Caracterización y estudio electroquímico de superficies de ...

Caracterización y estudio electroquímico

de superficies de Ti inmersas en medio

fisiológico y en cultivo celular

Tesis doctoral

Laura Burgos Asperilla

2012

FACULTAD DE CIENCIAS

Dpto. de Química Física Aplicada

Caracterización y estudio electroquímico de superficies de

Ti inmersas en medio fisiológico y en cultivo celular

Tesis doctoral

Laura Burgos Asperilla

2012

Directores

Concepción Alonso Fuente

Profesor Titular

Dpto. Química Física Aplicada (UAM)

Mª Cristina García Alonso

Científico Titular

Dpto. Ingeniería de Superficies, Corrosión y

Durabilidad. (CENIM-CSIC)

A mi familia

Agradecimientos

Una vez finalizado este trabajo, a veces lleno de dificultades y obstáculos, es

inevitable que te asalte un sentimiento egocéntrico que hace que centres la mayor

parte del mérito en el trabajo realizado por ti misma. Sin embargo, desde un punto de

vista objetivo, me doy cuenta que la realización de esta Tesis Doctoral no hubiera sido

posible sin la participación de personas e instituciones que han facilitado y hecho

posible este trabajo.

Me gustaría agradecer en primer lugar a la Dra. Concepción Alonso Fuente y a

la Dra. Mª Cristina García Alonso, las directoras de esta Tesis Doctoral, por la

confianza que depositaron en mi al aceptarme en su grupo de trabajo. Además, les

tengo que agradecer su paciencia, ayuda, dedicación, apoyo, motivación y

seguimiento que he recibido durante estos cinco años de arduo trabajo.

Además, también quiero agradecer a todo el departamento de Química Física

Aplicada de la Universidad Autónoma de Madrid por haberme acogido y tratado tan

bien en todo este tiempo y en concreto a la universidad por concederme el contrato

que me ha permitido realizar este trabajo.

Tengo que agradecer de forma especial y sincera al Dr. Jose Luis García Fierro y

a la Dra. Irene Llorente Carrasco por la ayuda prestada en la realización de los análisis

de XPS. De nuevo, agradecer a la Dra. Irene Llorente Carrasco por la realización de las

imágenes de AFM y a Alfonso García Delgado por su ayuda en la utilización del SEM. A

Alessandro Scapoli por la realización de la foto de la portada y a Cecilia Fernández

Martí por sus sugerencias.

Quiero agradecer también al Prof. Eduardo Ruiz Hitzky, la Dra. Pilar Aranda y a

la Dra. Margarita Darder Colom porque gracias a ellos, que me dieron la oportunidad

de trabajar en el ICMM, inicié mi aventura en el mundo de la investigación. Además,

gracias a todo el grupo de gente que me hizo más amena mi estancia allí y sobretodo

GRACIAS Almudena por ser mi Amiga, por ayudarme en todo lo que has podido, por

estar ahí en los buenos y los malos momentos, no solo en el trabajo en el ICMM, sino

gracias también por formar parte de mi vida y dejarme ser también parte de la tuya.

Gracias por tus risas, por hacerme los viajes al trabajo tan amenos y por tu curiosidad

incansable (Raul creo que me entiendes ¿verdad?). Suerte en vuestro nuevo

proyecto…………os quiero.

Gracias a la familia del CENIM: María C., Heidys, Iván, Jesús, Antonio, Miliki,

Emilio, Belén, Dani, Fernando, Violeta, Edgar, Rodrigo, Manuel, Alejandro, Juan Carlos,

Amir, Óscar, Blanca y Cris, por haberme acogido tan bien y haberme dado tantos

momentos alegres y divertidos, no sabéis cuanto echo de menos vuestras risas,

bromas “invisibles”, habilidades ocultas, etc. Porque al final pasamos más tiempo

juntos que con nuestras respectivas familias y ya se sabe que el roce hace el cariño, os

quiero. Además, quisiera agradecer a María su generosidad, sugerencias y sinceridad.

También añoro los desayunos a horas intempestivas con Jose Mª y Pedro Pablo.

Gracias por compartir conmigo vuestras historias, por vuestros consejos y

sugerencias, y por enseñarme cada día “El museo del bujero”. En esta gran familia no

puede faltar “la cuchipandi” (que no me olvido de vosotros). Diana, te agradezco tu

sensatez, sinceridad y tu espíritu de lucha, siempre se aprende algo nuevo a tu lado.

Mónica, gracias por dejarme conocerte mejor, por compartir conmigo esos momentos

difíciles, por escucharme y comprenderme y darme ánimo cuando lo he necesitado.

Irene, aunque no terminamos de colaborar juntas, a nivel personal me has aportado

mucho. Gracias por los consejos, por serenarme y ponerme los pies en el suelo

cuando me acelero. Y por último, pero no menos importante, Santi. Gracias por

hacerme reír, por animarme en los bajones, por poner banda sonora a la jornada

laboral (sobretodo los viernes). Por compartir conmigo tus cosas, por escuchar las

mías, porque nunca dejaré de soñar gracias a ti, tq. A toda la Cuchipandi, deciros que

gracias por acompañarme y aguantarme en los paréntesis de las 12, ya sabéis hora

Coca-cola Zero, os echo mucho de menos, os quiero y os llevaré siempre conmigo.

A mis AMIGOS de la UAM: Miriam, gracias por tu paciencia infinita, por

escucharme, ayudarme y aconsejarme. Sabes que sin ti, hubiera sido todo muchísimo

más difícil, gracias por estar ahí, tq. Ana, Ángel y Vero gracias por acogerme tan bien

en vuestro grupo, por compartir conmigo las comidas, vuestras historias y por

escucharme y animarme cuando lo he necesitado. Ana, gracias por esas sesiones de

“hierbas”, por tu generosidad, quiero que sepas que eres muy importante para mí,

que te admiro por ese tesón que tienes como madre y amiga. Ángel y Vero, aunque el

destino ha querido que nuestras vidas se separen os llevaré siempre en el corazón. A

los tres os quiero.

Me gustaría agradecer enormemente a Merce, Isa e Isabel ya que aunque

indirectamente, también habéis tenido un papel muy importante en este trabajo.

Gracias por animarme, aconsejarme, entenderme y por compartir conmigo esos ratos

en los que gracias a vosotras desconecto de la tesis.

Cómo no, también agradezco a mi familia por hacerme tan feliz y por

enseñarme que hay una vida después del trabajo:

Gracias Mamá y Papá por todo lo que habéis hecho por mí, desde el minuto 1

de mi vida siempre habéis estado ahí para todo y seguís estando. Gracias por

ser mis padres. Ya sabéis que para mi sois los mejores padres del mundo. Os

AMO.

A mi hermano Daniel y a mi cuñada Irene, os agradezco las risas, los llantos

(verdad Dani, vaya infancia más buena), los ratos juntos viendo pelis…Gracias

por estar ahí. Os quiero.

Gracias también a mi cuñado y a mis suegros por toda la ayuda, cariño y

buenos momentos que hemos pasado juntos. Os Quiero.

A mi Cachorro (Chema, no podías faltar), te agradezco todo el amor que me

das, las risas, las discusiones, los altos y los bajos, pues de cada momento hay

que sacar las cosas positivas. Gracias por animarme, por no dejar que me

estrelle, por aconsejarme, por quererme tal cual y sobretodo por darme lo

mejor que tengo en esta vida, Hugo. Te quiero mucho Cacho.

Hugo, eres lo mejor que me ha pasado en la vida y gracias a ti he aprendido a

valorar las cosas de otra manera. Perdóname por las ausencias y gracias por

todos los momentos de felicidad incondicional que me das. Te Quiero, Te

Adoro y Te amo.

Para terminar no se me olvida una frase que me escribió en la carpeta un amigo de la

infancia y que creo que es mi meta en la vida:

“No consiste en llenar la vida de años, sino los años de vida”

Índice

1. Introducción

1.1 Definición y requisitos de un biomaterial. Problemática ............................................ 1

1.2 Titanio ...................................................................................................................... 4

1.3 Modificaciones superficiales del titanio .................................................................... 9

1.4 Estudio de la interfase Ti/medio fisiológico ............................................................. 15

1.5 Estudio de la interfase Ti/Células ............................................................................ 22

1.5.1 Comportamiento celular ante el implante metálico o biomaterial ..................................... 22

1.5.2 Estudio de las interacciones electroquímicas de la interfase Ti/Células ............................. 24

1.5.3 Estudio de la adhesión celular mediante la microbalanza de cristal de cuarzo (QCM) ....... 27

2. Objetivos y Plan de Trabajo ....................................................................... 29

3. Materiales y métodos ............................................................................... 33

3.1 Materiales .............................................................................................................. 35

3.1.1 Electrodos ............................................................................................................................ 35

3.1.1.1 Electrodos de trabajo ................................................................................................... 35

3.1.1.2 Electrodos de referencia .............................................................................................. 37

3.1.1.3 Electrodo auxiliar o contraelectrodo ........................................................................... 37

3.1.2 Celda electroquímica ........................................................................................................... 37

3.2 Reactivos y disoluciones ......................................................................................... 40

3.3 Fundamento teórico de las técnicas utilizadas ........................................................ 41

3.3.1 Técnicas de caracterización ................................................................................................. 41

3.3.1.1 Espectroscopía fotoelectrónica de rayos-X (XPS) ........................................................ 41

3.3.1.2 Microscopía de fuerza atómica (AFM) ......................................................................... 43

3.3.1.3 Microscopía electrónica de barrido (SEM) y microanálisis por dispersión de

rayos X (EDX) ............................................................................................................................ 45

3.3.2 Experimentación con cultivos celulares ............................................................................... 47

3.3.3 Técnicas electroquímicas ..................................................................................................... 50

3.3.3.1 Potencial de corrosión ................................................................................................. 50

3.3.3.2 Curvas de polarización. Pendientes de Tafel ............................................................... 52

3.3.3.3 Espectroscopía de impedancia electroquímica (EIS) ................................................... 55

3.3.4 Microbalanza de cristal de cuarzo (QCM) ............................................................................ 61

3.4 Equipos................................................................................................................... 64

3.4.1 Microscopio electrónico de barrido (SEM) y microanálisis por dispersión de

rayos X (EDX) ................................................................................................................................. 64

3.4.2 Microscopio de fuerza atómica (AFM) ................................................................................. 64

3.4.3 Espectrómetro fotoelectrónico de rayos-X (XPS) ................................................................ 65

3.4.4 Potenciostato ....................................................................................................................... 65

3.4.5 Microscopio óptico invertido ............................................................................................... 66


3.5 Metodología ........................................................................................................... 67

3.5.1 Técnicas de caracterización ................................................................................................. 67


rayos X (EDX) ............................................................................................................................ 69


3.5.1.3 Espectroscopía fotoelectrónica de rayos-X (XPS) ......................................................... 69

3.5.2 Ensayos en cultivos celulares ............................................................................................... 69

3.5.3 Técnicas electroquímicas ..................................................................................................... 72

3.5.3.1 Potencial de corrosión .................................................................................................. 72

3.5.3.2 Curvas de polarización ................................................................................................. 72

3.5.3.3 Espectroscopía de impedancia electroquímica (EIS).................................................... 73


4. Resultados y discusión ............................................................................... 77

4.1 Estudio de la interfase Ti-Q/componentes del DMEMc ............................................ 79

4.1.1 Caracterización de Ti-Q ........................................................................................................ 79

4.1.1.1 Microscopía electrónica de barrido (SEM) ................................................................... 79


4.1.1.3 Espectroscopía fotoelectrónica de rayos X (XPS) ......................................................... 80

4.1.2 Microbalanza de cristal de cuarzo (QCM) ....................................................................... 82

4.1.3 Caracterización de las muestras de Ti-Q en los distintos componentes del DMEMc

por espectroscopía fotoelectrónica de rayos X (XPS) .................................................................. 87

4.1.4 Estudio electroquímico del Ti-Q sumergido en los distintos componentes del DMEMc .... 95

4.1.4.1 Evolución del potencial de corrosión con el tiempo de ensayo ................................... 95

4.1.4.2 Curvas de polarización ................................................................................................. 96

4.1.4.3 Espectroscopía de impedancia electroquímica (EIS).................................................. 101

4.1.5 Discusión ............................................................................................................................ 113

4.2 Estudio de la interfase Ti-Q/Osteoblastos Saos-2 .................................................. 119

4.2.1 Microscopía electrónica de barrido (SEM) ........................................................................ 119

4.2.3 Microbalanza de cristal de cuarzo (QCM) .......................................................................... 121

4.2.4 Estudio electroquímico del Ti-Q sumergido en cultivos de osteoblastos Saos-2 .............. 124

4.2.4.1 Evolución del potencial de corrosión con el tiempo de ensayo ................................. 125

4.2.4.2 Curvas de polarización ............................................................................................... 126

4.2.4.3 Espectroscopía de impedancia electroquímica (EIS) ................................................. 128

4.2.5 Discusión ............................................................................................................................ 135

4.3 Estudio de la interfase Ti-TT/componentes del DMEMc ........................................ 139

4.3.1 Caracterización de las superficies de Ti ............................................................................. 139


energía de rayos X (EDX) ........................................................................................................ 139

4.3.1.2 Microscopía de fuerza atómica (AFM) ....................................................................... 140

4.3.1.3 Espectroscopía fotoelectrónica de rayos X (XPS) ...................................................... 142

4.3.1.4 Cálculo del espesor de óxido de titanio mediante espectroscopía de

impedancia electroquímica. ................................................................................................... 144

4.3.2 Caracterización del Ti-TT en los distintos componentes del DMEMc por

espectroscopía fotoelectrónica de rayos X (XPS) ....................................................................... 145

4.3.3. Estudio electroquímico del Ti-TT sumergido en los distintos componentes del

DMEMc ....................................................................................................................................... 151



4.3.3.3 Espectroscopía de impedancia electroquímica (EIS) ................................................. 157

4.3.4 Discusión ............................................................................................................................ 171

4.4 Estudio de la interfase Ti-TT/Osteoblastos Saos-2 ................................................. 179

4.4.1 Curva de crecimiento de Osteoblastos Saos-2 .................................................................. 179

4.4.2 Microscopía electrónica de barrido (SEM) ........................................................................ 180

4.4.3 Caracterización del Ti-TT sumergido en DMEMc y en cultivos de Saos-2 por

espectroscopía fotoelectrónica de rayos X (XPS) ....................................................................... 181

4.4.4. Caracterización electroquímica del Ti-TT sumergido en DMEMc y en cultivos

de osteoblastos Saos-2 ............................................................................................................. 185



4.4.4.3 Espectroscopía de impedancia electroquímica (EIS).................................................. 189

4.4.5 Discusión ............................................................................................................................ 195

5. Conclusiones ............................................................................................ 201

6. Bibliografía .............................................................................................. 207

7. Anexos ..................................................................................................... 221

7.1 Composición del DMEM ........................................................................................ 223

7.2 Composición bioquímica y hormonal del FBS ......................................................... 224

7.3 Diagrama de Pourbaix para el titanio .................................................................... 225

7.4 Curva de Volcano .................................................................................................. 226

7.5 Índice de figuras ................................................................................................... 227

7.6 Índice de tablas ..................................................................................................... 232

1. Introducción

1. Introducción 1

1.1 Definición y requisitos de un biomaterial. Problemática

Se puede definir un biomaterial como un material farmacológicamente inerte,

sintético o natural diseñado para sustituir o reforzar la función de un tejido o un

órgano. Para que un biomaterial pueda ser implantado en el cuerpo humano, debe

estar constituido por un material biológicamente compatible; es decir, que no

provoque su rechazo, que cuente con una elevada resistencia a la corrosión y unas

propiedades mecánicas adecuadas.

Tabla 1. Tipos de materiales sintéticos, ventajas, desventajas y aplicaciones de biomateriales utilizados en implantes.

Materiales Ventajas Desventajas Aplicaciones

Polímeros: Silicona, Teflón, Dacron,

Nylon.

Elásticos, fácil de fabricar, baja densidad.

Baja resistencia mecánica, degradación

con el tiempo.

Suturas, arterias, venas, nariz, orejas,

tendones.

Metales: Ti y sus aleaciones, Co-Cr,

aceros inoxidables.

Buenas propiedades mecánicas

Baja biocompatibilidad, corrosión en medios

fisiológicos, alta densidad.

Fijación ortopédica: tornillos, clavos, alambres, placas,

barras intermedulares,

implantes dentales.

Cerámicas: Óxidos de Al, aluminatos de Ca,

óxidos de Ti, compuestos de

carbono.

Buena biocompatibilidad,

resistencia a la corrosión, inerte.

Fractura ante esfuerzos de alto impacto, difícil

fabricación, baja resistencia mecánica,

inelásticos, alta densidad.

Bola en prótesis de cadera, implantes

dentales, dispositivos transcutáneos.

Compuestos: Cerámica-metal,

carbono-otro material.

Buena compatibilidad, inerte, resistencia a la

corrosión, alta resistencia a los

esfuerzos.

Carecen de consistencia en la fabricación del

material.

Válvulas cardiacas, uniones óseas, marcapasos.

2 1.1 Definición y requisitos de un biomaterial. Problemática

Existen cuatro grupos de materiales usados como implantes: metálicos,

cerámicos, poliméricos y compuestos de ellos. En la Tabla 1 se contemplan algunas

de las ventajas, desventajas y aplicaciones para los cuatro grupos de materiales.

Si atendemos a las propiedades mecánicas que se requieren para un

determinado implante, dependerá del órgano al que van a reemplazar: no se

necesitan las mismas propiedades funcionales para remplazar una válvula del

sistema cardíaco, que un trasplante de córnea, una pieza dental o una articulación.

Si nos centramos en aplicaciones donde se requiere la sustitución de componentes

óseos, los materiales más utilizados son los metales y/o aleaciones metálicas.

Teniendo en cuenta que más de tres cuartas partes del sistema periódico son

metales, el número de elementos metálicos que se utilizan en la fabricación de

implantes es bastante limitado. Centrándonos en los materiales que van a

remplazar a componentes del aparato locomotor, deben asegurar una buena

transmisión de cargas y distribución de fuerzas entre el hueso y el implante. Es

decir, su módulo elástico [1] debe ser lo más cercano al hueso posible (20 GPa en

zona cortical del hueso). Otras propiedades mecánicas importantes en

aplicaciones osteoarticulares serían: buena resistencia a la tracción, al impacto,

resistencia a la fractura, resistencia al desgaste y a la fatiga [1]. De todas ellas, quizá

las más importantes son las que se refieren a situaciones de carga dinámica, es

decir, desgaste y fatiga.

La biocompatibilidad de un material viene dada por su capacidad para producir

una respuesta apropiada en el organismo. Teniendo en cuenta, que no existe ningún

material totalmente inerte dentro del organismo, se pueden clasificar los

biomateriales atendiendo al grado de biodegradación y a la respuesta biológica que

desencadenan. Así, nos encontramos que pueden ser bioactivos, como la

hidroxiapatita; biodegradables, como el magnesio; bioinertes, como la alúmina y la

zirconia; o biotolerables como los polímeros y metales o aleaciones metálicas como el

acero inoxidable, aleaciones de CoCr y el Ti y sus aleaciones [2]. Los biomateriales se

1. Introducción 3

encuentran expuestos temporal o permanentemente a fluidos del cuerpo. Debido a

esto, es esencial entender las relaciones existentes entre las propiedades, funciones y

estructuras de los materiales biológicos y su interacción con el medio que les rodea,

pues el éxito de un biomaterial o de un implante dependerá de las propiedades y

biocompatibilidad del implante. En los casos de biomateriales metálicos es muy

importante que, la dosis de iones metálicos que puedan liberar a los tejidos vivos, no

interfiera en los procesos metabólicos del cuerpo humano y no provoque situaciones

de rechazo. En cuanto a la resistencia a la corrosión de los materiales metálicos, hay

que tener en cuenta que se encuentran inmersos en un medio hostil como es el

organismo humano, y a temperaturas del orden de 37°C, condiciones que pueden

provocar y favorecer dicha corrosión. No obstante, la mayoría de ellos forman una

capa de óxido en su superficie, protegiendo al metal y disminuyendo drásticamente la

velocidad de corrosión, como ocurre en el acero inoxidable, las aleaciones de CoCr y

el titanio y sus aleaciones.

Como ya se ha señalado, la selección de un determinado biomaterial metálico

dependerá del tipo de aplicación o función a cumplir dentro del cuerpo humano.

Dependiendo de su aplicación dentro del organismo, si es sólo temporal (tornillos,

placas de fijación de fracturas, etc.) se utilizarán aceros inoxidables, el Ta y el Ti-cp (Ti

comercialmente puro); o bien si es permanente (implantes dentales o en prótesis de

cadera o de rodilla, fundamentalmente) en las que entran en juego las aleaciones de

CoCr y las aleaciones de base titanio fundamentalmente, donde las solicitaciones

mecánicas son más exigentes durante un largo periodo de tiempo.

Teniendo en cuenta las excelentes características del titanio, se deduce que, el

titanio y sus aleaciones, son unos de los biomateriales metálicos con mejores

propiedades para ser utilizados en aplicaciones biomédicas, ya sea como implante

temporal o permanente. Entre sus principales cualidades se encuentran unas buenas

propiedades mecánicas (posee el menor módulo elástico de los biomateriales

metálicos) y una excelente biocompatibilidad y resistencia frente a la corrosión. Sin

4 1.2 Titanio

embargo, a pesar de sus buenas propiedades, las elevadas exigencias de las

condiciones fisiológicas en ciertas aplicaciones biomédicas, como las asociadas con el

aparato locomotor, dan lugar a que con el tiempo, se deteriore y tenga que ser

sustituido. Por esta razón, la investigación sobre el titanio en un medio fisiológico tan

exigente continúa evolucionando hacia lugares donde el campo de aplicación es muy

amplio.

1.2 Titanio

El titanio fue descubierto en 1791 (en el mineral menacanita) por el clérigo

británico William Gregor, quien le puso el nombre de “menaquita”. Cuatro años

después, el químico alemán Martin Heinrich Klaproth volvió a descubrir el elemento

en el mineral rutilo, y le llamó titanio, como alusión a la fuerza de los mitológicos

titanes griegos. El titanio es un metal de transición perteneciente al 4º período de la

tabla periódica, de número atómico 22, peso atómico 47,87 g/mol y cuya

configuración electrónica es [Ar] 3d24s2. La capa d, incompleta, hace del titanio un

elemento muy reactivo, que puede adoptar las valencias +2, +3 y +4 y, además,

formar disoluciones sólidas con muchos elementos sustitucionales [3]. Este metal de

transición ocupa el noveno lugar entre los elementos más abundantes en la corteza

terrestre (su concentración es del 0,8% en peso del total) y el cuarto entre los metales

más empleados habitualmente, después del Al, Fe y Mg [4]. El titanio se encuentra

muy diseminado en la Tierra en forma de dióxidos de titanio y diversas clases de

titanatos en minerales como la ilmenita, la anosovita, el rutilo y la pseudobrookita. Las

menas que contienen minerales de titanio están ampliamente distribuidas y son

muchos los países que poseen depósitos explotables. Los minerales principales, la

ilmenita (FeO·TiO2) y el rutilo (TiO2), se encuentran en rocas y en ciertas arenas de

playa. La ilmenita, romboédrica, frecuentemente se halla asociada a la magnetita,

mientras que el rutilo, tetragonal, aparece en las rocas ígneas, metamórficas y

sedimentarias. Otros minerales que aparecen junto al rutilo son la anatasa y la

1. Introducción 5

brookita, ambas TiO2 tetragonal y romboédrico, respectivamente, siendo el rutilo el

más abundante de todos. La transformación del mineral natural a titanio metálico

puro consiste, en esencia, en la cloración de las menas de ilmenita o rutilo para

formar tetracloruro de titanio (TiCl4) y, posteriormente, la reducción de éste mediante

magnesio fundido, en una atmósfera de argón, para evitar la oxidación (método de

Kroll) [5].

Debido a las dificultades de extracción y transformación, el titanio metálico

resulta caro comparado con otros metales de uso más extendido. Sin embargo, sus

excelentes propiedades mecánicas lo convierten en uno de los metales más atractivos

en un gran número de aplicaciones.

El titanio, en estado metálico, es un material alotrópico, es decir, puede existir

en más de una forma cristalográfica. A temperatura ambiente, presenta una

estructura hexagonal compacta (fase α), cuya densidad es de 4,5 g/cm3. Sin embargo,

a temperaturas superiores a 885°C, sufre una transformación reversible a la

estructura cúbica centrada en el cuerpo (fase β) con una densidad de 4,4 g/cm3

(Figura 1).

Figura 1. Estructuras cristalinas del titanio (fases α-Ti y β-Ti).

6 1.2 Titanio

En estado puro, el titanio presenta una resistividad eléctrica en el rango 0,4 –

0,6 μΩm, un valor bajo comparado con el de otros metales. Las propiedades térmicas

del titanio puro, se muestran en la Tabla 2.

Tabla 2. Propiedades térmicas del titanio puro.

Propiedades térmicas

Punto de fusión 1670 °C

Punto de ebullición 3260 °C

Calor latente de fusión 435,4 J/g

Calor específico 0,528 J/(°C·g)

Conductividad térmica 17 W/(°C·m)

El titanio puro es un material rígido y dúctil que presenta un módulo de

elasticidad de 108 GPa, el más cercano al hueso (de aproximadamente 20 GPa) de los

biomateriales metálicos, además de una elevada resistencia a la tracción (103 MPa) y

una gran tenacidad [3]. Sin embargo, tiene una baja resistencia al desgaste, debido al

bajo valor de la relación de los parámetros de red c/a (1,59), típica de la estructura

hexagonal compacta (Figura 1). Esta es una de las principales desventajas del Ti en

comparación con otros biomateriales metálicos. Por este motivo, el Ti-cp posee un

98,635-99,500% de pureza al que se le añaden impurezas intersticiales de C, H, O, N,

Fe y otras que disminuyen su reactividad además de incrementar la relación c/a,

mejorando así sus propiedades mecánicas. En función de las concentraciones de

impurezas añadidas, el α−Ti cp queda catalogado en grados (Tabla 3) según la ASTM

(American Society for Testing and Materials) [6].

Es también muy frecuente alear el titanio con impurezas tanto intersticiales

como sustitucionales. Hay elementos como el Al, Ga, Ge, C, O y N que tienden a

estabilizar la fase α. Hay otros, por el contrario, que tienden a estabilizar la fase β,

como son el Mo, V, Ta y Nb. Por último, también existen aleantes eutectoides como el

Mn, Fe, Cr, Co, Ni, Cu y Si que son solubles tanto en la fase α como en la β, no

estabilizan ninguna de ellas, pero mejoran su dureza. Por consiguiente, dependiendo

1. Introducción 7

de las impurezas disueltas en el titanio y sus concentraciones relativas, se podrán

obtener aleaciones tipo α, tipo β o, incluso, tipo α+β, respectivamente, si la fase α,

la β, o ambas fases coexisten a temperatura ambiente, abarcando un gran espectro de

propiedades mecánicas (Tabla 4) [7]. Esta variabilidad de composición y por tanto de

propiedades mecánicas, nos permite tener una cierta versatilidad a la hora de elegir el

tipo de implante de Ti que más se adecue a los requerimientos clínicos de la cirugía.

Tabla 3. Comparación de varias especificaciones para el α−Ti comercialmente puro (cp): concentración máxima de aleantes, tensión de ruptura (Tr), límite elástico (Te) y elongación máxima (ε).

ASTM-Ti

(cp) C (%) H (%)

O

(%)

N

(%)

Fe

(%) Otros (%)

Tr

(MPa)

Te

(MPa)

(%)

Grado 1 0,020 0,015 0,18 0,03 0,20 --- 240 170-310 24

Grado 2 0,020 0,015 0,25 0,03 0,30 --- 343 275-410 20

Grado 3 0,020 0,015 0,35 0,05 0,30 --- 440 377-520 18

Grado 4 0,020 0,015 0,40 0,05 0,50 --- 550 480 20

Grado 7 0,020 0,015 0,25 0,03 0,30 0,12-0,25 Pd 343 275-410 20

Grado 12 0,020 0,015 0,25 0,03 0,30 0,2-0,4 Mo

0,6-0,9 Ni 480 380 12

Las excelentes propiedades mecánicas del titanio y sus aleaciones, así como su

baja densidad (el 55% de la del acero) y su elevado punto de fusión, lo convierten en

un material de gran interés tecnológico. Pero, además, el titanio presenta una elevada

resistencia a la corrosión frente a ambientes químicos muy reactivos [8] y es

biocompatible en presencia de ambientes biológicos, lo que promueve su uso como

biomaterial. Pocas son las sustancias capaces de alterarlo: altas concentraciones de

HCl, H2SO4, NaOH o HF en caliente. En conjunto, estas propiedades han otorgado al

titanio una situación preferente en muy diversas aplicaciones industriales [8]. En

8 1.2 Titanio

medicina se usa tanto en prótesis óseas, tornillos y clavos, como en válvulas cardíacas

o instrumentos e implantes dentales.

Tabla 4. Varios tipos de aleaciones de titanio, así como sus respectivas composiciones, estructura cristalina, resistencia a tracción (Rt), límite elástico (Te) y elongación máxima (ε).

Aleación Composición (%) Estructura Rt (MPa) Te (MPa) ε (%)

Ti cp 99 Ti α 262-686 151-585 17-30

Ti-Al-Sn 5 Al, 2,5 Sn α 860 806 18

Ti-Al-V 6 Al, 4 V α+β 1171 1067 8

Ti-Al-Zn-Mo 6 Al, 2 Sn, 4 Zn, 6 Mo α+β 1098-1166 1029-1098 20

Ti-V-Cr-Al 13 V, 11 Cr, 3 Al β 853-1166 804-1098 10-25

Las principales líneas de investigación, dentro de la comunidad científica

dedicada al titanio y sus aleaciones en el campo de los biomateriales, se centran

fundamentalmente en dos aspectos. El primero de ellos está relacionado con las

características intrínsecas masivas del material, es decir, en sus propiedades

mecánicas, específicamente, reducir su módulo de elasticidad [9] (de 108 GPa, hasta

los aproximadamente 20 GPa del hueso); el segundo, con mejorar las propiedades de

la superficie del titanio, que es la que en definitiva se encuentra en contacto con el

medio fisiológico. Como ya se ha señalado, una de las principales desventajas del

titanio y sus aleaciones es su baja resistencia al desgaste: es, paradójicamente, la más

baja de los biomateriales metálicos utilizados en aplicaciones biomédicas. Este

material, en condiciones de fricción y/o desgaste producido entre el hueso y el

implante, da lugar a la rotura de la capa pasiva con la consiguiente liberación de

partículas de tamaño nanométrico e iones metálicos al medio que le rodea [10, 11]. Es

por ello, que se han encontrado altas concentraciones metálicas en los alrededores de

las prótesis de Ti [12, 13], lo cual puede dar lugar a resorción ósea, con la consiguiente

pérdida del implante [9], e incluso, a acumulaciones de partículas e iones en el hígado,

páncreas o nódulos linfáticos [14]. Para intentar paliar este problema, los esfuerzos se

centran en conseguir superficies más resistentes al desgaste y en acelerar la

1. Introducción 9

osteointegración ósea de tal forma, que se consiga una “interfase” continua implante-

hueso lo más rápidamente posible, que dé la estabilidad suficiente como para evitar

los problemas asociados con la liberación de partículas e iones metálicos. Para ello, es

evidente que el estudio de la interacción entre el material de implante y el medio

fisiológico en los primeros periodos de implantación, es fundamental para establecer

una estrategia que mejore la conexión íntima implante/hueso.

Precisamente para mejorar las propiedades del Ti y sus aleaciones en los

aspectos relacionados a su superficie, es posible plantear numerosas modificaciones

superficiales.

1.3 Modificaciones superficiales del titanio

En el proceso de osteointegración, la superficie del material de titanio es

fundamental en la respuesta al entorno biológico en los dispositivos médicos

artificiales. Si para determinadas aplicaciones biomédicas la superficie nativa de los

materiales de titanio no es adecuada, se realizan modificaciones o preparaciones

previas en dicha superficie: se trata, por ejemplo, de conseguir superficies más

rugosas que mejoren el anclaje al hueso, o más bioactivas, que aceleren los procesos

iniciales de osteointegración, o de mayor resistencia mecánica superficial, con el fin

de conseguir mayor resistencia frente al desgaste.

Los métodos más utilizados para modificar la superficie del Ti y la de sus

aleaciones, aparecen en la Tabla 5. Como se observa en la Tabla 5, podemos

considerar tres bloques fundamentales de modificaciones superficiales: métodos

mecánicos, que tienen como objetivo conseguir una rugosidad y topografía

específicas (aunque también se utilizan para eliminar impurezas de la superficie [15] así

como para mejorar el anclaje del biomaterial al hueso); los métodos químicos y los

físicos, en los que se modifica la naturaleza química de la superficie del titanio. Vamos

a centrarnos en los métodos que modifican la naturaleza química de la superficie.

10 1.3 Modificaciones superficiales del titanio

Tabla 5. Principales tratamientos superficiales del titanio y sus aleaciones para aplicaciones biomédicas [16].

Método de modificación superficial

Capa modificada Objetivo

Métodos mecánicos

Mecanizado Pulverizado (grinding) Pulido Chorreado

Se forman superficies rugosas o lisas por medio del proceso de sustracción o eliminación física de las primeras capas de la superficie.

Producir superficies con topografías específicas, limpiar y hacer más rugosas las superficies para mejorar la adhesión en hueso.

Métodos Químicos

Tratamientos ácidos <10nm de capa de óxido en la superficie

Eliminar escamas de óxido y contaminación.

Tratamientos básicos ~1m de gel de titanato sódico

Mejorar la biocompatibilidad, bioactividad o conductividad en hueso.

Tratamiento con peróxido de hidrógeno

~5nm de capa densa interna y una capa porosa externa

Sol-gel ~10m de capa fina como fosfato cálcico, TiO2 y sílice

Oxidación anódica ~10nm a 40m de capa de TiO2, adsorción e incorporación de aniones del electrolito

Producir superficies con topografías específicas, mejorar la resistencia a la corrosión, mejorar la biocompatibilidad, bioactividad o conductividad en hueso.

CVD ~1m de capa fina de TiN, TiC, TiCN, diamante y carbono como diamante.

Mejorar la resistencia al desgaste, resistencia a la corrosión y compatibilidad.

Métodos bioquímicos

Modificación por titania silanizada, fotoquímica, monocapas autoensambladas, proteínas

Inducir respuestas específicas en células y tejidos por medio de la inmovilización en la superficie de péptidos, proteínas o factores de crecimiento.

Métodos físicos

Atomizador térmico ~30 a 200m de capa de titanio, HA, silicato cálcico, Al2O3, ZrO2, TiO2

Mejorar la resistencia al desgaste, resistencia a la corrosión y propiedades biocompatibles.

PVD ~1m de capa fina de TiN, TiC, TiCN, diamante y carbono como diamante.

Mejorar la resistencia al desgaste, resistencia a la corrosión y compatibilidad.

Implantación y deposición de iones

~10nm de superficie modificada

y/o ~m de capa fina

Modificar la composición de la superficie, mejorar la resistencia al desgaste y a la corrosión y aumentar la biocompatibilidad.

1. Introducción 11

Métodos químicos

Existen muchos tratamientos químicos para modificar la superficie de los

materiales de Ti. En primer lugar, se puede hacer un pre-tratamiento ácido para

eliminar los contaminantes de la superficie y obtener acabados uniformes. Para este

pre-tratamiento se puede utilizar una mezcla de ácidos, compuesta por 10-30 % vol.

de HNO3 y 1-3 % vol. de HF [17]. El ácido fluorhídrico ataca rápidamente al TiO2 y

reacciona con el Ti, formando fluoruros de titanio solubles e hidrógeno. La

incorporación del hidrógeno al Ti puede provocar la fragilización de la capa

superficial1 [18]. Sin embargo, una relación de 10 a 1 de HNO3/HF puede minimizar la

formación de hidrógeno libre. Como resultado de estos tratamientos químicos, se

obtiene preferentemente una superficie de TiO2, pero suelen quedar residuos incluso

después de un tratamiento térmico. En esta misma línea de investigación, Wen y col.

han publicado que la bioactividad de las aleaciones de Ti se puede mejorar utilizando

la combinación de dos tratamientos químicos: 1º HCl + H2SO4 y 2º una disolución

alcalina [19]. Este tratamiento da lugar a la formación de microporos bioactivos en la

superficie del Ti. Kim y col. introducen por primera vez el tratamiento con bases,

previamente al tratamiento térmico [20, 21]. Este tratamiento consiste en definitiva en

sumergir los materiales en una disolución 5-10 M de NaOH o 10 M de KOH a 60°C

entre 1 y 24 horas. Posteriormente, se limpian con agua destilada y se secan al aire, a

40°C, durante 24 horas. A continuación, las muestras de Ti se tratan térmicamente,

entre 400-800°C, durante 1 hora. Este tratamiento forma una capa de apatita, muy

parecida al hueso, que es biológicamente activa (Figura 2).

1 La fragilización por hidrógeno ha sido definida como la pérdida de resistencia y ductilidad, inducida por el

hidrógeno, que puede derivar en la iniciación o propagación de fracturas mecánicas. La fragilización por

hidrógeno es especialmente devastadora, debido a la naturaleza del fallo originado. Dicho fallo sucede a

tensiones muy pequeñas (en comparación a las que serían necesarias en ausencia de hidrógeno) y tiene un

periodo de “incubación” tan variable que lo hace prácticamente impredecible.


Figura 2. Imágenes del microscopio electrónico de barrido (SEM) de superficies sin tratar, tratadas con base, y con una base y posterior tratamiento térmico, de izquierda a derecha respectivamente [21].

Otro método químico que tiene como finalidad aumentar la bioactividad

superficial es el tratamiento con peróxido de hidrógeno. La superficie de Ti, en

contacto con un medio vivo, reacciona con el H2O2 presente en el medio,

produciendo geles Ti-peroxy [22, 23] que facilitan la formación de apatita [24]. Cai y col.

tratan el Ti con H2O2 al 30% y HCl al 99% durante 30 minutos y lo lavan con agua

destilada. Posteriormente, lo sumergen en disoluciones de hasta 10 M de KOH a 60°C

durante 24 horas, y lo tratan térmicamente a 600°C durante 1 hora. Después, lo

sumergen durante 14 días en SBF (“simulated body fluid”, fluido simulado del cuerpo2)

a 37°C y queda depositada apatita en los poros de la superficie, induciendo la

diferenciación de las células MSCs en osteoblastos [25].

Entre los métodos electroquímicos que implican la modificación superficial se

encuentra por otro lado la oxidación anódica, que se utiliza para aumentar el espesor

de la capa de óxido de 3-7 nm a 100-1000 nm. Las ventajas del anodizado de Ti son,

entre otras, el aumento de la protección frente a la corrosión, la disminución de la

liberación de iones y la formación de una capa porosa. Las propiedades estructurales

y químicas de los óxidos formados por anodización, se pueden controlar variando

2 Este medio está compuesto por sales inorgánicas en las que están presentes tanto los iones calcio como los

iones fosfato.

1. Introducción 13

parámetros como el potencial del ánodo, la composición del electrolito, la

temperatura y la intensidad de corriente [16]. Las principales reacciones de oxidación

en el ánodo son la disolución (oxidación) del titanio en la interfase Ti/TiO2:

Ti ↔ Ti2+ + 2e-

y en la interfase TiO2/electrolito:

2H2O ↔ 2O2- + 4H+

2H2O ↔ O2 (gas) + 4H+ + 4e-

Los iones Ti2+ y O2- que se forman en estas reacciones redox son conducidos a

través del óxido por la aplicación de un campo eléctrico externo, dando como

resultado la formación de la capa de óxido (Ti2+ + 2O2- ↔ TiO2 + 2e-), siendo su

espesor proporcional al voltaje aplicado. Si el proceso de anodización se lleva a cabo a

potenciales por encima del límite de rotura, el óxido no resiste el flujo de corriente,

aumentando mucho la producción del gas y produciéndose, a menudo, explosiones.

Este tipo de anodización se suele llamar “Spark anodizing”: da lugar de forma típica a

capas de óxido menos uniformes y más porosas [16].

Yang y col. [26] combinan la oxidación anódica, en una disolución de H2SO4, con

un tratamiento térmico. De este modo consiguen superficies porosas de TiO2 en fases

anatasa/rutilo, las cuales, al ser sumergidas en SBF, inducen la formación de apatita

en la superficie.

Todos estos tratamientos modifican en gran medida la superficie del titanio y

sus aleaciones en cuanto a rugosidad y composición, y como resultado se obtienen

superficies de TiO2 cuyas características dependerán de los tratamientos utilizados.


Métodos físicos

Los métodos físicos también producen cambios importantes en la superficie.

Un ejemplo sería la deposición hidrotermal de hidroxiapatita [27], que consigue

obtener películas de hidroxiapatita con espesor uniforme e integridad estructural.

Sin embargo, existe un método físico que modifica ligeramente la superficie del

titanio; la oxidación térmica. Con este método se consigue crecer la capa de óxido que

lo recubre, dependiendo de la temperatura y el tiempo de tratamiento. La oxidación

térmica se suele llevar a cabo en diferentes atmósferas, ya sea en atmósfera normal,

que contiene tanto oxígeno como nitrógeno, como en atmósfera de argón. Hwang y

col. estudiaron la influencia de la atmósfera utilizada, en la oxidación térmica de Ti en

función de la temperatura (500°C y 700°C). A altas temperaturas obtuvieron una

estructura compacta de rutilo y por debajo de 600°C, capas de TiO2 amorfas, las

cuales mostraron más tendencia a formar CaP que las capas con rutilo [28]. En este

mismo sentido, Vaquila y col. confirmaron, por medio de espectroscopía Auger, que a

temperaturas inferiores a 200°C solo se detecta TiO2, mientras que a temperaturas

comprendidas entre 200°C y 350°C aparecen dos tipos de óxido de titanio: TiO2 y Ti2O3

[29]. El espesor de esta capa de óxido de titanio depende tanto de la temperatura

como del tiempo de exposición al oxígeno. Incrementando la temperatura, se

promueve la difusión del oxígeno hacia el seno del material, aumentando así la

oxidación global. Sin embargo, a altas temperaturas los átomos de oxígeno se

desorben de la superficie con la consecuente reducción del estado de oxidación del Ti.

Estas dos tendencias opuestas indican que debe haber un intervalo de temperatura

óptimo para conseguir la máxima oxidación. Lu y col. establecieron que el intervalo

donde se produce la oxidación máxima de la superficie está entre 227-327°C [30].

Cuando estos materiales se sumergen en una disolución acuosa, los grupos OH- unidos

a los cationes metálicos poseen propiedades ácido/base [31]. Lo grupos OH- presentes

en la superficie del Ti favorecen el enlace con iones fosfatos a través de los iones Ca2+

presentes en el medio fisiológico [32]. Estos puntos sirven como anclaje de los

1. Introducción 15

osteoblastos, y por tanto, a mayor concentración de OH- en la superficie, mayor

adhesión celular [31].

Muchos de estos estudios han confirmado que estos tratamientos térmicos son

adecuados para conseguir una mayor adhesión celular [31, 32].

1.4 Estudio de la interfase Ti/medio fisiológico

En la superficie del titanio y en la de sus aleaciones se genera,

espontáneamente en contacto con el aire, una capa de óxido de titanio (TiO2) que

recubre el material. Esta capa, cuyo espesor es de 3 a 7 nanómetros, confiere a estos

materiales propiedades tales como resistencia a la corrosión y capacidad de

repasivación, siendo químicamente inertes e incluso biocompatibles.

La superficie de óxido nativo de Ti sin tratar ha sido estudiada por McCafferty y

Wightman [33], encontrando que la superficie está protegida por tres tipos diferentes

de óxido de titanio. La parte más externa de la capa está formada por TiO2 y la parte

más interna por Ti2O3 y TiO. Por tanto, el Ti y sus aleaciones gracias a la fina capa de

óxido que poseen en su superficie son relativamente inertes y poseen buena

resistencia a la corrosión. Se podría decir que estos materiales no sufren “corrosión

importante” en entornos biológicos [16].

Cuando un material de Ti se introduce en un ser vivo, se pueden liberar

productos de corrosión e iones metálicos, debido a la interacción del biomaterial con

el medio fisiológico. Los procesos electroquímicos que tienen lugar en esta interfase,

pueden provocar daños, tanto en las inmediaciones del implante como en tejidos más

alejados de él [34, 35]. Por esta razón, para que un implante tenga éxito es muy

importante conocer los procesos que tienen lugar entre el biomaterial y los distintos

componentes del medio celular.

16 1.4 Estudio de la interfase Ti/medio fisiológico

Cuando estos materiales se sumergen en una disolución acuosa, se producen

en la superficie una serie de cambios, dando lugar a grupos Ti-OH que tienen carácter

ácido o básico [31], como se muestra en la Figura 3. En esta figura, se muestra un

esquema de cómo interacciona el Ti con los iones H+ y OH- presentes en un medio

acuoso. Los OH- son atraídos por los átomos de Ti polarizados de la superficie del

biomaterial (ácidos de Lewis) mientras que los H+ son atraídos por los átomos de

oxígeno polarizados (bases de Lewis). La primera reacción hace que la superficie se

cargue negativamente, mientras que la segunda hace que se cargue positivamente. La

carga neta de la superficie va a depender del valor de pH de la disolución que se

utilice [36].

Figura 3. Interfase formada entre la capa pasiva del Ti y una disolución acuosa. Marcado en azul, coordinación simple del grupo OH- con el Ti (carácter básico); en rojo, coordinación doble formando Ti2OH+ (carácter ácido).

En la mayoría de los casos la descripción de la carga de la superficie es más

compleja, ya que además de estos dos iones se pueden unir otros iones presentes en

el medio, así como moléculas de agua.

Boehm [37] sugiere que debido a la quimisorción del agua hay dos tipos de

grupos -OH coexistiendo en la superficie de TiO2. Estas dos especies de -OH se

distinguen por la distinta manera de coordinarse con el Ti: si se coordina de manera

simple (Figura 3 recuadro azul) se dice que tienen carácter básico; si se coordina de

ElectrolitoCapa pasiva

Ti

Ti

Ti

Ti

O

O

O

O

OH-

OH-

OH-

OH-

H+

H+

H+

H+

Titanio

1. Introducción 17

manera doble (Figura 3 recuadro rojo) entonces tiene carácter ácido. Por tanto, si nos

basamos en los valores de pK de estos grupos, a pH fisiológico se esperaría que la

superficie de TiO2 estuviera cargada negativamente [38]. Cuando esta superficie se

sumerge en una disolución de H2PO4-, las especies de fosfato que se forman pueden

ser Ti-H2PO4 o Ti-HPO4- [38].

Por otro lado, Takadama y col. argumentan que esta superficie está cargada

negativamente por distintas razones [39]. Los grupos -OH presentes en la superficie a

pH 7,4 repolimerizan y condensan en unidades de titania cargados negativamente,

que posteriormente interaccionan electrostáticamente con la carga positiva de los

iones de calcio, dando como resultado la formación de un titanato de calcio amorfo.

Estos autores suponen que dicho compuesto gana una carga positiva e interacciona

con la carga negativa del fosfato presente en la disolución, formándose así un fosfato

de calcio amorfo que finalmente se estabiliza en apatita cristalina (similar al hueso),

con una relación Ca/P de 1,65 [39]. Asimismo, la formación de depósitos externos de

Ca/P en la superficie de Ti impide el normal envejecimiento de la capa pasiva de TiO2

[40]. Sin embargo, la formación de una capa artificial de óxido de titanio ya sea por

anodizado [26] o por tratamiento térmico [41], mejora la formación de apatita frente a

la capa de óxido nativa del Ti.

Hanawa y Ota [42] han demostrado que, las superficies de titanio sólo adsorben

iones de calcio, fosfatos, oxígeno, grupos -OH y agua, aunque estén sumergidas en

disoluciones en las que haya otros tipos de iones. De esta manera, estudian la

formación y el crecimiento de capas de Ca/P en función del tiempo de inmersión y del

pH de la disolución. La composición de los depósitos de Ca/P a pH 7,4 varía en función

del tiempo, consiguiendo a los 30 días de inmersión, una composición muy cercana a

la de la hidroxiapatita. Por tanto, se puede concluir que las superficies de titanio, por


naturaleza, favorecen la formación de dicha apatita, aunque muy lentamente3,

necesitándose períodos largos de inmersión [42]. Uno de los precursores de la

hidroxiapatita es el fosfato de octacalcio; con él se puede formar una capa porosa en

la superficie de Ti, que mejoraría las propiedades de biocompatibilidad del implante

[43].

Otros autores plantean la posibilidad de acelerar el proceso de formación de

una capa de Ca-P en la superficie del Ti por medio de un tratamiento químico en dos

etapas. En la primera, la superficie de titanio se trata con ácidos y NaOH y en la

segunda se sumerge en disoluciones que contienen tanto iones calcio como iones

fosfato [44]. Con estos tratamientos consiguen una capa porosa y uniforme de Ca-P que

mejora la biocompatibilidad de las superficies de Ti. Es importante tener en cuenta

que la formación de una capa amorfa de TiO2 o una capa compuesta de cristales de

anatasa en la superficie de Ti favorece la formación de una capa porosa y uniforme de

Ca-P, mientras que si la capa de TiO2 está compuesta únicamente por cristales de

rutilo, la formación de esa capa no tiene lugar [28, 45].

Yang y col. [46] estudiaron la cinética de formación de la apatita sobre partículas

de TiO2 por medio de la microbalanza de cristal de cuarzo o QCM, obteniendo el

siguiente mecanismo: los iones Ca2+ del SBF (serum body fluid) son atraídos hacia la

interfase disolución/TiO2 que está cargada negativamente. A continuación, el titanato

de calcio formado en la interfase se combina con los iones fosfato formando núcleos

de apatita, a partir de los cuales se producirá la nucleación y su crecimiento [46]. Esta

técnica ha permitido a Galli y col. demostrar que en presencia de proteínas en el

medio, los iones fosfato producen la desorción de las proteínas adsorbidas sobre

superficies de Ti [47].

3 Estos depósitos son muy beneficiosos para el comportamiento biológico de los biomateriales. Gracias a ellos,

los osteoblastos se encuentran en un entorno químico más parecido al del hueso, favoreciendo la

osteointegración del implante.

1. Introducción 19

Sin embargo, en los fluidos biológicos del cuerpo humano no solo están

presentes sales inorgánicas, sino multitud de componentes orgánicos como la

glucosa, aminoácidos, vitaminas y proteínas.

La glucosa es el carbohidrato más común y se clasifica como un monosacárido,

aldosa y hexosa. También es conocida como dextrosa, debido a que es dextrógira, es

decir, que es un isómero con la propiedad de desviar el plano de luz polarizada hacia

la derecha. La Figura 4 muestra la fórmula molecular de la D-glucosa. Es un

compuesto soluble en agua con una densidad de 1,54 g/cm3. Es un sólido blanco

cristalino con una constante dieléctrica mucho más alta que la de los lípidos, proteínas

y carbohidratos complejos, como la celulosa y el almidón.

Figura 4. Fórmula molecular de la D-Glucosa.

Hasta donde llega nuestro conocimiento, no existen estudios previos de la

interacción que se produce entre la superficie de titanio y la glucosa, contrariamente

a lo que sucede con las proteínas. Los estudios realizados sobre el titanio, en medios

fisiológicos, demuestran que las proteínas se adsorben rápidamente sobre la

superficie, compitiendo con los iones inorgánicos a tiempos largos. Varios autores [48-

50] han estudiado cómo influyen las moléculas biológicas en el comportamiento frente

a la corrosión de los materiales metálicos, concluyendo que:

La adsorción de las proteínas sobre la superficie metálica modifica la

disponibilidad del oxígeno presente en la interfase biomaterial/fluido biológico,

lo que puede alterar las reacciones electroquímicas que tienen lugar sobre la


superficie metálica. Por un lado, la capa de proteínas adsorbida puede

dificultar la evolución de la reacción del oxígeno (disminuye la velocidad de la

reacción catódica), y por otro, puede dificultar la transferencia de carga

responsable de la disolución de la capa pasiva (reacción anódica), aumentando

la resistencia de polarización del biomaterial y disminuyendo la velocidad de

corrosión [48].

La adsorción de proteínas puede generar capas compactas que actúan de

barrera impidiendo la difusión de los iones del metal desde la superficie de

este hacia el electrolito o la formación del óxido. Debido a la disminución de la

velocidad de la reacción anódica, se espera que la resistencia de corrosión

aumente.

Las proteínas pueden unirse a los iones metálicos (formación de complejos

organometálicos) y transportarlos fuera de la interfase electrolito/biomaterial,

incrementándose la disolución del metal [49]. Por consiguiente, al aumentar la

reacción de disolución del metal, disminuye la formación de la capa pasiva [50].

Figura 5. Estructura terciaria de la albúmina de suero bovino (BSA).

Una de las proteínas más comunes y más abundantes presentes en el medio

fisiológico (que se toma como modelo en la mayoría de las investigaciones), es la

1. Introducción 21

albúmina de suero bovino (bovine serum albumin, BSA, Figura 5). Las proteínas están

compuestas por una serie de aminoácidos unidos mediante enlace peptídico. La

estructura básica de un aminoácido se compone de cuatro partes: un grupo amino (-

NH2), un grupo carboxílico (-COOH), un átomo de carbono central y una cadena

lateral. La BSA tiene una masa molecular de 66300 Da [51] con dimensiones de 4 x 4 x

14 nm3 [52]. Esta proteína contribuye en un 80% a la presión osmótica de la sangre y es

la responsable del mantenimiento del pH. Su estructura globular se consigue

plegando su cadena polipeptídica, que contiene 585 aminoácidos, en tres dominios -

hélice [50]. Debido a su mayor concentración, en los fluidos fisiológicos con respecto a

otras proteínas presentes, la BSA es la primera que llega a la superficie del implante

de acuerdo con las leyes de transporte de masa, y por eso juega un papel muy

importante en la adsorción inicial de las proteínas sobre las superficies biomédicas. La

adsorción de la albúmina depende en gran medida de la superficie metálica y de las

condiciones externas que se tengan, por tanto se hace difícil extrapolar su

comportamiento en diferentes sistemas biológicos [50].

El papel de esta proteína en el proceso de adsorción de los depósitos de Ca/P a

la superficie del Ti ha sido estudiado por Serro y col. Estos autores indican que existe

una inhibición parcial de la formación de la apatita debido a la presencia de la BSA [53].

Por otro lado, dichos autores sugieren que cuando una muestra de Ti se pone en

contacto con una disolución en la que están presentes tanto proteínas, como iones de

calcio y fosfato, se produce en primer lugar la adsorción de la BSA seguido de la

deposición de los iones [54]. En este sentido, Lima y col. [55] también llegan a la

conclusión de que los iones de cálcico y fosfato se incorporan a la superficie muy

lentamente, mientras que la BSA lo hace rápidamente. Aunque en la literatura existen

bastantes trabajos, en los que han estudiado el comportamiento electroquímico del Ti

y sus aleaciones en disoluciones que contienen BSA, las interacciones entre el suero

fetal bovino (fetal bovine serum, FBS) y las superficies de Ti no han sido del todo

aclaradas, dando lugar a resultados contradictorios [56]. Esta disparidad de resultados

22 1.5 Estudio de la interfase Ti/Células

parece debida a que dichos trabajos se llevaron a cabo sobre diferentes acabados

superficiales de Ti. Teniendo en cuenta que, las interacciones entre el medio

fisiológico y la superficie de los biomateriales dependen, en gran medida, de la

morfología de la superficie del material como la rugosidad, topografía o textura de los

biomateriales, no es de extrañar que a veces los resultados sean tan diferentes.

Un paso más allá en la investigación es considerar el efecto de las células vivas

sobre la superficie metálica y su interacción con la misma. Esta interacción

condicionará la biocompatibilidad y el mecanismo de osteointegración del biomaterial

metálico.

1.5 Estudio de la interfase Ti/Células

1.5.1 Comportamiento celular ante el implante metálico o biomaterial

Cuando se pone en contacto el titanio con el medio celular, además de las

interacciones de los distintos componentes del fluido fisiológico, también tienen lugar

los procesos de adhesión, crecimiento y diferenciación de las células presentes en el

organismo vivo sobre la superficie del implante. Inmediatamente después de que un

biomaterial es implantado en el cuerpo humano, además de las interacciones de la

superficie con el agua y los iones, se ponen en marcha una serie de mecanismos de

defensa del sistema inmunitario. Los que primero detectan la presencia del implante

son los neutrófilos y los macrófagos, seguidos por la formación a partir de los

macrófagos activados de células gigantes de cuerpo extraño. A continuación, las

células osteoprogenitoras migran a las cercanías del implante, donde se diferencian a

osteoblastos, que forman el hueso.

La adhesión celular implica un primer contacto con la superficie del

biomaterial; posteriormente, la extensión de la célula que va seguida por una

secuencia de diferenciación y crecimiento celular. Las células se unen a proteínas

adsorbidas a la superficie por medio de moléculas de adhesión transmembrana, a

1. Introducción 23

sitios específicos de las proteínas [36]. En orden cronológico, la interacción entre una

célula y la superficie se lleva a cabo en diferentes etapas:

1. En la superficie del biomaterial crece una interfase de acuerdo con sus

propiedades y con el entorno líquido en el que está sumergido.

2. Posteriormente se adsorbe una capa de proteínas que se estructura en

respuesta a las propiedades físico-químicas de la superficie.

3. Las células reconocen la capa de proteínas y reaccionan.

4. El tejido se estructura de acuerdo con las propiedades de las proteínas y

de la capa de células adheridas a la superficie.

Desde el punto de vista electroquímico, las células pueden afectar al proceso

de corrosión de los implantes metálicos con los que estén en contacto [57, 58], debido a

que los tejidos celulares segregan varios tipos de matriz extracelular. La matriz

extracelular suele estar compuesta por proteínas de adhesión como fibronectina,

elastina, integrinas y colágeno, glicosaminoglicanos como ácido hialurónico,

chondroitín sulfato, etc. [59] y factores de crecimiento, que no solo actúan como un

andamio físico para la adhesión celular y la organización de estructuras celulares, sino

que hacen de mediadores de la señalización intracelular hasta los receptores de la

superficie celular [60]. Por tanto, la matriz extracelular es necesaria para una buena

adhesión de las células al implante y su posterior osteointegración.

Desde el punto de vista biológico, el estudio de las interacciones que se

producen entre un biomaterial y un cultivo celular, puede realizarse según diversas

técnicas: entre ellas se encuentra la inmunofluorescencia, que nos proporciona

información de las distintas moléculas de adhesión (como por ejemplo integrinas) que

producen las células para adherirse a la superficie [61], o bien nos permite ver con

claridad tanto el núcleo como el citoplasma celular y así observar con detalle la

preferencia de las células por los distintos biomateriales [62, 63]. También es frecuente

el uso de moléculas como la tetrametilrodamina metil éster, que es una sustancia


fluorescente que se une a la membrana mitocondrial en células saludables. Cuando se

altera el potencial de membrana mitocondrial, se produce una disminución de la

fluorescencia, factor que advierte de necrosis o de muerte celular programada

(apoptosis) [64]. Otra manera de estudiar la adhesión y la viabilidad celular es

utilizando MTT (bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio). Esta

molécula es metabolizada en la mitocondria de células sanas produciéndose un

cambio de color, de amarillo claro a azul oscuro, cuya concentración es directamente

proporcional a la cantidad de células metabólicamente activas [65]. Otra de las técnicas

más utilizadas para observar la adherencia de las células al sustrato en cuestión es el

microscopio electrónico de barrido [66].

Todas estas técnicas se centran en qué les sucede a las células como

consecuencia de su interacción con el biomaterial metálico, pero ¿qué sucede con el

biomaterial metálico?, ¿cómo le afecta la presencia de las células vivas? Entre las

técnicas utilizadas para estudiar la modificación superficial del biomaterial se

encuentran las técnicas electroquímicas y la microbalanza de cristal de cuarzo (QCM).

1.5.2 Estudio de las interacciones electroquímicas de la interfase Ti/Células

El estudio electroquímico de la interacción entre la superficie de los

biomateriales metálicos y los cultivos celulares se puede llevar a cabo a través de

técnicas electroquímicas. Estas técnicas, permiten estudiar la cinética y los

mecanismos de adhesión celular sobre los materiales metálicos en función del grado

de recubrimiento celular y su efecto sobre las propiedades electroquímicas de la

interfase medio celular/superficie metálica. En la bibliografía se recogen

investigaciones sobre las interacciones electroquímicas existentes entre el implante y

las células para el Ti y sus aleaciones cuando se ponen en contacto con diferentes

tipos de líneas celulares, como por ejemplo células tipo osteoblastos U-2 OS [67],

osteoblastos humanos Saos-2 [68] y fibroblastos L929 [59]. Concretamente Hiromoto y

col. [59] han estudiado, cómo se ven afectadas las propiedades electroquímicas de una

1. Introducción 25

superficie de Ti (pulida a 600 grit), en presencia de fibroblastos L929. Estos autores

han obtenido que, la densidad de corriente anódica se mantiene invariable en

presencia de células, mientras que la densidad de corriente catódica disminuye. Por

tanto, concluyen que el efecto que provocan las células sobre la superficie de Ti es

ralentizar la difusión de las moléculas e iones a través de la matriz extracelular creada

por la secreción celular, mientras que la reacción anódica está limitada por la

pasividad de la capa de óxido. Sin embargo, este comportamiento no está del todo

claro, ya que los mismos autores en otro trabajo [69] han obtenido un aumento de la

densidad de corriente anódica en presencia de fibroblastos L929, concluyendo que se

acelera la reacción anódica debido al efecto acomplejante de las proteínas presentes

en el medio.

El potencial de corrosión es otra variable que se ve afectada por la presencia de

células en las superficies de titanio. Este parámetro genera controversia ya que como

se ha comentado, se han obtenido resultados dispares. Así, Hiromoto y col. [59] y

García-Alonso y col. [68] obtienen una disminución del potencial de corrosión en

presencia de células, mientras que otros autores obtienen el efecto contrario [69].

Huang [67] ha estudiado in situ el crecimiento de osteoblastos U-2 OS sobre Ti,

así como sobre la aleación Ti-6Al-4V durante 72 h., utilizando la espectroscopía de

impedancia electroquímica (electrochemical impedance spectroscopy, EIS). Los

resultados mostraron, un aumento en la impedancia y la resistencia de polarización

de los biomateriales, a medida que las células evolucionan hacia los diferentes

estadíos de adhesión, extensión y proliferación. No obstante, en los diagramas de

impedancia no se observaron claramente dos constantes de tiempo. Sin embargo,

MC. García–Alonso y col. [68] han obtenido dos constantes de tiempo claramente

diferenciadas en los diagramas de impedancia, a partir del cuarto día de incubación de

osteoblastos Saos-2, sobre la aleación de Ti-6Al-4V. La primera constante de tiempo

está relacionada con la presencia de las células sobre la superficie, mientras que la

segunda corresponde a la capa pasiva formada sobre la aleación de Ti-6Al-4V.


Mustafa y col. [70] han demostrado, que a tiempos largos de incubación, con células de

hueso de mandíbula humana (28 días), los iones de fósforo y calcio se incorporan a la

estructura de la capa de TiO2. Estas conclusiones son importantes, puesto que el fin

de todos estos estudios es la osteointegración del biomaterial en la estructura del

hueso.

Un aspecto que no podemos olvidar, ya que afecta al comportamiento celular,

es el acabado superficial del implante metálico. En este sentido se han llevado a cabo

estudios de adhesión y supervivencia celular sobre distintos acabados o

modificaciones superficiales del titanio. Demetrescu y col. [71] han realizado ensayos,

con fibroblastos humanos, sobre dos acabados superficiales de Ti: Ti nativo pulido con

papel de lija 2400 y una superficie de nanotubos de TiO2 obtenida por anodizado.

Estos autores concluyen que, la velocidad de corrosión es menor en el caso de la

superficie de nanotubos de TiO2 que en la superficie nativa, coincidiendo con mayores

valores de impedancia. Curiosamente, las células tienen una ligera preferencia por la

superficie nanoestructurada frente al óxido nativo. En este mismo sentido, Huang y

col. [72] mantienen que, el valor de la impedancia electroquímica para el Ti anodizado

(nanoestructurado), es de 2 a 4 veces superior al Ti sin tratamiento, durante los 5

primeros días de inmersión en un cultivo de osteoblastos U-2 OS. Además, para las

muestras tratadas se obtiene mejor extensión celular y biocompatibilidad. Por otro

lado, Karpagavalli y col. [73] han comprobado que la electrodeposición de TiO2

nanoestructurado sobre Ti6Al4V, en contacto con un cultivo de células de músculo de

aorta humana, aumenta la resistencia a la corrosión y disminuye la velocidad de

corrosión de la superficie electrodepositada con respecto a la aleación sin tratar.

Otra manera de favorecer la biocompatibilidad de un implante sería, como ya

señalamos anteriormente, modificar la superficie del biomaterial con tratamientos de

oxidación térmica, aumentando el espesor de la capa de TiO2 [74].

1. Introducción 27

1.5.3 Estudio de la adhesión celular mediante la microbalanza de cristal de

cuarzo (QCM)

Una técnica muy sensible capaz de medir con gran sensibilidad variaciones de

masa y que permite caracterizar la interfase Ti/células es la microbalanza de cristal de

cuarzo (quartz crystal microbalance, QCM). Esta técnica permite medir con gran

sensibilidad los cambios de masa en la superficie de cristales de cuarzo o sensores de

QCM. El registro de la frecuencia de resonancia del cristal de cuarzo a lo largo del

tiempo está relacionada linealmente con el cambio de masa en la superficie, por

medio de la ecuación de Sauerbrey [75]. Sin embargo, esta ecuación es válida para

pequeñas variaciones de masa que impliquen un cambio de frecuencia inferior al 2% y

depósitos no viscosos. En 1993, Gryte y col. [76] y Redepenning y col. [77] fueron los

primeros en resaltar que las células depositadas o adsorbidas sobre los sensores de

cuarzo no pueden ser tratados como una masa rígida ideal. Las células deben ser

consideradas como una masa viscosa similar a un fluido. Se estima que una monocapa

de células sobre un cristal de cuarzo de frecuencia de resonancia 5 MHz tiene un

espesor de 1m y que la densidad de las células es de 1 g·cm-3, entonces debería dar

lugar a un incremento de frecuencia teórico, si pudiera ser aplicada la ecuación de

Sauerbrey, de 5600 Hz [77]. Sin embargo, los resultados experimentales son, en

general, de al menos un orden de magnitud inferior a este valor. Esto es debido a que

las células se comportan como depósitos viscoelásticos y aunque no existe una

relación directa entre la masa de las células y el cambio en la frecuencia de

resonancia, se puede relacionar el recubrimiento celular con el incremento de

frecuencia [77]. Por otro lado, no es posible estudiar multicapas de células debido a

que la señal está completamente extinguida a distancias mayores de 1 m [78, 79].

Wegener y col. [80] llevaron a cabo un estudio detallado de adhesión celular

basándose en el análisis de la frecuencia utilizando tres líneas celulares diferentes

(células MDCK I y II y fibroblastos 3T3). Estos autores confirman las suposiciones de

Redepenning [77], en las que la disminución de la frecuencia está relacionado con el


número de células que están en contacto con la superficie. Ahora bien, durante el

proceso de adhesión celular, éstas se unen tanto a la superficie como a otras células

cercanas por medio de su citoesqueleto de actina en determinados puntos; de esta

manera, la mayoría de la superficie celular no está en contacto con la superficie del

sustrato: lo que detectamos no es el total de la masa adsorbida, sino una pequeña

fracción de la misma [81]. Como el mecanismo y la velocidad de adhesión son

diferentes para cada tipo celular, esa fracción de masa adsorbida a la superficie

variará, como refleja la disparidad de resultados obtenidos en la bibliografía.

Teniendo esto en cuenta, se han realizado estudios en los que se relacionan los

cambios en la frecuencia con el número de células realmente adheridas a la superficie

[82-84]. Así, Marx Kenneth y col. [84] lavan dos veces con PBS, obteniendo las células que

no se han adherido a la superficie y a continuación, realizan dos ciclos de tripsinación

y posterior lavado con PBS, contabilizando de esta manera el número real de células

adheridas a la superficie. También se ha registrado la variación de frecuencia durante

el despegue celular, producido por la adición de tripsina [85]. En este mismo sentido,

Gryte y col. [76] han conseguido medir la variación de frecuencia producida por el

despegue celular, añadiendo una cantidad determinada de NaOH, obteniendo

variaciones de frecuencia inferiores a los obtenidos en el proceso de adhesión ya que

el NaOH hace que se despeguen las células, pero no elimina toda la matriz

extracelular que han secretado dichas células.

También debemos comentar que en las etapas iniciales de adhesión de los

distintos tipos celulares se da una disminución en la frecuencia, debida a la adhesión

de las células a la superficie. Sin embargo, a tiempos más largos, se obtiene un

aumento de frecuencia alcanzando valores por encima del valor de la frecuencia

inicial [81]. Según Galli-Marxer y col. estas variaciones no están relacionadas con el

despegue de las células adheridas al cristal, sino que es debido al cambio de las

propiedades viscoelásticas de las células con el tiempo [81].

2. Objetivos y Plan de Trabajo

2. Objetivos y plan de trabajo 31

Las primeras etapas de interacción del medio fisiológico con el biomaterial

metálico tienen una gran importancia en la posterior aceptación o rechazo de dicho

biomaterial. El objetivo principal de esta Tesis será estudiar las interacciones que se

establecen entre cada uno de los componentes del medio fisiológico y la superficie

metálica de titanio, además de los cambios que se producen en la superficie de Ti en

presencia de osteoblastos, en función del tiempo de exposición; el fin no es otro que

conocer los procesos que tienen lugar en la interfase formada durante los estadíos de

adhesión, proliferación y crecimiento, así como la propagación y confluencia celular.

Concretamente, se han llevado a cabo los siguientes objetivos:

- Caracterización superficial de dos acabados diferentes de titanio: 1) titanio

evaporado sobre cristales de cuarzo (Ti-Q) y 2) titanio tratado térmicamente (Ti-TT),

por medio de la microscopía electrónica de barrido (SEM), microscopía de fuera

atómica (AFM) y espectroscopía fotoelectrónica de rayos X (XPS).

- Estudio de las interacciones que se producen entre la superficie de titanio (Ti-

Q y Ti- TT) y cada uno de los componentes del medio de cultivo celular en el que se

desarrollan los osteoblastos (Saos-2), en la primera semana de inmersión, mediante

técnicas electroquímicas, XPS y la microbalanza de cristal de cuarzo (QCM).

- Análisis de las interacciones entre la superficie de titanio (Ti-Q y Ti-TT) y

osteoblastos Saos-2 vivos en función del tiempo de exposición, con el fin de investigar

la interfase formada durante las distintas etapas de adhesión, proliferación y

crecimiento, así como la confluencia celular mediante técnicas electroquímicas y SEM.

- Cinética de adhesión de los osteoblastos sobre el Ti-Q mediante la QCM,

técnicas electroquímicas y SEM.

3. Materiales y métodos

3. Materiales y métodos 35

3.1 Materiales

3.1.1 Electrodos

3.1.1.1 Electrodos de trabajo

El material ensayado en el presente trabajo de investigación fue Titanio

obtenido mediante distintos procesados:

Ti-Q: Se emplearon cristales de cuarzo de corte AT de 10 MHz de Maxtek Ink.,

Santa Fe Springs, CA, USA, de 25 mm de diámetro, recubiertos por 300 nm de titanio

depositado en fase vapor en ambas caras. La disposición de los electrodos es

asimétrica, siendo sus áreas geométricas circulares 1,370 cm2 (cara superior) y 0,370

cm2 (cara inferior).

Figura 6. Cristal de cuarzo con electrodos de Ti.

Ti-TT: Se utilizaron fueron discos de Ti de grado 4 cortados perpendicularmente

a la dirección de una barra de 30 mm de diámetro suministrada por Goodfellow

Cambrigde (Inglaterra). La composición química nominal de las barras es la siguiente

(en % en masa): 99,475 % de titanio 0,010 % de carbono, 0,015 % de hidrógeno, 0,400

% de oxígeno, 0,050 % de nitrógeno y un 0,050 % de hierro. La superficie de las

muestras se desbastó utilizando diversos papeles de lija de finura de grano creciente,

600 y 1200 grit, y se finalizó con un pulido fino con pasta de diamante de 9 m y 1 m

de tamaño de partícula. Posteriormente, los discos de Ti se lavaron con agua destilada

36 3.1 Materiales

y seguidamente con etanol en un baño de ultrasonidos durante 5 minutos.

Finalmente, se dejaron secar a temperatura ambiente. Estas muestras se

denominaron titanio másico (Ti-m).

Las muestras de Ti-m se sometieron a un tratamiento térmico a 277°C durante

5 horas siguiendo el programa de temperatura que se muestran en la Figura 7. La

rampa de calentamiento fue de 2,86°C/min hasta alcanzar en 1 hora 30 minutos la

temperatura elegida de 277°C, donde las muestras de titanio permanecieron durante

5 horas. Posteriormente, se disminuyó la temperatura siguiendo una rampa de

enfriamiento de 2,14°C/min durante 2 horas hasta alcanzar temperatura ambiente,

aproximadamente 20°C. Las muestras así tratadas, se denominarán titanio tratado

térmicamente (Ti-TT). El área del electrodo de trabajo expuesta al medio fue de 0,79

cm2.

Figura 7. Programa de temperatura aplicado a las muestras de titanio másico (Ti-m).

Para eliminar cualquier interferencia (contaminación) en las medidas realizadas

en medios biológicos y con osteoblastos, la superficie de cada cara de los distintos


electrodos de trabajo (Ti-Q y Ti-TT) se esterilizaron con luz ultravioleta durante 15

minutos en una campana de flujo laminar.

3.1.1.2 Electrodos de referencia

El electrodo de referencia se utiliza para medir la diferencia de potencial de la

interfase metal/disolución de forma relativa y tiene un valor de potencial estable y

reproducible. La estabilidad del potencial del electrodo de referencia se debe a un

sistema redox en contacto con una disolución tampón o saturada. Las propiedades

que debería satisfacer un electrodo de referencia son un valor reproducible del

potencial y una reacción termodinámicamente bien definida, no polarizable y de fácil

uso [50]. En este trabajo, se empleó un electrodo de referencia de Ag/AgCl (E / 0,224 V

vs ENH) para las medidas electroquímicas realizadas en presencia de los componentes

del medio fisiológico. Sin embargo, para los ensayos electroquímicos en presencia de

células osteoblásticas, se utilizó un electrodo de platino, como pseudoreferencia,

debido a que las condiciones de esterilización (120°C y 1 atm) pueden modificar las

características de los electrodos de referencia, como calomelanos o Ag/AgCl utilizados

habitualmente en los ensayos electroquímicos.

3.1.1.3 Electrodo auxiliar o contraelectrodo

Como electrodo auxiliar o contraelectrodo se utilizó un hilo de platino

enrollado sobre sí mismo, para conseguir un área considerablemente mayor que la del

electrodo de trabajo y evitar polarizaciones indeseadas.

3.1.2 Celda electroquímica

Para realizar los ensayos electroquímicos sobre las distintas superficies de Ti se

utilizó una celda electroquímica de tres electrodos [86]. Generalmente, en las medidas

electroquímicas con biomateriales se suelen utilizar células electrolíticas

38 3.1 Materiales

convencionales con dos cuerpos de vidrio, ubicándose en la parte superior los

electrodos de trabajo (biomaterial), referencia y auxiliar. Sin embargo, estas células

no permiten el estudio “in situ” del comportamiento frente a la corrosión de

biomateriales metálicos en contacto con el medio celular, ya que el electrodo de

referencia, normalmente de calomelanos o de cloruro de plata, no soporta las

elevadas temperaturas de esterilización necesarias para trabajar con cultivos

celulares. Otro inconveniente es la disposición vertical del electrodo de trabajo, que

imposibilita la adhesión celular y por tanto, el estudio del mecanismo y la cinética de

corrosión del biomaterial en contacto con el medio celular.

Para solventar estos inconvenientes, se utilizó la célula electrolítica de la Figura

8 [86] para todos los ensayos, que consta de una base de teflón con dos piezas, entre

las que se aloja horizontalmente el electrodo de trabajo conectado eléctricamente

con el exterior mediante un contacto de cobre. La unión entre el electrodo de trabajo

y las piezas de teflón se realizó por medio de una junta tórica de silicona, la cual no es

nociva para los cultivos celulares [85]. La fijación exterior de ambos elementos se llevó

a cabo mediante cuatro tornillos. En la pieza superior de teflón se enrosca la celda

electroquímica de vidrio (ajustando de nuevo con una junta tórica de silicona) de

doble pared para mantener la termostatización deseada (25°C o 37°C). En la parte

superior, la celda tiene tres bocas para insertar el ER y el CE [86] y añadir el medio de

cultivo celular. Además, existen dos uniones Luer que permiten la entrada y la salida

de aire al 5% de CO2, atmósfera necesaria para mantener las condiciones ambientales

adecuadas en estos cultivos.

Para eliminar cualquier interferencia (contaminación) en las medidas realizadas

con medios biológicos y con osteoblastos, la celda electroquímica se esterilizó a 1 atm

y 120°C durante 30 minutos. Este proceso de esterilización se llevo a cabo en un

autoclave.


Figura 8. Partes de la celda electroquímica [86] y muestras de los dos acabados de Ti (imagen superior) y celda electroquímica en su conjunto (imagen inferior).

40 3.2 Reactivos y disoluciones

3.2 Reactivos y disoluciones

Los reactivos empleados en el presente trabajo se detallan en la siguiente

tabla.

Tabla 6. Relación de reactivos utilizados en los ensayos realizados en el presente trabajo.

Reactivo Pureza (%) Marca

NaH2PO4·H2O 99 Merck

NaCl 99 Merck

CaCl2·2H2O 99 Merck

D-Glucosa 99,5 Sigma-Aldrich

DMEM - Cambrex Biowhittaker

BSA 96 Sigma-Aldrich

FBS - Cambrex Biowhittaker

Penicilina/ Estreptomicina - Gibco

Tripsina-EDTA 0,25 Gibco

Etanol 96 Panreac

Etanol absoluto Panreac

Tetrametilsilano (TMS) 99,7 Merck

Para estudiar la interacción de los distintos componentes del medio fisiológico

con la superficie de Ti, se utilizó como referencia la composición del medio de cultivo

celular “Dulbecco´s modified eagle’s médium” (DMEM) (Anexo 7.1). El medio de

cultivo de los osteoblastos, en nuestro caso, está compuesto por DMEM (sin rojo

fenol) y completado por un 10% (v/v) de FBS (composición en el Anexo 7.2) y un 1%

de penicilina-estreptomicina para evitar contaminación bacteriana. En nuestro caso,

el DMEM utilizado no contiene rojo fenol pues se comprobó que aceleraba los

procesos de corrosión del titanio. A este medio completo le denominaremos DMEMc.

De todos los componentes de dicho medio centramos la atención en ciertas sales

inorgánicas como el NaH2PO4 y el CaCl2, y compuestos orgánicos como glucosa y la

albúmina (BSA). En la Tabla 7 aparecen las disoluciones empleadas en los distintos


ensayos. Todas las disoluciones fueron ajustadas a un pH de 7,4 con una disolución de

NaOH 0,1M, antes de ser utilizadas.

Posteriormente, se llevaron a cabo ensayos con DMEMc y con DMEMc en

presencia de Osteoblastos Saos-2.

Tabla 7. Composición de los distintos medios utilizados para los estudios electroquímicos y nomenclatura de las disoluciones.

Disoluciones NaCl

(mM)

NaH2PO4

(mM)

CaCl2

(mM)

Glucosa

(mM)

BSA

(g·l-1)

NaH2PO4 (disolución P) 110 0,91 --- --- ---

NaH2PO4 + CaCl2 (disolución PCa)

110 0,91 1,80 --- ---

NaH2PO4 + CaCl2 + Glucosa (disolución PCaG)

110 0,91 1,80 25,00 ---

NaH2PO4 + CaCl2 + BSA (disolución BSA)

110 0,91 1,80 --- 2,52

FBS (disolución FBS)* 110 0,91 1,80 0,57 2,52

*Entre otros componentes, ver Anexo 7.2.

3.3 Fundamento teórico de las técnicas utilizadas

3.3.1 Técnicas de caracterización

3.3.1.1 Espectroscopía fotoelectrónica de rayos-X (XPS)

La espectroscopía fotoelectrónica de rayos-X (XPS) es uno de los métodos de

caracterización de superficies más ampliamente utilizado en la actualidad. Esta

técnica está basada en el efecto fotoeléctrico, el cual fue observado originariamente

en superficies de metales fácilmente ionizables, tales como metales alcalinos. El

origen de la técnica se debe, fundamentalmente, al descubrimiento del efecto

42 3.3 Fundamento teórico de las técnicas utilizadas

fotoeléctrico (Hertz, 1887) y a la interpretación cuántica del efecto fotoeléctrico

(Einstein, 1905). Sin embargo, la técnica tal y como la conocemos ahora, no fue

desarrollada hasta los años 60, particularmente por Siegbahn, Turner y Price.

La espectroscopía fotoelectrónica de rayos X es una extensión del efecto

fotoeléctrico, que se basa en la irradiación de la muestra con rayos X blandos (de baja

energía h. Esto provoca la emisión de fotoelectrones con una energía de ligadura,

EB:

Siendo hla energía de los fotones, EK la energía cinética del fotoelectrón

emitido, W la función de trabajo del espectrómetro y EB la energía de ligadura,

parámetro que identifica al electrón de forma específica, en términos del elemento y

nivel atómico.

Los componentes más importantes de un espectrómetro fotoelectrónico de

rayos X son: una cámara de ultra-alto vacío, donde se produce el bombardeo de la

muestra con fotones, una rejilla de salida, por donde salen los electrones emitidos; un

analizador de energía de los electrones; un detector de electrones y un registrador.

Cuando se bombardea la muestra en la cámara de ultra-alto vacío, los fotoelectrones

se emiten en todas direcciones. Algunos pasan a través de una rejilla de salida y a

continuación el analizador de energía de los electrones los separa de acuerdo con su

energía cinética. Los electrones llegan al detector y el espectro registrado es el

número de electrones por unidad de tiempo (cuentas por segundo) como una función

de la energía de ionización o de la energía cinética de los fotoelectrones.

El XPS es una técnica espectroscópica cuantitativa, que permite analizar, en

una superficie determinada, los elementos presentes y su estado de oxidación,

indicando los elementos que se encuentran en las primeras capas de átomos (10 nm).

Esta profundidad de análisis depende del recorrido libre medio de los electrones en el


interior del sólido, siendo característico de cada elemento y dependiendo de la

energía cinética de los fotoelectrones que se están midiendo. Se pueden realizar

estudios de perfiles de profundidad eliminando progresivamente capas externas de

átomos con el bombardeo de átomos de argón [87].

3.3.1.2 Microscopía de fuerza atómica (AFM)

La microscopía de fuerza atómica (atomic force microscopy, AFM; desarrollada

por Binning, Quate y Gerber en 1986) es una técnica microscópica que se engloba

dentro de las microscopías de sonda de barrido (scanning probe microscopy, SPM),

entre las que también se encuentra la microscopía de efecto túnel (scanning tunnel

microscopy, STM; Binning y Rohrer, Premio Nobel de Física en 1982) entre otras.

Figura 9. Cantiléver y punta de AFM.

El primero de los microscopios de sonda de barrido fue el STM. Sin embargo, el

principal problema que presenta es que su uso queda restringido a muestras

metálicas o semiconductoras, pues para que los electrones puedan atravesar la

barrera por efecto túnel tienen que estar cerca del nivel de Fermi. Esta restricción fue

superada por el AFM, cuyo funcionamiento es similar al STM, con la salvedad de que

el parámetro que se emplea para evaluar la muestra no es la corriente túnel, sino la


fuerza de atracción y repulsión entre la punta y la muestra. Las puntas suelen ser de 2

micras de largo y menos de 100 Å de diámetro (Figura 9). Para mantener constante la

fuerza entre la punta y la muestra y poder medir sus variaciones, se monta la punta en

el extremo de una micropalanca flexible o cantiléver (100-200 micras de largo), cuya

deflexión es proporcional al desplazamiento entre punta y muestra: ésta se mide

mediante la reflexión de un láser en el extremo de la micropalanca y que incide sobre

un detector de diodos. Si se mantiene constante la deflexión, se registran los cambios

de posición del láser en el detector, obteniéndose la imagen (Figura 10). Varias son las

fuerzas que contribuyen a la flexión del cantiléver, siendo la más común la fuerza de

van der Waals. Este tipo de medida puede ser aplicada tanto a materiales aislantes,

como a semiconductores o conductores [88].

Figura 10. Esquema de un microscopio de fuerzas atómicas.

La unidad de AFM está constituida, fundamentalmente, por la cabeza óptica

(que incluye el láser y el sistema de detección), el escáner con el conjunto punta-

muestra (la base del AFM), la unidad electrónica de control (o realimentación) y un


ordenador desde el cual, gracias al software del microscopio, se regulan los

parámetros de operación del AFM y la adquisición de resultados.

Existen tres modos de operación básicos en AFM: modo de contacto

(dinámico), de no contacto (estático) y de contacto intermitente o “tapping”

(dinámico). Estos tres modos de operación se diferencian en la magnitud y tipo de

fuerzas que se establecen entre punta y muestra. En el modo de no contacto, a

medida que se acerca la punta a la muestra, empiezan a actuar las fuerzas atractivas o

de Van der Waals. En el modo de contacto, se sigue acercando la punta a la muestra

hasta que en un momento determinado, la punta toca la superficie de la muestra y

comienzan a aparecer las fuerzas de repulsión por solapamiento de las nubes de

electrones de la punta y la muestra. La magnitud de las fuerzas que intervienen es

muy distinta. En el caso del modo de contacto es del orden de 10-7N, mientras que en

el régimen de no contacto es del orden de 10-13N. Debido a esta diferencia, el modo

de no contacto presenta peor resolución topográfica que el modo de contacto. Sin

embargo, el modo de contacto presenta limitaciones cuando las muestras son muy

blandas o delicadas, por ejemplo, muestras biológicas. Una solución a estas

limitaciones, es el modo intermitente o “tapping”, que combina ambos modos.

Durante el barrido, la punta toca alternativamente la superficie y se levanta a una

frecuencia entre 5·104 y 5·106 ciclos/s. De esta manera, se mejora la resolución

topográfica al tocar la superficie (contacto) pero se evita dañarla cuando son

muestras delicadas (no contacto) [88].

3.3.1.3 Microscopía electrónica de barrido (SEM) y microanálisis por

dispersión de rayos X (EDX)

El principio fundamental de un microscopio electrónico de barrido (SEM) es el

empleo de un haz fino de electrones, procedente de un filamento de wolframio, para

incidir sobre la superficie de un material de naturaleza conductora [89]. Los electrones

que salen del cátodo, constituido por un filamento incandescente, atraviesan en su


marcha un medio de concentración, lentes electromagnéticas de forma cilíndrica y

son atraídos por el ánodo, al que se le ha impuesto un potencial negativo, que obliga

a los electrones a agruparse en un punto. El haz de electrones primarios incide

posteriormente en la muestra.

Al someter a la muestra, a este bombardeo de electrones primarios (haz de

electrones incidente) se originan, entre otros los siguientes procesos:

-Desprendimiento y formación de electrones secundarios.

-Desprendimiento y formación de electrones electrodispersados.

Los efectos de contraste topográfico de la superficie son debidos a los

electrones secundarios que salen de la banda de conducción, formándose a lo largo

de todo el recorrido del haz sobre la muestra. La señal obtenida varía gradualmente

con los cambios locales de la pendiente de la superficie. En el contraste topográfico

las zonas más elevadas y más brillantes son aquellas donde existe mayor

concentración de electrones, como por ejemplo los vértices y aristas, mientras que las

más oscuras corresponden a valles o zonas más bajas. Por tanto, desplazando el haz

de electrones sobre la superficie y recogiendo las señales producidas en cada punto,

es posible obtener un mapa topográfico de dicha superficie.

Los electrones electrodispersados dejan vacantes en niveles internos de

energía. El ion resultante, se estabiliza rellenando la vacante con un electrón de nivel

superior y la diferencia de energía entre los orbitales electrónicos implicados es

emitida en forma de radiación X. Los rayos-X producidos tienen una energía que

corresponde exactamente a una transición electrónica específica para cada elemento.

Dichos valores de energía, dan lugar a las líneas características del elemento o

radiación característica. Dependiendo del nivel energético del orbital atómico al que

lleguen los electrones, tenemos las líneas K, L, M. La energía de estas líneas es función

del número atómico de los elementos, lo que nos permite identificarlos y distinguirlos


en un espectro de dispersión de rayos X (energy-dispersive X-ray spectroscopy, EDX).

Por tanto, la espectroscopía de dispersión de rayos-X proporciona información

analítica sobre la composición del total o de zonas de la muestra de hasta unas

cuantas micras de diámetro y unos 3 nm de profundidad, aplicándose para identificar

o confirmar elementos o sustancias tanto conocidas como desconocidas en la

superficie de dicha muestra.

3.3.2 Experimentación con cultivos celulares

Con el fin de estudiar el proceso de interacción entre las células vivas del

organismo y el material del implante se recurre a los denominados experimentos “in

vitro” (“en vidrio” = en el laboratorio); es decir, ensayos con cultivos celulares.

En el último siglo, se han desarrollado metodologías para aislar células y

obtener, a partir de ellas, poblaciones homogéneas que luego puedan ser analizadas e

incluso multiplicarse “in vitro”. Esto ofrece ventajas tanto en la investigación básica,

pues permite estudiar diversos procesos que ocurren en las células, como en la

investigación aplicada, produciendo moléculas de interés e ingeniería de tejidos, entre

otras.

La mayoría de las células animales y vegetales aisladas pueden vivir,

multiplicarse e incluso expresar propiedades diferenciales, si se les provee de un

medio apropiado en una placa de cultivo. Así, las células pueden ser observadas

continuamente bajo el microscopio o analizadas bioquímicamente para explorar los

efectos producidos al agregar o eliminar moléculas específicas al medio celular (tales

como hormonas o factores de crecimiento) [90].

El cultivo de tejidos y células fue iniciado en 1907 por el zoólogo americano

Ross Harrison, de la Universidad Johns Hopkins. Este investigador publicó un breve

pero crítico artículo (“Observaciones de la fibra nerviosa viva en desarrollo”) [91] que


introdujo exitosamente una nueva técnica para demostrar experimentalmente cómo

se originan las fibras nerviosas: el cultivo de tejidos. Además de argumentar

sólidamente la “doctrina neural”, resolvió los problemas básicos del cultivo celular,

como el medio, la observación y la contaminación.

Actualmente, los cultivos se establecen principalmente a partir de

suspensiones celulares generadas por disgregación de tejidos.

A diferencia de las bacterias, la mayoría de las células obtenidas de tejidos no

están adaptadas para vivir en suspensión, y requieren una superficie sólida sobre la

cual crecer y dividirse. Para los cultivos celulares este soporte es la superficie de una

placa de cultivo de poliestireno. Los contenedores con el cultivo se mantienen en un

incubador a 37°C en una atmósfera de 5% de CO2. Aun así, a veces el crecimiento y la

diferenciación de las mismas sólo se logra recubriendo el soporte plástico con

componentes de la matriz extracelular (sustancia que rodea y contiene a las células en

los tejidos, con la cuál interactúan), como por ejemplo colágeno y laminina.

Los cultivos se pueden clasificar en: cultivos primarios y secundarios. Los

primarios son aquellos cultivos preparados directamente a partir de los tejidos de un

organismo, sin proliferación “in vitro”. Este tipo de cultivo puede iniciarse con o sin

fraccionamiento para separar los distintos tipos celulares. En la mayoría de los casos,

las células de los cultivos primarios, pueden ser despegadas del recipiente de cultivo a

uno nuevo, donde proliferarán para formar varios cultivos secundarios. En estas

condiciones, las células suelen crecer hasta cubrir la superficie del recipiente de

cultivo, formando una monocapa (capa de una célula de espesor), donde como

consecuencia del contacto entre las células se detiene temporalmente su

proliferación, hasta que se las subcultiva a un recipiente con medio fresco; así podrán

subcultivarse durante semanas o meses. En este estadío, las células frecuentemente

mostrarán distintas propiedades en función de su origen. Por ejemplo, los fibroblastos

(células que sintetizan fibras y mantienen la matriz extracelular del tejido de muchos


animales) secretarán colágeno o las células derivadas del tejido muscular esquelético

se fusionarán, para así generar fibras musculares con capacidad contráctil

espontánea. Gracias a que estos fenómenos ocurren en cultivo es posible estudiarlos

con diferentes metodologías, a veces no aplicables a tejidos intactos.

La mayoría de las células de los vertebrados cesan su división celular a partir de

un número finito de divisiones en cultivo, por un proceso llamado senescencia celular

[92]. Por ejemplo, los fibroblastos humanos normales se dividen solamente entre 25 y

40 veces en cultivo, antes de detenerse. Algunas células pueden frenar sus divisiones

celulares como consecuencia de la activación de mecanismos denominados “puntos

de control” (check points) del ciclo celular [93]. Para inmortalizar estas células, hay que

lograr la inactivación de los check-points. Una forma de hacerlo es introducir ciertos

“oncogenes” (genes promotores del cáncer) que pueden ser obtenidos de virus

cancerígenos (como algunas cepas de HPV o virus del papiloma humano, adenovirus,

etc.). Estas líneas celulares son muy útiles en la investigación, como fuente de un gran

número de células uniformes, que pueden ser conservadas y almacenadas en

nitrógeno líquido (a -196°C) por un período muy largo de tiempo, reteniendo su

viabilidad, constituyendo un buen modelo experimental para las primeras etapas de

una investigación.

Además de la obtención de ciertas líneas celulares, otro aspecto que ha

evolucionado en gran medida ha sido la elección de un medio de cultivo adecuado

para la supervivencia de las células. Hasta los años ´70, el cultivo de tejidos parecía

resultar de la fusión entre la ciencia y la brujería. Poco a poco, los fluidos coagulados

fueron reemplazados por placas con medios líquidos que contenían pequeñas

cantidades de una serie de moléculas necesarias para la supervivencia y multiplicación

celular: sales, glucosa, aminoácidos y vitaminas; además, la mayoría de los medios

incluían una mezcla poco definida de macromoléculas adicionadas bajo la forma de

suero fetal bovino o equino, o extracto crudo de embriones de pollo. Dichos medios

se siguen utilizando en la actualidad para los cultivos de rutina, generando la


dificultad, para muchos investigadores, de conocer cuáles son las macromoléculas

específicas que un tipo celular requiere para funcionar normalmente. Como

consecuencia, se desarrollaron numerosos medios químicamente definidos,

denominados “libres de suero”, que poseen, además de las pequeñas moléculas

mencionadas, varias proteínas específicas necesarias para la supervivencia y

proliferación, como factores de crecimiento que estimulan la proliferación celular. Así,

se descubrieron muchas moléculas de señalización extracelulares esenciales para la

supervivencia, desarrollo y proliferación de determinados tipos celulares, gracias a

estudios que buscaban establecer las condiciones mínimas de cultivo para un

comportamiento celular adecuado.

Otro componente de importancia para los medios de cultivo son los

compuestos indicadores de pH, como por ejemplo el rojo fenol (pH 7,4). Los mismos

le otorgan color al medio, que puede ir virando hacia otro color en función de los

cambios de acidez, permitiendo controlar este parámetro tan importante en el cultivo

celular. Por otro lado, la penicilina y la estreptomicina son un ejemplo de los muchos

antibióticos que se añaden para evitar el crecimiento de bacterias contaminantes en

los cultivos celulares. Todos ellos conforman el medio de cultivo celular utilizado en

experimentos “in vitro”.

3.3.3 Técnicas electroquímicas

3.3.3.1 Potencial de corrosión

El potencial de corrosión o potencial a circuito abierto consiste en la medida

del potencial del electrodo de trabajo con respecto al electrodo de referencia, cuando

ambos electrodos se encuentran sumergidos en el medio electrolítico sin

perturbación externa. En un biosistema, donde el biomaterial metálico está en

contacto con los fluidos fisiológicos, tienen lugar varias reacciones simultáneamente.


En las zonas anódicas se oxidará el metal y en las zonas catódicas se reducirá el

oxígeno presente en el medio. Debido a que el pH es neutro, la reacción de reducción

de los protones no contribuirá notablemente a la corrosión del metal. Además, en el

caso del titanio el enlace Ti-Hads es muy fuerte del orden de 20 KJ·mol-1 siendo la i0

muy pequeña, como muestra la curva de Volcano (i0 vs Gads, Anexo 7.4).

Inicialmente, al sumergir la pieza metálica en la disolución de estudio, la

diferencia de potencial entre las zonas anódicas y catódicas es la diferencia Eq-Eq´

(Figura 11). Pero al empezar a corroerse y debido a las polarizaciones de activación, la

diferencia de potencial decrece hasta que prácticamente se anula alcanzando el

potencial mixto de corrosión (Ecorr), al cual la velocidad del proceso de corrosión se

iguala con la del proceso de reducción. Suponiendo que la suma de todas las

microzonas anódicas es igual a la suma de todas las microzonas catódicas, las

densidades de corriente de ambos procesos se igualan alcanzando la densidad de

corriente de corrosión (icorr). La diferencia de potencial será mínima ya que los

electrones pasan de las zonas anódicas hacia las catódicas a través de la red cristalina

metálica.

Las medidas de potencial a circuito abierto o potencial de corrosión

proporcionan información acerca de la tendencia a corroerse o pasivarse del

biomaterial. Cuanto menor sea el potencial de corrosión de un determinado material

metálico, se puede considerar más activo, es decir, mayor tendencia a corroerse. Sin

embargo, valores de potencial de corrosión mayores definen un material más noble y

con menor tendencia a la corrosión. Es importante señalar que el potencial de

corrosión no suministra información cuantitativa sobre la cinética o velocidad con la

que ocurre la corrosión. Así, materiales con potenciales similares pueden tener

cinéticas de corrosión diferentes. Es por eso que este tipo de medidas son muy útiles

como complemento de otras técnicas electroquímicas [1].


3.3.3.2 Curvas de polarización. Pendientes de Tafel

Las curvas de polarización representan la variación que experimenta la

densidad de corriente de un electrodo (i) en función del potencial aplicado de forma

estacionaria o a una velocidad de barrido constante (˂ 5 mV·s-1). Las curvas de

densidad de corriente-potencial constituyen una primera aproximación en el estudio

de la corrosión, pues permiten observar el efecto que producen variables como la

composición química del electrolito, la temperatura y el tiempo de inmersión, entre

otros, en las distintas reacciones que tienen lugar en la superficie del electrodo.

Figura 11. Curvas de polarización para electrodos mixtos.

Para un electrodo de titanio inmerso en un medio neutro aireado, las

reacciones que tienen lugar son la oxidación del metal:

+i

-i

E

E´eq

EeqH2

Ecorr

Ti0 → Ti4+ + 4e-

O2 + 2H2O + 4e- → 4OH-

EeqO2

2H+ + 2e- → H2

icorr


Ti → Ti4+ + 4e-

y la reducción del oxígeno (Figura 11):

O2 + 2H2O + 4e- → 4OH-

En el potencial mixto de corrosión se igualan las densidades de corriente de

reducción y de oxidación, y la densidad de corriente neta es cero. La curva i/E que se

obtiene, es la suma de las curvas de oxidación anódica y de reducción catódica (trazo

discontinuo).

La ecuación básica de la curva densidad de corriente-potencial para un proceso

de corrosión es:

{ (

)

(

)

} (1)

donde:

: es la densidad de corriente total.

: es la densidad de corriente de corrosión.

= E – Ecorr : es la polarización.

F: constante de Faraday (96485 C/mol).

R, n y T: tienen su significado habitual.

← y →: son los coeficientes de transferencia de las reacciones anódica y catódica

respectivamente.

Las curvas de polarización de un electrodo mixto pueden representarse en

diagramas semilogarítmicos. Esta representación de E vs log i (Figura 12), conocida

como diagrama de Tafel es de gran utilidad para evaluar parámetros cinéticos [94]. A

partir del punto de intersección de las dos rectas (Figura 12) es posible calcular el

potencial mixto de corrosión (Ecorr) y el log icorr.


Figura 12. Diagrama de Tafel completo de un electrodo mixto en un medio neutro aireado.

Debido a que la polarización catódica de concentración es muy pronunciada se

obtiene una curva que tiende a ser paralela al eje de potencial. La densidad de

corriente de corrosión se reduce enormemente. En este caso la corrosión estaría

controlada catódicamente. La ecuación (1) puede representarse en función de las

pendientes de Tafel anódica y catódica:

{ (

) (

)}

donde:

; Pendiente de la recta anódica.

; Pendiente de la recta catódica.

Log i

E

Ecorr

icorr

Ti0 → Ti4+ + 4e-

O2 + 2H2O + 4e- → 4OH-

Eeq

E´eq

i0 i´0


Ambas pendientes pueden obtenerse experimentalmente a partir de las

pendientes de las curvas de densidad de corriente-potencial cuando estas se

representan en escala semilogarítmica.

3.3.3.3 Espectroscopía de impedancia electroquímica (EIS)

La espectroscopía de impedancia electroquímica (EIS) es una técnica

ampliamente extendida en muchos campos científicos. Es una técnica no destructiva,

muy sensible a pequeños cambios en el sistema que permite determinar la influencia

del medio (composición química del electrolito, concentración de oxígeno, pH, etc) y

de factores externos (potencial aplicado), en las propiedades electroquímicas del

sistema en estudio.

Como comentamos anteriormente, en electroquímica los parámetros cinéticos

se determinan a partir del análisis de los procesos de relajación de las reacciones

electródicas que quedan desplazadas del equilibrio o del estado estacionario, por

aplicación de una señal eléctrica. Dicho desplazamiento puede estar motivado por la

aplicación de una señal de tipo escalón, rampa rectangular, triangular, etc. En el

método de la impedancia electroquímica, partiendo del potencial de equilibrio o del

potencial a circuito abierto, la señal de excitación que se aplica es una función de tipo

sinusoidal:

E = E0 senωt

Variando la frecuencia, ω, de esta señal de potencial, E, desde cero al infinito, se

obtiene la respuesta del sistema, esta vez en corriente, i [95].

I = i0 sen(ωt+)

siendo E0 e i0 las amplitudes máximas de la señal de entrada y de su respuesta en

corriente, respectivamente, mientras que es la diferencia de fase entre dichas


señales. Por lo general, para conseguir respuestas lineales y que no se altere

irreversiblemente el sistema con la medida, la señal de entrada (E) se aplica sobre el

potencial de equilibrio o potencial estacionario del electrodo y su amplitud (E0) suele

ser muy baja, dentro del orden de 5-10 mV.

La relación entre la señal de potencial aplicada y la corriente de respuesta se

conoce como impedancia del sistema, de igual forma que en corriente continua, la

relación entre el voltaje y el flujo de corriente define la resistencia, en virtud de la ley

de Ohm. Pero la impedancia, a diferencia de la resistencia, es una magnitud vectorial,

con una dirección o argumento, :

= arctan (Z”/Z’)

donde Z´es la componente real y Z” la componente imaginaria de la impedancia. Y un

modulo, ⎪Z⎪, que vendrá definido por el cociente de las amplitudes de la señal de

voltaje y la señal de corriente:

⎪Z⎪= E0/i0

siendo:

⎪Z⎪ = [(Z’)2 + (Z’’)2]1/2

Dado que la aplicación del potencial en forma de onda sinusoidal tiene lugar en

un amplio rango de frecuencias, se obtiene para cada valor de frecuencia un vector

impedancia. Existen diferentes formas de representar la impedancia [96], siendo las

más utilizadas los denominados diagramas de Nyquist y de Bode. El diagrama de

Nyquist consiste en la representación en el plano complejo de la parte real e

imaginaria de los extremos del vector impedancia en todas y cada una de las

frecuencias estudiadas. El diagrama de Bode recoge la variación del módulo del vector

impedancia y del ángulo de fase, en función de la frecuencia.


La medida de impedancia en un sistema electroquímico constituye un examen

analítico de los distintos procesos que tienen lugar y que se manifiestan global y

simultáneamente en el sistema investigado. Así, cuando se trabaja a frecuencias

bajas, tanto los procesos rápidos como los lentos tienen lugar. Sin embargo, al

aumentar la frecuencia solo se observa la contribución de los procesos más rápidos,

que son los que tienen tiempo suficiente para ocurrir, antes de la inversión de la

polaridad de la señal de alterna.

Los resultados de impedancia son comúnmente interpretados por medio de un

circuito equivalente. En este sentido, los parámetros investigados en los experimentos

de impedancia se consideran como elementos eléctricos, los cuales forman un circuito

eléctrico que simula el comportamiento experimental. De acuerdo con el modelo

seleccionado y sus propiedades es posible obtener información de los mecanismos

electroquímicos y las propiedades del sistema. A continuación, se describen los

elementos eléctricos más comunes:

- Resistencia (R): representa la resistencia a la transferencia de carga a través de

una cierta interfase (por ejemplo electrolito/metal). Puede estar relacionada con la

resistividad presente para un compuesto o disolución a la transferencia de carga a

través de ellos (resistencia del electrolito, Re) o incorporada en un subcircuito RC

(circuito eléctrico formado por una resistencia combinada en paralelo con una

capacidad) la cual corresponde a la resistencia de transferencia o a la resistencia

faradaica de la interfase.

- Capacidad (C): representa la distribución de cargas en la interfase

electrodo/electrolito. Debido a la electroneutralidad de la materia, una disposición de

cargas sobre una superficie fuerza una imagen de signo contrario en la otra cara de la

interfase, haciendo que la doble capa en torno a los electrodos, las películas

pasivantes y otras capas superficiales, se comporten como condensadores o circuitos

eléctricos más complejos que contienen condensadores. La principal ventaja de este

elemento es la posibilidad de evaluar el espesor de la capa física (medio dieléctrico)


existente entre las placas del condensador. Generalmente, en sistemas reales este

elemento se corrige para tener en cuenta diferentes aspectos que pueden influir en

su comportamiento no ideal. Esta corrección de la capacidad se conoce como

elemento de fase constante, CPE (constant phase element). El CPE está definido por la

función empírica de admitancia de la expresión siguiente [97]:

donde Yp es una constante independiente de la frecuencia; el exponente es tal que

se encuentra en un intervalo . Si = 0 el CPE es una resistencia de valor R =

1/Yp. Cuando = 1 es un condensador puro de valor C = Yp. Cuando = 0,5 es la

admitancia de Warburg [97].

Figura 13. Circuito equivalente de Randles simplificado y su respuesta en frecuencia, representada en el plano complejo en forma de diagrama de Nyquist.

En la Figura 13 se muestra el circuito más sencillo (Randles simplificado), el cual

explica satisfactoriamente el comportamiento de un gran número de sistemas

electroquímicos. La respuesta en frecuencia del circuito de Randles simplificado, es

una semicircunferencia a partir de la cual se pueden determinar los valores de los

elementos del circuito (Figura 13). Re (resistencia del electrolito) vendrá dado por el

punto de corte a altas frecuencias del diagrama de impedancia con el eje real, Rtc

(resistencia a la transferencia de carga) coincidirá con el diámetro de la


semicircunferencia y, por último, Cdc (capacidad de la doble capa) se puede

determinar a partir del valor máximo de Z”:

Cdc = -1/(maxRtc)

donde = 2f, siendo f la frecuencia.

Procesos más lentos como la difusión se manifiestan por una distorsión de los

valores del vector impedancia que definen la semicircunferencia, produciéndose a

bajas frecuencias una línea recta de pendiente unidad. En sistemas electroquímicos

reales, a veces los diagramas de impedancias presentan ciertas anomalías que los

apartan del comportamiento ideal, siendo necesario un estudio exhaustivo de los

procesos que tienen lugar y cómo se pueden simplificar e interpretar a través de

circuitos equivalentes [98, 99].

Transformadas de Kramers-Kronig

Para determinar si los resultados obtenidos de impedancia son válidos o han

sido distorsionados durante la adquisición de los resultados experimentales, es

necesario aplicar las relaciones de Kramers-Kronig [100]. Las ecuaciones de Kramers-

Kronig (K-K) son relaciones de naturaleza matemática, por lo que no reflejan ninguna

otra propiedad física del sistema objeto de estudio. La ventaja de las relaciones de K-K

es que no es necesario utilizar un circuito eléctrico equivalente para determinar la

consistencia de los resultados experimentales [101].

Las transformadas de K-K se pueden aplicar siempre que el sistema objeto de

estudio sea invariante en el tiempo y cumpla las siguientes cuatro condiciones:

causalidad, linealidad, estabilidad, y valor finito [102, 103].

Un sistema es causal si su respuesta no precede a la perturbación [102]. Si a un

sistema en reposo se le aplica una perturbación en t = 0, la respuesta del sistema


debe ser 0 para t < 0. Físicamente esto quiere decir que el sistema no genera ruido

independiente de la señal aplicada para t ≥ 0.

Un sistema es lineal si la relación entre la perturbación introducida y la

respuesta se puede describir mediante ecuaciones diferenciales lineales [100]. Esto

significa que la impedancia obtenida sea independiente de la perturbación recibida.

Así, para asegurar la linealidad, se suele utilizar una amplitud de la perturbación entre

5 y 15 mV. Aunque hay que tener en cuenta que si la amplitud es demasiado pequeña

el cociente señal/ruido disminuye [103].

Un sistema electroquímico es estable si, cuando cesa la perturbación impuesta

el sistema vuelve al estado original [103].

La impedancia debe tener un valor finito en todo el intervalo de frecuencia

analizado, incluyendo ω → 0 y ω → ∞. Desde un punto de vista práctico, la condición

de valor finito no es crítica. En estudios de corrosión, sin embargo, la falta de

consistencia de los resultados electroquímicos, al aplicar las relaciones de K-K es, a

menudo debida a un fallo en la condición de estabilidad [104].

Las integrales de las transformadas de K-K se pueden expresar como [105]:

(

)∫

-

(5)

(

) ∫

-

(6)

donde Z’() y Z”() son funciones continuas que proporcionan la parte real e

imaginaria de la impedancia respectivamente, en función de la frecuencia angular ()

en rad/s (0 < < ∞); siendo x una variable de integración entre 0 < x < ∞. Utilizando

las ecuaciones (5) y (6) es posible transformar la parte real de la impedancia en la


parte imaginaria y viceversa [105]. La comparaciones de los diagramas obtenidos

experimentalmente, con los obtenidos calculando las relaciones de K-K, es un método

de validación de la adquisición de resultados.

3.3.4 Microbalanza de cristal de cuarzo (QCM)

La microbalanza de cristal de cuarzo es un dispositivo sensible a la masa que

tiene la habilidad de medir pequeños cambios de masa a tiempo real en sensores de

cristal de cuarzo. La sensibilidad de la QCM es de aproximadamente 100 veces mayor

que una balanza electrónica con una sensibilidad de 0,1 g [106]. Esto significa que la

QCM es capaz de medir cambios de masa tan pequeños como una fracción de

monocapa o de una sola capa de átomos. La alta sensibilidad y la supervisión en

tiempo real de los cambios de masa en el cristal del sensor de cuarzo, hacen de la

QCM una técnica con diversas aplicaciones.

La base física del funcionamiento de la QCM es el efecto piezoeléctrico inverso,

en el que la aplicación de un campo eléctrico, a través de un material piezoeléctrico,

induce una deformación del material. Jacques y Pierre Curie descubrieron el efecto

piezoeléctrico en 1880. Se encontró que el estrés mecánico aplicado a la superficie de

materiales como la sal Rochelle turmalina y el cuarzo (acéntricos4), daba lugar a un

potencial eléctrico a través del cristal, cuya magnitud era proporcional a la tensión

aplicada. Gracias a esta tensión mecánica, se produce un desplazamiento físico de los

átomos, haciendo que el momento dipolar varíe y generando una carga en el cristal.

El descubrimiento del efecto piezoeléctrico permitió verificar

experimentalmente el efecto piezoeléctrico inverso, que consiste en la aplicación de

un voltaje, a través de estos cristales, dando lugar a la correspondiente tensión

mecánica. El campo eléctrico induce la reorientación de los dipolos del material

4 Material acéntrico es aquel que posee un eje polar debido a los dipolos asociados a la disposición de los átomos en la red

cristalina.

http://translate.googleusercontent.com/translate_c?anno=2&hl=es&rurl=translate.google.es&sl=en&tl=es&u=http://www.tau.ac.il/~phchlab/experiments/QCM/Piezoelectric_History.htm&usg=ALkJrhgLZw9OTxoHzWiJMpaC-3v3aa7pWA


acéntrico, dando como resultado la tensión de red y la deformación de corte. La

magnitud de la deformación de corte depende de la magnitud del potencial aplicado.

La polaridad opuesta produce una tensión idéntica, pero en la dirección opuesta.

Cristal de cuarzo

El cuarzo es la forma más estable de la sílice (o dióxido de silicio SiO2). Para las

aplicaciones de la QCM se emplean cristales de -cuarzo, debido a sus excelentes

propiedades mecánicas y piezoeléctricas. El ángulo de corte, con respecto a la

orientación de los cristales, determina el modo de oscilación. El cristal cortado AT,

que es el más utilizado para aplicaciones de QCM, se fabrica cortando una barra de

cuarzo con un ángulo de corte 35° 10’con respecto al eje óptico, como se muestra en

la Figura 14 [106].

Figura 14. Fotografía del cristal de cuarzo y dibujo del corte AT.

La ventaja de la utilización del cristal de cuarzo cortado AT es que, la variación

de frecuencia con la temperatura, en torno a la temperatura ambiente es cercana a

cero.

En los estudios de QCM, se utiliza un disco delgado de -cuarzo, que se

intercala entre dos electrodos metálicos depositados por evaporación en uno y otro


lado del cristal, con un espesor aproximado de 300 nm. Los electrodos de oro han sido

unos de los más utilizados en los estudios de QCM, debido a la facilidad con la que se

evapora el Au. Sin embargo, se han empleado también Cu, Ni, Pt, Ti y otros metales.

Experimentalmente se ha comprobado que los cambios en la masa unida al

cristal del cuarzo, producen cambios en la frecuencia de resonancia del mismo. La

relación entre el cambio de frecuencia de resonancia fundamental (fm) y el cambio

de masa (m) viene dada por la ecuación de Sauerbrey [75]:

2/1

2

0

2

0 22

A

mf

A

mff

(7)

donde:

f0 : la frecuencia de resonancia antes de la adición o eliminación de masa,

A : el área del cristal,

: la densidad del cuarzo (2,648g·cm-3),

: la velocidad de transmisión de onda,

: la constante de cizallamiento (2,947x1011g·cm-1·s-2, corte AT).

Esta ecuación es válida para pequeñas variaciones de masa, que impliquen un

cambio de frecuencia inferior al 2% y depósitos no viscosos. Otro factor que afecta en

gran medida a la respuesta es la temperatura, ya que ésta origina cambios en la

viscosidad y densidad de la disolución. Por esta razón, es necesario termostatizar la

celda electroquímica, en adición a los motivos generales de cualquier experimento

electroquímico.

La microbalanza de cristal de cuarzo constituye una técnica novedosa y muy

prometedora en electroquímica (los primeros estudios con microbalanza de cuarzo in

situ datan de 1981), debido a que permite medir los cambios de masa que tienen

lugar durante los procesos electroquímicos [107]. Dichos cambios de masa pueden ser

debidos a las variaciones de masa que pueden tener lugar durante la oxidación o

64 3.4 Equipos

reducción de las especies electroactivas adheridas al electrodo, pero además, también

a cambios físicos en la zona interfacial. Así, la microbalanza de cuarzo responde, no

sólo a los cambios de masa del depósito, sino también a los cambios de densidad y/o

viscosidad que pueden producirse en una capa de disolución de unos 300nm desde la

superficie del electrodo. La alteración de la zona interfacial durante el proceso

electroquímico puede estar asociada a diversos factores: cambios en las propiedades

eléctricas del electrodo (por ejemplo debido a la corrosión del mismo), flujos de

especies hacia o desde el electrodo, asociados a la propia reacción de oxidación o

reducción, o como en nuestro caso la adsorción o desorción de especies sobre la

superficie del electrodo.

3.4 Equipos

3.4.1 Microscopio electrónico de barrido (SEM) y microanálisis por dispersión

de rayos X (EDX)

La morfología superficial del cristal de Ti (Ti-Q) y del Ti tratado térmicamente

(Ti-TT) se analizó utilizando un microscopio electrónico de barrido de modelo JEOL-

6500F, equipado con un cañón de emisión de campo (FEG), acoplado con dispersión

de rayos X (EDX). Las muestras se examinaron con 15 kV y 7 kV de voltaje de

aceleración, dependiendo de si se precisaba realizar microanálisis o toma de

imágenes, respectivamente. Las imágenes se obtuvieron usando un haz de electrones

secundarios.

3.4.2 Microscopio de fuerza atómica (AFM)

Con el fin de obtener imágenes topográficas y la medida de la rugosidad del Ti-

Q y del Ti-TT, se empleó la microscopía de fuerza atómica (AFM). Para ello, se utilizó

un AFM 5100 (Agilent) equipado con un scanner de 10 m de rango máximo en las

direcciones “x” e “y”, y de 4 μm en la dirección “z”. Las imágenes se obtuvieron


utilizando un cantiléver de nitruro de silicio con un radio de curvatura de sonda

nominal de 10nm y una constante de fuerza nominal de 40 N/m. La resolución de las

imágenes fue de 512 x 512 puntos. Se utilizó un software WSxM (Nanotec) [108]. Se

trabajó en modo de contacto intermitente o “tapping”. Además, no se precisó de un

tratamiento específico previo de las muestras estudiadas.

3.4.3 Espectrómetro fotoelectrónico de rayos-X (XPS)

El espectrómetro que se utilizó, para realizar la caracterización superficial por

medio de XPS de las muestras de titanio fue un VG Escalab 200R, equipado con un

analizador hemiesférico de electrones (energía de paso de 50 eV) y una fuente de

rayos-X de MgKα (hν = 1254,6 eV, 1 eV = 1,6302 · 10-19 J), a 120 W. Para medir la

energía cinética de los fotoelectrones se utilizó un analizador de electrones

hemiesférico, trabajando en modo de paso de energía constante. Durante la

adquisición de resultados, la presión en la cámara de análisis se mantuvo por debajo

de 2·10-8 mbar. Los resultados de XPS se obtuvieron en incrementos de 0,1 eV, con un

tiempo entre cada medida de 50 ms. Las energías de ligadura se calibraron respecto al

pico del C1s a 284,9 eV. Los espectros de alta resolución se resolvieron ajustando las

curvas a los componentes de cada pico, mediante el programa “XPS peak”. Se

ajustaron los resultados sin realizar suavizado de los mismos. Para ajustar la forma de

las curvas a los componentes, se utilizaron funciones simétricas, mezcla de Gaussiana

y Lorentziana. Las proporciones atómicas se calcularon a partir de las proporciones de

las áreas de pico experimentales y normalizando con los factores de sensibilidad

atómica [109].

3.4.4 Potenciostato

Los estudios de potencial de corrosión, espectroscopía de impedancia

electroquímica y curvas de polarización, se llevaron a cabo con un potenciostato

Gamry Instruments Referencia 600.

66 3.4 Equipos

3.4.5 Microscopio óptico invertido

La observación de los cultivos de control de osteoblastos en placas de

poliestireno y el recuento de los mismos, se realizó con un microscopio óptico

invertido Motic modelo AE30.


La microbalanza de cristal de cuarzo que se empleó para realizar los estudios

con los cristales de Ti (Ti-Q) fue una Stanford Research Systems (SRS) Modelo

QCM200. En la Figura 15, se muestra el brazo de la QCM así como sus componentes.

Figura 15. Brazo de QCM y sus componentes.

Esta técnica permite relacionar los cambios de frecuencia con los cambios de

masa. Para realizar las medidas de adsorción de los componentes del medio celular

sobre el Ti-Q se mantuvo la temperatura a 25°C por medio de un baño

termostatizado. El dispositivo utilizado para realizar las medidas de adsorción de

osteoblastos Saos-2 con la QCM fue el que se muestra en la Figura 16.

El sensor de cuarzo se aloja en el brazo de la microbalanza de cuarzo, que a su

vez está fijado dentro de una macrocelda electroquímica (Figura 16). La celda

presenta tres orificios para manipulación desde el exterior. En uno de ellos se coloca


un tubo con atmósfera de aire al 5 % de CO2. La celda presenta una doble pared que

permite la recirculación del agua, manteniendo la temperatura. Dentro de la celda

electroquímica se añade agua destilada para evitar que se evapore el líquido presente

encima del sensor. Por la misma razón, se tapa con un cristal cubreobjetos el brazo de

la QCM. Esta celda se mantuvo con un baño termostátizado a 37°C para el estudio de

ganancia de masa debido a la adhesión de los osteoblastos. Para evitar pérdidas de

calor, la celda en su conjunto se mantuvo dentro de una caja de material aislante.

Figura 16. Macrocelda electroquímica utilizada para realizar las medidas de QCM en presencia de los osteoblastos Saos-2.

3.5 Metodología

3.5.1 Técnicas de caracterización


dispersión de rayos X (EDX)

Las muestras de Ti-Q y Ti-TT en presencia y ausencia de osteoblastos, a

distintos tiempos de ensayo, fueron caracterizadas mediante microscopía electrónica

de barrido (SEM).

68 3.5 Metodología

Previo al estudio de SEM y/o EDX de una determinada muestra es necesario

metalizarla, siempre que ésta no sea conductora. Este metalizado puede ser de oro

(requerido para la toma de imágenes de alta calidad), o de carbono (indicado en el

caso de realizar microanálisis).

En el caso de toma de imágenes de Ti-Q y Ti-TT con osteoblastos se requiere

seguir un protocolo de fijación y posterior deshidratación de la estructura celular, ya

que el alto vacío de trabajo, necesario en el microscopio electrónico de barrido,

desestructura la materia biológica. Este protocolo de preparación se llevó a cabo a 4°C

en una campana de flujo laminar.

Las muestras, con los osteoblastos adheridos, se lavaron dos veces con

disolución tamponada de fosfato (PBS). Posteriormente, se añadió a cada pocillo

glutaraldehído al 2,5% en PBS hasta cubrir las muestras, que se dejaron sumergidas

durante 24 horas a 4°C, con el objeto de fijar la estructura celular. A continuación se

procedió a la deshidratación de las muestras remplazando progresivamente el

contenido en agua de la disolución por etanol. Para ello, las muestras se lavaron tres

veces con agua destilada para eliminar los restos de glutaraldehído y PBS. Luego se

partió de un volumen fijo de agua destilada, al que se fue retirando disolución y

añadiendo determinadas cantidades de etanol consiguiendo en cada paso las

siguientes concentraciones finales de etanol: 35%, 50%, 70% 95% y 100%. Las

muestras se mantuvieron 10 minutos en cada disolución. Por último, para dotar a

estas muestras de la resistencia mecánica necesaria para soportar el alto vacío del

microscopio, se fue remplazando progresivamente el etanol absoluto por

tetrametilsilano (TMS). El procedimiento fue retirar el etanol absoluto e ir añadiendo

en su lugar TMS, para alcanzar progresivamente 50% de TMS y 100% de TMS, en

cuyas disoluciones permanecieron las muestras durante 10 minutos. Transcurrido el

tiempo de tratamiento, se retiró el TMS y se dejó secar en la campana durante 30

minutos. Las muestras, así preparadas, pueden ser observadas al microscopio

electrónico de barrido.



Las muestras en estado de recepción, Ti-m, después del tratamiento térmico,

Ti-TT así como el Ti-Q fueron caracterizadas mediante AFM, para conocer la

topografía y la rugosidad de su superficie. No ha sido necesaria una preparación

previa de las distintas muestras.

3.5.1.3 Espectroscopía fotoelectrónica de rayos-X (XPS)

Las muestras de Ti en estado de recepción (Ti-m) después del tratamiento

térmico a 277°C durante 5 horas (Ti-TT), así como el Ti-Q fueron analizadas mediante

XPS. Además, esta técnica también se utilizó para analizar la composición de los dos

acabados de titanio, después de su inmersión, durante 7 días, en los distintos

componentes del DMEMc.

Igualmente el XPS se utilizó para analizar las proteínas presentes sobre las

superficies de Ti-TT, después de haber tenido lugar el crecimiento celular durante 7

días en un cultivo de osteoblastos. Para ello, los osteoblastos adheridos a la superficie

de las muestras se retiraron sumergiendo las muestras en agua destilada, en un baño

de ultrasonidos durante 10 minutos y dejándolas secar [110]. De esta manera, tanto la

capa de óxido de titanio como las especies fuertemente adsorbidas, permanecieron

sobre la superficie.

3.5.2 Ensayos en cultivos celulares

La línea celular de osteoblastos empleada para los distintos experimentos, fue

Saos-2 de osteosarcoma humano. Los osteoblastos en medio de cultivo DMEMc se

mantuvieron en una atmósfera de aire con un 5% de CO2, a 37°C y un 100% de

humedad relativa en un incubador.

Se obtuvieron curvas de crecimiento de la línea celular de osteoblastos para

conocer, en primer lugar, la velocidad de proliferación de los mismos y,

70 3.5 Metodología

posteriormente, poder comparar dicha proliferación sobre diferentes sustratos. Para

ello, se sembraron en una placa de poliestireno de 6 pocillos 2,5·104 osteoblastos/ml

(1,5·104 osteoblastos/cm2). Esta cantidad de osteoblastos es apropiada para cubrir

toda la superficie del pocillo en aproximadamente una semana. Las placas con los

cultivos se introdujeron en el incubador y se observó su crecimiento y proliferación

durante los 7 días de ensayo, mediante el microscopio óptico invertido. Transcurridos

2, 4, 6 y 7 días se procedió a despegar y contar dichos osteoblastos.

El recuento celular comprende una primera fase de despegue celular y una fase

posterior de contaje. Para llevar a cabo el despegue celular a cada tiempo de cultivo,

cada pocillo se lavó dos veces con una disolución tampón de fosfatos (phosphate

buffer solution, PBS). Una vez retirado el PBS, se añadió 0,4 ml de Tripsina-EDTA5, y

para favorecer la acción de la tripsina y por tanto el despegue celular, se introdujeron

durante aproximadamente 5 minutos en un incubador. Pasados esos 5 minutos, la

tripsina se neutralizó con 0,6 ml de medio fresco, DMEMc. La suspensión de

osteoblastos en DMEMc y tripsina se centrifugó a 1300 rpm, durante 4 minutos, para

separar los osteoblastos del medio de cultivo. Una vez decantado el sobrenadante se

obtuvo un pellet visible en el fondo del tubo, al cual se añadieron 5 ml de medio

fresco y se resuspendió para asegurar una distribución celular homogénea.

Posteriormente, para el contaje celular, se cargaron 15 l en cada lado de la cámara

Neubauer de contaje de células (Figura 17). Con ayuda del microscopio óptico

invertido, se buscó la cuadrícula que aparece en la Figura 17 y se contaron los

osteoblastos situados en los cuadrados marcados con una L. El total de osteoblastos

se sumó, se dividió entre 4 y se multiplicó por un factor de corrección 104, así se

5 La tripsina es una enzima peptidasa que rompe los enlaces peptídicos de las proteínas, mediante hidrólisis,

para formar péptidos de menor tamaño y aminoácidos. En este caso, se utiliza para romper las uniones

peptídicas de las células con la superficie. El ácido etilendiaminotetraacético o EDTA es una sustancia utilizada

como agente quelante que puede crear complejos con un metal que tenga una estructura de coordinación

octaédrica, como por ejemplo el calcio.


obtuvo el número de osteoblastos/ml. El contaje celular se realizó siempre por

duplicado.

Figura 17. Cámara Neubauer de contaje de células.

Con el objetivo de evaluar cuál es la concentración óptima de osteoblastos

adheridos sobre la superficie, que sea sensible a las medidas de impedancia, se

realizaron ensayos en función de la concentración celular, variando ésta entre 1,5·104

y 3,0·105 osteoblastos/cm2. Lo que se pretende es obtener un recubrimiento celular

total en el cultivo de Saos-2 a la semana de incubación. Como resultado, se eligió la

concentración más baja, 1.5 104 osteoblastos/cm2, como concentración celular más

adecuada para registrar el potencial de corrosión, las curvas de polarización y la

espectroscopía de impedancia electroquímica de las muestras de titanio.

En los ensayos con la QCM en presencia de osteoblastos la concentración

celular se varió entre 1,5·104 y 3,0·105 osteoblastos/cm2 obteniéndose una

concentración óptima de 5,0·104 osteoblastos/cm2 para alcanzar la confluencia celular

a las 24 horas de ensayo.

Como medida de control y para verificar la viabilidad del cultivo, en cada

ensayo se pusieron en marcha paralelamente cultivos de osteoblastos en placas de

poliestireno. De esta manera, se observó al microscopio óptico invertido la viabilidad

y proliferación de la línea celular en cada ensayo realizado con las superficies de Ti.

72 3.5 Metodología

3.5.3 Técnicas electroquímicas

Las técnicas electroquímicas que se utilizaron para evaluar la modificación de la

interfase metal/disolución debida a la interacción con los diferentes componentes del

DMEMc, así como con los osteoblastos, fueron la evolución del Ecorr con el tiempo, la

espectroscopía de impedancia electroquímica (EIS) durante 7 días y las curvas de

polarización después de 7 días de ensayo.

3.5.3.1 Potencial de corrosión

La evolución del potencial de corrosión (Ecorr) con el tiempo de inmersión (siete

días) de las muestras de Ti-Q y Ti-TT en ausencia de osteoblastos se midió frente al

electrodo de referencia Ag/AgCl. Sin embargo, en presencia de osteoblastos, el Ecorr se

midió frente a un pseudoreferencia de Pt.

3.5.3.2 Curvas de polarización

Con el objetivo de evaluar los parámetros correspondientes a la corrosión del

Ti-Q y del Ti-TT en cada una de las disoluciones de los componentes del medio celular

(DMEMc) se obtuvieron curvas de polarización. Este método potenciodinámico

consiste en aplicar un barrido lineal de potencial (catódico o anódico) a partir del

potencial de corrosión, a una velocidad de barrido de 1 mV/s. La magnitud de la

polarización fue de ± 0,5 V respecto del Ecorr. Las curvas de polarización se obtuvieron

a los 7 días de estar en contacto con cada uno de los componentes del DMEMc

estudiados sobre Ti-Q y Ti-TT, a los 7 días en el caso de los ensayos con Saos-2 sobre

Ti-Q y a los 1, 3, 5 y 7 días para los ensayos con Saos-2 sobre Ti-TT. Para realizar los

ensayos con osteoblastos se utilizaron diferentes muestras para cada tiempo de

ensayo y para cada una de las ramas catódica y anódica de las curvas de polarización.



Para obtener un espectro de impedancia electroquímica se aplicó una onda

sinusoidal de potencial de ± 10mV de amplitud respecto al Ecorr, para las muestras de

Ti-TT y Ti-Q que estaban en contacto con los componentes del DMEMc, y ± 5mV de

amplitud para las muestras de Ti-Q y Ti-TT que estaban en contacto con los

osteoblastos. El intervalo de frecuencias fue de 105 a 10-3 Hz, obteniendo 5 puntos por

década.

Los resultados de las medidas de EIS experimentales se ajustaron a diferentes

circuitos eléctricos equivalentes. Los parámetros de estos circuitos se calcularon,

ajustando la función de impedancia al espectro obtenido por medio de un programa

de ajuste de mínimos cuadrados, no lineal (NLLS program), como el Z-plot/Z-view.

En general, la selección de cada uno de los circuitos eléctricos equivalentes

utilizados para ajustar los resultados experimentales de impedancia, se realizó

teniendo en cuenta los siguientes criterios: 1) el significado físico del circuito, 2) que

los errores relativos para cada parámetro del circuito fueran mínimos y 3) que el valor

de , referido al ajuste con los datos experimentales, fuera el menor de todos.

Con el fin de evaluar la fiabilidad de los resultados de EIS, se procedió a realizar

las transformadas de Kramers-Kronig (K-K) mediante el programa Z-plot/Zview

representando las componentes real e imaginaria de la impedancia frente a la

frecuencia. En estas representaciones se incluyen tanto los resultados experimentales

como los obtenidos a partir de las transformadas de K-K. Asimismo, se calculó el error

para cada una de las representaciones a partir de la siguiente función estadística [111]:

∑ | |

(8)

donde | | representa el valor absoluto de la diferencia entre el valor

experimental de la impedancia y el valor calculado de las transformadas de

74 3.5 Metodología

K-K ; es el valor máximo de la impedancia experimental, y , el

número de puntos de los resultados experimentales. Con este cálculo, se consigue

comparar los resultados obtenidos experimentalmente con los calculados a partir de

las transformadas de K-K.


El tratamiento del cristal de cuarzo con Ti evaporado consistió en lavarlo

previamente con agua destilada y a continuación se secó con N2 de alta pureza.

Seguidamente, se montó el brazo de la QCM (Figura 15) con el cristal de cuarzo de Ti y

se realizaron medidas en aire hasta obtener un valor constante de frecuencia de

oscilación próximo a 5 MHz, que es la frecuencia del cristal de cuarzo.

A continuación, se introdujo el brazo de la QCM con el electrodo de Ti-Q en

posición vertical en agua ultra-pura a T = 25°C, obteniéndose una disminución en el

valor de la frecuencia de f = -776 Hz, valor próximo al calculado teóricamente por

Kanazawa y Gordon [78]. Posteriormente, se introdujo el brazo de la QCM en las

diferentes disoluciones de los componentes del DMEMc, es decir, en las disoluciones

P, PCa, BSA y FBS, a T = 25°C hasta que se obtuvieron valores estables de frecuencia

de oscilación.

Para llevar a cabo los ensayos de QCM con los osteoblastos Saos-2, se fijó el

brazo de la QCM en posición horizontal como se muestra en la Figura 16 y se registró

la frecuencia en aire hasta alcanzar un valor constante de aproximadamente 5 MHz.

Posteriormente, se añadieron 2 ml de DMEMc y se registró la frecuencia durante

aproximadamente 2 h. Una vez alcanzado un valor de la frecuencia estable de

aproximadamente 868 Hz, se añadió el volumen de suspensión celular, necesario para

alcanzar la concentración de osteoblastos deseada, y se registró la frecuencia durante

aproximadamente 24 h. Este tiempo es suficiente para que la mayoría de los

osteoblastos presentes en la suspensión celular se adhieran a la superficie del Ti-Q. A


continuación, sin dejar de registrar la frecuencia, se despegaron los osteoblastos

retirando el medio y añadiendo 1 ml de tripsina. Cuando se obtuvo un valor de

frecuencia constante (aproximadamente 5 h), se adicionó 1 ml de DMEMc para parar

el efecto de la tripsina y se procedió al contaje de los osteoblastos para determinar

cuántos habían quedado adheridos a la superficie expuesta.

4. Resultados y discusión

4. Resultados y discusión 79

4.1 Estudio de la interfase Ti-Q/componentes del DMEMc

4.1.1 Caracterización de Ti-Q

La caracterización de la morfología superficial del Ti-Q fue realizada mediante

SEM y AFM, y la composición superficial fue determinada por XPS.

4.1.1.1 Microscopía electrónica de barrido (SEM)

En la Figura 18 se puede observar la superficie de Ti evaporado sobre los

cristales de cuarzo (Ti-Q) a diferentes magnificaciones. La superficie metálica revela

una estructura para el Ti-Q en forma de escamas depositadas sin ninguna orientación

preferencial. Esta distribución aleatoria le confiere a la muestra una fina rugosidad

superficial, dotándola de cierta homogeneidad.

Figura 18. Imágenes de microscopía electrónica de barrido (SEM) de la superficie del Ti-Q a diferentes magnificaciones.


Las imágenes de AFM (10 m x 10 m) de Ti-Q (Figura 19) muestran una

topografía superficial homogénea con un perfil de rugosidad uniforme y

prácticamente constante en toda la muestra (RMS = 37 nm). Por tanto, se puede

concluir que este acabado presenta una rugosidad superficial a escala nanométrica

reproducible; esta rugosidad a nivel de nanoescala es importante, ya que puede influir

1 m 100 nm

80 4.1 Estudio de la interfase Ti-Q/componentes del DMEMc

en la respuesta física, química y biológica, así como en la conducta frente a la

corrosión de un biomaterial.

Figura 19. Imagen por microscopía de fuerza atómica (AFM) de la topografía superficial del Ti-Q y perfil de rugosidad.

4.1.1.3 Espectroscopía fotoelectrónica de rayos X (XPS)

La composición química de la superficie del Ti-Q expuesta al aire se analizó por

medio de la espectroscopía fotoelectrónica de rayos-X (XPS). En la Figura 20 se

muestran los espectros de alta resolución del C1s, del O1s y del Ti2p para el Ti-Q.


Figura 20. Espectros de alta resolución de XPS del C1s, del O1s y del Ti2p para el Ti-Q.

El espectro de alta resolución del Ti2p muestra que la superficie está cubierta

por una capa de óxido (formada espontáneamente) cuya composición es solamente


TiO2 (Ti2p3/2 458,5 eV y Ti2p1/2 464,3 eV), aunque también es posible detectar una

pequeña cantidad de Ti metálico (453,6 eV) y una mínima presencia de Ti2O3 (456,5

eV) (Tabla 8). El espectro de alta resolución del C1s se puede resolver en tres picos:

uno a 248,8 eV que representa los carbonos en los hidrocarburos del medio ambiente

(C-C y C-H) y los otros dos picos a 286,4 y 288,4 eV representando los carbonos en los

enlaces C=O y O-C=O [112]. Por último, el espectro de alta resolución del O1s muestra

tres componentes: 529,8 eV asignada al TiO2, 531,5 eV correspondiente al enlace Ti-

OH y 532,3 eV al enlace C=O (Figura 20). La asignación de estos picos está de acuerdo

con los obtenidos por McCafferty y Wightman [33].

Tabla 8. Energía de ligadura y % atómico de los espectros de alta resolución de XPS del O1s, del C1s y del Ti2p para el Ti-Q.

Superficie Elemento Asignación Energía de Ligadura (eV) % atómico

Ti-Q

C1s

C-C, C-H C=O

O-C=O

284,8 286,4 288,4

18,8 3,3 3,8

O1s TiO2

Ti-OH C=O

529,8 531,5 532,3

37,2 11,0 6,9

Ti2p

Ti Ti2O3

TiO2 TiO2

453,6 456,5 458,5 464,3

0,7 0,03 12,5 5,9


Una vez caracterizada la superficie del Ti-Q, se procedió a determinar si, como

consecuencia de la interacción de los distintos componentes del DMEMc con la

superficie de Ti-Q, se producía una adsorción o precipitación de algún compuesto

sobre la superficie. Para ello se utilizó la microbalanza de cristal de cuarzo (QCM).

Cualquier adsorción o precipitación de compuestos o iones sobre la superficie

del Ti-Q se traduce en una variación en la frecuencia de oscilación del cristal, la cual


puede ser relacionada, mediante la ecuación de Sauerbrey (ec. (7)), con un

incremento de masa. En la Figura 21 se muestra la variación de frecuencia en función

del tiempo de inmersión en las disoluciones de NaH2PO4 (P) y NaH2PO4 + CaCl2 (PCa).

El primer valor de frecuencia registrado fue para el Ti-Q en aire, hasta obtener un

valor de frecuencia estable próximo a 5 MHz, que es la frecuencia de oscilación del

cristal de cuarzo. Posteriormente se introdujo en posición vertical el brazo con el Ti-Q

en agua ultrapura a T = 25°C, obteniéndose una disminución en el valor de la

frecuencia de -776 Hz al cabo de aproximadamente 3h, como se puede apreciar en la

Figura 21. Según Kanazawa y Gordon [78] es posible predecir por medio de la ec. (9) el

cambio en la frecuencia de resonancia que tiene lugar cuando un cristal de cuarzo se

sumerge en un medio viscoso, como por ejemplo en una disolución.

(

)

(9)

donde,

fu : la frecuencia de oscilación del cristal (5 MHz)

q : la densidad del cuarzo (2,648 g/cm3)

q: la constante de cizallamiento del cuarzo (2,947·1011 g/cm·s2, corte AT)

L : densidad del líquido en contacto con el electrodo, para el agua (1 g/cm3)

L : la viscosidad del líquido en contacto con el electrodo, para el agua (0,0891

poisse).

La variación teórica de la frecuencia para un cristal de cuarzo de Ti sumergido

en agua destilada da como resultado un f = -714 Hz, similar a los f = -776 Hz que se

obtienen experimentalmente (Figura 21). A continuación se introdujo el Ti-Q en una

disolución de NaH2PO4 (pH = 7,4) registrándose después de 8 horas una disminución

de frecuencia de f = -40 Hz, indicando que los iones fosfato presentes en la

disolución P se han adsorbido sobre la superficie del Ti-Q (Figura 21).


Figura 21. Variación de la frecuencia de oscilación del cristal de cuarzo (Ti-Q) con el tiempo sumergido en la disolución P (NaH2PO4) y la disolución PCa (NaH2PO4 + CaCl2).

Aplicando la ecuación de Sauerbrey [75]:

2/1

2

0

2

0 22

A

mf

A

mff

(7)

donde:

f0 : la frecuencia de resonancia antes de la adición o eliminación de masa

A : el área del cristal (1,37 cm2)

: la densidad del cuarzo (2,648g·cm-3)

: la velocidad de transmisión de onda

: la constante de cizallamiento (2,947·1011g/cm·s2, corte AT)


se calcula el incremento de masa correspondiente a la adsorción de los iones fosfato,

que es de m = 0,71 g/cm2. Posteriormente, esta disolución se cambió por la

disolución PCa, obteniéndose un f = -6 Hz después de 10 h. aproximadamente

(Figura 21). Para estudiar la competitividad entre los iones fosfato y los iones calcio

por adsorberse sobre la superficie del Ti, se sumergió un cristal limpio directamente

en la disolución PCa, dando una disminución de frecuencia con respecto al agua de f

= -48 Hz, al cabo de 75 h. Comparando ambos procedimientos se puede concluir que

cuando ambos iones están presentes simultáneamente en la disolución, la cinética de

adsorción es más lenta.

La adsorción de proteínas como la albúmina sobre la superficie del Ti-Q

aparece en la Figura 22 a. Observamos una disminución de la frecuencia de f = -17

Hz al cabo de 14 horas. Ignorando cualquier cambio que se pueda producir en la

densidad y viscosidad del medio, se puede hacer una estimación aproximada de la

posible cantidad de BSA adsorbida sobre la superficie de Ti-Q. Teniendo en cuenta

que las dimensiones del área proyectada de una molécula de BSA es 4 x 14 nm [52] y

que el área expuesta del electrodo es 1,37 cm2, el número de moléculas de BSA que

formarían una monocapa sería de 2,45·1012. Puesto que la masa molecular de la BSA

es de 66KDa [51], una monocapa de BSA debería pesar 0,268 g. Si utilizamos la

ecuación de Sauerbrey [75], se obtiene que el f teórico para una monocapa de

moléculas de BSA es de -11 Hz. Por tanto, como para la BSA sola se ha obtenido un f

de -17 Hz el número de monocapas formadas es de 1,5: esto indica que la superficie

de Ti-Q se encuentra cubierta por más de una monocapa de BSA.

Por el contrario, si la BSA está en presencia de NaH2PO4 + CaCl2 (disolución BSA)

(Figura 22 b) se obtiene un valor de f = -57 Hz. Es decir, la adsorción de la BSA sobre

la superficie del Ti-Q se ve potenciada por la presencia de los iones Ca2+.


Figura 22. Variación de la frecuencia de oscilación del cristal de cuarzo (Ti-Q) con el tiempo sumergido en (a) una disolución de BSA y (b) una disolución de BSA + NaH2PO4 + CaCl2.

En la Figura 23 aparece la variación de la frecuencia como consecuencia del

proceso de adsorción del FBS. El f obtenido fue de -66 Hz. En este caso, la

disminución de la frecuencia es todavía mayor, lo que concuerda con los resultados


obtenidos hasta ahora, pues el FBS está constituido por multitud de proteínas,

(fundamentalmente BSA) y otros nutrientes celulares.

Figura 23. Variación de la frecuencia de oscilación del cristal de cuarzo (Ti-Q) con el tiempo sumergido en la disolución de FBS.

4.1.3 Caracterización de las muestras de Ti-Q en los distintos componentes del

DMEMc por espectroscopía fotoelectrónica de rayos X (XPS)

La espectroscopía fotoelectrónica de rayos X (XPS) se utilizó para obtener

información acerca de los elementos presentes sobre la superficie de Ti-Q después de

siete días de inmersión en cada una de las disoluciones utilizadas. Dicha información

ayudará posteriormente a seleccionar en cada caso, el circuito eléctrico equivalente

que mejor simule, tanto física como matemáticamente, los resultados experimentales

obtenidos mediante espectroscopía de impedancia electroquímica (EIS).


En la Figura 24, se muestran los espectros generales de XPS del Ti-Q en aire y

sumergido, durante 7 días, en cada una de las disoluciones de los componentes del

DMEMc estudiados.

Figura 24. Espectros generales de XPS para el Ti-Q sumergidos, durante 7 días en: (a) aire, (b) NaH2PO4, (c) NaH2PO4 + CaCl2, (d) NaH2PO4 + CaCl2 + glucosa, (e) NaH2PO4 + CaCl2 + BSA y (f) FBS.

Cuando una muestra de Ti-Q se sumerge en la disolución de NaH2PO4

(disolución P), los espectros generales obtenidos para el Ti son muy similares a los del

óxido nativo existente sobre una superficie de Ti expuesta al aire. Sin embargo, a

partir de los espectros de XPS de alta resolución para el O1s se observan notables

diferencias (Figura 25 a). Como se puede observar en la Tabla 9 las energías de

ligadura obtenidas para el espectro de O1s son 529,8 eV asignada al enlace del TiO2,

531,3 eV al enlace P=O- y 532,4 eV al enlace P-OH [31, 56]. Las bandas correspondientes

al -P=O y al P-OH tienen energías de ligadura próximas al Ti-OH (531,5 eV) y al C=O

(532,3 eV). Es posible que exista una contribución de Ti-OH en la banda de energía de


ligadura más baja, sin embargo, es poco probable la presencia de C=O (debido a la

contaminación en aire) para una muestra de Ti en contacto con la disolución. Además,

la presencia de fosfato (P2p) a 133,5 eV parece confirmar la posibilidad de que se

hayan formado este tipo de enlaces entre el fósforo y los grupos oxigenados de la

superficie del Ti-Q. Por otra parte, si se comparan los porcentajes atómicos de las

bandas asignadas en el espectro de alta resolución del Ti2p para el Ti-Q (Tabla 8) con

su homólogo para el Ti-Q/P (Tabla 9), se puede observar cómo para la muestra de Ti-Q

sumergida en la disolución de fosfato los % atómicos de las tres bandas del Ti

disminuyen ligeramente. La presencia de iones fosfato, así como la disminución de los

% atómicos de las bandas de Ti, confirman la adsorción de iones fosfato sobre la

superficie del Ti-Q, como ya se había comprobado mediante los ensayos con la QCM

después de 8 horas de inmersión.

En presencia de la disolución de NaH2PO4 + CaCl2 (disolución PCa) el espectro

del Ti2p muestra únicamente las bandas características del TiO2 (Ti2p3/2/458,4 eV y

Ti2p1/2/464,2 eV). Los % atómicos de ambas bandas han disminuido a más de la mitad

con respecto al Ti-Q en fosfato como se puede apreciar en la Tabla 9. De hecho, la

banda del O1s correspondiente al TiO2 (529,8 eV) disminuye a la cuarta parte (Figura

25 a y b). Es interesante resaltar que el % atómico de la banda de O1s

correspondiente al enlace -P=O aumenta con respecto a la disolución en ausencia de

Ca2+ (27,5 vs 7,4 %). Este aumento del % atómico puede ser debido a que la adsorción

de Ca2+ a la superficie de Ti cargada negativamente favorece la adsorción de los iones

fosfato [32]. Por esta razón, es posible asignar el pico 532,4 eV al enlace Ca-O-. De la

misma forma el % atómico de la banda correspondiente al P2p aumenta (1,5 vs 3,3

%), apareciendo la banda del Ca2p a 347,4 eV (Tabla 9). Sin embargo, el cociente Ca/P

después de 7 días de exposición a la disolución PCa es muy bajo (1,6/3,3 = 0,48)

comparado con el valor estándar cuando se forma la apatita (1,67), compuesto de

características similares al hueso.


Tabla 9. Energías de ligadura y % atómico de los espectros de XPS para el Ti-Q después de 7 días sumergido en las disoluciones de NaH2PO4 (P), NaH2PO4 + CaCl2 (PCa), NaH2PO4 + CaCl2 + glucosa (PCaG), NaH2PO4 + CaCl2 + BSA y FBS.

Superficie Elemento Asignación Energía de Ligadura (eV) % atómico

Ti-Q / P

C1s

C-C, C-H C=O

O-C=O

284,8 286,4 288,4

23,2 3,6 4,0

O1s TiO2

-P=O, Ti-OH P-OH

529,8 531,3 532,4

38,1 7,4 8,8

Ti2p Ti

TiO2 TiO2

453,6 458,5 464,2

0,4 8,9 4,2

P2p PO4

3- 133,5 1,5

Ti-Q / PCa

C1s C-C, C-H

C=O O-C=O

284,8 286,4 288,0

33,2 5,3 7,5

O1s TiO2

-P=O, Ti-OH Ca-O

529,8 531,4 532,4

9,2 27,5 6,3

Ca2p CaHPO4 347,4 1,6

Ti2p TiO2 TiO2

458,4 464,2

4,0 2,1

P2p PO43-

133,5 3,3

Ti-Q / PCaG

C1s C-C, C-H

C-OH -HC=O

284,9 286,5 287,8

21,8 18,5 14,4

O1s C=O C-OH

531,5 532,8

7,9 36,1

Ti-Q / BSA

C1s

C-C, C-H C-NH C=N

COOH, CONH

284,7 286,0 287,0 288,2

19,4 28,6 5,6 7,3

O1s TiO2

COOH, CONH C-OH, C-O

530,1 531,6 532,6

2,0 15,2 8,9

N1s -O=C-NH- 399,9 12,0

Ti-Q / FBS

C1s

C-C, C-H C-NH C=N

COOH, CONH

284,7 286,0 287,0 288,2

26,0 23,1 4,1 6,8

O1s TiO2

COOH, CONH C-OH, C-O

529,9 531,6 532,4

2,7 16,2 7,2

N1s -O=C-NH- 399,9 14,6


Figura 25. Espectros de XPS de alta resolución del C1s y del O1s para el Ti-Q después de 7 días de inmersión en a) NaH2PO4 (P), b) NaH2PO4 + CaCl2 (PCa) y c) NaH2PO4 + CaCl2 + glucosa (PCaG).


Cuando las muestras de Ti-Q se sumergen en la disolución de glucosa el

espectro general cambia drásticamente (Figura 24 d). La cantidad de glucosa

adsorbida sobre la superficie del Ti-Q es tan grande que la señal del Ti2p no se

detecta. El espectro de alta resolución del C1s muestra un ensanchamiento con una

contribución de tres componentes que corresponden al carbono en diferentes

entornos: la primera componente con la energía de ligadura más baja (284,9 eV) es

asignada al carbono enlazado a C e H (C-C y C-H); la segunda componente (286,5 eV)

es atribuida al carbono en el enlace C-OH; y la tercera componente a energía de

ligadura más alta (287,8 eV) es asignada al enlace -HC=O (Tabla 9). La forma del

espectro del O1s (Figura 25 c) también cambia. La componente principal a 532,8 eV es

la correspondiente al enlace C-OH. El % atómico de esta banda es cuatro veces

superior al % atómico de la banda correspondiente al enlace -C=O, que aparece a

531,5 eV, lo cual confirma la estructura molecular de la glucosa (Tabla 9). En este

caso, la presencia de fosfatos y calcio no es significativa, debido a los bajos

porcentajes obtenidos, que indican que la adsorción de la glucosa sobre la superficie

del Ti-Q impide la formación de los enlaces Ca-O y Ti-O-P, o bien que la capa

adsorbida de glucosa es lo bastante gruesa para que no sea posible la detección de

estos elementos.

El espectro general del Ti-Q sumergido, durante 7 días, en la disolución de BSA,

es similar al espectro obtenido para el Ti-Q sumergido en la disolución de glucosa

(Figura 24 e), en el sentido de que prácticamente no aparece la banda

correspondiente al TiO2, en este caso debido a la adsorción de la proteína. Sin

embargo, el espectro de alta resolución del C1s es completamente diferente,

mostrando las bandas características de la estructura de la proteína. La deconvolución

del espectro del C1s se realizó siguiendo el mismo procedimiento que Frateur y

Pradier [113, 114]. Las bandas obtenidas son las siguientes: 1) 284,7 eV para los enlaces

C-C y C-H, 2) 286,0 eV para el enlace C-O y para los grupos amino (C-NH-), 3) 287,0 eV


para los grupos C=N o N-C=C y 4) 288,2 eV para los grupos ácido (COOH) y para los

enlaces peptídicos (CO-NH-).

Figura 26. Espectros de XPS de alta resolución del C1s y del O1s para el Ti-Q sumergido, durante 7 días, en a) BSA y b) FBS.

Estos enlaces bien definidos corresponden a los diferentes grupos químicos

presentes en la molécula de BSA. El número de átomos de carbono en cada grupo

químico fue calculado a partir de los diferentes fragmentos de la proteína [115] y


comparado con los % atómicos de XPS, obteniendo la evidencia de que las moléculas

de BSA adsorbidas sobre la superficie del Ti-Q están intactas químicamente. Igual que

en el caso del C1s, la banda del N1s proviene de las proteínas adsorbidas. La banda del

N1s es simétrica y centrada en 399,9 eV, correspondiendo a la contribución del enlace

peptídico (-O=C-NH-) y el grupo –NH2, como se esperaba para los grupos amida y

amina de la BSA (399,9 eV). En concordancia con estos resultados, la banda del O1s

muestra los siguientes componentes: TiO2 (530,1 eV), O=C-OH y –O=C-NH- (531,6 eV)

y C-OH y C-O (532,6 eV) (Figura 26 a). Hay que resaltar la ausencia de fosfato y calcio

sobre la superficie del Ti-Q en presencia de BSA. Estudios previos [55, 116, 117] indican

que existe una competición entre la adsorción de los iones fosfato y la albúmina,

puesto que estos iones fosfato pueden competir con los grupos carboxílicos de la BSA

por intercambiarse con los grupos hidroxilo básicos de la superficie del Ti-Q. También

sabemos que el calcio aumenta la adsorción de la BSA, probablemente debido a que

actúa como puente entre el Ti y la BSA [118].

Cuando el Ti-Q se sumerge, durante 7 días, en la disolución de FBS, el espectro

de XPS no muestra diferencias significativas con respecto al espectro de la BSA, a

pesar de la complejidad de dicha composición (Figura 26 b, Anexo 7.2).

Si se estudia la variación del porcentaje atómico (Tabla 10), se observa que a

medida que aumenta la complejidad del medio, el porcentaje de Ti en la superficie va

decreciendo, sin ser significativo en presencia de glucosa, BSA y FBS. Después de la

inmersión del Ti-Q durante 7 días en BSA y FBS en la superficie no se detecta la

presencia de fósforo ni de calcio, aunque se conoce la capacidad que tienen los iones

Ca2+ de establecer un enlace puente entre los grupos COO- de la BSA y la carga

negativa superficial del Ti-Q. Posiblemente el espesor de la capa de proteínas impida

dicha detección. Además, los porcentajes atómicos del carbono y el nitrógeno

alcanzan su valor máximo para el Ti-Q sumergido en BSA y FBS manifestando la

presencia de proteínas adsorbidas sobre la superficie de dicho material.


Tabla 10. Tabla de % atómico de cada elemento, en la superficie de Ti-Q, sumergido durante 7 días en cada uno de los componentes del DMEMc.

Muestra Ti (at%) O (at%) C (at%) P (at%) Ca (at%) N (at%)

Ti-Q 19,0 55,1 25,9 - - -

Ti-Q/P 13,5 54,3 30,8 1,5 - -

Ti-Q/PCa 6,1 43,0 46,0 3,3 1,6 -

Ti-Q/PCaG 0,3 44,0 54,7 - - -

Ti-Q/BSA 0,5 26,1 60,9 - - 12,0

Ti-Q/FBS 1,1 26,1 60,0 - - 14,6

4.1.4 Estudio electroquímico del Ti-Q sumergido en los distintos componentes

del DMEMc

4.1.4.1 Evolución del potencial de corrosión con el tiempo de inmersión

El primer parámetro electroquímico estudiado fue la evolución del potencial de

corrosión (Ecorr) en función del tiempo de inmersión (1-7 días) del Ti-Q en cada una de

las disoluciones: NaH2PO4 (P), NaH2PO4 + CaCl2 (PCa), NaH2PO4 + CaCl2 + glucosa

(PCaG), albúmina (BSA) y suero fetal bovino (FBS) (Figura 27).

En la Figura 27 se puede observar la evolución del potencial de corrosión, Ecorr,

a lo largo del tiempo de inmersión. Durante los dos primeros días de inmersión

aumenta rápidamente hacia valores anódicos, hasta alcanzar un valor prácticamente

constante a partir del cuarto día de ensayo. Este aumento del Ecorr, indica que, al

sumergir el Ti-Q en cualquiera de las disoluciones de los componentes del DMEMc, se

produce un ennoblecimiento de la superficie en mayor o menor grado dependiendo

de la disolución. Para el Ti-Q sumergido en las disoluciones de P y PCaG se obtienen

resultados muy parecidos. Los valores de Ecorr para estas dos disoluciones son más

anódicos que en el caso de la disolución PCa (Figura 27), lo que indica que en

presencia de glucosa el efecto de los iones Ca2+ está apantallado. Para el caso de las


disoluciones de BSA y FBS se obtienen valores de Ecorr más catódicos que para el resto

de las disoluciones, lo que indica que el Ti-Q tiene una mayor actividad electroquímica

o tendencia a corroerse en estas disoluciones, debido probablemente al efecto

acomplejante de las proteínas con los iones Ti4+.

Figura 27. Evolución del Ecorr con el tiempo de inmersión para el Ti-Q en (■) NaH2PO4 (P), (●) NaH2PO4 + CaCl2 (PCa), (▲) NaH2PO4 + CaCl2 + glucosa (PCaG), (▼) albúmina (BSA) y (♦) suero fetal bovino (FBS).


Para evaluar la respuesta a la corrosión del Ti-Q en cada una de las disoluciones

(P, PCa, PCaG, BSA y FBS) de los componentes del medio celular (DMEMc), se

obtuvieron las curvas de polarización (± 0,5 V respecto al Ecorr) después de 7 días de

inmersión en cada una de ellas (Figura 28). Asimismo, en la Tabla 11 aparecen el Ecorr y

las pendientes de Tafel anódica y catódica para el Ti-Q después de 7 días de inmersión

en cada una de las disoluciones en estudio.


Tabla 11. Pendientes de Tafel y Ecorr para el Ti-Q después de 7 días de inmersión en cada una de las disoluciones de los componentes del DMEMc.

Disoluciones Ecorr (V) c (V) a (V)

P 0,192 0,124 0,522

PCa 0,007 0,261 1,154

PCaG 0,176 0,126 0,469

BSA -0,040 0,379 0,368

FBS -0,016 0,512 0,744

Si se comparan las curvas de polarización catódica (Figura 28 a), tanto para la

disolución de fosfato como en presencia de iones Ca2+ (PCa) y con glucosa (PCaG), se

distinguen dos intervalos de sobrepotencial. En el primero (de 0 V a -0,200 V) tiene

lugar la reducción del oxígeno disuelto en el electrolito [119]. En el segundo intervalo de

sobretensión (de -0,200 V a -0,500 V) tiene lugar la transferencia de carga debida a la

reducción de los protones presentes en la disolución (pH = 7,4), así como la reducción

del oxígeno, ya que se trata de un medio aireado (diagrama de Pourbaix Anexo 7.3).

La pendiente de Tafel catódica para el Ti-Q sumergido en la disolución de

fosfato fue de 0,124 V. Según Gnanamuthu [120] habría diferentes mecanismos para la

reducción del oxígeno que justificarían este valor de la pendiente de Tafel. Es difícil,

por no decir imposible, determinar un mecanismo de reacción por medio de un único

parámetro de Tafel. Los mecanismos propuestos para otros metales [120] incluyen la

formación de un intermediato O2H- en una etapa lenta.

O2 + H2O + e- + M → MHO2 + OH-

Las posibles reacciones posteriores implican la formación de un óxido metálico

y el recubrimiento por OH-. Por ejemplo:


Figura 28. Curvas de polarización del Ti-Q después de 7 días en (a) (■) NaH2PO4 (P), (●) NaH2PO4 +

CaCl2 (PCa), (▲) NaH2PO4 + CaCl2 + glucosa (PCaG) y (b) (●) albúmina (BSA) y (▲) suero fetal bovino (FBS), a una velocidad de barrido de 1mV/s.


M + O2 + e- → MO + OH-

MO + H2O + e- → MOH + OH-

MOH + e- → M + OH-

-------------------------------------------------------------

O2 + 2H2O + 4e- → 4OH-

La adición de CaCl2 a la disolución de fosfato da lugar a una significativa

disminución de la corriente catódica con un aumento en la pendiente de Tafel (Tabla

11). Esta disminución en la icat puede estar relacionada con la formación de

compuestos de fosfato y calcio sobre la superficie del Ti-Q, detectados por XPS. En

presencia de glucosa (disolución PCaG), la curva de polarización catódica obtenida

para la reducción del oxígeno es similar a la obtenida en fosfato, aunque estén

presentes los iones Ca2+, manteniendo el valor de 0,126 V para la pendiente de Tafel.

Podemos decir que la glucosa parece inhibir la formación de esos compuestos de

fosfato y calcio.

Por otro lado, en cuanto al comportamiento anódico (Figura 28 a), se puede

observar una respuesta muy similar para el Ti-Q sumergido en las disoluciones de

fosfato (P) y de glucosa (PCaG). La densidad de corriente aumenta debido a la

formación de la capa de óxido de titanio. Sin embargo, en la disolución de PCa se

obtiene un valor de la pendiente de Tafel anódica que es, prácticamente, el doble

(Tabla 11), indicando que el proceso cinético de la oxidación está todavía más

impedido debido a la incorporación de los iones Ca2+ y PO43- a la capa pasiva de TiO2.

Si se comparan los valores de las pendientes de Tafel anódicas y catódicas para las

disoluciones de P, PCa y PCaG, se observa que en todos los casos existe un control

anódico, que estará determinado por la resistencia a la corrosión de la capa pasiva de

TiO2 con los iones o moléculas incorporadas.

En la Figura 28 b, se muestran las curvas de polarización del Ti-Q después de 7

días sumergido en las disoluciones de BSA y FBS. Para la disolución de BSA, tanto la


corriente catódica como la anódica alcanzan valores superiores a los obtenidos para la

disolución de FBS, además de una disminución en los valores de las pendientes de

Tafel correspondientes (Tabla 11). El FBS además de la albúmina, contiene muchos

otros componentes como aminoácidos, proteínas, hormonas, etc. (Anexo 7.2) que

parecen bloquear los sitios activos donde tiene lugar la reducción del oxígeno [49].

Por otra parte, es conocido que las proteínas (como la BSA) pueden acelerar la

disolución de los metales por sus efectos quelantes [121, 122], favoreciendo la reacción

anódica. Los valores de las pendientes de Tafel anódica y catódica para las

disoluciones de BSA y FBS (Tabla 11), indican que existe un control mixto del proceso

de corrosión.

Figura 29. Densidad de corriente catódica calculada a = -0,2 V para el Ti-Q en cada una de las disoluciones de los componentes del DMEMc.

Otra manera de estudiar el efecto de cada uno de los componentes del DMEMc

sobre el Ti-Q fue medir la densidad de corriente catódica para una sobretensión de

-0,2 V respecto al Ecorr [119] (Figura 29). A dicho potencial tiene lugar la reducción del


oxígeno. Los resultados muestran que en presencia de Ca2+ la densidad de corriente

disminuye con respecto al valor obtenido para la disolución de iones fosfato; es decir,

los iones calcio bloquean los sitios activos para la reducción del oxígeno. Es

importante resaltar, que dicha reacción catódica está algo más favorecida para el Ti-Q

tratado con BSA que para el Ti-Q tratado con FBS, aunque ambos medios contengan

proteínas.


En la Figura 30 se muestra la evolución en los diagramas de Bode del módulo

de impedancia y del ángulo de fase frente a la frecuencia, para las muestras de Ti-Q

sumergido, durante 7 días, en las disoluciones de iones fosfato (P) (Figura 30 a y b) y

de iones fosfato e iones calcio (PCa) (Figura 30 c y d). A altas frecuencias se observa un

valor constante del módulo de impedancia, con °correspondiente a la

resistencia del electrolito (Re) de cada disolución. Para valores de frecuencia entre

100 y 10-2Hz se obtiene una recta de pendiente -0,91 que puede ser atribuida a un

condensador en paralelo con una resistencia. En el intervalo de frecuencias más bajas

(10-2 - 10-3Hz) se obtiene una recta de pendiente -0,83 y el valor del ángulo de fase se

acerca a -90°, aproximándose a un comportamiento capacitivo.

Los diagramas de la Figura 30 se ajustaron al circuito eléctrico equivalente de la

Figura 30 e, donde Re es la resistencia del electrolito medida entre el electrodo de

referencia y el electrodo de trabajo; R2 es la resistencia; CPE2 es un elemento de fase

constante o CPE (constant phase element), que simula un comportamiento no lineal

de un condensador, asociados ambos elementos con la interfase electrolito/P-TiO2 o

bien electrolito/PCa-TiO2; R1 y CPE1 son la resistencia y la pseudocapacidad asociada

con la interfase electrolito/TiO2-Ti.


Figura 30. Diagrama de Bode para el Ti-Q sumergido, durante 7 días, en la disolución de NaH2PO4 (a) módulo de impedancia, y (b) ángulo de fase vs la frecuencia; y en la disolución de NaH2PO4 + CaCl2 (c) módulo de impedancia y (d) ángulo de fase vs la frecuencia. Los símbolos son los resultados experimentales y (―) son los ajustes con el circuito eléctrico equivalente (e).

En presencia de glucosa (Figura 31), se observa un comportamiento que en

principio, parecía muy similar al del Ti-Q en las disoluciones de iones fosfato (P) y de

iones fosfato y calcio (PCa). Sin embargo, el intervalo de frecuencias donde el valor del


ángulo de fase está próximo a -90° aumenta, alcanzándose dicho valor a frecuencias

más altas (102 Hz). El valor de la pendiente (-0,90) así como el valor de ángulo de fase

le confieren a la interfase electrolito/glucosa-TiO2 un carácter capacitivo, siendo el

proceso de adsorción de la glucosa bastante rápido, ya que los resultados no varían

prácticamente durante los siete días de ensayo. Los resultados experimentales se

ajustaron utilizando el circuito de la Figura 31 c. Dicho circuito representa la superficie

de Ti-Q recubierta prácticamente por la glucosa adsorbida durante los 7 días de

ensayo. Conviene recordar que los resultados de XPS indicaban que el % Ti era

prácticamente cero y la banda correspondiente al TiO2 no aparecía (Figura 25). Los

dos módulos RC en serie representan las dos interfases existentes en el sistema Ti-

Q/PCaG, siendo Re la resistencia del electrolito, R2 y CPE2 la resistencia y la

pseudocapacidad de la interfase externa electrolito/glucosa adsorbida sobre el TiO2-Ti

y R1 y CPE1 la resistencia y la pseudocapacidad asociadas con la interfase interna

glucosa/TiO2-Ti.

Figura 31. Diagrama de Bode para el Ti-Q sumergido, durante 7 días, en la disolución de NaH2PO4 + CaCl2 + glucosa (a) módulo de impedancia, y (b) ángulo de fase vs la frecuencia. Los símbolos son los resultados experimentales y (―) son los ajustes con el circuito eléctrico equivalente (c).


Figura 32. Diagrama de Bode para el Ti-Q sumergido, durante 7 días, en la disolución de BSA a) módulo de impedancia, y b) ángulo de fase vs la frecuencia; y en la disolución de FBS c) módulo de impedancia y d) ángulo de fase vs la frecuencia. Los símbolos son los resultados experimentales y (―) son los ajustes con el circuito eléctrico equivalente e).

En la Figura 32, se muestran los diagramas de Bode para el Ti-Q sumergido en

las disoluciones de BSA (Figura 32 a y b) y FBS (Figura 32 c y d), así como el circuito

eléctrico equivalente (Figura 32 e) utilizado para ajustar los resultados experimentales

de impedancia obtenidos para ambas disoluciones. En presencia de BSA, a altas


frecuencias, aparece el valor de la resistencia del electrolito (Re) (Figura 32 a). A

frecuencias intermedias, entre 104 y 10-1 Hz, el módulo de impedancia aumenta

linealmente con una pendiente de -0,81; esta respuesta es asignada a un

pseudocondensador en paralelo con una resistencia. A frecuencias bajas, entre 10-1 y

10–3 Hz, se observa un cambio de pendiente en el módulo de impedancia (-0,73) para

todos los tiempos de ensayo, que se corresponde con una disminución en el ángulo

de fase (Figura 32 b) de = -73° a -65° a una frecuencia de 10-1 para aumentar hasta

alcanzar otro máximo a 4·10-3Hz de frecuencia y un valor de = -68°. En este caso los

diagramas de impedancia se mantienen desde el primer día de ensayo en los mismos

valores de impedancia y ángulo de fase. Esto indica que la albúmina se adsorbe sobre

el Ti-Q en los primeros instantes de la inmersión sin modificación a lo largo del tiempo

de ensayo, alcanzándose un recubrimiento completo de la superficie como muestran

los resultados de XPS. Teniendo esto en cuenta, los resultados experimentales se han

ajustado con dos constantes de tiempo (Figura 32 e): la primera (= CPE2·R2) se

asocia con la interfase externa electrolito/proteínas-TiO2 y la segunda (= CPE1·R1)

está asociada a la respuesta de la interfase interna proteínas/TiO2-Ti. El mismo efecto

se obtiene para el FBS (Figura 32 c y d) pero el cambio de pendiente, en el módulo de

impedancia, se da a frecuencias más altas (entre 0,04 y 10-3 Hz) que para la BSA y, por

consiguiente, el ángulo también cambia en base a ese intervalo.

En la Tabla 12 se muestran los resultados obtenidos del ajuste de los resultados

experimentales a los respectivos circuitos eléctricos equivalentes, para las muestras

de Ti-Q sumergidas en fosfatos, fosfatos e iones calcio y en glucosa. Para el Ti-Q

sumergido en la disolución P (Tabla 12), en general, los valores de CPE1 y CPE2

disminuyen ligeramente y por tanto, R1 y R2 aumentan levemente con el tiempo de

ensayo, sobre todo del primer al tercer día de inmersión. CPE2 está asociada con la

interfase formada entre el electrolito y los grupos Ti-OH (algunos pueden haber sido

reemplazados por grupos Ti-OP). El ligero descenso de los valores de CPE1 puede

corresponder al lento crecimiento de la película de óxido de titanio con el


consiguiente enriquecimiento en iones fosfato de la película, indicando una gran

estabilidad de la fina capa pasiva de TiO2 en la disolución de fosfatos. Los valores de

R1 son muy altos (cerca de 7-25 MΩ) y aumentan ligeramente con el tiempo de

ensayo. Estos valores tan altos para R1, implican una alta resistencia a la corrosión, es

decir, una baja velocidad de disolución del Ti y crecimiento del óxido de titanio. Un

dato a tener en cuenta es que la interfase formada por el electrolito/Ti-OP tiene una

baja resistencia (R2), lo que hace pensar que la contribución de esta interfase a las

propiedades electroquímicas es baja y por tanto, la respuesta en impedancia va a

estar dominada por la interfase electrolito/TiO2-Ti.

Cuando se añade CaCl2 a la disolución de NaH2PO4 (disolución PCa), las medidas

de impedancia durante los siete días de ensayo muestran la misma respuesta

independientemente del tiempo de medida (Figura 30 c y d). Los valores de CPE2 y

CPE1 disminuyen y, por tanto, R2 y R1 aumentan ligeramente con el tiempo de

ensayo, especialmente del primer al segundo día de inmersión (Tabla 12). Esta

disminución en los valores de CPE2 puede corresponder con la adsorción de los iones

Ca2+ por medio de los grupos hidroxilo ácidos, a la superficie del titanio, así como a la

adsorción de iones fosfato por medio de los iones Ca2+ o los grupos hidroxilo básicos

(Ti2OH+) [38, 123] como se muestra en las medidas de XPS (Tabla 9). Los valores de R1

son mayores que los obtenidos para la disolución de fosfatos y aumentan ligeramente

con el tiempo de inmersión. La adición de calcio a la disolución de fosfato aumenta al

doble la resistencia del óxido de titanio (R1), ya que se incorporan a la capa pasiva

aumentando su resistencia frente a la corrosión. Estos resultados están de acuerdo

con los obtenidos por Cheng y Roscoe [119].


Tabla 12. Ajustes de los resultados experimentales de EIS para el Ti-Q sumergido, durante 7 días, en las disoluciones de NaH2PO4 (P), NaH2PO4 + CaCl2 (PCa) y NaH2PO4 + CaCl2 + glucosa (PCaG).

2

3,2

·10

-4

6,8

·10

-4

6,6

·10

-4

4,5

·10

-4

5,8

·10

-4

6,0

·10

-4

1,4

·10

-3

1,4

·10

-3

1,6

·10

-3

1,8

·10

-3

1,7

·10

-3

1,8

·10

-3

1,4

·10

-3

3,9

·10

-4

8,8

·10

-4

7,3

·10

-4

4,8

·10

-4

4,8

·10

-4

6,2

·10

-4

n1

0,9

2

0,9

2

0,9

2

0,9

2

0,9

2

0,8

7

0,8

7

0,8

7

0,8

7

0,8

7

0,8

7

0,8

7

0,9

1

0,9

1

0,9

1

0,9

1

0,9

1

0,9

2

0,9

2

% E

rro

r

(CP

E1)

31

,4

30

,1

32

,3

33

,2

30

,1

38

,3

51

,5

46

,3

46

,1

44

,4

42

,1

41

,0

10

,4

4,4

10

,7

8,0

8,0

6,5

7,4

CP

E1

Fc

m-2

s-(

1-n

)

20

,10

16

,99

16

,50

15

,95

14

,94

15

,23

12

,97

13

,02

12

,97

13

,34

13

,12

13

,32

33

,10

29

,47

26

,20

24

,40

22

,40

21

,60

20

,60

% E

rro

r

(R1

)

2,5

5,5

6,2

7,2

8,7

15

,8

12

,0

18

,1

22

,3

33

,1

26

,1

21

,6

13

,5

3,7

4,1

4,9

3,8

3,9

4,6

R1

cm

2

7,5

·10

6

2,1

·10

7

2,7

·10

7

1,7

·10

7

2,6

·10

7

3,7

·10

7

3,3

·10

7

5,1

·10

7

3,9

·10

7

6,3

·10

7

7,5

·10

7

6,1

·10

7

1,6

·10

7

1,4

·10

7

1,2

·10

7

1,6

·10

7

1,6

·10

7

1,7

·10

7

1,8

·10

7

n2

0,9

3

0,9

3

0,9

3

0,9

3

0,9

3

0,8

8

0,8

8

0,8

8

0,8

8

0,8

8

0,8

8

0,8

8

0,9

0

0,8

8

0,9

0

0,9

0

0,9

0

0,9

0

0,9

0

% E

rro

r

(CP

E2)

37

,7

35

,3

36

,1

37

,7

33

,4

61

,0

83

,8

83

,9

87

,0

88

,1

85

,0

85

,3

40

,6

12

,6

36

,6

26

,9

21

,9

17

,5

18

,6

CP

E2

Fc

m-2

s-(

1-n

)

16

,37

15

,17

14

,79

13

,72

13

,61

9,5

9

7,9

9

7,2

3

6,9

4

6,5

1

5,5

3

6,3

9

8,3

1

9,1

7

7,5

8

7,0

9

8,0

3

7,8

5

8,0

4

% E

rro

r

(R2

)

25

,5

24

,7

24

,7

26

,4

24

,1

29

,2

39

,2

35

,5

35

,6

34

,5

32

,9

32

,1

9,5

4,0

9,6

7,1

6,8

5,6

6,4

R2

cm

2

95

,6

10

4,7

10

2,8

11

3,6

11

8,4

59

,6

70

,7

71

,6

74

,0

73

,5

76

,8

75

,8

51

,0

54

,9

53

,0

57

,9

58

,0

58

,2

59

,3

Re

57

,9

61

,7

62

,0

73

,9

63

,0

61

,3

68

,2

63

,0

64

,7

64

,9

64

,2

63

,4

92

,2

91

,5

92

,4

92

,3

84

,8

83

,0

83

,6

t

día

s

1

3

4

6

7

1

2

3

4

5

6

7

1

2

3

4

5

6

7

Sup

er-

fici

e

Ti-Q

/ P

Ti-Q

/

PC

a

Ti-Q

/

PC

aG


Tabla 13. Ajustes de los resultados experimentales de EIS para el Ti-Q sumergido, durante 7 días, en las disoluciones de BSA y FBS.

2

4,2

·10

-4

2,0

·10

-4

2,8

·10

-4

2,0

·10

-4

3,0

·10

-4

1,4

·10

-4

9,3

·10

-5

1,6

·10

-3

3,0

·10

-4

4,2

·10

-4

3,7

·10

-4

5,0

·10

-4

6,1

·10

-4

6,1

·10

-4

n1

0,9

2

0,9

2

0,9

2

0,9

1

0,9

1

0,9

1

0,9

1

0,9

1

0,9

1

0,9

0

0,9

1

0,9

0

0,9

0

0,9

0

% E

rro

r

(CP

E1)

0,2

0,1

0,1

0,1

0,2

0,1

0,1

0,1

0,2

0,2

0,2

0,3

0,3

0,3

CP

E1

Fc

m-2

s-(

1-n

)

37

,04

37

,19

37

,25

37

,81

39

,34

38

,98

38

,03

71

,61

76

,64

81

,75

80

,29

81

,02

80

,29

83

,94

% E

rro

r

(R1

)

34

,4

33

,2

73

,8

69

,5

27

,4

23

,5

22

,8

33

,0

19

,6

24

,2

33

,0

32

,8

35

,7

29

,4

R1

cm

2

9,0

·10

7

2,0

·10

8

4,0

·10

8

2,6

·10

8

1,3

·10

8

1,6

·10

8

1,2

·10

8

3,6

·10

7

4,3

·10

7

4,0

·10

7

5,7

·10

7

4,8

·10

7

5,1

·10

7

3,9

·10

7

n2

0,7

2

0,7

6

0,7

5

0,7

3

0,7

2

0,7

3

0,7

2

0,7

1

0,6

1

0,5

4

0,5

2

0,5

1

0,5

0

0,5

1

% E

rro

r

(CP

E2)

20

,6

13

,8

14

,9

14

,6

17

,2

11

,7

10

,8

5,1

11

,4

10

,7

10

,6

11

,9

11

,3

10

,7

CP

E2

Fc

m-2

s-(

1-n

)

85

,83

66

,41

74

,82

87

,81

92

,70

86

,35

90

,51

11

7,5

2

23

5,7

7

41

3,8

7

51

9,7

1

55

6,2

0

59

1,9

7

56

9,3

4

% E

rro

r

(R2

)

4,5

2,7

3,1

3,0

3,6

2,4

2,3

3,5

3,3

5,1

6,3

7,7

8,3

8,0

R2

cm

2

55

,4

47

,6

47

,6

47

,2

46

,4

45

,9

49

,0

61

,6

79

,4

12

9,9

16

0,2

16

9,3

18

6,5

19

3,9

Re

74

,0

74

,0

73

,8

72

,2

71

,5

71

,4

73

,4

65

,7

65

,4

66

,1

69

,4

69

,4

70

,1

68

,8

t

día

s

1

2

3

4

5

6

7

1

2

3

4

5

6

7

Sup

er-

fici

e

Ti-Q

/

BSA

Ti-Q

/

FBS


En presencia de glucosa, las medidas de impedancia durante los siete días de

ensayo muestran la misma respuesta independientemente del tiempo de inmersión.

Es necesario recordar que, en este caso, el circuito eléctrico equivalente consta de dos

módulos RC en serie (Figura 31 c). Los valores de CPE2 no cambian con el tiempo,

indicando que la adsorción de la glucosa sobre la superficie del Ti-Q es rápida y llega al

estado estacionario a tiempos cortos de inmersión. Sin embargo, los valores de CPE1

disminuyen con el tiempo de ensayo, indicando que la glucosa adsorbida en el Ti-Q

permite la difusión iónica y/o de oxígeno a su través, dando lugar a un aumento del

espesor del óxido de titanio. Este efecto concuerda con el ligero aumento que se

obtiene para R1 con el tiempo de inmersión a partir del segundo día, debido al lento

crecimiento del óxido superficial. La resistencia del electrolito (Re) se mantiene en

valores similares a los de las disoluciones anteriores (Tabla 12).

Cuando el Ti-Q se sumerge en una disolución de BSA, NaH2PO4 y CaCl2

(disolución de BSA) (Figura 32 a y b) los resultados obtenidos se ajustaron a dos

módulos RC en serie (Figura 32 e), en el que el más externo corresponde a la interfase

electrolito/BSA y el más interno se asocia con la interfase BSA/TiO2-Ti. La resistencia

del electrolito (Re) aumenta si se compara con los valores obtenidos sin BSA (Tabla

13) debido a la incorporación de la albúmina a la disolución. R2 y CPE2 se mantienen

prácticamente constantes a lo largo del tiempo de ensayo, indicando que la BSA se

adsorbe en los primeros instantes y no evoluciona a lo largo del mismo. Por otro lado,

R1 y CPE1 también se mantienen estables con el tiempo de ensayo, lo que indica que

la BSA no permite la difusión de oxígeno a su través con tanta facilidad como la

glucosa, y la capa pasiva de TiO2 se mantiene inalterada durante el experimento.

Por último, cuando las muestras de Ti-Q se sumergen en una disolución de FBS,

los diagramas de impedancia son muy similares a los obtenidos para la disolución de

BSA; además, los espectros de impedancia se han ajustado utilizando el mismo

circuito eléctrico equivalente. Sin embargo, R2, la resistencia asociada a la interfase

externa electrolito/proteínas, aumenta con el tiempo de inmersión adquiriendo


valores mucho mayores que en presencia de BSA al cabo de 7 días de ensayo. El valor

de n2, asociado con CPE2, disminuye, indicando que existe una mayor contribución de

difusión iónica a través de la película proteínica. Otra diferencia importante es que R1,

resistencia de la interfase interna proteínas/TiO2-Ti, es un orden de magnitud menor

que en presencia de BSA, lo que indica que existen en el FBS otros componentes que

activan la superficie del Ti-Q disminuyendo la resistencia de la capa de óxido de

titanio.

Transformadas de Kramers-Kronig (K-K)

Una vez analizados y ajustados los diagramas de impedancia obtenidos para el

Ti-Q sumergido en las disoluciones de los distintos componentes del DMEMc, se

procedió a calcular las transformadas de Kramers-Kronig (K-K) [100], con el objetivo de

evaluar la fiabilidad de los resultados experimentales obtenidos.

En la Figura 33, se muestran los diagramas en los que se representan los

resultados experimentales y los calculados a partir de las transformadas de K-K, para

el Ti-Q sumergido, durante 7 días, en las disoluciones P, PCa y PCaG. De la misma

manera, en la Figura 34, se muestran los resultados para el Ti-Q sumergido, durante 7

días, en las disoluciones de BSA y FBS.

Como se puede observar en las Figura 33 y 34, la consistencia de los resultados

experimentales es excelente. No obstante, se han calculado los errores medios

comparando los resultados obtenidos de las transformadas de K-K con los resultados

originales utilizando la ecuación (9) (Tabla 14).

∑ | |

(9)


Figura 33. Resultados experimentales (O) correspondientes al Ti-Q sumergido, durante 7 días, en las disoluciones de: a) NaH2PO4 (P), b) NaH2PO4 + CaCl2 (PCa) y c) NaH2PO4 + CaCl2 + glucosa (PCaG), y resultados obtenidos utilizando las relaciones de Kramers-Kronig (K-K)(+).


donde N es el número de puntos, Zex es el valor de la impedancia experimental, ZKK es

el valor de la impedancia obtenido por medio de los K-K y Zmax el valor máximo de la

impedancia.

Figura 34. Resultados experimentales (O) correspondientes al Ti-Q sumergido, durante 7 días, en las disoluciones de: a) BSA y b) FBS, y resultados obtenidos utilizando las relaciones de Kramers-Kronig (K-K)(+).

Dougherty y Smedley [124] consideran que, la fiabilidad de los resultados

obtenidos de las medidas de impedancia es buena o aceptable cuando el error medio,

tanto de la componente real como de la imaginaria, se encuentran por debajo del 3%.

El error medio obtenido para cada una de las transformadas de K-K no supera el 0,8%,

por tanto los resultados experimentales satisfacen las transformadas de K-K.


Carece de interés incluir los diagramas de las transformadas de K-K para todos

los días de medida, aunque sí han sido calculados dando resultados también en

excelente concordancia.

Tabla 14. Errores medios calculados, por medio de la expresión (9), de las representaciones de Kramers-Kronig (K-K) con respecto a los resultados obtenidos experimentalmente para el Ti-Q sumergido, durante 7 días, en las disoluciones de NaH2PO4 (P), NaH2PO4 + CaCl2 (PCa), NaH2PO4 + CaCl2 + glucosa (PCaG), BSA y FBS.

Error medio (%)

Disoluciones Componente real (Z´) Componente imaginaria (Z”)

P 0,792 0,167

PCa 0,681 0,062

PCaG 0,463 0,547

BSA 0,528 0,072

FBS 0,471 0,514

4.1.5 Discusión

Cuando una superficie de titanio se expone al aire, se forma espontáneamente

una fina capa de óxido en su superficie. Los análisis de XPS muestran que en la

interfase óxido/metal los estados de oxidación del titanio son predominantemente

Ti2+ y Ti3+, mientras que en la interfase aire/óxido predomina el estado de oxidación

Ti4+ [33, 125]. Sin embargo, en el caso del Ti evaporado sobre la superficie del cristal de

cuarzo, se han detectado fundamentalmente TiO2 y en muy baja proporción Ti2O3.

Parker y Kelly [126] han demostrado que la aparición de subóxidos puede ser debido a

la reducción del TiO2 por medio del haz de iones de argón dentro del equipo de XPS.

No obstante, la cantidad de Ti2O3 es muy pequeña con respecto al TiO2. Además, se

obtiene una banda que corresponde al enlace Ti-OH. Hughes-Wassell y col. [118]

sugieren que existen dos tipos de grupos hidroxilo coexistiendo en la superficie del


TiO2-Ti debido a la quimisorción del agua que hace que la superficie esté cargada

negativamente a pH fisiológico.

Después de sumergir una muestra de Ti-Q en una disolución que contiene

NaH2PO4, se obtiene un crecimiento de la película de óxido de titanio en la superficie

del electrodo, aumentando su resistencia a la corrosión y disminuyendo la corriente

de disolución anódica. El Ecorr se mueve de 0,017 V a valores anódicos hasta llegar a un

valor estable de 0,192 V después de siete días (Figura 27). Los resultados de EIS para

este tiempo de ensayo, muestran que la respuesta de impedancia está dominada por

la alta resistencia (R1 ≈ 7-25 MΩ) asignada a la interfase electrolito/TiO2-Ti con una

baja contribución de la interfase electrolito/Ti-OP. No obstante, la presencia de los

iones fosfato en la superficie del electrodo ha sido confirmada tanto por los

resultados obtenidos por XPS (Tabla 9) como por la ganancia de masa observada a

través de la QCM. Es conocido que el H2PO4- y el HPO4

2- pueden formar complejos con

el Ti mediante una reacción de intercambio con los grupos hidroxilos básicos, según la

siguiente reacción [38, 56]:

(Ti-OH2+)sólido + H2PO4

- ac

↔ (Ti...H2PO4)sólido + H2O

La adición de CaCl2 a la disolución de NaH2PO4, desplaza el Ecorr hacia valores

más catódicos y disminuye la corriente catódica y la anódica. En efecto, la pendiente

de Tafel catódica aumenta de 0,124 V para la disolución de NaH2PO4, hasta 0,261 V

para la disolución en presencia de Ca2+, reflejando que la reducción del oxígeno está

más impedida (Tabla 11). Esto puede ser atribuido al efecto bloqueante de

compuestos de calcio y fosfato para la reacción catódica. Si la presencia de estos iones

disminuye la corriente catódica, se espera una disminución en la corriente anódica

que provoque una disminución de la velocidad de corrosión. Dicho comportamiento

es verificado por la alta resistencia asociada con la interfase electrolito/TiO2-Ti, ya que

aumenta prácticamente al triple con respecto a la disolución con fosfatos, como

muestran los resultados obtenidos por impedancia (Tabla 12). De acuerdo con Lima y


col. [55], la formación de compuestos de fosfato y calcio es un proceso relativamente

lento que necesita un período de 1 o 2 semanas, controlado probablemente por la

velocidad de nucleación. De hecho, los resultados de QCM obtenidos para la

disolución de NaH2PO4 + CaCl2, confirman la baja velocidad de formación de los

compuestos de fosfato y calcio (Figura 21). Además, los resultados de XPS muestran

que después de siete días en la disolución de NaH2PO4 + CaCl2, en la superficie del Ti-Q

hay solo un 1,6% de Ca y un 3,3 % de P, aunque la adsorción de los iones fosfato se ve

claramente aumentada por la presencia de los iones calcio (Tabla 10). Por tanto, la

presencia de estos iones en la superficie del Ti-Q, después de los siete días de

inmersión, no es suficiente para inducir la nucleación y crecimiento de precipitados de

Ca/P. De hecho, la relación Ca/P es demasiado baja (0,48) para inducir la precipitación

del fosfato tricálcico o la apatita (1,67) [44]. La incorporación de los iones calcio y

fosfato a la película de óxido de titanio se ha encontrado tanto “in vivo” [127] como “in

vitro” [42]. Según la bibliografía, la velocidad de precipitación “in vitro” de una capa de

hidroxiapatita sobre el titanio fue varios órdenes de magnitud más lenta que, por

ejemplo, sobre las cerámicas bioactivas [56, 128]. Además, la osteointegración de los

implantes de Ti, normalmente requiere muchos meses [129], lo cual nos da una idea de

lo lenta que es la cinética de crecimiento del hueso.

En presencia de glucosa, los iones calcio no parecen tener ningún efecto ya que

las curvas de polarización son muy similares a las obtenidas para la disolución de

NaH2PO4, como se puede comprobar por los valores de las pendientes de Tafel (Tabla

11). Esto indica que la reacción de reducción del oxígeno no está impedida. Según los

espectros de XPS (Tabla 9, Figura 24), la superficie del electrodo está completamente

cubierta por la glucosa adsorbida. Sin embargo, permite la difusión iónica del oxígeno

hacia el electrodo, así como el crecimiento lento del óxido, según indican los valores

de la resistencia asociada con la interfase interna glucosa/TiO2-Ti que aumentan muy

lentamente con el tiempo de ensayo.


Existen otros componentes del medio fisiológico, que también intervienen en

el mecanismo de corrosión de las superficies de Ti-TT: las proteínas. De todas las que

existen en este medio celular, la más abundante es la albúmina. Por ello, se eligió la

albúmina como modelo para estudiar y comprender cómo afecta la presencia de las

proteínas en el comportamiento frente a la corrosión del sistema. La presencia de la

BSA junto con los iones calcio y fosfato provoca un cambio en los valores de Ecorr hacia

valores más anódicos a medida que aumenta el tiempo de tratamiento. Para esta

disolución se obtiene un valor de la pendiente de Tafel catódica de 0,379 V, indicando

que la adsorción de BSA inhibe la difusión del oxígeno hacia la superficie del

electrodo. Las medidas de QCM muestran que se forman 1,5 monocapas de BSA en 14

horas de inmersión en ausencia de iones calcio y fosfato. Por otra parte, los valores de

la capacidad asociada con la interfase externa electrolito/proteínas-TiO2 indican que

se llega al estado estacionario en periodos cortos de tiempo. Estos resultados indican

que las moléculas de BSA adsorbidas sobre la superficie podrían prevenir la liberación

del titanio al seno de la disolución (verificado por análisis de ICP masas).

Estos resultados concuerdan con los obtenidos por Khan y col. [130] que

muestran que la resistencia de corrosión no se ve afectada por la presencia de las

proteínas. En nuestro caso, tanto la resistencia asignada a la interfase externa

electrolito/BSA como la de la interfase interna BSA/TiO2-Ti permanecen constantes

con el tiempo de inmersión en las medidas de impedancia. La presencia de iones Ca2+

en la disolución de BSA da lugar a una mayor disminución de la frecuencia (Figura 22

b) según muestran las medidas de QCM, confirmando que la adsorción de la BSA está

favorecida cuando en el medio se encuentran los iones Ca2+. A pH fisiológico, la

albúmina está cargada negativamente (PI = 4,7- 4,9). La incorporación de los iones de

calcio a la molécula de BSA puede favorecer la atracción de ésta hacia la superficie de

Ti-Q, ya que se encuentra cargada negativamente debido a los grupos hidroxilo ácidos

presentes en el óxido de Ti. Por tanto, los iones Ca2+ intervienen en la adsorción

electrostática de la BSA con la superficie de titanio actuando como puente. Sin


embargo, este modelo electrostático no explica por qué la BSA se adsorbe en ausencia

de estos iones (a potencial a circuito abierto) sobre la superficie de titanio, como

muestran los resultados de QCM. De acuerdo con Hughes y col. [118] los efectos de la

hidratación tienen un papel muy importante, permitiendo que entren en juego

fuerzas atractivas de corto alcance.

Los resultados de XPS obtenidos para el Ti-Q después de 7 días de inmersión en

FBS, no muestran diferencias significativas cuando se comparan con los obtenidos

para las muestras sumergidas en BSA. Es más, sólo se detecta la adsorción de BSA

(Figura 26, Tabla 9). Sin embargo, la pendiente de Tafel catódica es mayor que la

obtenida para la BSA, indicando, en este caso, que la difusión del oxígeno hacia la

superficie de Ti-Q está más impedida. Además, la disminución de la frecuencia, en los

experimentos de QCM, es mayor en valor absoluto para el FBS (-66Hz) que en

presencia de BSA (-57 Hz), reflejando que tiene lugar la adsorción de otras moléculas

presentes en el FBS.

Los valores de la resistencia asociada con la interfase externa

electrolito/proteínas-TiO2 de las muestras sumergidas en FBS, aumentan ligeramente

a lo largo del tiempo de inmersión y son mayores que los obtenidos para la BSA (Tabla

13). Este hecho se puede justificar porque la cantidad de proteínas en esta disolución

y adsorbidas, es mayor que para el caso de las muestras sumergidas en BSA. De hecho

si se comparan los valores obtenidos para la resistencia de dicha interfase (R2) (Tabla

13), después de 7 días de ensayo, se observa que para el FBS es prácticamente cinco

veces mayor que para la disolución de BSA (193,9 vs 49,0 ·cm2). Esto explicaría que

la corriente catódica, debido a la reducción de oxígeno, sea menor para el FBS que

para la BSA. Además, a partir de las medidas de impedancia (Tabla 13), la evolución a

lo largo del tiempo de inmersión del valor de n2, asociado a la interfase externa

electrolito/proteínas, muestra que no se trata de un capacitor puro sino que, al

mismo tiempo, se está dando un proceso de difusión iónica a través de la película

orgánica. Dado que la resistencia de la interfase interna proteínas/TiO2 ha disminuido


con respecto a la de la BSA, es posible que existan procesos de corrosión en esta

interfase debido al efecto corrosivo de algún componente presente en el FBS.


4.2 Estudio de la interfase Ti-Q/Osteoblastos Saos-2

Uno de los momentos más importantes en el proceso de osteointegración de

un implante en un medio vivo es el contacto de las células osteoblásticas con la

superficie metálica del mismo. Este contacto determinará la adhesión, extensión y

proliferación celular, y será decisivo para el éxito del implante. En este capítulo se van

a estudiar las modificaciones que sufre la superficie del Ti-Q como consecuencia de la

interacción con las células formadoras de hueso como son los osteoblastos Saos-2.

4.2.1 Microscopía electrónica de barrido (SEM)

La microscopía electrónica de barrido se ha utilizado para caracterizar la

morfología superficial de las muestras de Ti-Q y observar la adhesión, morfología y

extensión de los osteoblastos Saos-2 sobre la superficie de las muestras de Ti-Q

después de ser sumergidas 1, 3, 5 y 7 días en un cultivo de osteoblastos Saos-2. En

una suspensión celular, la forma de un osteoblasto es esférica, pero para poder

proliferar y sobrevivir en el medio de cultivo, es necesario que se adhieran a una

superficie. Cuando los osteoblastos toman contacto con la superficie de Ti se

producen cambios en su morfología celular. El osteoblasto se deforma, se extiende

sobre la superficie dando lugar a prolongaciones denominadas filopodios, que junto

con las proteínas de adhesión segregadas por los propios osteoblastos darán lugar a

una buena adhesión celular (Figura 35 a).

El mecanismo de adhesión celular sobre superficies sólidas transcurre a lo

largo de distintas etapas, en las que los osteoblastos cambian su morfología e

interaccionan entre sí [131]. Lo primero que ocurre cuando se sumerge el biomaterial

en el cultivo celular es la adsorción de proteínas a la superficie. En la etapa I, los

osteoblastos, que aún tienen forma esférica, toman contacto con la superficie del

biomaterial y van anclándose a la misma (Figura 35 a); en la etapa II, empiezan a

extenderse sobre la superficie hasta tener una forma más plana, aunque aún se

120 4.2 Estudio de la interfase Ti-Q/Osteoblastos Saos-2

aprecia el citoplasma elevado y el núcleo; finalmente, en la etapa III, los osteoblastos

están muy extendidos y planos, aunque se sigue distinguiendo el núcleo (Figura 35 b).

Figura 35. Imágenes SEM de un osteoblasto Saos-2: a) en una de las etapas iniciales del proceso de adhesión celular y b) un osteoblasto completamente extendido sobre la superficie.

Una vez que el osteoblasto se ha adherido, empieza a proliferar, es decir, a

llevar a cabo la división celular (Figura 36 a) y a relacionarse con el entorno

moviéndose sobre la superficie e interaccionando con los osteoblastos vecinos (por

medio de los filopodios, Figura 36 b).

Figura 36. Imágenes SEM de los osteoblastos Saos-2: a) en la etapa de proliferación o división celular y b) adhiriéndose a la superficie de Ti e interconectando por medio de los filopodios con los osteoblastos vecinos.

En la Figura 37, se muestran las imágenes de la superficie de Ti-Q después de 1,

3, 5 y 7 días de incubación en cultivo celular de osteoblastos Saos-2. Se puede


observar cómo después de las primeras etapas de adhesión (Figura 37 a), los

osteoblastos se multiplican hasta llegar a cubrir casi por completo toda la superficie

con el tiempo (Figura 37 d). Sin embargo, a pesar de este recubrimiento progresivo,

no se consiguió la confluencia celular en toda la superficie de Ti-Q el último día de

ensayo.

Figura 37. Imágenes SEM del Ti-Q con Saos-2 a: a) día 1, b) día 3, c) día 5 y d) día 7 de incubación en el cultivo celular.


Un hecho importante en la biocompatibilidad de un material es la adhesión y

proliferación celular sobre su superficie. Con el objetivo de examinar la cinética de

adhesión celular sobre la superficie de Ti-Q, se llevaron a cabo ensayos con la


microbalanza de cristal de cuarzo (QCM). Para ello, se midió la variación de la

frecuencia con el tiempo en ausencia y presencia de osteoblastos Saos-2.

La Figura 38 muestra la variación de la frecuencia con el tiempo para 5·104

osteoblastos/cm2 añadidos después de un periodo inicial de incubación de 2 horas en

DMEMc en ausencia de osteoblastos. La disminución de la frecuencia debida al medio

de cultivo celular (DMEMc) fue de -863 Hz [47] en la etapa previa a la incubación con

los osteoblastos. Este valor es mayor que el correspondiente al agua (f = -776 Hz,

Figura 21), debido a la presencia de sales y proteínas capaces de adsorberse sobre el

Ti-Q. Dicho valor de frecuencia (f = -863 Hz) sirve para establecer la línea base

correspondiente a f = 0 Hz y evaluar la variación en frecuencia causada únicamente

por los osteoblastos.

Figura 38. Medida de QCM del Ti-Q con 5·104 Saos-2/cm2 y despegue celular con tripsina.

Después de inyectar los osteoblastos sobre el Ti-Q en el medio de cultivo, hay

una etapa inicial (10 minutos) durante la cual la frecuencia no varía debido a que tiene


lugar la sedimentación celular (por gravedad). Posteriormente la frecuencia disminuye

debido al contacto y a la adhesión de los osteoblastos sobre la superficie de Ti-Q [84],

hasta alcanzar un valor constante de f = -421 Hz después de 24 horas, tiempo

necesario para completar el proceso de adhesión. Teniendo en cuenta que las

viscosidades del DMEMc y del DMEMc con Saos-2 son muy similares, este cambio en

el f fue asignado a la respuesta de los osteoblastos adsorbidos sobre el cristal de Ti-

Q. Para demostrar que los osteoblastos realmente se han adherido a la superficie se

añadió tripsina al medio, para así romper las uniones de los osteoblastos a la

superficie y provocar el despegue celular [85]: se obtuvo un f positivo de 243 Hz. Es

necesario resaltar que no se ha obtenido el mismo valor de f para la adhesión (-421

Hz) que para el despegue con tripsina, debido a que los osteoblastos en el proceso de

adhesión segregan matriz extracelular, quedando adherida a la superficie cuando los

osteoblastos se despegan de ella [76]. Debido al comportamiento viscoelástico de los

osteoblastos, la ecuación de Sauerbrey [75] no se puede aplicar (apartado 3.3.4), pero

es posible a efectos comparativos considerar que los Saos-2 se comportan como un

medio viscoso. Así se puede utilizar la disminución de la frecuencia en función del

tiempo para estudiar la cinética de adsorción.

El proceso de disminución en frecuencia puede estar controlado por el

transporte (difusión) o por la cinética de adsorción, lo que predice dependencias con

el tiempo de t1/2 o exponenciales, respectivamente. El ajuste cinético de los resultados

experimentales (línea roja de la Figura 38) sigue una cinética de primer orden:

Δf = Δfm (1-e-kt)

Donde Δf es el cambio de frecuencia a un tiempo t, Δfm (-421 Hz) es el cambio

de frecuencia entre el estado inicial y el final y k es la constante cinética de primer

orden expresada en min-1 (k= 2·10-3 min-1). Este comportamiento indica que la

velocidad de adhesión es de primer orden, es decir, el proceso no está controlado por


la difusión sino por la velocidad de adsorción de los osteoblastos a la superficie

metálica.

Con el fin de establecer si existe una relación lineal entre el número de

osteoblastos añadidos y la variación de la frecuencia de oscilación, se realizaron

ensayos con diferente número de osteoblastos. Aunque algunos autores han concluido

que existe una relación lineal entre el número de osteoblastos adheridos a la superficie

metálica y la variación en frecuencia [80-82]. Sin embargo, no se ha podido establecer esa

relación debido al gran número de variables a tener en cuenta en cultivos celulares. Así

por ejemplo, es extremadamente difícil partir de cultivos que tengan exactamente el

mismo grado de diferenciación; es decir, células que estén programando su muerte

(apoptosis) y no se adhieran a la superficie y otras en estado adecuado para adherirse y

sobrevivir, en los mismos porcentajes en cada etapa. Teniendo esto en cuenta, la

actividad celular en cada “ensayo” será distinta, lo que provoca que la variabilidad en la

medida sea muy alta y la reproducibilidad baja. Todo ello, provocó que los resultados

obtenidos no fueran concluyentes.

4.2.4 Estudio electroquímico del Ti-Q sumergido en cultivos de osteoblastos

Saos-2

El estudio de las distintas etapas de adhesión y proliferación celular mediante

técnicas electroquímicas han ayudado a comprender cómo se modifican las

propiedades electroquímicas de la superficie metálica como consecuencia de la

interacción de un organismo vivo, que provoca cambios tanto en la composición del

medio de cultivo (consumiendo substancias presentes y agregando otras nuevas)

como en la superficie metálica.


4.2.4.1 Evolución del potencial de corrosión con el tiempo de inmersión

En la Figura 39 se puede observar la evolución con el tiempo del Ecorr del Ti-Q

sumergido en medio de cultivo DMEMc en ausencia y presencia de osteoblastos. El

Ecorr de la muestra sumergida en DMEMc disminuye desde -0,144 V vs Pt hasta

alcanzar un potencial estable a -0,336 V vs Pt; es decir, el Ti que recubre el cristal de

cuarzo, tiene tendencia a activarse con el tiempo de inmersión.

Figura 39. Evolución del Ecorr en función del tiempo de incubación para el Ti-Q sumergido, durante 7 días, en la disolución de (■) DMEMc y (●) presencia de osteoblastos Saos-2.

Al añadir los osteoblastos al medio de cultivo, el Ecorr se sitúa por debajo del

valor de referencia (DMEMc) durante los tres primeros días y permanece constante

hasta el final de los ensayos. Los valores obtenidos para el Ecorr (desde -0,214 a -0,235

V) son consistentes con los datos bibliográficos [68]. Dicha conducta sugiere que la

cantidad de proteínas adsorbidas directamente sobre la superficie de Ti-Q disminuye

debido a la reordenación de la estructura proteínica durante la adhesión celular: los

osteoblastos reordenan las proteínas adsorbidas a su alrededor para adherirse al Ti,

posiblemente disminuyendo las proteínas presentes previamente sobre la superficie.

Llama la atención en esta gráfica la gran variabilidad en los potenciales de corrosión

obtenidos en los distintos ensayos realizados. Esto puede ser debido como


comentamos anteriormente, a muchos factores inherentes al trabajo con cultivos

celulares, tales como distintos pases de osteoblastos o diferentes porcentajes de

estos en distintas etapas de diferenciación [68]. Además, no hay que olvidar que el Ecorr

se mide con respecto a un pseudoreferencia de Pt.


Con el objetivo de evaluar electroquímicamente cómo influye la presencia de

los osteoblastos en la superficie de Ti-Q, se registraron las curvas de polarización para

el Ti-Q, después de 7 días de inmersión, en DMEMc en ausencia y presencia de

osteoblastos (Figura 40).

Figura 40. Curvas de polarización del Ti-Q sumergido en (■) DMEMc y (●) presencia de osteoblastos Saos-2 a los 7 días de incubación.

Las curvas de polarización catódicas, tanto en ausencia como en presencia de

Saos-2, muestran dos intervalos de potencial. A bajo sobrepotencial (entre 0,000 V y -


0,300 V) tiene lugar la transferencia de carga atribuida a la reducción del oxígeno

disuelto en el medio. A altos sobrepotenciales respecto al Ecorr (entre -0,300 V y -0,500

V), tendrían lugar simultáneamente la reducción de oxígeno y el desarrollo de

hidrógeno, este último poco probable, como ya se ha mencionado anteriormente,

tanto por el pH de la disolución (pH =7,4) como por la fortaleza del enlace Ti-H. La

densidad de corriente catódica para el DMEMc, es inferior a la obtenida en presencia

de osteoblastos. Como comentamos anteriormente, los osteoblastos tienen un

metabolismo muy activo y además, para adsorberse a la superficie segregan matriz

extracelular, (compuesta fundamentalmente por proteínas de adhesión) que

desplazan a las proteínas previamente adsorbidas sobre la superficie. Esta actividad

celular promueve que el sistema sea muy dinámico, permitiendo la llegada de oxígeno

a la superficie con mayor facilidad que en el caso del DMEMc en susencia de Saos-2.

Por otro lado, la pendiente de Tafel catódica en DMEMc, es de 0,240 V. Este

valor es más alto que los 0,120 V obtenidos para la reducción del oxígeno sobre la

superficie de Ti en medio fisiológico [132] pero es similar al valor obtenido para la BSA

adsorbida en Ti-Q (Tabla 11) [133].

Con respecto a la rama anódica (Figura 40), el valor de la pendiente de Tafel

obtenida para el DMEMc después de 7 días de inmersión es de 0,772 V (Tabla 15).

Este valor tan alto de la pendiente anódica es similar al obtenido para el Ti-Q

sumergido en la disolución de FBS (Tabla 11), lo que confirma la presencia de una

capa pasiva protectora de óxido de Ti cubierta por una capa de proteínas adsorbidas

sobre la superficie. La densidad de corriente anódica es constante al variar el

potencial aplicado, lo que nos indica que dicha reacción está limitada por la pasividad

de la capa de óxido (cubierta por moléculas orgánicas). El crecimiento de la capa de

óxido en la interfase DMEMc/Ti-Q no está limitado por la difusión a través de la capa

adsorbida de biomoléculas sino por la difusión a través de la capa de óxido nativa que

protege al biomaterial.


Tabla 15. Ecorr y pendientes de Tafel al séptimo día de ensayo para el Ti-Q sumergido en DMEMc en presencia y ausencia de osteoblastos Saos-2.

Ecorr (V) c (V) a (V)

Ti-Q / DMEMc -0,336 0,240 0,772

Ti-Q / Saos-2 -0,223 0,314 0,244

En presencia de osteoblastos Saos-2, la rama anódica muestra densidades de

corriente más altas y valores para la pendiente de Tafel más bajos que para las

muestras de Ti-Q/DMEMc (Tabla 15). Este resultado confirma la alta reactividad del

metabolismo celular, produciendo superóxidos, óxidos nitrosos y protones que

pueden atacar a la superficie metálica [59]. La presencia de estos compuestos no solo

no favorece la formación de la capa de óxido sobre la superficie del titanio, sino que

parece dañarla, puesto que la densidad de corriente aumenta cuando el valor del

potencial aplicado es más anódico. Por tanto, la presencia de la capa pasiva deja de

controlar el proceso, alcanzándose un control mixto en presencia de osteoblastos.


En las Figura 41 a y b se muestra la evolución del módulo de impedancia y del

ángulo de fase frente a la frecuencia, para el Ti-Q sumergido en la disolución de

DMEMc durante 1, 3, 5 y 7 días de ensayo. Estas medidas de impedancia muestran

una respuesta similar independientemente del tiempo de ensayo: el sistema muestra

una única constante de tiempo desde el primer día. En la región de altas frecuencias

(105 Hz - 100 Hz), se observa la resistencia del electrolito, Re; a frecuencias medias y

bajas (100 – 10-3 Hz), la pendiente del módulo de impedancia es -0,87, pudiendo ser

atribuida a la interfase formada por la disolución de DMEMc (electrolito) y las

proteínas procedentes del DMEMc adsorbidas sobre el electrodo de Ti-Q (interfase

electrolito/proteínas-TiO2).


Figura 41. Diagrama de Bode para el Ti-Q sumergido, durante 1, 3, 5 y 7 días, en DMEMc a) módulo de impedancia, y b) ángulo de fase vs la frecuencia; y en DMEMc en presencia de Saos-2 c) módulo de impedancia y d) ángulo de fase vs la frecuencia. Los símbolos son los resultados experimentales y (―) son los ajustes con los circuitos eléctricos equivalentes e), f) y g).


La presencia de los osteoblastos Saos-2 en el medio de cultivo modifica la

interfase electrolito/proteínas-TiO2. Las Figura 41 c y d muestran el módulo de

impedancia y el ángulo de fase frente a la frecuencia respectivamente, de las

muestras de Ti-Q sumergidas en un cultivo de osteoblastos Saos-2 durante 1, 3, 5 y 7

días de ensayo. Desde el primer día de incubación hasta el último, la interfase

electrolito/Saos-2-proteínas-TiO2 cambia significativamente, alterando la respuesta

de los valores de impedancia frente a la frecuencia con respecto a los obtenidos en

ausencia de osteoblastos.

El sistema electroquímico se puede ajustar a dos constantes de tiempo, con un

desplazamiento a valores de frecuencia más altos del max con el tiempo de ensayo

(Figura 41d). A altas frecuencias, el módulo de impedancia del diagrama de Bode

muestra la resistencia del electrolito (Re) que es más alta que para el DMEMc en

ausencia de osteoblastos (Tabla 16). A frecuencias intermedias, se obtiene una

pendiente de -0,85 (Tabla 16), que puede ser atribuida a un condensador en paralelo

con una resistencia asociado con la interfase formada entre el medio de cultivo y la

capa de adsorción biomolecular (integrada por los Saos-2 y su matriz extracelular

adsorbidas sobre la película pasiva de la superficie de Ti-Q, interfase electrolito/Saos-

2-proteínas-TiO2). A frecuencias bajas (10-2 Hz - 10-3 Hz), se observa un cambio en la

pendiente definiéndose claramente una resistencia (tramo horizontal) para el séptimo

día de ensayo. Este cambio, se puede observar claramente en el diagrama de Bode del

ángulo de fase (Figura 41 d), en el que se aprecia un mínimo a 10-3 Hz,

correspondiente a la respuesta de la interfase más interna electrolito/proteínas-TiO2.

Los resultados de los diagramas de impedancia, para el Ti-Q en DMEMc, se

ajustaron considerando el circuito eléctrico equivalente de la Figura 41 e, donde Re es

la resistencia del electrolito entre el electrodo de trabajo y el de referencia; CPE2 es

un elemento de fase constante que simula el comportamiento no lineal de un

condensador, correspondiente a la interfase formada por el medio de cultivo DMEMc


(electrolito) y las proteínas adsorbidas sobre el Ti-Q (electrolito/proteínas-TiO2); R2 es

la resistencia asociada con ella.

Para estudiar los cambios en los diagramas de impedancia para las muestras de

TiQ en presencia de osteoblastos, se consideraron los circuitos eléctricos equivalentes

de las Figura 41 f y g. Teniendo en cuenta las imágenes de SEM (Figura 37) que

muestran un recubrimiento parcial de la superficie de Ti por Saos-2 para los días 1, 3 y

5 de muestreo, los resultados experimentales de EIS se ajustaron al circuito de la

Figura 41 f. Considerando que el cultivo celular es prácticamente confluente al

séptimo día (Figura 37 d), el circuito eléctrico equivalente utilizado para el ajuste fue

el que se muestra en la Figura 41 g. Los componentes electrónicos de ambos circuitos

tienen su significado habitual, con una salvedad: R2 y CPE2 representan la resistencia

y la pseudocapacidad asociadas a la interfase externa DMEMc/Saos-2-proteínas-TiO2,

y R1 y CPE1 son la resistencia y la pseudocapacidad de la interfase DMEMc/TiO2-Ti (1,

3 y 5 días, Figura 41 f) que simula la superficie sin recubrimiento celular, y para el

séptimo día simulan la interfase interna Saos-2-proteínas/TiO2-Ti (Figura 41 g).

La Tabla 16 muestra los resultados del ajuste de las medidas de impedancia

para las muestras sumergidas en DMEMc en ausencia y en presencia de Saos-2

durante 1, 3, 5 y 7 días. En ausencia de Saos-2, los valores de CPE2 aumentan

ligeramente con el tiempo, debido, probablemente, a que la capa de proteínas se

hace más compacta. En consecuencia, R2 disminuye a partir del tercer día de ensayo.

Estos resultados indican que en los primeros instantes de inmersión se produce la

adsorción rápida de las proteínas sobre la superficie del Ti-Q; pero a tiempos de

inmersión más largos, la presencia de aminoácidos y proteínas aumenta la velocidad

de corrosión de los biomateriales metálicos [134, 135]. Además, está documentdo que el

Ti se puede disolver selectivamente por la formación de complejos con las proteínas

[122, 136].


Tabla 16. Ajustes de los resultados experimentales de EIS para el Ti-Q sumergido, durante 1, 3, 5 y 7 días, en la disolución de DMEMc en presencia y ausencia de osteoblastos Saos-2.

2

1,1

·10

-2

1,2

·10

-2

1,2

·10

-2

1,1

·10

-2

2,0

·10

-3

1,7

·10

-3

1,9

·10

-3

2,4

·10

-3

n1

- - - -

0,7

1

0,7

1

0,7

3

0,7

8

%

Erro

r

(CP

E1)

- - - - 7,6

4,0

4,8

6,7

CP

E1

Fc

m-2

s-(

1-n

)

- - - -

65

,96

13

6,6

4

13

6,6

0

20

3,2

1

%

Erro

r

(R1

)

- - - - 9,4

11

,5

13

,6

21

,4

R1

cm

2

- - - -

2,9

·10

6

6,1

·10

5

6,4

·10

5

1,2

·10

4

n2

0,8

4

0,8

3

0,8

2

0,8

3

0,9

1

0,9

0

0,8

7

0,9

8

% E

rro

r

(CP

E2)

1,2

1,2

1,2

1,2

2,5

4,5

4,6

1,2

CP

E2

Fc

m-2

s-(

1-n

)

38

,54

48

,18

52

,26

53

,28

40

,89

44

,89

36

,61

52

,43

%

Erro

r

(R2

)

12

,3

17

,9

16

,0

12

,3

10

,5

12

,3

13

,0

14

,8

R2

cm

2

3,3

·10

6

3,6

·10

6

2,9

·10

6

2,1

·10

6

1,4

·10

6

3,3

·10

5

3,3

·10

5

1,2

·10

5

Re

13

2,7

13

9,6

13

8,2

11

4,6

18

3,5

19

4,3

19

4,2

18

0,9

t

día

s

1

3

5

7

1

3

5

7

Sup

er-

fici

e

Ti-Q

/

DM

EMc

Ti-Q

/

Sao

s-2


De acuerdo con los ajustes de los resultados de EIS (Tabla 16), la

pseudocapacidad (CPE2) de la capa de adsorción biomolecular integrada con Saos-2

aumenta con el tiempo de inmersión, sugiriendo que la cantidad de proteínas

adsorbidas directamente sobre la superficie del Ti-Q disminuye durante la adhesión

celular [59]. De igual modo, los valores de R2 disminuyen a medida que la

concentración de las proteínas adsorbidas disminuye. La resistencia del óxido (R1)

disminuye y CPE1 aumenta considerablemente desde el primer día de incubación con

Saos-2. Estos resultados indican que los componentes que generan los osteoblastos,

como óxido nitroso y superóxidos, pueden disolver, por medio de reacciones

químicas, el óxido de titanio acelerando la corrosión de la superficie del Ti-Q [137],

como ya habíamos observado a través de las curvas de polarización.

Transformadas de Kramers-Kronig (K-K)

Una vez analizados y ajustados los diagramas de impedancia obtenidos para el

Ti-Q sumergido en DMEMc en ausencia y en presencia de osteoblastos Saos-2, se

procedió a calcular las transformadas de Kramers-Kronig [100], para así evaluar la

fiabilidad de las medidas de impedancia.

En la Figura 42, se muestran los diagramas que representan los resultados

experimentales y los resultados calculados a partir de las transformadas de K-K para el

Ti-Q sumergido en DMEMc durante 1, 3, 5 y 7 días, en ausencia y presencia de Saos-2.

Como se puede observar, la consistencia de los resultados experimentales es bastante

buena. No obstante, se han calculado los errores medios de los resultados de las

transformadas de K-K con respecto a los resultados originales utilizando la ecuación

(9).

El error medio obtenido para cada una de las transformadas de K-K no supera

el 0,7% (Tabla 26); por tanto los resultados experimentales satisfacen las

transformadas de K-K.


Figura 42. Resultados experimentales (O) correspondientes al Ti-Q sumergido, durante 7 días, en: a) DMEMc y b) DMEMc con Saos-2, y los resultados obtenidos utilizando las relaciones de Kramers-Kronig (K-K)(+).

Carece de interés incluir los resultados de las transformadas de K-K para todos

los días de medida. Éstos resultaron también con buena concordancia.

Tabla 17. Errores medios calculados por medio de la expresión (9), de las representaciones de Kramers-Kronig (K-K) con respecto a los resultados obtenidos experimentalmente para el DMEMc en presencia y ausencia de Saos-2 para el séptimo día de ensayo.

Error medio (%)

Medios Componente Real (Z´) Componente Imaginaria (Z”)

DMEMc 0,517 0,207

Saos-2 0,545 0,614


4.2.5 Discusión

La adhesión celular es un proceso dinámico que comienza con el contacto

inicial de la célula con las proteínas adsorbidas sobre la superficie. Este hecho implica

la acción conjunta de varias moléculas, que inducen a la posterior respuesta celular en

términos de migración, proliferación y diferenciación, así como el remodelado sobre

la superficie de las proteínas adsorbidas o de la matriz extracelular. Es evidente que

este complejo mecanismo de adhesión y proliferación celular modifica continuamente

tanto la interfase osteoblastos/TiO2, como la superficie del material metálico.

En los estudios de QCM, teniendo en cuenta que las viscosidades del DMEMc y

del DMEMc con Saos-2 son muy parecidas, el cambio en la frecuencia se debe

fundamentalmente a la adsorción de los osteoblastos sobre el cristal de Ti-Q. Es

destacable la gran sensibilidad de la microbalanza de cristal de cuarzo, ya que es capaz

de detectar ganancias de masa en los momentos iniciales de la adhesión celular a

través de la adhesión de “puntos localizados” de las extensiones o filopodios que los

osteoblastos utilizan para adherirse a las superficies y cuyo mecanismo progresa hasta

el posterior recubrimiento de la superficie metálica.

El mecanismo de adhesión celular de los osteoblastos es un proceso que sigue

una cinética de primer orden, es decir, está controlado por la velocidad de adsorción de

los osteoblastos. Redepenning y col. [77], utilizando la ecuación de Kanazawa [78, 79] han

obtenido un comportamiento similar para una monocapa de osteoblastos. Los valores

obtenidos de la constante de velocidad reflejan valores correspondientes a una cinética

lenta, acorde con la cinética de adhesión de otraslíneas celulares como pueden ser los

fibroblastos.

Transcurridas 24 horas de ensayo, el proceso de tripsinización para despegar los

osteoblastos de la superficie de Ti no permitió la recuperación de los valores de

frecuencia característicos del cultivo DMEMc, lo cual se debe a la generación de la


matriz extracelular por parte de los osteoblastos, que queda adsorbida sobre la

superficie de Ti.

Galli Marxer y col. [81] han detectado un aumento en los valores de la frecuencia

para tiempos de incubación superiores a las 24 horas que han asociado a un cambio en

las propiedades viscoelásticas de los osteoblastos, es decir, a un aumento de la rigidez

propia de un estado más avanzado del proceso de adhesión celular.

Por otra parte, las propiedades electroquímicas de la superficie de Ti-Q se ven

alteradas como consecuencia de su interacción con el medio de cultivo celular y con las

células osteoblásticas. La interacción electroquímica de la superficie de Ti-Q con las

células osteoblásticas y el medio de cultivo DMEMc dio lugar a valores de potencial de

corrosión negativos, que incluso tienden a evolucionar hacia valores más negativos a lo

largo del tiempo de ensayo, lo que indica que hay una tendencia a que el material sea

más activo, es decir, mayor tendencia hacia la corrosión. Esta tendencia se puede

explicar teniendo en cuenta la asociación de dos procesos que ocurren

simultáneamente en el medio de cultivo celular. Por una parte, considerando

únicamente el DMEMc, el medio de cultivo celular contiene iones inorgánicos que

disminuyen el potencial, como es el caso de los fosfatos y el calcio, y proteínas como la

albúmina que compiten por la adsorción sobre la superficie metálica. Además no hay

que olvidar que ciertas proteínas pueden formar complejos que faciliten la disolución

del Ti [68]. Y por otra parte, considerando la presencia de las células osteoblásticas, hay

que tener en cuenta que en el proceso de adhesión sobre la superficie metálica, los

osteoblastos sustituyen las proteínas adsorbidas del medio celular por proteínas

específicas de adhesión [59], generando matriz extracelular que actúa como un colchón

idóneo para su anclaje en la superficie de Ti-Q. Este metabolismo tan activo y dinámico,

no sólo genera estas proteínas sino que también generan productos de desecho muy

reactivos, como superóxidos, óxido nitroso, protones, etc [137]. Todos ellos actúan

activamente sobre la superficie de óxido de Ti, atacándola y disminuyendo la

protección del material metálico. Este proceso se ve reflejado en la disminución de los


valores de la pendiente de Tafel (Tabla 15) tanto catódica como anódica respecto al

DMEMc, así como en los mayores valores de la densidad de corriente anódica y

catódica en las curvas de polarización (Figura 40). En este último caso, parece que la

adhesión celular y los procesos implicados facilitan la llegada del oxígeno a la superficie

del Ti-Q obteniéndose densidades de corriente un orden de magnitud mayor que para

el DMEMc (Figura 40).

Los valores de la capacidad para la interfase electrolito/proteínas-TiO2, para las

muestras de Ti-Q en DMEMc, aumentan ligeramente a lo largo de los 7 días de ensayo

(Tabla 16). Consecuentemente, la resistencia asociada a dicha interfase disminuye a

partir del tercer día. Como ya se ha mencionado anteriormente, la adsorción de las

proteínas es un proceso rápido que aumentaría la resistencia para tiempos cortos de

inmersión. Sin embargo, la presencia de proteínas facilitaría la formación de

complejos aumentando la velocidad de corrosión para tiempos más largos.

La misma tendencia se observa para la interfase externa e interna del sistema

DMEMc/Saos-2/TiO2-Ti durante los 7 días de inmersión (Tabla 16). Por una parte, en

la interfase externa la cantidad de proteínas adsorbidas sobre la superficie de Ti-Q

disminuye debido al reordenamiento de proteínas que llevan a cabo los osteoblastos

[59]. En consecuencia, disminuye la resistencia y aumenta la capacidad. Los

compuestos que generan los osteoblastos pueden modificar la capa pasiva de TiO2

acelerando su disolución y por tanto, adelgazando el espesor del óxido y

disminuyendo su capacidad protectora, como muestran las curvas de polarización. Por

otro lado, la pendiente de Tafel anódica es menor que para el Ti-Q en DMEMc, lo que

indica que la actividad metabólica de los osteoblastos promueve fenómenos de

corrosión en mayor medida que el DMEMc.


4.3 Estudio de la interfase Ti-TT/componentes del DMEMc

4.3.1 Caracterización de las superficies de Ti

La caracterización de la morfología superficial de las muestras de Ti antes (Tim)

y después del tratamiento térmico (Ti-TT) fue examinada por microscopía electrónica

de barrido (SEM) y microscopía de fuerza atómica (AFM), y la composición superficial

por dispersión de energía de rayos X (EDX) y espectroscopía fotoelectrónica de rayos X

(XPS).


dispersión de energía de rayos X (EDX)

La Figura 43 a muestra una imagen de SEM de la superficie de titanio después

del tratamiento térmico a 277°C durante 5 h. (Ti-TT).

Figura 43. (a) Imagen de SEM del titanio tratado térmicamente (Ti-TT) y (b) análisis por EDX.

La superficie metálica oxidada presenta una topografía homogénea en la que

todavía se revelan surcos paralelos del proceso de pulido, sobre los que se aprecian

precipitados blancos diseminados por toda la superficie de la muestra. El análisis por

140 4.3 Estudio de la interfase Ti-TT/componentes del DMEMc

EDX de estos precipitados refleja dos picos asociados a titanio y oxígeno (Figura 43 b),

lo que indica que se trata de óxidos de titanio.


La Figura 44 muestra, a modo de ejemplo, una imagen de AFM de 10 m x 10

m de la topografía de la superficie de titanio antes del tratamiento térmico (Ti-m).

Figura 44. Imagen de AFM de la topografía superficial del Ti antes del tratamiento térmico (Ti-m) y perfil de Ti-m de uno de los surcos de la superficie.


La superficie presenta crestas y valles de aproximadamente 350 nm de alto y

unas 2 m de ancho como consecuencia del pulido de la superficie. A lo largo del

surco y en sus alrededores, la rugosidad superficial (RMS) varía entre 12,38 y 91,68

nm (Tabla 18).

La Figura 45 muestra, a modo de ejemplo, una imagen de AFM de 10 m x 10

m de la superficie de Ti después del tratamiento térmico (Ti-TT).

Figura 45. Imagen de AFM de la topografía superficial del Ti-TT después del tratamiento térmico y perfil de Ti-TT de uno de los surcos de la superficie.


De nuevo, al igual que en la superficie de Ti-m, se observan crestas cuya altura

se ha reducido a aproximadamente 200 nm y valles que se mantienen con un ancho

de 2 m, como observamos en el perfil de uno de los surcos de la superficie (Figura 45

b). Comparando la topografía de las muestras de Ti-m y Ti-TT (Figura 44 y 45), se

puede concluir que la superficie de Ti después del tratamiento térmico presenta una

topografía aparentemente más rugosa, con pequeñas protuberancias, que no se

observan en el Ti-m. Sin embargo, al contrario de lo que cabría esperar, la rugosidad

(RMS) arroja valores similares a la superficie de titanio sin tratar (Tabla 18).

Tabla 18. Resultados de rugosidad (RMS) del titanio antes (Tim) y después del tratamiento térmico (Ti-TT).

RMS (nm)

Tim Ti-TT

28,42 56,06

51,09 92,40

78,50 66,63

42,69 29,99

32,92 70,77

12,38 19,43

91,68 52,52

46,44 59,07

4.3.1.3 Espectroscopía fotoelectrónica de rayos X (XPS)

Con propósitos comparativos, se analizó la composición superficial de las

muestras de titanio antes (Ti-m) y después del tratamiento térmico (Ti-TT) mediante

espectroscopía electrónica de rayos X (XPS).

La composición química de las superficies de Ti-m y Ti-TT analizadas por XPS, se

muestra en la Tabla 19, donde se resumen las energías de ligadura de los picos y los %

atómicos correspondientes. Los espectros de XPS obtenidos para ambas muestras,


son similares en cuanto a composición, pero difieren en la proporción de las especies

presentes.

El pico de XPS correspondiente al Ti2p confirma que la composición química de

la película de óxido es TiO2 (Ti2p 458,6 eV) para el Ti-m y Ti-TT. Sin embargo, el

aumento en el % atómico de dicho pico para el Ti-TT nos indica que el tratamiento

térmico ha favorecido el crecimiento de TiO2.

Tabla 19. Energías de ligadura y % atómico de los espectros de alta resolución de XPS del O1s y del Ti2p para las muestras de Ti-m y Ti-TT.

Superficie Elemento Asignación Energía de ligadura

(eV) % atómico

Ti-m

C1s C-C, C-H 284,8 34,8

O1s TiO2

Ti-OH 530,2 531,6

33,9 16,1

Ti2p TiO2 458,6 15,3

Ti-TT

C1s C-C, C-H 284,8 3,5

O1s TiO2

Ti-OH 529,9 531,4

58,2 14,8

Ti2p TiO2 458,6 23,5

El espectro de alta resolución para el Ti-TT de O1s (Figura 46) muestra que la

banda del O1s puede deconvolucionarse en dos componentes. El primer pico se

asigna al enlace Ti-O en el TiO2 y el segundo al enlace del Ti-OH. Es interesante

observar que, como consecuencia del tratamiento térmico, el % atómico del pico

asociado al enlace TiO2 aumenta, y por consiguiente, aumenta el % atómico del pico

del Ti2p. Es decir, el tratamiento térmico favorece el crecimiento de la capa de TiO2,

mientras el % atómico de los enlaces Ti-OH permanece prácticamente constante en la

superficie.


Figura 46. Espectros de alta resolución de XPS del O1s para el Ti-m y el Ti-TT.

4.3.1.4 Cálculo del espesor de óxido de titanio mediante espectroscopía de

impedancia electroquímica.

La capacidad de un condensador puede expresarse como:

(11)

donde A es el área de cada placa, d la distancia entre ellas, ε0 la permitividad en el

vacío (8,9·10-12 F m-1) y εY la constante dieléctrica relativa del medio existente entre

las placas, en este caso εY = 80 relativa al TiO2 [138]. A partir de esta ecuación, se puede

realizar una estimación del espesor del óxido formado sobre el titanio al tratarlo

térmicamente y compararlo con el valor del óxido nativo en una disolución de fosfato.

Para ello se ha calculado la capacidad a partir de medidas de impedancia a altas

frecuencias, aplicando el método de frecuencia fija.

(12)

Donde fi = 100 Hz y Z” es la componente imaginaria del valor de la impedancia Z a esa

frecuencia. El espesor del óxido obtenido para el Ti-m es de aproximadamente 2,2 nm


correspondiéndose con el óxido nativo, y de 12,0 nm para el Ti-TT. El tratamiento

térmico ha aumentado en aproximadamente 10 nm el espesor de la capa de TiO2.

4.3.2 Caracterización del Ti-TT en los distintos componentes del DMEMc por

espectroscopía fotoelectrónica de rayos X (XPS)

La espectroscopía fotoelectrónica de rayos X (XPS) se utilizó para obtener la

información necesaria a cerca de los elementos presentes sobre la superficie de Ti-TT,

después de siete días de tratamiento, en cada uno de los componentes del DMEMc.

Dicha información, será útil, posteriormente, para escoger el circuito eléctrico

equivalente más adecuado para simular los resultados experimentales obtenidos con

la espectroscopía de impedancia electroquímica (EIS), en cada caso.

En la Figura 47 se muestran los espectros de alta resolución del C1s y del O1s

para el Ti-TT después de estar inmerso en una disolución de NaH2PO4 (P/Figura 47 a),

NaH2PO4 +CaCl2 (PCa/Figura 47 b) y NaH2PO4 +CaCl2 + glucosa (PCaG/Figura 47 c). En

la Tabla 20 se muestran las energías de ligadura así como los % atómicos

correspondientes a cada uno de los componentes del espectro de XPS.

En presencia de iones fosfato (disolución P) y de iones fosfato y calcio

(disolución PCa), el espectro del C1s puede ser resuelto en tres componentes que

corresponden al carbono en diferentes entornos. El primer pico, a más baja energía

de ligadura, es asignado a un carbono enlazado a C o H (C-C, C-H); el segundo, es

atribuido al carbono en el enlace sencillo C-O; el tercero, al carbono en C=O (-HC=O)

[112] (Tabla 20). El espectro de alta resolución del O1s muestra la deconvolución de la

banda del O1s en dos componentes asignados a TiO2 y Ti-OH. También, se aprecia una

banda a 133,3 eV correspondiente al PO43- y además, en presencia de Ca2+, se observa

la incorporación de estos iones a la composición superficial como CaHPO4 [139] a 347,9

eV.


Figura 47. Espectros de alta resolución de XPS del C1s y O1s para el Ti-TT sumergido 7 días en las disoluciones: (a) NaH2PO4, (b) NaH2PO4+ CaCl2 y (c) NaH2PO4+ CaCl2 + glucosa.


Tabla 20. Energías de ligadura y % atómico de los espectros de alta resolución de XPS, para el Ti-TT al cabo de 7 días sumergido en las disoluciones de NaH2PO4 (P), NaH2PO4+ CaCl2 (PCa), NaH2PO4+ CaCl2 + glucosa (PCaG), NaH2PO4+ CaCl2 + BSA y FBS.

Superficie Elemento Asignación Energía de ligadura (eV) % atómico

Ti-TT / P

C1s C-C, C-H

C=O O-C=O

284,8 286,3 288,4

24,5 6,7 5,5

O1s TiO2

Ti-OH 529,9 531,4

29,6 12,7

Ti2p TiO2 458,5 18,9

P2p PO43-

133,3 1,5

Ti-TT / PCa

C1s C-C, C-H

C=O O-C=O

284,8 286,5 288,5

16,3 6,1 4,3

O1s TiO2

Ti-OH 529,9 531,4

38,9 15,0

Ti2p TiO2 458,6 16,8

P2p PO43-

133,5 1,3

Ca2p CaHPO4 347,9 1,4

Ti-TT / PCaG

C1s C-C, C-H

C=O O-C=O

284,8 286,3 288,4

26,0 20,3 14,1

O1s TiO2

O-C=O 530,1 531,8

17,6 13,1

Ti2p TiO2 458,6 7,5

P2p PO43-

133,5 0,8

Ca2p Ca2+

347,1 0,6

Ti-TT / BSA

C1s

C-C, C-H C-NH-, C=O

CO-NH-, COOH

284,8 286,0 288,1

28,4 19,9 15,0

O1s TiO2

CO-NH-, COOH 529,9 531,6

5,1 8,6

Ti2p TiO2 458,6 5,2

N1s -O=C-NH-, –NH2 399,9 17,8

Ti-TT / FBS

C1s C-C, C-H

C-NH-, C=O CO-NH-, COOH

284,8 286,0 288,1

26,2 18,6 12,9

O1s TiO2

C=O

530,1 531,9

8,3 15,5

Ti2p TiO2 458,6 3,4

P2p PO43-

133,6 0,3

Ca2p Ca2+

347,7 0,2

N1s -O=C-NH-, –NH2 399,9 14,6


Cuando se añade glucosa a la disolución de PCa se observan dos diferencias

notables en los espectros del C1s y del O1s. En el caso del C1s, aunque las energías de

ligadura asignadas son las mismas, la contribución de los picos C=O y O-C=O ha

incrementado considerablemente. En el espectro de alta resolución del O1s las

energías de ligadura que se han utilizado para resolver el espectro se asignaron a TiO2

y O-C=O (Tabla 20), confirmando la presencia de glucosa adsorbida sobre la superficie

de Ti-TT, aunque sin llegar a alcanzar un recubrimiento total puesto que está presente

el TiO2 representando la superficie libre se sigue detectando Ti en los espectros de

XPS.

El % atómico de la componente Ti2p asociada a la banda del TiO2 es

prácticamente la misma para las muestras que han estado sumergidas en las

disoluciones de iones fosfato y de iones fosfato y calcio; sin embargo, disminuye a

más de la mitad en las muestras que han estado sumergidas en la disolución de

glucosa (PCaG). Asimismo, se observa un % atómico similar del pico del O1s para el

enlace Ti-OH en las disoluciones de iones fosfato y de iones fosfato y calcio, aunque

esta contribución ha desaparecido cuando la disolución contiene glucosa. La

adsorción de la glucosa sobre la superficie de las muestras de Ti-TT queda reflejada en

la mayor contribución de los picos asociados a los enlaces C=O y O-C=O, presentes en

la molécula de glucosa. El hecho más reseñable es la presencia de iones PO43- y Ca2+

después de la inmersión del Ti-TT en la disolución que contiene glucosa, aunque el

porcentaje atómico del P2p y Ca2p se ha reducido a la mitad. Hay que tener en cuenta

que la glucosa adsorbida podría impedir la detección de dichos iones así como del

TiO2 y Ti-OH, como muestra la disminución del % atómico obtenido, llegando en algún

caso a desaparecer (Ti-OH). Otra posibilidad es que en presencia de glucosa disminuya

la adsorción tanto del PO43- como del Ca2+. Sin embargo, el % atómico determinado

para el P2p y el Ca2p representaría la adsorción de PO43- y Ca2+ sobre la superficie de

TiO2 libre, debido a que la adsorción de la glucosa sobre el Ti-TT es un proceso más


rápido que la adsorción iónica y además solo se alcanza un recubrimiento superficial

parcial.

Figura 48. Espectros de alta resolución de XPS del C1s y del O1s de las muestras de Ti-TT sumergido, durante 7 días, en (a) BSA y (b) FBS.


En la Figura 48 se muestran los espectros de alta resolución del C1s y del O1s

para el Ti-TT sumergido durante 7 días, en las disoluciones de BSA y FBS. En principio,

el espectro del C1s parecería similar al obtenido en presencia de glucosa; sin

embargo, la deconvolución es ligeramente diferente, mostrando las bandas

características de la estructura de la proteína (Tabla 20). El espectro del C1s se puede

descomponer en tres picos: 284,8 eV para los enlaces C-C, C=C y C-H; 286,0 eV para el

enlace C=O y para el grupo amino (C-NH-); y el pico que aparece a 288,1 eV que se

asigna a los enlaces peptídicos (CO-NH-) y grupos ácidos (COOH). Estas energías de

ligadura corresponden a los diferentes grupos químicos presentes en la molécula de la

BSA. El espectro del O1s confirma también la presencia de la albúmina sobre el Ti-TT.

En la Figura 48 se muestra la contribución de dos componentes, la correspondiente a

la superficie de titanio oxidada (TiO2/529,9 eV) y la de los grupos característicos de la

BSA. Al igual que el C1s, la señal del N1s proviene de las proteínas adsorbidas. El pico

del N1s es simétrico y centrado a 399,9 eV; su principal contribución corresponde al

enlace peptídico (–O=C-NH-) y al grupo –NH2, como se espera para los grupos amida y

amina de la BSA. Es importante destacar la ausencia de fosfato y calcio en presencia

de BSA, contrariamente a lo que sucede cuando la superficie de Ti-TT es tratada con

FBS. Esto se explica por la gran variedad de compuestos del FBS, frente a una única

proteína presente en la disolución de BSA.

Tabla 21. Porcentaje atómico de los elementos que aparecen en XPS sobre las superficies de Ti-TT, después de 7 días de inmersión en cada uno de los componentes del DMEMc.

Muestra Ti (at%) O (at%) C (at%) P (at%) Ca (at%) N (at%)

Ti-TT 23,5 73,0 3,5 - - -

Ti-TT/P 18,9 42,7 36,9 1,5 - -

Ti-TT/PCa 16,8 53,8 26,7 1,3 1,4 -

Ti-TT/PCaG 7,5 30,7 60,4 0,8 0,6 -

Ti-TT/BSA 5,2 13,7 63,3 - - 17,8

Ti-TT/FBS 3,4 23,8 57,7 0,3 0,2 14,6


Por otro lado, si se centra la atención en el porcentaje atómico (Tabla 21) de

cada elemento, se puede observar que a medida que el medio en el que están

sumergidas las muestras de Ti-TT es más complejo, el % Ti va disminuyendo. Esto es

debido principalmente a la adsorción de los diferentes iones, moléculas y

biomoléculas a la superficie del Ti-TT. Hay que resaltar también que en la muestra que

ha estado sumergida en la disolución de iones fosfato y calcio (PCa), la relación Ca/P

es de 0,9; superior para la obtenida para el Ti-Q (0,48). Estos valores son más bajos

que el que se considera estándar para la formación de apatita (1,67).

En presencia de albúmina no se observa ninguno de estos dos elementos (P2p

o Ca2p), lo que induce a pensar que la adsorción de esta impide que se detecten

dichos iones, aunque hayan sido incorporados a la capa de óxido. En este caso, el

porcentaje atómico del Ti ha disminuido respecto a las disoluciones anteriores,

alcanzando un valor mínimo en presencia de FBS. En este caso se puede apreciar un

0,3% de fosforo y un 0,2% de calcio. Estos resultados indican que a pesar de la

presencia de la albúmina en la disolución de FBS, existen otros iones y/o moléculas

que compiten con la BSA por adsorberse sobre la superficie de Ti-TT. Por lo tanto, la

capa de biomoléculas adsorbida es más homogénea y estructurada para las muestras

de Ti-TT inmersas en BSA que en FBS. Pudiéndose detectar en este último caso el

fósforo y el calcio. Por otra parte, los porcentajes atómicos del C y el N alcanzan su

valor máximo cuando se sumerge el Ti-TT en albúmina, debido al contenido en C y N

de dicha proteína.

4.3.3. Estudio electroquímico del Ti-TT sumergido en los distintos

componentes del DMEMc

4.3.3.1 Evolución del potencial de corrosión (E corr) con el tiempo de inmersión

El primer parámetro electroquímico estudiado, fue la evolución del potencial

de corrosión (Ecorr) en función del tiempo de ensayo (1-7 días), del Ti-TT sumergido en


cada una de las siguientes disoluciones: NaH2PO4 (P), NaH2PO4 + CaCl2 (PCa), NaH2PO4

+ CaCl2 + glucosa (PCaG), BSA y FBS (Figura 49).

En la Figura 49 se observan dos tendencias diferentes dependiendo de la

disolución utilizada. Por una parte, se observa un desplazamiento del Ecorr desde

valores catódicos hacia valores anódicos, a medida que aumenta el tiempo de

inmersión del Ti-TT, en la disolución muestreada. Dicha conducta es seguida por el Ti-

TT sumergido en las disoluciones de iones fosfato (P), iones fosfato y calcio (PCa) y

glucosa (PCaG). Durante los primeros días, el potencial de corrosión aumenta

rápidamente hasta alcanzar un valor prácticamente constante, a partir del sexto día.

En resumen, destacamos que, como consecuencia de la inmersión de las muestras de

Ti-TT en las disoluciones con fosfato, fosfato y calcio y glucosa, la superficie sufre un

ennoblecimiento, debido fundamentalmente a su interacción con los iones fosfato y

calcio.

Figura 49. Evolución del Ecorr con el tiempo para el Ti-TT en (■) NaH2PO4 (P), (●) NaH2PO4 + CaCl2 (PCa), (▲) NaH2PO4 + CaCl2 + glucosa (PCaG), (▼) albúmina (BSA) y (♦) suero fetal bovino (FBS).

La segunda tendencia, se observa para el Ti-TT inmerso en BSA y FBS. La

evolución del potencial de corrosión presenta un comportamiento diferente cuando


en el medio están presentes las proteínas, como por ejemplo la albúmina, BSA. En

este caso, el Ecorr se sitúa en valores por debajo de los potenciales obtenidos para las

muestras de Ti-TT sumergidas en PCa y PCaG, y permanece constante en -0,08 V vs

Ag/AgCl desde el primer día hasta los 7 días de inmersión. Este comportamiento

indica que la superficie del Ti-TT alcanza un estado estacionario el primer día de

ensayo, en el cual permanece hasta el final del mismo; es decir, la interacción de las

proteínas con la superficie de Ti-TT se produce en los primeros momentos de la

inmersión y no se altera con el tiempo de ensayo. La disolución de suero fetal bovino

(denominada como FBS) contiene albúmina en las mismas proporciones que la

disolución de BSA, además de otros muchos nutrientes necesarios para la vida celular,

entre los que se encuentran sales inorgánicas y vitaminas. No obstante, la respuesta

del potencial de corrosión es idéntica a la encontrada con la disolución de albúmina,

por lo que se puede concluir que la lectura del potencial de corrosión o la

espontaneidad de la reacción de corrosión, parece estar controlada por la presencia

de la albúmina.


En la Figura 50, se muestran las curvas de polarización (± 0,5 V respecto al Ecorr)

para el Ti-TT, después de siete días de inmersión en cada una de las disoluciones en

estudio: P, PCa y PCaG, BSA y FBS.

Tabla 22. Ecorr y pendientes de Tafel al séptimo día de ensayo para el Ti-TT en cada una de las disoluciones de los componentes del DMEMc.

Disoluciones Ecorr (V) c (V) a (V)

P 0,038 0,121 0,466

PCa 0,079 0,187 0,421

PCaG 0,104 0,160 0,360

BSA -0,082 0,228 0,454

FBS -0,081 0,213 0,416


Figura 50. Curvas de polarización del Ti-TT sumergido, durante 7 días, en (a) (■) NaH2PO4 (P), (●) NaH2PO4 + CaCl2 (PCa), (▲) NaH2PO4 + CaCl2 + glucosa (PCaG), y (b) (■) NaH2PO4 (P), (●) albúmina (BSA) y (▲) suero fetal bovino (FBS), a una velocidad de barrido de 1mV/s.


El primer hecho reseñable es el desplazamiento anódico del Ecorr, que se

produce al sumergir 7 días el Ti-TT en PCa y PCaG, con respecto a la disolución de

fosfato (P); este hecho confirma el efecto protector generado por los iones presentes

en ambas disoluciones (Tabla 22, Figura 49 a los 7 días). Por el contrario, en presencia

de BSA y FBS, el Ecorr adquiere valores más catódicos que en ausencia de proteínas,

poniendo de manifiesto el efecto corrosivo de las mismas, posiblemente debido a la

capacidad para acomplejar los iones Ti4+.

El segundo hecho reseñable es que, independientemente de que el Ti-TT esté

sumergido en P, PCa, PCaG, BSA o FBS, la rama anódica es prácticamente la misma

para todas las disoluciones, los valores de pendientes de Tafel anódica, a (Tabla 22),

son muy similares y siempre superiores a los valores de las pendientes catódicas, lo

que nos indica que el proceso está controlado anódicamente. Se observa que las

densidades de corriente anódicas en presencia de fosfato y calcio (PCa) y glucosa

(PCaG) son ligeramente menores que para el Ti-TT en disolución de fosfato,

confirmando el efecto bloqueante de los iones calcio y de la glucosa. Por el contrario,

la densidad de corriente anódica para el Ti-TT en presencia de BSA y FBS es mayor que

en la disolución de fosfato, confirmando el efecto acomplejante de la albúmina, a

pesar de la capa de óxido (TiO2) que protege la superficie del biomaterial (≈ 10 nm).

En cuanto a la rama catódica, se pueden diferenciar dos zonas en las curvas de

polarización: una región de sobrepotencial comprendida entre 0 V y -0,200 V y otra a

sobrepotenciales más catódicos entre -0,200 V y -0,500 V. Teniendo en cuenta el

diagrama de Pourbaix para el Ti (Anexo 7.3) a pH de 7,4 [140], en la primera zona tiene

lugar la reducción del oxígeno disuelto en la disolución [119], mientras que en la

segunda se da la reducción del oxígeno, así como la de los protones, aunque la

contribución de esta última reacción no sea muy significativa. La pendiente de Tafel

catódica para las muestras de Ti-TT sumergidas en la disolución de fosfatos es de

0,121 V, correspondiente a la reducción del oxígeno:


O2 + 4H+ + 4e- → 2H2O

La adición de CaCl2 a la disolución de fosfato (disolución PCa) da lugar a una

significativa disminución de la corriente catódica (Figura 50 a), así como a un aumento

en el valor de la pendiente de Tafel catódica, c (0,187 V vs 0,121 V); esto refleja la

dificultad que tiene el oxígeno para reducirse debido, probablemente, a la presencia

de iones fosfato e iones calcio adsorbidos sobre la superficie.

Cuando evaluamos la respuesta a la polarización catódica del Ti-TT en una

disolución que contiene glucosa (disolución PCaG), tanto la pendiente de Tafel

catódica como la densidad de corriente alcanzan valores intermedios entre las

disoluciones de fosfato (P) y fosfato y calcio (PCa) (Tabla 22). Esto indica que en

presencia de glucosa la reacción de reducción de oxígeno no está tan impedida como

en el caso de la disolución de fosfato y calcio (PCa); de hecho, el porcentaje atómico

de ambos iones ha disminuido para el Ti-TT en presencia de glucosa, como indican los

resultados obtenidos por XPS.

En el caso de la disolución de BSA, la presencia de los iones Ca2+ favorece su

adsorción, así como la de los iones fosfato sobre la superficie del Ti-TT, la cual está

cargada negativamente debido a la presencia de los grupos hidroxilo. Por otro lado,

en presencia de BSA y FBS (Figura 50 b) los valores de las pendientes catódicas son

más altas que en los casos tratados anteriormente, indicando que los procesos

catódicos están menos favorecidos en presencia de proteínas. Sin embargo, los

valores de las pendientes de Tafel catódicas para las disoluciones de BSA y FBS son

muy similares entre sí: queda claro que la albúmina controla el mecanismo de

reacción sobre el resto de los componentes del suero fetal bovino. No obstante, la

densidad de corriente catódica es mayor para la disolución que contiene únicamente

albúmina, BSA, que para el suero fetal bovino, FBS. Esto puede ser debido a que los

compuestos presentes en la disolución de FBS bloquean con mayor eficiencia los sitios

de reducción de O2 impidiendo que se de dicha reacción.


Figura 51. Densidad de corriente catódica calculada a -0,2 V para el Ti-TT sumergido en cada una de las disoluciones de los componentes del DMEMc.

Otra manera de estudiar el efecto de cada uno de los componentes del DMEMc

sobre el Ti-TT, fue medir la densidad de corriente catódica a un sobrepotencial

constante de -0,2 V respecto al Ecorr (Figura 51). Se aprecia cómo a medida que

aumenta la complejidad del medio la densidad de corriente catódica va

disminuyendo, debido, principalmente, a la interacción con la superficie de los

distintos compuestos que bloquean de una u otra manera la difusión de oxígeno hacia

la superficie de titanio, impidiendo la reducción del mismo. Por otra parte, el valor de

densidad de corriente catódica para la disolución de FBS es el más bajo de todos,

indicando que los componentes de dicha disolución bloquean más eficientemente los

sitios en los que se produce la reducción del oxígeno.


En la Figura 52 se muestran los diagramas de Bode del módulo de impedancia y

del ángulo de fase frente a la frecuencia, para las muestras de Ti-TT sumergidas,


durante 7 días, en la disolución de fosfato (P) (Figura 52 a y b) y en la disolución de

fosfato y calcio (PCa) (Figura 52 c y d).

Figura 52. Diagrama de Bode para el Ti-TT sumergido, durante 7 días, en la disolución de NaH2PO4 (a) módulo de impedancia, y (b) ángulo de fase vs la frecuencia; y en la disolución de NaH2PO4 + CaCl2 (c) módulo de impedancia y (d) ángulo de fase vs la frecuencia. Los símbolos son los resultados experimentales y (―) son los ajustes con el circuito eléctrico equivalente (e).

El módulo de impedancia frente a la frecuencia (Figura 52 a y c) muestra un

valor constante a altas frecuencias. El valor de la impedancia en esta zona, que

coincide con un valor del ángulo de fase igual a cero (Figura 52 b), corresponde al


valor de la resistencia del electrolito (Re) en cada disolución. A medida que va

disminuyendo la frecuencia, desde 102 a 10–2 Hz (Figura 52 a y c), se obtiene una recta

de pendiente –0,9 con valores del ángulo de fase de –90˚ en el mismo intervalo de

frecuencias (Figura 52 b y d). Los valores de ángulo cercanos a –90˚ indican, que la

interfase electrolito/P-TiO2 tiene un comportamiento capacitivo debido, a la capa

oxidada protectora y resistente generada a 277˚C.

La pendiente de –0,9 se puede atribuir a la respuesta eléctrica de un

condensador en paralelo con una resistencia, según se muestra en el circuito eléctrico

equivalente de la Figura 52 e; es decir, el sistema está controlado por una única

constante de tiempo, o lo que es lo mismo, un solo proceso. Finalmente, en la región

de frecuencias más bajas, entre 10–2 y 10–3 Hz, aunque no se aprecian diferencias en

el diagrama de Bode del módulo de impedancia, se observa que el ángulo (Figura 52 b

y d) evoluciona desde –60° del primer día, hasta los cerca de –90° del séptimo: en

lugar de definir una resistencia hacia ángulos de fase cercanos a 0, a medida que

aumenta el tiempo de inmersión, evoluciona hacia un comportamiento capacitivo

más protector. La conducta descrita es, por tanto, similar para el Ti-TT en presencia de

iones fosfato (disolución P) y de iones fosfato y calcio (disolución PCa).

Para ajustar los resultados experimentales de EIS se utilizó el circuito eléctrico

equivalente de la Figura 52 e, donde Re es la resistencia del electrolito medida entre

el electrodo de referencia y el electrodo de trabajo, R1 y CPE1 son la resistencia y la

pseudocapacidad asociadas a la interfase electrolito/TiO2-Ti.

En primera instancia, el comportamiento que se observa para el Ti-TT cuando

se sumerge en la disolución que contiene glucosa (PCaG) (Figura 53), parecería similar

al descrito para las disoluciones de iones fosfato (P) y de iones fosfato y calcio (PCa).

Sin embargo, en este caso, a las frecuencias más bajas entre 10–2 y 10–3 Hz, el ángulo

varía de -70° a aproximadamente -90° (Figura 53 b), y el valor de la impedancia

alcanzado a bajas frecuencias (Z = 1·107 Hz) (Figura 53 a) es menor que en los casos de


las disoluciones de fosfato (P) y fosfato y calcio (PCa) (Figura 52). Además, la

pendiente de la recta obtenida a frecuencias intermedias en el diagrama del módulo

de impedancia es de -0,96.

Figura 53. Diagrama de Bode para el Ti-TT sumergido, durante 7 días, en la disolución de NaH2PO4 + CaCl2 + glucosa (a) módulo de impedancia, y (b) ángulo de fase vs la frecuencia. Los símbolos son los resultados experimentales y (―) son los ajustes con el circuito eléctrico equivalente (c).

Para ajustar los resultados de impedancia, se utilizó el circuito eléctrico

equivalente de la Figura 53 c. Éste refleja la superficie de titanio oxidada (Ti-TT)

recubierta parcialmente por glucosa adsorbida, en los siete días de ensayo, en

presencia de iones fosfatos y de iones Ca2+. Re es la resistencia del electrolito; R2 y

CPE2 son la resistencia y la pseudocapacidad asociadas a la interfase

electrolito/glucosa; y R1 y CPE1 son la resistencia y la pseudocapacidad de la interfase

electrolito/TiO2-Ti, representando lasuperficie de Ti-TT libre.


Figura 54. Diagrama de Bode para el Ti-TT sumergido, durante 7 días, en la disolución de BSA (a) módulo de impedancia, y (b) ángulo de fase vs la frecuencia; y en la disolución de FBS (c) módulo de impedancia y (d) ángulo de fase vs la frecuencia. Los símbolos son los resultados experimentales y (―) son los ajustes con el circuito eléctrico equivalente (e).

En la Figura 54, se muestran los diagramas de Bode para el Ti-TT sumergido en

las disoluciones de BSA (Figura 54 a y b) y FBS (Figura 54 c y d), así como el circuito

eléctrico equivalente (Figura 54 e) utilizado para ajustar los resultados experimentales

de impedancia obtenidos en ambas disoluciones. En presencia de albúmina, a


frecuencias intermedias, entre 102 y 10–2 Hz, el módulo de impedancia aumenta

linealmente, con una pendiente de -0,97; esta respuesta es asignada a un

pseudocondensador en paralelo con la resistencia de la interfase externa (Figura 54

e). Finalmente, en esta misma disolución, a las frecuencias más bajas, entre 10-2 y 10-3

Hz, se observa un cambio de pendiente cuyo valor es -0,71, en el módulo de

impedancia, para todos los tiempos de ensayo; este hecho se corresponde con una

disminución en el ángulo de fase () hasta -20° aproximadamente (Figura 54 b). En

este caso, los diagramas de impedancia en la región de bajas frecuencias no

evolucionan con el tiempo hacia un comportamiento capacitivo más protector, sino

que se mantiene desde el primer día de ensayo, en los mismos valores de impedancia

y ángulo de fase, intentando definir una resistencia. Esto indica que la albúmina se

adsorbe sobre el Ti-TT en los primeros instantes de la inmersión, alcanzándose un

recubrimiento prácticamente completo de la superficie, sin modificación a lo largo del

tiempo de ensayo, como muestran los resultados de XPS. Teniendo esto en cuenta,

los resultados experimentales se han ajustado con dos constantes de tiempo (Figura

54 e). La primera de ellas ( = CPE2·R2) se asocia con la interfase externa

electrolito/proteínas-TiO2 y la segunda ( = CPE1·R1) está asociada a la respuesta de la

interfase proteínas/TiO2-Ti. El mismo efecto se obtiene para el FBS (Figura 54 c y d)

pero el cambio de pendiente, en el módulo de impedancia se da a frecuencias más

altas (entre 0,04 y 10-3 Hz) que para la BSA y; por consiguiente, el ángulo también

disminuye a dicha frecuencia.

En la Tabla 23, se muestran los ajustes de los resultados experimentales a los

circuitos eléctricos equivalentes del Ti-TT sumergido, durante 7 días, en las

disoluciones de fosfato (P), fosfato y calcio (PCa) y glucosa (PCaG). Si consideramos los

resultados obtenidos con los ajustes de las medidas de impedancia para el Ti-TT/P

(Tabla 23), se observa que la resistencia del electrolito (Re), así como la capacidad

(CPE1) y la resistencia (R1) asociadas con la interfase formada por la superficie de

titanio oxidada (TiO2) en contacto con la disolución de fosfato, permanecen estables,


a lo largo de los 7 días de ensayo, con valores similares a los obtenidos por otros

autores [141, 142].

Cuando la disolución utilizada es de fosfato y calcio (PCa), no se observan

grandes variaciones en los resultados de capacidad a lo largo de los 7 días de ensayo.

Sin embargo, el valor de R1 aumenta en un orden de magnitud comparando el primer

y el último día de ensayo (Tabla 23). Dicho aumento se puede asociar a la adsorción

de los iones calcio y fosfato a la superficie del Ti-TT. El efecto de la adición de calcio a

la disolución de fosfato se refleja en valores de CPE1 más bajos que para las muestras

Ti-TT/P, lo que lleva asociadas unas resistencias más altas a los tiempos de ensayo

más largos. Es decir, no sólo interaccionan los iones fosfato con la capa de óxido, sino

también los iones Ca2+, que debido a su efecto puente entre los iones fosfato de carga

negativa y los grupos OH- existentes sobre el Ti-TT, dan lugar a una capa más

resistente frente a la corrosión. El cambio en la capacidad de la doble capa más

externa puede ser un indicador del cambio en el espesor de dicha capa. El inverso de

la capacidad es directamente proporcional al espesor de la capa porosa. Por tanto, la

disminución en la capacidad es consistente con un aumento en el espesor de dicha

capa debido a la interacción con el electrolito.

En presencia de glucosa (disolución de PCaG), el circuito eléctrico equivalente

propuesto para el ajuste de los resultados de EIS cambia con respecto al utilizado en

el caso de las disoluciones de fosfato (P) y de fosfato y calcio (PCa) (Figura 52 e). CPE2

es la capacidad debida a la adsorción de glucosa sobre la superficie del Ti-TT. Los

valores de CPE2 se mantienen prácticamente constantes a lo largo del tiempo (Tabla

23), indicando que la adsorción de la glucosa a la superficie del Ti-TT es rápida. Los

valores de R2, asociados a la formación de esta capa, aumentan ligeramente a lo largo

del tiempo de inmersión, lo que quiere decir que la glucosa se reorganiza sobre la

superficie de Ti-TT aumentando su resistencia. A su vez, como observamos en la Tabla

23, el valor de R1 asociada a la interfase electrolito/TiO2-Ti aumenta con el tiempo de

exposición. En este caso, tanto los iones fosfato como los iones calcio pueden ser

incorporados a la superficie libre de Ti-TT aumentando su resistencia.


Tabla 23. Ajustes de los resultados experimentales de EIS para el Ti-TT, sumergido, durante 7 días, en las disoluciones de NaH2PO4 (P), NaH2PO4 + CaCl2 (PCa) y NaH2PO4 + CaCl2 + glucosa (PCaG).

2

9,3

·10

-3

8,7

·10

-3

8,9

·10

-3

1,3

·10

-2

1,4

·10

-2

1,5

·10

-2

1,4

·10

-2

1,5

·10

-2

1,5

·10

-2

2,0

·10

-2

1,1

·10

-2

1,8

·10

-2

2,1

·10

-2

1,1

·10

-3

1,5

·10

-3

1,9

·10

-3

1,9

·10

-3

1,8

·10

-3

1,2

·10

-3

1,1

·10

-3

n1

0,9

6

0,9

5

0,9

6

0,9

6

0,9

7

0,9

6

0,9

6

0,9

6

0,9

6

0,9

7

0,9

7

0,9

7

0,9

7

0,9

3

0,9

4

0,9

4

0,9

4

0,9

4

0,9

4

0,9

4

% E

rro

r

(CP

E1)

1,0

0,9

0,9

0,9

1,0

1,0

0,8

0,9

0,9

0,8

0,7

1,1

1,2

7,6

10

,0

11

,0

11

,4

14

,4

10

,2

10

,2

CP

E1

Fc

m-2

s-(

1-n

)

9,4

8

9,5

3

9,4

9

9,1

1

8,9

2

9,2

0

6,7

2

7,2

4

7,0

4

7,1

0

7,2

8

7,2

9

7,2

7

3,7

3

3,6

2

3,5

2

3,6

4

3,3

7

3,2

4

3,2

7

% E

rro

r

(R1

)

11

,6

19

,1

16

,1

19

,9

20

,2

19

,8

18

,1

24

,9

22

,1

19

,7

19

,3

15

,2

17

,4

5,9

5,8

13

,1

5,1

5,3

25

,8

22

,6

R1

cm

2

1,8

·10

8

5,5

·10

7

3,0

·10

7

9,7

·10

7

1,9

·10

8

1,4

·10

8

4,5

·10

7

3,8

·10

7

1,1

·10

8

1,9

·10

8

9,2

·10

7

2,6

·10

8

4,9

·10

8

7,3

·10

7

6,1

·10

7

1,3

·10

8

4,6

·10

7

5,0

·10

7

3,5

·10

8

3,1

·10

8

n2

- - - - - - - - - - - - -

0,9

7

1,0

0

1,0

0

1,0

0

0,9

9

1,0

0

1,0

0

% E

rro

r

(CP

E2)

- - - - - - - - - - - - - 6,5

8,1

8,8

9,2

9,9

6,8

7,1

CP

E2

Fc

m-2

s-(

1-n

)

- - - - - - - - - - - - -

4,5

0

4,6

1

4,5

4

4,5

8

5,0

5

4,9

5

5,0

2

% E

rro

r

(R2

)

- - - - - - - - - - - - -

11

,5

13

,3

14

,0

14

,9

16

,0

11

,5

11

,7

R2

cm

2

- - - - - - - - - - - - -

14

8,6

15

5,8

16

1,1

16

0,5

16

5,9

18

8,2

19

8,2

Re

14

1,9

14

0,7

14

0,3

13

9,8

14

0,6

14

1,4

10

4,4

12

2,7

11

5,9

12

7,9

12

8,2

12

4,6

12

5,8

99

,2

10

5,4

10

6,9

10

5,0

10

6,7

11

2,8

11

9,3

t día s 1

2

4

5

6

7

1

2

3

4

5

6

7

1

2

3

4

5

6

7

Sup

er-

fici

e

Ti-T

T/P

Ti-T

T/

PC

a

Ti-T

T/

PC

aG


Tabla 24. Ajustes de los resultados experimentales de EIS para el Ti-TT sumergido, durante 7 días, en las disoluciones de BSA y FBS.

2

5,1

·10

-4

2,3

·10

-4

2,1

·10

-4

2,2

·10

-4

2,4

·10

-4

2,2

·10

-4

2,1

·10

-4

1,3

·10

-3

2,3

·10

-3

2,3

·10

-3

2,7

·10

-3

2,9

·10

-3

2,6

·10

-3

2,3

·10

-3

n1

0,9

7

0,9

7

0,9

7

0,9

7

0,9

7

0,9

7

0,9

7

0,9

3

0,9

6

0,9

6

0,9

6

0,9

6

0,9

5

0,9

5

% E

rro

r

(CP

E1)

7,5

0,5

0,4

0,4

0,4

0,7

0,7

10

,6

29

,6

34

,0

23

,9

14

,4

11

,9

9,8

CP

E1

Fc

m-2

s-(

1-n

)

9,8

4

9,3

5

9,1

5

9,0

0

9,0

1

9,0

7

9,0

5

55

,36

34

,59

38

,73

29

,91

22

,00

21

,40

20

,51

% E

rro

r

(R1

)

7,6

1,4

1,2

1,1

1,1

1,7

1,8

10

,6

29

,3

34

,0

23

,9

14

,4

11

,9

9,8

R1

cm

2

4,2

·10

6

3,9

·10

6

3,9

·10

6

3,9

·10

6

3,9

·10

6

3,8

·10

6

3,8

·10

6

2,4

·10

6

2,4

·10

6

2,3

·10

6

2,7

·10

6

3,4

·10

6

3,2

·10

6

3,1

·10

6

n2

0,9

9

1,0

0

1,0

0

1,0

0

1,0

0

1,0

0

1,0

0

0,9

8

0,9

7

0,9

7

0,9

7

0,9

8

0,9

8

0,9

8

% E

rro

r

(CP

E2)

88

,4

5,4

5,0

5,1

5,4

8,8

9,2

2,4

11

,9

12

,0

11

,9

11

,4

10

,1

9,0

CP

E2

Fc

m-2

s-(

1-n

)

11

8,2

1

96

,83

11

1,9

1

12

3,9

0

12

3,6

8

11

3,0

5

11

2,0

6

12

,25

13

,61

13

,26

14

,46

16

,91

17

,64

18

,33

% E

rro

r

(R2

)

30

,3

2,8

3,5

4,3

4,3

7,6

6,8

3,6

16

,2

16

,2

16

,6

16

,8

15

,2

13

,9

R2

cm

2

3,4

·10

6

2,5

·10

6

2,5

·10

6

2,4

·10

6

2,4

·10

6

2,2

·10

6

2,1

·10

6

1,3

·10

6

9,2

·10

5

9,7

·10

5

8,0

·10

5

5,9

·10

5

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·10

5

4,8

·10

5

Re

93

,7

89

,1

88

,0

88

,6

88

,2

86

,2

85

,0

97

,1

96

,6

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,8

96

,3

95

,1

94

,0

92

,7

t

día

s

1

2

3

4

5

6

7

1

2

3

4

5

6

7

Sup

er-

fici

e

Ti-T

T/

BSA

Ti-T

T/

FBS


Cuando el Ti-TT se sumerge en la disolución de BSA, el circuito eléctrico

equivalente que en principio mejor simularía el comportamiento de los resultados

experimentales de impedancia es el que se muestra en la Figura 54 e. Re es la

resistencia del electrolito, CPE2 y R2 son la capacidad y la resistencia debida a la

interfase externa electrolito/BSA-TiO2 y CPE1 y R1 son la capacidad y la resistencia

asociadas a la interfase interna proteínas/TiO2-Ti. El primer resultado que llama la

atención es el valor de R2 del orden de 106cm2. Dicho valor no corresponde a la

resistencia de una interfase electrolito/BSA, más bien parece tener una cierta

contribución del óxido TiO2. Por otra parte, la resistencia R1 de la interfase interna

BSA/TiO2-Ti es del mismo orden de magnitud que para R2. Por tanto, aunque dos

circuitos RC en serie parecerían ser la mejor opción para ajustar los resultados de EIS

para el Ti-TT inmerso en BSA, los resultados obtenidos del ajuste no parecen tener

sentido físico. En consecuencia, se utilizó un circuito simplificado donde Re es la

resistencia del electrolito, y CPE1 y R1 son la capacidad y la resistencia de la interfase

electrolito/proteína-TiO2 (los resultados se muestran en la Tabla 25). En este caso, el

valor de CPE1 presenta valores de 8-9 µFcm-2s-(1-n), obteniéndose valores similares

para el primer y último día de ensayo. Los valores de CPE1 asociados a la BSA son el

doble de los obtenidos para el Ti-TT en la disolución que contiene glucosa. Esto es

debido, probablemente, a que la BSA es una proteína altamente polar que incrementa

la constante dieléctrica de la disolución cuando se disuelve en agua (comportamiento

atípico). Puesto que la capacidad y la constante dieléctrica son proporcionales, es

lógico que se obtengan valores de capacidad mayores para la disolución de BSA que

para la disolución que contiene glucosa. Asimismo, el valor de la R1 es muy elevado (≈

106 cm2) si la comparamos con la resistencia asociada a la interfase glucosa/TiO2 (≈

150 cm2), lo que induce a pensar que existe una contribución de la capa de TiO2.

Además, esta resistencia disminuye con el tiempo de inmersión en BSA. No hay que

olvidar el efecto quelante de la albúmina que puede hacer disminuir la resistencia del

óxido de Ti, resultado que ya observamos en las mayores densidades de corriente


anódicas, en las curvas de polarización obtenidas para las muestras sumergidas en

BSA (Figura 50 b).

Tabla 25. Ajustes de los resultados experimentales de EIS para el Ti-TT sumergido, durante 7 días, en las disoluciones de BSA y FBS.

Super-

ficie

t

días

Re

R1

cm2

% Error

(R1)

CPE1

Fcm-2s-(1-n)

% Error

(CPE1) n1

2

Ti-TT /

BSA

1 93,5 5,3·106 1,4 9,24 0,5 0,97 5,3·10-4

2 88,9 5,1·106 1,4 8,68 0,5 0,97 5,1·10-4

3 87,7 4,9·106 1,3 8,61 0,5 0,97 5,0·10-4

4 88,4 4,9·106 1,3 8,52 0,5 0,97 4,7·10-4

5 87,9 4,8·106 1,3 8,53 0,5 0,97 4,7·10-4

6 86,0 4,7·106 1,0 8,51 0,4 0,97 2,3·10-4

7 84,8 4,7·106 1,0 8,47 0,3 0,97 2,2·10-4

Ti-TT /

FBS

1 97,1 2,2·106 2,8 10,46 1,3 0,96 2,4·10-3

2 96,6 2,6·106 3,3 10,49 1,5 0,95 3,5·10-3

3 95,8 2,5·106 3,3 10,59 1,6 0,95 3,5·10-3

4 96,3 2,8·106 3,5 10,54 1,6 0,95 3,7·10-3

5 95,1 3,3·106 3,8 10,47 1,6 0,95 3,8·10-3

6 94,0 3,1·106 3,6 10,59 1,6 0,95 3,6·10-3

7 92,7 3,0·106 3,6 10,61 1,5 0,95 3,5·10-3

Finalmente, cuando las muestras de Ti-TT se sumergen en la disolución de FBS,

el circuito eléctrico equivalente utilizado para ajustar estos resultados es el mismo

que para la disolución de BSA. En este caso, los valores de R1 son también muy

elevados, aunque prácticamente la mitad que en el caso de la disolución de BSA; esto

es debido a la mayor competencia que existe entre la BSA y el resto de los

componentes del FBS por adsorberse a la superficie. CPE1 se mantiene constante con

el tiempo de ensayo, indicando que la adsorción de los componentes del FBS se

produce en los primeros momentos. Efectivamente, si R1 tiene cierta contribución de

la capa oxidada presente sobre la superficie de Ti-TT, el ligero aumento que se

observa para los valores de R1 con el tiempo de ensayo indicaría que la capa de óxido


crece paulatinamente. No obstante, estos valores de R1 en presencia de BSA son

mayores que para la disolución de FBS debido a la existencia de otros componentes

en el FBS que aumentan la corrosión del Ti-TT.

Trasformadas de Kramers-Kronig (K-K)

Una vez analizados los diagramas de impedancia obtenidos para el Ti-TT

tratado con cada uno de los componentes del DMEMc y ajustados a los circuitos

eléctricos equivalentes, se procedió a calcular las transformadas de Kramers-Kronig

[100], con el objetivo de evaluar la fiabilidad de los resultados experimentales

obtenidos.

En las Figura 55 y 56 se muestran los diagramas donde se representan los

resultados experimentales, así como los calculados a partir de las transformadas de K-

K, para el Ti-TT sumergido, durante 7 días, en las disoluciones de: P, PCa y PCaG, y BSA

y FBS, respectivamente. Además, se han calculado los errores medios comparando los

resultados obtenidos de las transformadas de K-K con los resultados experimentales

utilizando la ecuación (9) (Tabla 26):

∑ | |

(9)

donde N es el número de puntos, Zex es el valor de la impedancia experimental, ZKK es

el valor de la impedancia obtenido por medio de los K-K y Zmax el valor máximo de la

impedancia.

Por regla general, la consistencia de los resultados experimentales es

excelente.


Figura 55. Resultados experimentales (O) correspondientes al Ti-TT sumergido, durante 7 días, en (a) NaH2PO4 (P), (b) NaH2PO4 + CaCl2 (PCa) y (c) NaH2PO4 + CaCl2 + glucosa (PCaG) y resultados obtenidos utilizando las relaciones de Kramers-Kronig (K-K)(+).


Figura 56. Resultados experimentales (O) correspondientes al Ti-TT sumergido, durante 7 días, en (a) BSA y (b) FBS y resultados obtenidos utilizando las relaciones de Kramers-Kronig (K-K)(+).

En la Tabla 26 se muestran los errores medios calculados de las

representaciones de K-K con respecto a los resultados experimentales para el Ti-TT en

las disoluciones de P, PCa, PCaG, BSA y FBS.

Como se ha comentado anteriormente, Dougherty y Smedley [124] consideran

que la fiabilidad de los resultados obtenidos de las medidas de impedancia es buena o

aceptable cuando el error medio, tanto de la componente Real como de la Imaginaria,

se encuentra por debajo del 3%. En la Tabla 26 vemos que el error medio obtenido

para cada una de las transformadas de K-K no supera el 0,9%; por tanto, los

resultados experimentales satisfacen las transformadas de K-K [143-145].


Tabla 26. Errores medios calculados, ec. (9), de las representaciones de Kramers-Kronig (K-K) con respecto a los resultados obtenidos experimentalmente para el Ti-TT sumergido, durante 7 días, en las disoluciones de NaH2PO4 (P), NaH2PO4 + CaCl2 (PCa), NaH2PO4 + CaCl2 + glucosa (PCaG), BSA y FBS.

Error medio (%)

Disoluciones Componente real (Z´) Componente imaginaria (Z´´)

P 0,878 0,021

PCa 0,598 0,086

PCaG 0,599 0,150

BSA 0,246 0,259

FBS 0,414 0,679

4.3.4 Discusión

Cuando una superficie de Ti recién pulida se pone en contacto con la

atmósfera, se forma espontáneamente una capa pasiva de TiO2 [33], como ha quedado

reflejado en los análisis de XPS para el titanio másico (Ti-m) (Tabla 19). El buen

comportamiento frente a la corrosión tanto “in vitro” como “in vivo” de esta capa

pasiva de óxido de titanio, ha propiciado que existan numerosos estudios acerca de

los diferentes métodos para aumentar el espesor de la capa y aumentar así su

estabilidad en contacto con los medios fisiológicos. El tratamiento térmico a 277˚C

durante 5 h, aumenta ligeramente el espesor de esta capa de TiO2 [30] según la

estimación mediante EIS, en 10 nm con respecto al Ti sin tratamiento térmico. Este

aumento de espesor, quedó reflejado en el aumento del % atómico de la banda

correspondiente al TiO2 de los espectros de O1s y Ti2p, en los análisis de XPS (Tabla

19), así como a partir de las medidas de capacidad. Según Hwang y col. [28] cuando el

titanio se trata a temperaturas inferiores a 600°C se obtienen capas de TiO2 amorfas y

de tipo anatasa que favorecen la precipitación de depósitos Ca-P.

Asimismo, el tratamiento térmico promueve una modificación en la topografía

de la superficie que, aunque no afecta a la rugosidad media medida (RMS) (Tabla 18),

sí resulta apreciable en las imágenes obtenidas mediante el AFM (Figura 44 y 45). En


las aplicaciones biomédicas, la modificación superficial llevada a cabo sobre los

implantes se focaliza en la nanoestructuración de la superficie [83, 146-148], ya que la

existencia de cierta nanorugosidad en la superficie favorece el anclaje y/o la adhesión

de las células osteoblásticas.

Cuando el Ti-TT se sumerge en la disolución que contiene fosfatos, la lectura

del potencial de corrosión durante los 7 días de ensayo evoluciona hacia valores

anódicos (Figura 49). Teniendo en cuenta que el potencial de corrosión nos suministra

información acerca de la espontaneidad de la reacción de corrosión, su aumento nos

indica que el material disminuye su tendencia a corroerse, es decir, se ennoblece, o lo

que es lo mismo, la capa de óxido que recubre la superficie se va haciendo menos

activa [149]. Según Ouerd y col. [56], cuando el Ti se sumerge en una disolución de

fosfatos, se producen interacciones entre los grupos -OH2+ de la superficie del Ti y los

fosfatos de la disolución que se traduce en un aumento del Ecorr.

La excelente estabilidad de la capa de óxido formada sobre la superficie de Ti

en este medio queda reflejada en las curvas de polarización obtenidas a los 7 días de

inmersión. Centrándonos en la rama anódica, se observa que, a pesar de aumentar la

polarización, la densidad de corriente permanece prácticamente constante. Este es un

comportamiento típico de materiales pasivos, muy resistentes a la formación de

picaduras, como es el caso del Ti. Prueba de ello es que la pendiente de Tafel anódica

es mayor que la catódica (Tabla 22), indicando que es el proceso anódico, es decir, la

presencia de esta capa de óxido, el que controla el sistema. La gran estabilidad de la

superficie, también quedó reflejada en los valores de capacidad y resistencia

asociados con la interfase electrolito/TiO2-Ti, que se mantienen prácticamente

constantes a lo largo de los 7 días (Tabla 23), indicando que se trata de un sistema

estable debido al control anódico que ejerce la capa de TiO2. La incorporación de P en

la capa de óxido se observó a través de los espectros de XPS después de 7 días de

inmersión (Tabla 20). Así, el % atómico del pico del O1s asignado al enlace Ti-OH para

el Ti-TT, aumenta para el Ti-TT después del tratamiento con la disolución de fosfatos.


Dicho pico podría tener una contribución del enlace P=O-, cuya energía de ligadura es

similar (531,3 eV). Como el porcentaje atómico del fósforo en esta muestra es solo del

1,5% (Tabla 21), dicha contribución no sería muy significativa. Sin embargo,

basándonos en los resultados de Helsen y Healy [36, 38], es más probable que al ponerse

en contacto el Ti-TT con una disolución acuosa, en este caso de fosfatos, se haya

formado mayor número de grupos Ti-OH.

La presencia de Ca2+ en las disoluciones fisiológicas juega un papel importante

en la interacción del medio con las superficies de los implantes de Ti. Como ocurría

con la disolución de fosfatos, el potencial de corrosión de las muestras de Ti-TT

aumenta a medida que aumenta el tiempo de inmersión: la superficie se ennoblece

con el tiempo. La presencia de los iones Ca2+ favorece la atracción de los iones fosfato

hacia la superficie de Ti-TT, que está cargada negativamente [38, 128]. Los grupos Ti-OH

ácidos (Ti-O-) del Ti-TT interaccionan con los iones Ca2+ [123] para formar una capa de

titanato de calcio. Esta capa facilita la incorporación de los iones fosfato a la superficie

que, con el tiempo, forman los núcleos de hidroxiapatita [32]. La incorporación de los

iones Ca2+a la superficie se pone de manifiesto en la disminución de la corriente

catódica [119] (Figura 50) y en el aumento de un orden de magnitud que se obtiene en

el valor de la resistencia asociada con la interfase electrolito/TiO2-Ti al cabo de 7 días

(Tabla 23). Este aumento puede corresponder, además de a la adsorción de calcio

sobre la superficie de Ti-TT, por medio de los grupos hidroxilo ácidos (Ti-O-), a la

adsorción de los iones fosfato por medio de los grupos hidroxilo básicos (Ti-OH2+) [38,

123] o a la formación de CaHPO4 [139], como muestran los espectros de XPS (Tabla 20).

Como se puede observar por los resultados obtenidos, la presencia de iones fosfato y

calcio en el medio fisiológico modifica, aunque sea lentamente, la composición

química de la superficie de Ti-TT. Teniendo en cuenta que estos dos iones están

directamente implicados en la formación de la hidroxiapatita que compone el hueso,

es evidente que su interacción con las superficies metálicas, con el resultado final de


formar fosfatos de calcio de estequiometria similar a la del hueso, es muy favorable

para conseguir una superficie que sea biocompatible con el entorno fisiológico.

Otros iones inorgánicos con porcentajes importantes en el medio fisiológico

son los cloruros. En general, estos iones despasivan los materiales metálicos mediante

la formación de picaduras, con la consiguiente liberación de iones metálicos al medio

circundante; como consecuencia provocan la acumulación en los alrededores del

implante o incluso en órganos alejados de la localización del mismo.

Afortunadamente, la superficie de los materiales metálicos de base Ti están

recubiertas por una capa de óxido de titanio que es resistente a la acción de estos

iones.

La gran complejidad del medio fisiológico reside, no sólo en el alto contenido

de sales inorgánicas, sino en la presencia de un gran número de compuestos

orgánicos cuya interacción con las superficies metálicas difiere de la encontrada para

los iones inorgánicos. La interacción con la superficie de estas moléculas más grandes

puede venir dada por la adsorción de las mismas mediante enlaces físicos o químicos,

o bien pueden formar complejos con los iones metálicos de la superficie, dando lugar

a la disolución del metal.

Cuando las muestras de Ti-TT se sumergen en una disolución que, además de

iones Ca2+ y PO43-, contiene glucosa, el aumento del potencial de corrosión a lo largo

de los 7 días de ensayo indica que sigue la misma tendencia que con las que contenían

fosfatos y calcio; es decir, la superficie se ennoblece. Sin embargo, el efecto de la

glucosa sobre la superficie de las muestras parece ser diferente a los otros dos iones.

De la misma manera que para las disoluciones anteriores, el sistema está

controlado anódicamente; por tanto, es la capa de TiO2 la que impide o retarda la

corrosión. En presencia de glucosa, la densidad de corriente catódica para el Ti-TT es

menor que en la disolución de fosfatos y mayor que en la disolución de NaH2PO4 +


CaCl2 (Figura 50), por lo tanto, la reacción de reducción de oxígeno está menos

impedida en presencia que en ausencia de glucosa. Este hecho, se ve corroborado por

el valor de la pendiente de Tafel catódica (PCaG/0,160 V), que es ligeramente menor

que en ausencia de glucosa (PCa/0,187 V) (Tabla 22). Por otra parte, el espectro de

XPS (Figura 47) muestra que existe aproximadamente la mitad de la superficie del Ti-

TT libre de glucosa, además de estar presentes los iones calcio y fosfato. En

concordancia, los resultados de impedancia (que se han ajustado a un circuito que

refleja un recubrimiento parcial de glucosa) muestran que la resistencia asociada a la

interfase electrolito/TiO2-Ti aumenta con el tiempo de inmersión (Tabla 23)

posiblemente debido a la incorporación de los iones fosfato y calcio a la superficie del

óxido libre de glucosa.

La adsorción de la albúmina sobre el Ti-TT sumergidos en las disoluciones de

BSA y FBS es muy rápida [150], manteniéndose estable a lo largo del tiempo, lo que

bloquea la posible interacción con otros componentes de la disolución [59]. Es por esto

que el potencial de corrosión para ambos casos se mantiene constante durante los 7

días de ensayo (Figura 49). Además, en presencia de proteínas, los valores de las

pendientes anódicas son superiores a los de las pendientes catódicas (Tabla 22). Estos

resultados concuerdan con los obtenidos por Williams y col. [150] y por tanto el

proceso, de nuevo, está controlado anódicamente, debido por un lado, a la capa de

óxido superficial, y por otro a la capa de biomoléculas adsorbidas a la superficie [151].

Ahora bien, no hay que olvidar que las proteínas pueden acelerar la disolución de los

metales por sus efectos quelantes [121, 122], acelerar la reacción anódica y disminuir la

densidad de corriente catódica con respecto a las disoluciones que no contienen

proteínas [117]. Esta disminución, es debida, según Cheng y Roscoe [119], a que las

moléculas de BSA adsorbidas cubren los sitios de reacción y/o bloquean el transporte

hacia la superficie de Ti del oxígeno disuelto en el electrolito. En la disolución de FBS

hay más competencia entre la albúmina y el resto de componentes por adsorberse o

interactuar con la superficie, y por consiguiente, habrá menor cantidad de albúmina


adsorbida que en el caso de la BSA. Esto justifica la ligera diferencia de densidad de

corriente anódica registrada para ambos casos (iFBS < iBSA) (Figura 50).

Centrándonos en los resultados obtenidos para las muestras sumergidas en la

disolución de BSA, los valores de la resistencia, son iguales para el primer y el último

día de ensayo, debido a que la adsorción de albúmina es muy rápida e impide que

tanto el fosfato como el calcio se adsorban a la superficie inmediatamente: siendo a

tiempos más largos de inmersión cuando estos iones podrían desplazar las moléculas

de albúmina, adsorberse y formar depósitos de CaP [116].

Es importante destacar, que las atracciones electrostáticas, entre la superficie

del Ti-TT y los diferentes iones presentes en el electrolito podrían ser las responsables

de la adsorción de la albúmina. En medio ácido la BSA tiene carga positiva, debido a

que los grupos amino (-NH2) se convierten en –NH3+. Sin embargo, en medios básicos

los grupos carboxílicos pierden un H+ convirtiéndose en –COO-, lo que contribuye a

que la proteína esté cargada negativamente. A pH fisiológico (pH = 7,4) la albúmina

está cargada negativamente, debido a que su punto isoeléctrico es de pI= 4,7-4,9 y a

que tiene además muchos sitios de unión para el Ca2+: la incorporación de los iones de

calcio a la molécula de albúmina puede favorecer la atracción de la misma hacia la

superficie que está cargada negativamente (Ti-O-) [128]. De este modo, el Ca2+ actuaría

como puente entre la albúmina y la superficie de Ti-TT [55, 123]. Los iones de calcio

deberían aumentar la adsorción de albúmina sobre la superficie del Ti, mientras que

los iones fosfato deberían disminuirla. La ausencia de fósforo así como de calcio en la

superficie de Ti-TT/BSA se puede explicar, según indican las medidas de XPS, por la

posible competencia entre los grupos carboxilo de la albúmina y los iones fosfato por

intercambiarse con los grupos hidroxilo básicos presentes en la superficie [54, 55, 117]. Sin

embargo, en presencia de iones Ca2+ la adsorción de la albúmina está favorecida, por

tanto, es la capa de proteínas (BSA) la que no permite su detección.


Finalmente, intentando simular el suero fisiológico completo, los resultados

obtenidos para el comportamiento de las muestras de Ti-TT sumergidas en la

disolución de FBS, parecen indicar que la capa de biomoléculas adsorbida es más

heterogénea que en el caso de las muestras sumergidas en la disolución de BSA. A

pesar de que la evolución del potencial de corrosión con el tiempo, refleja un

comportamiento idéntico al de la disolución con albúmina (Figura 49), (indicando que

la presencia de la albúmina es determinante en la tendencia frente a la corrosión del

sistema), tanto las curvas de polarización, como la impedancia y XPS no fueron

capaces de evidenciar diferencias entre las dos disoluciones (BSA y FBS). Por ejemplo,

los valores de la resistencia para las muestras sumergidas en FBS son algo más bajos

que para la disolución de BSA (Tabla 25). Por otro lado, en el caso del FBS, el valor de

la resistencia aumenta ligeramente, a la vez que la capacidad se mantiene constante

con el tiempo de inmersión, lo que indicaría, según Contu y col. [48], que el oxígeno

sería capaz de llegar a la superficie de las muestras haciendo crecer ligeramente el

óxido superficial. Sin embargo, los fenómenos de corrosión provocados por los

componentes del FBS hacen que se encuentre en equilibrio tanto la formación de la

capa de TiO2 como la destrucción de la misma. Además, nuestros resultados reflejan

que cuando sólo tenemos albúmina en la disolución los valores de resistencia y

capacidad permanecen constantes a lo largo del tiempo, por lo que no se favorece la

difusión a través de la capa de albúmina adsorbida, sino todo lo contrario. De alguna

manera, la presencia de otras proteínas (en menor proporción, iones y vitaminas

presentes en el FBS) impiden la adsorción completa de la albúmina sobre la superficie

(sistema dinámico) permitiendo una leve difusión del oxígeno a través de estos

puntos libres. Esta competencia de interacción con la superficie se comprobó

mediante XPS a través del cual pudimos detectar tanto fósforo como calcio sobre su

superficie (Tabla 20).


4.4 Estudio de la interfase Ti-TT/Osteoblastos Saos-2

Como ya se ha mencionado anteriormente (Capítulo 4.2) la etapa fundamental

para que tenga éxito un implante metálico es aquella donde se produce el contacto

con las células osteoblásticas. No todos los acabados superficiales de los materiales de

base Ti son adecuados para la osteointegración del biomaterial en el hueso. Es por

esto necesario hacer la superficie lo más apetecible posible para los osteoblastos. En

este capítulo se van a estudiar las interacciones que tienen lugar entre el acabado

denominado Ti-TT (descrito en el capítulo 4.3) y los osteoblastos humanos Saos-2.

4.4.1 Curva de crecimiento de Osteoblastos Saos-2

En la Figura 57 aparece la curva de crecimiento de osteoblastos de

osteosarcoma humano Saos-2 para una concentración celular inicial de 2,5·104

osteoblastos/ml (1,5·104 osteoblastos/cm2) sobre una placa de poliestireno utilizada

como control y sobre las superficies de Ti-m y Ti-TT. Estas curvas nos proporcionan

información sobre la predisposición y velocidad con la que proliferan los osteoblastos

sobre dichas superficies.

Figura 57. Curva de crecimiento (a) y diagrama de barras (b) de los osteoblastos Saos-2 en placa de (●) plástico, (▲) Ti-m y (■) Ti-TT.

180 4.4 Estudio de la interfase Ti-TT/Osteoblastos Saos-2

En la Figura 57 podemos observar cómo partiendo en todos los casos de la

misma concentración celular, al cabo de 7 días, el valor máximo de osteoblastos

obtenido para el crecimiento en la placa de poliestireno es de, aproximadamente,

6,5·105 osteoblastos/ml; le siguen las superficies de Ti-TT y Ti-m, para las que se han

obtenido 4,5·105 y 3,6·105 osteoblastos/ml, respectivamente. Estos resultados indican

que el tratamiento térmico proporciona una superficie más adecuada para la

adhesión celular que la superficie sin tratamiento térmico, y que la proliferación

celular aumenta exponencialmente.

4.4.2 Microscopía electrónica de barrido (SEM)

En la Figura 58 se muestran las imágenes de SEM para el Ti-TT después de 1, 3,

5 y 7 días de incubación en el cultivo celular.

Figura 58. Imágenes de SEM del Ti-TT con Saos-2 a: a) día 1, b) día 3, c) día 5 y d) día 7 de incubación en el cultivo celular.


Desde los primeros estadíos de adhesión (Figura 58 a) los osteoblastos se

multiplican con el tiempo aumentando el grado de recubrimiento sobre la superficie

metálica (Figura 58 d). A pesar de este recubrimiento progresivo, no se llega a

alcanzar la confluencia celular sobre la superficie de Ti-TT. La adhesión celular y la

desorción continúan con un mecanismo dinámico sin cubrir la superficie en su

totalidad.

4.4.3 Caracterización del Ti-TT sumergido en DMEMc y en cultivos de Saos-2

por espectroscopía fotoelectrónica de rayos X (XPS)

Para evaluar y entender las interacciones que se producen entre un implante y

el entorno biológico en el que se va a alojar, es necesario conocer la composición de

la superficie después de exponerla al medio del cultivo celular. En la Tabla 27

aparecen los picos característicos de XPS de la superficie de una muestra de Ti-TT

después de haber estado sumergida 7 días en DMEMc. Lo primero que llama la

atención es que la señal correspondiente al Ti2p no aparece, demostrando que la

cantidad de proteínas adsorbidas es tan grande (mayor que el recorrido libre medio

del electrón para los fotoelectrones del Ti2p que es de aproximadamente 3 nm) que

enmascara la superficie de Ti; la consecuencia es que dicho pico no se registra. Sin

embargo, el espectro de alta resolución del C1s muestra las bandas características de

la estructura de una proteína (es decir, aminoácidos unidos por enlaces peptídicos en

una cadena lineal). La deconvolución del espectro del C1s está realizada en base a

estudios previos [113, 114, 152]; se puede descomponer en tres picos (Tabla 27): el

primero a energía de ligadura más baja (284,8 eV) correspondiente a los enlaces C-C,

C=C y C-H; uno atribuido a los enlaces del grupo amino (C-NH-) y al enlace C=O (286,4

eV); y por último, a energía de ligadura más alta el pico asignado al enlace peptídico

(CO-NH-) y a los grupos ácidos (COOH) de las proteínas adsorbidas (288,3 eV).


Tabla 27. Energía de ligadura y % atómico de los espectros de XPS para el Ti-TT después de 7 días sumergido en DMEMc y para 1, 3, 5 y 7 días en presencia de Saos-2.

Superficie Elemento Asignación Energía de

ligadura (eV) % atómico

Ti-TT /DMEMc

C1s C-C, C-H

C-NH-, C=O CO-NH-, COOH

284,8 286,4 288,3

19,6 15,0 11,4

O1s

O=C-OH, C=O, -O=C-NH-

-C=O, COOH,

C-OH

531,5

533,0

25,0

9,0

N1s -O=C-NH-, –NH2

-NH3+

399,9 401,5

7,4 2,6

Ca2p Ca2+ 347,7 3,0

P2p PO4-3 133,5 7,0

Tiempo (Días) 1 3 5 7

Ti-TT / Saos-2

C1s

C-C, C-H C-NH-, C=O

CO-NH-, COOH

284,8 286,2 288,2

16,7 13,5 20,7 21,8 30,7 34,3 26,7 31,8 20,5 17,2 18,3 19,6

O1s TiO2

N-C=O C-O

529,9 531,6 532,8

4,1 4,2 4,5 2,0 4,2 4,1 4,0 3,5 1,3 1,8 1,5 1,9

N1s -O=C-NH-,–NH2

–NH3+

400,1 401,6

11,9 12,4 12,5 12,0 2,8 2,9 3,3 3,2

Ti2p3/2 TiO2 458,6 7,3 7,9 7,8 3,6

P2p PO4-3 133,5 0,2 1,0 0,4 0,4

Ca2p3/2 CaHPO4 347,4 0,3 0,7 0,3 0,2


Figura 59. Espectros de alta resolución de XPS del O1s de Ti-TT y de Ti-TT con Saos-2 a diferentes tiempos de incubación una vez retirados los osteoblastos Saos-2.

De acuerdo con estos resultados, el espectro de alta resolución del O1s

muestra a 531,5 eV el pico correspondiente a los enlaces O=C-OH, C=O y -O=C-NH-; y

a 533,0 eV el pico asignado a los enlaces -C=O, COOH y C-OH. De la misma forma que


el C1s, la banda del N1s proviene de las proteínas adsorbidas (Tabla 27). El pico del

N1s es asimétrico y se deconvoluciona a su vez en dos picos, el correspondiente a –

NH3+ (401,5 eV) y la principal contribución (399,9 eV) del enlace peptídico (-O=C-NH-)

y del grupo amino (-NH2) (Tabla 27). Asimismo, aparecen las bandas asociadas al Ca y

al P con % atómicos muy superiores a las observadas en el caso de las disoluciones de

fosfato (P), fosfato y calcio (PCa) y FBS (Tabla 20 y Tabla 27).

Una vez analizada por XPS la superficie de Ti-TT sumergido, durante 7 días, en

DMEMc, se procedió a evaluar las modificaciones superficiales del Ti-TT como

consecuencia de la actividad celular en presencia de Saos-2 durante 7 días. En la Tabla

27, aparecen la energía de ligadura de los picos correspondientes a las muestras

sumergidas durante 1, 3, 5 y 7 días en un cultivo celular con una densidad celular

inicial de 1,5·104 osteoblastos/cm2.

En este caso, a diferencia de lo que sucedía con las muestras sumergidas en

DMEMc, aparece claramente el pico del Ti2p a 458,6 eV correspondiente al TiO2. De

hecho, el espectro de alta resolución del O1s muestra la banda que se asigna al TiO2 a

una energía de ligadura más baja (529,9 eV) (Figura 59). El séptimo día de incubación

el % atómico de esta banda disminuye, lo que podría indicar que la capa de TiO2 ha

disminuido de espesor por la acción de los osteoblastos ya que la contribución debida

a las proteínas es prácticamente constante a lo largo del tiempo de ensayo. El pico

principal que aparece a 531,6 eV se atribuye al oxígeno en los enlaces N-C=O [114], y la

señal a 532,8 eV se asigna a los átomos de oxígeno que forman el enlace C-O (Tabla

27). La banda del oxígeno podría recibir contribuciones debidas al oxígeno presente

en iones carbonato, iones fosfato y grupos carboxílicos [70, 110]. Sin embargo, el pico

correspondiente al enlace peptídico a 400,1 eV domina el espectro del N1s

observándose también el grupo –NH3+ a 401,6 eV (Tabla 27). Asimismo, aparecen las

bandas correspondientes al P2p y al Ca2p (Tabla 27), aunque con muy poco %

atómico. La asignación de las bandas del C1s es la misma que en el caso del DMEMc.


4.4.4. Caracterización electroquímica del Ti-TT sumergido en DMEMc y en

cultivos de osteoblastos Saos-2

4.4.4.1 Evolución del potencial de corrosión (E corr) con el tiempo de inmersión

En la Figura 60, se muestra la variación del Ecorr, durante 7 días, de las

superficies de Ti-TT sumergidas en el medio de cultivo DMEMc sin osteoblastos (Ti-

TT/DMEMc) y con osteoblastos Saos-2 (Ti-TT/Saos-2). El Ecorr para el DMEMc aumenta

levemente desde -0,014 V vs Pt hasta estabilizarse al cabo de 7 días en +0,016 V vs Pt.

Cuando se añaden Saos-2 al medio, el potencial varía de -0,145 V a -0,071 V vs Pt

como puede observarse en la Figura 60. Es decir, en los dos casos se observa una

ligera tendencia hacia valores de potencial anódicos con el tiempo de inmersión. En

general, el Ecorr para las muestras sumergidas en el cultivo de Saos-2 toma valores más

catódicos que en ausencia de osteoblastos.

Figura 60. Evolución del Ecorr en función del tiempo de incubación para el Ti-TT sumergido, durante 7 días, en la disolución de (■) DMEMc y en (●) presencia de osteoblastos Saos-2.


Es destacable la gran variabilidad de los valores de potencial de corrosión en el

medio con osteoblastos para cada día de ensayo, en comparación con el potencial de

corrosión cuando los osteoblastos no están presentes en el medio.


En la Figura 61, se han representado las curvas de polarización registradas para

el Ti-TT sumergido, durante 7 días, en DMEMc en ausencia y presencia de Saos-2.

Figura 61. Curvas de polarización del Ti-TT sumergido en DMEMc en presencia (●) y ausencia (■) de osteoblastos Saos-2 a los 7 días de ensayo.

Tanto la densidad catódica como anódica son superiores en presencia de

células, lo que indica que la actividad celular y los productos generados por ellas

alteran el comportamiento frente a la corrosión de la superficie de Ti-TT. Este

comportamiento es similar al observado para el Ti-Q. En presencia de osteoblastos, se


pueden identificar dos zonas en la región catódica. La primera zona, comprendida

entre 0 V y -0,300 V de sobretensión respecto al Ecorr, es atribuida a la reducción del

oxígeno disuelto en la disolución. La segunda, comprendida entre -0,300 V y -0,500 V

de polarización, puede ser atribuida según los diagramas de Pourbaix para el Ti a pH

7,4, a una combinación de reducción de oxígeno y de reducción de los protones. Sin

embargo, en ausencia de osteoblastos no se diferencian claramente estas dos zonas:

lo que se estará produciendo es la reacción catódica de reducción de oxígeno.

Figura 62. Curvas de polarización de Ti-TT sumergido durante 1 (■), 3 (●), 5 (▲) y 7 (▼) días en un cultivo de osteoblastos Saos-2.

Si se comparan las curvas de polarización en presencia de células obtenidas a lo

largo de 7 días (Figura 62) se puede observar que, a medida que aumenta el tiempo

de inmersión, la densidad de corriente anódica también aumenta. Estos resultados

indican que el fenómeno de transferencia de carga está menos impedido en las

superficies de Ti-TT en presencia de Saos-2, debido, probablemente, al efecto de las


especies generadas como consecuencia del metabolismo celular (H2O2, óxidos

nitrosos, etc.) que modifican la estabilidad de la capa oxidada de las muestras de Ti-

TT. Además, la densidad de corriente catódica aumenta del día 3 al 7, lo que indica

que el acceso del oxígeno a la superficie esta cada vez más favorecido.

En la Tabla 28, aparecen los valores de las pendientes de Tafel anódicas y

catódicas para las muestras de Ti-TT sumergidas de 1 a 7 días en DMEMc y en

presencia de osteoblastos. Si comparamos los valores de las pendientes de Tafel

anódicas y catódicas en DMEMc (Tabla 28), se puede decir que el primer día de

ensayo existe un control anódico, que evoluciona hacia un control mixto al séptimo

día de inmersión. El control anódico inicial viene determinado fundamentalmente por

la resistencia de la capa de óxido con la película orgánica adsorbida sobre la

superficie. Sin embargo, la disminución de la pendiente anódica indica que la acción

de los componentes del DMEMc repercute en la estabilidad de la capa de óxido

facilitando el flujo de corriente a su través. Por otra parte, en presencia de Saos-2 el

valor de la pendiente de Tafel catódica es 0,354 V para el primer día (pocas células

adheridas sobre la superficie, Figura 58 a), valor similar al obtenido cuando las

muestras están sumergidas en DMEMc. Con el tiempo de incubación, la pendiente de

Tafel catódica evoluciona de manera parecida al DMEMc (Tabla 28, Figura 58 d). Sin

embargo, los valores de las pendientes de Tafel anódicas indican que el mecanismo de

corrosión evoluciona desde un control anódico, el primer día de ensayo, hacia un

control mixto, a medida que aumenta el recubrimiento celular de la superficie en los

días 3 y 5, y finalmente, al séptimo día se da un control catódico (Figura 58). Podemos

decir que la capa va perdiendo resistencia con el paso del tiempo.

En presencia de Saos-2, el valor de la pendiente de Tafel catódica para el

séptimo día, es menor que en DMEMc, indicando que la reducción de oxígeno está

más favorecida.


Tabla 28. Pendientes de Tafel al séptimo día de ensayo para el Ti-TT sumergido en DMEMc en presencia y ausencia de osteoblastos Saos-2.

Tiempo (días) c (V) a (V)

Ti-TT /DMEMc

1 0,336 0,957

3 0,661 0,540

5 0,600 0,494

7 0,618 0,520

Ti-TT / Saos-2

1 0,354 0,715

3 0,639 0,652

5 0,562 0,470

7 0,511 0,387


En la Figura 63 (a y b) se muestran los diagramas de Bode obtenidos para el Ti-

TT sumergido en el medio de cultivo (DMEMc) a 1, 3, 5 y 7 días de ensayo. En estos

diagramas, podemos observar que la respuesta en impedancia es la misma

independientemente del tiempo de ensayo. A altas frecuencias, de 105 a 630 Hz,

aparece un valor constante en el módulo de impedancia seguido por un continuo

aumento desde aproximadamente 70 cm2 (Re) hasta 107 cm2 a frecuencias medias

y bajas (630 y 10-3 Hz) con una pendiente de -0,97. Los valores de (Figura 63 b)

aumentan desde 0° a -89° entre 105 y 10 Hz, manteniéndose en ese valor hasta el

final del ensayo. El ajuste de los resultados experimentales de impedancia se ha

realizado utilizando el circuito eléctrico equivalente de la Figura 63 e, donde Re es la

resistencia del electrolito entre el electrodo de referencia y el de trabajo, y R2 es la

resistencia de la superficie oxidada del Ti-TT y las proteínas adsorbidas. CPE2 está

asociada con una distribución de valores de capacidad que contiene la contribución

de la capacidad de la capa oxidada así como de las proteínas adsorbidas sobre la

superficie del Ti-TT.


Figura 63. Diagrama de Bode para el Ti-TT sumergido, durante 1, 3, 5 y 7 días, en DMEMc a) módulo de impedancia, y b) ángulo de fase vs la frecuencia; y en DMEMc en presencia de Saos-2 c) módulo de impedancia y d) ángulo de fase vs la frecuencia. Los símbolos son los resultados experimentales y (―) son los ajustes con los circuitos eléctricos equivalentes e), f) y g).


Tabla 29. Ajustes de los resultados experimentales de EIS del Ti-TT sumergido, durante 1, 3, 5 y 7 días, en la disolución de DMEMc en presencia y ausencia de osteoblastos Saos-2.

2

9,8

·10

-4

1,2

·10

-3

1,5

·10

-3

1,7

·10

-4

6,3

·10

-3

6,5

·10

-3

8,4

·10

-3

3,5

·10

-2

n1

- - - - -

0,8

9

0,9

7

1,0

0

%

Erro

r

(CP

E1)

- - - - - 6,5

6,4

2,6

CP

E1

Fc

m-2

s-(

1-n

)

- - - - -

16

,84

23

,42

28

,65

%

Erro

r

(R1

)

- - - - -

11

,3

11

,9

20

,9

R1

cm

2

- - - - -

1,1

·10

8

7,2

·10

7

2,1

·10

7

n2

0,9

7

0,9

8

0,9

6

0,9

6

0,9

5

0,9

4

0,9

4

0,9

1

%

Err

or

(CP

E2)

0,2

0,2

0,2

0,1

0,5

1,3

1,6

4,7

CP

E2

Fc

m-2

s-(

1-n

)

9,0

5

8,0

5

8,2

4

8,6

2

11

,10

11

,85

11

,56

20

,67

%

Erro

r

(R2

)

15

,3

17

,8

17

,2

16

,2

12

,6

5,8

5,3

10

,5

R2

cm

2

2,2

·10

8

2,4

·10

8

2,7

·10

8

2,9

·10

8

4,5

·10

7

4,2

·10

5

2,1

·10

5

9,5

·10

4

Re

76

,3

68

,6

61

,7

57

,3

71

,6

88

,0

79

,0

78

,3

t

día

s

1

3

5

7

1

3

5

7

Sup

er-

fici

e

Ti-T

T/

DM

EM c

Ti-T

T/

Sao

s-2


La presencia de los osteoblastos Saos-2 en el medio de cultivo modifica la

interfase Ti-TT/proteínas adsorbidas del DMEMc, provocando cambios en la respuesta

de impedancia. En la Figura 63 (c y d), se muestra la evolución del módulo de

impedancia y del ángulo de fase frente a la frecuencia, respectivamente, para las

muestras de Ti-TT sumergidas en DMEMc con Saos-2 durante 1, 3, 5 y 7 días. De 1 a 3

días de incubación, la interfase del sistema Saos-2/Ti-TT ha cambiado

significativamente alterando los valores de impedancia frente a la frecuencia. El

sistema muestra una constante de tiempo para el primer día y dos constantes

claramente diferenciadas después del tercer día de ensayo, con max a 10 Hz y 10-3 Hz

en el ángulo de fase (Figura 63 d).

A frecuencias altas, el módulo de impedancia muestra un valor constante (Re, a

= 0 en el ángulo de fase), cuya resistencia es ligeramente más alta que para DMEMc

(Tabla 29). A frecuencias medias, entre 240 y 1 Hz, la pendiente de aproximadamente

-0,9 puede ser atribuida a un condensador en paralelo con una resistencia asociados a

la interfase electrolito (DMEMc)/Saos-2. En el intervalo de frecuencias más bajas

(desde 10-2 a 10-3 Hz) se observa una pendiente de -0,83 en el módulo de impedancia

frente a la frecuencia. Esta pendiente puede ser atribuida a la interfaseelectrolito

(DMEM)/TiO2-Ti-TT representando la superficie libre del biomaterial en contacto con

Saos-2. El cambio de pendiente se ve reflejado en el diagrama de Bode del ángulo de

fase (Figura 63 c y d) apareciendo un mínimo a 10-1 Hz.

Los resultados de las medidas de impedancia del Ti-TT en presencia de Saos-2

se han ajustado teniendo en cuenta los circuitos eléctricos equivalentes de la Figura

63. Para el primer día de inmersión del Ti-TT en Saos-2, se ha propuesto el mismo

circuito que para el sistema DMEMc/Ti-TT (Figura 63 e), debido a que existe una sola

constante de tiempo y a que el recubrimiento celular de la superficie es escaso (Figura

58 a). Para los días 3 y 5 se propuso el circuito eléctrico equivalente de la Figura 63 f,

que representa una superficie de Ti-TT parcialmente cubierta por Saos-2 (Figura 58 b y

c). Para el séptimo día, aunque no se alcanza la confluencia celular (Figura 58 d), el


circuito equivalente que mejor representa este sistema es el que se muestra en la

Figura 63 g. Los componentes del circuito son: Re, la resistencia del electrolito; CPE2,

elemento de fase constante que puede ser asignado a la capacidad de la capa de

adsorción de las biomoléculas, que incluye osteoblastos y matriz extracelular; R2, la

resistencia asociada con ella; CPE1, un elemento de fase constante que simula la

conducta no ideal de un condensador de la interfase formada por el medio de cultivo

(DMEMc) y los aminoácidos, proteínas y matriz extracelular adsorbidos sobre la

superficie oxidada del Ti-TT; y R1 la resistencia asociada a la superficie de óxido

modificada libre de osteoblastos. Para el día 7, CPE1 y R1 corresponden a la interfase

interna Saos-2-proteínas/TiO2.

En la Tabla 29 se muestran los ajustes de los resultados experimentales y

teóricos de las medidas de EIS de Ti-TT en DMEMc en presencia y ausencia de

osteoblastos Saos-2 después de 1, 3, 5 y 7 días de incubación.

Para el Ti-TT inmerso en DMEMc, CPE2 es prácticamente constante a lo largo

de los 7 días de ensayo y sin embargo R2 aumenta ligeramente. No obstante, el orden

de magnitud 108 es característico de la capa de óxido existente sobre el Ti-TT.

En presencia de Saos-2 (Tabla 29), la CPE2 de la capa biomoléculas aumenta

con el tiempo de incubación; R2 disminuye sugiriendo que la cantidad de proteínas

adsorbidas directamente sobre el Ti-TT decrece igualmente durante la adhesión

celular como ya se ha mencionado con anterioridad para el sistema Saos-2/Ti-Q.

Además, la resistencia del óxido (R1) también disminuye y CPE1 aumenta con el

tiempo de ensayo. Esto indica que la presencia de osteoblastos altera la capa oxidada,

puesto que los compuestos secretados por éstos aceleran su disolución.


Trasformadas de Kramers-Kronig (K-K)

Una vez analizados y ajustados los diagramas de impedancia, las transformadas

de Kramers-Kronig (K-K) [100] permitieron evaluar la fiabilidad de las medidas de

impedancia.

Figura 64. Resultados experimentales (O) correspondientes al Ti-TT sumergido en: a) DMEMc y b) DMEMc con Saos-2, y resultados obtenidos utilizando las relaciones de Kramers-Kronig (K-K)(+) para el día 7 de ensayo.

A modo de ejemplo, en la Figura 64, aparecen representados los resultados

experimentales y los calculados a partir de las transformadas de K-K para el Ti-TT


sumergido en DMEMc durante 7 días en ausencia y presencia de Saos-2. Como se

puede observar en la Figura 64, la consistencia de los resultados experimentales es

bastante buena. En la Tabla 30 se muestran los errores medios calculados utilizando la

ecuación (9), de las transformadas de K-K con respecto a los resultados

experimentales para el DMEMc en presencia y ausencia de osteoblastos a los 7 días

de ensayo.

Tabla 30. Errores medios calculados por medio de la expresión (9), de las representaciones de Kramers-Kronig (K-K) con respecto a los resultados obtenidos experimentalmente para el DMEMc en presencia y ausencia de Saos-2 para el séptimo día de ensayo.

Error medio (%)

Medios Componente real (Z´) Componente imaginaria (Z”)

DMEMc 0,129 0,398

Saos-2 0,918 0,123

El error medio obtenido para cada una de las transformadas de K-K para todos

los días de ensayo, no supera el 1%, por lo que los resultados experimentales

satisfacen las transformadas de K-K.

4.4.5 Discusión

La interacción entre el medio fisiológico y la superficie del implante depende como

hemos visto, del estado superficial del biomaterial. Topografía, rugosidad o textura, y

composición química, condicionan la posterior adhesión celular a través de las

interacciones con receptores celulares [153]. Las modificaciones superficiales

producidas por la oxidación del Ti consiguen, por un lado, modificar la composición

química de la superficie (como se comprobó mediante XPS (Figura 46) pero por otro,

se crean “nanotopografías” (Figura 44 Figura 45) que pueden ser relevantes para

favorecer la adsorción de proteínas previas a la adhesión celular [154]. La tendencia

general de las investigaciones en curso parece indicar que las topografías del orden de

la nanoescala son capaces de, a corto y medio plazo, modular la respuesta celular. Por


otra parte, una vez que los osteoblastos comienzan su adhesión, la presencia de

microsurcos sobre la superficie metálica pueden “ordenar” dicha adhesión. De hecho,

teniendo en cuenta las dimensiones de los filopodios de estas células, que tienen un

diámetro en torno a 50-100 nm, se puede afirmar que los surcos por encima de los 2

µm de anchura y 500 nm de profundidad favorecen el punto de anclaje de los

osteoblastos y por tanto, su adhesión [155].

Por todo lo expuesto, queda claro que el tratamiento de oxidación da lugar a

una estructura superficial texturada y químicamente modificada, que podría favorecer

la adsorción de proteínas y la adhesión de los osteoblastos, como se pudo comprobar

en el estudio de la cinética de adhesión de osteoblastos sobre la superficie oxidada,

en comparación con la superficie sin oxidar (Figura 57). Estos resultados indicaron que

el tratamiento térmico proporciona una superficie más adecuada para la adhesión

celular que la superficie de titanio sin tratamiento térmico.

La etapa inicial implicada en la adhesión celular es la adsorción de proteínas y

la formación de biopelículas sobre la superficie. Esta adsorción de proteínas es el paso

intermedio en la adhesión celular con la superficie del biomaterial. La presencia de

estas proteínas sobre la superficie del Ti-TT, después de ser expuesta al DMEMc,

quedó confirmada a través del XPS con la detección de los grupos amino –NH2, grupos

ácidos –COOH y el grupo amida CO-NH-, asignado al enlace peptídico (Tabla 27) [113,

114, 152]. La superficie aparece totalmente recubierta por distintas proteínas y la matriz

extracelular después de 7 días de inmersión puesto que no se ha registrado la banda

correspondiente al Ti2p.

El enriquecimiento de la biopelícula fue también observado mediante

impedancia electroquímica. Los valores de resistencia (R2) atribuidos a la interfase

electrolito/proteínas-TiO2 para el Ti-TT sumergido en DMEMc, aumentan ligeramente

a lo largo de los 7 días de ensayo (Tabla 29). Este comportamiento también se ha


observado sobre platino [156], electrodos de “glassy carbón” [157] y otros electrodos

metálicos [158] inmersos en disoluciones de albúmina.

El complejo mecanismo competitivo de adsorción de proteínas y adhesión de

osteoblastos, quedó reflejado en la variabilidad del potencial de corrosión a lo largo

del tiempo de incubación. En el estudio del Ecorr con el tiempo, lo primero que llama la

atención es la gran variación que obtenemos cuando el medio contiene osteoblastos

(Figura 60). Esto es debido a muchos factores implicados en la investigación con

cultivos celulares, tales como distintos pases de osteoblastos o diferentes porcentajes

de estos en distintas etapas de diferenciación [68]. Es prácticamente imposible utilizar

en cada ensayo la misma proporción de osteoblastos en el mismo estadío de

diferenciación.

Para las muestras de Ti-TT sumergidas en el cultivo de Saos-2, el Ecorr adquiere

valores más catódicos que en DMEMc durante los 7 días de incubación [59, 68]. Esto

puede ser debido a que tanto los iones y proteínas presentes en el medio (ej. PO4-3,

Ca2+ y BSA) como la matriz extracelular segregada por los osteoblastos, se adsorben a

la superficie, como ha sido confirmado por XPS. En el proceso de adsorción los iones y

las proteínas compiten por unirse al sustrato; además, las proteínas pueden formar

complejos con los iones Ti4+ facilitando la disolución del Ti [68]. Como se aha

comentado anteriormente, los osteoblastos tienen un metabolismo muy activo y son

muy reactivos produciendo superóxidos, óxido nitroso, protones, etc. [137]. Para

adsorberse a la superficie segregan matriz extracelular, produciéndose el

desplazamiento o sustitución de las proteínas del medio adsorbidas por otras

segregadas por los osteoblastos en el intento de anclarse a la superficie del material

[59]. Todos estos factores hacen que el Ecorr se desplace a valores más catódicos que en

ausencia de Saos-2, lo que nos indica una tendencia hacia un sistema activo. Este

movimiento de moléculas en la superficie del Ti-TT favorece la llegada del oxígeno a la

superficie con mayor facilidad que en el caso del DMEMc. Por esta razón, la densidad

de corriente catódica en presencia de Saos-2 aumenta con el tiempo de incubación


(Figura 62) siendo en cualquier caso superior a la obtenida para el Ti-TT en ausencia

de osteoblastos. De la misma forma, la densidad de corriente anódica es superior en

presencia de Saos-2 que en DMEMc y aumenta durante los siete días de ensayo

(Figura 62). Este hecho se debe, de nuevo, a la acción de los productos excretados por

los osteoblastos (superóxidos, óxidos nitrosos, protones, etc.) que parecen atacar con

mayor facilidad a la superficie oxidada del Ti disminuyendo el carácter protector de la

capa de óxido (TiO2).

Todos estos resultados concuerdan con los referidos en otros trabajos donde

las proteínas y aminoácidos aceleran la disolución del titanio (reacción anódica) [134], y

la presencia de Saos-2 aumenta la velocidad de corrosión de los biomateriales

metálicos [135]. Así se pasa de un control anódico para el primer día a un control

catódico para el séptimo día. En este caso, la etapa limitante del proceso podría ser la

reducción del oxígeno bien por problemas de difusión, o bien porque los sitios donde

se produce esta reacción estén bloqueados.

La presencia de los osteoblastos sobre la superficie de Ti-TT fue también

evidenciada de forma indirecta por XPS puesto que aparecen los picos característicos

de las proteínas de adhesión después de la desorción celular. El estudio de XPS refleja

que el % atómico de la banda correspondiente al TiO2 disminuye a los siete días (Tabla

27), sin llegar a desaparecer. Dicha disminución se podría deber a la reducción del

espesor de la capa de TiO2 debido al efecto corrosivo de los productos de desecho

celular ya comentado anteriormente. El espectro de alta resolución del P2p sugiere la

presencia del fósforo en forma de fosfatos o pirofosfatos y el del Ca2p en forma de

CaHPO4. Por tanto, la presencia de estos dos iones (precursores de la hidroxiapatita)

en la superficie del Ti-TT, después de estar 7 días en contacto con los osteoblastos,

indica, al parecer, que han sido incorporados a la superficie del óxido. Esta

incorporación ha sido estudiada por otros autores in vivo [127] e in vitro [42], pero en el

caso que nos ocupa, el tiempo de incubación ha sido tan breve que no ha sido

suficiente para inducir la nucleación de precipitados de Ca/P. Es bien conocido que la


osteointegración de los implantes de titanio normalmente requiere varios meses [129].

De hecho, el cociente Ca/P en función del tiempo para la apatita es de 1,67 [133],

mientras que el valor máximo de cociente obtenido en estas muestras ha sido de 0,74

para el día 1 y el mínimo para el día 7 de 0,54. A medida que pasa el tiempo se

obtiene que la relación Ca/P va disminuyendo. La razón pudiera ser los cambios que,

como hemos señalado, producen los osteoblastos en la superficie, sustituyendo las

proteínas del medio adsorbidas por otras que segregan ellos mismos [59], desplazando

a los iones de calcio y fósforo adsorbidos sobre la superficie [54].

De acuerdo con el ajuste de los resultados de impedancia en presencia de Saos-

2 (Tabla 29), el valor de capacidad (CPE2) asignada a la interfase electrolito

(DMEMc)/Saos-2-proteínas aumenta a lo largo de los 7 días de ensayo. Esto indica que

la cantidad de proteínas adsorbidas sobre la superficie de Ti-TT disminuye debido a la

presencia de osteoblastos [59]. Como es lógico, a medida que aumenta el valor de la

capacidad disminuye el valor de la resistencia, debido a la disminución de la

concentración de proteínas adsorbidas. Por otra parte, el valor de la resistencia (R1)

asociada a la interfase electrolito (DMEMc)/TiO2-Ti disminuye con el consiguiente

aumento en el valor de la capacidad (CPE1) a lo largo del tiempo de incubación. Este

cambio es más drástico para el día 7 (Tabla 29) alcanzando un valor de R1 = 2,1·107

·cm2 para la interfase interna Saos-2-proteínas/TiO2. Estos resultados vuelven a

indicar que los compuestos generados por los osteoblastos modifican la capa de TiO2,

acelerando su disolución coincidiendo con el aumento de densidad de corriente

anódica observado en las curvas de polarización. Además, los valores de CPE1 son

muy similares a los obtenidos por otros autores en la bibliografía [59, 159].

5. Conclusiones

5. Conclusiones 203

Se han estudiado las interacciones de los componentes más significativos del

DMEMc, así como con el medio de cultivo en ausencia y en presencia de osteoblastos

Saos-2, con dos acabados diferentes de Ti. El primero de ellos (Ti evaporado sobre

cristales de cuarzo) de baja rugosidad (37 nm) y con una capa pasiva de óxido de

titanio de aproximadamente 2 nm de espesor; el segundo (Ti másico con tratamiento

térmico), de mayor intervalo de rugosidad (19-92 nm) con un espesor de la capa

oxidada de 12 nm debido al tratamiento térmico utilizado.

La interacción de ambas superficies con los distintos componentes presentes

en el medio fisiológico ha dado lugar a las siguientes conclusiones, dependiendo de la

naturaleza inorgánica u orgánica del componente utilizado:

Naturaleza inorgánica:

- La inmersión de las superficies de Ti en la disolución que contiene NaH2PO4 da

lugar a la incorporación de iones fosfato a la superficie de TiO2, aumentando la

resistencia a la corrosión de la capa pasiva.

- La adición de CaCl2 a la disolución de NaH2PO4 favorece la incorporación de

iones calcio y fosfato a la capa pasiva de TiO2, lo que produce un aumento de la

resistencia del óxido. No obstante, la relación Ca/P es demasiado baja para

inducir la precipitación de la hidroxiapatita. Este resultado confirma la lenta

cinética de crecimiento de los núcleos Ca-P observada en las superficies de los

implantes de Ti en ensayos in vivo.

Naturaleza orgánica:

- La glucosa se adsorbe rápidamente a la superficie de Ti-Q, manteniéndose en

un estado estacionario hasta el final del ensayo. No obstante, la espectroscopía

de impedancia electroquímica reveló que la glucosa permite la difusión del

oxígeno a su través que se traduce en un aumento de la resistencia de la capa

de óxido de titanio a lo largo del tiempo de ensayo. Sin embargo, la adsorción

204 5. Conclusiones

de glucosa sobre el Ti-TT no alcanza el recubrimiento total, permitiendo la

incorporación de iones fosfato e iones calcio sobre la superficie libre de Ti/TiO2

aumentando su resistencia con el tiempo de inmersión.

- La albúmina se adsorbe sobre las superficies de titanio formando una capa

densa y homogénea que impide la difusión del oxígeno hacia la superficie del

electrodo, manteniendo la resistencia frente a la corrosión de la capa pasiva

inalterada con el tiempo de inmersión. En presencia de iones calcio, dicha

adsorción se ve favorecida ya que estos iones actúan como puente de unión

entre los grupos básicos de la superficie de Ti y los grupos ácidos de la proteína.

- El estudio de las interacciones del Ti con el suero fetal bovino, FBS, pone de

manifiesto la presencia de otras proteínas sobre la superficie del biomaterial

(XPS, QCM) produciendo un incremento de la resistencia de la interfase externa

con el tiempo de inmersión y una disminución de la corriente de reducción del

oxígeno.

- Las pendientes catódicas y anódicas del Ti-Q son menores que para el Ti-TT,

por tanto, los procesos anódicos y catódicos están más impedidos en el Ti-TT;

es decir, el tratamiento térmico promueve la formación de una capa de óxido

que resiste mejor los procesos de corrosión.

- En presencia de DMEMc la interacción de aminoácidos, proteínas y otros

componentes del medio con la superficie de Ti-Q provoca la disminución de la

resistencia a la corrosión de la capa de óxido de titanio. Por el contrario, la

superficie de Ti-TT no parece verse afectada por la presencia de estos

componentes, manteniendo una alta resistencia del óxido de Ti a lo largo del

tiempo de inmersión.

En presencia de células osteoblásticas:

5. Conclusiones 205

- Las superficies de Ti se recubren a medida que aumenta el tiempo de

inmersión, aunque en ninguno de los dos casos, Ti-Q o Ti-TT se observa un

recubrimiento confluente después de un tiempo de incubación de 7 días.

- Los compuestos que generan los osteoblastos modifican la capa de TiO2

acelerando la disolución de la superficie de Ti, y por tanto, adelgazando la capa

de TiO2 para ambos acabados.

- La pendiente de Tafel anódica, tanto para el Ti-TT como para el Ti-Q,

disminuye en presencia de Saos-2 y además aumenta la densidad de corriente

anódica con el tiempo de incubación, lo cual confirma la agresividad de los

productos de desecho generados por los osteoblastos Saos-2, que son capaces

de alterar la superficies de Ti disminuyendo su resistencia frente a la corrosión.

- Los estudios con la QCM muestran que la cinética de adhesión de los

osteoblastos Saos-2 sobre Ti-Q es de primer orden con K = 2·10-3 min-1, lo que

significa que el proceso no está controlado por difusión, sino por la velocidad

de adsorción de los osteoblastos sobre la superficie metálica.

- Los análisis de XPS realizados sobre el Ti-TT después de estar en contacto con

los osteoblastos Saos-2, muestran claramente la presencia de proteínas en la

superficie, así como iones fosfato y calcio incorporados a la capa de óxido de

titanio después de siete días de incubación.

6. Bibliografía

6. Bibliografía 209

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7. Anexos

7. Anexos 223

7.1 Composición del DMEM

COMPONENTES Peso

molecular

Concentración

(mg/L)

Concentración

(mM)

Aminoácidos

Glycine 75 30 0,4

L-Arginine hydrochloride 211 84 0,398

L-Cystine 2HCl 313 63 0,201

L-Glutamine 146 584 4

L-Histidine hydrochloride-H2O 210 42 0,2

L-Isoleucine 131 105 0,802

L-Leucine 131 105 0,802

L-Lysine hydrochloride 183 146 0,798

L-Methionine 149 30 0,201

L-Phenylalanine 165 66 0,4

L-Serine 105 42 0,4

L-Threonine 119 95 0,798

L-Tryptophan 204 16 0,0784

L-Tyrosine disodium salt dihydrate 261 104 0,398

L-Valine 117 94 0,803

Vitaminas

Choline chloride 140 4 0,0286

D-Calcium pantothenate 477 4 0,00839

Folic Acid 441 4 0,00907

Niacinamide 122 4 0,0328

Pyridoxine hydrochloride 206 4 0,0194

Riboflavin 376 0,4 0,00106

Thiamine hydrochloride 337 4 0,0119

i-Inositol 180 7,2 0,04

Sales Inorgánicas

Calcium Chloride (CaCl2) 111 200 1,8

Ferric Nitrate (Fe(NO3)3"9H2O) 404 0,1 0,000248

Magnesium Sulfate (MgSO4) 120 97,67 0,814

Potassium Chloride (KCl) 75 400 5,33

Sodium Bicarbonate (NaHCO3) 84 3700 44,05

Sodium Chloride (NaCl) 58 4750 81,9

Sodium Phosphate monobasic (NaH2PO4-H2O)

138 125 0,906

Otros Componentes

D-Glucose (Dextrose) 180 4500 25

HEPES 238 5958 25,03

224 7.Anexos

7.2 Composición bioquímica y hormonal del FBS

Componentes Unidades Rango Mean pH pH 7–7,3 7,07

Osmolality mosm/kg 308–334 315,82

Conductivity mS/cm

7

Total protein g/dl 3,8–4,4 4,08

Endotoxin EU/ml 0,03–4,8 1,20

Albumin g/dl

2,52

Alkaline phosphatase U/l 202–380 289,45

Bicarbonate mequiv/l 7–12 10

Bilirubin mg/dl 0,1–0,4 0,23

BUN mg/dl 12–21 16,32

Calcium mg/dl 11,1–24 14,32

Chloride mequiv/l 79–103 97,77

Cholesterol mg/dl 22–38 31,21

Creatinine mg/dl 2,4–3 2,77

Globulin g/dl

1,19

_ Globulin g/dl

_ Globulin g/dl

0,378

GG-transpeptidase U/l 5–12 6,18

Glucose mg/dl 32–142 102,32

HD lipoproteins mg/dl 10–12 10,82

LD lipoproteins mg/dl 1,6–52,8 30,19

Phosphorus (inorganic) mg/dl 8,4–10,8 9,65

Potassium mequiv/l 10,1–14 12,22

SGOT U/l 31–60 44,5

Sodium mequiv/l 110–141 133,59

Transferrin mg/dl 153–271 190,22

Triglycerides mg/dl 46–83 65–91

Uric acid mg/dl 1,3–3 2,22

Hemoglobin mg/dl 6,4–23,3 13–11

Lactate dehydrogenase mg/dl 484–755 637,77

Vitronectin µg/ml 13–70

Cortisol µg/dl 0,1–2,24 0,82

Estradiol pg/ml 8,78–36 18,67

FSH ng/ml 7,0–115,1 51,1

Growth hormone ng/ml 34,3–221,5 180,8

Insulin nIU/ml 2,56–12,11 5,96

Lutinizing hormone ng/ml 0,1–1,16 71

Progesterone ng/ml 0,03–0,18 0,08

Prolactin ng/ml 1,16–45,68 14,04

Prostaglandin E pg/ml 0,25–5,20 0,60

Prostaglandin F pg/ml 0,76–18,2 1,85

Testosterone ng/ml 0,01–0,18 0,097

TSH mU/ml 0,39–1,40 0,83

Thyroxine (T4) µg/ml 12,05–21,22 15,18

Capacidad total de unir hierro g/dl 148–376 264,95

7. Anexos 225

7.3 Diagrama de Pourbaix para el titanio

226 7.Anexos

7.4 Curva de Volcano

7. Anexos 227

7.5 Índice de figuras

Figura 1. Estructuras cristalinas del titanio (fases α-Ti y β-Ti). ................................................... 5

Figura 2. Imágenes del microscopio electrónico de barrido (SEM) de superficies sin tratar, tratadas con base, y con una base y posterior tratamiento térmico, de izquierda a derecha respectivamente [21]. ........................................................................................... 12

Figura 3. Interfase formada entre la capa pasiva del Ti y una disolución acuosa. Marcado en azul, coordinación simple del grupo OH- con el Ti (carácter básico); en rojo, coordinación doble formando Ti2OH+ (carácter ácido). ......................................................................... 16

Figura 4. Fórmula molecular de la D-Glucosa. .......................................................................... 19

Figura 5. Estructura terciaria de la albúmina de suero bovino (BSA). ...................................... 20

Figura 6. Cristal de cuarzo con electrodos de Ti. ...................................................................... 35

Figura 7. Programa de temperatura aplicado a las muestras de titanio másico (Ti-m). .......... 36

Figura 8. Partes de la celda electroquímica [86] y muestras de los dos acabados de Ti (imagen superior) y celda electroquímica en su conjunto (imagen inferior). ................................ 39

Figura 9. Cantilever y punta de AFM. ........................................................................................ 43

Figura 10. Esquema de un microscopio de fuerzas atómicas. .................................................. 44

Figura 11. Curvas de polarización para electrodos mixtos. ...................................................... 52

Figura 12. Diagrama de Tafel complete de un electrodo mixto en un medio neutro aireado. 54

Figura 13. Circuito equivalente de Randles simplificado y su respuesta en frecuencia, representada en el plano complejo en forma de diagrama de Nyquist. ......................... 58

Figura 14. Fotografía del cristal de cuarzo y dibujo del corte AT. ............................................ 62

Figura 15. Brazo de QCM y sus componentes. ......................................................................... 66

Figura 16. Macrocelda electroquímica utilizada para realizar las medidas de QCM en presencia de los osteoblastos Saos-2. .............................................................................. 67

Figura 17. Cámara Neubauer de contaje de células. ................................................................ 71

Figura 18. Imágenes de microscopía electrónica de barrido (SEM) de la superficie del Ti-Q a diferentes magnificaciones. .............................................................................................. 79

Figura 19. Imagen por microscopía de fuerza atómica (AFM) de la topografía superficial del Ti-Q y perfil de rugosidad. ................................................................................................ 80

228 7.Anexos

Figura 20. Espectros de alta resolución de XPS del C1s, del O1s y del Ti2p para el Ti-Q. ........ 81

Figura 21. Variación de la frecuencia de oscilación del cristal de cuarzo (Ti-Q) con el tiempo sumergido en la disolución P (NaH2PO4) y la disolución PCa (NaH2PO4 + CaCl2). ............ 84

Figura 22. Variación de la frecuencia de oscilación del cristal de cuarzo (Ti-Q) con el tiempo sumergido en (a) una disolución de BSA y (b) una disolución de BSA + NaH2PO4 + CaCl2. .......................................................................................................................................... 86

Figura 23. Variación de la frecuencia de oscilación del cristal de cuarzo (Ti-Q) con el tiempo sumergido en la disolución de FBS. .................................................................................. 87

Figura 24. Espectros generales de XPS para el Ti-Q sumergidos, durante 7 días en: (a) aire, (b) NaH2PO4, (c) NaH2PO4 + CaCl2, (d) NaH2PO4 + CaCl2 + glucosa, (e) NaH2PO4 + CaCl2 + BSA y (f) FBS. ............................................................................................................................ 88

Figura 25. Espectros de XPS de alta resolución del C1s y del O1s para el Ti-Q después de 7 días de inmersión en a) NaH2PO4 (P), b) NaH2PO4 + CaCl2 (PCa) y c) NaH2PO4 + CaCl2 + glucosa (PCaG). ................................................................................................................. 91

Figura 26. Espectros de XPS de alta resolución del C1s y del O1s para el Ti-Q sumergido, durante 7 días, en a) BSA y b) FBS. ................................................................................... 93

Figura 27. Evolución del Ecorr con el tiempo de inmersión para el Ti-Q en (■) NaH2PO4 (P), (●) NaH2PO4 + CaCl2 (PCa), (▲) NaH2PO4 + CaCl2 + glucosa (PCaG), (▼) albúmina (BSA) y (♦) suero fetal bovino (FBS). .................................................................................................. 96

Figura 28. Curvas de polarización del Ti-Q sumergido, durante 7 días, en (a) (■) NaH2PO4 (P), (●) NaH2PO4 + CaCl2 (PCa), (▲) NaH2PO4 + CaCl2 + glucosa (PCaG) y (b) (●) albúmina (BSA) y (▲) suero fetal bovino (FBS), a una velocidad de barrido de 1mV/s. ................. 98

Figura 29. Densidad de corriente catódica calculada a = -0,2 V para el Ti-Q en cada una de las disoluciones de los componentes del DMEMc. ........................................................ 100

Figura 30. Diagrama de Bode para el Ti-Q sumergido, durante 7 días, en la disolución de NaH2PO4 (a) módulo de impedancia, y (b) ángulo de fase vs la frecuencia; y en la disolución de NaH2PO4 + CaCl2 (c) módulo de impedancia y (d) ángulo de fase vs la frecuencia. Los símbolos son los resultados experimentales y (―) son los ajustes con el circuito eléctrico equivalente (e).................................................................................... 102

Figura 31. Diagrama de Bode para el Ti-Q sumergido, durante 7 días, en la disolución de NaH2PO4 + CaCl2 + glucosa (a) módulo de impedancia, y (b) ángulo de fase vs la frecuencia. Los símbolos son los resultados experimentales y (―) son los ajustes con el circuito eléctrico equivalente (c). ................................................................................... 103

Figura 32. Diagrama de Bode para el Ti-Q sumergido, durante 7 días, en la disolución de BSA a) módulo de impedancia, y b) ángulo de fase vs la frecuencia; y en la disolución de FBS c) módulo de impedancia y d) ángulo de fase vs la frecuencia. Los símbolos son los

7. Anexos 229

resultados experimentales y (―) son los ajustes con el circuito eléctrico equivalente e). ........................................................................................................................................ 104

Figura 33. Resultados experimentales (O) correspondientes al Ti-Q sumergido, durante 7 días, en las disoluciones de: a) NaH2PO4 (P), b) NaH2PO4 + CaCl2 (PCa) y c) NaH2PO4 + CaCl2 + glucosa (PCaG), y resultados obtenidos utilizando las relaciones de Kramers-Kronig (K-K)(+). ................................................................................................................................ 111

Figura 34. Resultados experimentales (O) correspondientes al Ti-Q sumergido, durante 7 días, en las disoluciones de: a) BSA y b) FBS, y resultados obtenidos utilizando las relaciones de Kramers-Kronig (K-K)(+). ............................................................................................ 112

Figura 35. Imágenes SEM de un osteoblasto Saos-2: a) en una de las etapas iniciales del proceso de adhesión celular y b) un osteoblasto completamente extendido sobre la superficie. ....................................................................................................................... 120

Figura 36. Imágenes SEM de los osteoblastos Saos-2: a) en la etapa de proliferación o división celular y b) adhiriéndose a la superficie de Ti y relacionándose por medio de los filopodios con los osteoblastos vecinos. ........................................................................ 120

Figura 37. Imágenes SEM del Ti-Q con Saos-2 a: a) día 1, b) día 3, c) día 5 y d) día 7 de incubación en el cultivo celular. ..................................................................................... 121

Figura 38. Medida de QCM del Ti-Q con 5·104 Saos-2/cm2 y despegue celular con tripsina. 122

Figura 39. Evolución del Ecorr en función del tiempo de incubación para el Ti-Q sumergido, durante 7 días, en la disolución de (■) DMEMc y (●) presencia de osteoblastos Saos-2. ........................................................................................................................................ 125

Figura 40. Curvas de polarización del Ti-Q sumergido en (■) DMEMc y (●) presencia de osteoblastos Saos-2 a los 7 días de incubación. ............................................................. 126

Figura 41. Diagrama de Bode para el Ti-Q sumergido, durante 1, 3, 5 y 7 días, en DMEMc a) módulo de impedancia, y b) ángulo de fase vs la frecuencia; y en DMEMc en presencia de Saos-2 c) módulo de impedancia y d) ángulo de fase vs la frecuencia. Los símbolos son los resultados experimentales y (―) son los ajustes con los circuitos eléctricos equivalentes e), f) y g). ................................................................................................... 129

Figura 42. Resultados experimentales (O) correspondientes al Ti-Q sumergido, durante 7 días, en: a) DMEMc y b) DMEMc con Saos-2, y los resultados obtenidos utilizando las relaciones de Kramers-Kronig (K-K)(+). .......................................................................... 134

Figura 43. (a) Imagen de SEM del titanio tratado térmicamente (Ti-TT) y (b) análisis por EDX. ........................................................................................................................................ 139

Figura 44. Imagen de AFM de la topografía superficial del Ti antes del tratamiento térmico (Ti-m) y perfil de Ti-m de uno de los surcos de la superficie. ......................................... 140

230 7.Anexos

Figura 45. Imagen de AFM de la topografía superficial del Ti-TT después del tratamiento térmico y perfil de Ti-TT de uno de los surcos de la superficie. .................................... 141

Figura 46. Espectros de alta resolución de XPS del O1s para el Ti-m y el Ti-TT. .................... 143

Figura 47. Espectros de alta resolución de XPS del C1s y O1s para el Ti-TT sumergido 7 días en las disoluciones: (a) NaH2PO4, (b) NaH2PO4+ CaCl2 y (c) NaH2PO4+ CaCl2 + glucosa...... 146

Figura 48. Espectros de alta resolución de XPS del C1s y del O1s de las muestras de Ti-TT sumergido, durante 7 días, en (a) BSA y (b) FBS. ........................................................... 149

Figura 49. Evolución del Ecorr con el tiempo para el Ti-TT en (■) NaH2PO4 (P), (●) NaH2PO4 + CaCl2 (PCa), (▲) NaH2PO4 + CaCl2 + glucosa (PCaG), (▼) albúmina (BSA) y (♦) suero fetal bovino (FBS). ................................................................................................................... 152

Figura 50. Curvas de polarización del Ti-TT sumergido, durante 7 días, en (a) (■) NaH2PO4 (P), (●) NaH2PO4 + CaCl2 (PCa), (▲) NaH2PO4 + CaCl2 + glucosa (PCaG), y (b) (■) NaH2PO4 (P), (●) albúmina (BSA) y (▲) suero fetal bovino (FBS), a una velocidad de barrido de 1mV/s. ........................................................................................................................................ 154

Figura 51. Densidad de corriente catódica calculada a -0,2 V para el Ti-TT sumergido en cada una de las disoluciones de los componentes del DMEMc. .................................... 157

Figura 52. Diagrama de Bode para el Ti-TT sumergido, durante 7 días, en la disolución de NaH2PO4 (a) módulo de impedancia, y (b) ángulo de fase vs la frecuencia; y en la disolución de NaH2PO4 + CaCl2 (c) módulo de impedancia y (d) ángulo de fase vs la frecuencia. Los símbolos son los resultados experimentales y (―) son los ajustes con el circuito eléctrico equivalente (e).................................................................................... 158

Figura 53. Diagrama de Bode para el Ti-TT sumergido, durante 7 días, en la disolución de NaH2PO4 + CaCl2 + glucosa (a) módulo de impedancia, y (b) ángulo de fase vs la frecuencia. Los símbolos son los resultados experimentales y (―) son los ajustes con el circuito eléctrico equivalente (c). ................................................................................... 160

Figura 54. Diagrama de Bode para el Ti-TT sumergido, durante 7 días, en la disolución de BSA (a) módulo de impedancia, y (b) ángulo de fase vs la frecuencia; y en la disolución de FBS (c) módulo de impedancia y (d) ángulo de fase vs la frecuencia. Los símbolos son los resultados experimentales y (―) son los ajustes con el circuito eléctrico equivalente (e). ........................................................................................................................................ 161

Figura 55. Resultados experimentales (O) correspondientes al Ti-TT sumergido, durante 7 días, en (a) NaH2PO4 (P), (b) NaH2PO4 + CaCl2 (PCa) y (c) NaH2PO4 + CaCl2 + glucosa (PCaG) y resultados obtenidos utilizando las relaciones de Kramers-Kronig (K-K)(+). .. 169

Figura 56. Resultados experimentales (O) correspondientes al Ti-TT sumergido, durante 7 días, en (a) BSA y (b) FBS y resultados obtenidos utilizando las relaciones de Kramers-Kronig (K-K)(+). ............................................................................................................... 170

7. Anexos 231

Figura 57. Curva de crecimiento (a) y diagrama de barras (b) de los osteoblastos Saos-2 en placa de (●) plástico, (▲) Ti-m y (■) Ti-TT. ..................................................................... 179

Figura 58. Imágenes de SEM del Ti-TT con Saos-2 a: a) día 1, b) día 3, c) día 5 y d) día 7 de incubación en el cultivo celular. ..................................................................................... 180

Figura 59. Espectros de alta resolución de XPS del O1s de Ti-TT y de Ti-TT con Saos-2 a diferentes tiempos de incubación una vez retirados los osteoblastos con ultrasonidos. ........................................................................................................................................ 183

Figura 60. Evolución del Ecorr en función del tiempo de incubación para el Ti-TT sumergido, durante 7 días, en la disolución de (■) DMEMc y en (●) presencia de osteoblastos Saos-2. ..................................................................................................................................... 185

Figura 61. Curvas de polarización del Ti-TT sumergido en DMEMc en presencia (●) y ausencia (■) de osteoblastos Saos-2 a los 7 días de ensayo. ........................................................ 186

Figura 62. Curvas de polarización de Ti-TT sumergido durante 1 (■), 3 (●), 5 (▲) y 7 (▼) días en un cultivo de osteoblastos Saos-2. ............................................................................ 187

Figura 63. Diagrama de Bode para el Ti-TT sumergido, durante 1, 3, 5 y 7 días, en DMEMc a) módulo de impedancia, y b) ángulo de fase vs la frecuencia; y en DMEMc en presencia de Saos-2 c) módulo de impedancia y d) ángulo de fase vs la frecuencia. Los símbolos son los resultados experimentales y (―) son los ajustes con los circuitos eléctricos equivalentes e), f) y g). ................................................................................................... 190

Figura 64. Resultados experimentales (O) correspondientes al Ti-TT sumergido en: a) DMEMc y b) DMEMc con Saos-2, y resultados obtenidos utilizando las relaciones de Kramers-Kronig (K-K)(+) para el día 7 de ensayo. ......................................................................... 194

232 7.Anexos

7.6 Índice de tablas

Tabla 1. Tipos de materiales sintéticos, ventajas, desventajas y aplicaciones de biomateriales utilizados en implantes. ...................................................................................................... 1

Tabla 2. Propiedades térmicas del titanio puro.......................................................................... 6

Tabla 3. Comparación de varias especificaciones para el α−Ti comercialmente puro (cp): concentración máxima de aleantes, tensión de ruptura (Tr), límite elástico (Te) y elongación máxima (ε). ...................................................................................................... 7

Tabla 4. Varios tipos de aleaciones de titanio, así como sus respectivas composiciones, estructura cristalina, resistencia a tracción (Rt), límite elástico (Te) y elongación máxima (ε). ....................................................................................................................................... 8

Tabla 5. Principales tratamientos superficiales del titanio y sus aleaciones para aplicaciones biomédicas [16]. ................................................................................................................. 10

Tabla 6. Relación de reactivos utilizados en los ensayos realizados en el presente trabajo. .. 40

Tabla 7. Composición de los distintos medios utilizados para los estudios electroquímicos y nomenclatura de las disoluciones. ................................................................................... 41

Tabla 8. Energía de ligadura y % atómico de los espectros de alta resolución de XPS del O1s, del C1s y del Ti2p para el Ti-Q. ......................................................................................... 82

Tabla 9. Energías de ligadura y % atómico de los espectros de XPS para el Ti-Q después de 7 días sumergido en las disoluciones de NaH2PO4 (P), NaH2PO4 + CaCl2 (PCa), NaH2PO4 + CaCl2 + glucosa (PCaG), NaH2PO4 + CaCl2 + BSA y FBS. .................................................... 90

Tabla 10. Tabla de % atómico de cada elemento, en la superficie de Ti-Q, sumergido durante 7 días en cada uno de los componentes del DMEMc. ..................................................... 95

Tabla 11. Pendientes de Tafel y Ecorr para el Ti-Q a los 7 días de inmersión en cada una de las disoluciones de los componentes del DMEMc. ............................................................... 97

Tabla 12. Ajustes de los resultados experimentales de EIS para el Ti-Q sumergido, durante 7 días, en las disoluciones de NaH2PO4 (P), NaH2PO4 + CaCl2 (PCa) y NaH2PO4 + CaCl2 + glucosa (PCaG). ............................................................................................................... 107

Tabla 13. Ajustes de los resultados experimentales de EIS para el Ti-Q sumergido, durante 7 días, en las disoluciones de BSA y FBS. ........................................................................... 108

Tabla 14. Errores medios calculados, por medio de la expresión (9), de las representaciones de Kramers-Kronig (K-K) con respecto a los resultados obtenidos experimentalmente para el Ti-Q sumergido, durante 7 días, en las disoluciones de NaH2PO4 (P), NaH2PO4 + CaCl2 (PCa), NaH2PO4 + CaCl2 + glucosa (PCaG), BSA y FBS. ........................................... 113

7. Anexos 233

Tabla 15. Ecorr y pendientes de Tafel al séptimo día de ensayo para el Ti-Q sumergido en DMEMc en presencia y ausencia de osteoblastos Saos-2. ........................................... 128

Tabla 16. Ajustes de los resultados experimentales de EIS para el Ti-Q sumergido, durante 1, 3, 5 y 7 días, en la disolución de DMEMc en presencia y ausencia de osteoblastos Saos-2. ..................................................................................................................................... 132

Tabla 17. Errores medios calculados por medio de la expresión (9), de las representaciones de Kramers-Kronig (K-K) con respecto a los resultados obtenidos experimentalmente para el DMEMc en presencia y ausencia de Saos-2 para el séptimo día de ensayo. ..... 134

Tabla 18. Resultados de rugosidad (RMS) del titanio y del titanio después del tratamiento térmico. ........................................................................................................................... 142

Tabla 19. Energías de ligadura y % atómico de los espectros de alta resolución de XPS del O1s y del Ti2p para las muestras de Ti-m y Ti-TT. ................................................................. 143

Tabla 20. Energías de ligadura y % atómico de los espectros de alta resolución de XPS, para el Ti-TT al cabo de 7 días sumergido en las disoluciones de NaH2PO4 (P), NaH2PO4+ CaCl2 (PCa), NaH2PO4+ CaCl2 + glucosa (PCaG), NaH2PO4+ CaCl2 + BSA y FBS. ........................ 147

Tabla 21. Porcentaje atómico de los elementos que aparecen en XPS sobre las superficies de Ti-TT, después de 7 días de inmersión en cada uno de los componentes del DMEMc. 150

Tabla 22. Ecorr y pendientes de Tafel al séptimo día de ensayo para el Ti-TT en cada una de las disoluciones de los componentes del DMEMc. .............................................................. 153

Tabla 23. Ajustes de los resultados experimentales de EIS para el Ti-TT, sumergido, durante 7 días, en las disoluciones de NaH2PO4 (P), NaH2PO4 + CaCl2 (PCa) y NaH2PO4 + CaCl2 + glucosa (PCaG). ............................................................................................................... 164

Tabla 24. Ajustes de los resultados experimentales de EIS para el Ti-TT sumergido, durante 7 días, en las disoluciones de BSA y FBS. ........................................................................... 165

Tabla 25. Ajustes de los resultados experimentales de EIS para el Ti-TT sumergido, durante 7 días, en las disoluciones de BSA y FBS. ........................................................................... 167

Tabla 26. Errores medios calculados, ec. (9), de las representaciones de Kramers-Kronig (K-K) con respecto a los resultados obtenidos experimentalmente para el Ti-TT sumergido, durante 7 días, en las disoluciones de NaH2PO4 (P), NaH2PO4 + CaCl2 (PCa), NaH2PO4 + CaCl2 + glucosa (PCaG), BSA y FBS. ................................................................................. 171

Tabla 27. Energía de ligadura y % atómico de los espectros de XPS para el Ti-TT después de 7 días sumergido en DMEMc y para 1, 3, 5 y 7 días en presencia de Saos-2. ................... 182

Tabla 28. Pendientes de Tafel al séptimo día de ensayo para el Ti-TT sumergido en DMEMc en presencia y ausencia de osteoblastos Saos-2. ........................................................... 189

234 7.Anexos

Tabla 29. Ajustes de los resultados experimentales de EIS del Ti-TT sumergido, durante 1, 3, 5 y 7 días, en la disolución de DMEMc en presencia y ausencia de osteoblastos Saos-2. 191

Tabla 30. Errores medios calculados por medio de la expresión (9), de las representaciones de Kramers-Kronig (K-K) con respecto a los resultados obtenidos experimentalmente para el DMEMc en presencia y ausencia de Saos-2 para el séptimo día de ensayo. ..... 195

Caracterización y estudio electroquímico de superficies de ...

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