la formación
de aldehídos que reaccionan con el reactivo de Schiff dando un color
púrpura/magenta. Este reactivo de Schiff es el producto de reacción de la fucsina y
el bisulfito sódico.
Se realizó un gel de electroforesis en poliacrilamida en condiciones
desnaturalizantes (SDS-PAGE) de la CGTasa purificada y se realizó la tinción como
sigue:
Sumergir el gel en ácido fosfotúngstico al 5 % en ácido clorhídrico 2 N, con
agitación a temperatura ambiente durante 90 minutos y secarlo.
Sumergir el gel en 500 ml de una disolución de metanol al 7 % - ácido
acético al 14 % durante 1 hora a temperatura ambiente agitando
suavemente repitiendo este paso una vez más para eliminar el SDS
completamente. Secar el gel.
Materiales y métodos
57
Oxidar los oligosacáridos con una disolución de ácido periódico al 1 % en
ácido tricloroacético al 7 %. Dejar incubando durante 1 hora a temperatura
ambiente con agitación suave y secar el gel.
Eliminar el exceso de ácido periódico con 250 ml de una solución de
metabisulfito sódico al 0.5 % en ácido clorhídrico 0.1 N a temperatura
ambiente. Inicialmente, el gel se teñirá con el iodo formado en la reacción
del ácido periódico con el agente reductor. Este color amarillo se irá
perdiendo con el tiempo ya que el iodo pasará a ioduro en
aproximadamente 1 hora. Secar el gel cuando se aclare.
La tinción con el reactivo de Schiff (Sigma) se lleva a cabo sumergiendo el
gel en esta disolución y permitiendo que el color rosa se desarrolle en la
oscuridad y con hielo. El desarrollo del color es gradual, siendo las bandas
teñidas estables durante varios días.
2.2.17- Análisis mediante nanoelectrospray LC/MS de la CGTasa purificada
Para llevar a cabo la digestión de la CGTasa con tripsina, se realizó una
diálisis previa de la proteína frente a una disolución de bicarbonato amónico 100
mM pH 8,5, a 4°C durante al menos 12 horas con un volumen 100 veces mayor al
volumen de la muestra. Para esta diálisis se utilizaron cassettes de diálisis “Slide-A-
Lyzer” (Pierce) con un límite de exclusión de 10 kDa. Posteriormente, la muestra
dializada, se concentró hasta 30 g/ml en un evaporador “Eppendorf concentrator
5301”.
La tripsina liofilizada (Sigma) se reconstituyó disolviéndola en HCl 1 mM
hasta una concentración de 1 mg/ml. La CGTasa se digirió con tripsina en una
relación 1:20 (tripsina:enzima problema). La disolución de tripsina se adicionó a la
enzima dializada y se incubó a 37°C durante 18 horas.
La muestra digerida se liofilizó para realizar su posterior análisis en las
instalaciones del laboratorio de Agilent Technologies en Alemania, analizándose
con un sistema HPLC/MS NanoLC/Trap mod. 1100 (Agilent Technologies) con un
volumen de inyección de 5 l. Se utilizó un flujo de 10 l/min con una fase móvil
de 0,1% (v/v) de ácido fórmico en agua.
Materiales y métodos
58
Los péptidos obtenidos tras la digestión con tripsina se analizaron con la
aplicación informática BLAST disponible en el servidor ExPASy (Expertise Analisys
System) (www.expasy.org). Esta aplicación permite alinear las secuencias que se
quieren estudiar con las disponibles en las bases de datos, permitiendo por tanto
comprobar si presentan homología o identidad con un determinado tipo de
proteínas.
2.3.- Secuenciación del gen de la CGTasa de Hfx. mediterranei
2.3.1.- Aislamiento de DNA genómico de Hfx. mediterranei
El cultivo del microorganismo para la extracción de DNA se realizó en medio
complejo: agua de sales al 25 % (p/v) y extracto de levadura al 0,5 % (p/v),
suplementado con glucosa al 1 % (p/v). El pH del medio se ajustó a 7,4 con
tampón Tris-HCl 1 M pH 7,4 y se incubó a 42 ºC con agitación constante.
El cultivo se retiró en la fase exponencial de crecimiento, y la extracción del
DNA se realizó, según Ausubel y col. (1995), a partir de 15 ml de cultivo. Las
células se lisaron con SDS al 10 % (p/v) y la extracción se realizó con NaCl (0,7
M)/CTAB (10 % (p/v)).
Se empleó alternativamente otro método para la extracción del DNA en el
que la lisis de las células se realizó en agua y la extracción con fenol saturado pH
8,0 (Dyall-Smith y Doolittle, 1994).
2.3.2.- Medida de la concentración del DNA genómico
La concentración de DNA se midió espectrofotométricamente registrando la
absorbancia de la muestra a 260 nm. Para DNA puro, un valor de absorbancia de
1 corresponde a una concentración de 50 g/ml. La pureza de la muestra se estimó
determinando la relación A260
/A280
. Para DNA puro, esta relación debe estar entre
1,8-2,0.
Materiales y métodos
59
2.3.3.- Electroforesis en gel de agarosa
La separación electroforética de fragmentos de DNA se realizó de forma
rutinaria en geles de agarosa 1-1,5 % (p/v) (Pronadisa), en tampón TAE 1X
(Apéndice I) con 0,5 g/ml de bromuro de etidio.
Las bandas teñidas con bromuro de etidio se observaron y fotografiaron con
un sistema “Gel Logic 200” de Kodak.
Para purificar los fragmentos de DNA a partir de geles de agarosa se
empleó el kit “GFXTM
PCR DNA and gel band purification” suministrado por la casa
comercial GE Healthcare.
2.3.4.- Obtención de la sonda para la CGTasa
Con la información de la secuencia peptídica de la CGTasa de Hfx.
mediterranei, por comparación de secuencias y considerando la frecuencia del uso
de codones en Hfx. mediterranei (http://www.kazusa.or.jp/codon/), se diseñaron dos
parejas de oligonucleótidos degenerados a partir de 4 péptidos (Tabla 1). Los
oligonucleótidos fueron sintetizados por el método de la fosforamitida y
suministrados por la casa comercial Genotek.
Tabla 1: Oligonucleótidos empleados para la obtención de la sonda para la búsqueda del
gen de la CGTasa de Hfx. mediterranei.
NOMBRE Secuencia * Tm
(ºC)
Longitud
(pb)
31-40f 5’-GAC GTS ATY TAC CAG ATY GTS ACS GAC CGV -3’ 70,4 30
230-239r 5’- BCG RAT RCC GTC RAT YTT RAT SAG CCA SAG -3’ 68,4 30
247-254f 5’- GTS GAC GCS GTS GCS CAC ATG CCS -3’ 73,0 24
290-302r 5’- BCG GAA GTC RAT RAT SGA CAT RCC SGA GTC GTT SGA GAA -3’ 73,8 39
* Donde S=G/C, Y=C/T, V=G/A/C, B=G/T/C, R=A/C
Para generar los productos de PCR iniciales, se prepararon mezclas de reacción
con cada una de las parejas de oligonucleótidos:
Materiales y métodos
60
Tabla 2: Concentraciones de todos los componentes de la reacción utilizada para generar
los productos iniciales de PCR.
REACTIVOS * 31-40f/230-239r 247-254f/290-302r
MgCl2 50 mM 2 mM 2 mM
10X tampón PCR 1X 1X
dNTP 12.5 mM 0,2 mM 0,2 mM
31-40f 100 pmol ----
230-239r 100 pmol ----
247-254f ---- 100 pmol
290-302r ---- 100 pmol
DNA genómico de Hfx. mediterranei 1 g 1 g
Taq polimerasa 2,5 U 2,5U
DMSO 1 % (v/v) 1 % (v/v)
H2O ultrapura
Hasta un volumen
final de 100 l
Hasta un volumen
final de 100 l
* Todos los reactivos de PCR son de la casa comercial Ecogen
Para cada una de las reacciones de PCR se realizaron controles con cada
oligonucleótido por separado, para descartar que el producto generado proviniera
de la reacción de uno sólo de ellos. Las reacciones se llevaron a cabo en un
termociclador “GeneAmp® PCR System 2700” de Applied Biosystems y las
condiciones se muestran a continuación (Figura 17):
Figura 17: Programa de amplificación.
96 ºC
5 min
95 ºC
1 min
65 ºC
1 min
72 ºC
7 min
4 ºC
35 ciclos
2 min
72 ºC
Materiales y métodos
61
Con el fin de comprobar si se habían amplificado los fragmentos, se realizó
una electroforesis de agarosa al 1,5 % (p/v) y se purificaron los productos de PCR,
para su posterior marcaje con digoxigenina.
En los Servicios Técnicos de Investigación de la Universidad de Alicante, se
secuenciaron los productos obtenidos con los mismos cebadores empleados en su
amplificación, para comprobar si presentaban homología con la familia de las -
amilasas. Cada una de las reacciones de PCR se realizó empleando el kit de
secuenciación “ABI PRISMTM
Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction
Kit” (Applied Biosystems). Este kit proporciona una mezcla (Premix) de los cuatro
terminadores marcados, así como dATP, dCTP, dGTP, dTTP, Tris-HCl pH 9, MgCl2,
pirofosfatasa termostable y AmpliTaq DNA polimerasa. Esta enzima es un mutante
de la Taq polimerasa que no posee actividad nucleasa 5’-3’ y en la que se ha
reducido drásticamente la discriminación por los didesoxinucleótidos. Las muestras
obtenidas se purificaron con el kit “Centri.Sep Column” de Princeton Separations y
se analizaron en un secuenciador automático “ABI PRISMTM
310 Genetic Analyzer”
(Applied Biosystems), empleando el método de terminadores didesoxi marcados por
fluorescencia (Sanger y col., 1977), siendo el tiempo de inyección de 60 segundos y
el tiempo de carrera de 120 minutos. Se utilizó el programa “ABI Prism 310
Collection v.1.1.2” para la adquisición de datos y “Sequencing Analysis v.3.0” para
el análisis de las secuencias.
Las secuencias obtenidas se compararon con las secuencias presentes en las
bases de datos utilizando los programas TRANSLATE y BLAST del servidor ExPASy
(Expertise Analisys System) (www.expasy.org).
Para realizar el marcaje del producto obtenido, y así poderlo emplear como
sonda, se reamplificó el fragmento utilizando nucleótidos marcados con
digoxigenina del kit “PCR DIG Probe Shyntesis” de Roche Molecular Biochemicals.
Para comprobar la eficacia del marcaje se realizó una electroforesis en gel
de agarosa al 1,5 % (p/v) y una estimación del rendimiento de este marcaje
mediante el protocolo de Roche Molecular Biochemicals. Esta técnica (Dot blot)
consistió en fijar en una membrana de nylon Hybond H+
(GE Healthcare) diluciones
Materiales y métodos
62
de un control marcado de concentración conocida suministrado por el kit de
marcaje, y varias diluciones del producto marcado (Roche Molecular Biochemicals,
2003). A continuación se siguen los pasos de detección que se realizan en las
técnicas de hibridación, detalladas en el siguiente apartado, obteniéndose una serie
de señales en una placa autoradiográfica de mayor o menor intensidad en función
de la mayor o menor concentración de producto marcado fijado en la membrana.
2.3.5.- Localización del gen de la CGTasa de Hfx. mediterranei en una genoteca en
fago
Para localizar el gen de la CGTasa se empleó una genoteca de DNA
genómico de Hfx. mediterranei en fago construida en nuestro laboratorio. Los
pasos a seguir en la construcción de esta genoteca se basaron en el método de
Sambrook y col. (2001). En nuestro caso, se empleó el fago como vector de
clonación, dado que Hfx. mediterranei es un organismo procariota. En concreto se
utilizó el vector Lambda EMBL3 del kit “EMBL3 BamH I Arms Genomic Cloning
System” (Promega) que es una modificación del bacteriófago que puede integrar
fragmentos de DNA compatibles con BamH I de 9 a 23 kb.
Para la búsqueda en la genoteca se siguió el protocolo recomendado por el
kit empleado para su construcción “EMBL3 BamH I Arms Genomic Cloning System”
de Promega, y el manual Sambrook y col., (2001). El primer paso realizado fue una
siembra en placa de la misma. Teniendo en cuenta el rendimiento obtenido en la
construcción de la genoteca, se realizaron diferentes diluciones en tampón SM
(Apéndice I), con el fin de obtener placas con calvas de lisis aisladas. El rango de
diluciones empleado fue de 1:2 a 1:4. Las células hospedadoras empleadas fueron
Escherichia coli KW251 cuyo genotipo se muestra en el Apéndice II.
Se inoculó una colonia de células E. coli KW251 en un medio de cultivo de
LB (Luria-Bertani) (Apéndice I) suplementado con MgSO4 10 mM y maltosa 0,2 %
(p/v). El crecimiento se detuvo a una DO600
entre 0,5 y 1,0 y el cultivo se centrifugó
a 500 xg durante 10 minutos. El precipitado se resuspendió suavemente en un
volumen de MgSO4 10 mM que permitiera llevar las células hasta una DO
600 de
0,5. El crecimiento con maltosa y MgSO4 facilita la adsorción e infección del fago.
Materiales y métodos
63
Para la adsorción el fago emplea receptores codificados por el gen lamB cuya
función es el transporte de maltosa, y cuya expresión es inducida por su presencia
en el medio. Así mismo, los iones de magnesio incrementan la estabilidad de las
partículas víricas, ya que el exceso de cargas negativas de las cápsides de los
bacteriófagos se compensa con la presencia de iones divalentes en el medio.
Se alcanzó un volumen final de 4 ml de células hospedadoras que fueron
infectadas con 20 l de genoteca diluida 1:4. Se incubó la mezcla durante 30
minutos a 37 ºC para permitir la infección y se sembraron en placa. La siembra se
realizó con LB Top agar sobre placas Petri con medio de cultivo LB con agar al 2 %
(p/v) (Apéndice I). Se mezclaron 200 l de las células infectadas con 3 ml de LB Top
agar (cantidad recomendada para placas Petri de 9 cm de diámetro). Rápidamente
se repartió uniformemente sobre las placas de LB agar precalentadas a 37 ºC. Se
dejó solidificar el Top agar y se incubó a 37 ºC durante toda la noche. El número
de placas debe ser alrededor de 20 para que los resultados obtenidos sean
estadísticamente representativos.
Una vez obtenidas placas con calvas de lisis aisladas, en las que se
encuentra representado todo el genoma de Hfx. mediterranei, se llevó a cabo la
hibridación en placa empleando la sonda generada para la CGTasa.
Las calvas de lisis de las placas se transfirieron a membranas de nylon
Hybond-N+
de GE Healthcare para llevar a cabo la hibridación. Las placas se
enfrían a 4 ºC durante 30 minutos para evitar romper o deteriorar la capa de LB
Top agar durante la transferencia.
Las membranas se colocaron sobre la superficie de la placa evitando generar
burbujas y se transfirieron durante 1 minuto, tiempo durante el cual se realizó el
marcaje de la membrana para su posterior orientación.
Las membranas se separaron de las placas y se sumergieron en la disolución
de desnaturalización (Apéndice I) durante 5 minutos a temperatura ambiente. Las
membranas se secaron parcialmente empleando papel Whatman 3MM y se
incubaron en la disolución de neutralización (Apéndice I) durante 15 minutos. A
continuación, se realizó una incubación de 10 minutos a temperatura ambiente en
2XSSC (Apéndice I). Finalmente, las membranas se secaron totalmente en papel
Whatman 3MM.
Materiales y métodos
64
Una vez secas las membranas, el DNA de las calvas de lisis transferido debe
ser fijado. Para ello, se irradiaron las membranas con luz ultravioleta durante 1
minuto por cada lado, comenzando por aquél que no contenía DNA. Se empleó el
transiluminador “UV Transilluminator 2000” de BioRad como fuente de luz
ultravioleta.
La hibridación de las membranas con el DNA de las calvas de lisis fijado, se
llevó a cabo durante toda la noche a 68 ºC en un horno de hibridación (GE
Healthcare), empleando 20 ml de una disolución de hibridación (Apéndice I) que
contenía 150 ng de la sonda marcada con digoxigenina. Previamente a esta
hibridación se realizó una incubación de una hora a 68 ºC en una solución de
prehibridación que posee la misma composición que la de hibridación, excepto la
sonda, que no se adiciona en este tratamiento previo que se emplea para
humedecer y atemperar las membranas. La disolución de hibridación se incubó en
un baño hirviendo durante 10 minutos, y a continuación se enfrió en hielo durante 5
minutos antes de ser añadida a las membranas. Con este tratamiento se consigue
desnaturalizar las hebras de la sonda para poder llevar a cabo la hibridación con el
DNA fijado en las membranas.
Tras la hibridación se llevaron a cabo los siguientes lavados para eliminar la
sonda unida inespecíficamente:
Dos lavados de 5 minutos cada vez en 2XSSC SDS 0,1 % (p/v) a
temperatura ambiente.
Dos lavados de 15 minutos cada vez en 0,1XSSC SDS 0,1 % (p/v) a
68ºC.
La detección se realizó de acuerdo a los protocolos de Roche Molecular
Biochemicals (2003). En este proceso se usa un anticuerpo frente a la digoxigenina
que contiene la sonda marcada. Las membranas se expusieron a una placa
autoradiográfica Curix RP2 de Agfa.
El revelado de la placa se llevó a cabo como sigue:
Sumergir la placa de 15 a 60 segundos en revelador G150 de Agfa
diluido 1:4.
Materiales y métodos
65
Parar el revelado con un baño en ácido acético al 10 % (p/v), durante 1
minuto.
Fijar las placas durante 5 minutos en Agefix de Agfa diluido 1:5.
Todos estos pasos se realizaron en una cámara oscura con luz roja. Las
etapas siguientes son con luz normal:
Lavar las placas con agua destilada.
Secar al aire.
En la figura 18 se resumen los principales pasos de la técnica de hibridación
en placa descrita anteriormente.
Figura 18: Esquema de la localización de genes en una genoteca de fago
A partir de los resultados obtenidos en las placas autoradiográficas, las
calvas de lisis que resultaron positivas se extrajeron de la placa original con ayuda
de una pipeta Pasteur y se introdujeron en un vial con una disolución de cloroformo
a una concentración final del 5 % (p/v) en tampón SM para permitir la difusión del
fago. Con estas calvas positivas, se realizó una segunda búsqueda infectando de
Agujeros en agar
Materiales y métodos
66
nuevo células E. coli KW251. Para ello se infectaron 200 l de células con 5 l de
la calva de lisis resuspendida, tal y como se ha explicado anteriormente. Se
siguieron los mismos pasos que para la primera búsqueda. Las placas
autoradiográficas en este caso, sólo poseen positivos si la calva original es
realmente positiva para el gen objeto de estudio. Exactamente igual que para la
segunda búsqueda, se extrajeron las calvas positivas para realizar una tercera
búsqueda y poder comprobar así que definitivamente el clon seleccionado poseía el
gen de interés.
2.3.6.- Aislamiento de DNA y análisis de las secuencias
A partir de las calvas identificadas como portadoras del gen de interés se
debe obtener el DNA del bacteriófago, con una elevada pureza y concentración
para su secuenciación.
Para extraer el DNA vírico se debe, en primer lugar, propagar el clon del
fago en un cultivo a gran escala para obtener suficiente cantidad de DNA. Se
realizó un preinóculo de células de E. coli KW251 en 5 ml de LB, suplementado con
MgSO4
10 mM y maltosa 0,2 % (p/v). El cultivo se dejó crecer hasta una DO600
entre 0,5-1,0. Una vez alcanzada, las células se centrifugaron y resuspendieron en
MgSO4 10 mM hasta una DO
600 de 0,5, según el protocolo del manual de
instrucciones “EMBL3 BamH I Arms Genomic Cloning System” (Promega), y el
manual Sambrook y col., (2001).
Con las células hospedadoras preparadas, se llevó a cabo la adsorción de
los bacteriófagos identificados como portadores del gen de la CGTasa. Se tomaron
2 ml de las células y se les añadió 60 l del fago positivo para el gen, incubándolo
durante 30 minutos a 37 ºC. Una vez transcurrido este tiempo, se inocularon en un
medio de 300 ml de LB suplementado únicamente con MgSO4 10 mM y 30 l de
una mezcla de DNAasa/RNAasa a una concentración de 1 mg/ml, que permite
digerir los ácidos nucleicos de las células lisadas liberados al medio como
consecuencia de la propagación vírica. Los cultivos se dejaron crecer durante toda
la noche para permitir la propagación del bacteriófago.
Materiales y métodos
67
Tras el crecimiento durante toda la noche, se les añadió 1,5 ml de
cloroformo (0,5 % (v/v)) y se incubaron con agitación durante 15 minutos. Este
proceso favorece la lisis de aquellas células que no han sido lisadas por los fagos y,
como consecuencia, la liberación de éstos al medio de cultivo. El cultivo se
centrifugó a 8000 xg durante 10 minutos, quedando las partículas víricas en
suspensión en el medio de cultivo. Se recuperó el sobrenadante tras esta
centrifugación para continuar con el proceso de extracción del DNA viral.
La purificación del DNA viral se siguió de acuerdo con el protocolo
recomendado por el kit “Lambda DNA Maxi Kit” de la casa comercial Qiagen. El
DNA obtenido se resuspendió en 400-500 l de agua ultrapura y se dejó en un
baño a 37 ºC para su completa disolución. El DNA extraído se observó mediante
electroforesis en gel de agarosa al 0,8 % (p/v), a fin de comprobar su tamaño e
integridad. La concentración y pureza del DNA se midió espectrofotométricamente.
Para cerciorarnos de que el DNA vírico contiene un fragmento de DNA
genómico portador del gen de interés, se aplicó la técnica denominada Southern
blot (Southern, 1975). Esta técnica consiste en transferir el DNA contenido en un gel
electroforético de agarosa a una membrana de nylon. Tras la desnaturalización del
DNA por tratamiento alcalino, el DNA hibrida con la sonda marcada si contiene el
gen de estudio. El proceso de hibridación y detección se realizó de acuerdo con los
protocolos de Roche Molecular Biochemicals (2003) del mismo modo que en los
apartados anteriores. La figura 19 muestra un resumen del proceso de Southern
blot.
Figura 19: Esquema de la técnica Southern blot.
Placa autorradiográfica
Marcadores de tamaño
Gel
Membrana de nitrocelulosa
DNA viral
Tampón Papel Membrana de absorbente nitrocelulosa
Gel
Gel
Hibridación de la sonda
La sonda hibrida con el DNA homólogo (todavía invisible en este paso)
DNA transferido a la membrana (invisible en este paso)
Bandas creadas por la unión de la sonda marcada
Materiales y métodos
68
Fago4.3for
247-254f Fago4.2for
Fago4.1for
Fago4.12rev
Fago4.1rev
290-302r Fago4.2rev
Fago4.3rev
Fago4.4rev
Fago4.5rev Fago4.7rev Fago4.9rev Fago4.11rev Fago4.13rev
Fago4.6rev Fago4.8rev Fago4.10rev Fago4.14rev
Otra técnica que se empleó, más rápida y sencilla, fue la identificación de la
secuencia clonada mediante PCR y posterior secuenciación. Para ello, se emplearon
los mismos oligonucleótidos que se utilizaron para generar la sonda, así como las
mismas condiciones de amplificación (Apartado 2.3.4), pero teniendo como molde
en DNA aislado del fago. La presencia del gen se confirmará si se obtiene un
fragmento de tamaño aproximado al de la sonda, empleando como molde el DNA
vírico.
Además del tamaño, para terminar de comprobar la presencia de nuestro
gen en el DNA genómico integrado, se secuenciaron los fragmentos obtenidos y se
compararon con la secuencia de la sonda empleada para la CGTasa.
Para la secuenciación del inserto contenido en el DNA viral se empleó la
técnica de primer walking (secuenciación por paseo). En esta técnica se diseñan
oligonucleótidos a medida que se va conociendo la secuencia del gen. Con los
datos de las secuencias obtenidas en fases previas se diseñaron nuevos cebadores
específicos que permitieron ir avanzando en la secuenciación del fragmento de DNA
a estudio. Este método requirió sintetizar un gran número de oligonucleótidos
(Genotek) (Tabla 3) que se utilizaron como cebadores (Figura 20).
Figura 20: Secuenciación del DNA del fago que contiene el gen de la CGTasa por la
estrategia de primer walking, mediante síntesis progresiva de los distintos cebadores. En rojo
se indica la posición de la sonda respecto a los oligonucleótidos.
Con esta estrategia de secuenciación se utilizaron un total de 17
oligonucleótidos para obtener la secuencia completa del gen de la CGTasa y de
genes adyacentes: 3 en sentido directo, de 5’ a 3’ y 14 en sentido reverso, de 3’ a
Materiales y métodos
69
5’ (Tabla 3). La secuenciación se realizó tal y como se describe en el apartado
2.3.4.
Tabla 3: Oligonucleótidos empleados para la secuenciación del gen de la CGTasa de Hfx.
mediterranei.
NOMBRE Secuencia Tm (ºC) Longitud (pb)
Fago4.1for*1
5’- GCC TAC GGC GGA CAC CGA AG -3’ 63,1 20
Fago4.2for 5’- GGC TAC GAG GTG CTC TCG G -3’ 63,1 19
Fago4.3for 5’- GGT CGT CGG GAC TCG TTC C -3’ 63,1 19
Fago4.1rev*2
5’- GAG GAG GCT CAT GCC GCT G -3’ 63,1 19
Fago4.2rev 5’- GTC GCC GAA GAA CTC GTT CG -3’ 61,4 20
Fago4.3rev 5’- CAG ATA GCC GCT TTG AAT C -3’ 54,5 19
Fago4.4rev 5’- GGA GCG TTT GTG CGA CG -3’ 57,6 17
Fago4.5rev 5’- GAC GAC GAT GTC GTA GC -3’ 55,2 17
Fago4.6rev 5’- GGA ACT GCT GGA ACG C -3’ 61,0 19
Fago4.7rev 5’- GCA CGT CCG CGT AGT TC -3’ 57,6 17
Fago4.8rev 5’- CAG CGC GAG GTC CTC GC -3’ 62,4 17
Fago4.9rev 5’- CGA CGA GGC TCT TGA GGA CC -3’ 63,5 20
Fago4.10rev 5’- CCA TGT CGG CAA CCG TTT C -3’ 58,8 19
Fago4.11rev 5’- CAC CGA GGT TCT TCA GTA AGG -3’ 59,8 21
Fago4.12rev 5’- CGT ATC CTC GTT GGC GAC G -3’ 61,4 19
Fago4.13rev 5’- CGT CGG CTC GCC GAG TAT G -3’ 63,1 19
Fago4.14rev 5’- CCG CGT GAA GAA GTC GTT CG -3’ 61,4 20
*1 Los oligonucleótidos directos se indican como for.
*2 Los oligonucleótidos reversos se indican como rev.
El termociclador que se empleó fue el mismo que para otras ocasiones
variando la temperatura entre 50 ºC y 60 ºC en función de la temperatura de
hibridación de cada uno de los oligonucleótidos (Figura 21).
Materiales y métodos
70
4 ºC
94 ºC
3 min
94 ºC
50 seg 50 ºC -
60 ºC
9 seg
60 ºC
35 ciclos
4 min
Figura 21: Programa de PCR de secuenciación del DNA viral.
Bioinformática
Una vez obtenidas las secuencias, se llevó a cabo el análisis de las mismas.
Se realizaron búsquedas en diferentes bases de datos con el fin de contrastar los
resultados obtenidos. Las bases de datos que se utilizaron principalmente fueron:
GENBANK: Es la base de datos de EE.UU (Bethesda, Maryland) y recoge
todas la secuencias de ácidos nucleicos y proteínas. Aporta una descripción de la
secuencia, el nombre científico y taxonómico del organismo del que procede y una
tabla de datos que incluye la localización de la región codificadora y otras señales
que pueden tener importancia biológica.
EMBL Nucleotide Sequence Database: Está organizada por EMBL
(European Molecular Biology Laboratory) (Heidelberg) en colaboración con
GENBANK y DDBJ (DNA Database of Japan). Una de las principales funciones de
EMBL es la de actuar como distribuidora de otras bases de datos de enorme interés
(Stoesser y col., 2003).
SWISS-PROT Protein Database: Esta base de datos se creó mediante una
colaboración de EMBL Data Library y Amos Bairoch. Los datos derivan de la
traducción de las secuencias de DNA, y su principal ventaja consiste en que incluye
numerosas anotaciones cruzadas con otras bases de datos como PROSITE y PDB
(Brookhaven protein structures database).
PIR-International Database: Es una asociación formada por tres centros
de información sobre proteínas; PIR (Protein Information Resource) establecida en
NBRF (National Biomedical Research Foundation, Georgetown University,
Materiales y métodos
71
Wasington DC USA), MIPS (Martinsried Institute for Protein Sequences) establecida
en el Instituto Max Planck de Bioquímica (Alemania), y JIPID (Japan International
Protein Information Database) establecida en la Universidad de Tokio.
Para el análisis completo de las secuencias obtenidas, se emplearon una
serie de herramientas disponibles en el servidor ExPASy (Expertise Protein Analisys
System) (www.expasy.org) y en el paquete informático EMBOSS del EMBNet/CNB
(European Molecular Biology Network) (www.es.embnet.org). Las aplicaciones
principales empleadas fueron las siguientes:
FASTA: Realiza una búsqueda de Pearson y Lipman por similaridad entre
la secuencia objeto de análisis y las bases de datos de secuencias del mismo tipo
(ácidos nucleicos o proteínas).
BLAST: Alinea la secuencia con las de las bases de datos, no realiza
búsqueda de dominios, por ello es más rápido que FASTA.
REMAP: Traduce la secuencia de ácidos nucleicos en los 6 marcos
posibles de lectura, identifica marcos de lectura abierto (ORF) y también los sitios de
corte de enzimas de restricción.
TRANSEQ: Obtiene la secuencia de aminoácidos de uno de los marcos
de lectura obtenidos en el remap.
CLUSTALW/CLUSTALX: Realiza el mejor alineamiento entre diferentes
secuencias de interés.
MATCHER: Obtiene el mejor alineamiento entre dos secuencias,
proporcionando la identidad y similaridad entre ambas.
PROTPARAM TOOL: Proporciona los parámetros bioquímicos teóricos de
una secuencia de aminoácidos: número de aminoácidos, punto isoeléctrico, peso
molecular, índice alifático y composición aminoacídica.
PSIPRED: Predice la estructura secundaria de una proteína a partir de su
secuencia de aminoácidos.
TMHMM: Aplicación que identifica regiones transmembrana en una
secuencia aminoacídica, en base a su longitud y el coeficiente de hidropaticidad.
Materiales y métodos
72
GBLOCKS (http://molevol.cmima.csic.es/castresana/Gblocks.html):
Refina los alineamientos seleccionando los bloques que realmente están
conservados en un alineamiento múltiple para su uso en análisis filogenéticos.
PHYLIP (PHYLogeny Inference Package). Es un conjunto de programas
que permite la deducción de filogenias, por distintos métodos: parsimonia, máxima
similitud, matriz de distancias, probabilidad... etc.
SWISS-MODEL: Predice la estructura terciaria de una proteína por
comparación de secuencias con proteínas cristalizadas.
SIGNAL-P: Predice péptidos señales y sitios de corte de proteasas.
2.4.- Clonaje y expresión heteróloga de la CGTasa de Hfx. mediterranei
2.4.1.- Inserción del gen de la CGTasa de Hfx. mediterranei el vector de clonaje
pSTBlue-1 (Novagen)
Para poder realizar la expresión heteróloga de la CGTasa de Hfx.
mediterranei se debe obtener el gen clonado en un vector de expresión adecuado.
Para ello, en primer lugar, se debe insertar el gen en un vector de clonaje que nos
permita obtener un número elevado de copias del gen y emplear diferentes
herramientas de biología molecular para poder conseguir clonarlo en un vector de
expresión.
Se diseñaron 2 oligonucleótidos que incluían las secuencias correspondientes
a los extremos amino y carboxilo terminal de la CGTasa de Hfx. mediterranei y
contenían los sitios de corte para las enzimas de restricción Nde I (en el extremo
amino terminal) y BamH I (en el extremo carboxilo terminal), con el fin de dirigir el
clonaje en el vector de expresión pET-3a (Novagen). Los oligonucleótidos fueron
suministrados por la casa comercial Genotek y sus características se resumen en la
siguiente tabla (Tabla 4).
Materiales y métodos
73
Tabla 4: Oligonucleótidos empleados para la amplificación del gen de la CGTasa de Hfx.
mediterranei. Aparece subrayado el codón de inicio del gen y que forma parte de la
secuencia de restricción de la enzima Nde I. En ambos oligonucleótidos se ha marcado el
sitio de corte de la endonucleasa con una coma, y la secuencia de reconocimiento en
negrita.
NOMBRE Secuencia Tm
(ºC)
Longitud
(pb)
AmyExpFor 5’- CGGAGGTACCCA’TATGGGAAACGACGACC -3’ 70,9 29
AmyExpRev 5’- CTCTTAGGCG’GATCCAATCGTC -3’ 62,1 22
Para generar el producto de PCR se preparó una mezcla de reacción que
contenía los reactivos que aparecen en la siguiente tabla (Tabla 5).
Tabla 5: Concentraciones de los reactivos empleados para la amplificación del gen de la
CGTasa de Hfx. mediterranei con los sitios de corte apropiados para su posterior clonaje en
el vector de expresión.
REACTIVOS * Concentración
MgCl2 50 mM 2 mM
10X tampón PCR 1X
dNTP 12.5 mM 0,2 mM
AmyExpFor 100 pmol
AmyExpRev 100 pmol
DNA fago 1 g
Taq polimerasa 2,5 U
DMSO 1 % (v/v)
H2O ultrapura Hasta un volumen final de 100 l
* Todos los reactivos de PCR son de la casa comercial Ecogen
Para cada una de las reacciones de PCR se realizaron controles con cada
oligonucleótido por separado, para descartar que el producto generado proviniera
de la reacción de uno sólo de ellos. Las condiciones de la reacción se muestran a
continuación (Figura 22):
Materiales y métodos
74
Figura 22: Programa de PCR de amplificación del gen de la CGTasa de Hfx. mediterranei.
Para comprobar la especificidad de la amplificación, se realizó un gel de
agarosa como se describe en el apartado 2.3.3. La banda de interés se recortó a
partir del gel de agarosa y se purificó con el kit “GFXTM
PCR DNA and gel band
purification” de GE Healthcare. Una vez purificada se secuenció con los mismos
oligonucleótidos utilizados para la amplificación del gen y para su secuenciación
desde el fago , para comprobar que el gen estaba completo y sin mutaciones.
El vector de clonaje utilizado fue pSTBlue-1 del kit “AccepTorTM
Vector” de
Novagen (Figura 23). Este vector es un plásmido de 3,8 Kb, que confiere resistencia
tanto a ampicilina como a kanamicina y contiene el origen de replicación junto con
una porción del gen lac Z de E. coli.
El kit proporciona el plásmido en forma lineal y con dos residuos de timina
(T) en los extremos 3’. Esto permite una ligación directa y muy eficiente del producto
de PCR con el vector, ya que en el programa empleado para amplificar el gen se
incluye un tiempo de elongación extra, en el que la polimerasa añade residuos de
adenina en el extremo 3’ del producto de PCR.
El producto de PCR se ligó con el vector siguiendo las instrucciones del kit
“AccepTorTM
Vector” (Novagen). La reacción de ligación se incubó durante 2 horas
a 16 ºC y una vez obtenida la molécula recombinante, por ligación de vector e
inserto, se procedió a la transformación físico-química de las células competentes E.
coli Novablue (Novagen). Dicha cepa carece del gen de la T7 RNA polimerasa, por
lo tanto el huésped no se emplea para expresar sino para clonar. El genotipo de
esta cepa se muestra en el Apéndice II.
94 ºC
5 min
95 ºC
1 min
65 ºC
1 min
72 ºC
7 min
4 ºC
35 ciclos
2 min
72 ºC
Materiales y métodos
75
Figura 23: Mapa del vector de clonaje pSTBlue-1 (Novagen).
La transformación se llevó a cabo según el manual del kit “AcceptorTM
Vector”
(Novagen, 2003). Además de la transformación con el producto de la ligación, se
realizaron dos controles para comprobar el estado del plásmido y de las células
competentes. El primer control consistió en transformar las células con un plásmido
sin inserto. Y en el segundo control se siguió todo el proceso de transformación pero
sin añadir ningún tipo de DNA.
Se identificaron las colonias que poseían plásmido con inserto mediante el
proceso de -complementación. El análisis de transformantes se llevó a cabo por el
aislamiento y purificación de plásmidos. Para ello, se seleccionaron 10 colonias
blancas (con inserto), las cuales se crecieron individualmente en medio líquido LB
con ampicilina (100 g/ml), durante toda la noche a 37 °C en un agitador orbital.
La purificación de los plásmidos se realizó a partir de 3 ml de cultivo empleando el
kit “CONCERTTM
Rapid Plasmid Miniprep System” de Gibco BRL (Life Technologies).
Materiales y métodos
76
La pureza de los plásmidos se determinó espectrofotométricamente mediante la
relación A260
/A280
, empleando un espectrofotómetro “Ultraspec 2000” suministrado
por GE Healthcare. Todos los clones que resultaron positivos se conservaron a –80
°C en presencia de DMSO 10 % (v/v) como agente crioprotector.
Para analizar estos plásmidos aislados se realizó una electroforesis en gel de
agarosa al 1 % (p/v), diferenciando aquellos que tenían inserto mediante
comparación con el plásmido pSTBlue-1 sin inserto. Los plásmidos que
presumiblemente poseían inserto, se secuenciaron utilizando los oligonucleótidos
universales de plásmido M13For y M13Rev, y los empleados en la secuenciación del
gen desde el fago . El termociclador utilizado fue el mismo que para amplificar y
las condiciones de reacción fueron las descritas en el apartado 2.3.4.
Las secuencias obtenidas se compararon con la secuencia original de la
CGTasa de Hfx. mediterranei, utilizando la aplicación MATCHER del grupo de
programas EMBOSS del EMBNet/CNB (European Molecular Biology Network)
(Genetics Computer Group) (www.es.embnet.org) para descartar cualquier tipo de
mutación que pudiera haberse creado por el proceso de clonaje y para comprobar
que poseían el sitio de corte para las enzimas de restricción BamH I y Nde I.
2.4.2.- Inserción del gen de la CGTasa de Hfx. mediterranei en el vector de
expresión pET-3a (Novagen)
El plásmido de expresión pET-3a es uno de los sistemas más empleados para
el clonaje y la expresión de proteínas recombinantes en E. coli. Los genes que se
quieren expresar son clonados en el plásmido pET-3a bajo el control del promotor y
del terminador del bacteriófago T7, por tanto el gen de la T7 RNA polimerasa debe
ser suministrado por la célula huésped. Inicialmente estos genes son clonados en
huéspedes que no contienen dicho gen, eliminando así la inestabilidad del plásmido
debida a la producción de proteínas potencialmente tóxicas para la célula huésped.
Una vez que están en una célula que no es de expresión, los plásmidos se
transfieren a huéspedes que contienen una copia cromosómica del gen de la T7
RNA polimerasa bajo el control del promotor lacUV5, y la expresión es inducida por
adición de IPTG (Figura 24).
Materiales y métodos
77
Figura 24: Mapa del vector de expresión pET-3a (Novagen).
El primer paso para clonar el gen en el vector de expresión pET-3a fue
digerir tanto la molécula recombinante (pSTBlue1-CGTasa) como el propio vector
de expresión con las enzimas de restricción Nde I (Fermentas) y BamH I (Fermentas).
La digestión se llevó a cabo en dos etapas, en primer lugar se digirió con
BamH I (Fermentas), que es la enzima que mejor trabaja en el tampón de menos
fuerza iónica (1X One For All Buffer, Fermentas), durante 2 horas a 37 °C.
Posteriormente, se añadió la cantidad apropiada de tampón a la segunda enzima,
Nde I (Fermentas), para que ésta estuviera en condiciones óptimas (2X One For All
Buffer, Fermentas), incubándose a 37 °C durante la noche. La cantidad aproximada
de DNA digerido fue de 2 g. Transcurrido ese tiempo se inactivaron las enzimas
incubando la digestión a 80 °C durante 10 minutos.
Materiales y métodos
78
Se cargó todo el volumen de las digestiones en un gel de agarosa al 1 %
(p/v), se recortaron las bandas pertenecientes al inserto (gen de la CGTasa) y al
plásmido pET-3a linealizado, y se purificaron con el kit “GFXTM
PCR DNA and gel
band purification” (GE Healthcare).
La reacción de ligación del gen de la CGTasa con el vector de expresión
pET-3a se llevó a cabo siguiendo el protocolo de Roche Molecular Biochemicals
para la enzima T4 DNA ligasa. Se preparó la reacción de ligación con una relación
molar de 1:3 vector:inserto y se incubó durante 16 horas aproximadamente en un
baño termostatizado a 16 ºC. La concentración de plásmido lineal y de inserto se
determinó espectrofotométricamente.
Una vez transcurrida la reacción de ligación, se transformaron células
competentes de la cepa Novablue de E. coli siguiendo el mismo protocolo que se
ha descrito en el apartado 2.4.1. Las células transformadas se sembraron en placa
con medio LB con agar al 2 % (p/v) y 100 g/ml de ampicilina. Estas colonias se
crecieron en medio líquido LB con ampicilina 100 g/ml y se realizó el asilamiento
del DNA plasmídico con el kit “CONCERTTM
Rapid Plasmid Miniprep System” de
Gibco BRL (Life Technologies). Mediante electroforesis en gel de agarosa al 1 %
(p/v) y empleando como patrón pET-3a sin inserto, se comprobó si los plásmidos
aislados tenían inserto, además de observar su pureza y concentración. Los
plásmidos que presumiblemente tenían inserto, se secuenciaron como se ha descrito
en apartados anteriores. Las secuencias obtenidas se compararon con la secuencia
original de la CGTasa de Hfx. mediterranei, utilizando la aplicación MATCHER del
grupo de programas EMBOSS del EMBNet/CNB (European Molecular Biology
Network) (Genetics Computer Group) (www.es.embnet.org) para descartar cualquier
tipo de mutación que pudiera haberse creado por el proceso de clonaje.
2.4.3.- Transformación en el huésped de expresión E. coli BL21(DE3)
Como huésped de expresión se empleó la cepa E. coli BL21 (DE3) (Apéndice
II) suministrada en forma de células competentes por la casa comercial Novagen. La
transformación de estas células con el plásmido pET-3a con el inserto de la CGTasa
de Hfx. mediterranei se llevó a cabo de la misma forma que se describe en el
Materiales y métodos
79
apartado 2.4.1 utilizándose 50 ng de plásmido purificado. El crecimiento de las
células se realizó en placas LB con agar al 2 % (p/v) con ampicilina (100 g/ml).
2.4.4.- Expresión heteróloga de la CGTasa de Hfx. mediterranei
El proceso de crecimiento e inducción se llevó a cabo según el protocolo
“pET System Manual” (2006) de Novagen. Según éste, se creció la colonia
seleccionada en medio LB líquido con ampicilina 100 g/ml y glucosa 40 mM
durante toda la noche. Según describió Grossman y col. (1998), la adición de
glucosa al medio favorece que los niveles de expresión basales se mantengan bajos.
Cuando los cultivos alcanzan la fase estacionaria, si no queda glucosa en el medio
consumirán otra fuente de carbono como el glicerol. El metabolismo de esta fuente
alternativa provoca un aumento de los niveles de AMP cíclico, lo que estimula la
transcripción del promotor lacUV5 y por lo tanto la expresión de la T7 RNA
polimerasa.
Transcurrido este tiempo, se inocularon 30 l de este precultivo en 3 ml de
medio LB líquido suplementado con ampicilina (100 g/ ml) y se incubó a 37 ºC y
225 rpm en un agitador orbital hasta una DO600
de 0,5. Alcanzada esta densidad
óptica, estos 3 ml se inocularon en un matraz con 100 ml de LB líquido, también
suplementado con ampicilina a la misma concentración, y se incubó a 37 ºC con
agitación hasta una DO600
comprendida entre 0,5-1,0. Este cultivo, una vez crecido
a la densidad óptica deseada, se indujo con IPTG a una concentración de 0,4 mM
en el cultivo. Para mejorar la solubilidad de la proteína expresada se realizaron
ensayos a dos temperaturas diferentes de inducción, 37 y 22 ºC. Transcurridas las 3
horas de inducción, el cultivo se almacenó a 4 ºC hasta el aislamiento de las
fracciones.
Dicho aislamiento se llevó a cabo según el protocolo desarrollado por
Connaris y col. (1999), y Pire y col. (2001). Las fracciones que se analizaron fueron:
fracción celular total, fracción periplasmática, fracción citoplasmática soluble y
fracción citoplasmática insoluble o cuerpos de inclusión. El protocolo empleado
para cada aislamiento fue diferente según el tipo de fracción, optimizándose el
método para la obtención de la fracción citoplasmática soluble e insoluble. Debido
Materiales y métodos
80
a la elevada densidad de los cuerpos de inclusión, las fracciones citoplasmáticas
soluble e insoluble, se pueden separar por una simple centrifugación:
a) Fracción citoplasmática soluble:
El precipitado procedente de la fracción periplasmática se resuspendió en
8 ml de Tris-HCl 20 mM pH 7,5, NaCl 2 M, y tras sonicar y centrifugar
las células se precipitó 1 ml del sobrenadante con ácido tricloroacético al
10 % (p/v). Se resuspendieron las proteínas precipitadas en 100 l de
PBS y se añadieron 100 l de 2X Sample Buffer. Se incubó durante 5-10
minutos a 80-85 ºC y se guardaron a -20 ºC hasta que se realizó la
electroforesis en poliacrilamida.
b) Fracción citoplasmática insoluble:
El precipitado obtenido en el paso anterior se lavó dos veces con 4 ml
del tampón Tris-HCl 20 mM pH 7,5 y NaCl 2 M, para ello se centrifugó
a 10000 x g durante 5 minutos, y se descartó el sobrenadante. Mediante
este paso se consiguieron eliminar algunos contaminantes.
El precipitado obtenido se solubilizó con 8 ml de Tris-HCl 20 mM pH 7,5
conteniendo urea 8 M, DTT 50 mM y EDTA 2 mM (tampón de
solubilización) a 37 °C.
Para preparar la muestra para la electroforesis en poliacrilamida, se
transfirieron 100 l de la muestra anterior a un eppendorf y se añadieron
100 l de 2X Sample Buffer. Posteriormente, se incubó la muestra a 80-
85 °C durante 5-10 minutos, y se guardó a –20 °C, hasta su uso.
Estas fracciones se aislaron tanto de los cultivos empleados como control
(células transformadas con plásmido sin inserto) como de los cultivos empleados
para la expresión de la CGTasa.
Una vez aisladas las fracciones se procedió a la localización de la proteína
sobreexpresada. Para esto se prepararon dos geles de poliacrilamida al 12 % (v/v)
Materiales y métodos
81
conteniendo SDS al 1 % (p/v) (SDS-PAGE), y se cargaron las muestras obtenidas a
partir de cada una de las fracciones aisladas.
2.5.- Purificación y caracterización de la CGTasa recombinante de Hfx. mediterranei
2.5.1.- Solubilización de los cuerpos de inclusión y renaturalización
Antes de renaturalizar la proteína se solubilizaron los cuerpos de inclusión.
Para solubilizar los cuerpos de inclusión se emplearon agentes caotrópicos con alto
poder desnaturalizante y detergentes. Además, los tampones utilizados pueden
contener un agente reductor, como el DTT, el DTE o el -mercaptoetanol, para
mantener los residuos de cisteína en un estado reducido y prevenir la formación
incorrecta de puentes disulfuro, agentes quelantes de metales como el EDTA e
inhibidores de proteasas como el PMSF (Rudolph y col., 1997).
En nuestro caso, los cuerpos de inclusión se solubilizaron en tampón Tris-HCl
20 mM pH 8,0 conteniendo urea 8 M, DTT 50 mM y EDTA 2 mM (Pire y col.,
2001). Se incubaron a 37 ºC agitando vigorosamente durante el proceso de
incubación, hasta la completa solubilización de la muestra.
Una vez solubilizados los cuerpos de inclusión se llevó a cabo su
renaturalización a temperatura ambiente con agitación suave, y las medidas de
actividad se realizaron a diferentes tiempos con el método del dinitrosalicílico
(Apartado 2.2.4.4). Se variaron condiciones tales como pH, dilución de los cuerpos
de inclusión solubilizados, concentración y tipo de sal, y concentración de CaCl2.
2.5.2.- Purificación de la CGTasa recombinante de Hfx. mediterranei
La purificación de la CGTasa sobreexpresada se llevó a cabo mediante una
única etapa cromatográfica a temperatura ambiente a partir de la fracción soluble.
Esta etapa consistió en una cromatografía en Sepharosa 6B- -ciclodextrina,
desarrollada como se describe en el apartado 2.2.5.
Materiales y métodos
82
Las fracciones cromatográficas se analizaron mediante una electroforesis en
gel de poliacrilamida al 12 % (v/v) en presencia de SDS y en condiciones nativas
con el mismo procedimiento descrito en el apartado 2.2.6.
2.5.3.- Caracterización de la CGTasa recombinante de Hfx. mediterranei
Para la caracterización de la enzima recombinante se realizaron los mismos
ensayos que para la enzima nativa (Apartado 2.2):
Estimación de su masa molecular mediante una cromatografía en Sephacryl
S-200 (GE Healthcare HiPrep 10/60).
Determinación de las cuatro reacciones específicas de esta familia de
enzimas.
Efecto de la concentración de sal, de los iones hidrógeno, y de la
temperatura, sobre la actividad enzimática. Así como la influencia de la
temperatura y la concentración de sal en la estabilidad de la enzima.
Efecto de la concentración de EDTA sobre la actividad de la CGTasa, así
como la recuperación de actividad tras la adición de CaCl2, MgCl
2, MnCl
2,
NiCl2 y ZnCl
2. Pero en este caso, la muestra se dializó frente a tampón Tris-
HCl 20 mM pH 7,5, NaCl 3 M.
Cálculo de los parámetros cinéticos Vmax
(velocidad enzimática máxima), Km
(constante de Michaelis-Menten) y Vmax
/Km (eficacia catalítica) a diferentes
concentraciones de almidón desde 10 mM a 150 mM, tal y como se explica
para la enzima nativa.
Análisis de especificidad de sustratos de la CGTasa empleando almidón,
pululan, glucógeno, -ciclodextrina, -ciclodextrina y -ciclodextrina, para
comprobar que presentaba el mismo comportamiento que la enzima nativa.
Análisis de los productos de la reacción de la enzima recombinante por
cromatografía en capa fina.
Materiales y métodos
83
2.6.- Cristalización de la CGTasa recombinante de Hfx. mediterranei
Para realizar los ensayos de cristalización en primer lugar se dializó la
muestra frente a tampón Tris-HCl 20 mM pH 7,5, NaCl 2 M. A continuación se
concentró con una membrana con un corte de 30 kDa (Millipore) hasta alcanzar
concentraciones de enzima entre 10-15 mg/ml.
Los ensayos preliminares de cristalización de la CGTasa halófila se llevaron a
cabo empleando las disoluciones que se encuentran en los kits Hampton
Crystallization Screen I, Screen II y PEG/Ion Screen (Hampton Research). Todos los
ensayos se realizaron a 290 K mediante la técnica de hanging drop o gota colgante
(Figura 25), basada en la difusión de vapor entre la gota, formada por la mezcla de
volúmenes iguales de disolvente y proteína, y el disolvente que se encuentra en el
pocillo. En la mayoría de las CGTasas se han identificado dos átomos de Ca+2
en
su estructura (van der Maarel y col., 2002; Knegtel y col., 1996), por lo que estos
ensayos se realizaron en ausencia y en presencia de CaCl2 1 mM.
Los cristales obtenidos o bien se analizaron en un equipo de difracción de
rayos X para monocristales Bruker CCD-Apex en los Servicios Técnicos de
Investigación de la Universidad de Alicante, o se tiñeron con el colorante Izit
(Hampton Research). Este colorante ha sido diseñado para poder diferenciar entre
cristales inorgánicos y cristales de moléculas biológicas, ya que únicamente es
capaz de penetrar en estas últimas tiñéndolas de un color azul.
Materiales y métodos
84
Figura 25: Descripción de la técnica de cristalización hanging drop.
Componentes
típicos:
0,2 M Precipitante
0,1 M Tampón
0,01 M Sal
1) Poner la disolución
precipitante en el r eservor io
2) Mezclar la disolución del r eservorio y
la proteína en una pequeña gota sobre
el cubre siliconizado
Solución del r eservor io Proteína
Concentración
proteína: 5-20mg/ml
3) Invertir el cubre
sobre el pocillo y
sellar con silicona
24-48
horas
4) La difusión de
vapor conlleva una
reducción del
tamaño de la gota y
de la solubilidad de
la proteína
5) Cr istales?
Días, semanas,
meses?
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Resultados y discusión
87
3.1.- Purificación y caracterización de ciclomaltodextrin glucanotransferasa
(CGTasa) de Hfx. mediterranei
3.1.1.- Purificación de CGTasa de Hfx. mediterranei
Una vez crecido el cultivo se obtuvo el extracto enzimático crudo tal y como
se explica en el apartado 2.2.2 de materiales y métodos. La purificación se llevó a
cabo mediante tres etapas a temperatura ambiente cuyos resultados se muestran a
continuación.
Paso 1: Filtración tangencial. Se concentró el sobrenadante de 1 l de
medio de cultivo en 40-50 ml con el sistema “VivaFlow 200” (Vivascience).
Además de concentrar la muestra, con este paso se eliminaron proteínas con un
tamaño inferior a 30 kDa que era el corte de la membrana que empleamos.
Paso 2: Cromatografía en Sepharosa 6B--ciclodextrina. Tras equilibrar
la columna con el tampón correspondiente, se cromatografiaron los 40-50 ml del
paso anterior. Con la aplicación de un gradiente de concentración lineal creciente
de -ciclodextrina de 0 a 3 mg/ml, se comprobó que el máximo de actividad
correspondía con un pico de proteína que eluía a una baja concentración de -
ciclodextrina, entre 0,30 y 0,50 mg/ml (Figura 26). Se unieron las fracciones que
presentaban una mayor actividad constituyendo un volumen total de 30 ml. Este
volumen se concentró hasta 5 ml con filtros “Amicon” (Millipore) con un corte de 30
kDa para poder cromatografiarlo en la siguiente columna.
Paso 3: Cromatografía en Sephacryl S-200. Tras realizar esta etapa el
máximo de actividad se correspondió con un pico de proteína bien definido y con
una elevada concentración (Figura 27). Se observó un primer pico con una baja
concentración que presentó también actividad, pudiéndose tratar de la -amilasa
descrita con anterioridad en Hfx. mediterranei por nuestro grupo de investigación
(Pérez-Pomares y col., 2003). Las fracciones que presentaban una mayor actividad
se unieron en un volumen total de 15 ml que se empleó para los posteriores
estudios de caracterización.
Resultados y discusión
88
Volumen (ml)
0 50 100 150 200 250 300
A2
80
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
-c
iclo
dextr
ina (
mg/m
l)
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
Activid
ad (
U/m
l)
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
Volumen (ml)
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180
A280
0.00
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10
0.12
0.14
0.16
Activid
ad (
U/m
l)
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
Figura 26: Cromatograma de Sepharosa 6B--ciclodextrina. Con línea continua se
representa el perfil de absorbancia a 280 nm, con línea discontinua el gradiente del
tampón empleado para la elución y con puntos el perfil de actividad.
Figura 27: Cromatograma de Sephacryl S-200. Con línea continua se representa el perfil
de absorbancia a 280 nm y con puntos el perfil de actividad.
Resultados y discusión
89
Con la cromatografía en Sephacryl S-200 también se pretendía estimar la
masa molecular de la enzima, pero resultó errónea como se pudo comprobar más
adelante tras realizar una electroforesis de poliacrilamida en condiciones
desnaturalizantes y nativas. La masa molecular estimada por este método fue de 17
± 2 kDa. En esta cromatografía la proteína presenta un volumen de elución mucho
mayor que el que le correspondería debido a su tamaño, lo que indica que existe
algún tipo de interacción con la matriz. Esto también se ha podido observar en la
-amilasa caracterizada en Har. hispanica, donde la proteína a pesar de tener una
masa molecular de 43 kDa también eluye a un volumen superior al que le
correspondería (Hutcheon y col., 2005).
Los parámetros obtenidos tras la purificación de la proteína se muestran en la
tabla que aparece a continuación (Tabla 6), en la que se indican las actividades de
-ciclación de cada paso. Se determinó esta actividad ya que es la más específica
de las CGTasas, evitando realizar medidas de hidrólisis debido a la posible
presencia de otras enzimas con actividad amilolítica. En esta tabla se puede
observar que el proceso presenta un factor de purificación final de 4,7. Se ha
obtenido la proteína de forma pura tal y como se muestra en la figura 28 del
siguiente apartado, aunque como ocurre en otras proteínas halofílicas purificadas
en nuestro laboratorio, el rendimiento obtenido es muy bajo. Por ejemplo, en la
purificación de la -amilasa (Pérez-Pomares y col., 2003) y la D-2-hidroxiácido
deshidrogenasa (Bonete y col., 2000) de Hfx. mediterranei se alcanzó un
rendimiento de 1,8 y 2,2 % respectivamente.
Tabla 6: Proceso de purificación de la CGTasa de Hfx. mediterranei.
Pasos de purificación Vol (ml)
Unidades totales
Proteína (mg)
Ae (U/mg)
Rendimiento (%)
Factor purificación
Medio extracelular 1000 310 30,50 10,16 100 1,0 Filtración tangencial 50 102 5,00 20,48 31 2,0 Sepharosa 6B 30 37 1,32 28,00 12 2,8 Sephacryl S-200 15 7 0,15 48,00 3 4,7
Resultados y discusión
90
kDa 1 2 3 4 5
116.0
66.2
45.0
35.0
25.0
18.4
Tras realizar la SDS-PAGE (Figura 28), se observó que tras la última etapa
cromatográfica aparecía una única banda cuyo tamaño estimado era de
aproximadamente 77 kDa. Este tamaño es más similar, que el obtenido con la
Sephacryl S-200, al de otras CGTasas del Dominio Archaea, como la de P. furiosus
de 81 kDa (Lee y col., 2007) y la de Pyrococcus kodakaraensis de 79 kDa (Rashid y
col., 2002). No obstante, hay que considerar que la SDS-PAGE sobreestima el peso
molecular de las proteínas de organismos halófilos ya que éstas migran menos
debido a la elevada presencia de aminoácidos ácidos en su superficie (Lanyi, 1974;
Bonete y col., 1996; Madern y col., 2000).
Figura 28: SDS-PAGE correspondiente al proceso de purificación de la CGTasa.
Calle 1: marcadores de peso molecular (Fermentas).
Calle 2: extracto crudo.
Calle 3: filtración tangencial.
Calle 4: Sepharosa 6B--ciclodextrina.
Calle 5: Sephacryl S-200.
La electroforesis en condiciones nativas de la enzima purificada procedente
de la columna Sephacryl S-200, mostraba una única banda cuando se teñía con
azul Coomassie (Figura 29a), lo que indicó que se trataba de una proteína
monomérica como ocurre en la mayoría de las CGTasas caracterizadas. En base al
Resultados y discusión
91
(a) (b)
proceso de medida de la actividad enzimática, se desarrolló un método de tinción
basado en la incubación del gel en una solución de almidón al 1 % (p/v) en las
condiciones de medida de actividad. Tras esta incubación, la banda obtenida
presentaba actividad amilolítica al teñir el gel con la solución de yodo (Figura 29b).
Figura 29: Gel de electroforesis de poliacrilamida en condiciones nativas. (a) Tinción con
azul Coomassie, (b) Tinción de actividad.
3.1.2.- Caracterización de CGTasa de Hfx. mediterranei
3.1.2.1.- Efecto del tiempo de ensayo en la medida de actividad enzimática
Para comprobar cómo afectaba el tiempo de medida en la actividad
enzimática, se midió la actividad durante un período de 1 hora, sacando alícuotas
cada minuto en los primeros 10 minutos, y después cada 2 minutos hasta completar
la hora. Como se puede apreciar en la siguiente gráfica, hay una relación
prácticamente lineal entre la aparición de maltosa y el tiempo de incubación de la
reacción. Para los siguientes ensayos se emplearon tiempos de reacción de 20
minutos debido a que en ese intervalo era donde la pendiente parecía más acusada
y por ser un tiempo razonable para detectar cambios en la actividad.
Resultados y discusión
92
Figura 30: Efecto del tiempo de ensayo en la actividad CGTasa.
3.1.2.2.- Efecto de la concentración de sal sobre la actividad enzimática
La concentración de sal, al igual que el pH y la temperatura, tiene una gran
influencia sobre la actividad enzimática, ya que son factores que alteran la
estructura terciaria y cuaternaria de las proteínas.
La estabilidad de una proteína depende de las interacciones de ésta con
otras proteínas, con las moléculas de agua o con las sales presentes en la
disolución en la que se encuentra. Si una proteína es halofílica, será más estable y
con una actividad mayor en una disolución con elevada concentración de sal
(Madern y col., 2000). Sin embargo, como se puede apreciar en la figura 31, la
CGTasa de Hfx. mediterranei no presenta una mayor actividad a elevadas
concentraciones de sal, manteniéndola incluso a concentraciones bajas como 0,5 M
de NaCl donde conserva hasta un 65 % de su actividad. A partir de estos datos, se
determinó la concentración de 1,5 M de NaCl como óptima para la realización de
las sucesivas medidas de actividad. Este mismo comportamiento se puede observar
en la glucosa deshidrogenasa de Hfx. mediterranei, presentando un óptimo de
Tiempo (min)
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
Activid
ad
esp
ecíf
ica
(U
/mg
)
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Resultados y discusión
93
actividad a una concentración entre 1,3 y 1,75 M de NaCl (Pire, 1998), a
diferencia de otras enzimas caracterizadas por nuestro grupo de investigación como
la -amilasa (Pérez-Pomares y col., 2003) y la glutamato deshidrogenasa (Díaz y
col., 2006) de Hfx. mediterranei con concentraciones de sal óptimas de 3 M NaCl y
4 M NaCl respectivamente.
Figura 31: Efecto de la concentración de sal sobre la actividad CGTasa.
3.1.2.3.- Efecto de la concentración de los iones hidrógeno (pH) sobre la actividad
enzimática
Las enzimas por su naturaleza proteica poseen grupos químicos ionizables en
las cadenas laterales de sus aminoácidos. Dependiendo del pH del medio en el que
se encuentren, estos grupos pueden modificar su carga. Debido a estas
modificaciones se puede alterar la estructura terciaria de una enzima y por tanto
variar su actividad.
En la figura 32 se observa que el valor de pH óptimo, en el cual la actividad
catalítica es mayor, es en torno a 7,0. Más del 60 % de la actividad se pierde a
NaCl (M)
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5
Activid
ad
esp
ecíf
ica
(U
/mg
)
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Resultados y discusión
94
pHs inferiores a 5,0 y superiores a 8,0. Existe una gran diversidad en cuanto al pH
óptimo de las CGTasas purificadas y caracterizadas debido a la gran variedad de
microorganismos en los que se han aislado. No obstante, en T. kodakaraenis
(Rashid y col., 2002), la máxima actividad CGTasa se detecta a un pH óptimo
similar al obtenido para Hfx. mediterranei. Las enzimas que se han caracterizado en
Hfx. mediterranei también muestran valores de pH óptimos de 7-8, como la nitrito
reductasa (Martínez-Espinosa y col., 2001b) o la glucosa deshidrogenasa (Pire,
1998).
Figura 32: Efecto del pH sobre la actividad CGTasa.
3.1.2.4.- Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática
La velocidad de las reacciones enzimáticas se incrementa conforme se eleva
la temperatura hasta un cierto valor conocido como temperatura óptima, a partir
del cual, la velocidad decrece rápidamente por rotura de los enlaces no covalentes
de la estructura terciaria.
pH
4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 8,5 9,0 9,5
Activid
ad
esp
ecíf
ica
(U
/mg
)
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Resultados y discusión
95
Como se puede apreciar en la siguiente figura, a pH 7,0 la temperatura
óptima es de 55 ºC. A temperaturas de 35 y 60 ºC la enzima conserva el 50 % de
su actividad. Para las CGTasas de Paenibacillus pabuli (Jemli y col., 2007) y
Bacillus agaradhaerens (Martins y Hatti-Kaul, 2002), que se encuentran en
ambientes con una elevada radiación solar, se han obtenido temperaturas óptimas
similares en torno a 50-60 ºC. Del mismo orden son las que se han determinado en
nuestro laboratorio para las siguientes enzimas de Hfx. mediterranei: 50-60 ºC para
una -amilasa (Pérez-Pomares y col., 2003), 52 ºC para una D-2-hidroxiácido
deshidrogenasa (Bonete y col., 2000), 60 ºC para una glutamato deshidrogenasa
(Díaz y col., 2006), y 60 ºC para una nitrito reductasa (Martínez-Espinosa y col.,
2001b).
Esta elevada temperatura óptima es una característica común en las enzimas
de los organismos halófilos y suele ir acompañada de una alta termoestabilidad.
Dym y col. (1995) encontraron a partir de la estructura cristalográfica de la malato
deshidrogenasa de Haloarcula marismortui que varios de los motivos estructurales
que confieren el carácter halofílico son los mismos que aquellos que contribuyen a
la estabilidad de enzimas termofílicas. Estas enzimas se caracterizan por un
incremento en el número de puentes salinos y la introducción de residuos
aminoacídicos con carga negativa en la secuencia amino terminal. La elevada
temperatura óptima de las enzimas halofílicas en general, puede considerarse una
respuesta adaptativa a las altas temperaturas que estos organismos tienen que
soportar en sus hábitats salinos naturales donde están expuestos a una intensa luz
solar.
Resultados y discusión
96
Figura 33: Efecto de la temperatura sobre la actividad CGTasa.
3.1.2.5.- Efecto de la temperatura y la concentración de sal sobre la estabilidad
enzimática
Los estudios de termoestabilidad se llevaron a cabo modificando la
concentración de NaCl (entre 1 y 3 M) presente en el ensayo a temperaturas
comprendidas entre 50 y 80 ºC. Los resultados obtenidos se muestran en las figuras
34, 35 y 36, en las que se ha representado el logaritmo de la actividad residual
frente el tiempo de incubación.
Temperatura (ºC)
15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85
Activid
ad
esp
ecíf
ica
(U
/mg
)
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Resultados y discusión
97
Figura 34: Termoestabilidad de la CGTasa a una concentración de 1 M NaCl.
Figura 35: Termoestabilidad de la CGTasa a una concentración de 2 M NaCl.
Tiempo (h)
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180
Activid
ad r
esid
ual (%
)
0.1
1
10
100
80ºC
70ºC
50ºC
60ºC
Estabilidad 1M NaCl
Tiempo (h)
0 20 40 60 80 100 120 140 160
Activid
ad
re
sid
ua
l (%
)
0.1
1
10
100
80ºC
70ºC
60ºC
50ºC
Resultados y discusión
98
Figura 36: Termoestabilidad de la CGTasa a una concentración de 3 M NaCl.
Los datos obtenidos manifiestan que la proteína muestra una mayor
termoestabilidad conforme aumenta la concentración de NaCl del tampón en el que
se encuentra (Tabla 7). A temperaturas de 70 y 80 ºC, los tiempos de vida media
son muy bajos inactivándose la enzima en pocos minutos. A una temperatura de
60ºC se observa como la vida media de la enzima aumenta conforme la
concentración de sal es mayor. Por último, a 50 ºC las diferencias entre los tiempos
de vida media no son excesivamente significativos ya que las proteínas permanecen
estables durante semanas. A bajas concentraciones de sal las proteínas halofílicas
tienden a desestabilizarse, proceso que se encuentra favorecido por el aumento de
la temperatura. Sin embargo, a elevadas concentraciones salinas las proteínas se
mantienen estables, siendo la temperatura el único factor que puede perturbar su
estabilidad. Este patrón también se ha observado en las enzimas halofílicas
estudiadas por nuestro grupo de investigación (Bonete y col., 2007).
Tiempo (h)
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180
Activid
ad r
esid
ual (%
)
0.1
1
10
100
80ºC
70ºC
60ºC
50ºC
Resultados y discusión
99
Tabla 7: Tiempos de vida media a distintas temperaturas y concentraciones de sal, de la
CGTasa de Hfx. mediterranei.
Temperatura (ºC) 1 M NaCl (h) 2 M NaCl (h) 3 M NaCl (h)
50 214 239 255
60 5 18 82
70 0,03 0,03 0,04
80 0,02 0,02 0,03
A partir de la ecuación de Arrhenius se obtuvieron los valores de la energía
de activación para el proceso de desnaturalización:
El resto de los parámetros termodinámicos se obtuvieron a partir de los
valores de las constantes de desnaturalización. Mediante la teoría de Eyring del
estado de transición (1935), se postula una barrera de energía libre entre la
proteína nativa y un complejo activado que se despliega. La energía libre asociada
a este proceso se puede calcular a partir de la siguiente ecuación:
El ∆G se puede definir también como una combinación de valores energéticos y
entrópicos:
A partir de las dos ecuaciones anteriores se puede obtener la ecuación lineal:
Por lo tanto, representando log kdes
/T frente a 1/T, se puede calcular ∆H a partir de
la pendiente y ∆S a partir del valor de la ordenada.
Resultados y discusión
100
En el caso de una proteína en medio acuoso existen interacciones de la
proteína (nativa y desplegada) con el agua. Los puentes de hidrógeno y las
interacciones de van der Waals que se observan en el estado nativo, se han
formado a expensas de destruir otras interacciones de semejante naturaleza que la
proteína desplegada establecía con moléculas del agua. Cualquier molécula en
disolución acuosa puede alterar la estructura del agua en su vecindad, produciendo
efectos tanto entálpicos como entrópicos fuertemente relacionados con la
temperatura. De este modo, la estabilidad de una proteína está afectada no sólo
por las interacciones existentes entre la proteína y el agua, sino también por las
interacciones entre las propias moléculas de agua.
Los parámetros termodinámicos calculados para el proceso de
desnaturalización de la enzima a las temperaturas y concentraciones de NaCl
ensayadas, se muestran en la tabla 8. Los valores de energía de activación para el
proceso de inactivación térmica son prácticamente del mismo orden para las
diferentes concentraciones de sal, no obstante parece que va aumentando conforme
la concentración de sal es mayor. Al ser la proteína más estable al aumentar la
concentración de sal, será necesaria una mayor energía de activación para el
proceso de desnaturalización.
En el desplegamiento de una proteína, la entalpía se define como la energía
necesaria para romper las interacciones del estado nativo (van der Waals, enlaces
de hidrógeno, etc.). En el caso de la CGTasa de Hfx. mediterranei el ∆H es superior
a una concentración de NaCl 3 M, ya que es necesario romper un mayor número
de interacciones internas de la proteína y de interacciones estabilizantes entre los
iones salinos del medio acuoso y la proteína.
En el cambio en la entropía conformacional de una proteína contribuyen el
esqueleto peptídico y las cadenas laterales. El mayor aumento de la entropía a la
concentración de sal superior, puede ser explicado porque la proteína a esta
concentración de sal presenta una estructura más ordenada debido al efecto
compactante provocado por la concentración salina.
La estabilidad conformacional se define como la diferencia en la energía
libre entre el estado plegado y desplegado. Esta estabilidad termodinámica es la
suma de un elevado número de interacciones no covalentes débiles, que incluyen
Resultados y discusión
101
enlaces de hidrógeno, fuerzas de van der Waals, puentes salinos e interacciones
hidrofóbicas, y las fuerzas desestabilizadoras que aumentan la entropía
conformacional. Comparando el proceso de desactivación a una misma
temperatura, el ∆G es el mismo para las tres concentraciones de sal estudiadas.
Tabla 8: Parámetros termodinámicos a distintas temperaturas y concentraciones de sal de la
CGTasa de Hfx. mediterranei.
1 M NaCl 2 M NaCl 3 M NaCl
Temperatura (ºC) ∆G (KJ/mol) ∆G (KJ/mol) ∆G (KJ/mol)
50 95±4 95±4 95±4
60 89±4 89±4 89±4
70 84±4 84±4 83±4
80 79±4 78±4 78±4
Ea (KJ/mol) 265±4 274±4 277±6
∆H (KJ/mol) 266±2 274±2 280±2
∆S (KJ/molºK) 0,530±0,006 0,555±0,005 0,573±0,006
3.1.2.6.- Efecto de la concentración de EDTA y de iones divalentes en la actividad
enzimática
La mayoría de las -amilasas requieren iones Ca+2
para su actividad y/o
estabilidad (van der Maarel y col., 2002). Tras la cristalización de diversas CGTasas
se ha comprobado que presentan dos átomos de Ca+2
en su estructura, uno cerca
del final del N-terminal y otro en la región del centro activo. Ambos iones
proporcionan estabilidad en la estructura de las regiones flexibles de la proteína y
en el centro activo (Knegtel y col., 1996). Para comprobar si la CGTasa de Hfx.
mediterranei presentaba un requerimiento específico por este tipo de iones, se
incubó la proteína durante 1 hora a temperatura ambiente en presencia de
concentraciones crecientes de EDTA.
Los resultados obtenidos (Figura 37) muestran que la proteína se inactiva
completamente a concentraciones superiores de EDTA 10 mM, tal y como ocurre en
Resultados y discusión
102
la CGTasa de P. kodakaraensis (Rashid y col., 2002) donde la actividad disminuye
en un 70 % en presencia de esta concentración de EDTA.
Figura 37: Inactivación de la CGTasa de Hfx. mediterranei en presencia de concentraciones
crecientes de EDTA.
Una vez inactivada la enzima con una concentración elevada de EDTA (50
mM) y tras dializarla frente a tampón Tris-HCl 20 mM pH 7,5, NaCl 2 M, para la
eliminación del agente quelante, se estudió la recuperación de la actividad con
diferentes concentraciones de CaCl2 desde 0,5 mM hasta 10 mM, 50 mM, 100 mM
y 200 mM, durante 15 minutos, 22 horas y 72 horas. Los resultados obtenidos se
muestran en la siguiente tabla (Tabla 9).
EDTA (mM)
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55
Activid
ad
re
sid
ua
l (%
)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Resultados y discusión
103
Tabla 9: Recuperación de la actividad con diferentes concentraciones de CaCl2 tras la
inactivación con EDTA de la CGTasa de Hfx. mediterranei.
Actividad residual (%)
CaCl2 (mM) 15 min 22 h 72 h
0,5 2,5 5,5 10,0
1 3,0 6,0 11,0
2 3,0 6,0 12,0
3 3,5 6,5 12,0
4 4,0 7,0 13,0
5 4,0 7,0 13,0
6 5,0 8,0 14,0
7 6,5 8,5 14,5
8 7,5 10,5 16,5
9 8,0 11,0 17,0
10 10,0 13,0 19,0
50 2,5 6,5 10,0
100 1,5 3,0 4,5
200 1,0 1,0 1,0
Como se puede observar en la tabla anterior, los mejores resultados se
obtuvieron a una concentración de CaCl2 10 mM y un tiempo de incubación de 72
horas, aunque sólo se pudo recuperar un 19 % de actividad, considerando el 100 %
de actividad la mostrada por la CGTasa sin inactivar con EDTA. A concentraciones
superiores de CaCl2 la actividad disminuía recuperándose sólo un 10 % en CaCl
2
50 mM y a 200 mM prácticamente no se recuperaba. Este mismo comportamiento
se ha observado en la CGTasa de P. kodakaraensis (Rashid y col., 2002) y en la -
amilasa de Hfx. mediterranei (Pérez-Pomares y col., 2003). Del mismo modo, se
comprobó si la enzima recuperaba actividad tras la adición de MgCl2, MnCl
2, NiCl
2
y ZnCl2, a una concentración de 10 mM y un tiempo de incubación de 72 horas.
Con MgCl2 y MnCl
2 se recuperó un 4 % y 3 % de la actividad respectivamente.
Mientras que no se logró recuperar la actividad con ninguno de los otros iones que
se probaron.
Resultados y discusión
104
Los datos muestran que esta enzima requiere específicamente el ion calcio
para su estabilidad y/o actividad tal y como ocurre en las enzimas pertenecientes a
la familia de las -amilasas (MacGregor y col., 2001; van der Maarel y col., 2002).
3.1.2.7.- Determinación de actividades catalíticas específicas de CGTasa
3.1.2.7.1.- Actividad de ciclación
Para determinar las actividades de formación de -, -, y -ciclodextrina se
emplearon determinados reactivos que eran encapsulados o formaban complejos
de inclusión con las ciclodextrinas.
En la siguiente figura se muestran los resultados obtenidos para la actividad
de ciclación a -, - y -ciclodextrina. Las medidas de actividad se realizaron a los
20 minutos de reacción para poder compararlas con las actividades de hidrólisis.
Figura 38: Actividad de ciclación a -, - y -ciclodextrina de la CGTasa de Hfx.
mediterranei.
2D Graph 1
Tiempo (min)
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
Activid
ad e
spe
cífic
a (
U/m
g)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
-ciclodextrina
-ciclodextrina
-ciclodextrina
Resultados y discusión
105
En el caso de la ciclación a -ciclodextrina, la concentración de ésta
aumentó drásticamente en el primer minuto de reacción y se mantuvo prácticamente
constante con el aumento del tiempo de reacción. Se comprobó con reacciones
control que este aumento tan acusado era debido a la formación de la -
ciclodextrina y no a ninguna interferencia en el método de medida de la actividad.
La reacción transcurre de una forma muy rápida, alcanzando a los 20 minutos una
actividad específica de 88 U/mg.
Tanto para la ciclación a - como a -ciclodextrina, se observó como la
concentración de ambas ciclodextrinas aumentó de forma más o menos constante
con respecto al tiempo. A los 20 minutos de reacción, se alcanzó una actividad
específica de 48 U/mg para la ciclación a -ciclodextrina y de 34 U/mg en el caso
de la -ciclodextrina. En ambos casos la actividad era mucho menor que la obtenida
en la ciclación a -ciclodextrina.
Como se ha visto en la introducción, las CGTasas caracterizadas hasta el
momento producen una mezcla de -, - y -ciclodextrinas, siendo una de ellas la
mayoritaria. El rendimiento y la relación entre las ciclodextrinas depende no sólo del
microorganismo que las produzca, sino también de la concentración de la enzima,
la naturaleza del sustrato y las condiciones de reacción (temperatura, pH y tiempo).
En el caso de la enzima de Hfx. mediterranei, produce mayoritariamente -
ciclodextrina (1,43 mM), seguida por -ciclodextrina (0,86 mM) y finalmente -
ciclodextrina (0,42 mM), con una proporción de 1:0,6:0,3 respectivamente.
3.1.2.7.2.- Actividad de acoplamiento
Para determinar esta actividad, se calculó la concentración de glucosa
obtenida por la hidrólisis del oligosacárido lineal formado por el acoplamiento entre
la dextrina y el aceptor (metil -D-glucopiranósido).
En las figuras 39 y 40 se muestran los resultados obtenidos para la actividad
de acoplamiento para cada una de las ciclodextrinas. En todos los casos, la
Resultados y discusión
106
concentración de glucosa aumentaba con respecto al tiempo de reacción. A los 20
minutos la actividad específica de acoplamiento de -ciclodextrina era de 0,02
U/mg y de -ciclodextrina de 0,49 U/mg.
Estas actividades de acoplamiento, se encuentran muy por debajo de las
obtenidas para las CGTasas descritas en otros microorganismos. Por ejemplo, en B.
firmus la actividad de acoplamiento de -ciclodextrina es de 46 U/mg (Moriwaki y
col., 2007). Del mismo modo que la actividad de ciclación, la actividad de
acoplamiento está muy influenciada por factores como la concentración de enzima
y las condiciones de la reacción.
Figura 39: Actividad de acoplamiento a -ciclodextrina de la CGTasa de Hfx. mediterranei.
Tiempo (min)
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
Activid
ad
esp
ecíf
ica
(U
/mg
)
0.000
0.005
0.010
0.015
0.020
0.025
Resultados y discusión
107
Figura 40: Actividad de acoplamiento a -ciclodextrina de la CGTasa de Hfx. mediterranei.
3.1.2.7.3.- Actividad de transferencia
Para detectar esta actividad se emplearon dos azúcares lineales, maltosa
como aceptor y p-nitrofenil--D-maltoheptaósido-4-6-O-etilideno (EPS) (Randox)
como donador. Este sustrato contiene un grupo p-nitrofenilo que tras ser liberado
permitió la cuantificación de la reacción.
Como se puede apreciar en la siguiente figura, la concentración de
p-nitrofenol aumentaba rápidamente al inicio de la reacción y se mantenía
prácticamente constante con el aumento del tiempo. Al igual que ocurría con la
actividad de ciclación a -ciclodextrina, se comprobó con reacciones control que
este aumento drástico era debido a la aparición de p-nitrofenol y no a una
interferencia en el método de medida de actividad. A los 20 minutos la actividad
específica era de 4,4 U/mg. Al igual que con la actividad de acoplamiento, la
actividad de transferencia de la CGTasa de Hfx. mediterranei es muy inferior a la
2D Graph 4
Tiempo (min)
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
Activid
ad
esp
ecíf
ica
(U
/mg
)
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
Resultados y discusión
108
obtenida en otros microorganismos, como en B. firmus que es de 340 U/mg
(Moriwaki y col., 2007).
Figura 41: Actividad de transferencia de la CGTasa de Hfx. mediterranei.
3.1.2.8.- Especificidad de sustratos de la CGTasa
En el análisis de la especificidad de sustratos de la CGTasa se empleó la
misma concentración para todos ellos y la reacción transcurrió durante 20 horas
para que la enzima los pudiera hidrolizar completamente (Tabla 10).
Como se puede apreciar en la tabla, se obtiene la máxima actividad de
hidrólisis empleando almidón como sustrato. Dentro de las ciclodextrinas, la
CGTasa presenta una mayor actividad con -ciclodextrina, ya que es la que más
unidades de glucosa presenta en su estructura. La baja actividad empleando pululan
como sustrato confirma que la enzima no es una pululanasa ya que es capaz de
hidrolizar los enlaces glucosídicos -1,4 pero no los -1,6 presentes en este
sustrato. No obstante, la actividad con este sustrato es ligeramente superior a la
2D Graph 6
Tiempo (min)
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
Activid
ad
esp
ecíf
ica
(U
/mg
)
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
Resultados y discusión
109
obtenida con -ciclodextrina, ya que el pululan empleado presentaba un mayor
número de unidades de glucosa que la -ciclodextrina.
Tabla 10: Especificidad de sustratos de CGTasa de Hfx. mediterranei.
Sustrato Actividad (U/mg) Actividad relativa (%)
Almidón 73,0 100
Pululan 4,6 6
Glucógeno 17,5 24
-ciclodextrina 1,3 2
-ciclodextrina 7,5 10
-ciclodextrina 20,6 28
3.1.2.9.- Determinación de parámetros cinéticos
Los estudios de velocidades iniciales se llevaron a cabo empleando almidón
como sustrato y determinando la actividad de hidrólisis y ciclación a -ciclodextrina.
En las figuras 42 y 43 se muestran los resultados obtenidos tras representar la
ecuación de Lineweaver-Burk para ambas actividades.
Figura 42: Representación doble inversa de la velocidad inicial frente a la concentración de
almidón para la actividad de hidrólisis de la CGTasa de Hfx. mediterranei.
Lineweaver-Burke
1/[Almidón] (mM)-1
0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.08 0.09 0.10 0.11
1/V
(U
/mg)-1
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
0.07
0.08
0.09
0.10
y = 0.0094 + 0.8276 x
Resultados y discusión
110
Figura 43: Representación doble inversa de la velocidad inicial frente a la concentración de
almidón para la actividad de ciclación a -ciclodextrina de la CGTasa de Hfx. mediterranei.
Los valores obtenidos para las constantes cinéticas de la CGTasa de Hfx.
mediterranei con ambas actividades se muestran en la siguiente tabla.
Tabla 11: Constantes cinéticas calculadas a partir de velocidades iniciales con las
actividades de hidrólisis y de ciclación a -ciclodextrina de la CGTasa de Hfx. mediterranei.
Kalmidón
(g/l) Vmáx
(U/mg)
Kcat
x 10-3
(min-1
)
Kcat
/ Kalmidón
x 10-3
(l g-1
min-1
)
Hidrólisis 14,3 ± 0,8 106 ± 4 8,07 ± 0,02 0,57 ± 0,03
Ciclación 17,2 ± 0,6 161 ± 5 12,26 ± 0,02 0,71 ± 0,03
Las constantes cinéticas determinadas para ambas actividades son del orden
de las obtenidas para otras CGTasas caracterizadas, no obstante, resulta muy
complicado compararlas entre sí ya que los valores se encuentran en un rango muy
amplio (Martins y Hatti-Kaul, 2002). Por ejemplo en B. agaradhaerens la Km que
1/[Almidón] (mM)-1
0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.08 0.09 0.10 0.11
1/V
(U
/mg
)-1
0.00
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
0.07
0.08
y = 0.0062 + 0.6505 x
Resultados y discusión
111
han determinado para almidón con la actividad de ciclación a -ciclodextrina es de
21,2 ± 6,1 g/l, valor muy similar al obtenido en Hfx. mediterranei. Sin embargo,
hay una gran diferencia respecto a la Vmax
ya que en B. agaradhaerens es de 7,4 ±
0,6 U/mg (Martins y Hatti-Kaul, 2002). Al comparar entre sí las constantes
determinadas para cada una de las actividades, se aprecia que las obtenidas para
la actividad de ciclación a -ciclodextrina son superiores a las obtenidas para la
actividad de hidrólisis.
3.1.3.- Análisis de los productos de reacción por capa fina
Se analizaron los productos de la reacción de la CGTasa con almidón por
capa fina tal y como se describe en el apartado 2.2.15. A diferencia de lo que
ocurre con las amilasas, en las CGTasas los productos mayoritarios de la reacción
son las ciclodextrinas (Figura 44). En las reacciones en las que intervienen amilasas
en un primer momento el almidón es hidrolizado a maltosa y maltotriosa, y
conforme aumenta el tiempo de reacción esta maltoriosa es a su vez hidrolizada,
obteniendo glucosa y maltosa como productos finales de la reacción. Sin embargo,
como se puede observar en la siguiente figura, no se aprecian diferencias entre las
reacciones llevadas a cabo durante 20 minutos y 24 horas, parece que
prácticamente se obtiene la misma concentración de ciclodextrinas. Al igual que
ocurría con la actividad de ciclación, la -ciclodextrina es la que se produce con
una menor concentración, mientras que la - y -ciclodextrina aparecen juntas y no
se pueden diferenciar claramente.
Resultados y discusión
112
Figura 44: Cromatografía en capa fina de los productos de la reacción de la CGTasa.
Calles 1-9 patrones: glucosa (1), maltosa (2), maltotriosa (3), maltotetraosa (4),
maltopentaosa (5), maltohexaosa (6), -ciclodextrina (7), -ciclodextrina (8) y -ciclodextrina
(10). Calles 10-12 reacciones a diferentes tiempos: tiempo 0 (10), 20 minutos (11) y 24
horas (12).
3.1.4.- Estudios de glicosilación de la enzima
Aunque la mayoría de las glicoproteínas estudiadas son proteínas que
forman parte de la membrana o de los flagelos, se ha comprobado que también
están glicosiladas algunas proteínas de membrana implicadas en el aporte de
nutrientes a las células, como por ejemplo enzimas que participan en la
degradación de polisacáridos (Eichler y Adams, 2005). Este es el caso de la
proteína de unión a maltosa en Thermococcus litoralis (Greller y col., 2001) y a
celobiosa en Pyrococcus furiosus (Koning y col., 2002).
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Resultados y discusión
113
Además de estas proteínas de membrana, se han detectado en arqueas
proteínas extracelulares glicosiladas. Como por ejemplo la proteína de respuesta a
cobre en Methanobacterium bryantii (Kim y col., 1995), una fosfatasa alcalina en
Har. marismortui (Goldman y col., 1990), o una amilopululanasa en P. furiosus y T.
litoralis (Brown y Kelly, 1993).
Al tratarse la CGTasa de una proteína extracelular, se pensó que podía estar
glicosilada como señal de reconocimiento para su transporte hacia el exterior de la
célula, por lo que se realizó una tinción con el reactivo de Schiff. Tras realizar el gel
de electroforesis de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes y teñirlo tal y
como se indica en el apartado 2.2.16, se observó que no aparecía ninguna banda
teñida. Por esta razón descartamos que la proteína emplee la glicosilación como
señal de transporte.
3.1.5.- Análisis mediante nanoelectrospray LC/MS de la CGTasa de Hfx.
mediterranei
Este análisis se aplica para realizar la identificación y caracterización de
proteínas mediante análisis peptídico. El análisis mediante Nanoelectrospray LC/MS
de la CGTasa de Hfx. mediterranei ha permitido confirmar que la enzima se trataba
de una ciclomaltodextrin glucanotransferasa y obtener una serie de péptidos con los
que poder buscar la secuencia del gen en una genoteca en fago como veremos
más adelante.
En la tabla 12 se muestran los péptidos obtenidos con una mejor resolución.
Una vez obtenida la secuencia del gen (Apartado 3.2), se comprobó que estos
péptidos obtenidos en un primer momento para la enzima nativa, suponían un 21 %
del total de los residuos que componen la secuencia aminoacídica de la CGTasa de
Hfx. mediterranei.
Resultados y discusión
114
Tabla 12: Secuencia aminoacídica de los péptidos obtenidos mediante LC/MS.
Secuencia Mr exp. (Da) Mr cal. (Da) Error (Da) Score
DVIYQIVTDR 1554.8258 1554.9130 0.0872 168
LWLIKIDGIR 1410.6682 1410.7150 -0.0468 23
VDAVAHMP 1062.6082 1063.5484 -0.9403 32
FSNDSGMSIIDFR 1943.2654 1942.8407 0.4247 132
TDPNEFFGDMET 1939.2254 1938.7982 0.4272 64
VDVAHQDG 1322.6547 1322.8321 0.1774 68
QWLDAGIDGIR 1243.6654 1242.6357 1.0298 50
GFIGADQSN 1475.0915 1475.1035 0.0120 58
AIPFTDDWY 1321.4654 1320.5411 0.9243 55
FTVADGDTR 980.7054 980.4563 0.2491 57
DMAIAVIIT 1404.8254 1403.7442 1.0812 77
VIQALTSLR 1000.3254 999.6077 0.7178 61
EFGDNVVLVAINR 1445.0654 1444.7674 0.2980 31
SYDTFSS 1627.3456 1627.6188 0.2732 66
VNDATTPVGN 1479.3654 1479.0666 0.2989 44
SDGTVTEGESGSNR 1578.9254 1578.7274 0.1980 71
GTWKDSTGEYS 1921.1854 1920.8378 0.3477 84
Tras realizar una comparación de cada uno de ellos con las bases de datos,
se comprobó que los cuatro primeros presentaban una mayor homología que el
resto con enzimas pertenecientes a la familia de las -amilasas (Tabla 13, Figura
45). El péptido DVIYQIVTDR presentó un 90-100 % de identidad con todos los
microorganismos con los que se comparó, lo que indicaba que probablemente
forme parte de una región muy conservada. Por el contrario, el péptido LWLIKIDGIR
sólo presentó un 100 % de identidad con uno de los microorganismos, en el resto
presentaba una base adicional no secuenciada en Hfx. mediterranei.
Resultados y discusión
115
Tabla 13: Comparación de los péptidos DVIYQIVTDR, LWLIKIDGIR, VDAVAHMP y
FSNDSGMSIIDFR de Hfx. mediterranei con las bases de datos.
Péptido ID UniProt Fuente Longitud (pb) Identidad (%)
DVIYQIVTDR
P08137 -amilasa B. circulans 528 100
Q7X3T0 CGTasa B. agaradhaerens
679 100
O30565 CGTasa B. brevis 692 100
P31746 CGTasa Bacillus sp. 703 100
B1KQS8 -amilasa S. woodyi 703 100
C3FVU7 CGTasa B. thuringiensis 703 100
P27036 CGTasa B. ohbensis 704 100
LWLIKIDGIR
O30565 CGTasa B. brevis 692 100
O82984 CGTasa Bacillus sp. 704 82
P27036 CGTasa B. ohbensis 704 82
Q7X3T0 CGTasa B. agaradhaerens
679 64
Q5ZEQ7 CGTasa A. gottschalkii 721 55
P31797 CGTasa B. stearothermophilus 711 55
Q9F5W3 CGTasa B. circulans 713 55
VDAVAHMP
Q5ZEQ7 CGTasa A. gottschalkii 721
87,5
Q7X3T0 CGTasa B. agaradhaerens
679 87,5
Q9F5W3 CGTasa B. circulans 713
87,5
P31797 CGTasa B. stearothermophilus 711 75,0
O82984 CGTasa Bacillus sp. 704 75,0
P27036 CGTasa B. ohbensis 704
75,0
O30565 CGTasa B. brevis 692
75,0
FSNDSGMSIIDFR
C4MH58 CGTasa B. circulans 618
69,2
Q7X3T0 CGTasa B. agaradhaerens
679 69,2
P26827 CGTasa T. thermosulfurogenes 710 69,2
P31797 CGTasa B. stearothermophilus 711 69,2
Q6S3E3 CGTasa Bacillus sp. 712 69,2
B2D1U4 CGTasa Paenibacillus sp. 713 69,2
P14014 CGTasa B. licheniformis 718 69,2
Resultados y discusión
116
A) 10 20 30 40 50 60
| | | | | |
Péptido --------------------------------DVIYQIVTDR------------------
P08137 -ALLAAIAFGSVAPAEAAPATSVS-NKQNFSTDVIYQIVTDRFVDGNTANNPAGSAYDAT
B1KQS8 PHLLPLLAT-LIATPSLASDTDVS-NTVNYSTDVIYQIVTDRFLDGDSGNNPPPAMLDSS
Q7X3T0 -----------------QQATDRS-NSVNYSTDVIYQIVTDRFYDGDESNNPSGELYSED
P31746 -TILLSFIFFLLLSLPTVAEADVT-NKVNYSKDVIYQIVTDRFSDGNPGNNPSGAIFSQN
P27036 -TIPLALLLFILLSLPTAAQADVT-NKVNYTRDVIYQIVTDRFSDGDPSNNPTGAIYSQD
O30565 -MITPSFIISSFLSLPTVVEASVT-NKVNYSKDVIYQIVTDRFSDGNPANNPSGAIFSQN
C3FVU7 -----MLLWDGGCHLKEKDKLKVNRNNVNFSKDVIYQIVTDRFHNGCPSYNPKGGLYDES
**********
B) 250 260 270 280 290 300
| | | | | |
Péptido -------------------LWLIK-IDGIR------------------------------
O30565 ADYDLNNKVVDQYLKESIKLWLIK-IDGIRVDAVKHMSEGWQTSLMSDIYTYKPVFTFGE
O82984 ADYDLNNTVMDQYLKESIKLWLDKGIDGIRVDAVKHMSEGWQTSLMSDIYAHEPVFTFGE
P27036 ADYDLNNTVMDQYLKESIKLWLDKGIDGIRVDAVKHMSEGWQTSLMSDIYAHEPVFTFGE
Q7X3T0 ASFNHINSELNNYLEDAVKKWLDLGIDGIRIDAVAHMPPGWQKAYMDTIYDHRAVFTFGE
Q5ZEQ7 AGLNLNNNFVDQYLRDSIKFWLDLGVDGIRVDAVKHMPLGWQKSFVDTIYNHKPVFVFGE
P31797 ADLNHQNPVIDRYLKDAVKMWIDMGIDGIRMDAVKHMPFGWQKSLMDEIDNYRPVFTFGE
Q9F5W3 ADLNHNNSSVDVYLKDAIKMWLDLGVDGIRVDAVKHMPFGWQKSFMSTINNYKPVFTFGE
*: :****
C) 250 260 270 280 290 300
| | | | | |
Péptido ------------------------------VDAVAHMP----------------------
Q7X3T0 ASFNHINSELNNYLEDAVKKWLDLGIDGIRIDAVAHMPPGWQKAYMDTIYDHRAVFTFGE
Q5ZEQ7 AGLNLNNNFVDQYLRDSIKFWLDLGVDGIRVDAVKHMPLGWQKSFVDTIYNHKPVFVFGE
Q9F5W3 ADLNHNNSSVDVYLKDAIKMWLDLGVDGIRVDAVKHMPFGWQKSFMSTINNYKPVFTFGE
P31797 ADLNHQNPVIDRYLKDAVKMWIDMGIDGIRMDAVKHMPFGWQKSLMDEIDNYRPVFTFGE
O82984 ADYDLNNTVMDQYLKESIKLWLDKGIDGIRVDAVKHMSEGWQTSLMSDIYAHEPVFTFGE
P27036 ADYDLNNTVMDQYLKESIKLWLDKGIDGIRVDAVKHMSEGWQTSLMSDIYAHEPVFTFGE
O30565 ADYDLNNKVVDQYLKESIKLWLIK-IDGIRVDAVKHMSEGWQTSLMSDIYTYKPVFTFGE
:*** **.
D) 10 20 30 40 50 60
| | | | | |
Péptido -------------------------------FSNDSGMSIIDFR----------------
Q6S3E3 -FMSTINNYKPVFTFGEWFLGVNEISPEYHQFANESGMSLLDFRFAQKARQVFRDNTDNM
B2D1U4 -FMSTINNYKPVFTFGEWFLGINEISPEYHQFANESGMSLLDFRFAQKARQVFRDNTDNM
C4MH58 -WMAYISEYKPVFTFGEWFLGVGENDPSNVSFANESGMSLLDFRFGQKVRQVFRDNTDNM
P14014 -WMSSIYAHKPVFTFGEWFLGSAAPDADNTDFANESGMSLLDFRFNSAVRNVFRDNTSNM
P26827 -FMDSILSYRPVFTFGEWFLGTNEIDVNNTYFANESGMSLLDFRFSQKVRQVFRDNTDTM
P31797 -LMDEIDNYRPVFTFGEWFLSENEVDANNHYFANESGMSLLDFRFGQKLRQVLRNNSDNW
Q7X3T0 AYMDTIYDHRAVFTFGEWFTGPSG-NEDYTKFANNSGMSVLDFRFAQTTRNVIGNNNGTM
*:*:****::***
Figura 45: Alineamiento de los péptidos DVIYQIVTDR (A), LWLIKIDGIR (B), VDAVAHMP (C)
y FSNDSGMSIIDFR (D) de Hfx. mediterranei con enzimas pertenecientes a la familia de las
-amilasas de B. circulans (P08137), S. woodyi (B1KQS8), B. agaradhaerens (Q7X3T0),
Bacillus sp. (P31746, O82984, Q6S3E3), B. ohbensis (P27036), B. brevis (O30565), B.
thuringiensis (C3FVU7), A. gottschalkii (Q5ZEQ7), B. stearothermophilus (P31797), B.
circulans (Q9F5W3, C4MH58), Paenibacillus sp. (B2D1U4), B. licheniformis (P14014) y T.
thermosulfurogenes (P26827). Se ha marcado con un asterisco (*) los aminoácidos
idénticos entre sí, con dos puntos (:) los conservados y con un punto (.) los
semiconservados. En rojo se señalan los aminoácidos hidrofóbicos, en azul los ácidos, en
verde los no polares y en magenta los básicos.
Resultados y discusión
117
3.2.- Secuenciación del gen de CGTasa de Hfx. mediterranei
3.2.1.- Obtención de la sonda para CGTasa de Hfx. mediterranei
La utilización de productos de PCR marcados como sondas es una estrategia
de localización más eficaz que el empleo de oligonucleótidos marcados en el
extremo 3’ con colas de adenina marcadas con digoxigenina.
Los productos generados por PCR permiten localizar genes de una forma
más fiable que los oligonucleótidos marcados, ya que presentan una mayor
especificidad al ser de mayor tamaño, reduciendo por tanto la probabilidad de
encontrar falsos positivos.
Otra ventaja que poseen los productos de PCR frente a los oligonucleótidos
es la temperatura de hibridación. Mientras que para el oligonucleótido su
temperatura de anillamiento es próxima a 50 ºC, para generar productos por PCR
la temperatura a la que se hibrida generalmente es superior a 60 ºC, por lo que las
uniones son más específicas.
La generación de sondas por PCR está sustituyendo a la utilización de
oligonucleótidos en las técnicas de hibridación, ya que presentan como principal
ventaja el aumento de la especificidad y la fiabilidad en la localización del gen de
interés.
Para generar el producto de PCR en primer lugar se aisló el DNA genómico
de Hfx. mediterranei comprobando su pureza y concentración en una electroforesis
de agarosa al 0,8 % (p/v) (Figura 46).
Con los péptidos obtenidos tras la digestión con tripsina de la enzima
purificada (Apartado 3.1.6), y por comparación con las bases de datos, se
diseñaron dos parejas de oligonucleótidos que presentaban una elevada homología
con la familia de las amilasas. Tras realizar la PCR se comprobó en un gel de
agarosa al 1,5 % (p/v) que únicamente la pareja 247-254f/290-302r generaba
bandas a partir del DNA genómico (Figura 47).
Resultados y discusión
118
Figura 46: Electroforesis de agarosa al 0,8 % (p/v).
Calle 1: patrones moleculares de tamaño Marker III (Fermentas).
Calles 2 y 3: muestras del DNA aislado de Hfx. mediterranei.
Figura 47: Electroforesis de agarosa al 1,5 % (p/v).
Calles 1 y 5: patrones moleculares de tamaño Marker III (Fermentas).
Calle 2: reacción de PCR con la pareja 31-40f/230-239r.
Calles 3 y 4: reacciones control con los oligos 31-40f y 230-239r por
separado.
Calle 6: reacción de PCR con la pareja 247-254f/290-302r.
Calles 7 y 8: reacciones control con los oligos 247-254f y 290-320r por
separado.
1 2 3 pb
21226
5148
3530
2027 1904 1584 1375
947 831
564
21226
5148 3530
1904 1584 1375 947 831
564
pb 1 2 3 4 5 6 7 8
Resultados y discusión
119
pb 1 2 3 4 5 pb
21226
5148 3530
2027
1584 1375
947 831
1904
1031
500
200
300
400
800
600
Se repitió la reacción de PCR con la pareja 247-254f/290-302r para
purificar las bandas y secuenciarlas. En una electroforesis de agarosa al 1,5 % (p/v)
(Figura 48) se comprobó la existencia de tres bandas a unas 2000 pb, 300 pb y
200 pb. Estas bandas se purificaron y se secuenciaron con el oligo 247-254f.
Figura 48: Electroforesis de agarosa al 1,5 % (p/v).
Calle 1: patrones moleculares de tamaño Marker III (Fermentas).
Calle 2: reacción de PCR con la pareja de oligos 247-254f/290-302r.
Calle 3: reacción de PCR control con el oligo 247-254f.
Calle 4: reacción de PCR control con el oligo 290-302r.
Calle 5: patrón de 100 pb (Amersham).
A continuación (Figura 49) se muestra un alineamiento de la secuencia
obtenida con la banda de 200 pb, con las demás bandas no se obtuvo secuencia.
Tras compararla con las bases de datos, se comprobó que presentaba una elevada
homología con enzimas pertenecientes a la familia de las amilasas, por lo tanto se
decidió emplearla como sonda para la localización del gen de la CGTasa de Hfx.
mediterranei en una genoteca en fago .
Resultados y discusión
120
250 260 270 280 290 300
| | | | | |
Hfx.mediterranei -------------------------------VDAVAHMPPKWQKTLVDTIYDHRPVFTFG
B.clarkii LASLNQQHSFIDKYLKESIQLWLDTGIDGIRVDAVAHMPLGWQKAFISSVYDYNPVFTFG
B.agaradhaerens LASFNHINSELNNYLEDAVKKWLDLGIDGIRIDAVAHMPPGWQKAYMDTIYDHRAVFTFG
A.gottschalkii LAGLNLNNNFVDQYLRDSIKFWLDLGVDGIRVDAVKHMPLGWQKSFVDTIYNHKPVFVFG
B.circulans LADLNHNNSSVDVYLKDAIKMWLDLGVDGIRVDAVKHMPFGWQKSFMSTINNYKPVFTFG
Paenibacillus sp. LADLNHNNSSVDVYLKDAIKMWLDLGVDGIRVDAVKHMPFGWQKSFMSTINNYKPVFTFG
T.thermosulf LADLNQQNSTIDSYLKSAIKVWLDMGIDGIRLDAVKHMPFGWQKNFMDSILSYRPVFTFG
:*** *** *** :.:: .:..**.**
310 320 330 340 350 360
| | | | | | Hfx.mediterranei EWFLGADQSNPRYYEFSNDSGMSIIDFR--------------------------------
B.clarkii EWFTGAQGSN-HYHHFVNNSGMSALDFRYAQVAQDVLRNQKGTMHDIYDMLASTQLDYER
B.agaradhaerens EWFTGPSGNE-DYTKFANNSGMSVLDFRFAQTTRNVIGNNNGTMYDIEKMLTDTENDYDR
A.gottschalkii EWYLGKDEYDPNYYHFANNSGMSLLDFEFAQTTRSVFRNHEKNMFDLYDMLKNTENNYER
B.circulans EWFLGVNEISPEYHQFANESGMSLLDFRFAQKARQVFRDNTDNMYGLKAMLEGSEVDYAQ
Paenibacillus sp. EWFLGINEISPEYHQFANESGMSLLDFRFAQKARQVFRDNTDNMYGLKAMLEGSEVDYAR
T.thermosulf EWFLGTNEIDVNNTYFANESGMSLLDFRFSQKVRQVFRDNTDTMYGLDSMIQSTASDYNF
**: * . . * *:**** :**.
Figura 49: Alineamiento de la secuencia de la sonda de Hfx. mediterranei con enzimas
pertenecientes a la familia de las -amilasas: Anaerobranca gottschalkii (Q5ZEQ7), B.
agaradhaerens (Q7X3T0), B. circulans (Q9F5W3), Paenibacillus sp. (B2D1U4), B. clarkii
(B9A1J6), Thermoanaerobacter thermosulfurogenes (CDGT). Se ha marcado con un
asterisco (*) los aminoácidos idénticos entre sí, con dos puntos (:) los conservados y con un
punto (.) los semiconservados. En rojo se señalan los aminoácidos hidrofóbicos, en azul los
ácidos, en verde los no polares y en magenta los básicos.
El marcaje de la sonda se comprobó con una electroforesis de agarosa al
1,5 % (p/v) (Figura 50). Como se puede apreciar en la figura, la sonda se marcó
correctamente puesto que su tamaño era ligeramente superior al fragmento no
marcado debido a la inserción de los nucleótidos marcados con digoxigenina.
Una vez obtenida la sonda marcada se procedió a estimar el rendimiento del
marcaje mediante un Dot blot (Figura 51). Se depositaron en una membrana de
nitrocelulosa diferentes diluciones del producto marcado, frente a diferentes
diluciones conocidas de un DNA control proporcionado por la casa comercial. Ésta
es una técnica orientativa y necesaria para estimar la concentración de la sonda y
para evitar su exceso en las hibridaciones que pueda dar lugar a ruido de fondo o a
falsos positivos, y para comprobar que realmente ha funcionado el marcaje.
Resultados y discusión
121
Figura 50: Electroforesis de agarosa al 1,5 % (p/v).
Calle 1: patrón de 100 pb (Amersham).
Calle 2: reacción de PCR de marcaje con digoxigenina con la pareja de
oligos 247-254f/290-302r.
Calle 3: reacción de PCR control con la pareja de oligos 247-254f/290-
302r.
Figura 51: Dot blot que muestra la estimación del marcaje gracias a la distinta intensidad
obtenida en función de la concentración de sonda.
La dilución 1/1000 de la sonda presenta aproximadamente la misma
intensidad de quimioluminiscencia que en el caso del DNA control cuya
concentración total de DNA marcado es de 5 pg/ l, dado que la concentración
1 1:10 1:100 1:1000 1:10000 1:100000
1031
500
900
700
400
300
200
pb 1 2 3
DNA control
Sonda
pg/ l 500 50 5 0.5 0.05
Resultados y discusión
122
óptima para llevar a cabo las hibridaciones es de 15 ng/ml emplearemos 3 l del
producto de PCR marcado por ml de disolución de hibridación.
3.2.2.- Localización del gen de CGTasa de Hfx. mediterranei en una genoteca en
fago
Teniendo en cuenta el tipo de genoteca seleccionada, identificamos el clon
de interés mediante el método de hibridación en placa de las calvas de lisis con la
sonda específica de DNA para el gen objeto de estudio.
El método de hibridación en placa requiere que las calvas de lisis de la placa
Petri se traspasen sobre la superficie de una membrana de nylon (HybondTM-N+
,
Amersham Pharmacia Biotech). Por tratamiento alcalino se lisan las células y se
desnaturaliza el DNA que queda fijado al filtro (Sambrook y col., 2001).
La hibridación de ácidos nucleicos para la detección de secuencias
específicas de DNA y RNA se usa muy habitualmente. Las sondas de ácidos
nucleicos son utilizadas en una gran variedad de ensayos como Dot blot, Southern
blot, Northern blot, hibridación in situ, en placa, de colonias, etc. El fundamento en
todos ellos es el mismo, y está basado en la capacidad de desnaturalización y
renaturalización del DNA. Tras una desnaturalización previa, se realiza la
hibridación con una sonda específica, que al estar marcada permite su detección y
selección. Un aspecto importante en todas estas técnicas es el desarrollo de nuevos
métodos de marcaje y detección.
La hibridación se encuentra influida por los siguientes factores:
Las concentraciones relativas de los ácidos nucleicos.
La concentración de sales en la disolución de hibridación.
La desnaturalización.
La temperatura de hibridación (Tm).
Mediante el control de estas condiciones, particularmente de la
concentración de sales (astringencia), se puede llegar a regular el grado de
especificidad durante la hibridación: en condiciones de máxima astringencia, la
Resultados y discusión
123
hibridación es totalmente específica, reconociéndose tan sólo las secuencias
complementarias de la sonda empleada.
La sensibilidad del ensayo estará dada por la cantidad absoluta de
secuencias que queremos detectar en la muestra y por la intensidad de las señales
del elemento con el cual hemos marcado nuestra sonda. Los sistemas actuales están
en condiciones de detectar cantidades absolutas muy por debajo del nanogramo de
DNA.
Desde el desarrollo del primer fago recombinante (Campbell, 1971), en el
que se comprobó que para su viabilidad únicamente se requiere una tercera parte
de su genoma, se ha llevado a cabo un detallado análisis de su estructura y función
permitiendo emplearlo como vector de clonaje. Así mismo, se han obtenido distintas
variantes, que deben de ser elegidas en función de las enzimas de restricción
empleadas, el tamaño del fragmento de DNA a insertar y si el vector va a ser
empleado para expresión del DNA clonado.
La capacidad de desnaturalización y posterior hibridación que posee el DNA,
ha sido aprovechado para la identificación de secuencias ya sea sobre células
completas, virus, RNA, DNA, tejidos, etc. La optimización de los métodos de
hibridación (Khandjian, 1987) ha permitido que se puedan emplear diferentes
soportes para la transferencia, fijación y posterior hibridación de los ácidos
nucleicos. De hecho, actualmente la hibridación de DNA ha cobrado gran
importancia, ya que está permitiendo el desarrollo de una nueva tecnología: los
chips de DNA.
Empleando la hibridación en placa con la sonda de la CGTasa se realizó la
primera búsqueda de la librería, seleccionándose todos los fagos positivos que
fueron posibles, en nuestro caso un total de 58 fagos. La segunda búsqueda se
realizó con 12 de ellos, de los cuales con 3 se obtuvieron placas con prácticamente
todos los clones positivos. Por ello, se hizo una tercera búsqueda con estos fagos
obteniendo placas con todos los clones positivos en uno de los casos (fago 4.3.2),
con prácticamente el 90 % en otro (fago 6.14.7) y con señales muy débiles en el
último caso (fago 9.3.2). En la siguiente figura se pueden apreciar las placas
correspondientes a las tres búsquedas en la librería de fago .
Resultados y discusión
124
(A) (B)
(C)
Figura 52: Búsqueda en la librería de DNA genómico de Hfx. mediterranei en fago con la
sonda para la CGTasa. (A) Primera búsqueda en la librería, (B) Segunda búsqueda sobre
las calvas aisladas de la primera búsqueda, (C) Tercera búsqueda sobre las calvas de la
segunda búsqueda, todos los clones son positivos (fago 4.3.2).
3.2.3.- Obtención del DNA viral y secuenciación
A partir de las calvas identificadas como portadoras del gen de interés se
debe obtener el DNA del bacteriófago para su secuenciación.
El DNA vírico es una molécula lineal dúplex recombinante. En ella, la región
central del genoma del bacteriófago, que codifica para la integración del fago en el
Resultados y discusión
125
cromosoma de la bacteria hospedadora durante la fase lisogénica, ha sido
sustituida por un fragmento de DNA genómico de Hfx. mediterranei. Esta región no
es esencial para la replicación del virus, pudiendo ser sustituida sin afectar al
proceso lítico.
La purificación del DNA es un proceso sencillo y que está suficientemente
estandarizado. En el caso del DNA viral, los kits de purificación presentan
modificaciones respecto a los de purificación del DNA plasmídico y genómico, ya
que las partículas virales se encuentran en el medio de cultivo y no en el precipitado
celular. Es necesario precipitar las partículas virales para la extracción del DNA
vírico. Excepto en este paso, el resto de la purificación viene a ser muy similar a la
realizada para todos los tipos de DNAs.
La calidad del DNA (elevada pureza) es un factor muy importante, ya que
éste será empleado para la obtención de la secuencia. Un DNA con un grado de
pureza bajo daría problemas de dobles secuencias o ruido de fondo en las
reacciones de secuenciación, con resultados de difícil interpretación.
Se aisló el DNA de los tres fagos que habían resultado positivos en la tercera
búsqueda en la librería. A partir de cultivos de 250 ml de LB, para cada uno de los
fagos, se obtuvieron 400 l de DNA vírico con una concentración entre 255-300
ng/ l y una pureza Abs260/280
entre 1,71-1,88.
Para comprobar la integridad de los distintos DNAs de los fagos se realizó
una electroforesis de agarosa al 1 % (p/v), en la que se pudo observar su elevado
grado de integridad y la ausencia de degradación de los mismos (Figura 53).
Mediante el Southern blot se comprobó que el fago 4.3.2 era el que
mostraba una mayor señal de hibridación con la sonda para la CGTasa, el 6.14.7
tenía una señal muy débil y el 9.3.2 no dio ninguna señal, lo que nos llevó a pensar
que se trataba de un falso positivo (Figura 54).
Resultados y discusión
126
pb 1 2 3 4
pb 1 2 3 4 5
21226
5148 3530
947
1375 1584 2027
2027
5148
21226
947
1584 1904
3530 4268
564
831
1375
Figura 53: Electroforesis de agarosa al 1 % (p/v).
Calle 1: patrones moleculares de tamaño Marker III (Fermentas).
Calle 2: DNA aislado del fago 4.3.2.
Calle 3: DNA aislado del fago 6.14.7.
Calle 4: DNA aislado del fago 9.3.2.
Figura 54: Southern blot.
Calles 1 y 5: patrones moleculares de tamaño Marker III
marcados (Fermentas).
Calle 2: DNA aislado del fago 4.3.2.
Calle 3: DNA aislado del fago 6.14.7.
Calle 4: DNA aislado del fago 9.3.2.
Resultados y discusión
127
21226
5148 3530
2027
1584 1374
947 831
561
1031
200 300 400 500
100
800 700
pb 1 2 3 4 5 6 pb
En segundo lugar se realizó una PCR con los DNAs de los diferentes fagos y
con la pareja de oligos 247-254f/290-302r. En el caso del fago 4.3.2 se obtuvo un
fragmento con tamaño y concentración similares a los que se obtienen al generar la
sonda a partir de DNA genómico. Con el fago 6.14.7 se amplificó una banda con
un tamaño similar pero con una concentración bastante inferior, y con el fago 9.3.2
no se obtuvo ninguna banda del tamaño esperado, lo que nos demostraría una vez
más que se trataba de un falso positivo (Figura 55).
Figura 55: Electroforesis de agarosa al 1,5 % (p/v).
Calle 1: patrón de 100 pb (Fermentas).
Calle 2: PCR con el DNA del fago 4.3.2.
Calle 3: PCR con el DNA del fago 6.14.7.
Calle 4: PCR con el DNA del fago 9.3.2.
Calle 5: PCR control con DNA genómico.
Calle 6: patrones moleculares de tamaño Marker III (Fermentas).
Antes de comenzar a secuenciar es importante desarrollar una estrategia
general que tenga en cuenta el tamaño de la región que se va a secuenciar, la
exactitud requerida de la secuencia, y las facilidades de que se disponga. La
estrategia que se llevó a cabo en este trabajo fue la secuenciación por paseo o
primer walking.
Resultados y discusión
128
La secuenciación del DNA viral y de cósmidos es más complicada que la del
DNA plasmídico, debido al mayor tamaño del vector y del inserto contenido en éste.
Por ello, no es muy común encontrar bibliografía y, generalmente, se emplean
subclonajes en vectores plasmídicos para llevar a cabo la secuenciación de
fragmentos de DNA grandes. En el caso de DNA de arqueas, que contienen un
elevado porcentaje de G+C, la dificultad se ve incrementada ya que puede llevar a
la desnaturalización deficiente del molde, o a formación de estructuras secundarias
en el molde o en la hebra que se está formando. Para evitar estos problemas se
añadió DMSO al 1 % en la reacción de secuenciación. El programa de PCR
utilizado fue optimizado respecto al recomendado por Perkin Elmer. Se modificaron
las temperaturas de hibridación y elongación, los tiempos de desnaturalización y
elongación, así como el número de ciclos. Se prolongaron los tiempos de
desnaturalización para permitir que las hebras de DNA se desnaturalizaran por
completo, y se aumentaron el tiempo y la temperatura de elongación, ya que se
observó que a mayor temperatura se obtenía mayor lectura, y aumentando el
tiempo, una lectura más limpia, con menos ruido de fondo. De esta forma se
consiguió secuenciar hasta 700 pb de DNA viral en una única reacción de
secuenciación, superando las ventajas que ofrece el subclonaje en plásmido del
fragmento de interés.
Mediante la técnica de primer walking y el programa de PCR optimizado,
empleando el DNA del fago 4.3.2 identificado por hibridación con una sonda de
CGTasa de Hfx. mediterranei, se han conseguido secuenciar 7898 pb que se
corresponden con 5 genes, cgt, malE, malF, malG y malK, relacionados con la
degradación de almidón y con el transporte de maltosa al interior celular en Hfx.
mediterranei. En el segundo marco de lectura en sentido reverso, se identificó el gen
malK que codifica la ATPasa de un transportador de maltosa tipo ABC (ATP-Binding
Cassette). A continuación, en el primer marco en sentido directo se identificó en
primer lugar el gen malE que codifica la proteína de unión a maltosa del
transportador, seguido por malF que codifica una de las permeasas de dicho
transportador. Posteriormente, se identificó el gen malG en el segundo marco de
lectura en sentido directo que codifica para la segunda permeasa necesaria en el
transportador. Y finalmente, el gen cgt nuevamente en el primer marco de lectura
Resultados y discusión
129
directo, que codifica para una CGTasa (Figura 56). Estas secuencias han sido
depositadas en la base de datos GenBank con los siguientes números de acceso:
AJ876899 (CGTasa), AM411531 (malE), AM411532 (malF), AM411533 (malG) y
AM411534 (malK).
Empleando las secuencias consenso para cajas TATA de halófilos (Palmer y
Daniels, 1995; Danner y Soppa, 1996; Soppa, 1999a, Brenneis y col., 2007), se
han encontrado tres posibles cajas TATA, indicando que estos genes podrían
constituir unidades transcripcionales independientes. El gen de la CGTasa y el de la
ATPasa (malK) se transcribirían cada uno por separado, mientras que los genes del
transportador de maltosa (malE, malF y malG) se transcribirían como una única
unidad transcripcional.
Del mismo modo se han identificado las posibles secuencias promotoras
BRE. En los organismos del Dominio Archaea el inicio de la transcripción requiere
de la unión de una proteína llamada factor de transcripción B (TFB) a una región
cercana a la caja TATA, región BRE, que se encuentra altamente conservada (Bell y
Jackson, 1998; Soppa, 1999b).
Figura 56: Secuencia completa de los genes implicados en la degradación de almidón y en
el transporte de maltosa al interior celular. Las secuencias de las proteínas se encuentran
sobre fondo coloreado, verde oscuro malK (desde 1472-328), turquesa malE (1756-
3051), verde claro malF (3064-4083), amarillo malG (4137-5231) y rosa cgt (5364-
7503). Los oligonucleótidos empleados en la secuenciación se señalan con cuadros
punteados azules, las secuencias BRE en rojo y las caja TATA en azul.
L F R K A V L D D G T P R Q R D P R S A F1
Y F A K Q F L T T E R P D S A T P A R L F2
I S Q S S S * R R N A P T A R P P L G W F3
1 CTATTTCGCAAAGCAGTTCTTGACGACGGAACGCCCCGACAGCGCGACCCCCGCTCGGCT 60
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
1 GATAAAGCGTTTCGTCAAGAACTGCTGCCTTGCGGGGCTGTCGCGCTGGGGGCGAGCCGA 60
X N R L A T R S S P V G R C R S G R E A F6
X I E C L L E Q R R F A G V A R G G S P F5
* K A F C N K V V S R G S L A V G A R S F4
G R T R F R W R R S R R W P T S H S R V F1
A A R A F V G D A R D A G R R V T R G F F2
P H A L S L A T L A T L A D E S L A G S F3
61 GGCCGCACGCGCTTTCGTTGGCGACGCTCGCGACGCTGGCCGACGAGTCACTCGCGGGTT 120
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
61 CCGGCGTGCGCGAAAGCAACCGCTGCGAGCGCTGCGACCGGCTGCTCAGTGAGCGCCCAA 120
P R V R K R Q R R E R R Q G V L * E R T F6
Q G C A S E N A V S A V S A S S D S A P F5
A A R A K T P S A R S A P R R T V R P N F4
Resultados y discusión
130
R R C * S N G D P H P E * T G * P R E R F1
G G A R V T G T H T R S K R A D P E N D F2
A V L E * R G P T P G V N G L T P R T T F3
121 CGGCGGTGCTAGAGTAACGGGGACCCACACCCGGAGTAAACGGGCTGACCCCGAGAACGA 180
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
121 GCCGCCACGATCTCATTGCCCCTGGGTGTGGGCCTCATTTGCCCGACTGGGGCTCTTGCT 180
R R H * L L P S G C G S Y V P Q G R S R F6
E A T S S Y R P G V G P T F P S V G L V F5
P P A L T V P V W V R L L R A S G S F S F4
Q P K R L N Q K L K P K A R T K T S N D F1
S R K G * T R N * N R K R E Q K L R T T F2
A E K A E P E T E T E S A N K N F E R L F3
181 CAGCCGAAAAGGCTGAACCAGAAACTGAAACCGAAAGCGCGAACAAAAACTTCGAACGAC 240
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
181 GTCGGCTTTTCCGACTTGGTCTTTGACTTTGGCTTTCGCGCTTGTTTTTGAAGCTTGCTG 240
C G F L S F W F S F G F A R V F V E F S F6
V A S F A S G S V S V S L A F L F K S R F5
L R F P Q V L F Q F R F R S C F S R V V F4
F F T R I R Q R R Q L L R W G Q L L R W F1
S S R G Y D S G G S Y C V G G S Y C V G F2
L H A D T T A E A V T A L G A V T A L G F3
241 TTCTTCACGCGGATACGACAGCGGAGGCAGTTACTGCGTTGGGGGCAGTTACTGCGTTGG 300
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
241 AAGAAGTGCGCCTATGCTGTCGCCTCCGTCAATGACGCAACCCCCGTCAATGACGCAACC 300
K K V R I R C R L C N S R Q P C N S R Q F6
S R * A S V V A S A T V A N P A T V A N F5
E E R P Y S L P P L * Q T P P L * Q T P F4
G Q L L R R G * F T V L G S R A A S T R F1
G S Y C V E V S L L Y W G R A L L R L A F2
A V T A S R L V Y C T G V A R C F D S R F3
301 GGGCAGTTACTGCGTCGAGGTTAGTTTACTGTACTGGGGTCGCGCGCTGCTTCGACTCGC 360
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
301 CCCGTCAATGACGCAGCTCCAATCAAATGACATGACCCCAGCGCGCGACGAAGCTGAGCG 360
P C N S R R P * N V T S P D R A A E V R F6
P A T V A D L N T * Q V P T A R Q K S E F5
P L * Q T S T L K S Y Q P R A S S R S A F4
G V * A I R R S W G G T R E G R T R R R F1
V F E R F A G L G V E H V K V G L V E G F2
C L S D S P V L G W N T * R S D S S K V F3
361 GGTGTTTGAGCGATTCGCCGGTCTTGGGGTGGAACACGTGAAGGTCGGACTCGTCGAAGG 420
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
361 CCACAAACTCGCTAAGCGGCCAGAACCCCACCTTGTGCACTTCCAGCCTGAGCAGCTTCC 420
P T Q A I R R D Q P P V R S P R V R R L F6
R H K L S E G T K P H F V H L D S E D F F5
T N S R N A P R P T S C T F T P S T S P F4
* Y * L S R P F Q A R C P S R R G R * S F1
D T D C L V R F R L D V R V D A G D E V F2
I L I V S S V S G S M S E S T R A M K S F3
421 TGATACTGATTGTCTCGTCCGTTTCAGGCTCGATGTCCGAGTCGACGCGGGCGATGAAGT 480
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
421 ACTATGACTAACAGAGCAGGCAAAGTCCGAGCTACAGGCTCAGCTGCGCCCGCTACTTCA 480
Fago4.14rev
Resultados y discusión
131
H Y Q N D R G N * A R H G L R R P R H L F6
T I S I T E D T E P E I D S D V R A I F F5
S V S Q R T R K L S S T R T S A P S S T F4
R G R C R G A D S C R S R W V R R R R P F1
G G D V E V Q I V V G A D G F D D A D R F2
G A M S R C R * L S E P M G S T T P T V F3
481 CGGGGGCGATGTCGAGGTGCAGATAGTTGTCGGAGCCGATGGGTTCGACGACGCCGACCG 540
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
481 GCCCCCGCTACAGCTCCACGTCTATCAACAGCCTCGGCTACCCAAGCTGCTGCGGCTGGC 540
R P R H R P A S L Q R L R H T R R R R G F6
D P A I D L H L Y N D S G I P E V V G V F5
P P S T S T C I T T P A S P N S S A S R F4
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E S M R F E P S D A G V T S S G R I P I F3
541 TCGAATCGATGAGATTCGAGCCGTCCGACGCCGGGGTAACGTCTTCGGGGCGTATACCGA 600
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
541 AGCTTAGCTACTCTAAGCTCGGCAGGCTGCGGCCCCATTGCAGAAGCCCCGCATATGGCT 600
D F R H S E L R G V G P Y R R R P T Y R F6
T S D I L N S G D S A P T V D E P R I G F5
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601 TTCGAACCTCGGTCTCGTGTGTGGTCTCCCGGAGGTCCGCGGAGAACGACTCGGACAGCC 660
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
601 AAGCTTGGAGCCAGAGCACACACCAGAGGGCCTCCAGGCGCCTCTTGCTGAGCCTGTCGG 660
N S G R D R T H D G P P G R L V V R V A F6
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Y E N E L S S L T R T T W F P S R S T D F3
661 GGTACGAAAACGAGCTATCGTCGTTGACGAGGACCACGTGGTTCCCCTCGCGTTCGACCG 720
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
661 CCATGCTTTTGCTCGATAGCAGCAACTGCTCCTGGTGCACCAAGGGGAGCGCAAGCTGGC 720
P V F V L * R R Q R P G R P E G R T R G F6
R Y S F S S D D N V L V V H N G E R E V F5
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721 ACACGTCGAGGAAGTTCATACTCGGCGAGCCGACGAAGCCGCCGACGAACTCGTTTGCGG 780
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
721 TGTGCAGCTCCTTCAAGTATGAGCCGCTCGGCTGCTTCGGCGGCTGCTTGAGCAAACGCC 780
V R R P L E Y E A L R R L R R R V R K R F6
S V D L F N M S P S G V F G G V F E N A F5
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V F V H V L G S A D L L E F T V F Q D D F2
F S Y T S L G R P T C W S L P S F R M T F3
Fago4.13rev
Resultados y discusión
132
781 GGTTTTCGTACACGTCCTTGGGTCGGCCGACCTGCTGGAGTTTACCGTCTTTCAGGATGA 840
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
781 CCAAAAGCATGTGCAGGAACCCAGCCGGCTGGACGACCTCAAATGGCAGAAAGTCCTACT 840
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T K T C T R P D A S R S S N V T K * S S F4
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M R S P I V I A S S W S W V T Y S E V I F3
841 CGATGCGGTCGCCCATCGTCATCGCCTCTTCCTGGTCGTGGGTGACGTACAGCGAGGTGA 900
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
841 GCTACGCCAGCGGGTAGCAGTAGCGGAGAAGGACCAGCACCCACTGCATGTCGCTCCACT 900
R H P R G D D D G R G P R P H R V A L H F6
V I R D G M T M A E E Q D H T V Y L S T F5
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901 TACCGAGGTCGTTCTGGAGGCGCTGAATCTCCGTCCGCATCGTCGTCCGGAGCTTCGCGT 960
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
901 ATGGCTCCAGCAAGACCTCCGCGACTTAGAGGCAGGCGTAGCAGCAGGCCTCGAAGCGCA 960
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961 CGAGGTTCGAAAGCGGTTCGTCAAAGAGGAACACGTCGGGTTCGCGGACGATGGCGCGGC 1020
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
961 GCTCCAAGCTTTCGCCAAGCAGTTTCTCCTTGTGCAGCCCAAGCGCCTGCTACCGCGCCG 1020
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S T R F R N T L S S C T P N A S S P A A F4
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1021 CGAGCGCGACGCGCTGTTTCTGCCCGCCGGAGAGTTCGTCGGGTTTGTCGTCGAGTAGTT 1080
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
1021 GCTCGCGCTGCGCGACAAAGACGGGCGGCCTCTCAAGCAGCCCAAACAGCAGCTCATCAA 1080
R A R R A T E A R R L T R R T Q R R T T F6
G L A V R Q K Q G G S L E D P K D D L L F5
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1081 CTTCGATGCCCATCATCTGTGCCGTCTCGCGGACGCGCTCGCGACGCTCTGCTTTCGAGA 1140
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
1081 GAAGCTACGGGTAGTAGACACGGCAGAGCGCCTGCGCGAGCGCTGCGAGACGAAAGCTCT 1140
R R H G D D T G D R P R A R S A R S E L F6
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V G A H P Q P E R H V L H D G L V R V Q F2
S V L I R S P N A M F S M T V L C G Y S F3
1141 GGTCGGTGCTCATCCGCAGCCCGAACGCCATGTTCTCCATGACGGTCTTGTGCGGGTACA 1200
Resultados y discusión
133
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
1141 CCAGCCACGAGTAGGCGTCGGGCTTGCGGTACAAGAGGTACTGCCAGAACACGCCCATGT 1200
P R H E D A A R V G H E G H R D Q A P V F6
L D T S M R L G F A M N E M V T K H P Y F5
T P A * G C G S R W T R W S P R T R T C F4
A R S S G T P S P R L A C G R A G P S H F1
R V V L E H H R H V S R A G V L V R H I F2
A * F W N T I A T S R V R A C W S V T S F3
1201 GCGCGTAGTTCTGGAACACCATCGCCACGTCTCGCGTGCGGGCGTGCTGGTCCGTCACAT 1260
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
1201 CGCGCATCAAGACCTTGTGGTAGCGGTGCAGAGCGCACGCCCGCACGACCAGGCAGTGTA 1260
A R L E P V G D G R R A H P R A P G D C F6
L A Y N Q F V M A V D R T R A H Q D T V F5
R T T R S C W R W T E R A P T S T R * M F4
P R R Q R G Y D R S W A I P T P K P C G F1
L V A N E D T T A R G R F Q P R N H A E F2
S S P T R I R P L V G D S N P E T M R S F3
1261 CCTCGTCGCCAACGAGGATACGACCGCTCGTGGGCGATTCCAACCCCGAAACCATGCGGA 1320
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
1261 GGAGCAGCGGTTGCTCCTATGCTGGCGAGCACCCGCTAAGGTTGGGGCTTTGGTACGCCT 1320
G R R W R P Y S R E H A I G V G F G H P F6
D E D G V L I R G S T P S E L G S V M R F5
R T A L S S V V A R P R N W G R F W A S F4
A S S T S R T P T G R R R * * T H R L R F1
R R R L P A P R R A D D G D E L T V F D F2
V V D F P H P D G P T T V M N S P S S T F3
1321 GCGTCGTCGACTTCCCGCACCCCGACGGGCCGACGACGGTGATGAACTCACCGTCTTCGA 1380
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
1321 CGCAGCAGCTGAAGGGCGTGGGGCTGCCCGGCTGCTGCCACTACTTGAGTGGCAGAAGCT 1380
A D D V E R V G V P R R R H H V * R R R F6
L T T S K G C G S P G V V T I F E G D E F5
R R R S G A G R R A S S P S S S V T K S F4
P Q P R S R Q R Q R F G R C R T P F * V F1
R N R E V V N G N D S A V V E L L S E C F2
A T E K S S T A T I R P L S N S F L S V F3
1381 CCGCAACCGAGAAGTCGTCAACGGCAACGATTCGGCCGTTGTCGAACTCCTTTCTGAGTG 1440
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
1381 GGCGTTGGCTCTTCAGCAGTTGCCGTTGCTAAGCCGGCAACAGCTTGAGGAAAGACTCAC 1440
G C G L L R * R C R N P R Q R V G K Q T F6
V A V S F D D V A V I R G N D F E K R L F5
R L R S T T L P L S E A T T S S R E S H F4
Y R A * * S P L Y P W L G V A Q Y S S S F1
I E R N S R H C I H G S V W H S I V L P F2
S S V I V A I V S M A R C G T V * F F P F3
1441 TATCGAGCGTAATAGTCGCCATTGTATCCATGGCTCGGTGTGGCACAGTATAGTTCTTCC 1500
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
1441 ATAGCTCGCATTATCAGCGGTAACATAGGTACCGAGCCACACCGTGTCATATCAAGAAGG 1500
Y R A Y Y D G N Y G H S P T A C Y L E E F6
T D L T I T A M T D M A R H P V T Y N K F5
I S R L L R W Q I W P E T H C L I T R G F4
Fago4.12rev
Resultados y discusión
134
P I L R M Y E A Q F R S S F A S W V Q T F1
L S F E C M K H N F V V V L H R G Y R P F2
Y P S N V * S T I S * * F C I V G T D R F3
1501 CCTATCCTTCGAATGTATGAAGCACAATTTCGTAGTAGTTTTGCATCGTGGGTACAGACC 1560
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
1501 GGATAGGAAGCTTACATACTTCGTGTTAAAGCATCATCAAAACGTAGCACCCATGTCTGG 1560
TATA-BOX
G I R R I Y S A C N R L L K A D H T C V F6
G * G E F T H L V I E Y Y N Q M T P V S F5
R D K S H I F C L K T T T K C R P Y L G F4
V M T R L N E R A R P C P G T Q T H F W F1
* * R V * T R E H V P V R G P R R T S G F2
N D A S E R E S T S L S G D P D A L L A F3
1561 GTAATGACGCGTCTGAACGAGAGAGCACGTCCCTGTCCGGGGACCCAGACGCACTTCTGG 1620
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
1561 CATTACTGCGCAGACTTGCTCTCTCGTGCAGGGACAGGCCCCTGGGTCTGCGTGAAGACC 1620
BRE
T I V R R F S L A R G Q G P V W V C K Q F6
R L S A D S R S L V D R D P S G S A S R F5
Y H R T Q V L S C T G T R P G L R V E P F4
H N F S H T G R P R F E R T S A T E D V F1
T I F R T L A D R V S S A R A R P K T S F2
Q F F A H W P T A F R A H E R D R R R Q F3
1621 CACAATTTTTCGCACACTGGCCGACCGCGTTTCGAGCGCACGAGCGCGACCGAAGACGTC 1680
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
1621 GTGTTAAAAAGCGTGTGACCGGCTGGCGCAAAGCTCGCGTGCTCGCGCTGGCTTCTGCAG 1680
C L K E C V P R G R K S R V L A V S S T F6
A C N K A C Q G V A N R A C S R S R L R F5
V I K R V S A S R T E L A R A R G F V D F4
N R G * M I M S * F E * F N M * T T Y S F1
I E D E * L C L N S N D L I C E Q L I P F2
S R M N D Y V L I R M I * Y V N N L F L F3
BRE TATA-BOX
1681 AATCGAGGATGAATGATTATGTCTTAATTCGAATGATTTAATATGTGAACAACTTATTCC 1740
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
1681 TTAGCTCCTACTTACTAATACAGAATTAAGCTTACTAAATTATACACTTGTTGAATAAGG 1740
L R P H I I I D * N S H N L I H V V * E F6
* D L I F S * T K I R I I * Y T F L K N F5
I S S S H N H R L E F S K I H S C S I G F4
S S I H T M P L N R R T L L K N L G A A F1
H L F T P C H * I A E P Y * R T S V R P F2
I Y S H H A T E S Q N L T E E P R C G R F3
1741 TCATCTATTCACACCATGCCACTGAATCGCAGAACCTTACTGAAGAACCTCGGTGCGGCC 1800
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
1741 AGTAGATAAGTGTGGTACGGTGACTTAGCGTCTTGGAATGACTTCTTGGAGCCACGCCGG 1800
E D I * V M G S F R L V K S F F R P A A F6
R M * E C W A V S D C F R V S S G R H P F5
* R N V G H W Q I A S G * Q L V E T R G F4
G T V A A L A G C V G V Q E S S T N Q S F1
A R L P R S R V A L A S K R V P P T S R F2
Fago4.11rev
Resultados y discusión
135
H G C R A R G L R W R P R E F H Q P V G F3
1801 GGCACGGTTGCCGCGCTCGCGGGTTGCGTTGGCGTCCAAGAGAGTTCCACCAACCAGTCG 1860
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
1801 CCGTGCCAACGGCGCGAGCGCCCAACGCAACCGCAGGTTCTCTCAAGGTGGTTGGTCAGC 1860
P V T A A S A P Q T P T W S L E V L W D F6
R C P Q R A R P N R Q R G L S N W W G T F5
A R N G R E R T A N A D L L T G G V L R F4
G G D S D G S G D E N T D S S T G E T S F1
A A I P T V R A T K T P T A V P A R R P F2
R R F R R F G R R K H R Q Q Y R R D V R F3
1861 GGCGGCGATTCCGACGGTTCGGGCGACGAAAACACCGACAGCAGTACCGGCGAGACGTCC 1920
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
1861 CCGCCGCTAAGGCTGCCAAGCCCGCTGCTTTTGTGGCTGTCGTCATGGCCGCTCTGCAGG 1920
P P S E S P E P S S F V S L L V P S V D F6
P R R N R R N P R R F C R C C Y R R S T F5
A A I G V T R A V F V G V A T G A L R G F4
E S E P V G T A S V W Y S L P E P E I P F1
N P N P L G Q P R S G T R F P N Q R F P F2
I R T R W D S L G L V L A S R T R D S R F3
1921 GAATCCGAACCCGTTGGGACAGCCTCGGTCTGGTACTCGCTTCCCGAACCAGAGATTCCC 1980
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
1921 CTTAGGCTTGGGCAACCCTGTCGGAGCCAGACCATGAGCGAAGGGCTTGGTCTCTAAGGG 1980
S D S G T P V A E T Q Y E S G S G S I G F6
R I R V R Q S L R P R T S A E R V L S E F5
F G F G N P C G R D P V R K G F W L N G F4
G R K S A L E Q F N E A S D H T V K G S F1
A G S R P S N S S T K R R T I R * R A R F2
P E V G P R T V Q R S V G P Y G E G L G F3
1981 GGCCGGAAGTCGGCCCTCGAACAGTTCAACGAAGCGTCGGACCATACGGTGAAGGGCTCG 2040
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
1981 CCGGCCTTCAGCCGGGAGCTTGTCAAGTTGCTTCGCAGCCTGGTATGCCACTTCCCGAGC 2040
P R F D A R S C N L S A D S W V T F P E F6
R G S T P G R V T * R L T P G Y P S P S F5
A P L R G E F L E V F R R V M R H L A R F4
D I S D M R K K T T S A I P A G Q G P Q F1
T S P T C A R R R R A R F P P G R V R S F2
H L R H A Q E D D E R D S R R A G S A V F3
2041 GACATCTCCGACATGCGCAAGAAGACGACGAGCGCGATTCCCGCCGGGCAGGGTCCGCAG 2100
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
2041 CTGTAGAGGCTGTACGCGTTCTTCTGCTGCTCGCGCTAAGGGCGGCCCGTCCCAGGCGTC 2100
S M E S M R L F V V L A I G A P C P G C F6
P C R R C A C S S S S R S E R R A P D A F5
V D G V H A L L R R A R N G G P L T R L F4
S F E W A H D W A G D Y Y Q R G F V V D F1
R S S G R T T G P V T T T S A G S S S T F2
V R V G A R L G R * L L P A R V R R R P F3
2101 TCGTTCGAGTGGGCGCACGACTGGGCCGGTGACTACTACCAGCGCGGGTTCGTCGTCGAC 2160
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
2101 AGCAAGCTCACCCGCGTGCTGACCCGGCCACTGATGATGGTCGCGCCCAAGCAGCAGCTG 2160
D N S H A C S Q A P S * * W R P N T T S F6
T T R T P A R S P R H S S G A R T R R R F5
Resultados y discusión
136
R E L P R V V P G T V V V L A P E D D V F4
Q S D Q V D V D L D V F T G A A R E A I F1
R A T R S T L T S T C S R V P P A R Q S F2
E R P G R R * P R R V H G C R P R G N P F3
2161 CAGAGCGACCAGGTCGACGTTGACCTCGACGTGTTCACGGGTGCCGCCCGCGAGGCAATC 2220
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
2161 GTCTCGCTGGTCCAGCTGCAACTGGAGCTGCACAAGTGCCCACGGCGGGCGCTCCGTTAG 2220
W L S W T S T S R S T N V P A A R S A I F6
G S R G P R R Q G R R T * P H R G R P L F5
L A V L D V N V E V H E R T G G A L C D F4
Q F D G N L V G L P H D A E T V A L V Y F1
S S T A T S S A S R T T R R R S L S S T F2
V R R Q P R R P P A R R G D G R S R L Q F3
2221 CAGTTCGACGGCAACCTCGTCGGCCTCCCGCACGACGCGGAGACGGTCGCTCTCGTCTAC 2280
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
2221 GTCAAGCTGCCGTTGGAGCAGCCGGAGGGCGTGCTGCGCCTCTGCCAGCGAGAGCAGATG 2280
W N S P L R T P R G C S A S V T A R T * F6
G T R R C G R R G G A R R P S P R E R R F5
L E V A V E D A E R V V R L R D S E D V F4
N K D I V D E P P E T V A D M V S V M G F1
T R T S S T N R R K R L P T W S P * W E F2
Q G H R R R T A G N G C R H G L R D G R F3
2281 AACAAGGACATCGTCGACGAACCGCCGGAAACGGTTGCCGACATGGTCTCCGTGATGGGA 2340
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
2281 TTGTTCCTGTAGCAGCTGCTTGGCGGCCTTTGCCAACGGCTGTACCAGAGGCACTACCCT 2340
L L S M T S S G G S V T A S M T E T I P F6
C C P C R R R V A P F P Q R C P R R S P F5
V L V D D V F R R F R N G V H D G H H S F4
G V P R P P K T N N Y G L G L P F A D G F1
E F H D P R K R T T T G W G C P S Q T G F2
S S T T P E N E Q L R A G A A L R R R V F3
2341 GGAGTTCCACGACCCCCGAAAACGAACAACTACGGGCTGGGGCTGCCCTTCGCAGACGGG 2400
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
2341 CCTCAAGGTGCTGGGGGCTTTTGCTTGTTGATGCCCGACCCCGACGGGAAGCGTCTGCCC 2400
P T G R G G F V F L * P S P S G K A S P F6
L L E V V G S F S C S R A P A A R R L R F5
S N W S G R F R V V V P Q P Q G E C V P F4
Y F L S A W A H A F G G Y Y F D D S A D F1
T S S A R G P T L S A G T T S T T R R T F2
L P Q R V G P R F R R V L L R R L G G R F3
2401 TACTTCCTCAGCGCGTGGGCCCACGCTTTCGGCGGGTACTACTTCGACGACTCGGCGGAC 2460
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
2401 ATGAAGGAGTCGCGCACCCGGGTGCGAAAGCCGCCCATGATGAAGCTGCTGAGCCGCCTG 2460
Y K R L A H A W A K P P Y * K S S E A S F6
T S G * R T P G R K R R T S S R R S P P F5
V E E A R P G V S E A P V V E V V R R V F4
E R I G V A L P E T I K G V Q F T V D N F1
Fago4.10rev
Resultados y discusión
137
S E L A S R S P R R L K A S S L L S T T F2
A N W R R A P R D D * R R P V Y C R Q L F3
2461 GAGCGAATTGGCGTCGCGCTCCCCGAGACGATTAAAGGCGTCCAGTTTACTGTCGACAAC 2520
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
2461 CTCGCTTAACCGCAGCGCGAGGGGCTCTGCTAATTTCCGCAGGTCAAATGACAGCTGTTG 2520
S R I P T A S G S V I L P T W N V T S L F6
R A F Q R R A G R S S * L R G T * Q R C F5
L S N A D R E G L R N F A D L K S D V V F4
F V P Y M P N D P A Y E P Q A A A F A E F1
S C R T C R T T R R T N R R R P P S P K F2
R A V H A E R P G V R T A G G R L R R R F3
2521 TTCGTGCCGTACATGCCGAACGACCCGGCGTACGAACCGCAGGCGGCCGCCTTCGCCGAA 2580
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
2521 AAGCACGGCATGTACGGCTTGCTGGGCCGCATGCTTGGCGTCCGCCGGCGGAAGCGGCTT 2580
K T G Y M G F S G A Y S G C A A A K A S F6
S R A T C A S R G P T R V A P P R R R R F5
E H R V H R V V R R V F R L R G G E G F F4
G N A A F A I N G P W Y L S T L N E K G F1
E T P R S Q S T G R G T S Q R S T R R V F2
K R R V R N Q R A V V P L N A Q R E G Y F3
2581 GGAAACGCCGCGTTCGCAATCAACGGGCCGTGGTACCTCTCAACGCTCAACGAGAAGGGT 2640
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
2581 CCTTTGCGGCGCAAGCGTTAGTTGCCCGGCACCATGGAGAGTTGCGAGTTGCTCTTCCCA 2640
P F A A N A I L P G H Y R E V S L S F P F6
L F R R T R L * R A T T G R L A * R S P F5
S V G R E C D V P R P V E * R E V L L T F4
I D Y G V A K L P S P E G G E P K P F T F1
S T T V W P S Y P L P R A A S Q S R S R F2
R L R C G Q V T L S R G R R A K A V H G F3
2641 ATCGACTACGGTGTGGCCAAGTTACCCTCTCCCGAGGGCGGCGAGCCAAAGCCGTTCACG 2700
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
2641 TAGCTGATGCCACACCGGTTCAATGGGAGAGGGCTCCCGCCGCTCGGTTTCGGCAAGTGC 2700
I S * P T A L N G E G S P P S G F G N V F6
Y R S R H P W T V R E R P R R A L A T * F5
D V V T H G L * G R G L A A L W L R E R F4
G I T M W Y F A K A M E E G G A D A A A F1
A S R C G T S P R R W K K A V P T P P P F2
H H D V V L R Q G D G R R R C R R R R Q F3
2701 GGCATCACGATGTGGTACTTCGCCAAGGCGATGGAAGAAGGCGGTGCCGACGCCGCCGCC 2760
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
2701 CCGTAGTGCTACACCATGAAGCGGTTCCGCTACCTTCTTCCGCCACGGCTGCGGCGGCGG 2760
P M V I H Y K A L A I S S P P A S A A A F6
P C * S T T S R W P S P L L R H R R R R F5
A D R H P V E G L R H F F A T G V G G G F4
S R S F I E W F A T S E D L A L K A A Q F1
V G R S S S G S P P A R T S R * R R P R F2
S V V H R V V R H Q R G P R A E G G P G F3
2761 AGTCGGTCGTTCATCGAGTGGTTCGCCACCAGCGAGGACCTCGCGCTGAAGGCGGCCCAG 2820
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
2761 TCAGCCAGCAAGTAGCTCACCAAGCGGTGGTCGCTCCTGGAGCGCGACTTCCGCCGGGTC 2820
Fago4.8rev
Resultados y discusión
138
L R D N M S H N A V L S S R A S F A A W F6
W D T T * R T T R W W R P G R A S P P G F5
T P R E D L P E G G A L V E R Q L R G L F4
E Q G S I P V L K S L V E S G D L P E H F1
N R A A S R S S R A S S R A A T S R S T F2
T G Q H P G P Q E P R R E R R P P G A R F3
2821 GAACAGGGCAGCATCCCGGTCCTCAAGAGCCTCGTCGAGAGCGGCGACCTCCCGGAGCAC 2880
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
2821 CTTGTCCCGTCGTAGGGCCAGGAGTTCTCGGAGCAGCTCTCGCCGCTGGAGGGCCTCGTG 2880
S C P L M G T R L L R T S L P S R G S C F6
P V P C C G P G * S G R R S R R G G P A F5
F L A A D R D E L A E D L A A V E R L V F4
V Q G F S E A V Q Q G Q P M P T H P D M F1
F R A S R R P S S R G N R C R P T R T W F2
S G L L G G R P A G A T D A D P P G H G F3
2881 GTTCAGGGCTTCTCGGAGGCCGTCCAGCAGGGGCAACCGATGCCGACCCACCCGGACATG 2940
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
2881 CAAGTCCCGAAGAGCCTCCGGCAGGTCGTCCCCGTTGGCTACGGCTGGGTGGGCCTGTAC 2940
T * P K E S A T W C P C G I G V W G S M F6
R E P S R P P R G A P A V S A S G G P C F5
N L A E R L G D L L P L R H R G V R V H F4
G K V W D P V K A A L T K A F N G K D V F1
G R C G T R S R P R S R R R S T A K T S F2
E G V G P G Q G R A H E G V Q R Q R R R F3
2941 GGGAAGGTGTGGGACCCGGTCAAGGCCGCGCTCACGAAGGCGTTCAACGGCAAAGACGTC 3000
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
2941 CCCTTCCACACCCTGGGCCAGTTCCGGCGCGAGTGCTTCCGCAAGTTGCCGTTTCTGCAG 3000
P F T H S G T L A A S V F A N L P L S T F6
P S P T P G P * P R A * S P T * R C L R F5
P L H P V R D L G R E R L R E V A F V D F4
E K A M K T A D E E I R S N L E * R A T F1
R R Q * R L P T K K F A A T S N N E L H F2
E G N E D C R R R N S Q Q P R I T S Y I F3
3001 GAGAAGGCAATGAAGACTGCCGACGAAGAAATTCGCAGCAACCTCGAATAACGAGCTACA 3060
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
3001 CTCTTCCGTTACTTCTGACGGCTGCTTCTTTAAGCGTCGTTGGAGCTTATTGCTCGATGT 3060
S F A I F V A S S S I R L L R S Y R A V F6
R S P L S S Q R R L F E C C G R I V L * F5
L L C H L S G V F F N A A V E F L S S C F4
S M S T A S R V A R R V E D V P F L D K F1
Q * A P H H V S P A A L R T S R F S T S F2
N E H R I T C R P P R * G R P V S R Q A F3
3061 TCAATGAGCACCGCATCACGTGTCGCCCGCCGCGTTGAGGACGTCCCGTTTCTCGACAAG 3120
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
3061 AGTTACTCGTGGCGTAGTGCACAGCGGGCGGCGCAACTCCTGCAGGGCAAAGAGCTGTTC 3120
D I L V A D R T A R R T S S T G N R S L F6
M L S C R M V H R G G R Q P R G T E R C F5
* H A G C * T D G A A N L V D R K E V L F4
Fago4.9rev
Resultados y discusión
139
R D V S L L F V L P G L F V F S A F M L F1
E T F R S S S F C R G C S S F R R S C C F2
R R F A P L R S A G A V R L F G V H A V F3
3121 CGAGACGTTTCGCTCCTCTTCGTTCTGCCGGGGCTGTTCGTCTTTTCGGCGTTCATGCTG 3180
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
3121 GCTCTGCAAAGCGAGGAGAAGCAAGACGGCCCCGACAAGCAGAAAAGCCGCAAGTACGAC 3180
R S T E S R K T R G P S N T K E A N M S F6
A L R K A G R R E A P A T R R K P T * A F5
S V N R E E E N Q R P Q E D K R R E H Q F4
F P V V Y L I G I S F T D A A P A N L F F1
F R S S T S S V S R L P M R H R R T C S F2
S G R L P H R Y L V Y R C G T G E P V R F3
3181 TTTCCGGTCGTCTACCTCATCGGTATCTCGTTTACCGATGCGGCACCGGCGAACCTGTTC 3240
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
3181 AAAGGCCAGCAGATGGAGTAGCCATAGAGCAAATGGCTACGCCGTGGCCGCTTGGACAAG 3240
N G T T * R M P I E N V S A A G A F R N F6
T E P R R G * R Y R T * R H P V P S G T F5
K R D D V E D T D R K G I R C R R V Q E F4
A G E G A F S V L T F G E A T F I G I E F1
L E R V R F P S * R S A R R R S S A S R F2
W R G C V F R P D V R R G D V H R H R E F3
3241 GCTGGAGAGGGTGCGTTTTCCGTCCTGACGTTCGGCGAGGCGACGTTCATCGGCATCGAG 3300
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
3241 CGACCTCTCCCACGCAAAAGGCAGGACTGCAAGCCGCTCCGCTGCAAGTAGCCGTAGCTC 3300
A P S P A N E T R V N P S A V N M P M S F6
R Q L P H T K R G S T R R P S T * R C R F5
S S L T R K G D Q R E A L R R E D A D L F4
N Y A D V L F G G T F S I V L F G H T I F1
T T R T C C S A A R S A S S C S A T P S F2
L R G R A V R R H V Q H R P V R P H H R F3
3301 AACTACGCGGACGTGCTGTTCGGCGGCACGTTCAGCATCGTCCTGTTCGGCCACACCATC 3360
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
3301 TTGATGCGCCTGCACGACAAGCCGCCGTGCAAGTCGTAGCAGGACAAGCCGGTGTGGTAG 3360
F * A S T S N P P V N L M T R N P W V M F6
S S R P R A T R R C T * C R G T R G C W F5
V V R V H Q E A A R E A D D Q E A V G D F4
A T L P I N G Q F W N S F G V T W L F V F1
Q R S R L T A S S G T R S A L R G C S S F2
N A P D * R P V L E L V R R Y V A V R R F3
3361 GCAACGCTCCCGATTAACGGCCAGTTCTGGAACTCGTTCGGCGTTACGTGGCTGTTCGTC 3420
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
3361 CGTTGCGAGGGCTAATTGCCGGTCAAGACCTTGAGCAAGCCGCAATGCACCGACAAGCAG 3420
A V S G I L P W N Q F E N P T V H S N T F6
R L A G S * R G T R S S T R R * T A T R F5
C R E R N V A L E P V R E A N R P Q E D F4
A T S V T L K I A F S L A L A L V V T N F1
Q Q A L R * R L R L A W R S H S S * P T F2
N K R Y A E D C V * L G A R T R R D Q R F3
3421 GCAACAAGCGTTACGCTGAAGATTGCGTTTAGCTTGGCGCTCGCACTCGTCGTGACCAAC 3480
Fago4.7rev
Resultados y discusión
140
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
3421 CGTTGTTCGCAATGCGACTTCTAACGCAAATCGAACCGCGAGCGTGAGCAGCACTGGTTG 3480
A V L T V S F I A N L K A S A S T T V L F6
R L L R * A S S Q T * S P A R V R R S W F5
C C A N R Q L N R K A Q R E C E D H G V F4
E R V R G K R I M R S L I I L P M G L P F1
S A S A E S A S C V L S S S F R W G C R F2
A R P R K A H H A F S H H P S D G V A V F3
3481 GAGCGCGTCCGCGGAAAGCGCATCATGCGTTCTCTCATCATCCTTCCGATGGGGTTGCCG 3540
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
3481 CTCGCGCAGGCGCCTTTCGCGTAGTACGCAAGAGAGTAGTAGGAAGGCTACCCCAACGGC 3540
S R T R P F R M M R E R M M R G I P N G F6
R A R G R F A C * A N E * * G E S P T A F5
L A D A S L A D H T R E D D K R H P Q R F4
S I F T I T V W R G I F S S A E F G L A F1
L S S P S P S G A A S S A P R S S D W R F2
Y L H H H R L A R H L Q L R G V R T G E F3
3541 TCTATCTTCACCATCACCGTCTGGCGCGGCATCTTCAGCTCCGCGGAGTTCGGACTGGCG 3600
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
3541 AGATAGAAGTGGTAGTGGCAGACCGCGCCGTAGAAGTCGAGGCGCCTCAAGCCTGACCGC 3600
D I K V M V T Q R P M K L E A S N P S A F6
T * R * W * R R A R C R * S R P T R V P F5
R D E G D G D P A A D E A G R L E S Q R F4
N Q I L T I F G L E T V S W L S E R W L F1
I K S * R Y S D S K P C R G S A S D G W F2
S N P D D I R T R N R V V A Q R A M A G F3
3601 AATCAAATCCTGACGATATTCGGACTCGAAACCGTGTCGTGGCTCAGCGAGCGATGGCTG 3660
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
3601 TTAGTTTAGGACTGCTATAAGCCTGAGCTTTGGCACAGCACCGAGTCGCTCGCTACCGAC 3660
F * I R V I N P S S V T D H S L S R H S F6
S D F G S S I R V R F R T T A * R A I A F5
I L D Q R Y E S E F G H R P E A L S P Q F4
A F A A Y N V T E M W L A Y P F M V I I F1
R S P P T T S P R C G * R T R S W S S S F2
V R R L Q R H R D V V S V P V H G H H H F3
3661 GCGTTCGCCGCCTACAACGTCACCGAGATGTGGTTAGCGTACCCGTTCATGGTCATCATC 3720
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
3661 CGCAAGCGGCGGATGTTGCAGTGGCTCTACACCAATCGCATGGGCAAGTACCAGTAGTAG 3720
A N A A * L T V S I H N A Y G N M T M M F6
P T R R R C R * R S T T L T G T * P * * F5
R E G G V V D G L H P * R V R E H D D D F4
T V S A L Q D V P D E L H E A A M V D G F1
P * A R F R T F L T N S T K R R W S T A F2
R E R A S G R S * R T P R S G D G R R R F3
3721 ACCGTGAGCGCGCTTCAGGACGTTCCTGACGAACTCCACGAAGCGGCGATGGTCGACGGC 3780
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
3721 TGGCACTCGCGCGAAGTCCTGCAAGGACTGCTTGAGGTGCTTCGCCGCTACCAGCTGCCG 3780
V T L A S * S T G S S S W S A A I T S P F6
* R S R A E P R E Q R V G R L P S P R R F5
G H A R K L V N R V F E V F R R H D V A F4
Resultados y discusión
141
A S Y F S R F F H V T L P S I K R P V F F1
R V T S R G S S T S R C R P S N G P C S F2
E L L L A V L P R H V A V H Q T A R V L F3
3781 GCGAGTTACTTCTCGCGGTTCTTCCACGTCACGTTGCCGTCCATCAAACGGCCCGTGTTC 3840
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
3781 CGCTCAATGAAGAGCGCCAAGAAGGTGCAGTGCAACGGCAGGTAGTTTGCCGGGCACAAG 3840
A L * K E R N K W T V N G D M L R G T N F6
R S N S R A T R G R * T A T W * V A R T F5
R T V E R P E E V D R Q R G D F P G H E F4
F A S I L T A A A S F Q Q F L I P F V F F1
S R P S * P R Q R R S S S S S S R S C S F2
R V H P D R G S V V P A V P H P V R V Q F3
3841 TTCGCGTCCATCCTGACCGCGGCAGCGTCGTTCCAGCAGTTCCTCATCCCGTTCGTGTTC 3900
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
3841 AAGCGCAGGTAGGACTGGCGCCGTCGCAGCAAGGTCGTCAAGGAGTAGGGCAAGCACAAG 3900
K A D M R V A A A D N W C N R M G N T N F6
R R T W G S R P L T T G A T G * G T R T F5
E R G D Q G R C R R E L L E E D R E H E F4
N E G G P A R Q N E L I V V Y G Y R E A F1
T R A D R R A K T N S S S S T A T G K P F2
R G R T G A P K R T H R R L R L P G S P F3
3901 AACGAGGGCGGACCGGCGCGCCAAAACGAACTCATCGTCGTCTACGGCTACCGGGAAGCC 3960
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
3901 TTGCTCCCGCCTGGCCGCGCGGTTTTGCTTGAGTAGCAGCAGATGCCGATGGCCCTTCGG 3960
L S P P G A R W F S S M T T * P * R S A F6
* R P R V P A G F R V * R R R R S G P L F5
V L A S R R A L V F E D D D V A V P F G F4
L S F A E Y G R G A A I S I I A L L F I F1
S R S P S T G A G R R L A S S R C C S S F2
L V R R V R A R G G D * H H R A V V H R F3
3961 CTCTCGTTCGCCGAGTACGGGCGCGGGGCGGCGATTAGCATCATCGCGCTGTTGTTCATC 4020
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
3961 GAGAGCAAGCGGCTCATGCCCGCGCCCCGCCGCTAATCGTAGTAGCGCGACAACAAGTAG 4020
R E N A S Y P R P A A I L M M A S N N M F6
G R T R R T R A R P P S * C * R A T T * F5
E R E G L V P A P R R N A D D R Q Q E D F4
G A F M W L N V K R G R L A D G V N D A F1
A R S C G * T S S A A D S Q T G * T T R F2
R V H V A E R Q A R P T R R R G E R R V F3
4021 GGCGCGTTCATGTGGCTGAACGTCAAGCGCGGCCGACTCGCAGACGGGGTGAACGACGCG 4080
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
4021 CCGCGCAAGTACACCGACTTGCAGTTCGCGCCGGCTGAGCGTCTGCCCCACTTGCTGCGC 4080
P A N M H S F T L R P R S A S P T F S A F6
R R T * T A S R * A R G V R L R P S R R F5
A R E H P Q V D L A A S E C V P H V V R F4
* A S S I P S G K S * K T T P K R * R W F1
E P P R Y H R A K A E R R R P N G S D G F2
Fago4.6rev
Resultados y discusión
142
S L L D T I G Q K L K D D A Q T V A M A F3
4081 TGAGCCTCCTCGATACCATCGGGCAAAAGCTGAAAGACGACGCCCAAACGGTAGCGATGG 4140
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
4081 ACTCGGAGGAGCTATGGTAGCCCGTTTTCGACTTTCTGCTGCGGGTTTGCCATCGCTACC 4140
H A E E I G D P L L Q F V V G L R Y R H F6
T L R R S V M P C F S F S S A W V T A I F5
S G G R Y W R A F A S L R R G F P L S P F4
L R W R Q F E T S G I R L W P S S A A K F1
S G G G S S R H P V Y G C G H P A R R S F2
P V E A V R D I R Y T A V A I Q R G E V F3
4141 CTCCGGTGGAGGCAGTTCGAGACATCCGGTATACGGCTGTGGCCATCCAGCGCGGCGAAG 4200
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
4141 GAGGCCACCTCCGTCAAGCTCTGTAGGCCATATGCCGACACCGGTAGGTCGCGCCGCTTC 4200
S R H L C N S V D P I R S H G D L A A F F6
A G T S A T R S M R Y V A T A M W R P S F5
E P P P L E L C G T Y P Q P W G A R R L F4
C R R W N R * R R P V R R S E R * Y W S F1
V A D G T A E D G R C D A R S V N T G L F2
S P M E P L K T A G A T L G A L I L V C F3
4201 TGTCGCCGATGGAACCGCTGAAGACGGCCGGTGCGACGCTCGGAGCGTTAATACTGGTCT 4260
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
4201 ACAGCGGCTACCTTGGCGACTTCTGCCGGCCACGCTGCGAGCCTCGCAATTATGACCAGA 4260
H R R H F R Q L R G T R R E S R * Y Q D F6
T D G I S G S F V A P A V S P A N I S T F5
T A S P V A S S P R H S A R L T L V P R F4
V C S C S R F T G F S S Q R C R E P A V F1
S A L V P D L L D S H R S A V G N R R F F2
L L L F P I Y W I L I A A L S G T G G S F3
4261 GTCTGCTCTTGTTCCCGATTTACTGGATTCTCATCGCAGCGCTGTCGGGAACCGGCGGTT 4320
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
4261 CAGACGAGAACAAGGGCTAAATGACCTAAGAGTAGCGTCGCGACAGCCCTTGGCCGCCAA 4320
T Q E Q E R N V P N E D C R Q R S G A T F6
Q R S K N G I * Q I R M A A S D P V P P F5
D A R T G S K S S E * R L A T P F R R N F4
R Y T L R A G * S S S R R H R R * C R S F1
D I L F E R A E A L P G G T V V S A V P F2
I Y S S S G L K L F P E A P S L V P F L F3
4321 CGATATACTCTTCGAGCGGGCTGAAGCTCTTCCCGGAGGCACCGTCGTTAGTGCCGTTCC 4380
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
4321 GCTATATGAGAAGCTCGCCCGACTTCGAGAAGGGCCTCCGTGGCAGCAATCACGGCAAGG 4380
R Y V R R A P Q L E E R L C R R * H R E F6
E I Y E E L P S F S K G S A G D N T G N F5
S I S K S R A S A R G P P V T T L A T G F4
S G L S A T S S C R A T T S S S I S R * F1
L G Y R R P H R A G L R H R R R Y P G D F2
W V I G D L I V Q G Y D I V V D I P V T F3
4381 TCTGGGTTATCGGCGACCTCATCGTGCAGGGCTACGACATCGTCGTCGATATCCCGGTGA 4440
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
4381 AGACCCAATAGCCGCTGGAGTAGCACGTCCCGATGCTGTAGCAGCAGCTATAGGGCCACT 4440
E P N D A V E D H L A V V D D D I D R H F6
Fago4.5rev
Resultados y discusión
143
R Q T I P S R M T C P * S M T T S I G T F5
R P * R R G * R A P S R C R R R Y G P S F4
R T S P S C S A H R R L R C S T * A R F F1
E R R L R V Q H T A D Y A A R R E R D S F2
N V A F V F S T P Q I T L L D V S A I Q F3
4441 CGAACGTCGCCTTCGTGTTCAGCACACCGCAGATTACGCTGCTCGACGTGAGCGCGATTC 4500
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
4441 GCTTGCAGCGGAAGCACAAGTCGTGTGGCGTCTAATGCGACGAGCTGCACTCGCGCTAAG 4500
R V D G E H E A C R L N R Q E V H A R N F6
V F T A K T N L V G C I V S S S T L A I F5
S R R R R T * C V A S * A A R R S R S E F4
N R E R S A G L P S A R S S C S P G S R F1
T G N G R P G C L R L V R V V P R V R G F2
P G T V G R V A F G S F E L F P G F A V F3
4501 AACCGGGAACGGTCGGCCGGGTTGCCTTCGGCTCGTTCGAGTTGTTCCCCGGGTTCGCGG 4560
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
4501 TTGGCCCTTGCCAGCCGGCCCAACGGAAGCCGAGCAAGCTCAACAAGGGGCCCAAGCGCC 4560
L R S R D A P N G E A R E L Q E G P E R F6
* G P V T P R T A K P E N S N N G P N A F5
V P F P R G P Q R R S T R T T G R T R P F4
S N Q S R I R R R S S R S S G T V * Q W F1
R T N R E S V G V Q V V L L E Q S D S G F2
E P I E N P S A F K S F F W N S L T V A F3
4561 TCGAACCAATCGAGAATCCGTCGGCGTTCAAGTCGTTCTTCTGGAACAGTCTGACAGTGG 4620
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
4561 AGCTTGGTTAGCTCTTAGGCAGCCGCAAGTTCAGCAAGAAGACCTTGTCAGACTGTCACC 4620
D F W D L I R R R E L R E E P V T Q C H F6
T S G I S F G D A N L D N K Q F L R V T F5
R V L R S D T P T * T T R R S C D S L P F4
R F R R S S S R C R S S C R P R T R C R F1
D S D G H H R D V A H R A G R V R A V A F2
I P T V I I A M S L I V P A A Y A L S R F3
4621 CGATTCCGACGGTCATCATCGCGATGTCGCTCATCGTGCCGGCCGCGTACGCGCTGTCGC 4680
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
4621 GCTAAGGCTGCCAGTAGTAGCGCTACAGCGAGTAGCACGGCCGGCGCATGCGCGACAGCG 4680
R N R R D D D R H R E D H R G R V R Q R F6
A I G V T M M A I D S M T G A A Y A S D F5
S E S P * * R S T A * R A P R T R A T A F4
A A S S S S V G R F C S S T S C * R R S F1
P R V H L P S E D S V R L R P V D A G R F2
R E F I F R R K I L F V Y V L L T Q V G F3
4681 GCCGCGAGTTCATCTTCCGTCGGAAGATTCTGTTCGTCTACGTCCTGTTGACGCAGGTCG 4740
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
4681 CGGCGCTCAAGTAGAAGGCAGCCTTCTAAGACAAGCAGATGCAGGACAACTGCGTCCAGC 4740
A A L E D E T P L N Q E D V D Q Q R L D F6
R R S N M K R R F I R N T * T R N V C T F5
G R T * R G D S S E T R R R G T S A P R F4
A A D S E S R S S S D C T P C T S N S A F1
R R T R N R A P H R T V H R V R P T R H F2
G G L G I A L L I G L Y T V Y V Q L G I F3
4741 GCGGCGGACTCGGAATCGCGCTCCTCATCGGACTGTACACCGTGTACGTCCAACTCGGCA 4800
Resultados y discusión
144
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
4741 CGCCGCCTGAGCCTTAGCGCGAGGAGTAGCCTGACATGTGGCACATGCAGGTTGAGCCGT 4800
A A S E S D R E E D S Q V G H V D L E A F6
P P P S P I A S R M P S Y V T Y T W S P F5
R R V R F R A G * R V T C R T R G V R C F4
S T T A N S R W R C T T R R R R F R S T F1
Q R Q Q T R A G G V L R G D G G S V Q H F2
N D S K L A L A V Y Y A A T A V P F N T F3
4801 TCAACGACAGCAAACTCGCGCTGGCGGTGTACTACGCGGCGACGGCGGTTCCGTTCAACA 4860
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
4801 AGTTGCTGTCGTTTGAGCGCGACCGCCACATGATGCGCCGCTGCCGCCAAGGCAAGTTGT 4860
D V V A F E R Q R H V V R R R R N R E V F6
M L S L L S A S A T Y * A A V A T G N L F5
* R C C V R A P P T S R P S P P E T * C F4
R G S * R P T W T E F P S P T R R P Q S F1
V A L E D L H G R N S R L L R G G R S R F2
W L L K T Y M D G I P V S Y E E A A V V F3
4861 CGTGGCTCTTGAAGACCTACATGGACGGAATTCCCGTCTCCTACGAGGAGGCCGCAGTCG 4920
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
4861 GCACCGAGAACTTCTGGATGTACCTGCCTTAAGGGCAGAGGATGCTCCTCCGGCGTCAGC 4920
R P E Q L G V H V S N G D G V L L G C D F6
V H S K F V * M S P I G T E * S S A A T F5
T A R S S R C P R F E R R R R P P R L R F4
S T A R H R G E S S S R S F S R S R R R F1
R R R A T V A S R R R G H S P A L D G G F2
D G A P P W R V V V E V I L P L S T A G F3
4921 TCGACGGCGCGCCACCGTGGCGAGTCGTCGTCGAGGTCATTCTCCCGCTCTCGACGGCGG 4980
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
4921 AGCTGCCGCGCGGTGGCACCGCTCAGCAGCAGCTCCAGTAAGAGGGCGAGAGCTGCCGCC 4980
D V A R W R P S D D D L D N E R E R R R F6
T S P A G G H R T T T S T M R G S E V A F5
R R R A V T A L R R R P * E G A R S P P F4
D S R R C L S S P S S L G G R S S S S H F1
T R D G V Y L H L P H W V D G V R R R T F2
L A T V F I F T F L T G W T E F V V A Q F3
4981 GACTCGCGACGGTGTTTATCTTCACCTTCCTCACTGGGTGGACGGAGTTCGTCGTCGCAC 5040
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
4981 CTGAGCGCTGCCACAAATAGAAGTGGAAGGAGTGACCCACCTGCCTCAAGCAGCAGCGTG 5040
S E R R H K D E G E E S P P R L E D D C F6
P S A V T N I K V K R V P H V S N T T A F5
V R S P T * R * R G * Q T S P T R R R V F4
K R S S G T G Q T T R S P S G C T R S S F1
N A P R G R D K L H A P R R A V L A H Q F2
T L L G D G T N Y T L P V G L Y S L I S F3
5041 AAACGCTCCTCGGGGACGGGACAAACTACACGCTCCCCGTCGGGCTGTACTCGCTCATCA 5100
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
5041 TTTGCGAGGAGCCCCTGCCCTGTTTGATGTGCGAGGGGCAGCCCGACATGAGCGAGTAGT 5100
L R E E P V P C V V R E G D P Q V R E D F6
C V S R P S P V F * V S G T P S Y E S M F5
F A G R P R S L S C A G R R A T S A * * F4
A S T R F R G R A S R R S P S R S P P P F1
Fago4.4rev
Resultados y discusión
145
R V L D S V G A L L G V R P H V R L P H F2
E Y S I P W A R F S A F A L T F A S P I F3
5101 GCGAGTACTCGATTCCGTGGGCGCGCTTCTCGGCGTTCGCCCTCACGTTCGCCTCCCCCA 5160
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
5101 CGCTCATGAGCTAAGGCACCCGCGCGAAGAGCCGCAAGCGGGAGTGCAAGCGGAGGGGGT 5160
A L V R N R P R A E R R E G E R E G G G F6
L S Y E I G H A R K E A N A R V N A E G F5
R T S S E T P A S R P T R G * T R R G W F4
S C S C T S S H S G T S K V G C R S A A F1
H A R V P L R T A V H R R W A V V R R R F2
M L V Y L F A Q R Y I E G G L S F G G V F3
5161 TCATGCTCGTGTACCTCTTCGCACAGCGGTACATCGAAGGTGGGCTGTCGTTCGGCGGCG 5220
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
5161 AGTACGAGCACATGGAGAAGCGTGTCGCCATGTAGCTTCCACCCGACAGCAAGCCGCCGC 5220
D H E H V E E C L P V D F T P Q R E A A F6
M M S T Y R K A C R Y M S P P S D N P P F5
* A R T G R R V A T C R L H A T T R R R F4
S K A K P K R A R W C S F I F L L R L I F1
R R L S R N A L G G V L L Y F Y * D * * F2
E G * A E T R S V V F F Y I F I K I N R F3
BRE TATA-BOX
5221 TCGAAGGCTAAGCCGAAACGCGCTCGGTGGTGTTCTTTTATATTTTTATTAAGATTAATA 5280
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
5221 AGCTTCCGATTCGGCTTTGCGCGAGCCACCACAAGAAAATATAAAAATAATTCTAATTAT 5280
D F A L G F R A R H H E K I N K N L N I F6
T S P * A S V R E T T N K * I K I L I L F5
R L S L R F A S P P T R K Y K * * S * Y F4
E I S L I W L K P I Y L E L E D N Y L * F1
K Y L L F G L N Q Y I * N * K I I I C D F2
N I S Y L A * T N I S R T R R * L F V M F3
5281 GAAATATCTCTTATTTGGCTTAAACCAATATATCTAGAACTAGAAGATAATTATTTGTGA 5340
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
5281 CTTTATAGAGAATAAACCGAATTTGGTTATATAGATCTTGATCTTCTATTAATAAACACT 5340
S I D R I Q S L G I Y R S S S S L * K H F6
L F I E * K A * V L I D L V L L Y N N T F5
F Y R K N P K F W Y I * F * F I I I Q S F4
* D T Y S H T M S F D R R T F L K G L G F1
E I L I H T L C H S T G E R S * K D S D F2
R Y L F T H Y V I R Q A N V P E R T R I F3
5341 TGAGATACTTATTCACACACTATGTCATTCGACAGGCGAACGTTCCTGAAAGGACTCGGA 5400
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
5341 ACTCTATGAATAAGTGTGTGATACAGTAAGCTGTCCGCTTGCAAGGACTTTCCTGAGCCT 5400
H S V * E C V I D N S L R V N R F P S P F6
I L Y K N V C * T M R C A F T G S L V R F5
S I S I * V S H * E V P S R E Q F S E S F4
L S A I G L A G G T G A G N D D L A F V F1
* A Q S V S P E V P A P E T T T S H S S F2
E R N R S R R R Y R R R K R R P R I R L F3
5401 TTGAGCGCAATCGGTCTCGCCGGAGGTACCGGCGCCGGAAACGACGACCTCGCATTCGTC 5460
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
Resultados y discusión
146
5401 AACTCGCGTTAGCCAGAGCGGCCTCCATGGCCGCGGCCTTTGCTGCTGGAGCGTAAGCAG 5460
N L A I P R A P P V P A P F S S R A N T F6
I S R L R D R R L Y R R R F R R G R M R F5
Q A C D T E G S T G A G S V V V E C E D F4
S Q A A A A T P P E Q T V N F A D D V I F1
R R R P Q R R H L N R R * T S Q T T S F F2
A G G R S D A T * T D G E L R R R R H L F3
5461 TCGCAGGCGGCCGCAGCGACGCCACCTGAACAGACGGTGAACTTCGCAGACGACGTCATT 5520
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
5461 AGCGTCCGCCGGCGTCGCTGCGGTGGACTTGTCTGCCACTTGAAGCGTCTGCTGCAGTAA 5520
E C A A A A V G G S C V T F K A S S T M F6
R A P P R L S A V Q V S P S S R L R R * F5
R L R G C R R W R F L R H V E C V V D N F4
Y Q L I S D R F R D G N P N N N P T G E F1
I S L S R T G S E T E I R T T I Q R A N F2
S A Y L G P V P R R K S E Q Q S N G R T F3
5521 TATCAGCTTATCTCGGACCGGTTCCGAGACGGAAATCCGAACAACAATCCAACGGGCGAA 5580
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
5521 ATAGTCGAATAGAGCCTGGCCAAGGCTCTGCCTTTAGGCTTGTTGTTAGGTTGCCCGCTT 5580
* * S I E S R N R S P F G F L L G V P S F6
K D A * R P G T G L R F D S C C D L P R F5
I L K D R V P E S V S I R V V I W R A F F4
L A S D D C S N L R K Y C G G D W Q G I F1
S R A T T V R T S G S T A A A T G R A S F2
R E R R L F E P P E V L R R R L A G H H F3
5581 CTCGCGAGCGACGACTGTTCGAACCTCCGGAAGTACTGCGGCGGCGACTGGCAGGGCATC 5640
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
5581 GAGCGCTCGCTGCTGACAAGCTTGGAGGCCTTCATGACGCCGCCGCTGACCGTCCCGTAG 5640
S A L S S Q E F R R F Y Q P P S Q C P M F6
V R S R R S N S G G S T S R R R S A P C F5
E R A V V T R V E P L V A A A V P L A D F4
I D K I Q S G Y L T D L G V S A V W I S F1
S T R F K A A I * P T S G S L P S G F P F2
R Q D S K R L S D R P R G L C R L D F P F3
5641 ATCGACAAGATTCAAAGCGGCTATCTGACCGACCTCGGGGTCTCTGCCGTCTGGATTTCC 5700
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
5641 TAGCTGTTCTAAGTTTCGCCGATAGACTGGCTGGAGCCCCAGAGACGGCAGACCTAAAGG 5700
M S L I * L P * R V S R P T E A T Q I E F6
* R C S E F R S D S R G R P R Q R R S K F5
D V L N L A A I Q G V E P D R G D P N G F4
P P F E N I T A V D S D I G T S Y H G Y F1
R R S R T S P P S T R T S E P P I T A T F2
A V R E H H R R R L G H R N L L S R L L F3
5701 CCGCCGTTCGAGAACATCACCGCCGTCGACTCGGACATCGGAACCTCCTATCACGGCTAC 5760
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
5701 GGCGGCAAGCTCTTGTAGTGGCGGCAGCTGAGCCTGTAGCCTTGGAGGATAGTGCCGATG 5760
G G N S F M V A T S E S M P V E * * P * F6
G A T R S C * R R R S P C R F R R D R S F5
R R E L V D G G D V R V D S G G I V A V F4
Fago4.3rev
Resultados y discusión
147
W A R D F T D P N E F F G D M E T F K Q F1
G R A I S P T R T S S S A T W R R S N N F2
G A R F H R P E R V L R R H G D V Q T T F3
5761 TGGGCGCGCGATTTCACCGACCCGAACGAGTTCTTCGGCGACATGGAGACGTTCAAACAA 5820
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
5761 ACCCGCGCGCTAAAGTGGCTGGGCTTGCTCAAGAAGCCGCTGTACCTCTGCAAGTTTGTT 5820
Q A R S K V S G F S N K P S M S V N L C F6
S P A R N * R G S R T R R R C P S T * V F5
P R A I E G V R V L E E A V H L R E F L F4
L V D V A H Q N G I K V V I D F V P N H F1
S * T W P T K T A S R S S S T S F R I T F2
R R R G P P K R H Q G R H R L R S E S H F3
5821 CTCGTAGACGTGGCCCACCAAAACGGCATCAAGGTCGTCATCGACTTCGTTCCGAATCAC 5880
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
5821 GAGCATCTGCACCGGGTGGTTTTGCCGTAGTTCCAGCAGTAGCTGAAGCAAGGCTTAGTG 5880
S T S T A W W F P M L T T M S K T G F * F6
V R L R P G G F R C * P R * R S R E S D F5
E Y V H G V L V A D L D D D V E N R I V F4
T S P S T S D G E L E D G A L Y D N G S F1
P R R R L P T V N S K T G P S T T T G A F2
L A V D F R R * T R R R G P L R Q R E L F3
5881 ACCTCGCCGTCGACTTCCGACGGTGAACTCGAAGACGGGGCCCTCTACGACAACGGGAGC 5940
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
5881 TGGAGCGGCAGCTGAAGGCTGCCACTTGAGCTTCTGCCCCGGGAGATGCTGTTGCCCTCG 5940
V E G D V E S P S S S S P A R * S L P L F6
C R A T S K R R H V R L R P G R R C R S F5
G R R R S G V T F E F V P G E V V V P A F4
Y V A A Y N D D P K S Y F H H N G G T D F1
T S P P T T T T P R A I F T T T A A P T F2
R R R L Q R R P Q E L F S P Q R R H R L F3
5941 TACGTCGCCGCCTACAACGACGACCCCAAGAGCTATTTTCACCACAACGGCGGCACCGAC 6000
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
5941 ATGCAGCGGCGGATGTTGCTGCTGGGGTTCTCGATAAAAGTGGTGTTGCCGCCGTGGCTG 6000
* T A A * L S S G L L * K * W L P P V S F6
S R R R R C R R G W S S N E G C R R C R F5
V D G G V V V V G L A I K V V V A A G V F4
Y S S Y E D Q I Y R N L Y N L A D F D H F1
I R A T R T R F T A T S T I S P T S T T F2
F E L R G P D L P Q P L Q S R R L R P P F3
6001 TATTCGAGCTACGAGGACCAGATTTACCGCAACCTCTACAATCTCGCCGACTTCGACCAC 6060
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
6001 ATAAGCTCGATGCTCCTGGTCTAAATGGCGTTGGAGATGTTAGAGCGGCTGAAGCTGGTG 6060
* E L * S S W I * R L R * L R A S K S W F6
S N S S R P G S K G C G R C D R R S R G F5
I R A V L V L N V A V E V I E G V E V V F4
H E A Y I D Q Y L K D A I K Q W L D A G F1
T R R T S T S T * K T P S S S G W T R E F2
R G V H R P V P E R R H Q A V V G R G N F3
Fago4.2rev
Resultados y discusión
148
6061 CACGAGGCGTACATCGACCAGTACCTGAAAGACGCCATCAAGCAGTGGTTGGACGCGGGA 6120
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
6061 GTGCTCCGCATGTAGCTGGTCATGGACTTTCTGCGGTAGTTCGTCACCAACCTGCGCCCT 6120
W S A Y M S W Y R F S A M L C H N S A P F6
G R P T C R G T G S L R W * A T T P R P F5
V L R V D V L V Q F V G D L L P Q V R S F4
I D G I R V D A V A H M P P K W Q K T L F1
S T V S A S T R L R T C R R S G K R R S F2
R R Y P R R R G C A H A A E V A K D A R F3
6121 ATCGACGGTATCCGCGTCGACGCGGTTGCGCACATGCCGCCGAAGTGGCAAAAGACGCTC 6180
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
6121 TAGCTGCCATAGGCGCAGCTGCGCCAACGCGTGTACGGCGGCTTCACCGTTTTCTGCGAG 6180
I S P I R T S A T A C M G G F H C F V S F6
F R R Y G R R R P Q A C A A S T A F S A F5
D V T D A D V R N R V H R R L P L L R E F4
V D T I Y D H R P V F T F G E W F L G A F1
S I P S T T T G R C S P S A S G S S A Q F2
R Y H L R P P A G V H L R R V V P R R R F3
6181 GTCGATACCATCTACGACCACCGGCCGGTGTTCACCTTCGGCGAGTGGTTCCTCGGCGCA 6240
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
6181 CAGCTATGGTAGATGCTGGTGGCCGGCCACAAGTGGAAGCCGCTCACCAAGGAGCCGCGT 6240
T S V M * S W R G T N V K P S H N R P A F6
R R Y W R R G G A P T * R R R T T G R R F5
D I G D V V V P R H E G E A L P E E A C F4
D Q S N P R Y Y E F S N D S G M S L L D F1
T S R I R G T T S S R T T A A * A S S I F2
P V E S A V L R V L E R Q R H E P P R F F3
6241 GACCAGTCGAATCCGCGGTACTACGAGTTCTCGAACGACAGCGGCATGAGCCTCCTCGAT 6300
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
6241 CTGGTCAGCTTAGGCGCCATGATGCTCAAGAGCTTGCTGTCGCCGTACTCGGAGGAGCTA 6300
S W D F G R Y * S N E F S L P M L R R S F6
L G T S D A T S R T R S R C R C S G G R F5
V L R I R P V V L E R V V A A H A E E I F4
F R F G Q E I R Q V L R D F T D D W Y G F1
F D S D R R F D R S S A T S P T T G T D F2
S I R T G D S T G P P R L H R R L V R I F3
6301 TTTCGATTCGGACAGGAGATTCGACAGGTCCTCCGCGACTTCACCGACGACTGGTACGGA 6360
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
6301 AAAGCTAAGCCTGTCCTCTAAGCTGTCCAGGAGGCGCTGAAGTGGCTGCTGACCATGCCT 6360
K R N P C S I R C T R R S K V S S Q Y P F6
N E I R V P S E V P G G R S * R R S T R F5
K S E S L L N S L D E A V E G V V P V S F4
F R D M L Q E T E S E H D Q V I D Q V P F1
S G I C S K R P N R N T T R S S T R C P F2
Q G Y A P R D R I G T R P G H R P G A L F3
6361 TTCAGGGATATGCTCCAAGAGACCGAATCGGAACACGACCAGGTCATCGACCAGGTGCCC 6420
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
6361 AAGTCCCTATACGAGGTTCTCTGGCTTAGCCTTGTGCTGGTCCAGTAGCTGGTCCACGGG 6420
N L S I S W S V S D S C S W T M S W T G F6
Fago4.1rev
Resultados y discusión
149
I * P Y A G L S R I P V R G P * R G P A F5
E P I H E L L G F R F V V L D D V L H G F4
F I D N H D M P R F T V A D G D T R N T F1
S S T T T I C P G S P S P T A T R G T P F2
H R Q P R Y A P V H R R R R R H A E H R F3
6421 TTCATCGACAACCACGATATGCCCCGGTTCACCGTCGCCGACGGCGACACGCGGAACACC 6480
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
6421 AAGTAGCTGTTGGTGCTATACGGGGCCAAGTGGCAGCGGCTGCCGCTGTGCGCCTTGTGG 6480
K M S L W S I G R N V T A S P S V R F V F6
R * R C G R Y A G T * R R R R R C A S C F5
E D V V V I H G P E G D G V A V R P V G F4
D M A L A V L L T S R G T P A V Y Y G T F1
T W R S R S F * P R A G R P R C T T E P F2
H G A R G P S D L A R D A R G V L R N R F3
6481 GACATGGCGCTCGCGGTCCTTCTGACCTCGCGCGGGACGCCCGCGGTGTACTACGGAACC 6540
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
6481 CTGTACCGCGAGCGCCAGGAAGACTGGAGCGCGCCCTGCGGGCGCCACATGATGCCTTGG 6540
S M A S A T R R V E R P V G A T Y * P V F6
R C P A R P G E S R A R S A R P T S R F F5
V H R E R D K Q G R A P R G R H V V S G F4
E Q Y L T G G N D P D N R K P M P S F D F1
S S T S P A A T T P T T E S P C R R S T F2
A V P H R R Q R P R Q P K A H A V V R H F3
6541 GAGCAGTACCTCACCGGCGGCAACGACCCCGACAACCGAAAGCCCATGCCGTCGTTCGAC 6600
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
6541 CTCGTCATGGAGTGGCCGCCGTTGCTGGGGCTGTTGGCTTTCGGGTACGGCAGCAAGCTG 6600
S C Y R V P P L S G S L R F G M G D N S F6
R A T G * R R C R G R C G F A W A T T R F5
L L V E G A A V V G V V S L G H R R E V F4
T T T T A Y K V I Q A L T S L R S S N R F1
R R R P R T R S S R R S L A S G R R T G F2
D D D R V Q G H P G A H * P P V V E P A F3
6601 ACGACGACGACCGCGTACAAGGTCATCCAGGCGCTCACTAGCCTCCGGTCGTCGAACCGG 6660
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
6601 TGCTGCTGCTGGCGCATGTTCCAGTAGGTCCGCGAGTGATCGGAGGCCAGCAGCTTGGCC 6660
V V V V A Y L T M W A S V L R R D D F R F6
C S S S R T C P * G P A * * G G T T S G F5
R R R G R V L D D L R E S A E P R R V P F4
R S P T A D T E E R W I N S D V F V Y E F1
A R L R R T P K N G G * T R T S S S T S F2
L A Y G G H R R T V D K L G R L R L R A F3
6661 CGCTCGCCTACGGCGGACACCGAAGAACGGTGGATAAACTCGGACGTCTTCGTCTACGAG 6720
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
6661 GCGAGCGGATGCCGCCTGTGGCTTCTTGCCACCTATTTGAGCCTGCAGAAGCAGATGCTC 6720
R E G V A S V S S R H I F E S T K T * S F6
A S A * P P C R L V T S L S P R R R R R F5
A R R R R V G F F P P Y V R V D E D V L F4
Fago4.1for
Resultados y discusión
150
R E F G D N V V L V A I N R S L D W Y D F1
A N S G T T S S S S P S T G V S T G T T F2
R I R G Q R R P R R H Q P E S R L V R R F3
6721 CGCGAATTCGGGGACAACGTCGTCCTCGTCGCCATCAACCGGAGTCTCGACTGGTACGAC 6780
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
6721 GCGCTTAAGCCCCTGTTGCAGCAGGAGCAGCGGTAGTTGGCCTCAGAGCTGACCATGCTG 6780
R S N P S L T T R T A M L R L R S Q Y S F6
A R I R P C R R G R R W * G S D R S T R F5
A F E P V V D D E D G D V P T E V P V V F4
V S G L Q T S L P E G T Y D D A L G G T F1
S P V S K R R F R R E P T T T P S A A R F2
L R S P N V A S G G N L R R R P R R H A F3
6781 GTCTCCGGTCTCCAAACGTCGCTTCCGGAGGGAACCTACGACGACGCCCTCGGCGGCACG 6840
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
6781 CAGAGGCCAGAGGTTTGCAGCGAAGGCCTCCCTTGGATGCTGCTGCGGGAGCCGCCGTGC 6840
T E P R W V D S G S P V * S S A R P P V F6
R R R D G F T A E P P F R R R R G R R C F5
D G T E L R R K R L S G V V V G E A A R F4
L D G F S T T V N T D G S I D T F S V G F1
S M A S L R P S T P T A R * I P S R S V F2
R W L L Y D R Q H R R L D R Y L L G R S F3
6841 CTCGATGGCTTCTCTACGACCGTCAACACCGACGGCTCGATAGATACCTTCTCGGTCGGT 6900
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
6841 GAGCTACCGAAGAGATGCTGGCAGTTGTGGCTGCCGAGCTATCTATGGAAGAGCCAGCCA 6900
S S P K E V V T L V S P E I S V K E T P F6
A R H S R * S R * C R R S S L Y R R P R F5
E I A E R R G D V G V A R Y I G E R D T F4
P Q T V C V W E H T G T T A E P A L G H F1
R R P S A S G S T P E P R P N L L S A T F2
A D R L R L G A H R N H G R T C S R P R F3
6901 CCGCAGACCGTCTGCGTCTGGGAGCACACCGGAACCACGGCCGAACCTGCTCTCGGCCAC 6960
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
6901 GGCGTCTGGCAGACGCAGACCCTCGTGTGGCCTTGGTGCCGGCTTGGACGAGAGCCGGTG 6960
G C V T Q T Q S C V P V V A S G A R P W F6
D A S R R R R P A C R F W P R V Q E R G F5
R L G D A D P L V G S G R G F R S E A V F4
V G P T M G Q P G H T V V L S G D G F G F1
S A R R W D S P A T P S S S A A T A S A F2
R P D D G T A R P H R R P Q R R R L R Q F3
6961 GTCGGCCCGACGATGGGACAGCCCGGCCACACCGTCGTCCTCAGCGGCGACGGCTTCGGC 7020
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
6961 CAGCCGGGCTGCTACCCTGTCGGGCCGGTGTGGCAGCAGGAGTCGCCGCTGCCGAAGCCG 7020
T P G V I P C G P W V T T R L P S P K P F6
R R G S S P V A R G C R R G * R R R S R F5
D A R R H S L G A V G D D E A A V A E A F4
S T E G S V E F G T T S A S I T S W S N F1
A P R G R S S S A R P A H P S P R G R T F2
H R G V G R V R H D Q R I H H L V V E H F3
7021 AGCACCGAGGGGTCGGTCGAGTTCGGCACGACCAGCGCATCCATCACCTCGTGGTCGAAC 7080
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
7021 TCGTGGCTCCCCAGCCAGCTCAAGCCGTGCTGGTCGCGTAGGTAGTGGAGCACCAGCTTG 7080
Resultados y discusión
151
L V S P D T S N P V V L A D M V E H D F F6
C C R P T P R T R C S W R M W * R T T S F5
A G L P R D L E A R G A C G D G R P R V F4
T E I E A T V P A V S G G Y Y D V T V T F1
R K S K R P F P P S R A A T T T * R S R F2
G N R S D R S R R L G R L L R R D G H G F3
7081 ACGGAAATCGAAGCGACCGTTCCCGCCGTCTCGGGCGGCTACTACGACGTGACGGTCACG 7140
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
7081 TGCCTTTAGCTTCGCTGGCAAGGGCGGCAGAGCCCGCCGATGATGCTGCACTGCCAGTGC 7140
V S I S A V T G A T E P P * * S T V T V F6
C P F R L S R E R R R P R S S R R S P * F5
R F D F R G N G G D R A A V V V H R D R F4
D A N G A Q S D P F S G Y E V L S G D Q F1
T Q T V P R A T R S R A T R C S R A T K F2
R K R C P E R P V L G L R G A L G R P N F3
7141 GACGCAAACGGTGCCCAGAGCGACCCGTTCTCGGGCTACGAGGTGCTCTCGGGCGACCAA 7200
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
7141 CTGCGTTTGCCACGGGTCTCGCTGGGCAAGAGCCCGATGCTCCACGAGAGCCCGCTGGTT 7200
S A F P A W L S G N E P * S T S E P S W F6
P R L R H G S R G T R P S R P A R P R G F5
V C V T G L A V R E R A V L H E R A V L F4
I S A R F V V N D A T T D V G E N V Y V F1
S R L G S S S T T R R R T W A R T S T S F2
L G S V R R Q R R D D G R G R E R L R R F3
7201 ATCTCGGCTCGGTTCGTCGTCAACGACGCGACGACGGACGTGGGCGAGAACGTCTACGTC 7260
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
7201 TAGAGCCGAGCCAAGCAGCAGTTGCTGCGCTGCTGCCTGCACCCGCTCTTGCAGATGCAG 7260
I E A R N T T L S A V V S T P S F T * T F6
F R P E T R R * R R S S P R P R S R R R F5
D R S P E D D V V R R R V H A L V D V D F4
V G N V H E L G D W D T D R A V G P F F F1
S A T S T N W V T G T P T A P W D R S S F2
R Q R P R T G * L G H R P R R G T V L Q F3
7261 GTCGGCAACGTCCACGAACTGGGTGACTGGGACACCGACCGCGCCGTGGGACCGTTCTTC 7320
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
7261 CAGCCGTTGCAGGTGCTTGACCCACTGACCCTGTGGCTGGCGCGGCACCCTGGCAAGAAG 7320
T P L T W S S P S Q S V S R A T P G N K F6
R R C R G R V P H S P C R G R R P V T R F5
D A V D V F Q T V P V G V A G H S R E E F4
N Q V V H E Y P N W Y Y D V N L P A G T F1
I R S S T S T R T G T T T * T F P R G R F2
S G R P R V P E L V L R R E P S R G D G F3
7321 AATCAGGTCGTCCACGAGTACCCGAACTGGTACTACGACGTGAACCTTCCCGCGGGGACG 7380
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
7321 TTAGTCCAGCAGGTGCTCATGGGCTTGACCATGATGCTGCACTTGGAAGGGCGCCCCTGC 7380
L * T T W S Y G F Q Y * S T F R G A P V F6
* D P R G R T G S S T S R R S G E R P S F5
I L D D V L V R V P V V V H V K G R P R F4
Fago4.2for
Resultados y discusión
152
D I E F K F V K I A S D G T V T W E S G F1
T S S S N S S K S P A T E P S R G S R G F2
H R V Q I R Q N R Q R R N R H V G V G V F3
7381 GACATCGAGTTCAAATTCGTCAAAATCGCCAGCGACGGAACCGTCACGTGGGAGTCGGGG 7440
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
7381 CTGTAGCTCAAGTTTAAGCAGTTTTAGCGGTCGCTGCCTTGGCAGTGCACCCTCAGCCCC 7440
S M S N L N T L I A L S P V T V H S D P F6
P C R T * I R * F R W R R F R * T P T P F5
V D L E F E D F D G A V S G D R P L R P F4
S N R Q Y T T P T D S T G E Y S G T W K F1
R T D S T P R R R T R P A S T V G R G S F2
E P T V H H A D G L D R R V Q W D V E V F3
7441 TCGAACCGACAGTACACCACGCCGACGGACTCGACCGGCGAGTACAGTGGGACGTGGAAG 7500
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
7441 AGCTTGGCTGTCATGTGGTGCGGCTGCCTGAGCTGGCCGCTCATGTCACCCTGCACCTTC 7500
D F R C Y V V G V S E V P S Y L P V H F F6
T S G V T C W A S P S S R R T C H S T S F5
R V S L V G R R R V R G A L V T P R P L F4
* K V G R L G R P K R L P R D R P R R L F1
E K S D D W V G L R D Y R G T D R V V S F2
K S R T I G S A * E T T A G P T A S S R F3
7501 TGAAAAGTCGGACGATTGGGTCGGCCTAAGAGACTACCGCGGGACCGACCGCGTCGTCTC 7560
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
7501 ACTTTTCAGCCTGCTAACCCAGCCGGATTCTCTGATGGCGCCCTGGCTGGCGCAGCAGAG 7560
H F T P R N P R G L L S G R S R G R R R F6
T F L R V I P D A * S V V A P G V A D D F5
S F D S S Q T P R L S * R P V S R T T E F4
D D R P I F I H D D P K R L V A L L N R F1
T T D P F S S T T T R S V S S P C * I G F2
R P T H F H P R R P E A S R R P V E S A F3
7561 GACGACCGACCCATTTTCATCCACGACGACCCGAAGCGTCTCGTCGCCCTGTTGAATCGG 7620
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
7561 CTGCTGGCTGGGTAAAAGTAGGTGCTGCTGGGCTTCGCAGAGCAGCGGGACAACTTAGCC 7620
S S R G M K M W S S G F R R T A R N F R F6
R R G V W K * G R R G S A D R R G T S D F5
V V S G N E D V V V R L T E D G Q Q I P F4
H R D * K T G P P R R R P R R C R R C R F1
T E T E K R V L R D D G H V A V V D A E F2
P R L K N G S S E T T A T S L S S M Q K F3
7621 CACCGAGACTGAAAAACGGGTCCTCCGAGACGACGGCCACGTCGCTGTCGTCGATGCAGA 7680
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
7621 GTGGCTCTGACTTTTTGCCCAGGAGGCTCTGCTGCCGGTGCAGCGACAGCAGCTACGTCT 7680
C R S Q F V P G G L R R G R R Q R R H L F6
A G L S F F P D E S V V A V D S D D I C F5
V S V S F R T R R S S P W T A T T S A S F4
S Q T P R T G G R R D S F R G P R E R R F1
V K L P E R A V V G T R S V V R E K G D F2
S N S Q N G R S S G L V P W S A R K E T F3
7681 AGTCAAACTCCCAGAACGGGCGGTCGTCGGGACTCGTTCCGTGGTCCGCGAGAAAGGAGA 7740
Fago4.3for
Resultados y discusión
153
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
7681 TCAGTTTGAGGGTCTTGCCCGCCAGCAGCCCTGAGCAAGGCACCAGGCGCTCTTTCCTCT 7740
L * V G L V P P R R S E N R P G R S L L F6
F D F E W F P R D D P S T G H D A L F S F5
T L S G S R A T T P V R E T T R S F P S F4
R R P G S G Q S R R P I V V A M D A P P F1
D G P G R V R V G G Q S S L R W T R R Q F2
T A R V G S E S E A N R R C D G R A A N F3
7741 CGACGGCCCGGGTCGGGTCAGAGTCGGAGGCCAATCGTCGTTGCGATGGACGCGCCGCCA 7800
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
7741 GCTGCCGGGCCCAGCCCAGTCTCAGCCTCCGGTTAGCAGCAACGCTACCTGCGCGGCGGT 7800
R R G P D P * L R L G I T T A I S A G G F6
V V A R T P D S D S A L R R Q S P R A A F5
S P G P R T L T P P W D D N R H V R R W F4
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F A A V A H R R I V E V M V R F G L D S F2
S R Q S L T A G * S R * W C G S A S T R F3
7801 ATTCGCGGCAGTCGCTCACCGCCGGATAGTCGAGGTGATGGTGCGGTTCGGCCTCGACTC 7860
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
7801 TAAGCGCCGTCAGCGAGTGGCGGCCTATCAGCTCCACTACCACGCCAAGCCGGAGCTGAG 7860
I R P L R E G G S L R P S P A T R G R S F6
L E R C D S V A P Y D L H H H P E A E V F5
N A A T A * R R I T S T I T R N P R S E F4
A W S F G R D S T D R R L F1
R G H S A A T V R T D A X F2
V V I R P R Q Y G Q T P F3
7861 GCGTGGTCATTCGGCCGCGACAGTACGGACAGACGCCT 7898
----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|----:----|
7861 CGCACCAGTAAGCCGGCGCTGTCATGCCTGTCTGCGGA 7898
A H D N P R S L V S L R R F6
R T T M R G R C Y P C V G F5
R P * E A A V T R V S A F4
3.2.4.- Análisis de las secuencias
La automatización de los sistemas de secuenciación ha permitido que la
velocidad a la que se obtienen secuencias de ácidos nucleicos sea enorme. Sin
duda, toda esa información debe ser analizada, almacenada y distribuida de forma
adecuada, para poder ser empleada por toda la comunidad científica.
Por otro lado, la secuencia encierra gran información sobre la estructura y
función de la biomolécula en cuestión. El desarrollo de aplicaciones que posibilitan
relacionar regularidades en la estructura con la función y la secuencia, permiten
poder atribuir funciones a proteínas de las que únicamente se conoce su secuencia
de DNA. La posibilidad de comparar secuencias de una misma proteína pero de
Resultados y discusión
154
diferentes organismos, permite reconstruir la historia evolutiva y las relaciones
filogenéticas entre especies (Chenna y col., 2003).
El análisis de las secuencias comienza con la obtención de los marcos de
lectura a partir de la secuencia de DNA obtenida, con ayuda del programa REMAP
(EMBOSS). Con cada uno de los marcos se realizaron búsquedas en las bases de
datos empleando los programas BLAST y FASTA (ExPASy). En el caso de los marcos
directos se identificaron tres proteínas pertenecientes a un transportador de maltosa
tipo ABC (ATP-Binding Cassette) (Higgins, 2001; Davidson y col., 2008): una
proteína de unión a maltosa (malE), y dos permeasas (malF y malG); y una CGTasa
(cgt). Y en los marcos reversos se identificó la cuarta proteína perteneciente al
transportador de maltosa tipo ABC: una proteína de unión a ATP (malK) (Figura 57).
Mediante el programa TRANSEQ (EMBOSS) se obtuvieron las secuencias de
aminoácidos para cada una de las proteínas identificadas.
Figura 57: Representación de la organización genómica de la CGTasa y de los genes que
constituyen el transportador de maltosa tipo ABC en Hfx. mediterranei.
MalE
Comenzaremos con el análisis del primer gen que forma parte del
transportador de maltosa tipo ABC, malE, que codifica una proteína de unión a
maltosa. En primer lugar comprobamos con el programa TATFIND, que pertenece a
la familia de proteínas Tat (twin-arginine translocation) ya que posee el motivo típico
S/T-R-R-X-F-L-K en su extremo amino, donde X representa cualquier aminoácido
(Berks y col., 2000). En el caso de Hfx. mediterranei esta secuencia es N-R-R-T-L-L-K
(Figura 58). El uso preferente de esta vía por las arqueas halófilas sugiere una
adaptación evolutiva (Rose y col., 2002). Para mantener el equilibrio osmótico con
el exterior acumulan intracelularmente altas concentraciones de iones K+
(Madern y
malK malE malF malG cgt
284 pb 12 pb 53 pb 130 pb
1149 pb 1296 pb 1020 pb 1095 pb 2142 pb
Resultados y discusión
155
NRRTLLK ALA GCV
Corte de proteasa Proteína Tat
malE madura
precursor malE
col., 2000). Las proteínas para evitar agregaciones y ser estables en estas
condiciones intracitoplasmáticas de elevada salinidad, se pliegan adquiriendo
rápidamente una conformación estructural en la que los residuos ácidos quedan
expuestos en la superficie de la proteína. Este sistema de transporte permite
translocar a través de la membrana proteínas ya plegadas de diferentes tamaños.
Se empleó el programa SIGNALP para identificar un posible péptido señal.
Esta aplicación identificó un sitio de corte entre Ala22 y Gly23, pasando por tanto
de un proteína precursora de 431 aminoácidos a una proteína madura con 409
(Figura 58).
Figura 58: Esquema que representa la secuencia de la proteína de unión a maltosa de Hfx.
mediterranei en el que se muestra la señal de reconocimiento para su transporte (Tat) y el
sitio de corte de una proteasa para su maduración.
Para conocer los parámetros bioquímicos teóricos, se empleó el programa
PROTPARAM TOOL del servidor ExPASy (Expertise Protein Analysis System). El
número de aminoácidos que contiene esta proteína de Hfx. mediterranei es de 409,
su peso molecular de 43,87 kDa y su pI 4,27. El valor del punto isoeléctrico tan
bajo, similar al pI 3,78 obtenido para Har. marismortui, es característico de las
proteínas halófilas y se debe a la influencia de los aminoácidos cargados
negativamente. En especies no halófilas como T. litoralis y E. coli el pI es 5,49 y
5,53 respectivamente. Estas cargas negativas desestabilizarían la proteína debido a
la repulsión electrostática que tendría lugar con el disolvente, sin embargo, este
efecto es compensado con el efecto hidrofóbico que se produce por el aumento de
la concentración de sal y que estabiliza la proteína. Por otro lado, estas cargas
proporcionan grupos carboxilos hidratados que mantienen la solubilidad de la
proteína a elevadas concentraciones de sal (Mevarech y col., 2000). La
Resultados y discusión
156
composición de aminoácidos de la proteína de unión a maltosa en Hfx.
mediterranei y en otras especies caracterizadas, se muestra en la siguiente tabla.
Tabla 14: Composición de aminoácidos correspondiente a la proteína de unión a maltosa
de Hfx. mediterranei, Har. marismortui, T. litoralis y E. coli.
Hfx. mediterranei Har. marismortui T. litoralis E. coli
RESIDUO Nº % Nº % Nº % Nº %
Ala (A) 44 10,8 50 11,7 32 7,1 50 12,6
Arg (R) 8 2,0 10 2,3 11 2,4 7 1,8
Asn (N) 14 3,4 15 3,5 19 4,2 21 5,3
Asp (D) 33 8,1 38 8,9 22 4,9 24 6,1
Cys (C) 1 0,2 1 0,2 2 0,4 0 0,0
Gln (Q) 17 4,2 21 4,9 23 5,1 9 2,3
Glu (E) 33 8,1 37 8,7 32 7,1 27 6,8
Gly (G) 41 10,0 40 9,4 38 8,4 30 7,6
His (H) 6 1,5 5 1,2 6 1,3 3 0,8
Ile (I) 13 3,2 14 3,3 17 3,8 25 6,3
Leu (L) 20 4,9 22 5,2 40 8,9 34 8,6
Lys (K) 19 4,6 4 0,9 35 7,8 39 9,8
Met (M) 9 2,2 11 2,6 7 1,6 9 2,3
Phe (F) 19 4,6 18 4,2 19 4,2 16 4,0
Pro (P) 29 7,1 23 5,4 27 6,0 21 5,3
Ser (S) 31 7,6 36 8,5 26 5,8 15 3,8
Thr (T) 21 5,1 30 7,0 16 3,6 23 5,8
Trp (W) 8 2,0 9 2,1 12 2,7 8 2,0
Tyr (Y) 13 3,2 16 3,8 23 5,1 15 3,8
Val (V) 30 7,3 26 6,1 43 9,6 20 5,1
(Asp+Glu) 66 75 54 51
(Arg+Lys) 27 15 46 46
Como se puede comprobar en la tabla anterior, en la proteína de Hfx.
mediterranei se produce una gran diferencia entre el número total de residuos
cargados positiva y negativamente, alcanzando una proporción de 7 % y 16 % del
total de residuos, respectivamente. En el caso de proteínas homólogas no
halofílicas, como por ejemplo en E. coli o T. litoralis, estos porcentajes no difieren
Resultados y discusión
157
considerablemente entre sí. Este hecho también se aprecia en otras proteínas
halofílicas caracterizadas con anterioridad, como la de Har. marismortui, donde la
elevada proporción de aminoácidos cargados negativamente respecto a los
cargados positivamente, se ha descrito como un mecanismo de adaptación a
ambientes hipersalinos ya que contribuye a la solubilidad y estabilidad en dichos
medios. El aumento del número de aminoácidos cargados negativamente conlleva
una disminución en el contenido de Lys, un incremento en los residuos hidrofóbicos
Gly, Ala y Val, y una disminución de residuos alifáticos (Madern y col., 2000;
Esclapez y col., 2005).
Su estructura secundaria se puede predecir empleando la aplicación PSIPRED
del servidor ExPASy (Expertise Protein Analysis System). En la figura 59 se muestran
los diferentes elementos de la estructura secundaria, como hebras y hélices . En
la proteína malE de Hfx. mediterranei se han predicho un total de 11 hebras y 17
hélices . Estos números son muy similares a los obtenidos para Har. marismortui
con 13 hebras y 19 hélices , y T. litoralis con 14 hebras y 20 hélices .
Resultados y discusión
158
Figura 59: Predicción de la estructura secundaria de la proteína de unión a maltosa de Hfx.
mediterranei. En amarillo se muestra la conformación en hebra , y en verde la
conformación en hélice .
Resultados y discusión
159
Gracias a la base de datos PFAM del servidor ExPASy (Expertise Protein
Analysis System), podemos clasificar la proteína objeto de estudio, dentro de la
familia de proteínas correspondiente. En este caso, se trata de una proteína de
unión a solutos, en concreto, se engloba dentro de la familia de proteínas que unen
maltosa/maltotriosa en transportadores de tipo ABC y que permiten la entrada de
este soluto al interior celular.
En la siguiente comparación de secuencias se observa el alineamiento para
proteínas de unión a maltosa de distintos organismos todos ellos pertenecientes al
Dominio Archaea: Har. marismortui (Baliga y col., 2004), Halomicrobium
mukohataei, Halogeometricum borinquense, Natrialba magadii, P. kodakaraensis
(Fukui y col., 2005), P. abyssi (Cohen y col., 2003), Thermofilum pendens (Anderson
y col., 2008), Thermococcus barophilus, T. gammatolerans, Halorubrum
lacusprofundii y Hfx. mediterranei.
10 20 30 40 50 60
| | | | | |
Har.marismortui ----------MTMERRTVLKRIGGVGAATALAGCS-VQEQG---------------NGGS
Hmc.mukohataei MYDYFINRISMGFDRRTLLKHIGATGTIAAVGGCVGVEEQG---------------TDAD
Hfx.mediterranei ----------MPLNRRTLLKNLGAAGTVAALAGCVGVQESS---------------TNQS
Hgm.borinquense ----------MTMDRRSVLKHLGGVGVIGALAGCVGVQKQ-----------------NEQ
Hrr.lacusprofundi ----------MNEKRRTLLKTMGGSTALAALAGCISTGGDG---------------GDGG
Nab.magadii ----------MPLQRRQLLAGIGG-AATLTVAGCLG---------------------D--
P.abyssi -----------MKRGIYAVLLVGVLIFSVVASGCIGGTQTQTE----------TQTPEKT
P.kodakaraensis -----------MRKGIFALLLVGVLFLGVVASGCIGGGET-------------TTTPSTS
T.barophilus -----------MKKALFALLLVAVLAVAVVASGCIGGGTT---------------TPTTS
T.pendens ---------MTEKQQKQASKKTLTIVAAVVLVLVVLGVAA--------------------
T.gammatolerans --------MVNMRKGLFTLLLIGVLLFGVVASGCIGGGGGGTTSSPSKTSSSSTSQTTTS
.
70 80 90 100 110 120
| | | | | |
Har.marismortui EGETA-----SGDGSGDG---------ASGGSQQ---------SGGTATAWYQLQDSEIP
Hmc.mukohataei AG---------GGESSNG---------TDSTTEE---------PAGSATAWYGLSDTELE
Hfx.mediterranei GGDSDG----SGDENTDS---------STGETSES-------EPVGTASVWYSLPEPEIP
Hgm.borinquense STQSDS----GATEGGNS---------KATEMESS-------GPAGTAKAWYQLSDTEVP
Hrr.lacusprofundi DGSDGS----DGSNGSDG---------SDGSDGSDS------GTTGTTTLWADLSAAEDE
Nab.magadii ----------------D-----------DRG----------------TTLWNEFEDAEEE
P.abyssi QTPTTTQPSPTTTTSPTQ-----TTSQTPTETETH--TQEAECGSGKVVIWHNMQPNELQ
P.kodakaraensis QSQTTS--SPTETTSPTE-----TTTTSPTETTT---APTVECGSGKVVIWHNMQPNELE
T.barophilus SPTQTT--TSETTSSPTK-----TTTSSPTETTTTTTTESEKVPSGKVVIWHAMQPNEAQ
T.pendens ----M-----LLTQKPS----------APKRNVT-------------IVIWHAMGPEEVK
T.gammatolerans QAQTTTSISTTTSQTTTTGATETTTTATTTTTTTTTTTTSTQGEKITIVLWHAMGQAEAQ
* : *
Resultados y discusión
160
130 140 150 160 170 180
| | | | | |
Har.marismortui AREDAMETFASETEFGVDGSD-ISNMEKKTTSAIPAGQGPEVFEWAHDWVGDYYQ-RE--
Hmc.mukohataei LREDIIAAFNEESSHTIKGGN-IAEMQDRTTSAIPAGQGPETFQWAHDWVGDYYE-RG--
Hfx.mediterranei GRKSALEQFNEASDHTVKGSD-ISDMRKKTTSAIPAGQGPQSFEWAHDWAGDYYQ-RG--
Hgm.borinquense LREEALQTFNDQTKHTLDGSD-ISNLKKKTTSAIPAGQGPTTFEWAHDWGGDYYQ-RN--
Hrr.lacusprofundi AMSGYIDEYESDSGDTINKEAPGGELDQQLETAIPAGDGPESWIWAHDWVGRFAVREEPP
Nab.magadii TLEEHLEVFNEGRDDELNADN-IADMEDQLETAIPAGDGPGTFAWAHDWLGRYHD-QE--
P.abyssi VFQSLAEEYMAMCPDVEIVFEQKPDLENALKVAIPAGQGPDLFIWAHDWIGKFAE-AG--
P.kodakaraensis VFQSIAEEYMAECPNVEITFEQKPNLEDALKAAIPSGQGPDLFIWAHDWIGKFAD-AG--
T.barophilus VFESIIEEFMAEYPSIEIVLEQKPNLEDALKAAIPAGQGPDLFIWAHDWIGKFAE-AG--
T.pendens TLEDVIADFHVQHPEITVKLEQKADLETSLKTAIPAGQGPDLFIWAHDWIGKFAE-AG--
T.gammatolerans TFKDLISEFEIEHPNIDIQMEYKANLETALKAAIPAGKGPDLFIWAHDWIGKFAE-GG--
. : :: ***:*.** : ***** * :
190 200 210 220 230 240
| | | | | | Har.marismortui FVVDQSDELSVSLDQ-FTDAAASAVQFDDAVVGLPHSAETVTLIYNTDIVDEAPETIDDM
Hmc.mukohataei FVVDQSDELSVDLDQ-FTSAAAGAVQTDDAIVGLPFSAETVTLIYNADIVDKPPETFEEM
Hfx.mediterranei FVVDQSDQVDVDLDV-FTGAAREAIQFDGNLVGLPHDAETVALVYNKDIVDEPPETVADM
Hgm.borinquense FVVDKSDALSVSLDT-FTDGATEAIQFDGATIGLPHSAETVALIYNTEMVDSAPETVSEM
Hrr.lacusprofundi FLYDASDDVDVSLDS-YTETARQAAQFDGALHGLPFASETVALFYNEDMVDEPPETMEEM
Nab.magadii FGYDASGDLSLDLESEFTADAVDAVQWEGHTYGVPYASETVTLMYNPDLVDEPPETLEEM
P.abyssi LLEPIDEYITDDLLQKFAPMAREAIEYKGHYYALPFAAETVAMIYNKKIVSEPPKTFDEL
P.kodakaraensis LLEPIDDYITDDILKDFAPMAVDAMQYKGHYYAMPFAAETVAIIYNKAMVSEPPKTFDEM
T.barophilus LLEPIDEYITPDILDKFSGMAKEAIEYGGHYYAMPFAAETVAIIYNKKMISEPPKTFDEM
T.pendens LLEPIDEYVTPSVLNKFSPIGQNAIEYRGHYYAMPLAAETVALIYNKALVPNPPKTFDEM
T.gammatolerans LLKPIDGYVTEDFTNSFIPIAQDAFEYKGHYYGVPFAAETVALIYNKDMVPNPPQNFDEM
: . : .. : . * : . .:* :***::.** :: ..*:.. ::
250 260 270 280 290 300
| | | | | |
Har.marismortui VSAMESYHDP-SSSQYGLAAPF-DPYFTSGWIQAFGGYYFDPEQDPALGLDADEAIEGLQ
Hmc.mukohataei AASMEAYHDS-ANGKYGLAMPF-NPYFISGIAQAFGGRYFDPESDPVVGLDSEETVRGFE
Hfx.mediterranei VSVMGGVPRPPKTNNYGLGLPFADGYFLSAWAHAFGGYYFDDSADERIGVALPETIKGVQ
Hgm.borinquense KSVMEEYHDP-ESGMYGLSCPF-DGYFVSAWAQAFGGYYFDHEKETQLGINIDATVKGFQ
Hrr.lacusprofundi VSIMDDHHDP-ANGQYGLSYPVTDPYFVSGFIQAYGGDIFD-EENLKVTVDSDACKQGID
Nab.magadii VDIMDDHHDP-SNGQYGLSYPPVDPYFVSGYLHAFGGRIFH-EDTGELGIEDDEFIEGLE
P.abyssi KEVMEKYYDP-NNEKYGIAWPI-NAYFISAIAQAFGGYYFD-DKTEQPGLDKPETIEGFK
P.kodakaraensis KAIMEKYYDP-DNEKYGIAWPI-NAYFISGIAQAFGGYYFD-DATEQPGLDKPETIEGFK
T.barophilus KAIMEKYYKP-DEEKYGIAYPI-NAYFISAWAHAFGGYYFD-DKTKQPGLDKPETIKGFE
T.pendens KSIMAKFTNP-DKGTYGLATPI-DPYFLSGWVHAFGGYYFD-DKTKQPGLDKPETIKGFK
T.gammatolerans KTIMEQHYDP-DNGKYGIASPI-DPYFLSAWAQAFGGYYFD-DKTETPGVNLTETVEGFR
* . **:. * : ** *. :*:** *. . : .*.
310 320 330 340 350 360
| | | | | | Har.marismortui FALDTLRPYMPDDPNYEPQAATFSEGNAAFAVNGPWYLATLNQSDVNYEVATFPDINGGE
Hmc.mukohataei FMLDNLVPYMPNDPGFEPQQATFAEGNAAFAVNGPWYLATLNDSDINYEVTTFPSMDGGE
Hfx.mediterranei FTVDNFVPYMPNDPAYEPQAAAFAEGNAAFAINGPWYLSTLNEKGIDYGVAKLPSPEGGE
Hgm.borinquense FALDNLVPYMPNDPTYGPQAAAFAEGNAPLAINGPWYLSTLNEKGIDYGVSKLPAPEGGK
Hrr.lacusprofundi ALET-LSDYVPSDPGYESQIVAFADGLAPFAINGPWELGNLQDEIDNLGVTTLPTVDGNN
Nab.magadii LLQDNLWEYVPEDPEYGSQMAPFNDGNAPFAINGPWQVGGFRDAGVDATLAPLPDVDGGS
P.abyssi FFFENIWPYMAPTADYNTQQSIFLEGRAPIMVNGPWSIGSVKDAGIDFGVAPLPPIIKDG
P.kodakaraensis FFFTQIWPYMAPTADYNTQQSIFLEGRAPMMVNGPWSINDVKKAGIDFGVVPLPPITKDG
T.barophilus FFFKNIFPYMAPTGDYNTQQAIFLEGRAPMMVNGPWSIGSVKDAGIDFGVAPLPPIIENG
T.pendens FFFEQVYPYVAKTRDYNAQVSLFLEGKAPMMINGPWSIGDVKKAGINFGVAPLPPIDSSS
T.gammatolerans FFFDNIWPYMAHTTDYNAQVDLFTSGNAPMMINGPWIISKVKEAGINFGVVPLPPINKDG
. *:. : .* * .* *.: :**** : ... : : :* .
Resultados y discusión
161
370 380 390 400 410 420
| | | | | |
Har.marismortui ----VTPYTGISMWYFADGMSEGGADATAARN-FVEWFATNEDHATRLAEEQGSIPVLDS
Hmc.mukohataei ----FTPLSGIKMWYFSKAMEEGDVDATAGRE-FIEWFVTNEDHLLTRAEEQGHIPVLSS
Hfx.mediterranei ----PKPFTGITMWYFAKAMEEGGADAAASRS-FIEWFATSEDLALKAAQEQGSIPVLKS
Hgm.borinquense ----PTPYTGITMWYFSKAMEADNASTQAALD-FIEWYTTNEDILLRNAKEQGAVPVLER
Hrr.lacusprofundi ----PRTYSGIQLFYFSSMLADADQSTVDATTGLAEWYTTNEDIVLSNADEQGYIPVLTN
Nab.magadii ----PTPYTGIQVWYFTAALEDADETTFETIMDFAEWYTTNEDVIVDNAERHGLIPVHQE
P.abyssi KEYWPRPYGGVKLIYFAAGTHNK-----DAAWKFVKWFTTNPEVIKQLALDLGYIPVLSE
P.kodakaraensis KEYWPRPYGGVKDIYFAAGLKNK-----DAAWKFVKWFTTTPEVIKELSLQLGYIPVLKP
T.barophilus KEYYPRPYGGVKLIYFAKGIKNK-----DAAWFFVKWFTTNPEVAKTLAKELGYIPVLKE
T.pendens ---VPHPYGGVKLVYVAKGVKDK-----AAVWTFLEWLTTNPNVIKQFAIRNGYIPVLKE
T.gammatolerans KTYYPRPYAGVKLIYVTSNAPDEK---MQAIWEFLKWFSTSEDVAVTLAFQNGYVPVLNS
. *: *.: : :* *. : : * :**
430 440 450 460 470 480
| | | | | | Har.marismortui LVGSDELP--DHVQTYSQTVSQGVPMPTDPRMNKVWSPLENALIEAFNGDS--SAEDALT
Hmc.mukohataei LAGSDDLP--GPVRAYSEAVDQGIPMPTDPRMSDVFAALEEPVVQIFNGSQ--SPAQALA
Hfx.mediterranei LVESGDLP--EHVQGFSEAVQQGQPMPTHPDMGKVWDPVKAALTKAFNG-K--DVEKAMK
Hgm.borinquense IATSDELP--DAVQGFSQAVQQGVPMPAHPKMNAVWTPVKDALTKAFNGDA--DVATAMD
Hrr.lacusprofundi VVDNDDLS--SEVQAFAQQVDHGVPIPTHPDMDSVWTPVTDALERVFNDEQ--DSDAALD
Nab.magadii YAESDDLG--EDVETFIETVEMGTPMPADPRMDLVFTPLEEALERVFNESE--EPAEAME
P.abyssi VLNDPEIKNDPVIYGFGQAVQHAYLMPKSPKMGAVWGGVQGAIDEILKDPKHADIEAILK
P.kodakaraensis VLEDPDIKADPVIYGFGQAVQHAYLMPKSPKMGAVWGGVDGAITEILQDPAHADFEAILK
T.barophilus VLNDPEIQSDPVLYGFGKAVEYAIPMPKSPEMGSVWGPVDTAITEILKDPQNADIAAILK
T.pendens VLNDPEIQNNPVIYGFGQAVQNAIPMPKSPEMAAVWGPVDTAITNIMGGKQ--SIEAALT
T.gammatolerans VANEPDITSDPVISAYLQALQHAYLMPKSTKMAAVWGPVGQAITDYIGGKK--TLEQALN
. :: : : : :. . :* . * *: : .: : :
490
|
Har.marismortui TAAEEIRSNWE--
Hmc.mukohataei GAADEARSNWE--
Hfx.mediterranei TADEEIRSNLE--
Hgm.borinquense EAAKTVRSNWE--
Hrr.lacusprofundi QAASEIREAL---
Nab.magadii AAAEEIRGRWD--
P.abyssi KYQEEILKNMQG-
P.kodakaraensis KYQEKILQDMGSS
T.barophilus AQNEEILKAISGG
T.pendens AAQQEVLSALKK-
T.gammatolerans DAQKEILKALSS-
.
Figura 60: Alineamiento de la secuencia de la proteína de unión a maltosa de Hfx.
mediterranei con sus homólogas de varios microorganismos pertenecientes al Dominio
Archaea: Har. marismortui (Q5UZY4), P. kodakaraensis (Q5JJ58), Hgm. borinquense
(C1V642), Hmc. mukohataei (C7NWX8), Nab. magadii (C0G250), T. barophilus (B5IRL8),
T. gammatolerans (C5A4E0), P. abyssi (Q9V297), T. pendens (A1S070), y Hrr.
lacusprofundi (B9LTV0). Se ha marcado con un asterisco (*) los aminoácidos idénticos entre
sí, con dos puntos (:) los conservados y con un punto (.) los semiconservados. En rojo se
señalan los aminoácidos hidrofóbicos, en azul los ácidos, en verde los no polares y en
magenta los básicos.
Los valores medios de identidad entre estas proteínas comparadas se
encuentran alrededor del 11 % y los de similaridad del 29 %. A pesar de no ser
valores demasiado altos, estos porcentajes varían sustancialmente cuando se
compara la proteína de Hfx. mediterranei con cada una de ellas por separado
Resultados y discusión
162
(Tabla 15), por lo que podemos concluir que la secuencia obtenida de Hfx.
mediterranei corresponde con una proteína de unión a maltosa y que pertenece a
un transportador de maltosa tipo ABC. Como se puede apreciar en la siguiente
tabla, la proteína presenta el mayor porcentaje de identidad con las
correspondientes a los miembros de la Familia Halobacteriaceae y dentro de ellos
con Hgm. borinquense, Har. marismortui y Hmc. mukohataei.
Tabla 15: Porcentajes de identidad y similaridad entre la proteína de unión a
maltosa de Hfx. mediterranei y de otros organismos del Dominio Archaea.
ORGANISMO IDENTIDAD (%) SIMILARIDAD (%)
Hgm. borinquense 60 73
Har. marismortui 58 70
Hmc. mukohataei 53 68
Hrr. lacusprofundi 41 58
Nab. magadii 38 54
T. pendens 37 54
T. barophilus 36 54
T. gammatolerans 34 53
P. abyssi 34 50
P. kodakaraensis 33 51
Otra forma de observar homologías entre las secuencias de malE de
diferentes organismos consiste en la realización de árboles filogenéticos en los que
se observan las distancias evolutivas. Para ello, en primer lugar se seleccionaron las
secuencias que se querían comparar entre sí en las bases de datos. Se escogieron
secuencias que pertenecieran a diferentes grupos taxonómicos para poder
relacionar evolutivamente la proteína perteneciente a Hfx. mediterranei.
El filograma (Figura 61) se obtuvo a partir de un alineamiento múltiple de las
secuencias con el programa ClustalX, la depuración de este alineamiento con el
programa Gblocks (Castresana) y la aplicación del método de máxima similitud
(maximum likelihood) del programa Phylip.
En el árbol filogenético obtenido se observan diferentes agrupaciones de
malE en función del grupo taxonómico al que pertenecen. Se identifican dos
grandes grupos formados por las proteínas pertenecientes al Dominio Bacteria y
por las del Dominio Archaea, y dentro de este último se observa una clara
Resultados y discusión
163
separación entre los organismos termófilos y halófilos. La proteína malE de Hfx.
mediterranei se encuentra localizada en el grupo de las arqueas halófilas junto con
miembros de su misma familia.
Figura 61: Filograma realizado a través del programa PHYLIP con la opción maximum-
likelihood con las siguientes proteínas: Q2AFR0 (H. orenii), A7D3Y7 (Hrr. lacusprofundi),
Q5UZY4 (Har. marismortui), A1S070 (T. pendens), B5IRL8 (T. barophilus), C5A4E0 (T.
gammatolerans), C0G250 (Nab. magadii), C7NWX8 (Hmc. mukohataei), C1V642 (Hgm.
borinquense), Q9V297 (P. abyssi), Q5JJ58 (P. kodakaraensis), Q9X0T1 (T. maritima),
A8F5P2 (T. lettingae), A5IMY6 (T. petrophila), A4IKY9 (G. thermodenitrificans) y B0K7T3 (T.
pseudethanolicus).
Resultados y discusión
164
Para finalizar con el análisis de este gen, en la siguiente figura se muestra un
modelo teórico de la estructura tridimensional de la proteína malE de Hfx.
mediterranei, el cual se realizó con el programa SWISS-MODEL por homología con
las estructuras previamente resueltas en las bases de datos de P. furiosus (entrada
PDB 1elj) y E. coli (entradas PDB 1n3w, 1n3x, 1peb y 1nl5).
Figura 62: Representación esquemática de la proteína malE de Hfx. mediterranei en el que
se indica el posible sitio de unión a maltosa. En rojo se muestran las hélices y en verde las
hojas .
Como se puede apreciar en la siguiente figura (Figura 63), la topología de la
proteína halofílica es muy similar a la obtenida por cristalografía en P. furiosus
(entrada PDB 1elj) (Evdokimov y col., 2001). A pesar de que las dos proteínas no
muestran una elevada identidad (Tabla 15), se ha comparado con su estructura
puesto que es la única Archaea de la que se dispone la estructura tridimensional.
Resultados y discusión
165
Figura 63: Superposición de la estructura de la proteína de unión a maltosa de Hfx.
mediterranei (lila) y la de P. furiosus (verde).
MalF
El siguiente gen identificado en la secuencia de DNA, malF, codifica una
permeasa perteneciente al transportador de maltosa tipo ABC. Los parámetros
bioquímicos teóricos obtenidos de la secuencia de aminoácidos son: 339
aminoácidos, 37,40 kDa y un pI 5,69. En Har. marismortui el pI es 5,74, muy
similar al obtenido en Hfx. mediterranei, mientras que en especies no halófilas como
P. abyssi o E. coli es 9,46 y 8,48 respectivamente. En este caso muestra un menor
número de aminoácidos cargados negativamente (Tabla 16), el porcentaje de
aminoácidos ácidos y básicos es similar, alrededor de 7 %. Este hecho se debe a
que al tratarse de una proteína de membrana los aminoácidos predominantes son
los hidrofóbicos ya que son los que formarán las hélices transmembrana, dejando
sólo pequeñas regiones de la proteína en contacto con el citoplasma o el medio
Resultados y discusión
166
extracelular. No obstante cabe destacar que las proteínas halófilas, igual que en el
caso anterior, presentan un menor número de Lys que sus homólogas no halofílicas,
y que estas últimas poseen un mayor porcentaje de residuos básicos.
Tabla 16: Composición de aminoácidos correspondiente a la permeasa malF de Hfx.
mediterranei, Har. marismortui, P. abyssi y E. coli.
Hfx. mediterranei Har. marismortui P. abyssi E. coli
RESIDUO Nº % Nº % Nº % Nº %
Ala (A) 38 11,2 39 12,2 30 9,9 44 8,6
Arg (R) 17 5,0 13 4,1 8 2,6 16 3,1
Asn (N) 11 3,2 10 3,1 13 4,3 24 4,7
Asp (D) 10 2,9 10 3,1 7 2,3 21 4,1
Cys (C) 0 0 0 0 0 0 3 0,6
Gln (Q) 6 1,8 9 2,8 6 2,0 22 4,3
Glu (E) 15 4,4 11 3,4 10 3,3 15 2,9
Gly (G) 25 7,4 25 7,8 16 5,3 46 8,9
His (H) 3 0,9 2 0,6 2 0,7 1 0,2
Ile (I) 26 7,7 20 6,2 31 10,3 31 6,0
Leu (L) 37 10,9 40 12,5 35 11,6 68 13,2
Lys (K) 5 1,5 6 1,9 17 5,6 23 4,5
Met (M) 8 2,4 6 1,9 10 3,3 16 3,1
Phe (F) 36 10,6 29 9,1 25 8,3 34 6,6
Pro (P) 13 3,8 13 4,1 16 5,3 21 4,1
Ser (S) 24 7,1 23 7,2 13 4,3 24 4,7
Thr (T) 19 5,6 17 5,3 19 6,3 39 7,6
Trp (W) 7 2,1 7 2,2 10 3,3 12 2,3
Tyr (Y) 8 2,4 7 2,2 14 4,6 23 4,5
Val (V) 31 9,1 33 10,3 20 6,6 31 6,0
(Asp+Glu) 25 21 17 36
(Arg+Lys) 22 19 25 39
Con los resultados obtenidos con la base de datos PFAM, podemos clasificar
esta proteína dentro de la superfamilia de transportadores tipo ABC. En este caso,
se trata de una proteína de membrana encargada del transporte de solutos unidos
Resultados y discusión
167
desde el exterior, en concreto, se encargaría del transporte de la maltosa unida por
la proteína anterior (malE) a través de la membrana.
En la siguiente figura se muestran los diferentes elementos de la estructura
secundaria predichos con el programa PSIPRED. Esta proteína al tratarse de una
proteína de membrana, está formada casi exclusivamente por hélices , presenta
únicamente 2 hebras frente a 15 hélices . Esta proporción es muy similar a la
obtenida para Har. marismortui con 2 hebras y 12 hélices , y P. abyssi con 2
hebras y 11 hélices .
Resultados y discusión
168
Figura 64: Predicción de la estructura secundaria de la permeasa (malF) del transportador
de maltosa tipo ABC de Hfx. mediterranei. En amarillo se muestra la conformación en hebra
, y en verde la conformación en hélice .
Para que la proteína se encuentre en la membrana, las hélices deben de
tener una longitud similar al espesor la membrana plasmática y presentar un índice
de hidropaticidad que les permita ser estables en la bicapa lipídica. Es decir, poseer
un elevado número de aminoácidos hidrofóbicos conformando las hélices. Para
predecir si se cumplen estos requisitos, y cuál sería el número de hélices
transmembrana de la permeasa, se utilizó la aplicación TMHMM. En este caso, en
la proteína malF de Hfx. mediterranei de las 15 hélices predichas, 8 podrían ser
hélices transmembrana (Tabla 17). En Har. marismortui esta permeasa estaría
formada por 7 hélices transmembrana y por 6 en P. abyssi.
Resultados y discusión
169
EXTRACELULAR
CITOPLASMA
Tabla 17: Regiones transmembrana identificadas en la permeasa (malF) del transportador
de maltosa tipo ABC de Hfx. mediterranei.
Número N terminal Región transmembrana C terminal Longitud (pb)
1 24 LFVLPGLFVFSAFMLFPVVYLI 46 22
2 56 ANLFAGEGAFSVLTFGEATFIG 78 22
3 85 VLFGGTFSIVLFGHTIATL 104 19
4 114 VTWLFVATSVTLKIAFSLALAL 136 22
5 149 RSLIILPMGLPSIFTITVWRGI 171 22
6 199 LAFAAYNVTEMWLAYPFMVIIT 221 22
7 257 PVFFASILTAAASFQQFLIPFV 279 22
8 305 YGRGAAISIIALLFIGAFMWLN 327 22
En la siguiente figura se muestra un predicción de la disposición de la
proteína en la membrana, indicando cómo se encontrarían distribuidas cada una de
las regiones transmembrana.
Figura 65: Representación esquematizada de las hélices transmembrana identificadas en la
permeasa (malF) de Hfx. mediterranei en el que se indica el posible sitio de unión a NBD
(malK).
Resultados y discusión
170
Los TMD se han englobado en siete subfamilias dependiendo del sustrato
que translocan a través de la membrana: araH (arabinosa), cysTW
(sulfato/tiosulfato), fecCD (hierro), hisMQ (histidina), livHM (cadenas laterales de
aminoácidos), malFG (maltosa) y oppBC (oligopéptidos). En el caso de Hfx.
mediterranei, el dominio transmembrana (malF y malG) del transportador de
maltosa tipo ABC, formaría parte de la familia malFG.
En los transportadores de tipo ABC el dominio transmembrana (TMD) está
poco conservado, la secuencia de estas proteínas es bastante divergente y poseen
un número variable de hélices transmembrana. Sin embargo, como se ha visto en la
introducción (Apartado 1.7.1), los sistemas importadores ABC poseen en los TMD
un motivo conservado implicado en la interacción con los NBD (Mourez y col.,
1997; 1998). Este motivo está relacionado con la señalización de la presencia del
soluto en la cara externa y el acoplamiento de la hidrólisis del ATP para su
translocación (Figura 65 y 66).
Se realizó un alineamiento múltiple entre la secuencia proteica de malF de
Hfx. mediterranei con proteínas homólogas de los organismos Hmc. mukohataei,
Hgm. borinquense, Nab. magadii, Hrr. lacusprofundi, P. abyssi (Cohen y col.,
2003), P. kodakaraensis (Fukui y col., 2005), T. barophilus, P. furiosus y Har.
marismortui (Baliga y col., 2004) (Figura 66).
10 20 30 40 50 60
| | | | | |
Nab.magadii MSTSFLDRVSSEGQRL---LPFETRNLNLFGLLLVAPGVVLFLSFMLFPIAFLVYLSMTD
Hrr.lacusprofundi MASSQIGTDVSGLSRLRAALPFSSRD---WGLLLVAPGVLLFSSFMLYPIFYLFYISLTD
Hfx.mediterranei -----MSTASRVARRVED-VPFLDKRD--VSLLFVLPGLFVFSAFMLFPVVYLIGISFTD
Har.marismortui -----MSTVSRAADRIES-VPFLTRDD--ASLLLVLPGLFVFSAFMLFPVLYLLGISFTN
Hmc.mukohataei -----MRTVSRLTQRVER-IPFIEQED--YSLLFVLPGLFVFAAFMLFPVLYLVGLSFTD
Hgm.borinquense -----MSTASRVATRIAD-VPFLDKED--TSLLLVLPGLFVFSAFMLFPVLYLVGISFTN
P.abyssi MGEDEMKKTTI-------------AA-----LVLILPGITAFLFFNLWPIIYSIYLAFTN
T.barophilus -----MKKTTV-------------VA-----LFLILPGIIAFLTFNLWPIVYSIYIAFTN
P.furiosus -----MKKTTV-------------AA-----LMLIIPGIAAFLFFNLWPIVYSIYLAFTN
P.kodakaraensis -----MKKTTA-------------AA-----LMLILPGMAAFLFFNLWPIVYSIYLAFTN
: *.:: **: * * *:*: : . :::*:
Resultados y discusión
171
70 80 90 100 110 120
| | | | | |
Nab.magadii ATHAGTIIG---------GDTNFVGFDNYVDLFT------------------DSQFWTSF
Hrr.lacusprofundi ATFAGSVIG---------GGAELIGLANYVQLIG------------------DSQFWTSM
Hfx.mediterranei AAPANLFAGEGAFSVLTFGEATFIGIENYADVLFGGTFSIVLFGHTIATLPINGQFWNSF
Har.marismortui AQPANLFAGEGVVAVLTFGDALFVGLENYADVLT------------------DGQFWNSF
Hmc.mukohataei AAPANLFAGEGSFAVLTFGEATFVGLKNYTDVLA------------------DPEFWNSF
Hgm.borinquense ARPANLFAGETALDVLTFGQAEFVGLQNYVSALT------------------DPAFWNSF
P.abyssi AQLGNFPVEKA-------GTLKFVGLENFKWILS------------------DEKFRSAF
T.barophilus AQLGNFPIEST-------KQLQFVGLENFKWALS------------------DEKFRRAF
P.furiosus AKLGNFPIQSP--TA---EPLRFVGLENFKWLLK------------------QEKFLNAF
P.kodakaraensis AQLGNFPIYNPQSAV---EPMHFVGLENFKWALS------------------DDKFINAF
* .. ::*: *: : : * ::
130 140 150 160 170 180
| | | | | |
Nab.magadii GITWLFLAVSLVIKIIVGLGLAMLLTHARVVGKRYMRAIVIIPMGLPAIFIITVWRGMFS
Hrr.lacusprofundi TTTWLFVAVSLVLKVFLAVGIALLLNHVRVAGKRYMRAAVIVPLGFPGIFTITVWRGMFS
Hfx.mediterranei GVTWLFVATSVTLKIAFSLALALVVTNERVRGKRIMRSLIILPMGLPSIFTITVWRGIFS
Har.marismortui GVTWLFVATSVTLKIGASLAIALVVTSELVRGKRVLRSLIIFPMGLPPIFTITVWRGIFS
Hmc.mukohataei GVTWLYVATSVALKLGLSISVAMVVTSDRVRGRRIMRSLIILPMGLPAIFTITVWRSMFS
Hgm.borinquense GVTWLFVGTSVTAKIAFSVGIALVVTSDRVRGKRFLRSLIIIPMGLPAIFVVTVWRGIFS
P.abyssi KWTWIFVATSVTLKVLVGIGLSLLYNSKYVRGKMIYRALLIIPWALPLLFSITVWKFMFD
T.barophilus LWTWFFVLTSVTLKVSSGIFLSILYNNKYVRGRLFYRSLLIIPWALPLLFSITVWRFMFD
P.furiosus KWTWIFVATSVTLKVLAGLFLSLLYNSKYVRGKTIYRSLLIIPWALPLLFSVTVWKFMFD
P.kodakaraensis KWTWIFVFTSVTLKALAGLFLSLLYNSKYVKGKAIYRSLLIIPWALPLLFSVTVWKFMFD
**::: .*:. * .: :::: . * *: *: :*.* .:* :* :***: :*.
190 200 210 220 230 240
| | | | | |
Nab.magadii GARFGPFNELLATYNSAVSTLAGMVDQALFFVAVSVPEFLLVDLPVSWLSGRWSAFMAYV
Hrr.lacusprofundi DARYGVFNTILGRYNEFMSSLS-----------A--PELLLFDVPIGFLSGRWEAFFAYV
Hfx.mediterranei SAEFGLANQILTIF-----GLE----------------------TVSWLSERWLAFAAYN
Har.marismortui SAEFGLMNQLLTAF-----GAS----------------------SVAWLSGRWTAFVAYN
Hmc.mukohataei SADFGLINQLFEQF-----GAE----------------------PVAWLSTRWPAFFAYN
Hgm.borinquense TAEFGLANQILREI-----GFE----------------------SVAWLSQRWTAFLAYN
P.abyssi -PVFGPINQLLKSIG--ISNPP------------------------NWINDPFWAFLALN
T.barophilus -PVFGPINIVLKSLG--ISNPP------------------------NWINDPWWGFIALN
P.furiosus -PVFGPINLTLKSIG--VEGP-------------------------NWINDPFWGFIALN
P.kodakaraensis -PVFGPINLVLKSIG--ITGP-------------------------DWVNNPTWGFVALN
. :* * : ::. .* *
250 260 270 280 290 300
| | | | | |
Nab.magadii TTEVWLAYPFMVIIIVSALQDVPMELHDAAKVDGAGYFHRFIHVTLPAVKRPVMFASILT
Hrr.lacusprofundi TTEVWLAYPFMVIIIVSALQDVPRSLHEAAMVDGAGALQRFRTVTLPAIKGPVLFASILT
Hfx.mediterranei VTEMWLAYPFMVIITVSALQDVPDELHEAAMVDGASYFSRFFHVTLPSIKRPVFFASILT
Har.marismortui VTEAWLAYPFMVIITVSALQDVPEELHEAAVVDGAGFLARFAHITLPSIKRPVLFASILT
Hmc.mukohataei VTEMWLAYPFMVIITVSALQDVPEELHEAATVDGAGFLARFIHVTLPSIKRPVLFAAILT
Hgm.borinquense VTEVWLAYPFMVLITVSALQDVPEELHEAAMVDGAGYVSRFLHVTLPAIKRPVMFASILT
P.abyssi IIEVWLAYPFMMTVITAALQSVPDTLIEAAIIDGANYWQRFRHVILPTVSKPIAFATILT
T.barophilus IIEVWLAYPFMMTVITAALQSVPDTLIEAAIIDGATYWQRLRHVVIPIVSKPIAFATILT
P.furiosus IIEVWLAYPFMMTVITAALQSVPDVLIEAAIIDGANYWQRLRHVVLPVVGKPIAFATILT
P.kodakaraensis IIEVWLAYPFMMTVITAALQSVPDTLIEAAIIDGANYWQRIWNVVVPIVGKPIAFATILT
* *******: : .:***.** * :** :*** *: : :* : *: **:***
Resultados y discusión
172
310 320 330 340 350 360
| | | | | |
Nab.magadii AATSFQQFLIPWIFNAGGPSRQNELLIVYGYREAIELN-QYAYASAIMVTAIAFIGLFMW
Hrr.lacusprofundi AATSFQQFLIPWVFNQGGPSRQNELIIVYGYREAITFN-QFGLSAAILIVGIVFVGLFMY
Hfx.mediterranei AAASFQQFLIPFVFNEGGPARQNELIVVYGYREALSFA-EYGRGAAISIIALLFIGAFMW
Har.marismortui SAASFQQFLIPFVFNQGGPARANELIVVYGYREALSFQ-QYGRGAAISIIALVFIGAFMW
Hmc.mukohataei AAASFQQFLIPFVFNQGGPARANELIVVYGYREALSFS-QYGRGAAISLIAVVFIGVFMW
Hgm.borinquense AAASFQAFLIPYVFNQGGPARANELIVVYGYREAFTFS-QYGEGAAISLLAVAFIGAFMW
P.abyssi SAASFQYFMVPYLYNAG--LFEDKFILLYGFRKAFGATPHYGRATAVMVIATMVLAIYMY
T.barophilus SAASFQYFMVPYLYNAG--LFEDKFLLLYGFRKAFGASPHYGRAAAIMVIATLVLAVYMY
P.furiosus SAASFQYFMVPYIYNAG--LFEDRFILLYGFRQAFGATPYYGRATAVMIIATIILAIYMY
P.kodakaraensis SAASFQYFMVPYIYNAG--LFEDRFLLLYGFRKAFGASPHYGRAAAIMVIATLILAVYMY
:*:*** *::*:::* * :.::::**:*:*: :. .:*: : . .:. :*:
370
|
Nab.magadii LAVRKGNLAEGVDSA
Hrr.lacusprofundi AAVRYGGLAEGVGDE
Hfx.mediterranei LNVKRGRLADGVNDA
Har.marismortui LNVKKGKLADGVND-
Hmc.mukohataei INVKRGKLADGVSDE
Hgm.borinquense LNVKKGRLADGVSES
P.abyssi INVKITRLQEGAKE-
T.barophilus INVKITKLQEGAKG-
P.furiosus VNVKITRLQEGAKE-
P.kodakaraensis VNVRITRLQEGARG-
*: * :*.
Figura 66: Alineamiento de la secuencia de aminoácidos correspondiente a la permeasa
(malF) de Hfx. mediterranei con otras permeasas que forman parte de transportadores de
azúcares tipo ABC en organismos pertenecientes al Dominio Archaea: Nab. magadii
(C0G249), Hrr. lacusprofundi (B9LTU9), Har. marismortui (Q5UZY5), Hcm. mukohataei
(C7NWX7), Hgm. borinquense (C1V643), P. abyssi (Q9V296), T. barophilus (B5IRL7), P.
furiosus (Q8TZP9) y P. kodakaraensis (Q5JJ57). Se ha marcado con un asterisco (*) los
aminoácidos idénticos entre sí, con dos puntos (:) los conservados y con un punto (.) los
semiconservados. En rojo se señalan los aminoácidos hidrofóbicos, en azul los ácidos, en
verde los no polares y en magenta los básicos. También está indicado el motivo implicado
en la interacción entre TMD y NBD (Mourez y col., 1997; 1998).
Los valores medios de identidad entre estas proteínas comparadas se
encuentran alrededor del 20 % y los de similaridad del 46 %. De acuerdo con los
resultados obtenidos, podemos concluir que la secuencia obtenida de Hfx.
mediterranei corresponde a una permeasa perteneciente a un transportador de
maltosa tipo ABC. Los porcentajes de identidad y similaridad de aminoácidos entre
la proteína de Hfx. mediterranei y del resto de los organismos se muestran a
continuación (Tabla 18). Igual que en el caso anterior, la proteína presenta el mayor
porcentaje de identidad con los que pertenecen a su misma familia y en concreto,
con Har. marismortui, Hmc. mukohataei y Hgm. borinquense.
Resultados y discusión
173
Tabla 18: Porcentajes de identidad y similaridad entre la permeasa (malF)
de Hfx. mediterranei y la de otros organismos del Dominio Archaea.
ORGANISMO IDENTIDAD (%) SIMILARIDAD (%)
Har. marismortui 76 85
Hmc. mukohataei 73 84
Hgm. borinquense 73 86
Nab. magadii 50 63
Hrr. lacusprofundi 50 64
P. abyssi 39 63
T. barophilus 39 60
P. furiosus 39 61
P. kodakaraensis 38 61
En la figura 67 se muestra un filograma que revela las relaciones evolutivas
entre la proteína malF de Hfx. mediterranei y las de diversos organismos. Se
identifican dos grandes grupos formados por las proteínas pertenecientes al
Dominio Archaea y por las del Dominio Bacteria. Igual que en el caso anterior,
dentro del Dominio Archaea aparecen separados los organismos halófilos de
termófilos. La proteína malF de Hfx. mediterranei se encuentra en la rama
perteneciente a los organismos halófilos, todos ellos forman parte de la Familia
Halobacteriaceae.
Resultados y discusión
174
Figura 67: Filograma realizado a través del programa PHYLIP con la opción maximum-
likelihood con las siguientes proteínas: A7D3Y8 (Hrr. lacusprofundi), A1S069 (T. pendens),
B5IRL7 (T. barophilus), Q9V296 (P. abyssi), Q8TZP9 (P. furiosus), Q5JJ57 (P.
kodakaraensis), Q09AM1 (S. aurantiaca), B0J0I1 (R. leguminosarum), Q606S3 (M.
capsulatus), Q6HEF4 (B. thuringiensis), Q819G9 (B. cereus), C0G249 (Nab. magadii),
C7NWX7 (Hmc. mukohataei), C1V643 (Hgm. borinquense) y Q5UZY5 (Har. marismortui).
Resultados y discusión
175
Para finalizar, en la figura 68 se muestra un modelo teórico de la estructura
tridimensional de la proteína malF de Hfx. mediterranei, realizado con el programa
SWISS-MODEL por homología con la única estructura resuelta que hay hasta el
momento de esta proteína en E. coli (entrada PDB 3fh6H) (Khare y col., 2009). Y en
la figura 69 se observa cómo la topología de ambas proteínas es muy similar,
variando únicamente en la posición de algunos de sus lazos. Las diferencias en la
estructura de dos proteínas homólogas normalmente se producen en zonas alejadas
al centro activo.
Figura 68: Representación esquemática de la proteína malF de Hfx. mediterranei. En rojo se
muestran las hélices y en amarillo las hojas .
Figura 69: Superposición de la estructura de la permeasa malF de Hfx. mediterranei (lila) y
la de E. coli (verde).
Resultados y discusión
176
MalG
Continuando con el análisis de las secuencias, nos encontramos el siguiente
gen malG, que codifica la segunda permeasa perteneciente al transportador de
maltosa tipo ABC. Los parámetros bioquímicos teóricos obtenidos de la secuencia
de aminoácidos son: 364 aminoácidos, 39,3 kDa y un pI 4,71. El valor del pI es
similar al pI 5,31 obtenido en Har. marismortui, y muy inferior al obtenido en
especies no halófilas como P. kodakaraensis y E. coli que es 9,10 y 9,01
respectivamente. La composición de aminoácidos se muestra a continuación.
Tabla 19: Composición de aminoácidos correspondiente a la permeasa malG de Hfx.
mediterranei, Har. marismortui, P. kodakaraensis y E. coli.
Hfx. mediterranei Har. marismortui P. kodakaraensis E. coli
RESIDUO Nº % Nº % Nº % Nº %
Ala (A) 37 10,2 40 11,1 31 7,5 37 12,5
Arg (R) 11 3,0 13 3,6 15 3,6 9 3,0
Asn (N) 6 1,6 5 1,4 12 2,9 7 2,4
Asp (D) 9 2,5 12 3,3 14 3,4 7 2,4
Cys (C) 1 0,3 0 0 0 0 1 0,3
Gln (Q) 8 2,2 6 1,7 9 2,2 11 3,7
Glu (E) 15 4,1 13 3,6 14 3,4 7 2,4
Gly (G) 31 8,5 24 6,7 48 11,6 22 7,4
His (H) 0 0 1 0,3 2 0,5 4 1,4
Ile (I) 30 8,2 26 7,2 36 8,7 23 7,8
Leu (L) 45 12,4 44 12,3 53 12,8 46 15,5
Lys (K) 6 1,6 9 2,5 18 4,3 8 2,7
Met (M) 5 1,4 12 3,3 9 2,2 9 3,0
Phe (F) 25 6,9 24 6,7 34 8,2 19 6,4
Pro (P) 23 6,3 20 5,6 13 3,1 16 5,4
Ser (S) 24 6,6 27 7,5 24 5,8 16 5,4
Thr (T) 24 6,6 24 6,7 29 7,0 14 4,7
Trp (W) 7 1,9 8 2,2 4 1,0 8 2,7
Tyr (Y) 17 4,7 18 5,0 18 4,3 8 2,7
Val (V) 40 11 33 9,2 31 7,5 24 8,1
(Asp+Glu) 24 25 28 14
(Arg+Lys) 17 22 33 17
Resultados y discusión
177
En la tabla anterior se observa que el número de aminoácidos cargados
negativamente es ligeramente superior a los cargados positivamente en el caso de
las especies halófilas, mientras que ocurre lo contrario en las no halófilas. En todos
los casos, predominan los aminoácidos hidrofóbicos ya que son los que formarán
las hélices transmembrana.
Al igual que la proteína malF, los resultados obtenidos con la base de datos
PFAM, clasifican este permeasa dentro de la superfamilia de transportadores tipo
ABC, y en concreto, se encargaría del transporte de maltosa al interior celular junto
con la proteína anterior.
En la siguiente figura se muestran los diferentes elementos de la estructura
secundaria predichos con el programa PSIPRED. Esta proteína al tratarse de una
proteína de membrana está formada mayoritariamente por hélices , presenta
únicamente 1 hebra y 14 hélices . En Har. marismortui existe el mismo número
de hebras y hélices que en Hfx. mediterranei, mientras que en P. kodakaraensis
está formada por 13 hebras y 12 hélices .
Resultados y discusión
178
Figura 70: Predicción de la estructura secundaria de la permeasa (malG) del transportador
de maltosa tipo ABC de Hfx. mediterranei. En amarillo se muestra la conformación en hebra
, y en verde la conformación en hélice .
Resultados y discusión
179
EXTRACEL
CITOPLASMA
Al tratarse de una proteína de membrana podemos identificar las hélices
transmembrana que conformarían su estructura. Mediante la aplicación TMHMM se
determinó que de las 14 hélices predichas, 6 podrían ser hélices transmembrana
(Tabla 20). En Har. marismortui y P. kodakaraensis esta permeasa también estaría
formada por 6 hélices transmembrana.
Tabla 20: Regiones transmembrana identificadas en la permeasa (malG) del transportador
de maltosa tipo ABC de Hfx. mediterranei.
Número N terminal Región transmembrana C terminal Longitud (pb)
1 35 LGALILVCLLLFPIYWILIAAL 57 22
2 156 WNSLTVAIPTVIIAMSLIVPAA 178 22
3 191 ILFVYVLLTQVGGGLGIALLIG 213 22
4 228 ALAVYYAATAVPFNTWL 245 17
5 274 VILPLSTAGLATVFIFTFLTGW 296 22
6 326 IPWARFSAFALTFASPIMLVYL 348 22
En la figura 71 se representa la disposición teórica de la proteína en la
membrana, indicando cómo se encontrarían distribuidas cada una de las regiones
transmembrana.
Figura 71: Representación esquematizada de las hélices transmembrana identificadas en la
permeasa (malG) de Hfx. mediterranei en el que se indica el posible sitio de unión a NBD
(malK).
Resultados y discusión
180
Como se ha explicado con la proteína malF, los dominios TMD de los
sistemas importadores ABC poseen un motivo conservado implicado en la
interacción con los NBD (Mourez y col., 1997; 1998) (Figura 71 y 72).
A continuación se realizó un alineamiento múltiple entre la secuencia
proteica de malG de Hfx. mediterranei con proteínas homólogas de los organismos
P. kodakaraensis (Fukui y col., 2005), T. gammatolerans (Zivanovic y col. 2007), T.
litoralis, Hmc. mukohataei, Hgm. borinquense, Nab. magadii, Hrr. lacusprofundi, T.
barophilus y Har. marismortui (Baliga y col., 2004) (Figura 72).
10 20 30 40 50 60
| | | | | |
Nab.magadii MIAVVAILANVIGVLTTWAHEKVAWPMRAARTARLTFEQVRTGKRSVWDLAKTVASTVGA
Hrr.lacusprofundi ----MSLLGSTLALIRSKLIAFATAPKRFSVLIQRAIYDVRTGKRTPWDVAKSVLMTLFG
Hfx.mediterranei -----------------------MAPVEAVRDIRYTAVAIQRGEVSPMEPLKTAGATLGA
Hgm.borinquense ----MSLIRGVIDKIADDVTSAVYTPIEIGRDTAYTAHSIARGETSPVEPLKTLGATMGA
Hmc.mukohataei ----MSLLSTVGRKLVEDTRNVLLTPVEAARDIRYTVRGVRNGEIPPTDPLKTVGATVGA
Har.marismortui -----MLLGAIARKLSDDIKTFATMPARTVRKWSYTVQAVRRGELPASEVLKVILSTIGA
P.kodakaraensis -------MGRKRSEMLKSFVLTLLAIFIMFIILFPVYYIFTVSISPKSTLATTELELIPK
T.barophilus ---MNIRLPKRRGEVIKAFAVTLVAILIMFIILFPVYYIFTVSIKPVSTLATTELTLIPK
T.gammatolerans --MFDFHFRNRR-ELFKALLATALAIIVMGIILFPVYYVFTVSLKPQGTLASTSLDLLPD
T.litoralis -MKLKIELPKRKDELLKSFVLTLLALFVLAILLFPVYYMAMLSVKPSGTLATTEIDLIPD
. . . . :
70 80 90 100 110 120
| | | | | |
Nab.magadii IAVLVVLMFPIYWIFAASLSE-GAGLMSTDGVFADP---------------STYNLDAYR
Hrr.lacusprofundi LAMVLVLLFPLFWITSASLAE-GSRLFNTSGIFPDP---------------STYNLDAYR
Hfx.mediterranei LILVCLLLFPIYWILIAALSGTGGSIYSSSGLKLFP---------------EAPSLVPFL
Hgm.borinquense LVVVALLLFPVYWILMSALSGSGGSIYSTNGLSLLP---------------QNPSLKPFL
Hmc.mukohataei LLLVLLLLFPVYWILQAALSGTGASLYSSNGLSLLP---------------EDPTLQPFI
Har.marismortui TLVVLALLFPIYWILMAALSGSGSSLYTSESFSLFP---------------ANPTVKPFI
P.kodakaraensis QVTLDSYREVLFGFSGDRLMEDFEGRITGKGTIQNG----KLYVTDGTLIGTVKYG-PFT
T.barophilus NITAEAYKEVLFGFEGSKISANFTGKIEGNGKLDGN----ILYVTNGRIIGTVKAG-PFT
T.gammatolerans QMTLQNYKEVMFGHKDATVKTKVFNITSSRGKLIG--TEYTIEYMDGVLYGKYRGLPPRF
T.litoralis KVTFFNYRDLIFGHTEGLIKTTNFEINAKKGTIKDSLNRYEIELHEARIVGSYS---SRF
:: : . .
130 140 150 160 170 180
| | | | | | Nab.magadii WVLFESAF----------------------------------------------------
Hrr.lacusprofundi WVIFESDFF--FVD----------------GDWGYPQLVLGGG----------SGLVSFQ
Hfx.mediterranei WVIGDLIVQGYDIV----------------VDIPVTNVAFVFS----------TPQITLL
Hgm.borinquense WVIGDLIVPGYTIS----------------VNLPFTDLAVVFN----------TPELVFL
Hmc.mukohataei WVIGDLVVPAYNVT----------------VDIPLTGQSLVFS----------TPELTFL
Har.marismortui WVIGDLIVPSYSIS----------------AAIPFTDLAFVFQ----------TPGIEIL
P.kodakaraensis GLKFEIPVSRATFTVN-GGSGSGDFSGNVKGTIILTRINDDGT-----IGFGIVRNVTLT
T.barophilus ALRFEIPFKEVKFRVGQSGSKEGPFNGEISGAFRLTRINKDGS-----IGFAVVKNVKLE
T.gammatolerans NLKYISHLKVEGAN-RSVENGQVQYLGGKFVSMDAKRIMVSLASLRREYLYLTAKEVRIT
T.litoralis TLIDTEILERKGGEERQEPDGTQIIVRGESIKLNANQIESTGG---VKNLKVSAQKVIIT
: .
Resultados y discusión
181
190 200 210 220 230 240
| | | | | |
Nab.magadii ------------------------------------------------------------
Hrr.lacusprofundi WAGT--------------------------------------ETG---------------
Hfx.mediterranei DVSAIQPGTVG--------------------------RVAFGSFELFPGFAVEPIENPSA
Hgm.borinquense DVS---------------------------------------NYG---------IDRPSN
Hmc.mukohataei DAS---------------------------------------AHG---------VDRPSQ
Har.marismortui DAS---------------------------------------DYG---------VDRPSD
P.kodakaraensis EGTINGVKVSG--------------QMDGYIRAR---DTGKAEFTALG------KFVNSN
T.barophilus NGRINGITVSG--------------TMEKYIVAR---NTGAVEITAVG------KFVNSV
T.gammatolerans VNGKTGIPLDG--FTKVGNNTYVGRDVTLKIPDRVRLDSEEGHFEARDFYYVFINQIGGG
T.litoralis LSSPNEVPLDLSKFTKIDENTYEAQNVEMEIKDGGIVRAEEATFTATNFAFIRLAKVGGE
250 260 270 280 290 300
| | | | | |
Nab.magadii -PSALLNSLIVVFVTVSVSMSVVIPGAYALSRHEFRGRKKILYGYVLFTQVGAGLSIATL
Hrr.lacusprofundi -PGALFNSLYIVSVTLAAGFGMIVPAAYAFSRRQFVGRKRILYGYVLFTQIGAGLSIATL
Hfx.mediterranei FKSFFWNSLTVAIPTVIIAMSLIVPAAYALSRREFIFRRKILFVYVLLTQVGGGLGIALL
Hgm.borinquense FKQFFWNSLTVSIPTVIIAMCLIIPASYALSRRKFIFRRKILFTYVLLTQVGGGLGIALL
Hmc.mukohataei FKHFLWNSVTVAIPTVIISMCLIVPAAYALSRREFIFRRKILFLYVLMTQVGGGLGIALL
Har.marismortui FKHFLWNSLMVAIPTVLIAMSLIIPAAYALSRREFLFRRKVLFLYVLMTQVGGGLGVALL
P.kodakaraensis FFKYLKNSLILATLTVVLALIFVVPAAYAFSRLQFFGREHILYFYLMFTQVSGGLGIAGL
T.barophilus FFGHLKNSLFIAGFTVILTLFFVIPAAYAFSRLKFFGREHVLYFYLMFTQVAGGLGIAGL
T.gammatolerans FFGYLKRSLIIASLTVVLTLLFAVPAAYAFSRLKFFGREHILYFYLMFTQVSGGLGIAGL
T.litoralis VPDYMKRSLLIASLTVILTLLFVIPSAYAFSRLKFFGREHVLYFYLMFTQVAGGLGIAGL
: .*: : *: : . :*.:**:** :* *.::*: *:::**:..**.:* *
310 320 330 340 350 360
| | | | | |
Nab.magadii IALYVLFVNFGLSNNLLVLGLFYAAGAIPFNTWLLKTFMDNIPISYEEAAVIDGASRWQV
Hrr.lacusprofundi VALYSLFSSYGLTNNLFILGLFYAASAIPFNTWLLKTYMDNIPISYEEAAMVDGASFLDT
Hfx.mediterranei IGLYTVYVQLGINDSKLALAVYYAATAVPFNTWLLKTYMDGIPVSYEEAAVVDGAPPWRV
Hgm.borinquense IGLYTVYVQVGLNNSKLALAVYYAATAVPFNTWLLKTYMDGIPVSYEEAAVVDGAPPWRV
Hmc.mukohataei IGLYAIYVQFGLNDSKLALAVYYAATAVPFNTWLLKTYMDGIPVSYEEAAVVDGAPPWRV
Har.marismortui IGMYALYVQFGINDSKLALAVYYAATAVPFNTWLLKTYMDGIPVSYEEAAVVDGAPPWRV
P.kodakaraensis IALYGMLVKLGLYGKLPVLAFIYAAGSVPFNTWLLKGYIDSISPDFDEAALVDGANYFQI
T.barophilus IALYGMIVKLGLYDKLPVLSLIYAAGSVPFNTWLLKGYIDSISPDFDEAALVDGASYLQI
T.gammatolerans VALYGMLVKLDLTNNIYVLPLIYAAGGVPFNTWLLKSYLDSISPDFDEAALVDGANYLQI
T.litoralis VALYGMLVKLHLTNNIFVLPVIYAAGAVPFNTWLLKSYLDSIPPDFDEAALVDGAGYLQI
:.:* : . : .. * . *** .:******** ::*.*. .::***::***
370 380 390 400 410 420
| | | | | |
Nab.magadii IREVILPLSKPGIAVVLVFTFLAGWNEFIVAQTLLRP-ENYTLSVELYALATSGQYDTPW
Hrr.lacusprofundi IREVILPLTKPGLAVVLIFVWLAGWNEFIIAQTLLRP-ENYPLSVELYNIATEGRFSTPW
Hfx.mediterranei VVEVILPLSTAGLATVFIFTFLTGWTEFVVAQTLLGDGTNYTLPVGLYSLISE--YSIPW
Hgm.borinquense VTEVILPLSAAGLATVFIFTFLTGWTEFVVAQTLLGT-ENYTLPVGLYSLVDE--YSIPW
Hmc.mukohataei VTEVIIPLSTAGLATVLIFTFLTGWTEFVVAQTLLTT-ENYTLPVGLYALIDE--YSIPW
Har.marismortui VTEVIIPMSTAGLATVFIFVFLTGWTEFVVAQTLLGT-ENYTLPVGLYAMVDE--YSIPW
P.kodakaraensis IRHVLLPMALPGIATVAVFAFIGGWTEFILASLLLGQES-QPLAVWIYSLLGGIGRGIDW
T.barophilus IRYVLLPMALPGIATVAIFAFIGGWTEFILANLLLTEAN-QPLSVWIYLLMGGIGRGIDW
T.gammatolerans IWHVLLPMALPGIATVAIFAFIGGWTELILASLLIDNESKYPLTVWLYSMLNDL-RNVSW
T.litoralis IRHVLIPMALPGLATVAIFAFIGGWTELILANLLLNQEN-YPLTVWLYTMLANL-RSISW
: *::*:: .*:*.* :*.:: **.*:::*. *: .*.* :* : . *
Resultados y discusión
182
430 440 450
| | |
Nab.magadii TQFSAFAILFAMPVALIYFFAQSYVESGLSFGGMEG
Hrr.lacusprofundi TRFAAFANLFALPVAVVYFAAQRSVEDGLSFGGME-
Hfx.mediterranei ARFSAFALTFASPIMLVYLFAQRYIEGGLSFGGVEG
Hgm.borinquense ARFSAFALVFASPLMLVYFFAQRYIEGGLSFSGMEG
Hmc.mukohataei ARFSAFALTFATPIMLVYLFAQRYIEGGLSFSGMEG
Har.marismortui ARFSAFALTFASPIMLAYLFAQRYIEGGLSFSGMEG
P.kodakaraensis SYFAAAALLFALPVFVMFILAQNYIRSGLTVGGLKE
T.barophilus NYFAAAALLFALPVFIMFMLAQNYVRSGLTVGGLKE
T.gammatolerans NQFSAAALLFALPVFIMFLLAQNYIKSGLTVGGLKE
T.litoralis NQFAAAALVFALPVFIMFLLAQNYVRSGLTLGGLKE
*:* * ** *: : :: ** :..**:..*::
Figura 72: Alineamiento de la secuencia de aminoácidos correspondiente a la permeasa
(malG) de Hfx. mediterranei con otras permeasas que forman parte de transportadores de
azúcares tipo ABC en organismos pertenecientes al Dominio Archaea: P. kodakaraensis
(Q5JJ56), T. litoralis (Q8NKS9), Nab. magadii (C0G248), Hrr. lacusprofundi (B9LTU8),
Hcm. mukohataei (C7NWX6), Hgm. borinquense (C1V644), T. barophilus (B5IRL6), T.
gammatolerans (C5A4E2) y Har. marismortui (Q5UZY6). Se ha marcado con un asterisco
(*) los aminoácidos idénticos entre sí, con dos puntos (:) los conservados y con un punto (.)
los semiconservados. En rojo se señalan los aminoácidos hidrofóbicos, en azul los ácidos,
en verde los no polares y en magenta los básicos. También está indicado el motivo
implicado en la interacción entre TMD y NBD (Mourez y col., 1997; 1998).
Los valores medios de identidad entre estas proteínas comparadas se
encuentran alrededor del 14 % y los de similaridad del 34 %. Pese a no ser los
valores demasiado altos, estos porcentajes varían sustancialmente cuando se
compara la proteína de Hfx. mediterranei con cada una de ellas por separado
(Tabla 21), por lo que podemos concluir que la secuencia obtenida de Hfx.
mediterranei corresponde con una permeasa perteneciente a un transportador de
maltosa tipo ABC. La proteína de Hfx. mediterranei presenta el mayor porcentaje de
identidad con Hgm. borinquense, Hmc. mukohataei y Har. marismortui, mientras
que con otros miembros de su familia como Hrr. lacusprofundi y Nab. magadii
presenta únicamente un 42 % de identidad y alrededor de un 60 % de similaridad.
Resultados y discusión
183
Tabla 21: Porcentajes de identidad y similaridad entre la permeasa (malG)
de Hfx. mediterranei y la de otros organismos del Dominio Archaea.
ORGANISMO IDENTIDAD (%) SIMILARIDAD (%)
Hgm. borinquense 75 84
Hmc. mukohataei 74 82
Har. marismortui 69 79
P. kodakaraensis 47 66
T. litoralis 46 69
T. barophilus 45 65
T. gammatolerans 42 64
Hrr. lacusprofundi 42 59
Nab. magadii 42 56
En la figura 73 se muestra un filograma que muestra las relaciones evolutivas
de la proteína malG de Hfx. mediterranei. Igual que en los casos anteriores,
aparecen separadas las proteínas pertenecientes al Dominio Archaea y las del
Dominio Bacteria. Dentro del grupo de las arqueas, se separan en dos ramas
independientes los halófilos de los termófilos. Una vez más, la proteína malG de
Hfx. mediterranei se encuentra localizada en el grupo de las arqueas halófilas junto
con otros miembros de su familia.
Resultados y discusión
184
Figura 73: Filograma realizado a través del programa PHYLIP con la opción maximum-
likelihood con las siguientes proteínas: Q2ACQ2 (H. orenii), Q09AM0 (S. auriantaca),
Q1D1E4 (M. xanthus), A9WE82 (C. aurantiacus), Q8NKS9 (T. litoralis), Q9V295 (P. abysii),
Q5JJ56 (P. kodakaraensis), Q8TZQ0 (P. furiosus), A7D3Y9 (Hrr. lacusprofundi) C0G248
(Nab. magadii), C7NWX6 (Hmc. mukohataei), C1V644 (Hgm. borinquense), B5IRL6 (T.
barophilus), C5A4E2 (T. gammatolerans) y Q5UZY6 (Har. marismortui).
Resultados y discusión
185
Finalmente, en la siguiente figura se muestra un modelo teórico de la
estructura tridimensional de la proteína malG de Hfx. mediterranei, realizado con el
programa SWISS-MODEL por homología con la única estructura resuelta hasta el
momento de esta proteína en E. coli (entrada PDB 3fh6HI) (Khare y col., 2009). Y
en la figura 75 se puede observar cómo la topología de ambas proteínas es muy
similar.
Figura 74: Representación esquemática de la proteína malG de Hfx. mediterranei. En rojo
se muestran las hélices .
Figura 75: Superposición de la estructura de la permeasa malG de Hfx.
mediterranei (lila) y la de E. coli (verde).
Resultados y discusión
186
MalK
El siguiente gen analizado, malK, codifica la última proteína que forma parte
del transportador de maltosa tipo ABC, se trata de una proteína de unión a ATP. El
número de aminoácidos que contiene esta proteína de Hfx. mediterranei es de 381,
su peso molecular de 42,42 kDa y su pI 4,62. Como en la proteína de unión a
maltosa (malE) el bajo valor del punto isoeléctrico, similar al pI 4,47 obtenido para
Har. marismortui, se debe a la influencia de los aminoácidos cargados
negativamente. En especies no halófilas como P. furiosus y E. coli el pI es 6,21 y
6,23 respectivamente.
La composición de aminoácidos de esta proteína de unión a ATP de Hfx.
mediterranei y en otras especies caracterizadas se muestra en la tabla 22. Como se
puede comprobar, en cuanto a la composición de aminoácidos, existe una mayor
proporción de aminoácidos cargados negativamente que aminoácidos básicos,
alcanzando una proporción de 18 % y 10 % del total de residuos, respectivamente.
Este hecho también se aprecia en otras proteínas halofílicas caracterizadas con
anterioridad, como la de Har. marismortui, que está compuesta por un 17 % de
residuos ácidos y un 9 % de básicos. En el caso de proteínas homólogas no
halofílicas, como en E. coli o P. furiosus, estos porcentajes no difieren
considerablemente entre sí. Como se ha explicado con anterioridad, este hecho se
ha descrito como un mecanismo de adaptación a ambientes hipersalinos ya que
contribuye a la solubilidad y estabilidad en dichos medios (Madern y col., 2000).
Resultados y discusión
187
Tabla 22: Composición de aminoácidos correspondiente a la proteína de unión a ATP de
Hfx. mediterranei, Har. marismortui, P. furiosus y E. coli.
Hfx. mediterranei Har. marismortui P. furiosus E. coli
RESIDUO Nº % Nº % Nº % Nº %
Ala (A) 19 5,0 29 7,3 22 5,9 28 7,5
Arg (R) 27 7,1 26 6,6 32 8,6 24 6,5
Asn (N) 12 3,1 9 2,3 8 2,2 13 3,5
Asp (D) 37 9,7 39 9,9 23 6,2 17 4,6
Cys (C) 1 0,3 2 0,5 1 0,3 3 0,8
Gln (Q) 12 3,1 16 4,1 13 3,5 22 5,9
Glu (E) 33 8,7 27 6,8 29 7,8 26 7,0
Gly (G) 26 6,8 41 10,4 34 9,1 28 7,5
His (H) 9 2,4 6 1,5 4 1,1 10 2,7
Ile (I) 19 5,0 18 4,6 20 5,4 21 5,7
Leu (L) 30 7,9 32 8,1 36 9,7 40 10,8
Lys (K) 13 3,4 10 2,5 18 4,8 15 4,0
Met (M) 13 3,4 12 3,0 13 3,5 11 3,0
Phe (F) 15 3,9 15 3,8 20 5,4 11 3,0
Pro (P) 16 4,2 18 4,6 18 4,8 20 5,4
Ser (S) 29 7,6 25 6,3 11 3,0 17 4,6
Thr (T) 29 7,6 26 6,6 15 4,0 14 3,8
Trp (W) 0 0 0 0 1 0,3 2 0,5
Tyr (Y) 6 1,6 8 2,0 8 2,2 6 1,6
Val (V) 35 9,2 36 9,1 46 12,4 43 11,6
(Asp+Glu) 70 66 52 43
(Arg+Lys) 40 36 50 39
En la figura 76 se muestran los diferentes elementos de la estructura
secundaria predichos mediante la aplicación PSIPRED. En la proteína malK de Hfx.
mediterranei se han determinado un total de 20 hebras y 13 hélices . Estos
números son muy similares a los obtenidos para Har. marismortui con 23 hebras y
13 hélices , y P. furiosus con 21 hebras y 13 hélices .
Resultados y discusión
188
Resultados y discusión
189
Figura 76: Predicción de la estructura secundaria de la proteína de unión a ATP de Hfx.
mediterranei. En amarillo se muestra la conformación en hebra , y en verde la
conformación en hélice .
Con los resultados obtenidos con la base de datos PFAM clasificamos la
proteína dentro de la familia de proteínas que forman parte de transportadores tipo
ABC. En este caso, se trata de una proteína de unión a ATP, encargada de la unión
y la hidrólisis de la molécula de ATP necesaria para realizar el transporte de maltosa
al interior celular.
En la siguiente comparación de secuencias se observa el alineamiento para
proteínas de unión a ATP de distintos organismos todos ellos pertenecientes al
Dominio Archaea: Har. marismortui (Baliga y col., 2004) P. kodakaraensis (Fukui y
col., 2005), Hgm. borinquense, Nab. magadii, Hmc. mukohataei, Hrr.
lacusprofundi, T. gammatolerans (Zivanovic y col., 2007), P. furiosus, T. litoralis
(Greller y col., 1999) y Hfx. mediterranei.
Resultados y discusión
190
WALKER A 10 20 30 40 50 60
| | | | | |
Hgm.borinquense ---------MATVTLDNLRKEFDNGRIVAVDDVSFEVEDGEFVTVVGPSGCGKSTTLRMI
Hmc.mukohataei ---------MATLRVDSLRKEFDNGRIVAVNDLSLDVADGEFVTVVGPSGCGKSTTLRML
Hfx.mediterranei ------MDTMATITLDTLRKEFDNGRIVAVDDFSVAVEDGEFITVVGPSGCGKSTTLRMV
Har.marismortui --MGVRLCVMASLELDGLRKEFDGGSIVAVDDIDLSIDDGEFVTVVGPSGCGKSTTLRMI
Nab.magadii MAAHRTNTEMARVRVESLRKEYDVGTVVAVDDLNLEIEDGEFVTVVGPSGCGKTTTLRML
Hrr.lacusprofundi -------MEMARVTLDTLRKEFDRGTIVAVDDIDLEIEDGEFVTVVGPSGCGKTTTLRMV
T.gammatolerans ---------MAEVVLRGVWKRF--GEVVAVRDMNLHVKDGEFMILLGPSGCGKTTTLRMI
P.kodakaraensis ---------MAEVKLINVWKQF--GDFTAVKDMNLHIKDGEFMILLGPSGCGKTTTLRMI
P.furiosus ---------MAGVRLVDVWKVF--GEVTAVRELSLEVKDGEFMILLGPSGCGKTTTLRMI
T.litoralis ---------MAGVRLVDVWKVF--GEVTAVREMSLEVKDGEFMILLGPSGCGKTTTLRMI
** : : : * : * ..** :... : ****: ::*******:*****:
LID/Q LOOP
70 80 90 100 110 120
| | | | | |
Hgm.borinquense AGLESPTGGSIRIGGEDVTD------VHARKRDVAMVFQNYALYPHKTVRQNMAFGLRMS
Hmc.mukohataei AGLEQPTDGKIFIDGEDITD------VHARSRDVAMVFQNYALYPHKTVRQNMAFGLRMS
Hfx.mediterranei SGLESPTSGRILVGDEDVTD------QHARTRDVAMVFQNYALYPHKTVMENMAFGLRMS
Har.marismortui AGLERPTSGRIRIGDEDVTD------VHARKRDVAMVFQNYALYPHKSIRQNMAFGLRMS
Nab.magadii AGLEEPTSGRIEIGDEDVTD------VHAKNRDVAMVFQNYALYPHKTVFENMEFGLRMS
Hrr.lacusprofundi AGLEEPTSGAVRFDDEDVTE------VHAKERPVAMVFQNYALYPHKTVLENMAFGLKMS
T.gammatolerans AGLEEPTKGQIYIGDKLVADPEKGVFVPPRDRDIAMVFQSYALYPHMTVYDNIAFPLKLR
P.kodakaraensis AGLEEPTKGQIYIGDKLVADPEKGIFVPPKDRDIAMVFQSYALYPHMTVYDNIAFPLKLR
P.furiosus AGLEEPSRGQIYIGDRLVADPEKGIFVPPKDRDIAMVFQSYALYPHMTVYDNIAFPLKLR
T.litoralis AGLEEPSRGQIYIGDKLVADPEKGIFVPPKDRDIAMVFQSYALYPHMTVYDNIAFPLKLR
:*** *: * : .... ::: .: * :*****.****** :: :*: * *::
SIGNATURE WALKER B
130 140 150 160 170 180
| | | | | | Hgm.borinquense TDLSKAERNRRVEETAEMMDIEDLLDDKPNELSGGQKQRVALGRAIVREPDVFLFDEPLS
Hmc.mukohataei TDLSSDQREEKVRETAAMMDIEELLDDKPNALSGGQKQRVALGRAIVREPDVFLFDEPLS
Hfx.mediterranei TDLSKAERRERVRETAQMMGIEELLDDKPDELSGGQKQRVALGRAIVREPDVFLFDEPLS
Har.marismortui TDLSKAERQERVTETAEMMGIGDLLDDTPDQLSGGQKQRVALGRAIVREPDVFLFDEPLS
Nab.magadii TDLDASERERRVVETAEMMDISELLEDKPDELSGGQKQRVALGRAIVREPDLFLFDEPLS
Hrr.lacusprofundi TDMTAEQRRERVTEMAEMMGIEDLLDDKPDELSGGQKQRVALGRAIAREPEVFLFDEPLS
T.gammatolerans -KVPKQEIDRRVREVAEMLGLTELLNRKPRELSGGQKQRVALGRAIVRKPKVFLMDEPLS
P.kodakaraensis -KVPKDEIDRRVREVAEMLGLTELLNRKPRELSGGQRQRVALGRAIVRKPQVFLMDEPLS
P.furiosus -KVPRQEIDQRVREVAELLGLTELLNRKPRELSGGQRQRVALGRAIVRKPQVFLMDEPLS
T.litoralis -KVPRQEIDQRVREVAELLGLTELLNRKPRELSGGQRQRVALGRAIVRKPQVFLMDEPLS
.: : .:* * * ::.: :**: .* *****:*********.*:*.:**:*****
D-LOOP SWITCH
190 200 210 220 230 240
| | | | | | Hgm.borinquense NLDAKLRTTMRTEIQRIQNELGITSIYVTHDQEEAMTMGDRLAILKDGILQQVGKPKDVY
Hmc.mukohataei NLDAKLRTTMRTEIQRLQDELGTTSIYVTHDQEEAMTMGDRIAILDNGILQQVGSPKHVY
Hfx.mediterranei NLDAKLRTTMRTEIQRLQNDLGITSLYVTHDQEEAMTMGDRIVILKDGKLQQVGRPKDVY
Har.marismortui NLDAKLRTTMRTEIQRLQEELGITAVYVTHDQEEAMTMGDRIVILNDGKLQQAGRPKTVY
Nab.magadii NLDAKLRTTMRAEIQRLQDELGITAVYVTHDQHEAMTMGDRIVILNDGELQQQGAPTEVY
Hrr.lacusprofundi NLDAKLRTEMRAEIQKLQKEFGVTAMYVTHDQEEAMTMGDRLAILNDGKLQQVGKPTEVY
T.gammatolerans NLDAKLRVKMRAELKKLQRQLGVTTIYVTHDQVEAMTMGDRIAVINQGVLQQVGTPDEVY
P.kodakaraensis NLDAKLRVKMRAELKRLQRQLGVTTIYVTHDQVEAMTMGDRVAVINQGQLQQVGTPEEVY
P.furiosus NLDAKLRVRMRAELKKLQRQLGVTTIYVTHDQVEAMTMGDRIAVMNGGVLQQVGSPDEVY
T.litoralis NLDAKLRVRMRAELKKLQRQLGVTTIYVTHDQVEAMTMGDRIAVMNRGVLQQVGSPDEVY
*******. **:*::::* ::* *::****** ********:.::. * *** * * **
Resultados y discusión
191
250 260 270 280 290 300
| | | | | |
Hgm.borinquense ENPTNKFVGGFVGSPSMNFVDVEVTGSGGSVTLANDDG-FDYSLTGDVAQRVSESGSK-T
Hmc.mukohataei QNPVNEFVGTFVGSPAMNMLDVSVS-TGDSVCLTNGDR-FAYSLDGPVAQAVADAEVD-S
Hfx.mediterranei ENPANEFVGGFVGSPSMNFLDVSVEREGNHVVLVNDDSSFSYRLSESFSADLRETTHETE
Har.marismortui ENPTNQFVGGFVGSPSMNFLDVTAEPLSSGVRLTGAHDDFSYDLTGGRASAFGDIQRG-S
Nab.magadii ENPTNRFVGGFIGSPSMNFIDVTVDQVSDGLRLRDTDGDFSFTLSAAYATANDAALGMDR
Hrr.lacusprofundi ENPVNKFVAGFIGSPSMNFIDVDVETDGSSATIHDDASGLAFELSDEYVAGHELENAP--
T.gammatolerans DRPANTFVAGFIGSPPMNFMDATIT--EDGFADFGEFR--LKLLPEHVEVLRDKNLLGRD
P.kodakaraensis DRPANTFVAGFIGSPPMNFMDATVT--EDGFADFGEFR--LKFLPDQFEVLREKNLVGRE
P.furiosus DKPANTFVAGFIGSPPMNFLDAIVT--EDGFVDFGEFR--LKLLPDQFEVLGELGYVGRE
T.litoralis DKPANTFVAGFIGSPPMNFLDAIVT--EDGFVDFGEFR--LKLLPDQFEVLGELGYVGRE
:.*.* **. *:***.**::*. . . *
310 320 330 340 350 360
| | | | | |
Hgm.borinquense ARLGVRPEDVTVVTGGAG-------IPTTVDVVEPIGSDNYLHLDVG-----------TD
Hmc.mukohataei ARLGIRPEDVAVSREPAESD-----IRAVVEVVEPIGSDNYLYLDLG-----------ES
Hfx.mediterranei VRIGIRPEDVTPASDGSN-L-----IDSTVGVVEPIGSDNYLHLDIA-----------PD
Har.marismortui YVLGIRPEHVSVSDGGDQNA-----VPATVDVLEPIGSDNYLYLDLGESKTGFEGDGAPD
Nab.magadii YTLGIRPENVSLADGQPQNA-----ITAGVDVVEPVGSDNFLHLDVG-----------PE
Hrr.lacusprofundi YTLGIRPENIRIVENPTGDET----LTSTVEVVEPIGSDNYVHLTIN-----------ED
T.gammatolerans VIFGIRPEDIYDAMFAQVKVPGENMVRAMVEIIENLGSEKIVHLRVG----------GIT
P.kodakaraensis VIFGIRPEDIYDALFAQVKIPGENMARALVEIIENLGGEKIVHLSIG----------DVT
P.furiosus VIFGIRPEDLYDAMFARVRVPGENLVRAVVEIVENLGSERIVHLRVG----------GVT
T.litoralis VIFGIRPEDLYDAMFAQVRVPGENLVRAVVEIVENLGSERIVHLRVG----------GVT
:*:***.: : * ::* :*.:. ::* :
370 380 390 400 410
| | | | |
Hgm.borinquense FIARVDSDVEPTVGDTIEITFDQSAVHLFDATGGDALLSGAEHREVPAR-
Hmc.mukohataei FIARVAADIEPTRGDTVGVQFDESDIHLFDTYG-FSILSEKETERSPVTA
Hfx.mediterranei FIARVDSDIEPETDETISITFDESDLHVFHPKTGESLKHRESKQRATPVQ
Har.marismortui FIARVSTDVEPAIGDRVQVSFDESAVHLFDPETGEAVTAGEDAPVATPQ-
Nab.magadii FIARVPSDVDIESGDHISITFDESDIHLFDMDSGAEILGHDQESQPATAP
Hrr.lacusprofundi FLARSTPDVLPETGDEVGVVFEETNIHLFDAETGEDVFLTDEEIAAAVA-
T.gammatolerans FLGSFRSESKVREGQEVDVVFDMRKAHIFERKSGKAIF------------
P.kodakaraensis FLGKFPAESRVQEGQEVDVVFDMRKAHVFEKGSGKAVF------------
P.furiosus FVGAFRSESRVREGVEVDVVFDMKKIHIFDKTTGKAIF------------
T.litoralis FVGSFRSESRVREGVEVDVVFDMKKIHIFDKTTGKAIF------------
*:. .: . : : *: *:*. :
Figura 77: Alineamiento de la secuencia de aminoácidos correspondiente a la proteína de
unión de ATP de Hfx. mediterranei con otras homólogas que forman parte de
transportadores de azúcares tipo ABC en organismos pertenecientes al Dominio Archaea: P.
kodakaraensis (Q5JJ54), P. furiosus (Q9HH32), T. litoralis (Q9YGA6), Har. marismortui
(Q5UZY2), Hgm. borinquense (C1V641), Hcm. mukohataei (C7NWX9), Nab. magadii
(C0G251), Hrr. lacusprofundi (B9LTV1) y T. gammatolerans (C5A4E4). Se ha marcado con
un asterisco (*) los aminoácidos idénticos entre sí, con dos puntos (:) los conservados y con
un punto (.) los semiconservados. En rojo se señalan los aminoácidos hidrofóbicos, en azul
los ácidos, en verde los no polares y en magenta los básicos. También están indicados los
motivos conservados Walker A, Walker B, Linker peptide (Signature motif), Lid (Q-loop), D-
loop y Switch (Schneider y col., 1998; Bhom y col., 2002).
Resultados y discusión
192
Como se puede apreciar en la figura anterior, las secuencias de las proteínas
malK están altamente conservadas presentando los siguientes motivos típicos:
Walker A: lazo típico de unión a fosfato. Forma un lazo que une los y
fosfatos de los di- y trinucleótidos.
Q-loop/lid: es una región que forma un lazo altamente flexible en el que
está incluida una glutamina que participa en la coordinación del ion
Mg+2
y en el ataque de la molécula de agua.
Signature sequence: es un motivo específico del transporte de tipo ABC y
el único que no interacciona con el nucleótido.
Walker B: sitio de unión de magnesio. El aspartato de este motivo
coordina el ion Mg+2
en el sitio de unión del nucleótido, mientras que el
glutamato que va a continuación en la secuencia, coordina el agua que
ataca al fosfato .
D-loop: el aspartato presente en este loop participa en el ataque del
fosfato ó en el del agua junto con los residuos presentes en el Walker B.
H-loop/switch region: contiene un residuo de histidina altamente
conservado que forma un puente de hidrógeno con el fosfato del ATP.
Los valores medios de identidad entre estas proteínas comparadas se
encuentran alrededor del 32 % y los de similaridad del 58 %. De acuerdo con los
resultados obtenidos, podemos concluir que la secuencia obtenida de Hfx.
mediterranei corresponde con una proteína de unión a ATP perteneciente a un
transportador de maltosa tipo ABC. Los porcentajes de identidad y similaridad de
aminoácidos entre la proteína de Hfx. mediterranei y del resto de los organismos se
muestran a continuación (Tabla 23). MalK presenta el mayor porcentaje de
identidad con las proteínas pertenecientes a miembros de su familia, Familia
Halobacteriaceae.
Resultados y discusión
193
Tabla 23: Porcentajes de identidad y similaridad entre la ATPasa
de Hfx. mediterranei y la de otros organismos del Dominio Archaea.
ORGANISMO IDENTIDAD (%) SIMILARIDAD (%)
Hgm. borinquense 73 82
Hmc. mukohataei 67 88
Har. marismortui 67 79
Nab. magadii 66 80
Hrr. lacusprofundi 64 79
T. gammatolerans 48 65
P. furiosus 48 65
T. litoralis 47 64
P. kodakaraensis 46 65
En el árbol filogenético obtenido se observan diferentes agrupaciones de
malK en función del grupo taxonómico al que pertenecen (Figura 78). En este caso,
las arqueas halófilas aparecen en un grupo separado, mientras que las termófilas se
encuentran en el mismo grupo que las bacterias, concretamente en la misma rama
que las bacterias termófilas. La proteína malK de Hfx. mediterranei se encuentra
localizada dentro del grupo de las arqueas halófilas junto con otros miembros de la
familia Halobacteriaceae.
Resultados y discusión
194
Figura 78: Filograma realizado a través del programa PHYLIP con la opción maximum-
likelihood con las siguientes proteínas: Q2AEH7 (H. orenii), Q9HHQ5 (Hbt. salinarum),
A7D3Y6 (Hrr. lacusprofundi), Q5UZY2 (Har. marismortui), A1RZD3 (T. pendens),
Q9YGA6 (T. litoralis), Q5JJ54 (P. kodakaraensis), Q8TZQ3 (P. furiosus), C1V641 (Hgm.
borinquense), C7NWX9 (Hmc. mukohataei), C0G251 (Nab. magadii), C5A4E4 (T.
gammatolerans), B4CQN3 (T. aquaticus), Q72L52 (T. thermophilus), A6LM65 (T.
melanesiensis) y A8F6Q4 (T. lettingae).
Resultados y discusión
195
Q-loop
Walker B
Walker A
Signature
D-loop
Switch
Para finalizar con el análisis de este gen, en la figura 79 se muestra un
modelo teórico de la estructura tridimensional de la proteína malK de Hfx.
mediterranei, en el que se señalan cada uno de los motivos típicos de estas
proteínas que se han explicado con anterioridad. Este modelo se realizó con el
programa SWISS-MODEL por homología con estructuras previamente resueltas en
las bases de datos de T. litoralis (entrada PDB 1g29), P. horikoshii (entrada PDB
2d62) y E. coli (entrada PDB 2awo y 2awn).
La topología de la proteína halofílica es muy similar a la obtenida por
cristalografía en T. litoralis (entrada PDB 1g29) como se puede apreciar en la figura
80.
Figura 79: Representación esquemática del monómero de malK de Hfx. mediterranei en el
que se han identificado las regiones conservadas propias de este tipo de proteínas. En lila
se muestran las hélices y en verde las hojas .
Resultados y discusión
196
Figura 80: Superposición de la estructura del monómero de la ATPasa de Hfx. mediterranei
(lila) y la de T. litoralis (verde).
CGTasa
El último gen analizado, cgt, codifica una CGTasa en Hfx. mediterranei. Al
igual que con la proteína malE, comprobamos con el programa TATFIND, que
pertenecía a la familia de proteínas Tat (twin-arginine translocation). En Hfx.
mediterranei esta secuencia es D-R-R-T-F-L-K y como ya se ha indicado
anteriormente, el uso de esta vía sugiere una adaptación evolutiva ya que permite el
plegamiento de la proteína antes de su secreción (Rose y col., 2002).
Con el programa SIGNALP se identificó un posible péptido señal. Esta
aplicación identificó un sitio de corte entre Ala25 y Gly26. El peso molecular teórico
del precursor de la CGTasa es 78,69 kDa (713 aminoácidos) y tras el corte de los
25 primeros aminoácidos durante la secreción, el peso molecular teórico de la
proteína madura es de 76,22 kDa y 688 aminoácidos (Figura 81). Su punto
isoeléctrico calculado es de 4,18, característico de las proteínas halófilas, y como
en los casos anteriores, se debe a la influencia de los aminoácidos cargados
Resultados y discusión
197
DRRTFLK TGA GND
Corte de proteasa Proteína Tat
CGTasa madura
Precursor CGTasa
negativamente. En especies no halófilas como T. thermosulfurogenes, P. furiosus y
B. stearothermophilus el pI es 5,40, 7,16 y 4,99 respectivamente.
Figura 81: Esquema que representa la secuencia de la CGTasa de Hfx. mediterranei en el
que se muestra la señal de reconocimiento para su transporte (Tat) y el sitio de corte de una
proteasa para su maduración.
La composición de aminoácidos de la CGTasa de Hfx. mediterranei se
muestra en la tabla 24. Como era de esperar, existe una gran diferencia entre el
número total de residuos cargados positiva y negativamente, alcanzando una
proporción de 6 % y 16 % del total de residuos, respectivamente. En el caso de
proteínas homólogas no halofílicas, como en T. thermosulfurogenes o P. furiosus,
estos porcentajes no difieren considerablemente entre sí. Este aumento de residuos
con carga negativa conlleva una disminución en el contenido de Lys, en Hfx.
mediterranei sólo constituyen un 2 % de los residuos totales mientras que en las
otras especies analizadas suponen entre un 4-6 %. Como se ha explicado
anteriormente al analizar la proteína malE y malK, al tratarse de una proteína
extracelular muestra los mecanismos de adaptación típicos a ambientes hipersalinos
(Madern y col., 2000).
Resultados y discusión
198
Tabla 24: Composición de aminoácidos correspondiente a la CGTasa de Hfx. mediterranei,
T. thermosulfurogenes, P. furiosus y B. stearothermophilus.
Hfx. mediterranei T.thermosulfurogenes P. furiosus B.stearothermophilus
RESIDUO Nº % Nº % Nº % Nº %
Ala (A) 42 6,1 39 5,5 38 5,3 39 5,5
Arg (R) 25 3,6 20 2,8 35 4,8 25 3,5
Asn (N) 36 5,2 61 8,6 51 7,1 65 9,1
Asp (D) 75 10,9 43 6,1 34 4,7 50 7,0
Cys (C) 3 0,4 1 0,1 4 0,6 2 0,3
Gln (Q) 26 3,8 24 3,4 14 1,9 29 4,1
Glu (E) 34 4,9 15 2,1 44 6,1 22 3,1
Gly (G) 61 8,9 64 9,0 51 7,1 65 9,1
His (H) 16 2,3 11 1,5 11 1,5 12 1,7
Ile (I) 28 4,1 45 6,3 58 8,0 38 5,3
Leu (L) 36 5,2 44 6,2 67 9,3 40 5,6
Lys (K) 14 2,0 26 3,7 43 6,0 26 3,7
Met (M) 8 1,2 16 2,3 12 1,7 22 3,1
Phe (F) 34 4,9 35 4,9 34 4,7 36 5,1
Pro (P) 32 4,7 26 3,7 43 6,0 24 3,4
Ser (S) 51 7,4 57 8,0 34 4,7 55 7,7
Thr (T) 62 9,0 76 10,7 34 4,7 49 6,9
Trp (W) 15 2,2 13 1,8 14 1,9 15 2,1
Tyr (Y) 35 5,1 43 6,1 52 7,2 33 4,6
Val (V) 55 8,0 51 7,2 49 6,8 64 9,0
(Asp+Glu) 109 58 78 72
(Arg+Lys) 39 46 78 51
En la estructura secundaria de la CGTasa de Hfx. mediterranei se han
predicho un total de 35 hebras y 13 hélices mediante la aplicación PSIPRED. En
otras especies analizadas la estructura secundaria también estaría formada por un
número elevado de hebras , en T. thermosulfurogenes estaría constituida por 32
hebras y 18 hélices , y en B. stearothermophilus por 34 hebras y 20 hélices .
Resultados y discusión
199
Resultados y discusión
200
Resultados y discusión
201
Figura 82: Predicción de la estructura secundaria de la CGTasa de Hfx. mediterranei. En
amarillo se muestra la conformación en hebra , y en verde la conformación en hélice .
Con un sombreado de distintos colores se muestran los dominios de esta proteína que se
explicarán posteriormente: en lila se muestran los aminoácidos que constituyen el dominio
A, en amarillo el dominio B, en rojo el dominio C, en verde el dominio D y en azul el
dominio E.
Con los resultados obtenidos con la base de datos PFAM agrupamos la
proteína dentro de la familia 13 de las glicosil hidrolasas según la clasificación
propuesta por Henrissat y que se recoge en la base de datos CAZy (CArbohydrate-
Active EnZymes) (www.cazy.org/CAZY). En concreto se trata de una CGTasa
(Henrissat, 1991).
A continuación se muestra un esquema obtenido con esta base de datos en
el que se puede apreciar los dominios en los que queda dividida la proteína así
como los residuos catalíticos. Cada uno de estos dominios se explicará más
adelante junto con la estructura terciaria.
Resultados y discusión
202
CGTasa TIG CBM_20
D235 E263 D331
Figura 83: Esquema que muestra los dominios de la CGTasa de Hfx. mediterranei y los
residuos catalíticos. El dominio catalítico se representa en verde (dominio A), el dominio
barril-beta en rojo (dominio C), el dominio TIG (similar a las inmunoglobulinas) en amarillo
(dominio D) y el dominio de unión a almidón en rosa (dominio E).
En la siguiente figura se observa una comparación de secuencias de
ciclomaltodextrin glucanotransferasas de distintos organismos del Dominio Archaea
y Bacteria: Thermococcus sp. (Hashimoto y col., 2001), B. stearothermophilus
(Fujiwara y col., 1992), T. thermosulfurogenes (Wind y col., 1998), B. ohbensis (Sin
y col., 1991), A. gottschalkii (Thiemann y col., 2004), P. kodakaraensis (Fukui y
col., 2005), P. furiosus (Lee y col., 2007), T. onnurineus (Lee y col., 2008), T.
barophilus y Hfx. mediterranei.
10 20 30 40 50 60
| | | | | |
B.stearothermoph ---MRRWLSLVLSMSFVFSAIFI--------VSDTQKVTVEAAGNL-----------NKV
T.thermosulfurog ---MKKTFKLILVLMLSLTLVFG--------LTAPIQAASDTAVS------------NVV
B.ohbensis ---MKNLTVLLKTIPLALLLFIL--------LSLPTAAQADVTNK--------------V
A.gottschalkii MINKKNSIGKAICICLSILLLFG--------VLSIFQPVTNATQNSLEHIKEHTSVNNQV
Hfx.mediterranei --MSFDRRTFLKGLGLSAIGLAGGTGAGNDDLAFVSQAAAATPPE------------QTV
Thermococcus sp. ---MRSRKIYMLVVLLLFLGFSEQ-------ISTVAAGVSPSYPAG--------------
P.kodakaraensis -------MGRLVSVVLIVLLLTP-------------IASAWEVPE---------------
P.furiosus -------MRKLIISFTILVLYFS-------------QVAAYYVPE---------------
T.onnurineus -------MKRALVLVFILLLILP-------------SVEAYSVPE---------------
T.barophilus --------MRKLAVLLTLLLILP-------------TVYAYQIPE---------------
70 80 90 100 110 120
| | | | | |
B.stearothermoph NFTSDVVYQIVVDRFVDGNTSNNPSGA---LFSSGCTNLRKYCGGDWQGIINKINDGYLT
T.thermosulfurog NYSTDVIYQIVTDRFVDGNTSNNPTGD---LYDPTHTSLKKYFGGDWQGIINKINDGYLT
B.ohbensis NYTRDVIYQIVTDRFSDGDPSNNPTGA---IYSQDCSDLHKYCGGDWQGIIDKINDGYLT
A.gottschalkii NYATDVIYQIVTDRFLDGDKYNNPTCEN--LYSEDGADLRKYLGGDWRGIIQKIEDGYLP
Hfx.mediterranei NFADDVIYQLISDRFRDGNPNNNPTGE---LASDDCSNLRKYCGGDWQGIIDKIQSGYLT
Thermococcus sp. DPQTWVIYQIVIDRFYDGNTSNNDPLKSPGLYDPNKENWKLYWGGDLEGIIAKLP--YLY
P.kodakaraensis --R-GIIYQVMVDRFYDGNTSNNEPFY-----DPTHSNYRLYWGGDLEGLIEKLD--YIK
P.furiosus --R-SVIYQIMVDRFYDRNPTNNEPFY-----DPEKKNYRLYWGGDIEGIIERLD--YIE
T.onnurineus --R-GVIYQVMVDRFYDGNQSNNEPFY-----DPMHTNYRLYWGGDLEGLIEKLD--YIQ
T.barophilus --K-SVIYQIMVDRFYDGNKSNNHPFY-----DPTHSNYRLYWGGDLEGIIENLD--YIK
::**:: *** * : ** . . . : * *** .*:* .: *:
Resultados y discusión
203
130 140 150 160 170 180
| | | | | |
B.stearothermoph DMGVTAIWISQPVENVFSVMNDAS--GSASYHGYWARDFKKPNPFFGTLSDFQRLVDAAH
T.thermosulfurog GMGVTAIWISQPVENIYAVLPDSTFGGSTSYHGYWARDFKRTNPYFGSFTDFQNLINTAH
B.ohbensis DLGITAIWISQPVENVYALHPSGY----TSYHGYWARDYKRTNPFYGDFSDFDRLMDTAH
A.gottschalkii DMGISAIWISSPVENIYAVHPQFG----TSYHGYWARDFKRNNPFFGDLNDFRELIAVAN
Hfx.mediterranei DLGVSAVWISPPFENITAVDSDIG----TSYHGYWARDFTDPNEFFGDMETFKQLVDVAH
Thermococcus sp. ELGVSAIWISPVFDNIDVPINGSN-GLEAGYHGYWPKDFKVIEEHFGTWEIFRRLSQEAA
P.kodakaraensis SLGVSMIWVSPLNDNINSLAYGSAP-----YHGYWTRDYKRIEEHFGGWEDFRRLVKEAK
P.furiosus SLGVSMIWLSPLNDNINRMAGGSAP-----YHGYWPRDFKRIDEHFGTWEDFRRLVEEAK
T.onnurineus SLGVSMIWLSPLNDNINRMAGGSAP-----YHGYWTHDYKRIEEHFGDWKTFKRLVEDAE
T.barophilus SLGISMVWLSPVNDNINRMASGSAP-----YHGYWTRDYKRIEEHFGNWRVFNTLVKEAE
:*:: :*:* :*: *****.:*:. : .:* * * *
REGIÓN I 190 200 210 220 230 240
| | | | | | B.stearothermoph AKGIKVIIDFAPNHTSPASETNPSYMENGRLYDNGTLLGGYTNDAN------------MY
T.thermosulfurog AHNIKVIIDFAPNHTSPASETDPTYAENGRLYDNGTLLGGYTNDTN------------GY
B.ohbensis SNGIKVIMDFTPNHSSPALETDPSYAENGAVYNDGVLIGNYSNDPN------------NL
A.gottschalkii EHDIKVIIDFAPNHTSPAEVNNPNYAEDGNLYNNGEFVASYSNDLN------------EI
Hfx.mediterranei QNGIKVVIDFVPNHTSPSTSDGE--LEDGALYDNGSYVAAYNDDPK------------SY
Thermococcus sp. KYNITIIIDFVPNHSNPNDAGEY-----GALYDNGTFVIDYPTDANYATVHPITKSLSYI
P.kodakaraensis KRGICIIVDYVPNHSNPVNYGEY-----GALYDNGTFLTDYFKDTKNAEVNPITGIRENV
P.furiosus KRGICIIVDYVPNHSNPATDGEF-----GALYDNGTLVTNYYEDRKNATRNPYTASLENI
T.onnurineus KRGICIIVDYVPNHSNPATDGEL-----GSLYDNGTLVTNYYYDAKNATVNPYTGSKELI
T.barophilus KRGICIIVDFVPNHSNPATDGEF-----GSLYDNGTFITNYYSDSKNATLNPYTGSLENI
.* :::*:.***:.* * :*::* : * * :
REGIÓN II
250 260 270 280 290 300
| | | | | |
B.stearothermoph FHHNGG-TTFSSLEDGIYRNLFDLADLNHQNPVIDRYLKDAVKMWIDMGIDGIRMDAVKH
T.thermosulfurog FHHYGG-TDFSSYEDGIYRNLFDLADLNQQNSTIDSYLKSAIKVWLDMGIDGIRLDAVKH
B.ohbensis FHHNGG-TDFSSYEDSIYRNLYDLADYDLNNTVMDQYLKESIKLWLDKGIDGIRVDAVKH
A.gottschalkii FYHFGG-TDFSTYEDSIYRNLFDLAGLNLNNNFVDQYLRDSIKFWLDLGVDGIRVDAVKH
Hfx.mediterranei FHHNGG-TDYSSYEDQIYRNLYNLADFDHHEAYIDQYLKDAIKQWLDAGIDGIRVDAVAH
Thermococcus sp. YNHNGGITNWNDRWEVRYKNLFNLADLNQLNPWVDNYLKESTVSYLEAGIGGIRIDAVKH
P.kodakaraensis YHHNGN-IYTWSGIPLKYANLYGLADFNQLNPWVDSYLTEGAMLFVDSGACGLRIDAVKH
P.furiosus YHHNGN-INDWFGFQLKYANLFGLADFNQMNDFVDNYLKEGAALFVKNGACGFRIDAVKH
T.onnurineus YHHNGD-IGDWFGFQLKYANLFGLADFNQLNPWVDSYLKDGARLFVEAGACGFRIDAVKH
T.barophilus YHHNGN-IKVWEGFELKYGNLFGLADFNQLNPWVDEYLKDGASLFVQSGVCGFRIDAVKH
: * *. * **:.**. : : :* ** .. ::. * *:*:*** *
REGIÓN III
310 320 330 340 350 360
| | | | | |
B.stearothermoph MPFGWQKSLMDEIDNYR--PVFTFGEWFLSE-NEVDANNHYFANESGMSLLDFRFGQKLR
T.thermosulfurog MPFGWQKNFMDSILSYR--PVFTFGEWFLGT-NEIDVNNTYFANESGMSLLDFRFSQKVR
B.ohbensis MSEGWQTSLMSDIYAHE--PVFTFGEWFLGS-GEVDPQNHHFANESGMSLLDFQFGQTIR
A.gottschalkii MPLGWQKSFVDTIYNHK--PVFVFGEWYLGK-DEYDPNYYHFANNSGMSLLDFEFAQTTR
Hfx.mediterranei MPPKWQKTLVDTIYDHR--PVFTFGEWFLGA-DQSNPRYYEFSNDSGMSLLDFRFGQEIR
Thermococcus sp. LEPGWLKTYADYVYARK--NVFMFGEWYQGFNDEMYWDMVKFANYTGIGLINIPLQQVLV
P.kodakaraensis MELGWLETFYLRLYSKG--PLFIYGEYFTPSLQKGDDLYEFYRYSNVSPVLSIPIREDIV
P.furiosus IELGWLETFYLYLYQISDEPLFIYGEYFANTPDKTFDLYEFYRYSNVSSLLNIPIRESIA
T.onnurineus MDLGWLESFYLDLYSSSERPLFIYGEYYSLSPQKTDDMYYFYLYSNVSPLLGIPIRNDIV
T.barophilus MDLGWLTQFYAHLYMQE--PLFIFGEYYKLNFEKDDDMFYFYQYSNVSPQLSIPIRNDIV
: * : :* :**:: : : . :.: : :
Resultados y discusión
204
REGIÓN IV
370 380 390 400 410 420
| | | | | | B.stearothermoph QVLRNNSDNWYGFNQMIQDTASAYDEVLDQVTFIDNHDMDRFMIDGGDPR---KVDMALA
T.thermosulfurog QVFRDNTDTMYGLDSMIQSTASDYNFINDMVTFIDNHDMDRFYN-GGSTR---PVEQALA
B.ohbensis DVLMDGSSNWYDFNEMIASTEEDYDEVIDQVTFIDNHDMSRFSFEQSSNR---HTDIALA
A.gottschalkii SVFRNHEKNMFDLYDMLKNTENNYERVVDQVTFIDNHDMDRFHYDGATKR---NVEIGLA
Hfx.mediterranei QVLRDFTDDWYGFRDMLQETESEHDQVIDQVPFIDNHDMPRFTVADGDTR---NTDMALA
Thermococcus sp. DVFAYDTKTMWDLESAVNKYTIDFMWQNKLTIFVDSHDVPRFLSLRNDLI---RFHQALA
P.kodakaraensis RIFAFFG-GLDKLSEELGDYYSHFVYPTKAVNFLDSHDLVRFLNAGDRKDEIQRFHMALA
P.furiosus RTFAYGG-SFEQLAKMLEEYYSLFVYPNKQLNFLDSHDLVRFLNMNPNKD---RYHMALG
T.onnurineus RTFAYGG-SMKDLARELEDYYSLFVYPNKQVNFLDSHDLVRFLNENHRLD---RYHMALA
T.barophilus RTFAFGG-SLKTLARELEEYYSHFVYPNKAVNFLDNHDLPRYLSEGKNLD---RYHMALG
: : : . . . *:*.**: *: . .*.
430 440 450 460 470 480
| | | | | |
B.stearothermoph VLLTSRGVPNIYYGTEQYMTG---------NGDPNNRKMMSSFNKNTRAYQVIQKLSSLR
T.thermosulfurog FTLTSRGVPAIYYGTEQYMTG---------NGDPYNRAMMTSFNTSTTAYNVIKKLAPLR
B.ohbensis VLLTSRGVPTIYYGTEQYLTG---------GNDPENRKPMSDFDRTTNSYQIISTLASLR
A.gottschalkii FLLTSRGVPTIYYGTEQYLTG---------NGDPYNRKPMSSFDQNTKAYKIIQKLAPLR
Hfx.mediterranei VLLTSRGTPAVYYGTEQYLTG---------GNDPDNRKPMPSFDTTTTAYKVIQALTSLR
Thermococcus sp. FVLTAPGIPIIYYGDEQYLHNDTVNDFGQVGGDPYNRPMMKTWNTSTTAFKLIKTLASLR
P.kodakaraensis LTLTLPGIPVIYYGDESYLVS----K--DGKGDPYNRP-TMVFDNTTEASRIIRTLGGLR
P.furiosus LVMTLPGIPVIYYGDESYLVS----K--EGKGDPYNRP-MMVFDNSTKAAEIIRKLSLLR
T.onnurineus LTMTLPGIPVIYYGDESYLVS----K--DGKGDPYNRP-MMVFNNTTEAARIIRTLAELR
T.barophilus LVMTLPGIPVIYYGDESYLVS----K--EGKGDPYNRP-MMKFDNQTEAARIIRTLAELR
. :* * * :*** *.*: . .** ** :: * : .:* * **
490 500 510 520 530 540
| | | | | |
B.stearothermoph RNNPALAYGDTEQRWINGDVYVYERQFGKDVVLVAVNRSSSSNYSITGLFTALPAGTYTD
T.thermosulfurog KSNPAIAYGTTQQRWINNDVYIYERKFGNNVALVAINRNLSTSYNITGLYTALPAGTYTD
B.ohbensis QNNPALGYGNTSERWINSDVYIYERSFGDSVVLTAVN-SGDTSYTINNLNTSLPQGQYTD
A.gottschalkii KSNPALAYGTTQERWLNNDVIIYERKFGNNIVLVAINRNLSQSYSITGLNTKLPEGYYYD
Hfx.mediterranei SSNRRSPTADTEERWINSDVFVYEREFGDNVVLVAIN-RSLDWYDVSGLQTSLPEGTYDD
Thermococcus sp. RYNPALAYGLIATRYVSDDIYIFERKFFDNVVLVAINRNLNSPYVVSNVYTSLPDGSYND
P.kodakaraensis KTNDALVFGDFMTVTASYETWAFERTFGNHSLLVVMNKGPAVNLTFS---VDWPDGNYRD
P.furiosus KVNDALAYSDFRTVYVDYNTWIFERKFGSHKILVALNKGPDKNITIS---LNWTDGTYID
T.onnurineus KTNDALAFGDFRTLYADYNVWAFERAFGAHRLLVVMNKGPDKNLTLS---LDWSDGRYVD
T.barophilus KENNALAYGDFKTVYVDYNTWVFERKFGSEKVLVAVNKVNSKNLTLS---LNWSDGIYRD
* . . : :** * *..:* .. . * * *
550 560 570 580 590 600
| | | | | |
B.stearothermoph QLGGLLDGNTIQVGSNGSVNAFDLGPGEVGVWAYSATESTPIIGHVGPMMGQVGHQVTID
T.thermosulfurog VLGGLLNGNSISVASDGSVTPFTLSAGEVAVWQYVSSSNSPLIGHVGPTMTKAGQTITID
B.ohbensis ELQQLLDGNEITVNSNGAVDSFQLSANGVSVWQITEEHASPLIGHVGPMMGKHGNTVTIT
A.gottschalkii ELDGLLSGKSITVNPDGSVNQFIINPGEVSIWQFAGETITPLIGQVGPIMGQVGNKVTIS
Hfx.mediterranei ALGGTLDGFSTTVNTDGSIDTFSVGPQTVCVWEHTGTTAEPALGHVGPTMGQPGHTVVLS
Thermococcus sp. YLGGLLNGVGITVSSG--TFSVELPAGSVSVWQYKATPTDPWVGAIDPVMGRAGNIVTVS
P.kodakaraensis ALY----GGEMVVSGG--KASVYLPRDSVYVFHIEGEQKKPLIGSITPYAARPGQEIVIG
P.furiosus IIE----GAILKVKEG--QGEIKLPRYSFYVFHVEEEQKTPLIGSITPYIAQPGQKILIA
T.onnurineus ALH----GAEMVVENG--RASVTLPRNSIYIFHVEGEQKEPLIGSLTPYTAQPGQRVLVA
T.barophilus VLY----GVKMQVKAG--KAEISAPKNKVLVFSYEGKQEKPLIGSITPYIAQPGQKLILG
: * * . . . :: * :* : * : *: : :
Resultados y discusión
205
610 620 630 640 650 660
| | | | | |
B.stearothermoph GEGFGTNTGTVKFGTT----AANVVSWSNNQIVVAVPN-----VSPGKYNITVQSSSGQT
T.thermosulfurog GRGFGTTSGQVLFGST----AGTIVSWDDTEVKVKVPS-----VTPGKYNISLKTSSGAT
B.ohbensis GEGFGDNEGSVLFDSD----FSDVLSWSDTKIEVSVPD-----VTAGHYDISVVNAGDSQ
A.gottschalkii GVGFGDKKGTVNFGEI----DATIISWTNSVIQIEIPS-----VPAGNYEITVSSEGGEK
Hfx.mediterranei GDGFGSTEGSVEFGTT----SASITSWSNTEIEATVPA-----VSGGYYDVTVTDANGAQ
Thermococcus sp. GEGFGDVPGRVLITNGQDYWTAEVTYWSDKSVEFIVPSGITTQLNENHVEVRIERADGAT
P.kodakaraensis GAGFGKGGKVIIGGRE-----AKVLSWEDGKIVVEVPR-----LETSAAWVNVTVVSDGG
P.furiosus GAGLNGNIKVYIGGRR-----ARIIEKEENSILVEVPE-----IKTMNAWIPVWVVVNGT
T.onnurineus GAGFGNDGEVFIGGEK-----AKVLSWEDDQILVEVPE-----VETEDSWISVYVETSYG
T.barophilus GAGFGKSGKVFIEGVR-----AEVLEWSDDMIVFKMPK-----LDARKAWVDVYVETDGK
* *:. . : : : :* : : : .
670 680 690 700 710 720
| | | | | |
B.stearothermoph SAAYDNFEVLTNDQVSVRFVVNNAT-----TNLGQNIYIVGNVYELGNWDTS--KAIGPM
T.thermosulfurog SNTYNNINILTGNQICVRFVVNNAS-----TVYGENVYLTGNVAELGNWDTS--KAIGPM
B.ohbensis SPTYDKFEVLTGDQVSIRFAVNNAT-----TSLGTNLYMVGNVNELGNWDPD--QAIGPM
A.gottschalkii SNSYN-FEVLTNKQIPVRFVVNNAY-----TSWGQNVYLVGNVHELGNWDPN--RAIGPF
Hfx.mediterranei SDPFSGYEVLSGDQISARFVVNDAT-----TDVGENVYVVGNVHELGDWDTD--RAVGPF
Thermococcus sp. SNGIA-FEYLTNKQIPAIFEVRNTQGTNLETQVGEFLWLTGSVPELSYWSPETIKAVGPM
P.kodakaraensis RSPPRPLRYYSGNDVPALIALNASL----VGEVSGTLWLSGDLPELGEPRPLLKSSMGYY
P.furiosus RSNEVKLRYYSSNDIPALIVLQG--------NYTGYLWVKGNIPELSEPRPLLKSPTGHY
T.onnurineus KSNTVKLHYYSSGDVPSLIVVNGS-------NLTGSLWIKGSLPELAEPRPLIKSSTGYY
T.barophilus KSNRVKLRYLGGNEEAFLLVLNAS-------NLTGQLWIKGNISELAEPIPLMRSKTGYY
. . : : :. ::: *.: **. . *
730 740 750 760 770 780
| | | | | |
B.stearothermoph FNQV-----VYSYPTWYIDVSVPEGKTIEFKFIKKDSQGNVTWESGSNHV-----YTTPT
T.thermosulfurog FNQV-----VYQYPTWYYDVSVPAGTTIQFKFIKKNGN-TITWEGGSNHT-----YTVPS
B.ohbensis FNQV-----MYQYPTWYYDISVPAEENLEYKFIKKDSSGNVVWESGNNHT-----YTTPA
A.gottschalkii FNQV-----VYQYPTWYLDISVPADTTLEFKFIKIDESGNVIWQSGLNRV-----YTTPE
Hfx.mediterranei FNQV-----VHEYPNWYYDVNLPAGTDIEFKFVKIASDGTVTWESGSNRQ-----YTTPT
Thermococcus sp. L--------CPGWPDWFVVASVPADTYIEFKFLKAPLGGTGIWEVGSNHA-----YLTPS
P.kodakaraensis FTVAPLPEGVPFSVRLYEGKAWGALRPLNLTLYGVG-NRTVTLTEKPPGV-----SEGQK
P.furiosus FAVVPLPRNKTFTVQLYKGLPWEPLQPTNVTLYGIG-NKTVILNEAAP--------ETPV
T.onnurineus FTVVPLPNGTIFSVELYRGLPWDELEPLNITLYGRT-NSTVLLSTELTEIPTERLTTTSP
T.barophilus FQVVSLPVNTSFSVDLYSGLPWEKLEPLNVTLYGKSTNKTIILTRIKP-------IPKHT
: : : .: .
790 800 810 820
| | | |
B.stearothermoph NTTGKIIVDWQN---------------------------------
T.thermosulfurog SSTGTVIVNWQQ---------------------------------
B.ohbensis TGTDTVLVDWQ----------------------------------
A.gottschalkii KGTDTIYFEW-----------------------------------
Hfx.mediterranei DSTGEYSGTWK----------------------------------
Thermococcus sp. SGIGEVSVEANR---------------------------------
P.kodakaraensis AGQKDVALYALSVVMIA---------------ALIAVVWKRKG--
P.furiosus CGPGIVAVFALLPLLKRKKKKSPNTTITPYGVPIVAVSWIVRWCL
T.onnurineus EMPGKSPDWIPYVALVTIG-------------ALLLLLAFRKGRL
T.barophilus QTVTESAAQSPSTSICGTG----------LVLMLSLIVLFKKR--
Figura 84: Alineamiento de la secuencia de aminoácidos correspondiente a la CGTasa de
Hfx. mediterranei con otras homólogas: Thermococcus sp. (Q9UWN2), B.
stearothermophilus (P31797), T. thermosulfurogenes (P26827), B. ohbensis (P27036), A.
gottschalkii (Q5ZEQ7), P. kodakaraensis (Q5JHI5), P. furiosus (Q3HUR2), T. onnurineus
(B6YXX8) y T. barophilus (B5IS54). Se ha marcado con un asterisco (*) los aminoácidos
idénticos entre sí, con dos puntos (:) los conservados y con un punto (.) los
semiconservados. En rojo se señalan los aminoácidos hidrofóbicos, en azul los ácidos, en
verde los no polares y en magenta los básicos. También se han identificado las cuatro
regiones conservadas en la familia de las -amilasas.
Resultados y discusión
206
La comparación de secuencias sugiere que la enzima de Hfx. mediterranei
contiene las cuatro regiones conservadas que han sido identificadas en la familia de
las -amilasas (McGregor y col., 2001): XDXXXNH (142
IDFVPNH148
), GXRXDXXZZ
(231
GIRVDAVAH239
), XXX(G/A)EZZZ (259
FTFGEWFL266
), y XXBBHD (329
FIDNHD334
),
donde normalmente X es un residuo hidrofóbico, B un residuo hidrofílico y Z un
residuo importante para la especificidad de la enzima. Tres de las cuatro regiones
contienen los residuos del centro activo: dos aspárticos, Asp235 y Asp331, en las
regiones II y IV respectivamente, y un glutámico, Glu263, en la III. Además, las cajas
I y IV contienen dos histidinas también conservadas. El sitio de unión de almidón
(SBD) en la CGTasa de Hfx. mediterranei está constituido por 106 residuos, desde el
aminoácido 583 al 688, de los cuales 11 están estrictamente conservados:
Cuatro de estos 11 residuos, Trp618, Lys653, Trp665 y Asn670, forman
parte del primer sitio de unión de maltosa, mientras que Thr600, Gly603 y Trp638
son parte del segundo sitio de unión. Los residuos restantes, Gly610, Leu615,
Gly616 y Pro636, no se encuentran directamente involucrados en la unión, pero
probablemente son necesarios como soporte estructural de este dominio.
Los valores medios de identidad entre estas proteínas comparadas se
encuentran alrededor del 13 % y los de similaridad del 32 %. Estos valores no son
demasiado altos, aunque los resultados obtenidos concuerdan con los esperados ya
que las proteínas de la familia de las -amilasas en general presentan un grado de
homología de secuencia muy bajo. Estos porcentajes varían sustancialmente cuando
se compara la proteína de Hfx. mediterranei con cada una de ellas por separado.
Teniendo en cuenta que en su secuencia están presentes las cuatro regiones
altamente conservadas en esta familia, podemos concluir que la secuencia obtenida
de Hfx. mediterranei corresponde con una CGTasa. Los porcentajes de identidad y
similaridad de aminoácidos entre la proteína de Hfx. mediterranei y del resto de los
organismos se muestran en la siguiente tabla, en la que se puede comprobar que la
Thr600 Gly603 Gly610 Leu615 Gly616 Trp618 Pro636 Trp638 Lys653 Trp665 Asn670
Resultados y discusión
207
mayor homología se obtuvo con especies del género Bacillus y con A. gottschalkii y
T. thermosulfurogenes (Tabla 25).
Tabla 25: Porcentajes de identidad y similaridad entre la CGTasa de Hfx. mediterranei y la
de otros organismos del Dominio Archaea y Bacteria.
ORGANISMO IDENTIDAD (%) SIMILARIDAD (%)
B. stearothermophilus 56 27
B. ohbensis 54 31
A. gottschalkii 53 31
T. thermosulfurogenes 53 30
Thermococcus sp. 36 32
P. kodakaraensis 28 31
T. barophilus 27 34
T. onnurineus 27 32
P. furiosus 27 32
En la figura 85 se muestra un filograma que revela las relaciones evolutivas
de la CGTasa de Hfx. mediterranei. Se observan dos grupos, por un lado las
arqueas termófilas y por otro las bacterias. La proteína de Hfx. mediterranei aparece
englobada dentro del grupo de bacterias. No obstante, no se puede concluir nada
relevante ya que es la única CGTasa secuenciada hasta el momento en una arquea
halófila. Hasta que no se identifique esta proteína en otras arqueas halófilas, no se
podrá establecer con exactitud sus relaciones evolutivas.
Resultados y discusión
208
Figura 85: Filograma realizado a través del programa PHYLIP con la opción maximum-
likelihood con las siguientes proteínas: A1S071 (T. pendens), Q9UWN2 (Thermococcus
sp.), Q5ZEQ7 (A. gottschalkii), B1KQS8 (S. woodyi), O52766 (P. macerans), P26827 (T.
thermosulfurogenes), P31797 (B. stearothermophilus), O30565 (B. brevis), P27036 (B.
ohbensis), Q3HUR2 (P. furiosus), B5IS54 (T. barophilus), B6YXX8 (T. onnurineus) y Q8X268
(P. kodakaraensis).
Resultados y discusión
209
Finalmente en la figura 86 se muestra un modelo teórico de la estructura
tridimensional de la CGTasa de Hfx. mediterranei, el cual se realizó con el
programa SWISS-MODEL por homología con estructuras previamente resueltas en
las bases de datos de B. stearothermophilus (entrada PDB 1cyg) y Bacillus sp. 1011
(entrada PDB 1ukq, 1pam y 1i75). Y en la figura 87 se observa como la topología
de la proteína halofílica es muy similar a la obtenida por cristalografía en B.
stearothermophilus para una CGTasa (entrada PDB 1cyg).
La elevada homología en la estructura que muestra la enzima halofílica con
enzimas pertenecientes a la familia de las -amilasas, nos ha permitido identificar
en el modelo propuesto (Figura 86) los cinco dominios típicos de este grupo de
proteínas (MacGregor y col., 2001):
El dominio A tiene una topología en forma de barril ( )8, es el más
conservado en todas las enzimas de la familia de las -amilasas. En él se
localiza la tríada catalítica fundamental para la actividad de cualquier
CGTasa, constituida por tres residuos ácidos.
El dominio B es un extenso lazo entre la tercera hélice y la tercera hoja del
barril TIM, interrumpiendo el dominio A. Este dominio varía mucho en su
secuencia y longitud entre los miembros de esta familia. Participando
posiblemente en la unión del sustrato o del Ca+2
.
El dominio C está contiguo al dominio A estabilizándolo. Está constituido por
hojas antiparalelas formando un barril . Se encuentra altamente
conservado, aunque su función todavía no está clara.
El dominio D presenta un plegamiento similar al que adoptan las
inmunoglobulinas, está formado por hojas antiparalelas. No se conoce su
función, aunque podría estar implicado en la unión del carbohidrato.
El dominio E también tiene una estructura de hojas antiparalelas y está
involucrado en la unión del almidón a la CGTasa. Se han descrito en este
dominio dos sitios de unión de maltosa. El primero de ellos se encarga de
unir el almidón y el otro de guiar y orientar la cadena de almidón hacia el
centro activo.
Resultados y discusión
210
Figura 86: Representación esquemática de la estructura terciaria de la CGTasa de Hfx.
mediterranei en el que se han identificado los cinco dominios típicos de esta familia de
proteínas. En lila se muestra el dominio A, en amarillo el B, en rojo el C, en verde el D y en
azul el E.
Figura 87: Superposición de la estructura de la CGTasa de Hfx. mediterranei (lila) y la de B.
stearothermophilus (verde).
Dominio A
Dominio B
Dominio C
Dominio D
Dominio E
Resultados y discusión
211
3.3.- Expresión heteróloga del gen de CGTasa de Hfx. mediterranei
La expresión heteróloga es el método que más se ha aplicado en la
producción de proteínas durante los últimos años. La mayoría de estos sistemas
emplean como huésped la bacteria gram negativa E. coli por diversas razones, entre
las que destacan su rápido crecimiento, su amplia caracterización genética, la
disponibilidad de un gran número de cepas y de vectores de expresión, y la
capacidad de producir proteínas a gran escala. Sin embargo, este tipo de expresión
no permite la modificación postraduccional de las proteínas ni, en ocasiones, el
plegamiento correcto de la misma dando lugar a la formación de cuerpos de
inclusión (Baneyx, 1999).
La sobreexpresión de proteínas en E. coli es una herramienta de gran utilidad
para la purificación, localización y análisis funcional de las proteínas. La técnica de
expresión se basa en la inserción de un promotor fuerte y una zona de unión al
cromosoma muy eficaz delante del ORF del gen a estudiar (Claros y col., 2001).
A menudo, las proteínas expresadas a elevados niveles tienden a asociarse
entre sí mediante interacciones hidrofóbicas para hacerse más solubles. Estas
asociaciones acaban siendo finalmente insolubles debido a su gran tamaño, ya que
la proteína es muy abundante y forman los denominados “cuerpos de inclusión”
(Claros y col., 2001). En este caso se requiere un paso previo de solubilización de
estos agregados, un plegamiento de la proteína para que adquiera su estructura
tridimensional, y por último la purificación de dicha proteína de los restos que la
acompañaban en los cuerpos de inclusión (Georgiou y Valax., 1999).
La obtención de proteínas expresadas en forma de cuerpos de inclusión
presenta varias ventajas (De Bernardez, 2001):
Se obtienen altos niveles de proteína recombinante.
Se evita el paso de la proteína a través de las membranas celulares.
La proteína se encuentra protegida del ataque de proteasas del
hospedador presentes en el citoplasma y el espacio periplásmico
Resultados y discusión
212
Sin embargo, tiene una gran desventaja. Durante el proceso de
renaturalización in vitro de la proteína se pueden formar estructuras intermedias
inactivas de forma irreversible, o agregaciones, lo que abortaría el proceso de
plegamiento impidiendo la formación de la proteína nativa. Este proceso
improductivo puede llegar a predominar sobre el correcto plegamiento bajo las
condiciones convencionales de dicho plegamiento, cuando se trata de proteínas
complejas (Rudolph y Lilie, 1996); por ello, este proceso debe ser cuidadosamente
desarrollado.
La expresión de proteínas halofílicas en huéspedes mesofílicos, como por
ejemplo E. coli, presenta el inconveniente de que la mayoría de las veces se
obtienen en forma de cuerpos de inclusión, requiriendo un paso posterior de
renaturalización de la proteína. Esto se debe a que dichas proteínas requieren la
presencia de elevadas concentraciones de sal para ser activas, solubles y estables.
Sin embargo, este problema, se ha solventado fácilmente mediante el empleo,
durante el proceso de renaturalización in vitro, de disoluciones con elevadas
concentraciones de sal. Otra de las soluciones posibles consistiría en llevar a cabo
la expresión homóloga de dichas proteínas, lo que permitiría su modificación
postraduccional y correcto plegamiento.
La ciclodextrin glucanotransferasa (CGTasa) de Hfx. mediterranei se ha
expresado heterólogamente en E. coli. A continuación se describe el método
empleado para ello, así como la purificación y caracterización de la proteína.
3.3.1.- Clonaje de CGTasa de Hfx. mediterranei en el vector pSTBlue-1
Para poder realizar la expresión heteróloga de la CGTasa de Hfx.
mediterranei en primer lugar se sintetizó el gen por PCR y se insertó directamente
por complementariedad de sus extremos en el vector de clonaje pSTBlue-1.
Se diseñaron los oligonucleótidos AmyExpFor y AmyExpRev insertando las
secuencias de restricción de las enzimas Nde I y BamH I respectivamente, para
poder dirigir la expresión del gen en el vector pET-3a. Como hemos visto en el
capítulo anterior, en el análisis de las secuencias, el gen correspondiente a la
Resultados y discusión
213
CGTasa presenta una secuencia que codifica un péptido señal necesario para su
traslocación al medio extracelular. Para diseñar el oligonucleótido en sentido
directo, se tuvieron que eliminar los 25 primeros aminoácidos para expresar la
proteína madura en E. coli.
Una vez obtenidos los oligonucleótidos se procedió a la amplificación del
gen utilizando como molde el DNA aislado del clon de fago λ, a partir del cual se
obtuvo la secuencia completa de la CGTasa. Como se puede apreciar en la
siguiente figura, se obtuvo una única banda que coincidía con el tamaño del gen.
Figura 88: Electroforesis de agarosa al 1,5 % (p/v).
Calle 1: patrones moleculares de tamaño Marker III (Fermentas).
Calle 2: reacción de PCR con la pareja AmyExpFor/AmyExpRev.
Calles 3 y 4: reacciones control con los oligos AmyExpFor y AmyExpRev
por separado.
Se repitió la reacción de PCR para purificar la banda del gel de agarosa y
secuenciarla para comprobar que se trataba del gen objeto de estudio (Figura 89).
Resultados y discusión
214
Figura 89: Electroforesis de agarosa al 1,5 % (p/v).
Calle 1: patrones moleculares de tamaño Marker III (Fermentas).
Calle 2: reacción de PCR con la pareja AmyExpFor/AmyExpRev.
Una vez purificada se secuenció con los mismos oligonucleótidos utilizados
para secuenciar el gen desde el fago (Fago 4.1for, Fago4.2for, Fago 4.1rev,
Fago 4.2rev, Fago 4.3rev), comprobando que el gen estaba completo, sin
mutaciones y con las secuencias de restricción de las enzimas Nde I y BamH I.
El producto de PCR se ligó con el vector pSTBlue-1 siguiendo las
instrucciones del kit “AccepTorTM
Vector” (Novagen) y se transformaron físico-
químicamente las células competentes E. coli Novablue incluidas en el mismo kit.
El análisis de transformantes se llevó a cabo por el aislamiento y purificación
de 10 plásmidos correspondientes a colonias con coloración blanca, en principio
positivas frente a las de color azul negativas, debido a la presencia del gen de la -
galactosidasa en el plásmido pSTBlue-1.
Como se puede apreciar en la electroforesis de la figura 90, aparentemente
sólo la calle 7 contenía plásmido con inserto.
Resultados y discusión
215
Figura 90: Electroforesis de agarosa al 1 % (p/v).
Calle 1: patrones moleculares de tamaño Marker III (Fermentas).
Calles 2 y 13: plásmido pSTBlue-1control sin inserto.
Calles 3 a 12: plásmidos transformantes purificados pSTBlue-1-amy.
Se secuenció el plásmido número 5 y se comprobó que el gen estaba
completo y sin ninguna modificación. Por lo tanto, se continuó trabajando con este
plásmido para expresar el gen de CGTasa.
3.3.2.- Clonaje de CGTasa de Hfx. mediterranei en el vector de expresión pET-3a
El plásmido recombinante pSTBlue-1-amy y el vector de expresión pET-3a se
digirieron con las enzimas de restricción Nde I y BamH I tal y como se describe en el
apartado 2.4.2 de materiales y métodos. En la digestión del plásmido recombinante
se obtuvieron dos fragmentos, uno de unas 3851 pb correspondiente al vector
pSTBlue-1 y otro de aproximadamente 2067 pb que coincidía con el tamaño del
gen que codifica la CGTasa de Hfx. mediterranei (Figura 91). Como se puede
apreciar en la misma electroforesis, la digestión del vector pET-3a dio como
resultado la linealización del mismo y por tanto una banda de unas 4640 pb.
Resultados y discusión
216
Figura 91: Electroforesis de agarosa al 1 % (p/v).
Calle 1: patrones moleculares de tamaño Marker III (Fermentas).
Calle 2: digestión pET-3a con Nde I y BamH I.
Calle 3: digestión pSTBlue-1-amy con Nde I y BamH I.
Se recortaron y purificaron las bandas correspondientes al gen de la CGTasa
y al plásmido de expresión linealizado y se llevó a cabo la reacción de ligación. La
proporción inserto y vector en dicha reacción fue de 3:1, estimando sus
concentraciones por medidas electroforéticas y espectrofotométricas.
Una vez realizada la ligación, se transformaron células competentes de la
cepa Novablue de E. coli para poder aislar, secuenciar y conservar la molécula
recombinante del gen de la CGTasa en el plásmido de expresión. La selección de
las colonias positivas se llevó a cabo por la resistencia a ampicilina que confiere el
vector a las células transformadas, ya que no presentan diferente coloración debido
a que el vector no posee el gen que codifica la -galactosidasa. Se purificaron 10
plásmidos comprobando por electroforesis que aparentemente todos poseían inserto
(Figura 92).
Resultados y discusión
217
Figura 92: Electroforesis de agarosa al 1 % (p/v).
Calle 1: patrones moleculares de tamaño Marker III (Fermentas).
Calle 2: plásmido pET-3a control sin inserto.
Calles 3 a 12: plásmidos transformantes purificados pET-3a-amy.
Se secuenció el plásmido número 4 y se comprobó que el gen estaba
completo y sin ninguna modificación. Por lo tanto, se continuó trabajando con este
plásmido para transformar el huésped de expresión.
3.3.3.- Expresión y localización de la CGTasa recombinante
La expresión de proteínas en organismos mesófilos, y de tiempos de
generación cortos como E. coli, es un método rápido y sencillo de obtener grandes
cantidades de proteína que no se obtendrían si se utilizasen los protocolos de
purificación de proteínas convencionales a partir del organismo de procedencia.
Como hemos señalado anteriormente, presenta ciertos inconvenientes que es
necesario eliminar para que el método en sí sea eficiente; entre ellos está el
plegamiento de la proteína en el caso en que la proteína aparezca como fracción
insoluble en forma de cuerpos de inclusión.
Resultados y discusión
218
Se ha visto que durante el proceso de plegamiento a la forma nativa se
pueden formar intermediarios que aborten dicho plegamiento, si esto sucediese se
obtendría mucho menos rendimiento en la expresión, por lo que en determinados
casos no sería un proceso rentable. La forma de evitar estas estructuras abortivas es
optimizando las condiciones de plegamiento de la enzima “in vitro”. Esto implica
variar todos aquellos parámetros que puedan afectar al plegamiento, así como a la
estabilidad de la enzima una vez plegada. Estos parámetros son característicos de
cada enzima, por lo que los datos publicados con anterioridad para enzimas de
organismos similares entre sí pueden o no corresponderse con los que se requerirán
para el plegamiento de la enzima en cuestión.
Empleando E. coli como hospedador de expresión y los diferentes vectores
que facilitan las casas comerciales para ello, se han expresado proteínas en el
citoplasma bacteriano, el espacio periplásmico o incluso se han encontrado
proteínas que han sido excretadas al medio extracelular (Bass y Yang, 1997).
Sin embargo, no hay muchas proteínas halofílicas activas tras su expresión en
E. coli, ya que requieren la presencia de elevadas concentraciones de sal para
mostrar actividad, y en algunos casos la eliminación de la sal da como resultado
una inactivación irreversible de la proteína (Connaris y col., 1999). En la actualidad
hay varias proteínas de microorganismos halófilos expresadas en E. coli como por
ejemplo: glucosa deshidrogenasa (Pire y col., 2001), NAD-glutamato
deshidrogenasa (Díaz y col., 2006) y 2-D-hidroxiácido deshidrogenasa (Domenech y
Ferrer, 2006) de Hfx. mediterranei; isocitrato deshidrogenasa (Camacho y col.,
2002) y dihidrofolato reductasa de Hfx. volcanii; malato deshidrogenasa de Har.
marismortui (Harel y col., 1988); nucleósido difosfato quinasa de Har. quadrata
(Yamamura y col., 2009) y Hbt. salinarum (Besir y col., 2005); rodopsina de Hbt.
halobium (Shand y col., 1991) y Hbt. salinarum (Mironova y col., 2005); -amilasa
A (Sivakumar y col., 2006) y -amilasa B (Tan y col., 2003) de H. orenii; chaperona
DnaK de Tetragenococcus halophilus (Sugimoto y col., 2003) y sarcosin
dimetilglicina metiltransferasa de Halorhodospira halochoris (Kallio y col., 2009).
Se empleó el plásmido pET-3a-amy anteriormente construido para
transformar el huésped de expresión E. coli BL21(DE3). Después de crecer la colonia
Resultados y discusión
219
seleccionada en LB con ampicilina y glucosa tal y como se indica en el apartado
2.4.4, se indujo el cultivo por adición de IPTG. Tras 3 horas de inducción, se
aislaron todas las fracciones celulares para localizar dónde se expresaba la CGTasa
recombinante. Para mejorar la solubilidad de la proteína expresada se redujo la
temperatura de inducción de 37º C a 22 ºC. Con esta modificación no se
consiguieron los resultados esperados, obteniéndose en todos los casos la proteína
sobreexpresada en la fracción soluble en la misma concentración,
independientemente de la temperatura (Figura 93). Tras realizar una electroforesis
en gel de poliacrilamida en presencia de SDS (SDS-PAGE), se observó que la
proteína sobreexpresada se obtenía mayoritariamente en la fracción citoplasmática
soluble y una pequeña concentración en forma de cuerpos de inclusión (Figura 94).
Aunque no se muestra en esta electroforesis, no se apreciaba ninguna banda en la
fracción periplasmática.
Figura 93: SDS-PAGE de la CGTasa recombinante a diferentes temperaturas: 22 ºC (Calles
3, 6 y 9) y 37 ºC (Calles 4, 7 y 10). Marcadores de peso molecular Fermentas (1); Fracción
total (2), soluble (5) e insoluble (8) de E. coli BL21(DE3) transformadas con el plásmido
control pET3a; Fracción total (3 y 4), soluble (6 y 7) e insoluble (9 y 10) de E. coli
BL21(DE3) transformadas con el plásmido pET3a-amy.
Resultados y discusión
220
Figura 94: Localización de la CGTasa recombinante mediante SDS-PAGE. Marcadores de
peso molecular Fermentas (1 y 9); Fracción total (2 y 4), soluble (6) e insoluble (8) de E. coli
BL21(DE3) transformadas con el plásmido pET3a-amy; Fracción total (3), soluble (5) e
insoluble (7) de E. coli BL21(DE3) transformadas con el plásmido control pET3a.
3.3.4.- Solubilización de los cuerpos de inclusión y renaturalización de la CGTasa
recombinante
Una vez solubilizados los cuerpos de inclusión en tampón Tris-HCl 20 mM
pH 8,0 conteniendo urea 8 M, DTT 50 mM y EDTA 2 mM, se realizaron diferentes
ensayos para su renaturalización.
Los métodos que se utilizan para renaturalizar la proteína desnaturalizada se
basan en eliminar del medio las altas concentraciones de agentes desnaturalizantes
empleados en la solubilización, creando así un medio idóneo para que las proteínas
se plieguen de manera casi espontánea. Entre estos métodos están: dilución,
diálisis, filtración en gel y la inmovilización en un soporte sólido (Clark, 2001; Li y
col., 2004). En la diálisis, el agente desnaturalizante se va eliminando
gradualmente, pero algunas proteínas a concentraciones intermedias de agente
desnaturalizante tienden a formar estructuras intermedias, irreversibles e inactivas
que forman agregados mediante interacciones hidrofóbicas. En estos casos, es
mejor llevar a cabo una dilución rápida en la que la concentración del agente
Resultados y discusión
221
desnaturalizante disminuye rápidamente, evitando la tendencia de la proteína a
agregarse. La dilución es el método más utilizado en estudios de plegamiento de
proteínas a pequeña escala. En él se diluye la proteína solubilizada directamente en
un tampón de renaturalización.
Para la renaturalización de la CGTasa recombinante se realizaron numerosos
ensayos con el fin de determinar las condiciones óptimas de plegamiento. La
renaturalización se llevó a cabo mediante dilución en los diferentes tampones
empleados, siguiendo el proceso mediante la medida de la actividad enzimática de
hidrólisis. En el primer ensayo realizado para comprobar el pH y la dilución más
apropiada, se obtuvieron los mejores resultados diluyendo 1:20 los cuerpos de
inclusión solubilizados en tampón Tris-HCl 20 mM pH 7,5, NaCl 2 M, CaCl2 2 mM
(Tabla 26). En todas las condiciones ensayadas, se recuperaba un menor porcentaje
de actividad con una dilución 1:40 de los cuerpos de inclusión y cuando se empleó
un tampón a pH 9.
Tabla 26: Renaturalización de la CGTasa recombinante en tampones con diferente
pH y a diferentes diluciones.
Actividad (U/mg)
Dilución 0 h 3 h 5 h 22 h 30 h
Bis-Tris propano 20 mM pH 6,0,
NaCl 2 M, CaCl2 2 mM
1:10 11,16 11,35 11,47 12,15 12,35
1:20 11,86 12,11 12,21 12,84 13,07
1:40 10,71 10,92 11,17 11,45 11,85
Tris-HCl 20 mM pH 7,5, NaCl
2 M, CaCl2 2 mM
1:10 11,40 11,51 11,56 12,17 12,44
1:20 12,20 12,23 12,47 13,06 13,53
1:40 10,83 11,10 11,18 11,60 11,95
Tris-HCl 20 mM pH 9,0, NaCl
2 M, CaCl2 2 mM
1:10 10,77 10,90 11,30 11,73 11,90
1:20 10,75 11,68 11,95 12,05 12,44
1:40 10,54 10,56 11,00 11,54 11,78
Puesto que se trata de una enzima halofílica, la concentración de sal
presente en la disolución está estrechamente ligada al mantenimiento de su
estructura. El plegamiento correcto de la enzima dependerá en su mayor parte de
Resultados y discusión
222
Tiempo (h)
0 20 40 60 80 100 120 140 160
Activid
ad
esp
ecíf
ica
(U
/mg
)
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
NaCl 1M
NaCl 2M
NaCl 3M
NaCl 4M
este factor. Danson y Hough (1997), explicaron el efecto estabilizador de la sal
sobre las proteínas halofílicas en base a la tensión superficial existente en la
interfase entre la superficie de la proteína y el agua. Se probaron distintas
concentraciones de NaCl y KCl, desde 1 a 4 M (Figuras 95 y 96).
El tipo de sal empleado en el tampón no influía excesivamente en la
renaturalización de la proteína ya que las diferencias de actividad eran mínimas, no
obstante la actividad era mayor cuando se empleaba NaCl en lugar de KCl. En
ambos casos, a la concentración más baja de sal la renaturalización ocurría muy
lenta en las primeras 40 horas, dando lugar a una curva sigmoide. Mientras que
para las otras concentraciones de sal estudiadas se obtenía un perfil hiperbólico.
Este mismo comportamiento se ha observado en la glucosa deshidrogenasa de Hfx.
mediterranei (Pire y col., 2001). La mejor actividad se observó a una concentración
de NaCl 2 M y 3 M, siendo superior la actividad recuperada a NaCl 2 M. A
diferencia de lo que cabría esperar al tratarse de una enzima halofílica, la actividad
obtenida a una concentración de NaCl 4 M era ligeramente inferior que la
recuperada a 2 M.
Figura 95: Renaturalización de la CGTasa recombinante en tampón Tris-HCl 20 mM pH
7,5 a diferentes concentraciones de NaCl.
Resultados y discusión
223
Tiempo(h)
0 20 40 60 80 100 120 140 160
Activid
ad e
spe
cíf
ica
(U
/mg)
0
2
4
6
8
10
12
14
16
KCl 1M
KCl 2M
KCl 3M
KCl 4M
Figura 96: Renaturalización de la CGTasa recombinante en tampón Tris-HCl 20 mM pH
7,5 a diferentes concentraciones de KCl.
Finalmente, los cuerpos de inclusión solubilizados se diluyeron 1:20 en
tampón Tris-HCl 20 mM pH 7,5, NaCl 2 M a diferentes concentraciones de CaCl2,
desde 0,5 a 10 mM. Como se puede apreciar en la figura 97, los mejores
resultados se obtenían a una concentración de CaCl2 4,0 mM y 6,0 mM. A
concentraciones superiores de CaCl2 la actividad disminuía hasta un 16 % respecto
a la obtenida para las concentraciones de 4,0-6,0 mM. Este mismo comportamiento
se ha observado en la CGTasa de P. kodakaraensis (Rashid y col., 2002).
Debido a que no se consiguió renaturalizar completamente la enzima, ya
que la máxima actividad que se recuperó fue de 19 U/mg que supone sólo un 40 %
de la actividad que presenta normalmente la CGTasa nativa, se continuó
únicamente con la fracción soluble donde la enzima estaba activa y con una mayor
concentración.
Resultados y discusión
224
Tiempo (h)
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300
Activid
ad e
specíf
ica (
U/m
g)
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
CaCl2 0.5 mM
CaCl2 1.0 mM
CaCl2 4.0 mM
CaCl2 6.0 mM
CaCl2 8.0 mM
CaCl2 10.0 mM
Figura 97: Renaturalización de la CGTasa recombinante en tampón Tris-HCl 20 mM pH
7,5, NaCl 2 M a diferentes concentraciones de CaCl2.
3.4.- Purificación y caracterización de la CGTasa recombinante de Hfx. mediterranei
3.4.1.- Purificación de la CGTasa recombinante de Hfx. mediterranei
La fracción soluble una vez obtenida, se incubó durante 5-6 horas a
temperatura ambiente para obtener la enzima completamente activa. Durante este
tiempo de incubación, la actividad se recupera progresivamente al estar la enzima
en un medio con una elevada concentración de sal.
La purificación se llevó a cabo mediante una única etapa cromatográfica en
Sepharosa 6B- -ciclodextrina a temperatura ambiente, en la que se
cromatografiaron los 50 ml correspondientes a la fracción soluble. Con la
aplicación de un gradiente de concentración lineal creciente de -ciclodextrina de 0
a 3 mg/ml, se comprobó que el máximo de actividad correspondía con un pico de
Resultados y discusión
225
Sepharosa 6B recombinante
Volumen (ml)
0 25 50 75 100 125 150 175 200 225 250
A2
80
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
Activid
ad
(U
/ml)
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
Actividad(U/ml)
-cic
lode
xtr
ina
(m
g/m
l)
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
-ciclodextrina
proteína que eluía a una concentración de -ciclodextrina, entre 0,70 y 0,90 mg/ml
(Figura 98). Esta concentración era algo superior a la que se obtuvo para la enzima
nativa que era de 0,30 a 0,50 mg/ml. Se unieron las fracciones que presentaban
una mayor actividad constituyendo un volumen total de 30 ml y se filtraron para
eliminar la -ciclodextrina presente.
En la tabla en la que se muestran los resultados de la purificación (Tabla 27)
se puede observar el rendimiento obtenido y el valor de la actividad específica de la
enzima recombinante. La actividad específica resultó similar a la obtenida en la
enzima nativa, pero el rendimiento mejoró mucho, resultando el proceso más
ventajoso ya que se emplea una única etapa cromatográfica. Con la expresión
heteróloga se obtiene hasta 13 veces más rendimiento en el proceso de
purificación.
Figura 98: Cromatograma de Sepharosa 6B- -ciclodextrina. Con línea continua se
representa el perfil de absorbancia a 280 nm, con línea discontinua el gradiente del
tampón empleado para la elución y con puntos el perfil de actividad.
Resultados y discusión
226
Volumen (ml)
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180
A2
80
0.00
0.02
0.04
0.06
0.08
Activid
ad
(U
/ml)
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
Tabla 27: Proceso de purificación de la CGTasa recombinante de Hfx. mediterranei.
Pasos de purificación Vol (ml)
Unidades totales
Proteína (mg)
Ae (U/mg)
Rendimiento (%)
Factor purificación
Fracción soluble 50 27,5 22,00 1,25 100 1,00 Sepharosa 6B 30 13,0 0,26 50,00 47 40,00
Se cromatografiaron 2 ml procedentes de la purificación en Sepharosa 6B- -
ciclodextrina en una columna Sephacryl S-200. Como se puede observar en la
siguiente figura, la CGTasa recombinante presentaba el mismo comportamiento
que la enzima nativa. Eluía en el mismo volumen, lo que confirmaba que este tipo
de enzima interacciona de algún modo con la matriz. La actividad de la CGTasa
nativa era superior a la de la recombinante puesto que en la enzima nativa esta
columna representaba el último paso en su purificación y por tanto se cromatografió
una mayor concentración de enzima.
Figura 99: Cromatograma de Sephacryl S-200. Con línea continua se representa el perfil
de absorbancia a 280 nm y con puntos el perfil de actividad, de la CGTasa recombinante.
Con línea discontinua de color rojo se representa el perfil de actividad de la CGTasa nativa.
Resultados y discusión
227
3.4.2.- Electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes y
nativas
Con la electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones
desnaturalizantes (Figura 100), se comprobó que aparecía una única banda cuyo
tamaño coincidía con el de la CGTasa nativa. En el caso de la enzima
recombinante, a diferencia de la nativa, con un único paso cromatográfico se
obtiene la proteína de forma pura.
La electroforesis en condiciones nativas de la enzima recombinante
purificada, mostraba una única banda cuando se teñía con azul Coomassie que
coincidía en tamaño con la enzima nativa (Figura 101a). Dicha banda presentaba
actividad amilolítica cuando se teñía con la solución de yodo (Figura 101b).
Figura 100: SDS-PAGE correspondiente al proceso de purificación de la CGTasa
recombinante.
Calle 1: marcadores de peso molecular (Fermentas).
Calle 2: fracción soluble.
Calle 3: Sepharosa 6B- -ciclodextrina.
kDa 1 2 3
116.0
66.2
45.0
35.0
25.0
Resultados y discusión
228
(a) (b)
1 2 1 2
Figura 101: Gel de electroforesis de poliacrilamida en condiciones nativas. (a) Tinción con
azul Coomassie, (b) Tinción de actividad. Las calles con el número 1 corresponden a la
enzima nativa y las del número 2 a la recombinante.
3.4.3.- Caracterización de CGTasa recombinante de Hfx. mediterranei
3.4.3.1.- Efecto de la concentración de sal, de los iones hidrógeno (pH) y de la
temperatura sobre la actividad enzimática
En la figura 102 se puede comprobar que la CGTasa recombinante muestra
el mismo perfil de actividad que la silvestre en relación con la concentración de sal,
presentando en ambos casos una actividad máxima en 1,5 M de NaCl. Del mismo
modo que la nativa, a una concentración de 0,5 M de NaCl conserva un 52% de su
actividad.
El valor de pH óptimo, en el cual la actividad catalítica de la enzima
recombinante es mayor, es en torno a 7,0, al igual que ocurre en la nativa (Figura
103). Ambas pierden más del 60 % de la actividad a pHs inferiores a 5,0 y
superiores a 8,0.
Resultados y discusión
229
Figura 102: Efecto de la concentración de sal sobre la actividad CGTasa.
Figura 103: Efecto del pH sobre la actividad CGTasa.
Resultados y discusión
230
La enzima recombinante mostró el mismo comportamiento frente a la
temperatura que la nativa (Figura 104). Para un pH 7,0 la temperatura óptima es de
55 ºC y a temperaturas de 35 y 60 ºC ambas enzimas conservan el 50 % de su
actividad.
Figura 104: Efecto de la temperatura sobre la actividad CGTasa.
3.4.3.2.- Efecto de la temperatura y la concentración de sal sobre la estabilidad
enzimática
Los estudios de termoestabilidad se llevaron a cabo modificando la
concentración de NaCl (entre 1 y 3 M) presente en el ensayo a temperaturas
comprendidas entre 50 y 80 ºC. Los resultados obtenidos se muestran en las figuras
105, 106 y 107.
Resultados y discusión
231
Tiempo (h)
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200
Activid
ad r
esid
ual (%
)
0.1
1
10
100
80ºC
70ºC
60ºC
50ºC
Tiempo (h)
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200
Activid
ad
re
sid
ua
l (%
)
0.1
1
10
100
80ºC
70ºC
60ºC
50ºC
Figura 105: Termoestabilidad de CGTasa recombinante a una concentración de 1 M NaCl.
Figura 106: Termoestabilidad de CGTasa recombinante a una concentración de 2 M NaCl.
Resultados y discusión
232
Tiempo (h)
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200
Activid
ad r
esid
ual (%
)
0.1
1
10
100
80ºC
70ºC
60ºC
50ºC
Figura 107: Termoestabilidad de CGTasa recombinante a una concentración de 3 M NaCl.
Los datos obtenidos manifiestan que la proteína recombinante muestra la
misma termoestabilidad que la enzima nativa para las concentraciones de sal y
temperaturas estudiadas (Tabla 28). La CGTasa recombinante muestra una mayor
termoestabilidad conforme aumenta la concentración de NaCl del tampón en el que
se encuentra. A temperaturas de 70 y 80 ºC, la enzima se inactiva en pocos
minutos, mostrando tiempos de vida media muy bajos. Sin embargo, a 60 ºC se
observa como la vida media de la enzima aumenta conforme la concentración de
sal es mayor. Por último, a 50 ºC las diferencias entre los tiempos de vida media no
son excesivamente significativos ya que las proteínas permanecen estables durante
semanas. Como se ha explicado en la caracterización de la enzima nativa, a bajas
concentraciones de sal las proteínas halofílicas tienden a desestabilizarse, proceso
que se encuentra favorecido por el aumento de la temperatura. Sin embargo, a
elevadas concentraciones salinas las proteínas se mantienen estables, siendo la
temperatura el único factor que puede perturbar su estabilidad. Este patrón también
Resultados y discusión
233
se ha observado en las enzimas halofílicas caracterizadas por nuestro grupo de
investigación (Bonete y col., 2007).
Tabla 28: Tiempos de vida media a distintas temperaturas y concentraciones de sal de la
CGTasa nativa y recombinante de Hfx. mediterranei.
NATIVA RECOMBINANTE
Temperatura
(ºC)
1 M NaCl
(h)
2 M NaCl
(h)
3 M NaCl
(h)
1 M NaCl
(h)
2 M NaCl
(h)
3 M NaCl
(h)
50 214 239 255 199 247 257
60 5 18 82 7 14 75
70 0,03 0,03 0,04 0,06 0,06 0,10
80 0,02 0,02 0,03 0,04 0,04 0,05
Los parámetros termodinámicos calculados para el proceso de
desnaturalización de la enzima recombinante a las temperaturas y concentraciones
de NaCl ensayadas (Tabla 29), son del mismo orden que los obtenidos para la
enzima nativa. Los valores de energía de activación para el proceso de inactivación
térmica son prácticamente del mismo orden para las diferentes concentraciones de
sal. Al igual que ocurre en la enzima nativa, la energía de activación va
aumentando ligeramente conforme la concentración de sal es mayor, ya que al ser
la proteína más estable al aumentar la concentración de sal, será necesaria una
mayor energía de activación para el proceso de desnaturalización. Al igual que
ocurre con la enzima nativa, en la recombinante el ∆H es superior a una
concentración de NaCl 3 M, ya que es necesario romper un mayor número de
interacciones internas de la proteína y de interacciones estabilizantes entre los iones
salinos del medio acuoso y la proteína. Del mismo modo, el mayor aumento de la
entropía a la concentración de sal superior, se puede explicar porque la proteína
presenta una estructura más ordenada debido al efecto compactante provocado por
la sal.
Resultados y discusión
234
Tabla 29: Parámetros termodinámicos a distintas temperaturas y concentraciones de sal de
la CGTasa nativa y recombinante de Hfx. mediterranei.
1M NaCl 2 M NaCl 3 M NaCl
NATIVA RECOMB NATIVA RECOMB NATIVA RECOMB
Temp(ºC) ∆G (KJ/mol) ∆G (KJ/mol) ∆G (KJ/mol)
50 95±4 87±6 95±4 96±9 95±4 94±7
60 89±4 82±6 89±4 90±9 89±4 88±7
70 84±4 76±6 84±4 84±9 83±4 82±7
80 79±4 70±6 78±4 78±9 78±4 76±7
Ea (KJ/mol) 265±4 266±2 274±4 284±5 277±6 287±4
∆H (KJ/mol) 266±2 268±4 274±2 281±7 280±2 288±4
∆S
(KJ/molºK)
0,530
±0,006
0,562
±0,006
0,555
±0,005
0,574
±0,007
0,573
±0,006
0,602
±0,009
3.4.3.3.- Efecto de la concentración de EDTA y de iones divalentes en la actividad
enzimática
Tras incubar la enzima recombinante durante 1 hora a temperatura ambiente
en presencia de concentraciones crecientes de EDTA, se comprobó que presentaba
el mismo comportamiento que la enzima nativa, inactivándose completamente a
concentraciones de EDTA superiores a 10 mM (Figura 108).
Resultados y discusión
235
Figura 108: Inactivación de la CGTasa en presencia de concentraciones crecientes de
EDTA.
Se siguió el mismo procedimiento que para la enzima nativa, se inactivó con
una concentración elevada de EDTA (50 mM) y tras dializarla frente a tampón Tris-
HCl 20 mM pH 7,5, NaCl 3 M, para la eliminación del agente quelante, se incubó
con diferentes concentraciones de CaCl2 desde 0,5 mM hasta 10 mM, 50 mM, 100
mM y 200 mM, durante 15 minutos, 22 horas y 72 horas (Tabla 30). Los mejores
resultados se observaron a una concentración de CaCl2 10 mM y un tiempo de
incubación de 72 horas, donde la enzima recombinante recuperaba un 25 % de
actividad a diferencia de la nativa que sólo alcanzaba un 19 %. Al igual que sucede
en la enzima nativa, a las concentraciones superiores de CaCl2 ensayadas la
actividad disminuía y sólo se recuperaba un 12 % en CaCl2 50 mM. Con MgCl
2 y
MnCl2 sólo se recuperó un 3 % y 2 % de la actividad respectivamente, mientras que
no se logró recuperar nada de actividad con ninguno de los otros iones que se
probaron (NiCl2 y ZnCl
2).
Resultados y discusión
236
Tabla 30: Recuperación de la actividad con diferentes concentraciones de CaCl2 tras la
inactivación con EDTA de la CGTasa nativa y recombinante de Hfx. mediterranei.
Actividad residual (%)
NATIVA RECOMBINANTE
CaCl2 (mM) 15 min 22 h 72 h 15 min 22 h 72 h
0,5 2,5 5,5 10,0 1,0 7,0 14,0
1 3,0 6,0 11,0 2,0 7,5 13,0
2 3,0 6,0 12,0 3,0 8,0 13,5
3 3,5 6,5 12,0 3,0 9,0 16,0
4 4,0 7,0 13,0 4,0 10,0 18,0
5 4,0 7,0 13,0 6,0 12,0 20,0
6 5,0 8,0 14,0 8,0 14,0 22,0
7 6,5 8,5 14,5 12,5 18,0 22,0
8 7,5 10,5 16,5 12,5 20,0 23,5
9 8,0 11,0 17,0 13,0 21,0 24,0
10 10,0 13,0 19,0 18,0 22,0 25,0
50 2,5 6,5 10,0 3,0 6,0 13,0
100 1,5 3,0 4,5 2,5 3,5 6,0
200 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0
3.4.3.4.- Determinación de actividades catalíticas específicas de CGTasa
3.4.3.4.1.- Actividad de ciclación
Respecto a la actividad de ciclación, como se observa en las figuras 109,
110 y 111, la enzima recombinante presenta el mismo comportamiento a lo largo
del tiempo que la nativa. En el caso de la ciclación a -ciclodextrina, a los 20
minutos de reacción la actividad específica era de 89 U/mg, mientras que la que se
obtenía para la enzima nativa era de 88 U/mg. En la ciclación a -ciclodextrina la
actividad alcanzada por la CGTasa recombinante era de 46 U/mg, del mismo
orden que la determinada para la nativa, 48 U/mg. La actividad específica obtenida
para la enzima recombinante en la ciclación a -ciclodextrina era de 41 U/mg,
ligeramente superior a la actividad de 34 U/mg determinada para la nativa. En
Resultados y discusión
237
ambos casos la actividad era mucho menor que la obtenida en la ciclación a -
ciclodextrina.
Figura 109: Actividad de ciclación a -ciclodextrina de la CGTasa de Hfx. mediterranei.
Figura 110: Actividad de ciclación a -ciclodextrina de la CGTasa de Hfx. mediterranei.
Resultados y discusión
238
Figura 111: Actividad de ciclación a -ciclodextrina de la CGTasa de Hfx. mediterranei.
En todos los casos, la concentración de ciclodextrina alcanzada por la
enzima recombinante era superior a la obtenida con la nativa, debido a que su
concentración era más elevada. La CGTasa recombinante, producía
mayoritariamente -ciclodextrina (6 mM), seguida por la -ciclodextrina (2,78 mM) y
finalmente la -ciclodextrina (1,42 mM), con una proporción de 1:0,5:0,2
respectivamente, muy similar a la obtenida en la nativa (1:0,6:0,3).
3.4.3.4.2.- Actividad de acoplamiento
Para la actividad de acoplamiento la CGTasa recombinante presenta el
mismo comportamiento que la enzima nativa (Figuras 112 y 113). En la todos los
casos, la concentración de glucosa aumentaba con respecto al tiempo de reacción.
Igual que en el caso anterior la concentración de glucosa alcanzada por la enzima
recombinante era superior a la obtenida con la nativa, debido a que su
concentración era más elevada.
Resultados y discusión
239
Figura 112: Actividad de acoplamiento a -ciclodextrina de la CGTasa de Hfx.
mediterranei.
Figura 113: Actividad de acoplamiento a -ciclodextrina de la CGTasa de Hfx.
mediterranei.
Resultados y discusión
240
En ambas enzimas, las actividades de acoplamiento obtenidas para cada
una de las ciclodextrinas son prácticamente idénticas. A los 20 minutos la actividad
específica de acoplamiento de -ciclodextrina era de 0,023 U/mg para la enzima
recombinante y 0,022 U/mg para la nativa. En el caso de la -ciclodextrina era de
0,44 U/mg en la recombinante y 0,49 U/mg en la enzima nativa. Como ya se ha
visto para la enzima nativa, estas actividades de acoplamiento se encuentran muy
por debajo de las obtenidas para las CGTasas descritas en otros microorganismos,
ya que esta actividad está muy influenciada por factores como la concentración de
enzima y las condiciones de la reacción.
3.4.3.4.3.- Actividad de transferencia
Como se puede apreciar en la siguiente figura, la enzima recombinante se
comporta del mismo modo que la enzima nativa. La concentración de p-nitrofenol
aumentaba rápidamente al inicio de la reacción y se mantenía prácticamente
constante con el aumento del tiempo de reacción. A los 20 minutos la actividad
específica era de 4,6 U/mg, del mismo orden que la obtenida para la nativa, 4,4
U/mg. Al igual que con la actividad de acoplamiento, la actividad de transferencia
de la CGTasa de Hfx. mediterranei es muy inferior a la obtenida en otros
microorganismos al estar influenciada, no sólo por el tipo de microorganismo, sino
también por factores como la concentración de enzima y las condiciones de
reacción.
Resultados y discusión
241
Figura 114: Actividad de transferencia de la CGTasa de Hfx. mediterranei.
3.4.3.5.- Especificidad de sustratos de la CGTasa
Se comprobó si la CGTasa recombinante presentaba la misma afinidad por
los sustratos analizados que la enzima nativa. Se empleó la misma concentración
para todos ellos y la reacción transcurrió durante 20 horas para que la enzima los
pudiera hidrolizar completamente.
Como se aprecia en la tabla 31, los valores obtenidos para la enzima
recombinante son del mismo orden que los de la nativa. En ambas, se obtiene la
máxima actividad de hidrólisis empleando almidón como sustrato, y dentro de las
ciclodextrinas, presentan una mayor actividad con -ciclodextrina ya que es la que
más unidades de glucosa presenta en su estructura. Del mismo modo que la nativa,
la enzima recombinante presenta una baja actividad empleando pululan como
sustrato al no poder hidrolizar los enlaces glucosídicos -1,6. Como ya se ha visto
en la caracterización de la enzima nativa, la baja actividad de hidrólisis obtenida
Resultados y discusión
242
con -ciclodextrina se debe a que el resto de sustratos empleados presentan un
mayor número de unidades de glucosa que ésta.
Tabla 31: Especificidad de sustratos de CGTasa de Hfx. mediterranei.
NATIVA RECOMBINANTE
Sustrato Actividad
(U/mg)
Actividad
relativa (%)
Actividad
(U/mg)
Actividad
relativa (%)
Almidón 72,92 100 68,85 100
Pululan 4,58 6 4,70 7
Glucógeno 17,50 24 16,07 23
-ciclodextrina 1,25 2 1,38 2
-ciclodextrina 7,50 10 6,76 10
-ciclodextrina 20,6 28 18,40 27
3.4.3.6.- Determinación de parámetros cinéticos
Al igual que para la enzima nativa, los estudios de velocidades iniciales se
llevaron a cabo empleando almidón como sustrato y determinando la actividad de
hidrólisis y de ciclación a -ciclodextrina. En las figuras 115 y 116 se muestran los
resultados obtenidos tras representar la ecuación de Lineweaver-Burk para ambas
actividades.
Los valores obtenidos para las constantes cinéticas de la CGTasa
recombinante de Hfx. mediterranei se muestran en la siguiente tabla, junto con los
calculados con anterioridad para la enzima nativa. En ella se observa que los
valores para ambas proteínas son del mismo orden para las dos actividades
analizadas. Al comparar entre sí las constantes determinadas para cada una de
estas actividades se aprecia que, al igual que sucede con la enzima nativa, las
obtenidas para la actividad de ciclación a -ciclodextrina son superiores a las
obtenidas para la actividad de hidrólisis.
Resultados y discusión
243
Tabla 32: Constantes cinéticas calculadas a partir de velocidades iniciales con las
actividades de hidrólisis y de ciclación a -ciclodextrina de la CGTasa de Hfx. mediterranei.
Kalmidón
(g/l) V
máx
(U/mg)
Kcat
x 10-3
(min-1
)
Kcat
/ Kalmidón
x 10-3
(l g-1
min-1
)
Hidrólisis
NATIVA 14,3 ± 0,8 106 ± 4 8,07 ± 0,02 0,57 ± 0,03
RECOMB 22 ± 1 125 ± 6 9,55 ± 0,01 0,43 ± 0,02
Ciclación
NATIVA 17,2 ± 0,6 161 ± 5 12,26 ± 0,02 0,71 ± 0,03
RECOMB 21 ± 1 188 ± 7 14,36 ± 0,01 0,68 ± 0,03
Figura 115: Representación doble inversa de la velocidad inicial frente a la concentración
de almidón para la actividad de hidrólisis de la CGTasa recombinante de Hfx. mediterranei.
Cinética con actividad de hidrólisis
1/[Almidón] (mM)-1
0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.12
1/V
(U
/mg)-1
0.00
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10
0.12
0.14
y = 0.0080 + 1.1155 x
Resultados y discusión
244
1/[Almidón] (mM)-1
0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.12
1/V
(U
/mg
)-1
0.00
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
0.07
0.08
y = 0.0053 + 0.6933 x
Figura 116: Representación doble inversa de la velocidad inicial frente a la concentración
de almidón para la actividad de ciclación a -ciclodextrina de la CGTasa recombinante de
Hfx. mediterranei.
3.4.3.7.- Análisis de los productos de reacción por capa fina
Al igual que con la enzima nativa, se analizaron los productos de la reacción
de la CGTasa recombinante con almidón por capa fina. En la siguiente figura
(Figura 117) se puede apreciar como ambas enzimas presentan los mismos
productos de reacción, y no se aprecian diferencias entre las reacciones llevadas a
cabo durante 20 minutos y 24 horas. Como es característico en las CGTasas los
productos mayoritarios de la reacción de hidrólisis son las ciclodextrinas. En ambas,
la -ciclodextrina es la que se produce en una menor concentración, mientras que
las otras dos aparecen juntas y no se pueden diferenciar claramente.
Resultados y discusión
245
Figura 117: Cromatografía en capa fina de los productos de la reacción de la CGTasa.
Calles 1-9 patrones: glucosa (1), maltosa (2), maltotriosa (3), maltotetraosa (4),
maltopentaosa (5), maltohexaosa (6), -ciclodextrina (7), -ciclodextrina (8) y -ciclodextrina
(10). Calles 10-12 reacción CGTasa nativa a diferentes tiempos: tiempo 0 (10), 20 minutos
(11) y 24 horas (12). Calles 13-15 reacción CGTasa recombinante a diferentes tiempos:
tiempo 0 (13), 20 minutos (14) y 24 horas (15).
Todos los resultados obtenidos en la caracterización de la enzima
recombinante concuerdan con los obtenidos para la nativa de Hfx. mediterranei,
presentan el mismo comportamiento cinético y las mismas características.
3.5.- Cristalización de la CGTasa recombinante de Hfx. mediterranei
La CGTasa de Hfx. mediterranei se intentó cristalizar mediante la técnica de
hanging drop a 290 K bajo diferentes condiciones, pero en ninguno de los casos
ensayados se obtuvieron resultados satisfactorios. En presencia de PEG 3350 20 %
y fosfato amónico 0,2 M crecieron cristales, pero tanto al difractarlos como al
teñirlos con Izit (Hampton Research), se observó que se correspondían con cristales
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Resultados y discusión
246
inorgánicos. Por otro lado, con la solución 41 (HEPES sódico 0,1 M, propanol 10 %
y PEG 4000 20 %) del kit Crystal Screen 1 (Hampton Research) se obtuvieron
multitud de cristales en forma de aguja que también resultaron ser cristales
inorgánicos. Éstos aparecieron inmediatamente después de mezclar la disolución
con la muestra de proteína, lo cual nos hizo pensar que no eran cristales proteicos.
Para comprobarlo, realizamos el mismo ensayo pero utilizando como muestra
únicamente el tampón Tris-HCl 20 mM pH 7,5, NaCl 2 M, obteniéndose los
mismos resultados y confirmando que los cristales obtenidos no eran proteicos. En la
actualidad se están realizando nuevos ensayos variando las disoluciones de
cristalización y la temperatura.
DISCUSIÓN GENERAL
Discusión general
249
Muchos procesos industriales se desarrollan bajo condiciones extremas, por
lo que en los últimos años la producción de enzimas que sean estables y activas
bajo estas situaciones ha despertado un gran interés. Dadas sus características, Hfx.
mediterranei podría emplearse como fuente de enzimas con aplicaciones
industriales, ya que es capaz de crecer en un amplio rango de concentraciones
salinas (1,5-4,0 M NaCl) y tolera elevadas temperaturas. Entre estas enzimas se
encontrarían amilasas, nucleasas y proteasas que ya están siendo utilizadas
actualmente en diferentes procesos procedentes de otras haloarqueas (Eichler,
2001; Oren, 2002a).
Con el objetivo de producir alguna de estas enzimas de interés
biotecnológico, se decidió llevar a cabo estudios con aquellas capaces de degradar
almidón. En concreto con una CGTasa que, hasta la fecha, es la primera
caracterizada tanto a nivel bioquímico como molecular perteneciente a una arquea
halófila. Sus propiedades la hacen muy interesante desde el punto de vista
biotecnológico, ya que es capaz de permanecer estable y activa en diferentes
condiciones. Presenta actividad en un amplio rango de concentraciones salinas,
incluso a bajas concentraciones como a 0,5 M de NaCl donde conserva hasta un
65 % de su actividad. En relación con el pH del medio en el que se encuentra, el
intervalo en el que presenta su máxima actividad es entre 6,0 y 7,5. Y en este
intervalo su temperatura óptima es de 55 ºC, aunque a temperaturas de 35 y 60 ºC
la enzima conserva el 50 % de su actividad. Por otro lado, su proceso de
purificación es otra de las ventajas ya que es purificada en sólo dos etapas
cromatográficas, aunque el rendimiento obtenido no es muy alto.
Además de estas características la CGTasa muestra las propiedades típicas
de enzimas halofílicas que las hacen ser estables en medios donde hay baja
disponibilidad de agua, como es el caso de algunos procesos industriales. El bajo
punto isoeléctrico calculado para esta enzima es característico de las proteínas
halófilas y se debe a la influencia de los aminoácidos cargados negativamente. En
la proteína de Hfx. mediterranei se produce una gran diferencia entre el número
total de residuos cargados positiva y negativamente, lo que ha sido descrito como
un mecanismo de adaptación a ambientes hipersalinos ya que contribuye a la
Discusión general
250
solubilidad y estabilidad en dichos medios (Mevarech y col., 2000). Este aumento en
el número de aminoácidos cargados negativamente conlleva una disminución en el
contenido de Lys, un incremento en los residuos hidrofóbicos Gly, Ala y Val, y una
disminución de residuos alifáticos (Madern y col., 2000; Esclapez y col., 2005).
En relación con las cuatro actividades que caracterizan este tipo de enzimas,
en la CGTasa de Hfx. mediterranei la ciclación es la actividad predominante
seguida por la hidrólisis, mientras que las actividades de acoplamiento y
transferencia son muy bajas. Las CGTasas caracterizadas hasta el momento
producen una mezcla de -, - y -ciclodextrinas. En el caso de la enzima de Hfx.
mediterranei, produce mayoritariamente -ciclodextrina, seguida por -ciclodextrina
y finalmente -ciclodextrina, con una proporción de 1:0,6:0,3 respectivamente. Las
moléculas encapsuladas en ciclodextrinas o en sus derivados presentan cambios
ventajosos en sus propiedades químicas y físicas, lo que las hacen apropiadas para
sus aplicaciones en muchos campos de la industria como la alimentación, farmacia,
cosmética, etc. Las aplicaciones de la -ciclodextrina son algo más limitadas si la
comparamos con la -ciclodextrina, ya que alberga moléculas más pequeñas en su
interior debido a que su cavidad tiene un diámetro de 4,7-5,3 Å frente a los 6,0-6,5
Å de la otra ciclodextrina. Aún así la -ciclodextrina producida por la CGTasa de
Hfx. mediterranei podría ser empleada en la industria farmacéutica y alimentaria
para enmascarar los sabores de ciertos medicamentos y alimentos, sin ser
perjudicial para el ser humano ya que esta ciclodextrina prácticamente no es
degradada por las -amilasas de los microorganismos de la flora del colon.
Aunque el objetivo principal de este trabajo consiste en encontrar una enzima
con aplicaciones industriales, en paralelo se realizó un análisis bioinformático de su
secuencia que ha aportado información importante sobre la adaptación de estos
microorganismos al medio extremo en el que viven y que puede ser empleada para
una posible mejora de la enzima.
El análisis de la secuencia de la CGTasa de Hfx. mediterranei ha revelado,
además de la presencia de un péptido señal eliminado durante el proceso de
secreción, que pertenece a la familia de proteínas Tat (Twin-arginine translocation).
Se han identificado proteínas que pueden ser transportadas por este sistema en
Discusión general
251
aproximadamente 29 arqueas, de las cuales sólo 9 corresponden a organismos
halófilos. Sin embargo, en ninguno de estos organismos se han caracterizado
funcionalmente las proteínas que participan en el transporte (TatA, TatB y TatC). En
Hfx. volcanii se ha demostrado la versatilidad de esta vía que transloca tanto
proteínas secretoras como funcionales (Gimenez y col., 2007). En Halobacterium
sp. NRC-1 se ha comprobado que más del 60 % de las proteínas que son
exportadas emplean el sistema Tat, a diferencia de lo que ocurre en bacterias y
eucariotas en las que el 90 % de las proteínas son exportadas con el sistema Sec
(Bolhuis, 2002; Kwan y col., 2008). El uso preferente de esta vía por las arqueas
halófilas sugiere una adaptación evolutiva ya que este sistema de transporte permite
translocar a través de la membrana proteínas ya plegadas de diferentes tamaños
(Rose y col., 2002). Hfx. mediterranei es un buen modelo para estudiar la
translocación de proteínas en arqueas halófilas y comprobar si, como los datos
sugieren, esta vía juega un papel más importante que el sistema Sec en
haloarqueas.
La comparación de secuencias sugiere que la CGTasa de Hfx. mediterranei
presenta las cuatro regiones conservadas que han sido identificadas en la familia de
las -amilasas y que contienen los residuos del centro activo (McGregor y col.,
2001), así como el sitio de unión de almidón (SBD) (Svensson y col., 1989;
Machovic y Janecek, 2006). Por otro lado, en un modelo teórico de su estructura
tridimensional se han podido identificar los cinco dominios típicos de este grupo de
proteínas (MacGregor y col., 2001). Mediante estudios estructurales de la CGTasa
de Hfx. mediterranei se puede contribuir a esclarecer la función de algunos de estos
dominios y la interacción del centro activo de la proteína con el SBD.
Al tratarse de la única CGTasa secuenciada hasta el momento en una
arquea halófila, no se han podido establecer sus relaciones evolutivas. La proteína
de Hfx. mediterranei puede establecer las bases para la secuenciación de otras
CGTasas de haloarqueas y poder realizar un filograma en el que se observaran con
exactitud estas relaciones evolutivas.
Además del gen de la CGTasa, en este estudio se ha conseguido secuenciar
cuatro genes más pertenecientes a un transportador de tipo ABC encargado del
Discusión general
252
transporte de maltosa al interior celular en Hfx. mediterranei. Empleando las
secuencias consenso para cajas TATA de halófilos (Palmer y Daniels, 1995; Danner
y Soppa, 1996; Soppa, 1999a; Brenneis y col., 2007), se ha propuesto que el gen
de la CGTasa y el de la ATPasa (malK) se transcribirían cada uno por separado,
mientras que el resto de los genes del transportador (malE, malF y malG) se
transcribirían como una única unidad transcripcional. Se han encontrado proteínas
pertenecientes a transportadores de maltosa tipo ABC en 18 organismos
pertenecientes al Dominio Archaea, de los cuales sólo 5 pertenecen a la Familia
Halobacteriaceae. Poco se conoce de este sistema de transporte de maltosa en los
organismos pertenecientes a esta Familia, por lo que Hfx. mediterranei es un buen
candidato para su estudio.
Los sistemas ABC constituyen una de las familias de proteínas más
abundantes (Higgins, 2001; Davidson y col., 2008) y puede considerarse como el
mecanismo más antiguo por el que los solutos atraviesan la bicapa lipídica en
contra de un gradiente de concentración (Schneider y Hunke, 1998). Estos
transportadores están formados por dos dominios transmembrana y dos dominios
de unión a nucleótido. Y en el caso de Hfx. mediterranei al tratarse de un sistema
importador, también está presente una proteína extracelular de unión a soluto.
Los dominios transmembrana, que forman el canal por el que atraviesan los
solutos la membrana, están formados típicamente por 6 -hélices transmembrana
cada uno. En el caso de Hfx. mediterranei se ha determinado a través de sus
secuencias, que la permeasa MalF estaría formada por 8 hélices transmembrana y
la MalG por 6, por lo que el transportador estaría constituido por 14 hélices
transmembrana, valor muy cercano a los determinados para otros microorganismos.
Los dominios de unión a nucleótido son los que proporcionan energía al
transportador mediante la unión e hidrólisis de ATP. A pesar de la gran diversidad
de solutos transportados, las secuencias de estos dominios están muy conservadas
entre todos los transportadores ABC. En el caso de Hfx. mediterranei también se han
identificado estos motivos conservados en su secuencia y en su estructura terciaria
(Schneider y col., 1998; Bhom y col., 2002).
Discusión general
253
La proteína de unión a soluto en Hfx. mediterranei une maltosa de forma
específica para cederla a las subunidades de membrana del transportador (Ames y
col., 1996). Al encontrarse en el medio extracelular también presenta un bajo punto
isoeléctrico. Como en el caso de la CGTasa, al analizar su secuencia se ha
identificado un posible péptido señal eliminado una vez translocada a través de la
membrana, y la señal de reconocimiento para la vía de transporte Tat. Con su
cristalización se conseguiría comprobar si es correcto el sitio de unión a maltosa que
se ha determinado con el modelo teórico de su estructura, y se esclarecería la
relación existente entre esta proteína y las proteínas de membrana.
Uno de los pasos que encarece el uso de enzimas a nivel industrial es su
producción y posterior purificación, pero con la expresión de la CGTasa en E. coli y
el método de purificación que se ha diseñado, se obtienen elevadas
concentraciones de enzima pura en un solo paso cromatográfico con un relativo
bajo coste económico. La enzima expresada tiene las mismas características y el
mismo comportamiento cinético que la enzima silvestre. Además, cabe destacar que
sólo se han expresado 4 CGTasas de arqueas termófilas, por lo tanto se trata de la
primera perteneciente a una arquea halófila expresada de forma heteróloga. Otra
de las finalidades de la expresión de la proteína es su cristalización, ya que sólo se
conoce la estructura tridimensional de las bacterias T. thermosulfurigenes, Bacillus
sp. 1011, B. circulans 251 y B. stearothermophilus. Con su estructura se ampliaría
el conocimiento sobre la función de cada uno de sus dominios y sobre los
mecanismos de halofilicidad, pero sobre todo se conocería qué residuos pueden ser
reemplazados para mejorar la enzima.
Antes de que se desarrollara la tecnología del DNA recombinante las
CGTasas eran modificadas químicamente o inmovilizadas para mejorar sus
funciones. Las técnicas empleadas actualmente para mejorar el rendimiento de estas
enzimas son la evolución dirigida o la mutagénesis dirigida. Con la evolución
dirigida se obtienen mejores enzimas que con la mutagénesis debido a la limitada
comprensión que se tiene sobre la relación entre la estructura y la función de las
enzimas. La evolución dirigida se basa en la construcción de miles de millones de
variantes de las enzimas ya existentes mediante técnicas de PCR (Leemhuis y col.,
Discusión general
254
2009; Kelly y col., 2009). Sin embargo, la mutagénesis dirigida es muy valiosa para
estudiar determinados residuos seleccionados mediante estudios estructurales o por
alineamientos de secuencias. Ambas técnicas se combinan con frecuencia para
obtener mejores resultados.
En general, los residuos que se encuentran presentes en las regiones
conservadas 1 y 2 (Figura 84) determinan la orientación del sustrato dentro del
centro activo y juegan un papel crucial en la ruptura del enlace glucosídico. El tipo
de ciclodextrina producida por las CGTasas depende del número de unidades de
glucosa unidas en los subsitios del centro activo. La sustitución de residuos en estos
subsitios o mutaciones que afectan indirectamente a sus propiedades, provocan que
las CGTasas produzcan específicamente un tipo de ciclodextrina sobre otra (Tabla
33). Los subsitios -1 y -2 son cruciales para la actividad catalítica, mientras que en
el subsitio -3 se producen interacciones específicas con el sustrato. Este subsitio
muestra variaciones en la composición de aminoácidos dependiendo de la
ciclodextrina que se produzca. Durante el proceso de circularización, el residuo de
azúcar que se encuentra en el subsitio -3 es estabilizado por una Arg en la posición
47 y por un Asp en la 371 (tomando como referencia la numeración de B. circulans
251). Por ejemplo en la CGTasa de Thermococcus sp. B1001 y Klebsiella
pneumoniae que producen principalmente -ciclodextrina, en la posición 47 se
encuentra una Lys; cuando la mayoritaria es la -ciclodextrina este residuo es Lys,
His o Arg; mientras que en las que producen -ciclodextrinas está presente una Thr.
En B. circulans en esta posición se han realizado dos mutaciones (R47L y R47Q) que
han alterado la especificidad de la ciclodextrina producida (van der Veen y col.,
2000c). La mutación en esta posición en la CGTasa de Bacillus sp. que produce
principalmente -ciclodextrina, provoca un incremento en la producción de -
ciclodextrina desde un 10 % a un 39 % (Goh y col., 2009).
Además de la formación de ciclodextrinas, las CGTasas poseen actividad
hidrolítica. Durante las etapas finales del proceso de ciclación, las Phe 183 y 259
del subsitio +2 forman interacciones con el oligosacárido entrante, mientras que la
Ala 230, Leu 194 y Leu 197 del subsitio +1 forman una cavidad hidrofóbica que
atrapa los extremos no reductores de la cadena de azúcar antes del ataque
nucleofílico en el intermediario covalente (Uitdehaag y col., 2001). Estudios de
Discusión general
255
mutagénesis dirigida han revelado que los subsitios +1 y +2 determinan la
preferencia de la CGTasa por las reacciones de transglicosilación, ya que las
mutaciones en estos residuos disminuyen drásticamente la velocidad de ciclación y
normalmente aumenta la actividad de hidrólisis (van der Veen y col., 2001;
Leemhuis y col., 2002; Leemhuis y col., 2003b). Un triple mutante
A231V/F184Q/F260W en los subsitios +1 y +2 prácticamente hace desaparecer
la actividad de ciclación y aumenta la de hidrólisis en la CGTasa de T.
thermosulfurigenes (Kelly y col., 2007). En este mismo organismo, una mutación de
una Ser por una Pro en la posición 77 mejora la proporción ciclación/hidrólisis
(Kelly y col., 2008).
Con estos estudios estructurales y con mutagénesis dirigida se podría
conseguir que la CGTasa de Hfx. mediterranei presentara una actividad de ciclación
superior y que sintetizara una mayor concentración de una determinada
ciclodextrina, haciéndola idónea para su aplicación en determinados procesos
industriales. Basándonos en estudios anteriores para otras CGTasas (Tabla 33), en
Hfx. mediterranei se podrían reemplazar los residuos Tyr189, Phe265, Leu200 y
Tyr201, para aumentar la actividad de ciclación frente a la de hidrólisis. Del mismo
modo, para favorecer la formación de -ciclodextrina, puesto que es la más
utilizada en la industria, se podrían mutar los residuos Arg58 y Asp377. La
producción de esta ciclodextrina es de especial interés ya que actualmente se están
realizando investigaciones dirigidas hacia su empleo en el tratamiento del cáncer y
en terapia génica (Singh y col., 2002; Dass, 2004).
Discusión general
256
Tabla 33: Mutaciones que afectan a las reacciones catalizadas por las CGTasas y a la
producción de ciclodextrinas (Kelly y col., 2009). La numeración hace referencia a la
posición de los residuos en la CGTasa de B. circulans 251.
Posiciones Residuos Mutaciones Función/Efecto
Subsitio
+2
183 F,W N,S,L Ciclación, reducción de hidrólisis
232 K,A L,E Actividad general
259 F,Y L,N,I,E,H,R Ciclación, reducción de hidrólisis
Subsitio
+1
194 L T Ciclación
195 Y,F Todas Ciclación
230 A V Especificidad en transglicosilación
233 H D,N,R Actividad general
Subsitio
-1
100 Y F,S Actividad general
140 H D,N,R Actividad general
227 R A,K Actividad general
229 D A,N Actividad general
257 E A,Q Nucleófilo catalítico
327 H D,N,R Actividad general
328 D N,A Actividad general, estado transición
Subsitio
-2
98 H D Actividad general
Subsitio
-3
47 R,K,H,T W,L.Q Ciclación
89 Y,D,S,Q,A,G F,S,D,G Actividad general, especificidad producto
94 N,Y,E,S S,Q Disminuye ligeramente las actividades
196 D,N,G H Actividad reducida, más -CD
371 D G,N,R Actividad general, menos -CD
Subsitio
-6
167 Y F Selección de sustratos largos
179 G L Selección de sustratos largos
180 G,N L Selección de sustratos largos
193 N L,G Selección de sustratos largos
Subsitio
-7
145 S,M,L,D,E A, E Especificidad de ciclodextrina
146 S,E,V,F,L P Especificidad de ciclodextrina
147 T,D,N W Especificidad de ciclodextrina
Otros
residuos
21 F,V L Limitación de hidrólisis
76 S,T P Hidrólisis
326 D,S D,Q,L Ciclación y actividad general
CONCLUSIONES
Conclusiones
259
Las conclusiones más relevantes del trabajo presentado en esta Tesis
Doctoral se resumen a continuación:
1. La ciclomaltodextrin glucanotransferasa de Hfx. mediterranei es la primera
enzima de esta familia caracterizada tanto a nivel bioquímico como
molecular perteneciente a una arquea halófila. Se trata de una proteína
extracelular monomérica de aproximadamente 77 kDa que presenta
actividad óptima a 55ºC, pH 7,5 y NaCl 1,5 M. Muestra una elevada
tolerancia a las condiciones salinas, presentando actividad incluso a bajas
concentraciones como a 0,5 M de NaCl donde conserva hasta el 65 % de su
actividad. Como ocurre con otras enzimas halófilas, muestra una mayor
termoestabilidad conforme aumenta la concentración de sal del tampón en
el que se encuentra.
2. La enzima se inactiva completamente tratándola con el agente quelante
EDTA, lo que sugiere la existencia de un metal indispensable para el
mantenimiento de su actividad. Únicamente se recupera un 19 % de esta
actividad cuando la enzima se incuba durante 72 horas con CaCl2 10 mM,
lo que muestra que requiere el ion calcio para su estabilidad y/o actividad tal
y como ocurre en las enzimas pertenecientes a la familia de las -amilasas.
3. De las cuatro actividades que caracterizan a este tipo de enzimas, en la
CGTasa de Hfx. mediterranei la ciclación es la actividad predominante
seguida por la hidrólisis, mientras que las actividades de acoplamiento y
transferencia son muy bajas. Al igual que sucede con el resto de CGTasas
caracterizadas, produce una mezcla de ciclodextrinas siendo la
-ciclodextrina la mayoritaria, seguida por la -ciclodextrina y -ciclodextrina.
4. La secuencia de la CGTasa de Hfx. mediterranei consta de 2142 pb que
codifican 713 aminoácidos, en los que se han identificado las cuatro
regiones conservadas en la familia de las -amilasas así como el sitio de
unión de almidón. Posee las características típicas de las enzimas halofílicas,
presentando un bajo punto isoeléctrico, un aumento de residuos ácidos y
una disminución en el contenido de Lys. En un modelo teórico de su
Conclusiones
260
estructura tridimensional se han podido determinar los cinco dominios típicos
de este grupo de proteínas.
5. Con el análisis de su secuencia se ha identificado la presencia de un péptido
señal y de la secuencia de reconocimiento de la familia de proteínas Tat, lo
que revela que la CGTasa de Hfx. mediterranei podría ser transportada por
este sistema al medio extracelular.
6. Se han secuenciado cuatro genes adyacentes que pertenecen a un
transportador de maltosa tipo ABC que presentan las características típicas
de este tipo de transportadores.
7. Empleando las secuencias consenso para cajas TATA de halófilos se ha
propuesto que el gen de la CGTasa y el de la ATPasa (malK) se transcribirían
cada uno por separado, mientras que el resto de los genes del transportador
(malE, malF y malG) se transcribirían como una única unidad transcripcional.
8. La CGTasa de Hfx. mediterranei se ha expresado de forma heteróloga en
E. coli, obteniéndose la enzima pura con una elevada concentración de
forma rápida, sencilla y en un único paso cromatográfico. La enzima
sobreexpresada presenta un comportamiento cinético y unas características
idénticas a la proteína silvestre de Hfx. mediterranei.
9. La CGTasa recombinante de Hfx. mediterranei se ha intentado cristalizar
mediante la técnica de hanging drop a 290 K bajo diferentes condiciones,
pero en ninguno de los casos ensayados se han logrado cristales adecuados
para la determinación de su estructura tridimensional.
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APÉNDICES
Apéndice I
297
APÉNDICE I: Medios de cultivo y soluciones
MEDIOS DE CULTIVO
Agua de sales al 30 % LB (Luria-Bertani)
NaCl 19,5 % Bactotriptona 1 %
MgCl2 3,5 % Extracto de levadura 0,5 %
MgSO4 4,9 % NaCl 1 %
CaCl2 0,09 % pH 7,5 (NaOH)
KCl 0,5 % Esterilizar
NaHCO3 0,02 %
NaBr 0,06 %
KH2PO
4 0,05 %
FeCl3 0,0005 %
LB Agar LB TOP Agar
Bactotriptona 1 % Bactotriptona 1 %
Extracto de levadura 0,5 % Extracto de levadura 0,5 %
NaCl 1 % NaCl 1 %
pH 7,5 (NaOH) pH 7,5 (NaOH)
Agar 2 %
Esterilizar
Agarosa 0,7 %
Esterilizar
SOLUCIONES EMPLEADAS EN ELECTROFORESIS DE AGAROSA
Tampón TAE 10X Tampón TE
Tris-Acetato 0,4 mM
Tris-HCl 10 mM
EDTA 10 mM EDTA 1 mM
Ácido acético 0,2 M pH 8,0
pH 8,4
Tampón de carga 6X
Azul de bromofenol 0,03 %
Xileno cianol 0,03 %
Tris-HCl 10 mM pH 7,6
EDTA 60 mM
Glicerol 60 %
Apéndice I
298
SOLUCIONES EMPLEADAS EN ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS
Tampón de muestra
(2X Sample Buffer)
Tampón de recorrido 5X (1 l)
Tris-HCl 80 mM
15 g Tris-HCl
DTT 100 mM 72 g Glicina
SDS 2 % 3 g SDS
Azul de bromofenol 0,006 % pH 8,3 (HCl)
Glicerol 15 %
pH 6,8
SOLUCIONES EMPLEADAS EN LAS HIBRIDACIONES
20X SSC Tampón Ácido maleico
NaCl 3 M Ácido maleico 0,1 M
Citrato sódico 0,3 M NaCl 0,15 M
pH 7,0 (HCl) pH 7,5 (NaOH)
Esterilizar
Blocking solution (stock) Solución de
desnaturalización
Ácido maleico 0,1 M
NaOH 0,5 N
NaCl 0,15 M NaCl 1,5 M
SDS 2 %
pH 7,5 (NaOH)
Blocking reagent (Roche) 10 %
Disolver calentando
Esterilizar
Solución de neutralización Solución de hibridación
Tris-HCl 1 M pH 7,5 5X SSC
NaCl 1,5 M Blocking solution 10 % (p/v)
N-laurilsarcosina 10 % (p/v)
0,02 % SDS
Apéndice I
299
Tampón SM Tampón PBS (1 l)
NaCl 0,6 % NaCl 8 g
MgSO4 0,2 % KCl 0,2 g
Tris-HCl 1 M pH 7,5 5 % (v/v) Na2HPO
4 1,44 g
Gelatina 2 % (v/v) KH2PO
4 0,24 g
Esterilizar pH 7,4 (HCl)
Esterilizar
SOLUCIONES EMPLEADAS EN LAS MEDIDAS DE ACTIVIDAD
Tampón A
Bis-Tris propano 0,1 M pH 7,0
NaCl 1,5 M
Apéndice II
300
APÉNDICE II: Genotipos de las células empleadas
KW251: F-
, sup E44, gal K2, gal T2, met B1, hsd R2, mcr B1,mcr A, [arg A81::Tn
10], rec D1014.
El significado de los marcadores genéticos es el siguiente:
F-
: cepa que no contiene el episoma F.
sup E44: incluye un supresor para las mutaciones ámbar (mutaciones que
convierten cualquier codón en el codón de terminación UAG) del tRNA. El
supresor inserta una glutamina en el codón UAG.
gal K2: mutación en galactoquinasa. Bloquea el catabolismo de galactosa.
gal T2: mutación en galactosa-1-fosfato uridililtransferasa. Bloquea el
catabolismo de galactosa.
met B1: mutación en cistationina -sintasa. Requiere metionina para crecer en
un medio mínimo.
hsd R2: mutación que proporciona la pérdida en la actividad de restricción,
pero no de modificación de la enzima Eco K, una enzima de restricción tipo I. El
DNA clonado será metilado, y por tanto protegido frente a la restricción si el
vector fuera después introducido en una cepa hsd +.
mcr B1: mutación en el sistema de restricción de metilcitosina. Bloquea la
restricción del DNA metilado en la secuencia 5’...AGm
CT...3’.
mcr A: en el sistema de restricción de metilcitosina. Bloquea la restricción del
DNA metilado en la secuencia 5’...Gm
CGC...3’.
arg 81: mutación en N-acetilglutamato sintasa. Requiere arginina para crecer
en un medio mínimo.
Tn 10: transposón que confiere resistencia frente a tetraciclina.
rec D1014: mutación en exonucleasa V. El trímero Rec BCD (exonucleasa V)
degrada progresivamente, con requerimiento de ATP, ssDNA y dsDNA para
formar oligonucleótidos. Reduce la recombinación general y afecta en la
reparación de los daños causados por radiación. Permite una propagación más
fácil de secuencias con repeticiones inversas.
Apéndice II
301
Nova Blue: end A1, hsd R17 (rK12
-
,mK12
-
), sup E44, thi1, rec A1, gyr A96, rel A1, lac F’
[pro A+
B+
, lac 1q
Z M15: Tn 10 (TcR
)]
El significado de los marcadores genéticos es el siguiente:
end A1: mutación en endonucleasa A. Aumenta la calidad del DNA aislado a
partir de ésta cepa, impidiendo su degradación.
hsd R17 (rK12
-
, mK12
-
): mutación que proporciona la pérdida en la actividad de
restricción, pero no de modificación de la enzima Eco K, una enzima de
restricción tipo I. El DNA clonado será metilado, y por tanto protegido frente a
la restricción si el vector fuera después introducido en una cepa hsd +.
sup E44: incluye un supresor para las mutaciones ámbar (mutaciones que
convierten cualquier codón en el codón de terminación UAG) del tRNA. El
supresor inserta una glutamina en el codón UAG.
thi1: mutación en el metabolismo de la tiamina. Cuando se crece en medio
mínimo éste microorganismo requiere la presencia de tiamina ya que es incapaz
de sintetizarla.
rec A1: mutación en una ATPasa DNA dependiente, esencial para la
recombinación genética en E. coli. Previene la recombinación del DNA
introducido con el DNA de la célula, asegurando la estabilidad de los insertos.
gyr A96: mutación en DNA girasa. Confiere resistencia al ácido nalidíxico, que
en condiciones normales inhibiría la actividad enzimática.
rel A1: mutación que elimina el factor estricto que actúa en la inhibición de
síntesis de rRNA cuando se detiene la síntesis de proteínas. Esta mutación
permite la síntesis de rRNA en ausencia de síntesis de proteínas.
F’: contiene el episoma F’, plásmido de E. coli con fragmentos del cromosoma
bacteriano. El episoma F’ posee las características que se marcan entre
corchetes cuyo significado es:
pro A+
B+
: mutación en el metabolismo de la prolina. Cuando se crece en
medio mínimo este microorganismo requiere la presencia de prolina, ya que
es incapaz de sintetizarla.
lac 1q
: mutante del gen lac l que sintetiza aproximadamente diez veces más
represor que el tipo salvaje. Esta superproducción del represor inhibe la
transcripción del operón lac en ausencia de inductor.
lac Z M15: mutación por deleción que elimina las secuencias del gen lac Z
que codifica para la porción amino-terminal de la β-galactosidasa. El
Apéndice II
302
péptido expresado puede formar parte en la α-complementación para
formar la β-galactosidasa activa.
Tn 10 (TcR
): transposón que confiere resistencia frente a tetraciclina.
BL(21)DE3: F-
omp T, hsd SB (r
B
-
, mB
-
), gal, dcm, (DE3). El significado de los
marcadores genéticos es el siguiente:
F-
: cepa que no contiene el episoma F.
omp T: mutación que produce la carencia de una proteasa, lo que favorece la
obtención de proteínas recombinantes intactas.
hsd SB (r
B
-
, mB
-
): mutación que elimina tanto la restricción como la metilación del
DNA en la secuencia TGA(N)8TGCT.
gal: indica la incapacidad de esta cepa para emplear galactosa.
dcm: mutación en la citosina metilasa. Bloquea la metilación de la citosina en la
secuencia 5’....Gm
GAGG....3’ ó 5’....Cm
CTGG....3’.
(DE3): el gen que codifica la T7 RNA polimerasa está integrado en el genoma
del microorganismo.
Apéndice III
303
APÉNDICE III: Abreviaturas
ADP Difosfato de adenosina
ATP Trifosfato de adenosina
CAT Ciclo de los ácidos tricarboxílicos
CBM Sitio de unión de carbohidratos
CGTasa Ciclomaltodextrin glucanotransferasa
CoA Coenzima A
col. Colaboradores
CSPD 3-(4-metoxispiro-[1,2-diaminociclohexano-3-2’-(5’-cloro) triciclo
[3.3.1.13,7] decano]-4-il) fenil fosfato desódico
CTAB Bromuro de cetil trimetil amonio
DMSO Dimetilsulfóxido
DNA Ácido desoxirribonucleico
DNAasa Desoxirribonucleasa
dNTP Desoxirribonucleótidos trifosfato
DO Densidad óptica
DTE Ditioeritritol
DTT Ditiotreitol
Ea
Energía de activación
EDTA Ácido etilén-diamino-tetraacético
EPS p-nitrofenil- -D-maltoheptaósido-4-6-O-etilideno
ET
Enzima total
FISH Hibridación in situ con fluorescencia
GOD-PAP
HEPES
Glucosa oxidasa-peroxidasa-4-aminofenazona
Ácido N-2-Hidroxietilpiperacina-N'-2'-Etanesulfónico
HPLC Cromatografía líquida de alta resolución
IPTG Isopropil- -D-galactósido
Kav Coeficiente de partición
Kb Kilobases
Kcat
Constante catalítica
kDa KiloDalton
Apéndice III
304
Km
Constante de Michaelis-Menten
LB Medio de cultivo Luria-Bertani
MPa Megapascales
Mpb Megapares de bases
mRNA RNA mensajero
MS Espectrofotómetro de masas
NBD Dominio de unión a nucleótido
PAS Ácido periódico de Schiff
PBS Tampón fosfato salino
PCR
PEG
Reacción en cadena de la polimerasa
Polietilenglicol
PFGE Electroforesis de campo pulsante
PGP-Me Arquetidilglicerol metilfosfato
PHA Polihidroxialcanoato
PHB Polihidroxibutirato
PMSF Fluoruro de fenilmetilsulfonil
RNA Ácido ribonucleico
RNAasa Ribonucleasa
rRNA RNA ribosómico
SBD Sitio de unión de almidón
SBP Proteína de unión a soluto
SDS Dodecilsulfato sódico
SDS-PAGE Electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de SDS
SSC Citrato sódico salino
TAE Tampón Tris-acetato-EDTA
Tat Twin-arginine translocation
TE Tampón Tris-EDTA
TIM Isomerasa triosafosfato de músculo de pollo
Tm Temperatura de fusión de la doble hebra de DNA
TMAO N-óxido de trimetilamina
TMD Dominio transmembranal
Topo IA DNA topoisomerasa
Apéndice III
305
Tris Tri-(hidroximetil)-aminometano
U Unidad de actividad enzimática
UT
Unidades de actividad enzimática totales
Ve Volumen de elución
Vmáx
Velocidad enzimática máxima
Vo
Volumen muerto
Vt
Volumen total
X-Gal 5-bromo-4-cloro-3-indolil- -galactósido
Apéndice IV
306
APÉNDICE IV: Índice de figuras
Figura 1: Representación esquemática del árbol filogenético universal ........... 3
Figura 2: Árbol filogenético con los reinos del Dominio Archaea ................... 7
Figura 3: Fotografía tomada con microscopio electrónico en la que se
aprecian los gránulos de PHB en el citoplasma de Hfx. mediterranei ..............
16
Figura 4: Representación esquemática de las diferentes actividades de la
ciclomaltodextrin glucanotransferasa ...........................................................
20
Figura 5: Estructura barril ( / )8 (TIM-barrel) ................................................ 21
Figura 6: Estructura terciaria de una -amilasa de B. stearothermophilus y
una CGTasa de Bacillus sp. 1011 ..............................................................
21
Figura 7: Esquema de la interacción del sustrato con los subsitios del centro
activo de la CGTasa ..................................................................................
23
Figura 8: Esquema de las reacciones de transferencia, acoplamiento y
ciclación de la CGTasa ..............................................................................
25
Figura 9: Estructuras de las -, - y -ciclodextrinas ...................................... 27
Figura 10: Esquema de los componentes del sistema de transporte Sec ......... 31
Figura 11: Esquema del modelo funcional y estructural del sistema de
transporte Tat ............................................................................................
32
Figura 12: Organización en dominios de los transportadores ABC ................ 35
Figura 13: Representación lineal de un dominio ABC típico asignando los
sitios funcionales principales .......................................................................
37
Figura 14: Mecanismo de actuación de un transportador ABC que exporta un
soluto al medio extracelular ........................................................................
39
Figura 15: Reacción de -acoplamiento de la CGTasa ................................. 47
Figura 16: Actividad de transferencia de la CGTasa ..................................... 48
Figura 17: Programa de PCR de amplificación del gen de la CGTasa de Hfx.
mediterranei ..............................................................................................
60
Figura 18: Esquema de la localización de genes en una genoteca de fago 65
Figura 19: Esquema de la técnica Southern blot .......................................... 67
Figura 20: Secuenciación del DNA del fago que contiene el gen de la
CGTasa por la estrategia de primer walking ................................................
68
Figura 21: Programa de PCR de secuenciación del DNA viral ....................... 70
Figura 22: Programa de PCR de amplificación del gen de la CGTasa de Hfx.
mediterranei ..............................................................................................
74
Figura 23: Mapa del vector de clonaje pSTBlue-1 ........................................ 75
Figura 24: Mapa del vector de expresión pET-3a ......................................... 77
Figura 25: Descripción de la técnica de cristalización hanging drop .............. 84
Figura 26: Cromatograma de la purificación en Sepharosa 6B- -ciclodextrina 88
Figura 27: Cromatograma de la purificación en Sephacryl S-200 ................. 88
Apéndice IV
307
Figura 28: SDS-PAGE correspondiente al proceso de purificación de la
CGTasa ....................................................................................................
90
Figura 29: Gel de electroforesis de poliacrilamida en condiciones nativas ...... 91
Figura 30: Efecto del tiempo de ensayo en la actividad CGTasa ................... 92
Figura 31: Efecto de la concentración de sal sobre la actividad CGTasa ........ 93
Figura 32: Efecto del pH sobre la actividad CGTasa .................................... 94
Figura 33: Efecto de la temperatura sobre la actividad CGTasa .................... 96
Figura 34: Termoestabilidad de la CGTasa a una concentración de 1M NaCl 97
Figura 35: Termoestabilidad de la CGTasa a una concentración de 2M NaCl 97
Figura 36: Termoestabilidad de la CGTasa a una concentración de 3M NaCl 98
Figura 37: Inactivación de la CGTasa de Hfx. mediterranei en presencia de
concentraciones crecientes de EDTA ...........................................................
102
Figura 38: Actividad de ciclación a -, - y -ciclodextrina de la CGTasa de
Hfx. mediterranei .......................................................................................
104
Figura 39: Actividad de acoplamiento a -ciclodextrina de la CGTasa de Hfx.
mediterranei ..............................................................................................
106
Figura 40: Actividad de acoplamiento a -ciclodextrina de la CGTasa de Hfx.
mediterranei ..............................................................................................
107
Figura 41: Actividad de transferencia de la CGTasa de Hfx. mediterranei ...... 108
Figura 42: Representación doble inversa de la velocidad inicial frente a la
concentración de almidón para la actividad de hidrólisis de la CGTasa de
Hfx. mediterranei .......................................................................................
109
Figura 43: Representación doble inversa de la velocidad inicial frente a la
concentración de almidón para la actividad de ciclación a -ciclodextrina de
la CGTasa de Hfx. mediterranei ..................................................................
110
Figura 44: Cromatografía en capa fina de los productos de la reacción de la
CGTasa ....................................................................................................
112
Figura 45: Alineamiento de los péptidos DVIYQIVTDR, LWLIKIDGIR,
VDAVAHMP y FSNDSGMSIIDFR de Hfx. mediterranei con enzimas
pertenecientes a la familia de las -amilasas ...............................................
116
Figura 46: Electroforesis de agarosa al 0,8 % de DNA de Hfx. mediterranei ... 118
Figura 47: Electroforesis de agarosa al 1,5 % de PCR de amplificación ......... 118
Figura 48: Electroforesis de agarosa al 1,5 % de PCR de amplificación ......... 119
Figura 49: Alineamiento de la secuencia de la sonda de Hfx. mediterranei con
enzimas pertenecientes a la familia de las -amilasas .............................................
120
Figura 50: Electroforesis de agarosa al 1,5 % de la sonda marcada .............. 121
Figura 51: Dot blot que muestra la estimación del marcaje de la sonda ......... 121
Figura 52: Búsqueda en la librería de DNA genómico de Hfx. mediterranei en
fago con la sonda para la CGTasa ..........................................................
124
Figura 53: Electroforesis de agarosa al 1 % de DNA de fagos aislados .......... 126
Figura 54: Southern blot del gel de agarosa con los DNA de los fagos .......... 126
Figura 55: Electroforesis de agarosa al 1,5 % de PCR de amplificación ......... 127
Apéndice IV
308
Figura 56: Secuencia completa de los genes implicados en la degradación
de almidón y en el transporte de maltosa al interior celular ...........................
129
Figura 57: Representación de la organización genómica de la CGTasa y de
los genes que constituyen el transportador de maltosa tipo ABC en Hfx.
mediterranei ..............................................................................................
154
Figura 58: Esquema que representa la secuencia de la proteína de unión a
maltosa de Hfx. mediterranei ......................................................................
155
Figura 59: Predicción de la estructura secundaria de la proteína de unión a
maltosa de Hfx. mediterranei ......................................................................
157
Figura 60: Alineamiento de la secuencia de la proteína de unión a maltosa
de Hfx. mediterranei con sus homólogas de varios microorganismos
pertenecientes al Dominio Archaea .............................................................
159
Figura 61: Filograma realizado a través del programa PHYLIP con la opción
neighbor-joining con la proteína malE de Hfx. mediterranei .........................
163
Figura 62: Representación esquemática de la proteína malE de Hfx.
mediterranei en el que se indica el posible sitio de unión a maltosa ...............
164
Figura 63: Superposición de la estructura de la proteína de unión a maltosa
de Hfx. mediterranei y la de P. furiosus .......................................................
165
Figura 64: Predicción de la estructura secundaria de la permeasa (malF) del
transportador de maltosa tipo ABC de Hfx. mediterranei ...............................
167
Figura 65: Representación esquematizada de las hélices transmembrana
identificadas en la permeasa (malF) de Hfx. mediterranei en el que se indica
el posible sitio de unión a NBD (malK) ........................................................
169
Figura 66: Alineamiento de la secuencia de aminoácidos correspondiente a
la permeasa (malF) de Hfx. mediterranei con otras permeasas que forman
parte de transportadores de azúcares tipo ABC en organismos pertenecientes
al Dominio Archaea ...................................................................................
170
Figura 67: Filograma realizado a través del programa PHYLIP con la opción
neighbor-joining con la proteína malF ........................................................
174
Figura 68: Representación esquemática de la proteína malF de Hfx.
mediterranei ..............................................................................................
175
Figura 69: Superposición de la estructura de la permeasa malF de Hfx.
mediterranei y la de E. coli ........................................................................
175
Figura 70: Predicción de la estructura secundaria de la permeasa (malG) del
transportador de maltosa tipo ABC de Hfx. mediterranei ...............................
177
Figura 71: Representación esquematizada de las hélices transmembrana
identificadas en la permeasa (malG) de Hfx. mediterranei en el que se indica
el posible sitio de unión a NBD (malK) ........................................................
179
Figura 72: Alineamiento de la secuencia de aminoácidos correspondiente a
la permeasa (malG) de Hfx. mediterranei con otras permeasas que forman
parte de transportadores de azúcares tipo ABC en organismos pertenecientes
al Dominio Archaea ...................................................................................
180
Apéndice IV
309
Figura 73: Filograma realizado a través del programa PHYLIP con la opción
neighbor-joining con la proteína malG .......................................................
184
Figura 74: Representación esquemática de la proteína malG de Hfx.
mediterranei ..............................................................................................
185
Figura 75: Superposición de la estructura de la permeasa malG de Hfx.
mediterranei y la de E. coli .........................................................................
185
Figura 76: Predicción de la estructura secundaria de la proteína de unión a
ATP de Hfx. mediterranei ............................................................................
188
Figura 77: Alineamiento de la secuencia de aminoácidos correspondiente a
la proteína de unión de ATP de Hfx. mediterranei con otras homólogas que
forman parte de transportadores de azúcares tipo ABC en organismos
pertenecientes al Dominio Archaea .............................................................
190
Figura 78: Filograma realizado a través del programa PHYLIP con la opción
neighbor-joining con la proteína malK .......................................................
194
Figura 79: Representación esquemática del monómero de malK de Hfx.
mediterranei en el que se han identificado las regiones conservadas propias
de este tipo de proteínas ............................................................................
195
Figura 80: Superposición de la estructura del monómero de la ATPasa de
Hfx. mediterranei y la de P. horikoshii .........................................................
196
Figura 81: Esquema que representa la secuencia de la CGTasa de Hfx.
mediterranei ..............................................................................................
197
Figura 82: Predicción de la estructura secundaria de la CGTasa de Hfx.
mediterranei ..............................................................................................
199
Figura 83: Esquema que muestra los dominios de la CGTasa de Hfx.
mediterranei y los residuos catalíticos ..........................................................
202
Figura 84: Alineamiento de la secuencia de aminoácidos correspondiente a
la CGTasa de Hfx. mediterranei con otras homólogas ..................................
202
Figura 85: Filograma realizado a través del programa PHYLIP con la opción
neighbor-joining con la CGTasa ................................................................
208
Figura 86: Representación esquemática de la estructura terciaria de la
CGTasa de Hfx. mediterranei en el que se han identificado los cinco
dominios típicos de esta familia de proteínas ...............................................
210
Figura 87: Superposición de la estructura de la CGTasa de Hfx. mediterranei
y la de B. stearothermophilus ......................................................................
210
Figura 88: Electroforesis de agarosa al 1,5 % de PCR de amplificación ......... 213
Figura 89: Electroforesis de agarosa al 1,5 % de PCR de amplificación ......... 214
Figura 90: Electroforesis de agarosa al 1 % de plásmidos pSTBlue-1
transformados ...........................................................................................
215
Figura 91: Electroforesis de agarosa al 1 % de digestión de plásmido
recombinante pSTBlue-1-amy y pET-3a .......................................................
216
Figura 92: Electroforesis de agarosa al 1 % de plásmidos pET-3a
transformados ...........................................................................................
217
Apéndice IV
310
Figura 93: SDS-PAGE de la CGTasa recombinante a diferentes temperaturas 219
Figura 94: Localización de la CGTasa recombinante mediante SDS-PAGE ..... 220
Figura 95: Renaturalización de la CGTasa recombinante en tampón Tris-HCl
20 mM pH 7,5 a diferentes concentraciones de NaCl ..................................
222
Figura 96: Renaturalización de la CGTasa recombinante en tampón Tris-HCl
20 mM pH 7,5 a diferentes concentraciones de KCl .....................................
223
Figura 97: Renaturalización de la CGTasa recombinante en tampón Tris-HCl
20 mM pH 7,5, NaCl 2 M a diferentes concentraciones de CaCl2 .................
224
Figura 98: Cromatograma de la purificación en Sepharosa 6B- -ciclodextrina
de la CGTasa recombinante .......................................................................
225
Figura 99: Cromatograma de la purificación en Sephacryl S-200 de la
CGTasa recombinante ...............................................................................
226
Figura 100: SDS-PAGE correspondiente al proceso de purificación de la
CGTasa recombinante ...............................................................................
227
Figura 101: Gel de electroforesis de poliacrilamida en condiciones nativas de
la CGTasa nativa y recombinante ...............................................................
228
Figura 102: Efecto de la concentración de sal sobre la actividad CGTasa
recombinante ............................................................................................
229
Figura 103: Efecto del pH sobre la actividad CGTasa recombinante ............. 229
Figura 104: Efecto de la temperatura sobre la actividad CGTasa
recombinante ............................................................................................
230
Figura 105: Termoestabilidad de CGTasa recombinante a una concentración
de 1 M NaCl ............................................................................................
231
Figura 106: Termoestabilidad de CGTasa recombinante a una concentración
de 2 M NaCl ............................................................................................
231
Figura 107: Termoestabilidad de CGTasa recombinante a una concentración
de 3 M NaCl ............................................................................................
232
Figura 108: Inactivación de la CGTasa en presencia de concentraciones
crecientes de EDTA ....................................................................................
235
Figura 109: Actividad de ciclación a -ciclodextrina de la CGTasa
recombinante de Hfx. mediterranei ..............................................................
237
Figura 110: Actividad de ciclación a -ciclodextrina de la CGTasa
recombinante de Hfx. mediterranei ..............................................................
237
Figura 111: Actividad de ciclación a -ciclodextrina de la CGTasa
recombinante de Hfx. mediterranei ..............................................................
238
Figura 112: Actividad de acoplamiento a -ciclodextrina de la CGTasa
recombinante de Hfx. mediterranei ..............................................................
239
Figura 113: Actividad de acoplamiento a -ciclodextrina de la CGTasa
recombinante de Hfx. mediterranei ..............................................................
239
Figura 114: Actividad de transferencia de la CGTasa recombinante de Hfx.
mediterranei ..............................................................................................
241
Apéndice IV
311
Figura 115: Representación doble inversa de la velocidad inicial frente a la
concentración de almidón para la actividad de hidrólisis de la CGTasa
recombinante de Hfx. mediterranei ..............................................................
243
Figura 116: Representación doble inversa de la velocidad inicial frente a la
concentración de almidón para la actividad de ciclación a -ciclodextrina de
la CGTasa recombinante de Hfx. mediterranei .............................................
244
Figura 117: Cromatografía en capa fina de los productos de la reacción de
la CGTasa recombinante ...........................................................................
245
Apéndice V
312
APÉNDICE V: Índice de tablas
Tabla 1: Oligonucleótidos empleados para la obtención de la sonda para la
búsqueda del gen de la CGTasa de Hfx. mediterranei .................................
59
Tabla 2: Concentraciones de todos los componentes de la reacción utilizada
para generar los productos inciales de PCR .................................................
60
Tabla 3: Oligonucleótidos empleados para la secuenciación del gen de la
CGTasa de Hfx. mediterranei .....................................................................
69
Tabla 4: Oligonucleótidos empleados para la amplificación del gen de la
CGTasa de Hfx. mediterranei .....................................................................
73
Tabla 5: Concentraciones de los reactivos empleados para la amplificación
del gen de la CGTasa de Hfx. mediterranei .................................................
73
Tabla 6: Proceso de purificación de la CGTasa de Hfx. mediterranei ............ 89
Tabla 7: Tiempos de vida media a distintas temperaturas y concentraciones
de sal de la CGTasa de Hfx. mediterranei ...................................................
99
Tabla 8: Parámetros termodinámicos a distintas temperaturas y
concentraciones de sal de la CGTasa de Hfx. mediterranei ..........................
101
Tabla 9: Recuperación de la actividad con diferentes concentraciones de
CaCl2 tras la inactivación con EDTA de la CGTasa de Hfx. mediterranei .......
103
Tabla 10: Especificidad de sustratos de CGTasa de Hfx. mediterranei ........... 109
Tabla 11: Constantes cinéticas calculadas a partir de velocidades iniciales
con las actividades de hidrólisis y de ciclación a -ciclodextrina de la CGTasa
de Hfx. mediterranei ..................................................................................
110
Tabla 12: Secuencia aminoacídica de los péptidos obtenidos mediante
LC/MS .....................................................................................................
114
Tabla 13: Comparación de los péptidos DVIYQIVTDR, LWLIKIDGIR,
VDAVAHMP y FSNDSGMSIIDFR de Hfx. mediterranei con las bases de datos
115
Tabla 14: Composición de aminoácidos correspondiente a la proteína de
unión a maltosa de Hfx. mediterranei, Har. marismortui, T. litoralis y E. coli
156
Tabla 15: Porcentajes de identidad y similaridad entre la proteína de unión a
maltosa de Hfx. mediterranei y de otros organismos del Dominio Archaea .....
162
Tabla 16: Composición de aminoácidos correspondiente a la permeasa malF
de Hfx. mediterranei, Har. marismortui, P. abyssi y E. coli .............................
166
Tabla 17: Regiones transmembrana identificadas en la permeasa (malF) del
transportador de maltosa tipo ABC de Hfx. mediterranei ..............................
169
Tabla 18: Porcentajes de identidad y similaridad entre la permeasa (malF) de
Hfx. mediterranei y la de otros organismos del Dominio Archaea ..................
173
Tabla 19: Composición de aminoácidos correspondiente a la permeasa
malG de Hfx. mediterranei, Har. marismortui, P. kodakaraensis y E. coli .......
176
Tabla 20: Regiones transmembrana identificadas en la permeasa (malG) del
transportador de maltosa tipo ABC de Hfx. mediterranei ..............................
179
Apéndice V
313
Tabla 21: Porcentajes de identidad y similaridad entre la permeasa (malG)
de Hfx. mediterranei y la de otros organismos del Dominio Archaea .............
183
Tabla 22: Composición de aminoácidos correspondiente a la proteína de
unión a ATP de Hfx. mediterranei, Har. marismortui, P. furiosus y E. coli ........
187
Tabla 23: Porcentajes de identidad y similaridad entre la ATPasa de Hfx.
mediterranei y la de otros organismos del Dominio Archaea .........................
193
Tabla 24: Composición de aminoácidos correspondiente a la CGTasa de
Hfx. mediterranei, T. thermosulfurogenes, P. furiosus y B. stearothermophilus
198
Tabla 25: Porcentajes de identidad y similaridad entre la CGTasa de Hfx.
mediterranei y la de otros organismos del Dominio Archaea y Bacteria ..........
207
Tabla 26: Renaturalización de la CGTasa recombinante en tampones con
diferente pH y a diferentes diluciones ..........................................................
221
Tabla 27: Proceso de purificación de la CGTasa recombinante de Hfx.
mediterranei .............................................................................................
226
Tabla 28: Tiempos de vida media a distintas temperaturas y concentraciones
de sal de la CGTasa nativa y recombinante de Hfx. mediterranei ..................
233
Tabla 29: Parámetros termodinámicos a distintas temperaturas y
concentraciones de sal de la CGTasa nativa y recombinante de Hfx.
mediterranei .............................................................................................
234
Tabla 30: Recuperación de la actividad con diferentes concentraciones de
CaCl2 tras la inactivación con EDTA de la CGTasa nativa y recombinante de
Hfx. mediterranei ......................................................................................
236
Tabla 31: Especificidad de sustratos de CGTasa de Hfx. mediterranei ........... 242
Tabla 32: Constantes cinéticas calculadas a partir de velocidades iniciales
con las actividades de hidrólisis y de ciclación a -ciclodextrina de la CGTasa
de Hfx. mediterranei ..................................................................................
243
Tabla 33: Mutaciones que afectan a las reacciones catalizadas por las
CGTasas y a la producción de ciclodextrinas ...............................................
256
