CARACTERIZACION DE LAS PROTEINAS...llamados a y b; la diferencia de energía entre ellos es...
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CARACTERIZACION DE LAS PROTEINAS ELECTROFORESIS MONO Y BIDIMENSIONAL, DETERMINACION DEL PESO MOLECULAR Y DE LAS ESTRUCTURAS PRIMARIA, SECUNDARIA Y TERCIARIA.
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CARACTERIZACION DE LAS
PROTEINAS
ELECTROFORESIS MONO Y
BIDIMENSIONAL, DETERMINACION DEL
PESO MOLECULAR Y DE LAS
ESTRUCTURAS PRIMARIA,
SECUNDARIA Y TERCIARIA.
ELECTROFORESIS.
Es la migracion de una macromolecula (proteina, DNA,
RNA) en un campo electrico.
Electroforesis en gel de poliacrilamida: en condiciones
nativas (PAGE) o en presencia de SDS (SDS-PAGE).
Isoelectroenfocado ( IEF): Separación por punto isoeléctr ico
(pI) .
Electroforesis bidimensional en gel de poliacrilamida (2D -
PAGE): IEF en una primera dimensión, SDS-PAGE en la
segunda.
ISOELECTROENFOCADO: Separación por pI.
Las proteínas se corren en un gradiente de pH preformado, que se obtiene
sometiendo a electroforesis previa una mezcla de polianfolitos (polímeros
pequeños con múltiple carga) con diferentes valores de pI. En A se carga
la muestra y se aplica el voltaje, con lo cual las proteínas migrarán hasta
llegar al valor de su pI, donde, al no tener carga neta, quedarán
enfocadas, lo que se observa en B.
Electroforesis bidimensional (2D-PAGE)
DETERMINACIÓN DEL PESO MOLECULAR DE LAS
PROTEINAS.
M r = masa molecular relativa (por ejemplo, 50,000)
Masa molecular: Por ejemplo 50,000 daltons (50 kDa) .
A) Proteína nativa:
1) Ultracentrifugación.
2) Filtración por gel.
3) Espectrometría de masa.
B) Subunidad:
1) Electroforesis en gel de poliacrilamida en
presencia de dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE).
Espectrometría de Masa
• La Espectrometría de Masa es una técnica quepermite determinar la masa de moleculas pormedio de la medida de la relacion masa/carga (m/z).
• La medida de masas moleculares involucra laproduccion, separación y detección de ionesmoleculares en fase gaseosa.
•Cada molécula puede originar iones moleculares
con distinto número de cargas ( y distintas m/z).
Un espectrómetro de masa consiste de tres módulos:
1) Fuente de iones.
2) Analizador de masas.
3) Sistema de detección y adquisición de datos.
Técnicas actuales para trabajo biológico:
1) MALDI-ToF MS (desorción/ionización por laser asistida por
matriz, combinada con análisis de masas por tiempo de vuelo)
2) ES/MS (ionización por electrospray combinada con análisis de
masas por cuadrupolo)
Espectrometro
de masa,
MALDI-ToF
La muestra de
proteína se mezcla
con una matriz que
absorbe luz UV, y se
irradia con un laser
para ionizarla. Los
iones se aceleran con
una energía cinética
de 20-25 KeV, y se
separan en el tubo de
vuelo. El tiempo de
vuelo es proporcional
al valor de m/z
DETERMINACION DE LA
ESTRUCTURA PRIMARIA
SECUENCIACION DE PROTEINAS Y PEPTIDOS.
Para secuenciar una proteína siempre se debe partir de
la proteína purificada. La purificación puede consistir
en obtener la proteína pura en un tubo, a través de los
métodos de purificación ya mencionados, o, aún si no
está completamente homogénea, como una banda
discreta en un gel de SDS-PAGE.
Para secuenciar una proteína siempre se la debe
fragmentar para obtener péptidos de menor tamaño,
secuenciables por distintos procedimientos. Esta
fragmentación se hace enzimáticamente (proteasas) o
químicamente (p.ej.: BrCN).
Una vez fragmentada la proteína en péptidos de
una tamaño mediano, pueden aplicarse dos
métodos: el método de Edman, que implica
degradación química, y la espectrometría de
masa, que determina la secuencia en base a la
masa de los productos de fragmentación del
péptido.
Método de Edman
Previa separación de los péptidos por HPLC en
fase reversa, secuenciarlos químicamente por
reacción con el reactivo de Edman, isotiocianato
de fenilo, en un secuenciador automático.
1er.Ciclo
2
3er.
DEGRADACI
ON DE
EDMANREACCION DEL
RESIDUO N-
TERMINAL CON
ISOTIOCIANATO
DE FENILO
1er. Ciclo
2o. Ciclo
3er. Ciclo
Secuenciación
automática
por el método
de Edman
Identificación de proteínas por espectrometría de
masa
Sin separar los péptidos, determinar las masas de un cierto
número de los mismos por MS e identificar a la proteína en los
bancos de datos por comparación con las masas de digeridos
virtuales de todas las proteínas ya secuenciadas. Optimo cuando
el genoma del organismo del cual proviene la proteína está
completamente secuenciado.
Secuenciación de proteínas por espectrometría
de masa
Seleccionar un péptido determinado por MS y fragmentarlo,
obteniendo su secuencia a partir de las masas de los fragmentos
resultantes (MS/MS, espectrometría de masa en tandem con
cámara de colisión, o PSD, decaimiento después de la fuente ,
Post Source Decay).
DETERMINACIÓN DE LA
ESTRUCTURA
TRIDIMENSIONAL DE LAS
PROTEÍNAS.
RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR
(NMR)
Se basa en las propiedades magnéticas de átomos como el 1H, el31P o el 13C. Requiere el uso de aparatos de NMR de alta
potencia (hasta 800 MHz). Utiliza proteínas en solución
concentrada, por lo que no se requiere su cristalización. Pero es
aplicable a proteínas de tamaño relativamente pequeño, hasta
unos 30 – 40 kDa.
En los casos en que se ha hecho la comparación experimental, la
estructura de una proteína determinada por ambos métodos (NMR
y cristalografía) es muy similar. Ello se debe a que lo cristales
tienen una alto contenido de agua, y la conformación que adopta
la proteína será muy similar a la que tiene en solución.
PROPIEDADES MAGNETICAS DE ISOTOPOS
NUCLEARES
Isótopo Spin Abundancia natural
1H 1/2 99.98 %
13C 1/2 1.108 %
15N 1/2 0.37 %
31P 1/2 100 %
Los núcleos atómicos tienen rotación (spin). Los núcleos con
un valor de ½ tienen un momento magnético asociado.
Cuando se aplica un campo magnético externo, este momento
puede adoptar una de dos orientaciones o estados de spin,
llamados a y b; la diferencia de energía entre ellos es
proporcional a la fuerza del campo magnético aplicado. El estado
a tiene menor energía que b, y es el más poblado, pero la
diferencia es muy pequeña (en general, por un factor de 1.00001)
Si se aplica ahora un pulso de radiación electromagnética (un
pulso de radiofrecuencia) se pasa de a a b, si la frecuencia
corresponde a la diferencia de energía entre a y b.
Un espectro de resonancia se puede obtener variando el campo
magnético a frecuencia constante, o variando la radiofrecuencia a
campo magnético constante. Se hace esto último.
“Un aparato de NMR es basicamente una radio de
frecuencia modulada grande y muy cara”.
Los electrones generan un pequeño campo
magnético local, que se opone al campo aplicado, y
depende de la densidad electrónica que rodea al
núcleo.
Por eso, núcleos en diferentes ambientes resonarán
a frecuencias ligeramente diferentes.
Las diferentes frecuencias, conocidas como
desplazamiento químico, se expresan como partes
por millón (ppm), relativas a los desplazamientos de
un standard, usualmente tetrametilsilano.
ESPECTROS DE NMR UNIDIMENSIONAL.
(A) Espectro de 1H-NMR del etanol. (B) Espectro de 1H-
NMR de un fragmento (55 residuos de aminoacidos) de una
proteina.
CRISTALOGRAFIA
DE RAYOS X DE
PROTEINASLos rayos de luz visible son difractados por el objeto y
enfocados por una lente.
Los Rayos X no pueden ser enfocados por lentes.
La difracción de los Rayos X por una sola molécula es muy
débil. Por esa razón usamos cristales de proteína para
incrementar la señal.
Medimos la dirección e intensidad de los rayos difractados y
utilizamos una computadora para reconstruir la imagen.
¿Qué son los cristales?
Los cristales son arreglos de moléculas ordenados.
Los cristales de macromoléculas como las proteínas se
mantienen unidos por fuerzas iónicas débiles entre las distintas
moléculas.
Contienen aproximadamente un 40% de solvente.
La estructura cristalina es similar a la de solución
Los cristales de enzimas en general retienen la actividad
enzimática.
Diferentes formas de cristalización producen la misma
estructura.
Estructuras resueltas por RMN son similares a las de rayos X.
Puede haber diferencias significativas en loops y aminoácidos
de superficie.
¿Cómo se producen cristales?
Disminuimos gradualmente la solubilidad de la proteína de
manera que produce una precipitación ordenada (cristalización)
en vez de una precipitación desordenada (amorfa)
Ejemplos de
diversos tipos
de cristales de
proteínas.
El experimento de difracción de Rayos X.
Puede hacerse en un difractor de laboratorio, usando los rayos X con una
l de 1.54 A, obtenidos acelerando electrones contra una pieza de cobre, o
usando rayos X de l variable, obtenidos en un sincrotrón.
El Sincrotron.Acelera una corriente de electrones hasta una velocidad cercana a la de la luz,
que al ser desviados por un campo magnético, generan la llamada luz
sincrotrón.
Imagen de difracción.
Cada rayo difractado
impactado en el film
produce una reflexión
que puede ser
descripta como la
suma de las
contribuciones de
todos los elementos
que producen
dispersión en la celda
unidad
Los electrones de los átomos que forman la proteína son los que dispersan los
Rayos X. La amplitud de la onda dispersada por un átomo es proporcional a su
número de electrones. Un átomo de C dispersa seis veces mas intensamente que
uno de H.
Las ondas dispersadas se recombinan. Cada átomo contribuye a cada haz
dispersado. Las ondas dispersadas se refuerzan una a la otra en la película o en el
detector si están en fase, o se anulan si están fuera de fase.
La forma en que las ondas dispersadas se recombinan depende únicamente del
ordenamiento de los átomos.
Se mide la intensidad de cada mancha y estas intensidades y sus posiciones son los
datos experimentales básicos para el análisis cristalográfico de Rayos X.
La imagen se forma aplicando la transformada de Fourier, que asigna para cada
mancha una onda de densidad electrónica que es proporcional a la raíz cuadrada
de la intensidad observada en la mancha.
Cada onda tiene también una fase, que se pierde y debe determinarse
separadamente. Esto se ha dado en llamar el Problema de las Fases, que se
resuelve básicamente por tres métodos 1) derivados de átomos pesados (reemplazo
isomorfo), 2) dispersión anómala y 3) reemplazo molecular.
MAPAS DE DENSIDAD ELECTRÓNICA Y RESOLUCIÓN
Con los datos obtenidos, se calcula el mapa de densidad electrónica, que nos da
la densidad de los electrones en un gran número de puntos espaciados
regularmente en el cristal.
La resolución de los análisis de Rayos X está determinada por el número de
intensidades dispersas usadas en la síntesis de Fourier.
RefinamientoA los mapas iniciales se les realiza un ciclo de refinamiento
y modificaciones que consisten en ajustar los datos
iniciales al modelo.
Las intensidades no se modifican.
Se cambian las fases.
El ajuste se sigue por indicadores (R y Rfree).
Se chequea que la estereoquímica sea compatible con lo
conocido (usando el gráfico de Ramachandran).
La imagen que se obtiene es un modelo de la molécula. No
se muestran la estructura e interacciones sino que están
dibujadas. Las moléculas están en estado cristalino, no en
solución. Los modelos corresponden a un promedio de
mas de 1000 moléculas de proteína presentes en el cristal.
Además las estructuras están promediadas en el tiempo
que dura el experimento de cristalografía.
