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i CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE UNA COLECCIÓN NÚCLEO DE GERMOPLASMA DE MANÍ (Arachis hypogaea L.) MEDIANTE EL EMPLEO DE MARCADORES MICROSATÉLITES
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CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE UNA COLECCIÓN
NÚCLEO DE GERMOPLASMA DE MANÍ (Arachis hypogaea
L.) MEDIANTE EL EMPLEO DE MARCADORES
MICROSATÉLITES
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Universidad Nacional de Villa María
IAP Ciencias Básicas y Aplicadas Título del Trabajo Final de Grado: CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE UNA COLECCIÓN NÚCLEO DE GERMOPLASMA DE MANÍ (Arachis hypogaea L.) MEDIANTE EL EMPLEO DE MARCADORES MICROSATÉLITES. Autor: Funes, Florencia Nadia.
Director: Dra. Moreno, María Valeria.
Codirector: Dr. Baldessari, Jorge Javier.
Aprobado y corregido de acuerdo con las sugerencias del Tribunal evaluador (Art. Nº 15, Res. Nº 48/2000 del Consejo Superior)
Nombre y apellido
______________________
Firma
_____________________________________
Nombre y apellido
______________________
Firma
_____________________________________
Nombre y apellido
______________________
Firma
Aprobado y corregido de acuerdo con las sugerencias del Asesor (Art. Nº
2, Res. 77/2006 del Consejo Directivo IAP Ciencias Básicas y Aplicadas)
_____________________________________
Nombre y apellido
______________________
Firma
Lugar y fecha de aprobación:
iii
Universidad Nacional de Villa María
Instituto Académico- Pedagógico de Ciencias
Básicas y Aplicadas
Trabajo Final de Grado para optar el Título de
Ingeniero Agrónomo
CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE UNA COLECCIÓN
NÚCLEO DE GERMOPLASMA DE MANÍ (Arachis hypogaea
L.) MEDIANTE EL EMPLEO DE MARCADORES
MICROSATÉLITES
Autor
Funes Florencia Nadia
Director
Dra. Moreno María Valeria
Codirector
Dr. Jorge Baldessari
Villa María, Córdoba
Noviembre 2017
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ÍNDICE
Pág.
1 INTRODUCCIÓN .......................................................................................1
2 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA .....................................................................4
2.1 Producción de maní en el mundo ...................................................4
2.2 Origen del maní ..............................................................................4
2.3 El maní como alimento ...................................................................5
2.4 Descripción botánica ......................................................................6
2.5 Clasificación taxonómica ................................................................7
2.6 Mejoramiento genético de maní ......................................................8
2.7 Marcadores moleculares .................................................................9
2.7.1 Marcadores microsatélites y sus aplicaciones ..................... 10
3 HIPÓTESIS .............................................................................................. 13
4 OBJETIVOS ............................................................................................. 14
4.1 Objetivo general ............................................................................ 14
4.2 Objetivos específicos .................................................................... 14
5 MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................... 15
5.1 Material vegetal ............................................................................ 15
5.2 Experimento en campo ................................................................. 15
5.2.1 Sitio experimental ................................................................ 15
5.3 Experimento en laboratorio ........................................................... 16
5.3.1 Muestreo de material ........................................................... 16
5.3.2 Extracción de ADN .............................................................. 16
5.3.3 Evaluación de calidad, integridad y cuantificación del ADN 17
5.3.4 Reacción de la cadena de la polimerasa ............................. 17
5.3.5 Análisis de datos ................................................................. 18
6 RESULTADOS Y DISCUSIÓN ................................................................ 20
7 CONCLUSIONES .................................................................................... 26
8 CONSIDERACIONES FINALES .............................................................. 27
9 BIBLIOGRAFÍA ....................................................................................... 28
10 ANEXO .................................................................................................. 38
v
ÍNDICE DE TABLAS
Pág.
Tabla 1. Medidas de diversidad genética por locus y promedio……….. 22
Tabla 2. Resultados del AMOVA………………....................................... 25
vi
ÍNDICE DE FIGURAS
Pág.
Figura 1. Campo experimental…………………………………………….. 15
Figura 2. Muestreo de hojas………………............................................. 16
Figura 3. Extracción de ADN………………………………………………. 17
Figura 4. Electroforesis vertical en geles de poliacrilamida……....……. 18
Figura 5. Imagen tomada en el ensayo de campo para establecimiento
y multiplicación de la CNM…………………………….....
20
Figura 6. Imagen de los geles de poliacrilamida al 6% de los tres SSR
analizados para la entrada 1138 perteneciente a la
CNM….....................................................................................................
21
Figura 7. Identificación de las plantas seleccionadas para su
cosecha……………………………………………………………………......
21
Figura 8. Dendrograma obtenido en base a distancias de Nei con el
método de agrupamiento NJ…….....…………………………………........
24
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ÍNDICE DE ABREVIATURAS
AMOVA: Análisis Molecular de la Varianza
CMIM: Colección de Germoplasma de Maní de INTA-EEA Manfredi
CNM: Colección Núcleo de Maní
DArT: Diversity Array Technologies
EST: Expressed Sequence Tags
EEA: Estación Experimental Agropecuaria
INTA: Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria
PCR: Reacción en cadena de la polimerasa
Phi: Coeficiente de correlación de variabilidad molecular entre individuos
dentro de una misma población y de diferentes poblaciones.
PIC: Contenido de información polimórfica
SNP: Polimorfismo de nucleótido simple
SSR: Marcadores microsatélites, del inglés Simple Sequence Repeats
UE: Unión Europea
Var: variedad
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CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE UNA COLECCIÓN
NÚCLEO DE GERMOPLASMA DE MANÍ (Arachis hypogaea L.)
MEDIANTE EL EMPLEO DE MARCADORES MICROSATÉLITES
Autor: Funes, Florencia
Directora: Dra. María Valeria Moreno
Codirector: Dr. Baldessari, Jorge Javier
RESUMEN
Una colección de germoplasma constituye un recurso valioso como
fuente de alelos para ser usados en mejoramiento genético. Dado que éstas
son demasiado grandes, se dificulta su aprovechamiento de forma óptima.
Debido a ello se constituyen poblaciones de trabajo más pequeñas conocidas
como colecciones núcleo. La colección de germoplasma de maní de la
estación experimental de INTA Manfredi (CMIM) cuenta con 3443 entradas
activas provenientes de 40 países, principalmente de Sudamérica. En este
trabajo se caracterizó genotípicamente la colección núcleo de maní (CNM)
cultivado de la Estación Experimental del Instituto Nacional de Tecnología
Agropecuaria Manfredi (INTA- EEA Manfredi) formado por 154 accesiones
que representan el 4% de la colección total. Para establecer la población de
trabajo se seleccionó un individuo representativo dentro de cada entrada
mediante el uso de 3 marcadores microsatélites (SSR) altamente polimórficos.
El individuo seleccionado fue aquel que portó el alelo de mayor frecuencia
dentro de cada entrada para cada SSR analizado. Se obtuvo un valor de
diversidad genética elevado (0,82) y se generó un árbol que conglomeró 2
grupos y 5 subgrupos. El análisis del AMOVA evidenció que la variación
genética dentro de las subespecies fue alta (93,1%; p < 0,0001) a diferencia
de lo que sucedió entre las mismas. El valor del coeficiente PhiST fue de 0,07;
evidenciando que el factor subespecie originó un patrón de estructuración o
diferenciación bajo. Este estudio preliminar se considera importante para
conocer la diversidad existente en los materiales almacenados en la colección
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núcleo, los cuales serán utilizados posteriormente por el programa de
mejoramiento para la búsqueda de tolerancia al carbón del maní y de otros
caracteres de interés a mediano plazo.
Palabras clave: germoplasma, maní, colección núcleo, microsatélites.
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CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE UNA COLECCIÓN
NÚCLEO DE GERMOPLASMA DE MANÍ (Arachis hypogaea L.)
MEDIANTE EL EMPLEO DE MARCADORES MICROSATÉLITES
Autor: Funes, Florencia
Directora: Dra. María Valeria Moreno
Codirector: Dr. Baldessari, Jorge Javier
ABSTRACT
A germplasm collection constitutes a valuable resource for supplying
alleles that can be used in breeding. Because these collections are too large,
it is difficult to use them optimally so smaller work populations are developed.
They are known as core collections. The peanut germplasm collection stored
at the INTA Manfredi Experimental Station (CMIM) has 3443 active entries
from 40 different countries, mainly from South America. In this work the peanut
germplasm core collection (CNM) of Experimental Station Manfredi National
Agricultural Technology Institute (INTA-EEA Manfredi) conformed by 154
entries representing 4% of total collection was genotyped. To establish the
work population one representative individual was selected within each entry
using 3 highly polymorphic microsatellite markers (SSR). The selected
individual was the one who carried the highest frequency allele within each
entry for each SSR analyzed. A high genetic diversity value was obtained
(0.82) and a tree was generated that conglomerated 2 groups and 5
subgroups. AMOVA showed that genetic variation within subspecies was high
(93.1%, p<0.0001), but not between them. PhiST value was 0.07, evidence that
subspecies gave low differentiation. This work is greatly important as a
preliminary study to know the diversity in the materials stored at this core
collection. CNM will be used later by Manfredi´s breeding program for
evaluation of peanut smut tolerance and other characters of interest in the
medium term.
Keywords: germplasm, peanut, core collection, microsatellite.
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CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE UNA COLECCIÓN
NÚCLEO DE GERMOPLASMA DE MANÍ (Arachis hypogaea L.)
MEDIANTE EL EMPLEO DE MARCADORES MICROSATÉLITES
Autor: Funes, Florencia
Directora: Dra. María Valeria Moreno
Codirector: Dr. Baldessari, Jorge Javier
1 INTRODUCCIÓN
En Argentina el maní (Arachis hypogaea L.) constituye una economía
regional prácticamente abocada a la exportación principalmente por su calidad
confitera y la adaptación a los requerimientos mundiales para su
comercialización. Se concentra en las provincias de Córdoba (91,2%), La
Pampa (5%) y San Luis (4,4%), existiendo producciones marginales en
algunos departamentos de Salta (0,4%) y Santa Fe (0,1%) (Blengino, 2014).
La producción se destina 60% a la elaboración de maní tipo confitería y 20%
a la industria aceitera, dentro de la cual 40% se utiliza para la elaboración de
aceite y pasta de maní y 60% para pellets o harinas. El 89% se comercializa
en el mercado externo y el resto se emplea para consumo local (Blengino,
2015).
En la campaña 2015/16 se sembraron 313.500 ha, de las cuales se
cosecharon 270.250 ha con una producción total de 859.200 t. Mientras que
para el 2017 se estima una superficie sembrada de 319.400 ha, lo cual
correspondería a una cosecha de 1.136 mil t (Cámara Argentina del Maní,
2017).
El maní pertenece al orden Fabales, familia Fabaceae, género Arachis.
Dicho género está compuesto por 80 especies, las cuales se agrupan en 9
secciones, de acuerdo a la morfología, la distribución geográfica y la
capacidad de producir híbridos fértiles (Valls y Simpson, 2005). Su origen es
sudamericano, puntualmente en los departamentos de Tarija y Chuquisaca
(Bolivia) donde se registran los caracteres más primitivos del maní cultivado.
La distribución de las restantes especies abarca a Bolivia, Paraguay, Brasil,
2
Perú, Argentina y Ecuador (Valls et al., 1994). Es una especie tetraploide
originada por la unión (hibridación) de gametas de 2 especies diploides con
genomas distintos, dando lugar a un híbrido estéril en el que se habría
producido duplicación espontánea de los cromosomas para restaurar la
fertilidad (Kochert et al., 1991; Jung et al., 2003; Seijo et al., 2004).
Actualmente la hipótesis más aceptada, basada en evidencias cromosómicas,
corresponde al origen único del maní cultivado resultante entre el cruzamiento
de Arachis ipaensis (donadora del genoma BB) y Arachis duranensis
(donadora del genoma AA) (Krapovickas, 2004; Moretzsohn et al., 2006).
Dado que es un cultivo con reducida variabilidad genética, su mejoramiento
se vuelve dificultoso. Esta situación origina un aumento de la vulnerabilidad
de los nuevos cultivares a factores bióticos (enfermedades y plagas) y
abióticos (sequía, salinidad, toxicidad por aluminio, etc) (Plucknett et al., 1987;
Van de Wouw et al., 2009).
La producción de maní es afectada actualmente por carbón, producida
por el hongo Thecaphora frezii Carranza et Lindquist exclusiva en Argentina.
Esta patología produce una baja, hasta del 60%, en cuanto a la rentabilidad
del cultivo además de perdurar en los lotes, afectando campañas sucesivas
(Pastor et al., 2014). Una estrategia importante en la búsqueda de fuentes de
resistencia para esta enfermedad es recurrir a una colección núcleo de
germoplasma del cultivo en cuestión. De este modo, la misma, constituye el
primer paso en la detección de alelos deseables para el mejoramiento porque
permite evaluar los atributos genéticos de diversos recursos, ya sean
microbiológicos, vegetales o animales, de manera más rápida y económica
(Holbrook et al., 1993). Su construcción tiene como objetivo representar la
mayor parte de la diversidad genética de las entradas almacenadas en un
banco de germoplasma, minimizando el número de repeticiones (Frankel,
1984).
En este sentido, la Colección de Germoplasma de Maní de INTA-EEA
Manfredi (CMIM) del Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria de la
Estación Experimental Agropecuaria Manfredi (INTA-EEA Manfredi) posee
3.443 entradas activas de la especie cultivada (A. hypogaea) y 40 especies
de maní silvestre. Ésta es de sumo valor debido a su tamaño y a que la
3
mayoría de las entradas fueron recolectadas en el centro de origen de
diversidad (Sánchez et al., 2010). Disponer de información sobre la
composición genética de las entradas facilita la toma de decisiones para la
recolección y conservación de material, con el fin de agregar valor a los
recursos genéticos disponibles en una especie determinada y optimizar el
fitomejoramiento.
En este trabajo se pretende conformar y caracterizar genotípicamente
una colección núcleo de maní a través del uso de microsatélites. Esta
investigación se considera importante como estudio preliminar para conocer
la diversidad existente en los materiales almacenados en la colección núcleo,
los cuales serán utilizados posteriormente por el programa de mejoramiento
para la búsqueda de tolerancia al carbón del maní.
4
2 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
2.1 Producción de maní en el mundo
El maní es una planta perteneciente a la familia de las leguminosas
originaria de la región andina del noroeste Argentino y sureste de Bolivia
(García et al., 2005).
La producción mundial de maní con cáscara ronda las 41 millones de t
y está liderada por China (41% de la producción total), seguida por India (14%
del total). China ha conseguido posicionarse como primer productor y
exportador de maní en el mundo aprovechando sus ventajas comparativas en
términos de condiciones de suelos, altos rendimientos y disponibilidad de
mano de obra a bajo costo. Sin embargo, no ha avanzado en tecnología y
caracteres de calidad de grano. Si bien el volumen producido en Argentina es
relativamente bajo (2%), el reducido tamaño del mercado interno le permite
exportar prácticamente la totalidad de la producción al mercado internacional
(Blengino, 2014).
En el país anualmente se siembran entre 300 y 350 mil ha de maní, de
las cuales más de 90% pertenecen a la provincia de Córdoba. Esta situación
se debe principalmente a que posee un clima propicio para evitar el desarrollo
de aflatoxinas, principal requerimiento de calidad y sanidad exigido por la
Unión Europea (UE). El rendimiento promedio oscila entre 3,3 y 3,5 t de maní
por ha, representando aproximadamente 1 millón de t anuales (Pedelini,
2012).
2.2 Origen del maní
El maní es originario de las regiones tropicales de América del Sur,
donde algunas especies crecen de modo silvestre (Álava et al., 2012). El
territorio correspondiente al sureste de Bolivia y al noroeste Argentino, es
donde se encuentran las especies diploides que dieron origen al maní
cultivado tetraploide. Probablemente, la domesticación de la especie se ha
llevado a cabo en esta zona alrededor de 6 a 7 mil años atrás, por parte de
cazadores y recolectores durante el proceso de agriculturización. Se cree que
5
luego fue introducido en África por exploradores portugueses y, en Asia y
Europa, por colonizadores españoles (Ferguson et al., 2004; Williams et al.,
2006). Se estima que su utilización se remonta a más de 3 mil años, ya que
se encontró en tumbas indígenas del Perú que datan de esa época. Por ello
se infiere que seguramente el maní formaba parte del grupo de alimentos
habituales y que, desde allí, fue difundido en el continente por los indígenas
americanos (Álava et al., 2012).
2.3 El maní como alimento
El consumo local de maní es de aproximadamente 250 g per cápita por
año, muy por debajo del registrado en los países de consumo tradicional como
en Holanda donde ronda los 5 kg per cápita (Álava et al., 2012).
El maní, por sus altos contenidos de aceite, proteínas, vitaminas,
minerales y múltiples usos, es una excelente fuente alimenticia humana y
animal. Contribuye en la dieta con 30% de proteínas y 50% de grasas
insaturadas que disminuyen el colesterol, siendo muy rico en vitamina E y
minerales como sodio, potasio, hierro, magnesio, yodo, cobre y calcio (Álava
et al., 2012). La planta se aprovecha en forma integral para el consumo: las
semillas se ingieren crudas, tostadas o como confituras, mientras que su
follaje se utiliza en forraje fresco o ensilado. De la semilla se extrae el aceite
y un subproducto denominado “torta” prensada de maní que es rica en
proteínas digeribles. Además se obtiene por molienda harina de maní, la cual
es utilizada como concentrado para la alimentación animal. Las cáscaras
sirven como combustible, fibra cruda para forraje, producción de celulosa o
para compostaje (Augstburger et al., 2000). Asimismo, se han desarrollado
procesos a partir de la cáscara de maní para la generación de energía
eléctrica y la producción de carbón activado, agregando mayor valor a la
cadena y reduciendo la contaminación a lo largo del proceso productivo
(Blengino, 2014).
Los usos para alimentación humana en la industria local varían entre
copetín, insumo para la elaboración de chocolates y otros productos de
confitería (Blengino, 2014). El maní en grano es empleado de diferentes
formas tales como tostado, tostado y salado, repelado (o blanqueado) y
6
posteriormente tostado y salado, garrapiñado y en forma de manteca o pasta
de maní. Para el caso del maní con cascara se recurre al tostado, tostado y
salado o hervido y salado (Pereira, 1995).
2.4 Descripción botánica
Arachis hypogaea es una especie anual, herbácea, de porte erecto,
semierecto o rastrero. El sistema radicular está formado por una raíz principal
pivotante, aunque puede desarrollar raíces laterales. La profundidad que
puede alcanzar depende de las características del suelo, del clima y del
cultivar (Giambastiani, 2009; Valladares, 2010).
Es común la presencia de nódulos producidos por simbiosis con
Rhizobium leguminosarum con el objetivo de favorecer la fijación de nitrógeno
atmosférico. El eje central de la planta es siempre erecto llegando a 80 cm de
altura, puede ser de color verde o púrpura y presenta pilosidades en su
superficie. Puede tener inflorescencias, como es el caso del maní tipo
Valencia y Español, o no, como en el maní tipo Virginia. Presenta tallo
anguloso cuando es joven y se torna cilíndrico al envejecer, la médula central
desaparece con el tiempo y los tallos se vuelven huecos. Las ramas
secundarias pueden ser erectas, rastreras o intermedias. Los nudos pueden
ser vegetativos, cuando dan origen a una rama, o bien reproductivos, cuando
en ellos se forman las inflorescencias. La distribución de estos nudos da lugar
a dos tipos de ramificación: secuencial y alternada. Teniendo en cuenta esto,
los diferentes portes y sistemas de ramificación originan distintos tipos de
distribución de los frutos en el suelo (Giambastiani, 2009; Valladares, 2010).
Las hojas son pinnadas compuestas, con 2 pares de foliolos ovalados
opuestos de forma más o menos elíptica que alcanzan un tamaño de 4 a 8
cm. En la base del pecíolo se observan dos estípulas angostas, alargadas y
puntiagudas. Las inflorescencias se sitúan en las axilas de las hojas inferiores
o intermedias y se presentan en racimos de 3 a 5 flores, de las cuales sólo 1
o 2 alcanzan la madurez. Las flores son amarillas están constituidas por el
cáliz, el cual consta de 5 sépalos soldados por su base a un tubo calicinal
pubescente. En la parte superior de este tubo se ubica la corola, constituida
por un pétalo libre denominado estandarte, 2 pétalos denominados alas y
7
otros 2 unidos por una sutura longitudinal que integran la quilla. El androceo
contiene en total 10 estambres, 9 de ellos están unidos en su parte basal y el
restante es libre. El gineceo contiene el ovario, el estilo y el estigma. Tanto el
gineceo como el androceo están dentro de la quilla, por lo que la planta se
considera hermafrodita, con una tasa de autofecundación alrededor del 97%,
clasificándose como autógama (Pérez Juárez, 2007).
Tras la fecundación, la base del ovario se alarga generando una
estructura denominada comúnmente “clavo” que se desarrolla hacia el suelo,
la cual acabará enterrándose y transformándose en el fruto denominado
comúnmente “caja”. Los frutos son indehiscentes, constituidos por una
cubierta llamada pericarpio y pueden contener hasta 5 semillas, aunque
generalmente sólo se desarrollan 2 o 3 (Valladares, 2010; Pérez Juárez,
2007). El pericarpio está formado por 3 capas de tejidos: exocarpio,
mesocarpio y endocarpio. Las semillas son alargadas o redondeadas y con
tegumento muy delgado (Giambastiani, 2009). El color del tegumento puede
ser blanco, rosado, rojo, violáceo o negro y, a su vez, puede ser liso o
jaspeado (Pérez Juárez, 2007).
2.5 Clasificación taxonómica
El maní pertenece al reino Plantae, división Magnoliophyta, clase
Magnoliopsida, es del orden Fabales, de la familia Fabaceae y subfamilia
Faboideae, tribu Aeschynomeneae, del género Arachis y especie hypogaea.
Su nombre científico es Arachis hypogaea (Valladares, 2010).
Esta especie se divide en 2 subespecies y 6 variedades botánicas:
1) Subespecie hypogaea: se caracteriza por la ausencia de flores sobre
el eje principal y posee ramas laterales alternadas regularmente, tanto
vegetativas como reproductivas. Su ciclo de vida es largo. Esta subespecie
incluye:
a) Var. hypogaea: presenta folíolos con superficie dorsal sin
pilosidades, eje central o principal corto, hábito de crecimiento postrado a
erecto, inflorescencia simple y de 2 a 3 semillas por vaina.
8
b) Var. hirsuta: se caracteriza por folíolos con superficie dorsal con
pilosidades (1-2 mm), eje principal largo, hábito de crecimiento postrado y de
2 a 4 semillas por vaina.
2) Subespecie fastigiata: está caracterizada por presencia de flores sobre
el eje principal sin orden específico de ramas vegetativas y reproductivas
sobre los laterales. Su ciclo de vida es más corto que el de hypogaea.
Esta subespecie está conformada por:
a) Var. fastigiata: se caracteriza por folíolos con superficie dorsal
glabra y pilosidades sólo en la nervadura central, de 3 a 5 semillas por vaina,
ramas reproductivas cortas y delgadas, poco ramificado, hábito de crecimiento
erecto e inflorescencia simple.
b) Var. peruviana: muestra folíolos con superficie dorsal glabra y
pilosidades sólo en la nervadura central, ramas reproductivas largas y fuertes
(5-10 cm) con eje central fuerte y ramificaciones laterales.
c) Var. aequatoriana: presenta folíolos con toda la superficie dorsal
pilosa (1-2 mm), ramas reproductivas largas, principalmente las ramas
laterales, eje central con inflorescencia y ramas reproductivas cortas, tallos
púrpuras, ramificado con hábito de crecimiento erecto.
d) Var. vulgaris: se caracteriza por vainas con 2 semillas, frutos
agrupados en la base de la planta, porte erecto, ramificado e inflorescencia
compuesta.
Los cultivares de maní están clasificados botánicamente de acuerdo
con las características de los granos y el color del tegumento. Comercialmente
se clasifican como Valencia (var. fastigiata), Español (var.vulgaris), Virginia
(var. hypogaea con semillas grandes) y tipo Peruano o Runner (var. hypogaea
con semillas pequeñas) (Pedelini y Casini, 1997).
2.6 Mejoramiento genético de maní
En Argentina los primeros pasos en mejoramiento genético del cultivo
se dieron a partir de 1945 en el INTA- EEA Manfredi, mediante los trabajos
precursores de Rigoni, V.; Baez J.; Krapovickas, A.; Pietrarelli, J.; entre otros.
9
Las primeras variedades cultivadas en Córdoba procedieron de
materiales autóctonos que se comenzaron a cultivar regionalmente en el siglo
IXX. En el período desde 1950 hasta 1975, se difundieron los primeros
cultivares obtenidos por cruzamientos artificiales dirigidos a obtener
variedades con mayor contenido de aceite. Desde 1985 comienzan a
registrarse los primeros cultivares tipo “runner” obtenidos localmente. En 2003
se registra en Argentina el primer cultivar alto oleico (granoleico) que
contribuye al posicionamiento de nuestro país como exportador privilegiado y
referente en la producción mundial de maní confitería alto oleico de máxima
calidad (Tomas et al., 2013).
Debido al origen de la especie cultivada se generó un cuello de botella
genético, que asociado a su reproducción autógama y al empleo continuo de
un conjunto acotado de progenitores elite para originar variedades mejoradas,
redujo la variabilidad y la resistencia del cultivo a los múltiples estreses
bióticos y abióticos. Por ello, se plantea como una estrategia recurrir a los
bancos de germoplasma para aumentar la base genética de los materiales
(Tomas et al., 2013).
La utilidad de una colección de germoplasma depende de la
caracterización disponible, la cual permite un mejor aprovechamiento de la
diversidad genética y un uso eficiente de los recursos (Tomas et al., 2013). De
este modo, se podría maximizar el uso de la variabilidad genética existente
constituyendo un reservorio de genes útiles y deseables para el mejoramiento
de la especie.
El trabajo con germoplasma necesariamente conlleva el empleo de
herramientas moleculares, dado que éstas pueden acelerar la obtención de
nuevos cultivares más resistentes a plagas y enfermedades, con mayor
calidad alimenticia y con altos rendimientos. El uso de herramientas
moleculares en mejoramiento convencional reduce los tiempos y vuelve a la
agricultura más eficiente (Camarena et al., 2014).
2.7 Marcadores moleculares
Se define como marcador molecular a cualquier fenotipo molecular
proveniente de la expresión de un gen o de un segmento específico de ADN
10
correspondiente a regiones codificantes o no codificantes del genoma, cuya
secuencia puede ser conocida o no, que presenta diferencias entre individuos
y un patrón de heredabilidad (Ferreira y Grattapaglia, 1998). A diferencia de
los marcadores morfológicos, los moleculares pueden ser utilizados para la
detección y caracterización de genotipos a partir de células o tejidos en
cualquier estadio fisiológico, facilitándose así la aplicación de métodos
tempranos de selección y recombinación de los individuos de interés para el
mejoramiento genético (Morell et al., 1995).
Dentro de los marcadores de ADN más difundidos en maní en los
últimos tiempos se encuentran los marcadores microsatélites (SSR), las
regiones expresadas dentro de microsatélites (EST-SSR, por sus siglas en
inglés), la tecnología de chips de diversidad (DArT, por sus siglas en inglés) y
los polimorfismos de nucleótido simple (SNP), entre otros (Pandey et al.,
2012). Todos ellos brindan la posibilidad de identificar y mapear genes útiles
que pueden ser posteriormente incorporados y expresados en el genoma
vegetal (Ferreira y Grattapaglia, 1996). Los SSR son los elegidos para el
mejoramiento molecular en la mayoría de los cultivos debido a su abundancia
y a la distribución uniforme a lo largo del genoma, a su capacidad multialélica,
a la herencia codominante, a su alto nivel de polimorfismo, a la naturaleza
reproducible y a su fácil transferibilidad (Barkley et al., 2007; Ferguson et al.,
2004).
2.7.1 Marcadores microsatélites y sus aplicaciones
Los SSR son regiones genómicas hipervariables que consisten en
repeticiones en tándem de 1 a 6 nucleótidos flanqueadas por secuencias de
copia única, donde el origen del polimorfismo se basa en el diferente número
de repeticiones de la secuencia motivo. Debido a que son especie-
específicos, deben ser desarrollados para cada especie en estudio. Estos
marcadores han sido ampliamente utilizados en estudios genéticos en plantas
debido a que se ha demostrado su alta versatilidad y utilidad para la
caracterización de germoplasma (He et al., 2003; Picca et al., 2004; Kottapalli
et al., 2007; Kalia et al., 2011).
11
Para amplificar un SSR determinado se utilizan 2 oligonucleótidos que
funcionan como “iniciadores”, los cuales son moléculas de ADN de cadena
individual y longitud corta entre 10 y 30 nucleótidos. Estos iniciadores
flanquean las repeticiones de un microsatélite específico, donde se hibridan
complementariamente a las partes terminales. Posteriormente se efectúa la
amplificación (extensión) mediante la reacción en cadena de la polimerasa
(PCR, por sus siglas en inglés). El resultado es la síntesis de nuevas cadenas
de ADN complementarias a las cadenas iniciales. El microsatélite amplificado
por PCR es analizado por electroforesis en geles de alta resolución que
permiten detectar diferencias de entre 2 y 3 nucleótidos que corresponden al
mínimo polimorfismo de longitud en un microsatélite (Picca et al., 2004;
Levitus et al., 2010; Camarena et al., 2014).
Una de las limitaciones para la utilización de los SSR es la necesidad
de conocer las regiones que flanquean a las repeticiones para poder
desarrollar los iniciadores específicos (Levitus et al., 2010).
En la última década se han reportado diversos estudios basados en la
detección de polimorfismos mediante SSR dentro del género Arachis. Algunos
de ellos permitieron analizar la variabilidad genética de diversos conjuntos de
entradas de germoplasma, tanto silvestre como cultivado (He et al., 2003;
Ferguson et al, 2004; He et al., 2005; Barkley et al., 2007; Cuc et al., 2008;
Jiang et al., 2010; Wang et al., 2011; Macedo et al., 2012, Pandey et al., 2014).
En este sentido, algunos trabajos se centraron en la caracterización
molecular de colecciones núcleo (core collections) logrando reducir tiempo,
dinero y recursos humanos para incrementar el conocimiento del
germoplasma de maní. Éstas constituyen un subgrupo de las colecciones
originales y mantienen casi la totalidad de la variabilidad genética
representada en estas últimas (Holbrook y Dong, 2005; Kottapalli et al., 2007).
Otras aplicaciones constituyen la determinación de relaciones genéticas entre
Arachis hypogaea (AABB) y especies diploides de Arachis con genomas AA y
BB (Bertoti da Cunha et al., 2008). También en mapeo genético para diversos
caracteres tales como la eficiencia de las plantas durante el proceso de
transpiración (Varshney y Mahendar, 2009), la construcción del primer mapa
genético integrado en esta especie basado en SSR (Moretzsohn et al., 2005),
12
mapeo de alta resolución y aplicación de selección asistida por marcadores
(Gautami et al., 2009, Pandey et al., 2012).
13
3 HIPÓTESIS
El análisis con SSR permite determinar el nivel de variación alélica
entre los individuos dentro de cada entrada en la colección núcleo de
germoplasma de maní.
14
4 OBJETIVOS
4.1 Objetivo general
Caracterizar genotípicamente una colección núcleo de germoplasma de
maní cultivado del INTA-EEA Manfredi.
4.2 Objetivos específicos
Identificar y seleccionar un individuo de cada entrada que presente la
combinación alélica más frecuente mediante el uso de tres SSR.
Explorar la variabilidad genética presente en la colección núcleo de
germoplasma de maní cultivado de manera preliminar.
15
5 MATERIALES Y MÉTODOS
5.1 Material vegetal
El material vegetal utilizado correspondió a la CNM conformada a partir
de la CMIM constituida por 154 entradas de la colección original, incluyendo
razas locales, cultivares antiguos y líneas de cría. Esta selección se basó en
la caracterización fenotípica realizada previamente por el grupo de
mejoramiento del cultivo (Baldessari et al., 2016).
5.2 Experimento en campo
5.2.1 Sitio experimental
Se sembraron 2 surcos de 10 m (20 plantas) de cada entrada
perteneciente a la CNM en el campo (Figura 1). Este ensayo tuvo como
objetivo la multiplicación de la colección y la selección del individuo
representativo de cada entrada mediante el uso de SSR. Al final del ciclo se
cosechó la totalidad de la planta elegida y se corroboró que los descriptores
de fruto coincidan con el registro correspondiente para cada entrada en el
Catálogo de Recursos Genéticos de Maní (Sanchez et al., 2010). Los
restantes individuos muestreados para cada entrada se cosecharon en bulk
para preservar la variabilidad encontrada dentro de las mismas.
Figura 1. Campo experimental de 2 surcos de 10m de cada
entrada perteneciente a la CNM.
16
5.3 Experimento en laboratorio
5.3.1 Muestreo de material
Se realizó el muestreo de hojas jóvenes sin lesiones, ni signos de
ataques por patógenos (Figura 2), pertenecientes a 8 individuos de cada
entrada (1.232 muestras en total). De ellos, en 4 se realizó la extracción de
ADN para caracterizarlas con SSR y seleccionar el individuo representativo,
mientras que las restantes se almacenaron como material de resguardo en
caso de requerirse para futuros estudios.
5.3.2 Extracción de ADN
El proceso de extracción de ADN genómico (Protocolo 1- Anexo) se
llevó a cabo en 4 individuos de cada entrada (616 muestras) según el
protocolo propuesto por Doyle y Doyle (1987) con modificaciones según Pozzi
(2012) y adicionando una precipitación de polisacáridos con NaCl 2M (Figura
3). Se mantuvo la individualidad de las muestras. Los 4 individuos restantes
por entrada fueron liofilizados y almacenados para disponer de material
adicional en caso de ser necesario. Para ello se empleó un liofilizador modelo
FreeZone (Labconco, Estados Unidos).
Figura 2. Muestreo de hojas jóvenes de maní sin lesiones
ni ataques por patógenos.
17
5.3.3 Evaluación de calidad, integridad y cuantificación del ADN
Se realizó el control de la cantidad e integridad del ADN extraído con
geles de agarosa al 0,8% p/v teñidos con el colorante GelRed Nucleic Acid
Gel Stain (Biotum, Estados Unidos). La visualización del ADN se realizó
empleando un digitalizador de imágenes (Bio-Rad, Estados Unidos) acoplado
al programa Quantity One 1D. La cuantificación se realizó mediante el uso de
un espectrofotómetro NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, Estados Unidos).
5.3.4 Reacción de la cadena de la polimerasa
Esta etapa se llevó a cabo empleando 3 SSR: PM210 (He et al., 2003),
TC24C06 y TC24B05 (Macedo et al., 2012) seleccionados en base a trabajos
previos del grupo (Moreno et al., 2015).
Las reacciones de amplificación fueron efectuadas en un volumen final
de 6,25 μL, conteniendo 20 ng/μL de ADN, 0,5 U/μL de taq polimerasa
(Fermentas), 1X buffer de PCR, 0,2 mM de cada dNTP, 1,5 mM MgCl2, 0,25
μM de cebador sentido y 0,25 μM de cebador antisentido en agua grado HPLC
estéril. Para las amplificaciones de cada SSR se utilizó un termociclador
GeneAmp System 9700 (Applied Biosystems) mediante el siguiente programa
de ciclado: desnaturalización inicial 3 min a 94ºC, seguido de 35 ciclos de
amplificación considerando desnaturalización de 30 seg a 94ºC, hibridación
Figura 3. Extracción de ADN genómico de 4
individuos de cada entrada.
18
de 1 min a temperatura específica para cada marcador y extensión de 1 min
a 72ºC. Luego se incluyó 1 ciclo de extensión final de 10 min a 72ºC. La
temperatura de hibridación específica de cada SSR fue ajustada en un trabajo
previo del grupo (Moreno et al., 2015).
Los fragmentos amplificados fueron resueltos por electroforesis vertical
en geles de poliacrilamida 6% p/v, en cuba Gibco-BRL modelo S2 (Biometra,
Alemania) (Figura 4). Se adicionaron 6 μL de buffer conteniendo bromofenol,
xylene-xyanol y formamida en cada una de las muestras. Luego las mismas
se desnaturalizaron durante 5 min a 94°C e inmediatamente se colocaron en
hielo previo a su siembra en el gel. Se utilizó como buffer de corrida TBE 0,5X
en la bandeja superior y TBE 1X en la bandeja inferior. El tiempo de corrida
fue de 1,20 h a 70 W. En ambos extremos de cada gel se adicionó un patrón
molecular de 10 pb para determinar el peso de los fragmentos resueltos. Los
geles se colorearon con tinción de nitrato de plata (Protocolo 2- Anexo),
empleando un pre-tratamiento de ácido nítrico (Creste, 2001).
5.3.5 Análisis de datos
Para explorar de manera preliminar la variabilidad genética presente en
la CNM se calculó el número de alelos por locus, el número promedio de
alelos, el número de alelos totales, el contenido de información polimórfica
(PIC) y la diversidad genética por locus y promedio. Para ello se empleó el
Figura 4. Fragmentos amplificados resueltos por electroforesis
vertical en geles de poliacrilamida.
19
programa Info-Gen (Balzarini y Di Rienzo, 2003). Asimismo, se calculó la
matriz de distancias de Nei (Nei et al., 1983) y con ella se construyó un árbol
utilizando el método de agrupamiento de Neighbor-Joining (NJ) (Saitou y Nei,
1987) entre las subespecies y variedades botánicas de maní cultivado
pertenecientes a la CNM usando el programa Population 1.2.30 (Langella,
1999) el cual se visualizó gráficamente mediante el uso del programa FigTree
1.4.2 (Rambaut, 2007). Por último, se realizó un análisis molecular de la
varianza (AMOVA) a una vía de clasificación (factor subespecie) empleando
4000 permutaciones para el cálculo del valor de p asociado a cada término
del modelo (Excoffier et al., 1992). Estas estimas fueron calculadas con el
programa Info-Gen (Balzarini y Di Rienzo, 2003).
Una vez finalizada la caracterización con SSR en laboratorio se
seleccionó el individuo representativo de cada entrada que mostró la
combinación alélica más frecuente dentro de cada una de ellas.
20
6 RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Para identificar el individuo representante de cada entrada antes de la
cosecha de los materiales la caracterización genotípica de la CNM se llevó a
cabo durante el ciclo del cultivo (noviembre 2015-mayo 2016). La Figura 5
muestra la evolución del cultivo en el ensayo de campo durante la campaña
de evaluación.
Figura 5. Imágenes tomadas en el ensayo de campo para establecimiento y multiplicación de
la CNM (INTA-EEA Manfredi, campaña 2015-2016).
En base a la combinación alélica más frecuente detectada entre los 4
individuos por entrada, se logró seleccionar 1 de ellos como representante de
la misma, combinando los genotipos obtenidos para los 3 SSR analizados.
Por ejemplo, para la entrada 1138 los individuos 1, 2 y 4 presentan el mismo
alelo para el marcador PM210 (Figura 6-a), los individuos 1, 3 y 4 presentan
el mismo alelo para el marcador TC24C06 (Figura 6-b), mientras que para el
TC24B05 los 4 individuos evidenciaron el mismo alelo (Figura 6-c). Por ende,
los individuos representativos de esta entrada pueden ser tanto el 1 como el
4, dado que son los que poseen la combinación alélica más frecuente para los
tres SSR analizados. De ambos individuos se eligió el 1, cuya planta
presentaba mejor aspecto (mayor desarrollo foliar y mejor estado sanitario).
21
Figura 6. Imágenes de los geles de poliacrilamida al 6% p/v para la entrada 1138. a. PM210.
b. TC24C06. c. TC24B05.
En base a los resultados obtenidos en la caracterización genotípica, las
plantas seleccionadas para conformar la CNM fueron marcadas en el campo
para su posterior identificación al momento de la cosecha (Figura 7). En esta
instancia se cosechó la totalidad de semillas de la planta elegida por entrada,
verificando posteriormente la selección mediante caracteres fenotípicos de
fruto con el objeto de aumentar el número de semillas disponibles y poder
establecer una colección de trabajo continua en el tiempo.
Figura 7. Marcado de plantas para su identificación durante la cosecha.
Nota: Rojo: planta genotipada y seleccionada por entrada. Azul: plantas genotipadas no
seleccionadas.
En cuanto al análisis preliminar de variabilidad genética de la CNM, el
número de alelos totales obtenidos fue de 31. Los resultados para cada
estadístico se muestran en la Tabla 1.
22
Tabla 1. Medidas de diversidad genética por locus y promedio de la CNM.
Estadístico PM210 TC24C06 TC24B05 Promedio
Diversidad genética 0,772 0,782 0,900 0,818
PIC 0,740 0,748 0,892 0,793
Número de alelos 9 7 15 10,333
PIC: contenido de información polimórfica.
El valor de diversidad genética promedio para la CNM fue elevado
(0,818). Al comparar los valores de los estadísticos de diversidad promedio se
observa que son mayores los obtenidos en este trabajo que los reportados por
He et al. (2003) y Macedo et al. (2012) (0,68 y 0,60, respectivamente), lo cual
daría indicio de un alto grado de diversidad almacenada en la CNM. Mientras
que fueron similares a lo informado por Barkley et al. (2007) y Chintu (2013)
esto podría deberse principalmente a que fue analizado un número similar de
individuos al del presente trabajo. Este último autor también reportó similar
número de alelos promedio (10,6) al presente trabajo.
Para el caso del marcador PM210 los valores observados para el
número de alelos por locus fueron similares al trabajo de Barkley et al. (2007)
(9) y al de Kottapalli et al. (2007) (10), sólo que en éste último registró un
menor valor de PIC que puede deberse a que la colección del Departamento
de Agricultura de los Estados Unidos (USDA) está constituida sólo por 4 de
las 6 variedades botánicas representadas en la CNM (Wang et al., 2011).
Los valores obtenidos para el estadístico alelos por locus para el
TC24C06 fue menor (10) y para el marcador TC24B05 fue mayor (12) a lo
reportado por Macedo et al. (2012). En cuanto a los valores de variabilidad
genética no se evidenciaron grandes diferencias (0,8068 para TC24CO6 y
0,8850 para TC24B05) con el presente trabajo (0,818). La misma tendencia
se observó al compararlos con Chintu (2013) que reportó un valor de
diversidad genética de 0,80.
Se confeccionó un árbol en base a las distancias de Nei con el método
de agrupamiento NJ (Figura 8), éste mostró 2 grupos, uno (G1) con 8 entradas
y el segundo (G2) que abarcó 5 subgrupos y a las entradas restantes
pertenecientes a la colección. El G1 incluyó las entradas de la subespecie
fastigiata con una entrada de hypogaea. De la subespecie fastigiata, el 57,1%
23
perteneció a la variedad vulgaris (4), el 28,6% a la variedad peruviana (2) y el
14,3 a la variedad fastigiata (1) principalmente originarias de Paraguay.
El G2 abarcó 5 subgrupos (SG1-SG5). El SG1 no mostró buena
discriminación puesto que todas las variedades botánicas estuvieron
representadas en ese conjunto de entradas. El SG2 concentró entradas
principalmente de la subespecie fastigiata (15) y algunas de la subespecie
hypogaea (2). El 80% de las primeras perteneció a variedad fastigiata (12)
originarias de Paraguay y el 20% a variedad peruviana (3). El SG3 evidenció
mezcla de subespecies y variedades botánicas, representando a subespecie
fastigiata variedad fastigiata, subespecie fastigiata variedad peruviana,
subespecie fastigiata variedad aequatoriana, subespecie hypogaea variedad
hirsuta y subespecie hypogaea variedad hypogaea, de diversos orígenes
geográficos tales como Bolivia, Brasil, Perú, Ecuador, México y Argentina. El
SG4 mostró consistencia dado que se agruparon principalmente las entradas
provenientes de la India, mejoradas por ICRISAT que emplea el mismo grupo
de padres para obtener todos sus materiales (Baldessari, com. pers1). Por
último, el SG5 fue representado por 2 entradas de la subespecie fastigiata y 1
de la subespecie hypogaea.
En base al árbol obtenido, se puede inferir que se observa una
tendencia de agrupamiento pero será necesario aumentar el número de
marcadores para lograr la identificación unívoca de las entradas distinguiendo
entre subespecies y variedades botánicas. Dado que 23 entradas de la CNM
no poseen taxonomía confirmada (Tabla 2- Anexo) (Baldessari et al., 2016),
se dificulta para ellas relacionar este criterio con el patrón de agrupamiento
obtenido en el árbol. El 85,06% de las entradas posee clasificación
taxonómica lo cual es un valor mucho mayor al reportado por Barkley et al.
(2007) y constituye un dato importante al momento de considerar este criterio
como soporte de los grupos obtenidos.
Los resultados obtenidos en el AMOVA mostraron que existe
variabilidad genética tanto, entre las subespecies, como dentro de ellas. La
_________________________________________________________________________
1 Ing. Agr. Responsable del Programa de Mejoramiento de Maní, INTA-EEA Manfredi.
24
Figura 8. Dendrograma obtenido en base a las distancias de Nei con el método de
agrupamiento NJ.
variación entre las subespecies explicó el 6,9% del total, mientras que la
variación dentro de las mismas reveló el 93,1% restante, siendo significativa
para ambos casos (p < 0,0001) (Tabla 2). El valor del coeficiente PhiST fue de
0,07; evidenciando que el factor subespecie originó un patrón de
estructuración o diferenciación bajo entre las mismas. Estos resultados fueron
similares a los obtenidos por Varshney et al. (2009) quienes reportaron una
variación del 0,10% entre poblaciones y del 99,90% dentro de las mismas.
Cabe destacar que las poblaciones se establecieron en base a la clasificación
botánica de las entradas pertenecientes a la colección de germoplasma del
25
ICRISAT, tomando el mismo enfoque que el presente trabajo. Una tendencia
similar se observó en reportes como los de Jiang et al. (2014) y Chintu (2013)
con una variación dentro de las poblaciones (basadas en ambas subespecies)
del 75% y 72,9%, respectivamente. La variación entre las poblaciones fue del
25% y 27,1%, respectivamente. Asimismo estos autores informaron un nivel
bajo de diferenciación entre las mismas (PhiST = 0,14). Ambos trabajos
estuvieron basados en una colección de germoplasma de China.
Tabla 2. Resultados del AMOVA a una vía de clasificación (factor subespecie)
FV GL SC Comp Var % Variación PhiST
Entre 1 13,54 0,17 6,9
0,07 Dentro 115 260,67 2,27 93,1
Total 116 274,21 2,43 100 p valor (p<0,0001)
FV: fuente de variación. SC: suma de cuadrados
26
7 CONCLUSIONES
Los estudios realizados en este trabajo final de grado permitieron llegar
a las siguientes conclusiones:
La caracterización genotípica reflejó una alta variabilidad entre los
materiales elegidos para constituir la colección núcleo.
La variabilidad dentro de cada entrada fue baja, coincidente con el tipo
de reproducción de la especie.
Se logró una discriminación deficiente entre las entradas en base a su
clasificación botánica.
Se determinó una alta variación genética dentro de las subespecies, a
diferencia de lo que sucedió entre las mismas.
27
8 CONSIDERACIONES FINALES
El aporte de esta investigación se considera valioso dado que se
constituyó una población a partir de un individuo por entrada caracterizado
genotípicamente. Cabe destacar que el número de SSR empleado en los
trabajos reportados en la bibliografía consultada fueron mayores: 78 SSR en
Macedo et al. (2012) y 31 SSR en Barkley et al. (2007) al utilizado en este
trabajo. Por ello, esta investigación se presenta como un análisis preliminar
de variabilidad y surge la necesidad de incrementar el número de SSR
empleados para lograr mejor discriminación entre las entradas de la CNM. De
todos modos, los marcadores SSR analizados aquí constituyen una
herramienta adecuada para este tipo de estudios debido a que reflejan una
alta variabilidad de los materiales elegidos para constituir la CNM,
respaldando el criterio de selección utilizado para conformarla (Tabla 3-
Anexo) (Baldessari et al., 2016).
Es oportuno aclarar que este tipo de poblaciones presentan alta
variación, lo cual facilita su aplicación para diversos caracteres fenotípicos,
fisiológicos, agronómicos, sanitarios, etc. A partir de este trabajo se accede a
la multiplicación de la CNM a nivel de individuo y su evaluación agronómica
para diversos caracteres conjuntamente con la aplicación de herramientas
moleculares. Este enfoque tendrá un beneficio directo para el programa de
mejoramiento del cultivo de maní en INTA-EEA Manfredi porque permitirá
reducir el tiempo para la obtención de nuevas variedades insumiendo menos
recursos asignados para este objetivo.
28
9 BIBLIOGRAFÍA
Álava Gómez, J. C. 2012. Determinación de las Características
Agronómicas de 15 Cultivares de Maní (Arachis Hipogaea L.) Tipo
Valencia en la Parroquia Virgen de Fátima, Yaguachi-Guayas. Tesis de
grado de Ingeniería Agronómica, Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad
de Guayaquil, Ecuador. 73p.
Augstburger, F; Berger, J; Censkowsky, U; Heid, P; Milz, J; Streit, C. 2000.
Agricultura Orgánica en el Trópico y Subtrópico: Maní (Cacahuete).
Conferencia de las Naciones Unidas sobre Negocio y Desarrollo (UNCTAD).
Asociación Naturland, Alemania. Disponible en: https://azueroearthproject.or
g/wp-content/uploads2013/07/A.C1015_Augstburger_2000_spa.pdf.
Consultado el 18/06/16.
Baldessari J.; Conde M.B.; Gallardo R.M. 2016. La colección núcleo de
maní del INTA Manfredi, para mantener y evaluar variabilidad genética
con recursos escasos. XXXI Jornada Nacional de Maní, Gral. Cabrera,
Córdoba. 22/09/16.
Balzarini, M. and Di Rienzo, J. 2003. Info-Gen: Software para análisis
estadístico de datos genéticos. Facultad de Ciencias Agropecuarias.
Universidad Nacional de Córdoba. Argentina.
Barkley, N. A.; Dean, R. E.; Pittman, R. N.; Wang, M. L.; Holbrook, C. C.;
Pederson, G. A. 2007. Genetic diversity of cultivated and wild-type
peanuts evaluated with M13-tailed SSR markers and sequencing. Genetic
Resources. 89(2): 93-106.
Bertoti da Cunha, F.; Macedo Nobile, P.; Akemi Hoshino, A.; Moretzsohn,
M.C.; Romero Lopes, C.; Aparecio Gimenes, M. 2008. Genetic relationships
among Arachis hypogaea L. (AABB) and diploid Arachis species with AA
and BB genomes. Genet Resour Crop Evol (2008) 55: 15-20.
29
Blengino, C. 2014. Informe Sectorial Nº 1. Dirección de Agroalimentos.
Disponible en: http://www.alimentosargentinos.gob.ar/contenido/sectores/otr
os/mani/informes/2014_05May.pdf. Consultado el 20/04/16.
Blengino, C. 2015. Informe Sectorial Nº 2. Dirección de Agroalimentos.
Disponible en: http://www.alimentosargentinos.gob.ar/contenido/sectores/frut
asecas/informes/SECTORIAL%20MANI%202015.pdf. Consultado el
15/02/16.
Cámara Argentina del Maní. 2017. Primera estimación de producción de
maní 2016/2017. Informe 96. Bolsa de cereales de Córdoba. Disponible en:
http://www.camaradelmani.org.ar/espanol/1-estimacion-de-produccion-de-
mani-campana-201617-bccba/. Consultado el 17/05/17.
Camarena, F.; Chura, J.; Blas, R. 2014. Mejoramiento Genético y
Biotecnológico de Plantas. Agrobanco. San Isidro, Perú. Disponible en:
http://www.agrobanco.com.pe/data/uploads/pdf_cpc/MEJORAMIENTO_GEN
ETICO_Y_BIOTECNOLOGICO_DE_PLANTAS.pdf. Consultado el 25/06/16.
Chintus, J. 2013. Breeding groundnut for resistance to rosette disease
and its aphid vector, Aphis craccivora Koch in Malawi. Tesis de Grado
Doctor de Filosofía (PhD) en reproducción de plantas. Centro Africano para el
Mejoramiento de Cultivos, Escuela de Agricultura, Tierra y Ciencias
Ambientales, Universidad de KwaZulu-Natal, Pietermaritzburg, Sudáfrica. 143
p.
Creste, S.; Neto, A.T.; Figueira, A. 2001. Detection of single sequence
repeat polymorphisms in denaturing polyacrylamide sequencing gels by
silver staining. Plant Mol Biol Reporter, 19(4): 299-306.
Cuc, L.M.; Mace, E.S.; Crouch, J.H.; Quang, V.D.; Long, T.D.; Varshney, R.K.
2008. Isolation and characterization of novel microsatellite markers and
their application for diversity assessment in cultivated groundnut
30
(Arachis hypogaea). BMC Plant Biol 8:55.
Doyle, J.J.; Doyle, J.L. 1987. A rapid DNA isolation procedure for small
quantities of fresh leaf tissue. Phytochem, 19: 11-15.
Dwivedi, S.L; Bertioli, D.J; Crouch, J.H.; Valls, J.F.; Upadhyaya, H.D.; Fávero,
A; Moretzsohn, M.; Paterson, A.H. 2007. Chapter 3: Peanut. In: Genome
Mapping and Molecular Breeding in Plants. Springer-Verlag. Librería digital de
ICRISAT, New York. Pp. 115-151. ISBN: 978-3-540-34387-5.
Excoffier, L.; Smouse, P.; Quattro, J. 1992. Analysis of molecular variance
inferred from genetic distances among DNA haplotypes: application to
human mitochondrial DNA restriction data. Genetics 131: 479-491.
Ferguson, M.E.; Bramel, P.; Chandra, S. 2004. Plant Genetic resources:
Gene Diversity among Botanical Varieties in Peanut. Crop Sci: 44:1847-
1854.
Ferreira, M.E., y D. Grattapaglia. 1996. Introdução ao uso de marcadores
moleculares em análise genética. 2a Ed. EMBRAPA, Centro de Recursos
Genéticos y Biotecnología, Brasilia, Brasil. (Documento 20). 220 p.
Ferreira, M y Grattapaglia, D. 1998. Introducción al uso de marcadores
moleculares en el análisis genético. 1 Ed. Brasilia, EMBRAPA-
CENARGEN, documento 20. pp 220.
Frankel, O.H. 1984. Genetic perspectives of germosplam conservation. In
W.K Arber et al. Ed. Genetic Manipulation: Impact on Man and Society.
Cambridge Univ. Press, Cambridge. Pp 161-170.
Freeman, H.A.; Nigam, S.N.; Kelley, T.G.; Ntare, B.R.; Subrahmanyam, P.;
Boughton, D. 1999. The world groundnut economy: facts, trends, and
outlook. Librería digital de ICRISAT, India. Pp 52. ISBN: 92-9066-404-5.
31
García, G. 2005. Perfil descriptivo de la cadena de maní. Dirección de
mercados agrícolas. Disponible en: http://www.agroindustria.gob.ar/dimeagro
/publicaciones/perspectivas/Perfiles%20descriptivos/Cadena%20de%20man
%C3%AD.pdf. Consultado el 15/06/16.
Gautami, B.; Ravi, K.; Narasu, M. L.; Hoisington, D.; Varshney, R. K. 2009.
Novel set of groundnut SSR markers for germoplasm analysis and
interspecific transferability. IJIB. Pp 7. ISBN: 0973-8363.
Giambastiani, G. 2009. Cultivo de Maní. Cereales y Oleaginosas.
Universidad Nacional de Córdoba, Facultad de Ciencias agropecuarias. 14p.
He, G.; Meng, R.; Newman, M.; Gao, G.; Pittman, R.; Prakash, C.S. 2003.
Microsatellites as DNA markers in cultivated peanut (Arachis hypogaea
L.). BMC Plant Biology, 3: 3.
He, G., Meng, R.; Guo, B.; Gao, G.; Newman, M.; Pittman, R.N.; Prakash, C.S.
2005. Simple sequence repeat markers for botanical varieties of
cultivated peanut (Arachis hypogaea L.). Euphytica 142:131–136.
Holbrook, C.C.; Anderson, W.F.; Pittman, R.N. 1993. Selection of a core
collection from the U.S. germplasm collection of peanut. Crop Sci, 33:
859–861.
Holbrook C.C and W. Dong. 2005. Development and evaluation of a mini
core collection for the U.S peanut germoplasm collection. Crop Sci, 45
(7): 1540-1544.
Huifang, J.; Li, H.; Xiaoping, R.; Yuning, C.; Xiaojing, Z.; Youlin, X.; Jiaquan,
H.; Yong, L.; Liying, Y.; Liyun, W.; Boshou, L. 2014. Diversity
characterization and association analysis of agronomic traits in a
Chinese peanut (Arachis hypogaea L.) mini-core collection. Journal of
Integrative Plant Biology 56 (2): 159-169.
32
Jiang, H.F.; Ren, X.P.; Zhang, X.J.; Huang, J.Q.; Lei, Y.; Yan, L.Y.; Liao, B.S.;
Upadhyaya, H.D.; Holbrook, C.C. 2010. Comparison of genetic diversity
based on SSR markers between peanut mini core collections from China
and ICRISAT. Acta Agron Sin, 36(7): 1084-1091.
Jung, S.; Tate, P.L.; Horn, R.; Kochert, G.; Moore, K.; Abbott, A.G. 2003. The
phylogenetic relationship of possible progenitors of the cultivated
peanut. J. Hered, 94: 334–340.
Kalia R.K.; Rai M.K.; Kalia S.; Singh R.; Dhawan A. K. 2011. Microsatellite
markers: an overview of the recent progress in plants. Euphytica 177:309–
334
Kochert, G.; Halward, T.; Branch, W.D.; Simpson, C.E. 1991. RFLP variability
in peanut (Arachis hypogaea L.) cultivars and wild species. Theor Appl
Genet, 81(5): 565-570.
Kottapalli, K.R.; Burow, M.D.; Burow, G.; Burke, J.; Puppala, N. 2007.
Molecular characterization of the U.S. Peanut mini core collection using
microsatellite markers. Crop Sci, 47: 1718-1725.
Krapovickas, A. 2004. Consideraciones sobre el origen del maní. IV
Encuentro Latinoamericano de Especialistas en Arachis. Brasilia, DF, Brasil.
Langella, O. 1999. Populations v. 1.2.30. Disponible en: http://bioinformatics
.org/~tryphon/populations/#ancre_bibliographie. Consultado el 4/05/16.
Levitus, G.; Echenique, V.; Rubinstein, C; Hopp, E; Mroginski, L. 2010.
Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II. Consejo Argentino para la
Información y el Desarrollo de la Biotecnología. ArgenBio. Disponible en:
http://intainforma.inta.gov.ar/wp-content/uploads/2010/09/bio_WEB.pdf.
Consultado el 21/06/16.
33
Macedo, S.E; Márcio, C.; Moretzsohn, M.; Leal-Bertioli, S.C.M; Dione, M.T;
Alves; Gouvea, E.; Azevedo, V.C.R; Bertioli, D.J. 2012. Development and
characterization of highly polymorphic long TC repeat microsatellite
markers for genetic analysis of peanut. BMC Plant Biology, 5: 86.
Morell, M. K.; Peakall, R.; Preston, L. R.; Lloyd, H. L. 1995. DNA Profiling
techniques for plant variety identification. Australian Journal of
Experimental Agriculture, (35), 807-819.
Moreno, M.V.; Mamani, E.; Baldessari, J.; Etchart, V. 2015. Determinación de
muestra mínima para diversidad genética en maní. XXX Jornada Nacional
del Maní, General Cabrera, Córdoba, Argentina.
Moretzsohn, M.C.; Leoi, L.; Proite, K.; Guimarães, P.M.; Leal-Bertioli, S.C.M.;
José, A.C.V.F.; Gimenes, M.A.; Martins, W.S.; Valls, J.F.M.; Grattapaglia, D.;
Bertoli, D.J. 2005. A microsatellite-based, gene-rich linkage map for the
AA genome of Arachis (fabaceae). Theor Appl Genet (2005) 111: 1060-
1071.
Moretzsohn, M.C.; Leal-Bertioli, S.C.M.; Guimarães, P.M.; Proite, K.; José,
A.C.V.F.; Fávero, A.P.; Gimenes, M.A.; Valls, J.F.M.; Bertoli, D.J. 2006.
Mapeamiento genético em Arachis. V Encuentro Nacional de Especialistas
en Arachis. Córdoba, Argentina.
Moretzsohn, M.C.; Barbosa, A.V.G.; Alves-Freitas, D.M.T.; Teixeira, C.; Leal-
Bertioli, S.C.M.; Guimarães, P.M.; Pereira, R.W.; Lopes, C.R.; Cavallari, M.M.;
Valls, J.F.M; Bertioli, D.J; Gimenes, D.A. 2009. A linkage map for the B-
genome of Arachis (Fabaceae) and its synteny to the A-genome. BMC
Plant Biology, 9:40.
Nei, M.; Tajima, F.; Tateno, Y. 1983. Accuracy of estimated phylogenetic
trees from molecular data. II. Gene frequency data. J. Mol. Evol. 19: 153-
170.
34
Pandey, M.K.; Monyo, E.; Ozias-Akins, P.; Liang, X.; Guimaraes, P.; Nigam,
S.N.; Upadhyaya, H.D.; Janila, P.; Zhang, X.; Guo, B.; Cook, D.R.; Bertioli,
D.J.; Michelmore, R.; Varshney, R.K. 2012. Advances in Arachis genomics
for peanut improvement. Biotechnology Advances, 30: 639-651.
Pandey, M.K.; Upadhyaya, H.D.; Rathore, A.; Vadez, V.; Sheshshayee, M.S.;
Sriswathi, M.; Govil, M.; Kumar, A.; Gowda, M.V.C.; Sharma, S.; Hamidou, F.;
Kumar, V.A.; Khera, P.; Bhat, R.S.; Khan, A.W.; Singh, S.; Li, H.; Monyo, E.;
Nadaf, H.L.; Mukri, G.; Jackson, S.; Guo, B.; Liang, X.; Varshney, R.K. 2014.
Genomewide association studies for 50 agronomic traits in peanut using
the “reference set” comprising 300 genotypes from 48 countries of the
semi-arid tropics of the world. PlosOne, 9(8): e105228. Doi:
10.1371/journal.pone.0105228.
Pastor, N.A.; Ganuza, M.; Reynoso, M.M.; Folguera, J.; Rovera, M.; Torres,
A.M. 2014. Bioproducto a base de trichoderma controla el carbón de maní
y aumenta el rendimiento del cultivo. Disponible en:
http://www.ciacabrera.com.ar/docs/JORNADA%2030/32-%20BIOPRODUCT
O%20A%20BASE%20DE%20TRICHODERMA%20CONTROLA%20EL%20
CARB%C3%93N%20DE%20MAN%C3%8D%20Y%20AUMENTA%20DE%2
0RENDIMIENTO%20DEL%20CULTIVO.pdf. Consultado el 6/01/16.
Pedelini, R.; Casini, C. 1997. Manual del maní: hacia la calidad total. 2da
Edic. Publicación INTA-EEA Manfredi. 52 p.
Pedelini, R. 2012. Maní: Guía práctica para su cultivo. Boletín de
divulgación técnica Nº 2. Fundación Maní Argentino. 21 p. ISBN: 1851-4081.
Pereira, G. 1995. Cultivo de Maní. Boletín de divulgación Nº 48. Horticultura
INIA Tacuarembó, Uruguay. Disponible en: http://www.inia.uy/Publicaciones
/Documentos%20compartidos/111219240807155822.pdf. Consultado el
20/06/16.
35
Pérez Juárez, H.E. 2007. Efecto de la fertilización Química sobre el
rendimiento y la calidad del grano del maní (A. hypogaea L.), en la aldea
Las Cruces, La Libertad, Petén. Tesis Licenciatura. Guatemala. Universidad
de San Carlos de Guatemala. Facultad de agronomía. 49p.
Picca, A.; Helguera, M.; Salomón, N. Carrera, A. 2004. Marcadores
Moleculares. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal. INTA, Buenos Aires,
Argentina. Pp: 61- 68.
Plunknett, D.L.; Smith, N.J.H.; Williams, J.T.; Anishetty, N.M. 1987. A case
study in rice germplasm. In: Gene banks and the world’s food. (Ed).
Plunknett, D.L.; Smith, N.J.H.; Williams, J.T.; Anishetty, N.M. New Jersey
(USA) Princeton University Press. IR 36: 171-185.
Pozzi, F.I. 2012. Caracterización molecular de germoplasma de maní
cultivado para su empleo en mapeo de asociación. Tesis de Licenciatura
en Biología, Facultad de Ciencias Exactas, Físicas y Naturales, Universidad
Nacional de Córdoba. 56 p.
Rambaut, A. 2007. FigTree 1.4.2. Molecular evolution, phylogenetics and
epidemiology. Disponible en: http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/.
Consultado el 11/05/16.
Saitou, N.; Nei, M. 1987. The Neigbhor-joining Method: A New Method for
Reconstructing Phylogenetic Trees. Mol. Biol. Evol, 4(4): 406-425.
Sanchez, R.; Baldessari, J.; Royo, O.M. 2010. Peanut Genetic Resources
Catalogue 2010. 1era Edición. Manfredi, Córdoba, Argentina. 150 p. ISBN:
978-987-1623-69-3.
Savage, G.P.; Keenen, J.L. 1994. The composition and nutritive value of
groundnut kernels. In: Smart J (ed) The Groundnut Crop: A Scientific Basis
of Improvement. Chapman and Hall, London, pp 173–213.
36
Seijo, J.G.; Lavia, G.I.; Fernandez, A.: Krapovickas, A.; Ducasse, D.;
Moscone, E.A. 2004. Physical mapping of the 5S and 18S–25S rRNA genes
by FISH as evidence that Arachis duranensis and A. ipaënsis are the wild
diploid progenitors of A. hypogaea (Leguminosae). AJB, 91(9):1294-1303.
Tomas, P. A.; Gottlieb, A. M.; Schrauf, G. E.; Poggio, L. 2013. Utilización de
marcadores morfológicos y moleculares AFLP en la identificación de
germoplasma nativo y cultivado de Elymus scabrifolius (Poaceae).
Revista de la Facultad de Ciencias Agrarias. Universidad Nacional de Cuyo.
Mendoza. Argentina. 45(2): 85-100.
Valladares, C. A. 2010. Taxonomía y Botánica de los Cultivos de Grano.
Universidad nacional autónoma de honduras. Departamento de producción
vegetal. Centro universitario regional del litoral atlantico (curla). Disponible en:
http://institutorubino.edu.uy/materiales/Federico_Franco/6toBot/unidad-ii-
taxonomia-botanica-y-fisiologia-de-los-cultivos-de-grano-agosto-2010.pdf.
Consultado el 22/06/2016.
Valls, J.F.M.; Maass, B.L.; Lopes, C.R. 1994. Genetic resources of wild
Arachis and genetic diversity. In: Kerridge PC, Hardey B, editors. 1994.
Biology and Agronomy of Forage Arachis. Centro Internacional de Agricultura
Tropical (CIAT), Cali, Colombia, pp. 28–42.
Valls, J.F.M.; Simpson, C.E. 2005. New species of Arachis L.
(Leguminosae) from Brazil, Paraguay and Bolivia. Bonplandia 14(1):35–
63.
Van de Wouw, M.; Van Hintum, T.; Kik, C.; Van Treuren, R.; Visser, B. 2009.
Genetic erosion in crops: concept, research results and challenges. Plant
Genetics Resources, 8: 1-15. Disponible en: http://journals.cambrid
ge.org/action/displayAbstract?fromPage=online&aid=7322332. Consultado el
5/01/2016.
37
Varshney, R. K. and Mahendar T. 2009. High level of natural variation in a
groundnut (Arachis Hypogaea L.) germoplasm collection assayed by
selected informative SSR markers. Plant Breed, 128: 486-494.
Wang, M.L.; Sukumaran, S.; Barkley, N.A.; Chen, Z.; Chen, C.Y.; Guo, B.;
Pittman, R.N.; Stalker, H.T.; Holbrook, C.C.; Pederson, G.A.; Yu, J. 2011.
Population structure and marker-trait association analysis of the US
peanut (Arachis hypogaea L.) mini-core collection. Theor Appl Genet, 123:
1307-1317.
Williams, D.E. 2006. La Historia Mundial del Maní: Cuál será su Futuro? V
Encuentro Nacional de Especialistas en Arachis, Córdoba, Argentina.
38
10 ANEXO
1. Protocolo de extracción de ADN
1) Moler en mortero material verde (una hoja limpia y sana). Colocar en
tubo de 2 ml.
2) Agregar 800 μL de Buffer de extracción e incubar 65º durante una 1h
con agitación suave y continua.
3) Dejar los tubos destapados para permitir que la temperatura descienda
y agregar 600 μL de cloroformo-octanol (24:1). Mezclar la muestra por
inversión hasta obtener una emulsión.
4) Centrifugar los tubos durante 10 min a 14000 rpm, a temperatura
ambiente.
5) Trasvasar la fase acuosa a un nuevo tubo de 2 ml.
6) Agregar 600 μL de cloroformo-octanol (24:1). Mezclar la muestra por
inversión hasta obtener una emulsión.
7) Centrifugar los tubos durante 10 min a 14000 rpm, a temperatura
ambiente.
8) Trasvasar la fase acuosa a un nuevo tubo de 2 ml.
9) Precipitar el ADN agregando rápidamente 300 ml de isopropanol frío (-
20ºC) y mezclar suavemente por inversión.
10) Centrifugar para precipitar la medusa de ADN (5 min a 13000 rpm).
11) Descartar el sobrenadante y agregar 500 μL de etanol 70% frío (-20ºC),
mezclar por inversión (es mejor que el precipitado se despegue para un mejor
contacto con el alcohol). Repetir este paso una vez más con 250 μL.
12) Descartar el sobrenadante y agregar al pellet 500 μL de NaCl 2M, e
incubar durante 40 min a 65ºC.
13) Luego de la completa resuspensión del pellet, agitar suavemente los
tubos e incubar a 4ºC en heladera durante 10 min.
14) Centrifugar los tubos durante 10 min a 2000 rpm. Transferir el
sobrenadante a nuevos tubos.
15) Precipitar el ADN agregando rápidamente 300 μL de isopropanol frío (-
20ºC) y mezclar suavemente por inversión (10 veces).
16) Centrifugar para precipitar la medusa de ADN (5 min a 13000 rpm).
39
17) Descartar el sobrenadante y agregar 500 μL de etanol frío (-20ºC),
mezclar por inversión (es mejor que el precipitado se despegue para un mejor
contacto con el alcohol).
18) Repetir el paso anterior pero lavando con alcohol 100% frío.
19) Descartar el alcohol y dejar secar el precipitado.
20) Resuspender el precipitado en 50-100 μL de agua calidad HPLC.
Agregar 1-2 μL de enzima ARNasa (10 mg/ml). Mezclar la solución
suavemente por inversión durante 5 minutos e incubar 60 min a 37ºC.
Tabla 1. Buffer de extracción.
Componente Concentración final
Tris-CIH (pH 8,0) 100 Mm
NaCI 1,4 M
EDTA 20 mM
βME1 0,2%
Agua deionizada
CTAB2 (10%) 2% (p/v)
1β-mercaptoetanol, agregar inmediatamente antes de usar.
2Bromuro de Cetil-Trimetil-Amonio.
2. Protocolo de tinción
1) 1º FIJACION: 10 min en agitación.
Solución:
Etanol absoluto 100 ml
Ac. Acético 10 ml, enrazar 1 l con agua bidestilada.
2) 1º LAVADO: 1 min en agua destilada.
3) PRETRATAMIENTO: 3 min en agitación.
Solución:
Ac. Nítrico 15 ml, enrazar 1 l con agua bidestilada.
Advertencia: Colocar primero el agua y después el Ac. Nítrico porque de lo
contrario precipita.
4) 2º LAVADO: 1 min en agua destilada.
5) TINCION: 15 min en agitación.
40
Solución:
Nitrato de Plata 2 g, enrazar 1 l con agua bidestilada.
6) 3º LAVADO RAPIDO: contar 10 seg en agua destilada.
7) REVELADO: 1º lavado rápido con Hidróxido de Sodio y 2º lavado
con agitación con Carbonato de Sodio hasta que aparezcan las bandas.
Solución:
Hidróxido de Sodio 15 g/carbonato de Sodio 30 g
Formaldehído 540 μl, enrazar 1 l con agua bidestilada.
8) 2º FIJACION: 5 min en agitación.
Solución:
Ac. Acético 50 ml, enrazar 1 l con agua bidestilada.
9) 4º LAVADO: 5 min en agua destilada.
Tabla 2. Número de entradas con variedad botánica confirmada en la Colección de Maní de
INTA-EEA Manfredi (CMIM) y en su Colección Núcleo (CNM) (Baldessari et al., 2016).
Variedad Botánica CMIM CNM
fastigiata 1017 (43%) 56 (43%)
peruviana 259 (11%) 19 (15%)
aequatoriana 223 (9%) 10 (8%)
vulgaris 154 (6%) 9 (7%)
hypogaea 718 (30%) 32 (24%)
hirsuta 5 (0,21%) 5 (4%)
TOTAL 2376 131
41
Tabla 3. Estadísticas descriptivas para los 17 descriptores observados en la Colección de
Maní de INTA-EEA Manfredi (CMIM) y en su Colección Núcleo (CNM) (Baldessari et al.,
2016).
DESCRIPTORES
MEDIAS RANGO
CMIM CNM p-value SIG CMIM CNM
Largo Folíolo (cm) 5,91 5,89 0,8267 NS 2,67-10,1 2,8-39,2
Ancho Folíolo (cm) 3 2,98 0,5922 NS 1,32-5,26 2-4,8
Largo Fruto (cm) 3,17 3,24 0,3204 NS 1,5-6,7 1,9-6
Ancho Fruto (cm) 1,39 1,38 0,7415 NS 0,8-2,03 0,9-1,93
Largo Semilla (cm) 1,41 1,4 0,7005 NS 0,8-2,8 0,85-2,26
Ancho Semilla (cm) 0,91 0,91 0,4624 NS 0,6-1,97 0,66-1,9
Peso 100 Semillas (g) 57,39 55,7 0,392 NS 19-136 23-134
Forma Folíolo 7,67 7,82 0,4445 NS 1-13 5-13
Porte 4,54 4,46 0,6032 NS 1-7 1-7
Eje 1,7 1,77 0,113 NS 1-3 1-3
Tamaño 3,42 3,26 0,089 NS 1-5 1-5
Granos x fruto 2,53 2,68 0,0005 S 1-4 2-4
Pico 2,34 2,28 0,4883 NS 1-5 1-5
Constricción 2,46 2,36 0,1778 NS 1-5 1-5
Reticulado 2,33 2,39 0,5611 NS 1-5 1-5
Puntuación Viruela 3,27 3,26 0,9627 NS 0,41-5 0,64-4,95
Ciclo 2,33 2,36 0,5954 NS 1-3 1-3
SIG: significancia estadística. NS: no significativo. S: significativo.
