Caracterización Molecular Del Fitopatógeno Moniliophthora ...

PROSPECTIVA ISSN EN LÍNEA: 2216-1368- VOLUMEN 19, NO 1,2021

Caracterización Molecular Del Fitopatógeno Moniliophthora Roreri,

Utilizando Marcadores Issr, En Norte De Santander, Colombia.

Molecular Characterization Of The Phytoopathogen Moniliophthora Roreri,

Using Issr Markers, In Norte De Santander, Colombia.

Jessica Blanco Manzano1, Liliana Yanet Suárez Contreras2

1Ingeniero Biotecnológico, Universidad Francisco de Paula Santander, Cúcuta, Colombia 2Magister en biología, énfasis Genética, Laboratorio de Biotecnología Molecular, Departamento

del Ciencias del Medio Ambiente, Universidad francisco de Paula Santander, Cúcuta, Colombia

E mail: [email protected]

Recibido: 17/02/2020

Aceptado: 23/10/2020

http:://doi.org/10.15665/rp.v19i1.2234

RESUMEN

Las regiones del departamento de Norte de Santander, Colombia, cultivadores de cacao presentan la

enfermedad más grave que es la moniliasis causada por el hongo fitopatógeno Moniliophthora roreri.

Inicialmente se llevó a cabo el protocoló de desinfección en la mazorca enferma, se sembró en agar PDA

(papa dextrosa), agar PDA modificado (gentamicina y pulpa de cacao) y agar extracto de malta,

incubándolo por 10 días a una temperatura de 15°C, mostrando mejor crecimiento en agar PDA. Después

se continuó con la extracción de ADN, posteriormente se ratificó la efectividad de muestras conservadas

de monilia aisladas en los municipios de El Zulia, Cúcuta, Tibú, Puerto Santander, Bucarasica, El Tarra,

Teorama y Sardinata de Norte de Santander, una vez comprobada la presencia de ADN por electroforesis

en gel de agarosa, se seleccionaron 24 muestras, luego se estandarizó la técnica de ISSR (inter secuencias

repetidas); para el cual se obtuvieron patrones de bandas en la mayoría de las 27 muestras con los

cebadores 823, 880, 890 y 891, mientras que con el cebador 816, 874 y 885 generaron muy pocas bandas.

Con el empleo de ITS4 y ITS5 se realizó la PCR, los amplicones fueron secuenciados para 2 muestras

aisladas del hongo y arrojo: para el hongo HFa007 un porcentaje de identidad del 97,08%, Diaporthe

pseudomangiferaem y para el hongo HFa009 un porcentaje de 99,29% de identidad para Diaporthe

melonis. Se ejecutó el análisis estadístico, donde se obtuvo un dendograma basado en el coeficiente de Dice,

el cual mostro las relaciones existentes para las 28 muestras estudiadas. La muestra 6d-17 proveniente de

Sardinata se agrupo de forma independiente.

Palabras Clave: Moniliasis, PCR, hongo, Diaporthe pseudomangiferaem, Diaporthe melonis

Cite this article as: J. Blanco Manzano, L. Y. Suarez Contreras

“CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DEL FITOPATÓGENO

Moniliophthora roreri, UTILIZANDO MARCADORES ISSR, EN

NORTE DE SANTANDER, COLOMBIA.”, Prospectiva, Vol 19,

N° 1, 2021.

mailto:[email protected]


ABSTRACT

The regions of the department of Norte de Santander, Colombia, cocoa cultivators have the most serious

disease that is the moniliasis caused by the phytopathogenic fungus Moniliophthora roreri. Initially the

protocol of disinfection was carried out in the diseased ear, then it is sown in PDA agar (potato dextrose),

modified PDA agar (gentamicin and cocoa pulp) and malt extract agar, incubating them for 10 days at a

temperature of 15 ° C, showing better growth in PDA agar. After DNA extraction was continued, the

effectiveness of conserved samples of isolated monilia in the municipalities of El Zulia, Cúcuta, Tibú, Puerto

Santander, Bucarasica, El Tarra, Teorama and Sardinata de Norte de Santander, was later confirmed. the

presence of DNA by agarose gel electrophoresis, 24 samples were selected, then standardized the ISSR

technique (repeated inter sequences); for which they obtained band patterns in most of the 27 samples with

the primers 823, 880, 890 and 891, while with primer 816, 874 and 885 they generated very few bands.

With the use of ITS4 and ITS5 the PCR was performed, sequencing was carried out on 2 isolated samples

of the fungus and yield: for the HFa007 fungus with an identity percentage of 97.08% for Diaporthe

pseudomangiferaem and for the HFa009 fungus a percentage of 99.29% Diaporthe melonis. The statistical

analysis was executed, where a dendogram based on the Dice coefficient was obtained, which showed the

existing relationships for the 28 samples studied. The 6d-17 sample from Sardinata was grouped

independently.

Keywords: Moniliasis, PCR, fungus, Diaporthe pseudomangiferaem, Diaporthe melonis

1. INTRODUCCIÓN

Colombia ha posicionado gran cantidad de productos de la canasta familiar a nivel mundial, ahora tiene

como acompañante en la canasta exportadora al cacao, que en la última década conquistó varios mercados

internacionales, dobló su producción y pasó de tener más exportaciones que importaciones [1]. El grano de

cacao se ha convertido en producto fundamental de la economía de Colombia. A través de procesos

industriales se realiza la transformación de las almendras del cacao obteniendo como productos finales

maquillajes, licores, grasa natural comestible, chocolates y demás artículos elaborados con base de este. Por

otra parte, el cacao al igual que los diversos cultivos desarrolla enfermedades que alteran las funciones

normales de la planta debido a acciones de agentes patógenos o de factores ambientales.

La moniliasis es un problema actualmente común en Colombia, produciendo grandes pérdidas cercanas a

un 50% de la cosecha anual, lo anterior significa que, si la producción para el año 2016 fue del orden de 56

mil 785 toneladas, la monilia destruyó 28 mil 292 toneladas [2]. Esta problemática causa enfermedades en

vainas y en semillas comercialmente importantes que contienen algunas de estas especies, es una

podredumbre del cacao extremadamente destructiva, daños internos y externos a las vainas que resultan en

la pérdida total de este. En el departamento se observó la infección de este hongo en plantas forestales, al

occidente de la cordillera andina de Colombia zona rica en especies de Herrania y Theobroma [3].

Norte de Santander presenta problemas importantes en el cultivo de cacao como: baja producción por

problemas fitosanitarios, escasez de masa crítica, baja mano de obra, baja adopción y transferencia de

tecnología. Razón por la que se ha producido interés por el desarrollo tecnológico en cuanto a variedades,

semillas, manejo integrado de plagas y enfermedades [4,5]. En Colombia se han realizado estudios sobre

la biología molecular del hongo Moniliophthora roreri, con marcadores moleculares como ISSR (Inter

Simple Sequence Repeats), que permite caracterizar este tipo de hongo, con el rápido aislamiento de ADN

genómico puro de alto peso molecular [6]. En este trabajo se estandarizo la técnica molecular de ISSR para

evaluar y caracterizar la diversidad genética del hongo Moniliophthora roreri en Norte de Santander,

Colombia. Al mismo tiempo se planteó revelar las fuentes de variación genética, lo cual servirá de ayuda


para obtener más información sobre este hongo, facilitando el conocimiento para investigaciones futuras,

para implementar manejos que contrarresten esta enfermedad. En Norte de Santander, monilia afecta las

11.655 hectáreas cosechadas por los cacaoteros [7].

2. METODOLOGÍA

RECOLECCIÓN DE MUESTRAS

Se recolectaron muestras de frutos de cacao en la finca la Esmeralda, en la cual algunas mazorcas mostraron

presencia de manchas color café y crecimiento de esporas, síntomas de la enfermedad. Características muy

similares a la presencia del Fitopatógeno Moniliophthora roreri, obtenidos en municipio de El Zulia

(corregimiento de Astilleros). Se emplearon los siguientes pasos en campo: Se clasificaron los árboles que

contenían el fruto enfermo, con papel periódico estéril se tomó el fruto por el lado que no presentaba la

enfermedad y con un cuchillo estéril se cortó el pedúnculo, procediendo a envolver en papel periódico estéril

y luego se guardó en bolsas plásticas [8], rotulando cada bolsa. Después de la recolección se conservaron

en nevera por 3 o 4 días antes de la siembra.

Método de desinfección: Se lavó la mazorca con solución jabonosa y agua estéril, luego se cortó parte de

la epidermis del fruto en trozos de tejido de 0,5 cm en los límites del área enferma con la zona donde no hay

crecimiento fúngico, agregando 3 trozos de tejido por frasco de compota estériles y se procedió a realizar el

protocolo de desinfección empleado por [9], agregando hipoclorito de sodio 2.5% por 2 min, se enjuagó con

agua destilada estéril por 3 min, se agregó alcohol al 60% por 3min, se lavó con agua destilada por 3 min y

por último se secó cada trozo en servilletas. En seguida se procedió a la siembra en los siguientes medios:

800 µl de gentamicina: agar PDA, agar PDA modificado y agar extracto de malta, incubándolos por 10 días

a temperatura de 25°C.

Replicas empleadas para obtener el hongo puro: Se seleccionaron 4 cepas en crecimiento, y se realizaron

una serie de réplicas en agar PDA.

Extracción y verificación de ADN Fúngico: Las 4 cepas HFa007, HFa009, HFa010a y HFa010e

seleccionadas que se encontraban por duplicado en agar PDA (Agar Papa Destroxa), se sembraron en caldo

Dextrosa Saboraud y se incubaron por 10 días a temperatura de 25°C.

Posteriormente con ayuda de baja lenguas estériles se extrajo el hongo, dejándolo en una caja de Petri estéril,

con ayuda de una hojilla estéril se cortó el micelio en pedazos pequeños y se agregó 0.5 g en un microtubo

de 2 ml. Se adicionó 1 volumen (500 µl) de Buffer de Extracción el cual contenía (50 mM Tris-HCl pH:

7.5, 50 mM EDTA (ácido etilendiaminotetraacético), 2% SDS, 1% Na2SO3), se maceró con un pistilo por 1

min, se llevó agitación en el Vórtex por 1 min y se centrifugó a 6000 rpm por10 min. Después de centrifugar,

a cada microtubo se le extrajo el sobrenadante y se agregó a un nuevo tubo de 1.5 ml y se incubó a 70°C

por 15 min. Se le adicionó 1 volumen de fenol-cloroformo y se centrifugó a 10000 rpm durante 10 min. La

parte acuosa se transfirió a otro nuevo tubo de 1.5 ml, agregando 1 volumen de isopropanol y se llevó a 0°C

por 10 min, seguido a esto se llevó a centrifugar a 10000 rpm por 10 min; luego se procedió a descartar por

inmersión el isopropanol, se lavó con etanol al 70% y se centrifugó a 10000 rpm por 10 min, en seguida se

retiró el etanol por inmersión y se dejó secar el precipitado a 37°C. Estando completamente seco, se re-

suspendió en 50 µl Buffer TBE (tris, borato, EDTA) 1x y se guardó en nevera [6].

Para la verificación de la calidad del ADN extraído, se utilizó el gel de agarosa al 0,7% y Gel Red como

intercalante. La electroforesis fue corrida inicialmente a 120 V por 3 min y la corriente final de 110 V por

40 min. Posteriormente, se visualizó el gel en el ChemiDocTM Imaging System de BIO-RAD.

Chequeo de ADN de muestras de Monilia: Se realizó la comprobación de la calidad y cantidad del ADN

de 56 muestras del fitopatógeno conservadas en el laboratorio de Biotecnología Molecular para aplicar el


marcador ISSR. Chequeando las muestras con electroforesis en gel de agarosa, utilizando 9 geles de agarosa

al 0.8%, con una corrida electroforética de 120 V por 30 min y observadas en el ChemiDoc. Escogiendo las

mejores para la continuidad de este trabajo. Y también los ADN fueron cuantificados en el Nanodrop

Thermo Scientific.

Ensayo con el Marcador Molecular ISSR 880: Se realizó la mezcla de PCR Nova Taq® polimerasa,

cantidad para 11 muestras (tabla 1), a cada microtubo se agregaron 18 µl del Mix, y 2 µl del ADN de cada

muestra.

Visualización de los productos de PCR: Se empleó gel de agarosa a una concentración de 1,5% [10]. El

marcador de peso molecular empleado fue de 1Kb, y para la electroforesis la corriente inicial fue de 100 V

por 30 min y la final de 80 V por 10 min [11]. Posteriormente se visualizó el gel en el ChemiDoc.

Tabla 1. Mezcla de reacción utilizada para la PCR, con los cebadores ITS4 e ITS5 [3]. Componentes,

concentración y cantidad para 5 muestras de monilia.

Estandarización de la técnica molecular, ISSR (Inter Simple Sequence Repeat) Se escogieron 24

muestras de ADN de las conservadas, más 3 muestras aisladas, ajustando el cebador correspondiente a cada

mezcla. Luego se llevó al Termociclador MultiGeneTM OptiMax (Labnet) acordando la temperatura de

hibridación adecuada para cada cebador (tabla 2). Posteriormente se realizaron las electroforesis, con gel de

agarosa a una concentración del 2% y una corrida de 80 V por 2 h. Las bandas obtenidas se observaron en

el ChemiDocTM Imaging System de BIO-RAD.

Tabla 2. Temperaturas de alineamiento óptimas de los 7 Cebadores estandarizadas para ISSR.

Cebador Secuencia Tm

Estandarizada Referencia

816 (CA)8T 55 Phillips-Mora, 2003 [11]

823 (TC)7TCC 55 [11]

874 (C)3 TCC CTC CCT CCCT 55 [11]

880 G(GA)2CGACA G(GA)2 50 Aragón y Sánchez [12]

885 BHB (GA)8 55 [11]

890 ACGACTACG(GT)7 64.7 [12]

891 HVH (TG)7 55 [11]

Componentes Concentración

Final

Cantidad (µl) Volumen para

5 muestras

Agua desionizada

estéril

14.8 74.4µl

Buffer 1X 2.5 12.5µl

MgCl 1.5 mM 1.5 7.5µl

Cebador ITS 4 0.5 µM 1.25 6.25µl

Cebador ITS 5 0.5 µM 1.25 6.25 µl

DNTPs 0.2mM 0.50 2.5µl

Suero Fetal Bovino 1 5µl

Taq Polimerasa 0.02 U/µl 2 0.5µl

ADN 1

Total 23.8µl 116µl


3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Recolección de fruto de cacao enfermo: Las 4 Muestras recolectadas en la finca la Esmeralda presentaron

características de la enfermedad de cacao similares a la moniliasis (figura 1) [13].

Figura 1. Frutos de cacao enfermos aparentemente de monilia. Muestras recolectadas: a) HFa007,

b) HFa009a, c) HFa010a y d) HFa010e.

a b c d

Siembra del hongo en medio de cultivo: Después de sembrar los microorganismos en agar PDA, se pudo

apreciar el crecimiento de las cepas como lo muestra la figura 2. Se seleccionaron las cepas HFa007,

HFa009a, HFa010a y HFa010e, las cuales obtuvieron el mejor crecimiento sin presentar contaminación

(figura 2).

Figura 2. Siembra de cortes realizados al fruto de Cacao enfermo para cada muestra en medio PDA.

Muestras: a) HFa007, b) HFa009a, c) HFa010a y d) HFa010e.

a

b

c

d

A partir de las cepas madres se procedió a realizar la purificación mediante repiques sucesivos (figura 3) en

agar PDA, pH 5.6 y se incubaron a 25°C, hasta obtener cepas puras del fitopatógeno. Características

Morfológicas en medio PDA, Aa, Ab y Bb: presentan contaminación; Ac, Ad, Da y Db: borde irregular,

textura suave, tonalidad cremosa, esporulación con anillos centrales; Ba borde irregular, textura polvorienta,


tonalidad blanca, esporulación con anillos centrales; Bc: borde irregular, textura suave, tonalidad cremosa,

esporulación uniforme; Bd: borde irregular, textura suave, tonalidad amarillo cremoso, esporulación con

anillos centrales; Ca y Cb: borde irregular, textura suave, tonalidad café claro, esporulación con anillos

terminales; Cc y Cd: borde irregular, textura suave, tonalidad amarillo cremoso, esporulación con anillos

terminales; Dc y Dd: borde irregular, textura suave, tonalidad amarillo cremoso, esporulación con anillos

centrales.

Figura 3. Replicas sucesivas de las cepas en PDA, para las muestras: HFa007, HFa009a, HFa010a y

HFa010e.

Estas características de textura suave con anillos centrales o terminales de las cepas aisladas (figura 3), de

cacao infectado, son similares al hongo fitopatógeno Moniliophthora roreri, e iguales a las reportadas por

Villamizar y Afanador. [14, 15].

Extracción y visualización del ADN: Se utilizó el protocolo estandarizado por Suárez L. [6] realizando la

extracción de ADN por duplicado a partir de cultivos en PDB (figura 4).

Figura 4. Crecimiento de las cepas en Caldo Papa Dextrosa. Muestras: a) HFa007, b) HFa009a, c)

HFa010a y d) HFa010e.

a

b

c d


Extracciones de ADN: A las 8 cepas seleccionadas se les realizó la extracción del ADN y la electroforesis

en gel de agarosa al 0.7% (figura 5), en el gel se puede observar que todas las muestras analizadas

presentaban una buena cantidad de ADN, y se escogieron las muestras con mejor calidad y cantidad de

ADN (1): HFa007 R1, (4): HFa010e R2 y (7): HFa009 R1.

Figura 5. Electroforesis en gel de agarosa al 0.7% w/v, de las extracciones de ADN para 8 muestras

de monilia. (1): HFa007 R1, (2): HFa007 R2, (3): HFa010e R1, (4): HFa010e R2, (5): HFa010a R1, (6)

HFa010a R2, (7): HFa009 R1, (8): HFa009 R2.

Luego se estableció un orden para cada muestra en la electroforesis teniendo en cuenta el aislamiento con

su nomenclatura y municipio correspondiente (tabla 3). En este mismo orden se mantuvieron las muestras

en la corrida de cada electroforesis. Obteniendo en cada electroforesis los resultados reportados en las

figuras 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, y 14. (figura 6 a la 14). En la figura 6, se aprecia el ADN en el gel de

agarosa al 0.8%. La cantidad y calidad del ADN fue verificada en el Nanodrop, mostrando rangos de ADN

desde 5,3 ng/µl hasta 2.754,2 ng/µl, de las que se eligieron 28 ADN de diversos municipios, relacionados

en la tabla 3. La banda de cada muestra presento una cantidad de ADN y nivel de pureza aceptable.

Figura 6. Extracciones de ADN seleccionadas de monilia, gel de agarosa al 0.8% w/v.


Tabla 3. Municipios y corregimientos del departamento Norte de Santander, donde fueron aisladas las 28

muestras de monilia [16].

PCR. Ensayo con el cebador 880: Las condiciones para la mezcla de PCR fueron las enunciadas en la

tabla 4. Y Los pasos empleados: una Pre-desnaturalización 94°C por 5 min; luego una desnaturalización

94°C por 1 minuto, para el alineamiento del cebador (50°C) por 2 min; después una elongación a 72°C por

30 s y una Extensión final 72°C por 5 min. Se realizó una electroforesis empleando el marcador molecular

ISSR 880, se utilizó el gel de agarosa al 1.5%, seleccionando 6 muestras más de ADN positivos para Monilia

que se encontraban conservados en el laboratorio, más las 3 muestras escogidas inicialmente (figura 5); el

control positivo es la muestra (1): 1a-16. Para las demás electroforesis se cambiaron las muestras 4 y 6

debido a que contenían muy poco ADN (figura 7). En el ensayo con este cebador 880 no amplificaron las

muestras 4, 9 y 10.

Tabla 4. Condiciones de mezcla para la PCR-ISSR [7], para 28 muestras de monilia.

Componentes Concentración

final

Cantidad

(µl)

Volumen para

11 muestras

Volumen para 28

muestras

Agua desionizada estéril 13,5 148,5 µl 405 µl

Buffer PCR (10X) 1X 2 22 µl 60 µl

MgCl (50mM) 3,5 mM 1,4 15,4 µl 42 µl

cebadores (10µM) 0,25 µM 0,5 5,5 µl 15 µl

Dntp´s (10mM) 0,2 mM 0,4 4,4 µl 12 µl

Taq Polimerasa (5µ/µl) 1µ 0,2 2,2 µl 6 µl


Estandarización de la técnica molecular ISSR: Se realizaron electroforesis empleando el gel de agarosa

a una concentración del 2% y una corriente de 80 V por 2 h; seleccionando las 3 muestras iniciales escogidas

(figura 5) mas 24 muestras que se encontraban conservadas en nevera las cuales se comprobó que tenían

gran cantidad de ADN. En la figura 8, se puede observar que con el cebador 880 no amplificaron las

muestras 9, 13, 17, 21, 22, 26, 27 y 28. En la figura 9, se aprecia como con el cebador 890 amplificaron

todas las muestras excepto la 17; igualmente con el cebador 891 (figura 14) amplificaron la mayoría de las

muestras. En la tabla 3, se encuentra la relación de las muestras empleadas en las electroforesis para la

estandarización de la técnica molecular ISSR de cada cebador, con el municipio y corregimiento en donde

fueron recolectados para su posterior aislamiento. En la electroforesis No.5 para el cebador 816 (figura 10)

se observó que con este cebador no amplificaron la mayoría de las muestras y aquellas que lograron

amplificar contenían muy pocas bandas, igualmente con el empleo de los cebadores 823, 874 (amplifico

una sola banda para las muestras 5, 11, 12, 16) y 885.

Figura 7. Electroforesis con el cebador 880, para 9 muestras de monilia en gel de agarosa al 2% w/v.

(1): 1a-16, (2): Ac-1, (3): Ac-9, (4): TI3-41, (5): 5-8, (6): 6+-13, (7): HFa007, (8): HFa010e, (9): HFa009,

(10): Control -, (11): Control +, (12): HyperLadder 1Kb.


(1): 1a-16, (2): Ac-1, (3): Ac-9, (4): 26d+/- - 39, (5): 5-8, (6): 23-20, (7): HFa007, (8): HFa010e, (9):

HFa009, (10): TI-35, (11): 46-4, (12): 6a-15, (13): 6d-17, (14): 8-22, (15): 12(4)-45, (16): 17-19, (17): 19d-

8, (18): 13+-2, (19): 15c-14, (20): 16.-15, (21): 17.-20, (22): 18d-3, (23): 22c-18, (24): 22d-19, (25): 25-27,

(26): 36d-13, (27): 38.-16, (28): Control +, (29): Control -, (30): HyperLadder 1Kb.


(1): 1a-16, (2): Ac-1, (3): Ac-9, (4): 26d+/- - 39, (5): 5-8, (6): 23-20, (7): HFa007, (8): HFa010e, (9):

ADN (25ng/µl) 2,5 ng/µl 2 2 µl 2 µl

Total 20 µl 200 µl 540 µl


HFa009, (10): TI-35, (11): 46-4, (12): 6a-15, (13): 6d-17, (14): 8-22, (15): 12(4)-45, (16): 17-19, (17): 19d-

8, (18): 13+-2, (19): 15c-14, (20): 16.-15, (21): 17.-20, (22): 18d-3, (23): 22c-18, (24): 22d-19, (25): 25-27,


Figura 10. Electroforesis con el cebador 816, para 27 muestras de monilia en gel de agarosa al 2%

w/v. (1): 1a-16, (2): Ac-1, (3): Ac-9, (4): 26d+/- - 39, (5): 5-8, (6): 23-20, (7): HFa007, (8): HFa010e, (9):

HFa009, (10): TI-35, (11): 46-4, (12): 6a-15, (13): 6d-17, (14): 8-22, (15): 12(4)-45, (16): 17-19, (17): 19d-

8, (18): 13+-2, (19): 15c-14, (20): 16.-15, (21): 17.-20, (22): 18d-3, (23): 22c-18, (24): 22d-19, (25): 25-27,




HFa009, (10): TI-35, (11): 46-4, (12): 6a-15, (13): 6d-17, (14): 8-22, (15): 12(4)-45, (16): 17-19, (17): 19d-

8, (18): 13+-2, (19): 15c-14, (20): 16.-15, (21): 17.-20, (22): 18d-3, (23): 22c-18, (24): 22d-19, (25): 25-27,





HFa009, (10): TI-35, (11): 46-4, (12): 6a-15, (13): 6d-17, (14): 8-22, (15): 12(4)-45, (16): 17-19, (17): 19d-

8, (18): 13+-2, (19): 15c-14, (20): 16.-15, (21): 17.-20, (22): 18d-3, (23): 22c-18, (24): 22d-19, (25): 25-27,




HFa009, (10): TI-35, (11): 46-4, (12): 6a-15, (13): 6d-17, (14): 8-22, (15): 12(4)-45, (16): 17-19, (17): 19d-

8, (18): 13+-2, (19): 15c-14, (20): 16.-15, (21): 17.-20, (22): 18d-3, (23): 22c-18, (24): 22d-19, (25): 25-27,




HFa009, (10): TI-35, (11): 46-4, (12): 6a-15, (13): 6d-17, (14): 8-22, (15): 12(4)-45, (16): 17-19, (17): 19d-

8, (18): 13+-2, (19): 15c-14, (20): 16.-15, (21): 17.-20, (22): 18d-3, (23): 22c-18, (24): 22d-19, (25): 25-27,



El contenido de información polimórfica (PCI por sus siglas en inglés, Polymorphism Content Value) se

calculó con la fórmula: PIC = 2Pi (1-Pi) donde Pi es la frecuencia de ocurrencia de bandas polimórficas en

diferentes cebadores [17]. El valor PIC provee una medida influenciada por el número y frecuencia de alelos,

el valor máximo de PIC para un marcador ISSR es 0.5, se asume la presencia de dos alelos por locus en un

análisis de ISSR [18]. Los valores de PIC fueron altos a pesar de la existencia de bajos porcentajes de

polimorfismo, debido al rango de cantidad de bandas amplificadas por cada cebador (tabla 5). Para el

cebador 880 se obtuvo un número de bandas de 45 y para el 874 se logró un número menor de bandas de 8,

ver tabla 5.

Tabla 5. Número de bandas amplificadas, porcentaje de polimorfismo y valor PIC de cada cebador

utilizado. (El PIC hace referencia al contenido de información del polimorfismo).

Cebador Número de bandas

amplificadas

Porcentaje de

polimorfismo Valor PIC Rango de amplificación

880 45 12 0,21 400-2577 pb

816 23 4,8 0,09 335-1681 pb

874 8 4,6 0,09 208-2386 pb

885 14 5 0,1 333-3388 pb

823 28 7 0,13 471-1980 pb

890 40 16 0,27 211-3960 pb

891 32 14,4 0,25 268-2699 pb

Media 27 9 0,15

Análisis de secuenciación para el hongo aislado: Además, se realizó la mezcla de reacción utilizada para

la PCR-ITS 4 y 5 para un volumen de 5 muestras (tabla 1) y así se seleccionaron las dos muestras HFa007

y HFa009 para la secuenciación. Dado los resultados obtenidos de la secuenciación para las muestras

HFa007 y HFa009 arrojo: con el empleo del ITS 5 para el hongo HFa007 se observó un porcentaje de

identidad del 97.08% para Diaporthe pseudomangiferae, con el ITS 4 para el hongo HFa009 se observó un

porcentaje de 99.29% de identidad para Diaporthe melonis.

Tabla 6. Resultados de secuenciación de 2 cepas: identificación, valores E-value, porcentaje de identidad

de las secuencias analizadas utilizando la base de datos NCBI con accesión.

Código Género y especie Valor E % de identidad Accesión

HFa007 Diaporthe pseudomangiferae 0.0 97.08% MG576129.1

HFa009 Diaporthe melonis 0.0 99.29% MG661731.1

Las especies de Diaporthe y sus estados asexuales Phomopsis tienen amplios rangos de hospedadores y

están ampliamente distribuidos, y se presentan como patógenos de plantas, endófitos o saprobios, pero

también como patógenos de humanos y otros mamíferos. Diaporthe sp. son responsables de enfermedades

en una amplia gama de plantas hospederas, algunas de las cuales son económicamente importantes en todo

el mundo, causando pudriciones de raíces y frutos, muerte regresiva, chancros, manchas en las hojas,

tizones, pudrición y marchitez [19].


Análisis estadístico de los resultados de ISSR: La presencia o ausencia de cada banda observada en el

perfil de cada primer del análisis ISSR se plasmó en una matriz de uno (1) y cero (0), todas las bandas mono-

mórficas y polimórficas fueron consideradas para el análisis, incluyendo la muestra +control. Se realizó una

matriz de similaridad utilizando el coeficiente de Dice. Promedio (Average linkage): Correlación

cofenética= 0,962. Variables estandarizadas: Casos leídos 190, casos omitidos 0.

Además, para establecer las distancias genéticas en el dendrograma se usó el método UPGMA (Unweighted

Pair Group Method with Arithmetic Mean) y la distancia de Dice [20,21], y se halló el coeficiente de

correlación cofenético a fin de determinar la confiabilidad del análisis de agrupamiento. También, la

información binaria fue sujeta a un análisis de coordenadas principales o escalamiento multidimensional

(EMD). Todos los análisis estadísticos fueron realizados usando el programa estadístico Info-Gen 2013

[22].

Figura 15. Matriz de similaridad de Dice para 28 muestras del hongo Moniliophthora roreri, de Norte de

Santander. Donde un valor de 1.0 indica que el cebador es capaz de discriminar entre todas las muestras y

un valor de 0.0 indica que todas las muestras son idénticas.

Figura 16. Dendograma para 28 muestras del hongo Moniliophthora roreri, basado el método de

agrupamiento UPGMA y el coeficiente de similaridad de Dice.

1a-1

6

Ac-

1

Ac-

9

26d+

/- -3

9

05-a

go

23-2

0

HFa

007

HFa

010e

HFa

009a

TI-

35

46-4

6a-1

5

6d-1

7

ago-

22

12(4

)-45

17-1

4

19d-

8

13+-

2

15c-

14

16-1

5

17-2

0

18d-

3

22c-

18

22d-

19

25-2

7

36d-

13

38-1

6

Con

trol

+

1a-16 0

Ac-1 0,89 0

Ac-9 0,86 0,55 0

26d+/- -39 0,79 0,93 0,92 0

05-ago 0,93 0,92 0,93 0,9 0

23-20 0,83 0,94 0,9 0,92 0,83 0

HFa007 0,88 0,96 0,95 0,86 0,88 0,89 0

HFa010e 0,88 0,93 0,91 0,88 0,9 0,88 0,63 0

HFa009a 0,94 0,94 0,96 0,95 0,98 0,96 0,96 0,97 0

TI-35 0,9 0,94 0,98 0,97 0,93 0,93 0,95 0,93 0,72 0

46-4 0,93 0,93 0,93 0,95 0,89 0,95 1 0,96 0,88 0,98 0

6a-15 0,89 0,91 0,93 0,96 0,81 0,89 0,94 0,96 0,88 0,82 0,91 0

6d-17 0,95 0,92 0,96 0,98 1 0,98 0,95 0,95 0,93 0,98 1 0,96 0

ago-22 0,97 0,95 0,91 0,91 0,9 0,96 0,93 0,93 0,96 0,96 0,95 0,95 0,96 0

12(4)-45 0,9 0,95 0,96 0,94 0,95 0,91 0,88 0,93 0,97 0,96 0,95 0,96 0,93 0,9 0

17-14 0,83 0,9 0,92 0,89 0,85 0,85 0,91 0,87 0,95 0,97 0,98 0,9 0,98 0,93 0,91 0

19d-8 0,88 0,87 0,91 0,87 0,95 0,9 0,93 0,93 0,6 0,85 0,86 0,83 0,94 0,96 0,97 0,93 0

13+-2 0,83 0,89 0,89 0,9 0,89 0,94 0,91 0,91 0,97 0,98 0,91 0,93 0,91 0,86 0,91 0,95 0,9 0

15c-14 0,91 0,98 0,98 0,93 0,92 0,93 0,95 0,97 0,99 0,85 0,95 0,94 0,96 0,96 0,96 0,98 0,99 0,95 0

16-15 0,89 0,96 0,96 0,91 0,95 0,93 0,95 1 0,97 0,91 0,95 0,94 0,96 0,93 0,93 0,98 0,99 0,98 0,68 0

17-20 0,92 0,94 0,98 0,93 0,97 0,94 0,93 0,94 0,36 0,71 0,87 0,86 0,94 0,99 0,99 0,94 0,66 0,93 0,94 0,96 0

18d-3 0,92 0,93 0,96 0,95 0,98 0,95 0,96 0,98 0,3 0,75 0,88 0,89 0,92 0,95 0,95 0,95 0,61 0,94 0,99 0,99 0,4 0

22c-18 0,91 0,94 0,95 0,93 0,92 0,95 0,92 0,97 0,99 0,93 0,98 0,96 0,92 0,88 0,89 0,88 0,99 0,95 0,76 0,88 0,97 0,96 0

22d-19 0,86 0,94 1 0,95 0,96 0,95 0,97 0,97 0,74 0,44 0,98 0,82 0,98 0,98 0,98 0,97 0,86 0,97 0,79 0,86 0,71 0,75 0,93 0

25-27 0,92 0,88 0,88 0,94 0,91 0,92 0,94 0,91 0,98 0,9 0,98 0,97 1 0,91 0,92 0,9 0,96 0,9 0,9 0,77 0,99 0,98 0,87 0,92 0

36d-13 0,92 0,9 0,92 0,92 0,98 0,97 0,98 0,95 0,38 0,74 0,87 0,88 0,97 0,99 0,95 0,91 0,65 0,96 0,99 0,99 0,36 0,36 0,99 0,74 0,96 0

38-16 0,93 0,95 0,99 0,95 0,97 0,96 0,96 0,98 0,28 0,72 0,88 0,88 0,92 0,96 0,97 0,95 0,61 0,95 0,96 0,96 0,33 0,28 0,95 0,74 0,99 0,38 0

Control+ 0,88 0,95 0,96 0,9 0,88 0,91 0,91 0,88 0,98 0,91 0,96 0,95 0,97 0,87 0,87 0,84 0,96 0,91 0,89 0,9 0,99 0,98 0,77 0,94 0,86 0,97 0,98 0


Con base en el análisis de ISSR se construyó un dendograma de similitud (figura 16), en el cual se apreciaron

3 grupos genéticos I, II, III con un nivel de similitud de 0,962. El grupo I con una distancia genética de

0.93, con un total de 16 muestras, de las cuales se generaron dos subgrupos (Ia y Ib), el primero (Ia) agrupo

los aislamientos 1a-16 (El Zulia), 26d+/--39 (Cúcuta), 23-20 (Bucarasica), 17-14 (Teorama), HFa007

(Astilleros), HFa0010e (Astilleros), Ac-1 (Agua clara), Ac-9 (Agua clara), 8-22 (Bucarasica), 13+-2

(Bucarasica), 12(4)-45 (Teorama); el segundo (Ib) los aislamientos15c-14 (Agua clara), 16-15 (Agua clara),

25-27 (Agua clara), 22c-18 (El Tarra). El grupo II con una distancia genética de 0,95, está conformado por

los subgrupos (IIa y IIb), el grupo IIa contiene los aislamientos 5-8 (Cúcuta), 6a-15 (Sardinata), 46-4

(Cúcuta); el grupo IIb los aislamientos HFa009a (Astilleros), 18d-3 (Sardinata), 38-16 (Bucarasica), 17-20

(Teorama), 36d-13 (Tibú), 19d-8 (El Zulia), TI-35 (Tibú), 22d-19 (El Tarra). El grupo III con una distancia

genética de 0,97, contiene el aislamiento 6d-17 (Sardinata).

Figura 17. Análisis de escalamiento multidimensional (EMD) para 28 muestras del hongo Moniliophthora

roreri, de Norte de Santander.

4. CONCLUSIONES

• Las características morfológicas presentes en el hongo aislado de cacao enfermo como sus anillos

centrales o terminales, su textura suave, son características similares al género Moniliophthora

roreri. Sin embargo, al realizar la secuenciación arrojo que el hongo HFa007 con el empleo de ITS

es Diaporthe pseudomangiferae con un 97.08% de identidad y el hongo HFa009 con un porcentaje

de 99.29% de identidad para Diaporthe melonis.

• Los cebadores ISSR, mostraron ser una herramienta eficaz para manejar especies estrechamente

relacionadas. Los cebadores 823, 880, 890 y 891 presentaron mayor número de bandas; los 816,

874 y 885 no proporcionaron un patrón claro de amplificación. En el análisis estadístico la muestra

6d-17 recolectada en el municipio de Sardinata en Norte de Santander se agrupo de forma

independiente en el dendograma, indicando que esta muestra del fitopatógeno no es similar a las

otras muestras aisladas en otros municipios y pertenece a grupos genéticos separados.

AGRADECIMIENTOS

AL FINU, por parte de la financiación de este proyecto. A FEDECACAO. A los ingenieros: Leidy Jhoana

Moreno y Ricardo Alarcón, por su colaboración.


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