Trabajo de Grado

Caracterización molecular de procesamientos no canónicos del

factor de transcripción Ikaros en pacientes con Leucemia Linfoide

Aguda tipo B.

Presentado por: Victor Andres Villamizar

Directores: Valeriano López Segura, Helena Groot De Restrepo

Resumen

Íkaros es un factor de transcripción involucrado en varios niveles dentro del control de la hematopoyesis. Este

control se encuentra determinado por una expresión específica de las distintas isoformas del gen, y un desbalance

de estos niveles de expresión se ha visto relacionado con distintas neoplasias hematopoyéticas. En un trabajo

previo del grupo de investigación se estandarizó un nuevo método cuantitativo para la evaluación de los niveles

de expresión del gen Ikaros, este estudio encontró adicionalmente la presencia de procesamientos aberrantes en

un gran número de pacientes. Tomando en cuenta los resultados obtenidos en el trabajo previo, en el presente

trabajo se procedió a caracterizar los posibles procesamientos no canónicos del factor de transcripción Ikaros

(IKZF1) encontrados en pacientes con Leucemia Linfoide Aguda tipo B. Para esto se realizó en primer lugar un

análisis bioinformático de las regiones interexónicas de interés entre los exones 4 y 5, y los exones 6 y 7 del gen

IKZF1 en las cuales se sospecha la presencia de un splicing alternativo en búsqueda de sitios de splicing crípticos.

Este análisis resultó en la identificación de cuatro posibles sitios de splicing alternativos correspondientes a dos

inserciones a los extremos de los exones 4 y 5 de 129pb y 48pb correspondientemente, una inserción en el

extremo del intrón 7 de 69pb y una deleción de 30pb del extremo del intrón 6 la cual ya ha sido reportada

previamente en pacientes con Leucemia Linfoide Aguda de células T. Finalmente, se realizó caracterización

molecular mediante clonación y secuenciación de las regiones interexónicas amplificadas, sin embargo, no se ha

logrado obtener resultados concretos todavía.

Palabras claves: Factor de transcripción, Ikaros, splicing alternativo, leucemia linfoide aguda tipo B.

Introducción

La familia de factores de transcripción Ikaros es

esencial en la regulación de genes involucrados en

el desarrollo de las líneas celulares

hematopoyéticas (Dovat & Payne, 2010). Los

genes más importantes a este respecto son los

genes Íkaros, Helios y Aiolos, mientras que Eos y

Pegasus tienen funciones menos conocidas. Es

bien sabido que el factor de transcripción Íkaros

se encuentra involucrado en varios niveles dentro

del control de la hematopoyesis. Este control que

ejerce Ikaros, en conjunto con otros genes de la

misma familia, viene determinado por un control

específico de los niveles de expresión de las

distintas isoformas del gen (Ruiz et al., 2004).

Cambios en los perfiles de expresión de las

isoformas de estos genes se han visto relacionadas

con el desarrollo de trastornos hematopoyéticos

debido a una supuesta falta de su función como

supresores de tumores (Westman, Mackay, &

Gell, 2002). La identificación de los perfiles de

expresión de estos genes en pacientes con

neoplasias hematológicas permitiría una mayor

comprensión de estas enfermedades (Meleshko et

al., 2008) y en un futuro un diagnostico más

preciso.

El splicing alternativo de estos genes da como

resultado la obtención de diferentes mRNAs y

proteínas con distinta actividad y capacidad de

unión al ADN (Meleshko et al., 2008). Sin

embargo, existe una correlación directa entre la

probabilidad de que un gen sea catalogado como

causante de una enfermedad y el número de

intrones presentes en dicho gen (López-Bigas,

Audit, Ouzounis, Parra, & Guigó, 2005). La edición

precisa del pre-ARN requiere de un complicado

control en el interior de la célula, y mientras

mayor sea la cantidad de modificaciones

postranscripcionales que sufra un pre-ARN, mayor

será la probabilidad que se produzcan errores en

dicho procesamiento (López-Bigas et al., 2005).

En el caso del gen Ikaros (IKZF1), la sobreexpresión

de ciertas isoformas producidas por un splicing

alternativo con un comportamiento dominante

negativo se ha visto relacionada en muchas

ocasiones con neoplasias hematopoyéticas,

particularmente en pacientes con LLA-B (Davis,

2011).

En un trabajo previo del grupo de investigación

se estandarizó un nuevo método cuantitativo para

la evaluación de los niveles de expresión del gen

Ikaros que permitió de una manera costo-efectiva

y sencilla diferenciar diversos tipos de neoplásicas

basándose en la amplificación de las regiones

inter-exónicas. De este modo se pudo diferenciar

de un modo altamente significativo el grupo de

Leucemias mieloides crónicas (LMC), Leucemias

linfoides crónicas (LLC) y Mielomas multiples

(MM).

Junto a la cuantificación de la expresión de

cada región inter-exónica a estudio, otra

característica interesante en dicho estudio fue la

presencia de procesamientos no canónicos,

característica ya conocida en diversas isoformas

de la familia como puede ser la deleción de 30 pb

al final del exón 6 de Ikaros en pacientes con LLA o

una inserción de 60 pb al final del exón 2 (Sun

et al., 1999). El diseño inter-exónico de los

amplicones estaba desarrollado para este fin, de

modo que se pudo constatar a través de la

valoración de la curva de melting de algunos inter-

exones la presencia de dos picos de melting

asociados a la presencia de un procesamiento no

canónico. Concretamente se puedo observar

como la presencia de dos picos de melting en el

interéxón 4-5 era algo muy específico de los casos

de LLA-B, en los que más del 80% de los casos lo

presentaban.

Teniendo esto en cuenta, en el presente

estudio se planteó caracterizar molecularmente

estos procesamientos encontrados en los

pacientes de LLA-B. Para ello los amplicones que

obtuvieron dos picos de melting se clonaron y

secuenciaron. Adicionalmente, se realizó un

estudio bioinformático para estudiar la posible

presencia de sitios de splicing crípticos que

puedan explicar teóricamente la presencia de

dichos procesamientos no canónicos. La

comprobación de un mismo patrón de splicing en

todos los casos de LLA-B supondría un hallazgo

excepcional ya que supondría una característica

muy importante de la enfermedad y con un alto

nivel de poder discriminatorio, para la cual se

podrían diseñar sistemas de cribado rápido y

efectivo para este tipo de neoplasia.

Materiales y métodos

Análisis bioinformático

En primer lugar se procedió a la identificación

de sitios crípticos de splicing alternativo, éste se

realizó con ayuda del programa ESEfinder (2001-

2006, Cold Spring Harbor Laboratory).

Posteriormente se realizó la predicción de los

sitios de unión a secuencias potenciadoras

exónicas (ESEs) en los alrededores de los sitios de

splicing crípticos identificados empleando el

programa Alamut 2.3 (2013, Interactive

Biosoftware Ltd.). Posteriormente, coempleando

el programa Geneious (2005-2013, Biomatters

Ltd.), se seleccionaron las mutaciones que no

presentaran cambios en el marco de lectura y se

construyeron las diferentes isoformas teóricas que

pudieran ocurrir por la selección de uno de los

sitios de splicing alternativos encontrados. Para

finalizar, empleando el mismo programa, se

examinó la existencia de modificaciones en los

dominios de la proteína.

Caracterización molecular

Se utilizaron las muestras de los interexones

amplificados por RT-PCR de los pacientes donde

se observó la presencia de dos picos en la curva de

melting. La ligación se realizó utilizando el

plásmido pGEM®-T Easy (Promega) y ligasa T4. La

transformación con el plásmido se realizó en

bacterias E. coli supercompetentes mediante un

protocolo de shock térmico y fueron cultivaron en

placas de 2xTY con Ampicilina, IPTG y X-gal para la

selección de transformantes. Las plasmipreps de

las colonias seleccionadas se realizaron mediante

un protocolo de lisis alcalina y precipitación salina.

Para la comprobación de la presencia del

inserto, se realizaron digestiones con ADN

plasmídico obtenido de cada clon empleando la

enzima EcoR1 (Promega) y posteriormente se

observaron mediante electroforesis en gel de

agarosa al 2%.

La secuenciación de los clones se realizó por el

método Sanger en el Laboratorio de

Secuenciación de ADN del Departamento de

Ciencias Biológicas de la Universidad de los Andes.

Solo se secuenciaron los clones donde se observó

la presencia de una banda correspondiente a la

presencia del inserto en la electroforesis después

de la digestión.

Resultados

Los análisis bioinformáticos revelaron la

presencia de posibles sitios de sitios de splicing no

canónicos tanto en los extremos de los intrones

como dentro de los exones.

Figura 1. Ubicación espacial de

los sitios de splicing canónicos y

los posibles sitios de splicing

alternativos ubicados en los

extremos de los intrones 4, 6 y

sus exones adyacentes.

Figura 2. Regiones de

reconocimiento de secuencias

consenso de unión de factores

potenciadores de splicing. Se

muestran subrayados en rojo

los punto de corte alternativo

ubicados an (a) 129 pb dentro

del extremo 5’ del intrón 4,

(b) a 48 pb dentro del

extremo 3’ del intrón 4 (c) a

30 pb dentro del extremo 3’

del exón 6 y (d) a 69 pb

dentro del extremo 3’ del

exón 6. (e) leyenda de

relación entre colores y el

reconocimiento de alguna de

las proteínas potenciadores

del splicing.

Tabla I. Secuencias consenso identificadas como posibles sitios de splicing con su ubicación relativa con respecto al sitio canónico y el puntaje. En amarillo se encuentran los sitios de splicing alternativos que conservan el marco de lectura y en negrita los nucleótidos donde ocurre el splicing.

Tabla I. Secuencias consenso identificadas como posibles sitios de splicing con su ubicación relativa con respecto al sitio canónico y el puntaje. En amarillo se encuentran los sitios de splicing alternativos que conservan el marco de lectura y en negrita los nucleótidos donde ocurre el splicing.

La Figura 1 muestra la presencia de los posibles

sitios de splicing identificados por la búsqueda de

secuencias conservadas consistentes tanto con los

sitios donantes como los receptores utilizando el

programa ESEfinder (2001-2006, Cold Spring

Harbor Laboratory). En la Tabla I se presentan las

secuencias de los sitios de splicing predichos por

el programa con su posición relativa al sitio de

splicing canónico y con un valor de puntaje

otorgado por el mismo. Este valor corresponde a

un puntaje relativo basado en el parentesco de la

secuencia identificada con respecto a las

secuencias consenso manejadas por el programa.

Mediante la predicción de la proteina que se

formaría tomando en cuenta los sitios de corte

encontrados, se confirmo la presencia de un sitio

de splicing alternativo posible en cada extremo del

intrón, los cuales permiten que se mantenga el

marco de lectura sin alterar la integridad del resto

de la proteína. En la región interxónica 4-5 se

identificaron dos inserciones: una de 129pb al

extremo del exón 4 y otra de 48pb al extremo del

intrón 5. En la región interexónica 6-7 se identificó

una inserción en el extremo del intrón 7 de 69pb y

una deleción de 30pb del extremo del intrón 6

(Tabla I y Figura 3).

Tabla I. Secuencias consenso identificadas como posibles sitios de splicing con su ubicación relativa con respecto al sitio canónico y el puntaje. En amarillo se encuentran los sitios de splicing alternativos que conservan el marco de lectura y en negrita los nucleótidos donde ocurre el splicing.

Figura 3. Construcción, predicción de estructuras terciarias y ubicación de dominios funcionales de distintas isoformas

hipotéticas. Ik.1: isoforma canoníca. El número de las isoformas alternativas indica el exón donde ocurrió la modificación.

Signo + o – indica presencia de inserción o deleción respectivamente en el exón, mientras que su posición indica el lugar de

la modificación, en el extremo 5’ (derecha) o 3’ (izquierda) del exón. Dominios funcionales en rojo en la parte inferior de la

isoforma. Estructura terciaria (rosado: hélices alfa, amarillo: láminas beta, azul: giros) en la parte superior

El estudio de las ESEs reveló una alta presencia

de sitios de unión para una gran cantidad de

proteínas potenciadoras del splicing alrededor de

los cuatro sitios de splicing crípticos encontrados.

Como se puede observar en la figura 2, estos

posibles sitios de unión se concentran

principalmente en la región exónica de cada sitio

de corte alternativo como es esperado.

Al construir las diferentes isoformas teóricas

que pueden ser formadas por la selección de los

sitios de splicing alternativo y evaluar los cambios

tanto en los dominios funcionales como en la

estructura secundaria de la proteína, se observó

que en ninguno de los caso se presentaban

cambios significativos en la estructura de las

proteínas. Los dominios funcionales importantes

para su funcionamiento, tales como lo son los

cuatro dominios para la unión al ADN y los dos

dominios de dimerización se mantienen intactos

en todos los casos, y con la excepción de la

pérdida o ganancia de unas pequeñas regiones de

hélices alfa y pequeños giros, no se presenta un

cambio significativo evidente (Figura 3).

Para la caracterización molecular de los

procesamientos no canónicos se seleccionaron 6

muestras para secuenciación correspondientes a 4

pacientes diferentes. Las muestras fueron

seleccionadas según el tamaño de la banda

observada en el gel del producto digerido para

asegurar que se encontrara el amplicón insertado

(figura 4). Los resultados de la secuenciación

mostraron la presencia del splicing canónico entre

el exón 4 y el 5, sin embargo hasta los momentos

no se ha logrado identificar la presencia del

splicing aberrante por este método.

Discusión

En primera instancia, el estudio bioinformático

de las regiones interexónicas de interés en las

cuales se sospechaba la presencia de un splicing

alternativo (sitio de splicing entre los exones 4 y 5

y los exones 6 y 7), reveló la presencia de posibles

sitios de splicing crípticos.

Tomando en cuenta el sitio de splicing

canónico reportado para el gen IKZF1, la

amplificación del interexón 4-5 produciría un

amplicón de 156pb, de los cuales 76pb pertenecen

al exón 4 y 89pb al exón 5. Las curvas de melting

de las RT-PCR realizadas para los pacientes con

LLA-B mostraron para los 14 pacientes estudiados

un pico alrededor de los 86.5oC en todos los

casos. Sin embargo, en 13 de los 14 pacientes se

Figura 4. Digestiones del ADN plasmídico de las bacterias transformadas. Se observa en la parte superior el

plásmido en dos conformaciones diferentes y una banda inferior correspondiente al fragmento del amplicon

insertado. Las flechas indican las muestras que fueron seleccionadas para secuenciación

observó la presencia de un segundo pico a 84oC.

Tomando en cuenta que el pico de 86.5oC se

observó en la totalidad de los pacientes con LLA-B

así como en todos los otros pacientes de las otras

neoplasias hematopoyéticas estudiadas, se puede

asumir que éste corresponde al splicing canónico

del gen.

El programa ESEfinder (2001-2006, Cold Spring

Harbor Laboratory) evalúa los posibles sitios de

Splicing por su semejanza a una base de datos de

sitios de splicing de exones constitutivos,

otorgando un puntaje con valores arbitrarios

dependiendo de dicha semejanza (Cartegni et al.,

2003). El programa establece un umbral cercano a

6.7 correspondiente al primer cuantil de todos los

puntajes de los sitios de splicing en la base de

datos. Mediante este programa, se encontraron 4

posibles sitios de splicing en esta región: 2 de ellos

correspondientes a los sitios de splicing canónicos,

y otros 2 dentro del intrón 4 cerca de sus

extremos 5’y 3’.

La predicción de la proteína formada tomando

en cuenta ambos sitios alternativos de splicing

presentaría una inserción de 43 aminoácidos en el

extremo del intrón 4, o de 16 aminoácidos en el

extremo del intrón 5 y se mantiene el marco de

lectura en ambos casos.

La amplificación del sitio de splicing entre el

exón 6 y 7 produciría un amplicón de 152pb, de

los cuales 50pb pertenecen al exón 6 y 102pb al

exón 7. Las curvas de melting mostraron

estudiados un pico a los 85oC para los 14

pacientes con LLA-B, adicionalmente, en 5 de los

14 pacientes se observó la presencia de un

segundo pico a 82oC. Considerando que el pico de

85oC fue encontrado en todos los pacientes

estudiados, es posible asumir que este

corresponde al splicing canónico, mientras que el

segundo pico encontrado en 5 pacientes con LLA-

B, puede corresponder a otra forma de splicing no

canónica.

Al evaluar la presencia de sitios de splicing en

los extremos del intrón 6 y en los exones 6 y 7, se

encontraron un total de 10 posibles sitios de

splicing: los 2 sitios de corte canónicos, 1 en el

interior del exón 6, 2 dentro del intrón en el

extremo cercano al exón 6, 3 dentro del intrón en

el extremo cercano al exón 7, y 2 dentro del exón

7.

De los 8 sitios de splicing crípticos encontrados,

solamente dos de ellos permitía la conservación

del marco de lectura de la proteína sin la inserción

de ningún codón de parada: un sitio de splicing 5’

encontrado a 30 pb dentro del exón 6, y un sitio

de splicing 3’ ubicado a 69 pb dentro del intrón 6

en el extremo cercano al exón 7. La predicción de

la estructura de la proteína muestra que un

splicing alternativo en los sitios crípticos

encontrados significaría una deleción de 10

aminoácidos del exón 6 o una inserción de 23

aminoácidos contiguos al exón 7 respectivamente.

Al observar la estructura primaria y secundaria

de las proteínas formadas empleando los sitios de

splicing alternativos identificados se aprecia que,

aunque se pierden o se ganan pequeñas porciones

de estructuras secundarias, no se ve alterada a

primera vista ningún motivo funcional de la

proteína. Sin embargo, el cambio de las distancias

entre los motivos existentes puede ser el

responsable de los cambios en la actividad de la

proteína. La expresión de isoformas de Ikaros

presentando pequeñas inserciones o deleciones

in-frame, aunque no necesariamente esté

inhibiendo por completo la funcionalidad de la

proteína, puede estar afectando las interaciones

específicas de dicha proteína con algún proceso

celular en particular (Zhong et al., 2009).

El sitio de splicing críptico responsable de una

deleción de 30pb en el extremo del exón 6,

corresponde con los resultados encontrados por

Sun y colaboradores (1999) los cuales reportaron

la expresión de isoformas de Ikaros presentando

esta deleción en pacientes con LLA de células T.

Aunque no se conoce con exactitud cuál es el

efecto que causa esta deleción en el

funcionamiento de la proteína, como ya se ha

mencionado, es probable que altere la

distribución de los motivos funcionales y por lo

tanto pudiendo alterar su capacidad de unión al

ADN, de dimerización o hasta de localización

subcelular (Sun et al., 1999).

Tomando en cuenta los valores del puntaje de

los sitios de splicing encontrados por el software

ESEfinder, los sitios de corte alternativos del

extremo 3’ del intrón presentaron un puntaje muy

bajo en comparación con los sitios de corte

canónicos, sugiriendo que no se encuentran tan

bien conservados y por lo tanto con una menor

probabilidad de ser utilizado como sitio de splicing

alternativo. Por otro lado, los sitios de corte 5’ en

ambos casos si muestran un puntaje mayor al

umbral establecido por el programa, e incluso, en

el caso de la deleción en el intrón 6 ya reportada,

presenta un puntaje mayor al del punto de corte

canónico.

Al realizar la búsqueda de sitios de unión

exónicos de potenciadores de splicing (ESEs), se

observó que los cuatro sitios encontrados

presentaban en sus alrededores una gran cantidad

de posibles sitios de unión, los cuales se

encontraban principalmente en las regiones

exónicas. La presencia de estos sitios de unión a

proteínas potenciadores del splicing no

representan en ningún caso una prueba infalible

de la ocurrencia de un splicing alternativo en los

sitios crípticos identificados, sin embargo, como se

ha demostrado en numerosos estudios (Krainer,

Conway, & Kozak, 1990; Long & Caceres, 2009;

Swanson, Sherer, & Malim, 2010) la presencia de

las proteínas de la familia SR como las SRp40 y

SRp55, así como el factor SF2/ASF son

componentes necesarios para que pueda ocurrir

de forma correcta el splicing del pre-ARNm.

La caracterización molecular por clonación de

cada uno de estos posibles eventos de splicing

alternativo aclarará finalmente cual es la

estructura del splicing aberrante. El análisis

bioinformático ha permitido predecir los posibles

diferentes cambios en el splicing que pueden

explicar la presencia de dos amplicones al

momento de estudiar los sitios de empalme entre

los exones constitutivos.

Conclusiones

El análisis bioinformático permitió predecir

cuatro posibles sitios de splicing alternativos

que pueden explicar la presencia de los dos

picos en las curvas de melting de las regiones

interexónicas estudiadas, notoriamente

permitió la identificación de la deleción de

30pb en el exón 6 la cual ya ha sido reportada

también en estudios previos. La confirmación

de la presencia de estos procesamientos no

canónicos seria definitiva mediante la

secuenciación de estas regiones, sin embargo,

hasta este punto los resultados de la

caracterización molecular solamente han

resultado en la identificación del splicing

canónico. No obstante, se seguirán continuando

los esfuerzos para lograr identificar estas posibles

nuevas variantes de splicing.

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