CARACTERIZACIÓN EN MEDIO SUMERGIDO DE LA DEGRADACIÓN DE …
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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA CARACTERIZACIÓN EN MEDIO SUMERGIDO DE LA DEGRADACIÓN DE LA INULINA POR Lactobacillus delbrueckii QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE INGENIERO EN BIOTECNOLOGÍA PRESENTA: VÁZQUEZ PÉREZ GERSON ARTURO México, D.F. Mayo 2007 DIRECTOR INTERNO: Dr. ENRIQUE DÚRAN PÁRAMO INFORME TÉCNICO DE LA OPCIÓN CURRICULAR EN LA MODALIDAD DE PROYECTO DE INVESTIGACIÓN
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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA
CARACTERIZACIÓN EN MEDIO SUMERGIDO DE LA DEGRADACIÓN
DE LA INULINA POR Lactobacillus delbrueckii
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE
INGENIERO EN BIOTECNOLOGÍA
PRESENTA:
VÁZQUEZ PÉREZ GERSON ARTURO
México, D.F. Mayo 2007
DIRECTOR INTERNO: Dr. ENRIQUE DÚRAN PÁRAMO
INFORME TÉCNICO DE LA OPCIÓN CURRICULAR EN LA
MODALIDAD DE PROYECTO DE INVESTIGACIÓN
i
TABLA DE CONTENIDO
LISTA DE FIGURAS .............................................................................................. III
LISTA DE TABLAS ............................................................................................... VI
I INTRODUCCIÓN .............................................................................................. 1
II ANTECEDENTES ............................................................................................ 3
2.1 Flora bacteriana y tracto digestivo .......................................................... 3
2.2 Probióticos y Prebióticos .......................................................................... 5
2.2.1 Probióticos ......................................................................................... 5
2.2.2 Prebióticos ......................................................................................... 6
2.3 Alimentos funcionales............................................................................... 8
2.4 La inulina .................................................................................................... 9
2.5 Bacterias lácticas ................................................................................... 11
2.5.1 Lactobacillus delbrueckii ................................................................ 12
2.5.2 El medio MRS ................................................................................. 13
III JUSTIFICACIÓN............................................................................................ 14
IV HIPÓTESIS .................................................................................................... 14
V OBJETIVOS ................................................................................................... 15
5.1 Objetivo General .................................................................................... 15
5.2 Objetivos Específicos ............................................................................ 15
VI MATERIALES Y MÉTODOS ........................................................................ 16
6.1 Materiales ............................................................................................... 16
6.2 Métodos .................................................................................................. 16
6.2.1 Peso seco ....................................................................................... 16
6.2.2 Cuenta en placa ............................................................................. 17
6.2.3 Técnica del DNS ............................................................................ 17
6.2.4 Cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) ................ 20
ii
VII RESULTADOS .............................................................................................. 21
VIII ANÁLISIS Y DISCUSIÓN ............................................................................. 40
IX CONCLUSIONES .......................................................................................... 43
X BIBLIOGRAFÍA .............................................................................................. 46
iii
LISTA DE FIGURAS
Número Página
1 Estructura de enlace de fructosas y de la
glucosa en la inulina .................................................................................. 9
2 Vista al microscopio de barrido electrónico del Lactobacillus
delbrueckii ................................................................................................ 12
3 Reacción del DNS con un azúcar reductor .......................................... 17
4 Componentes básicos de un sistema para HPLC .............................. 20
5 Curva de crecimiento de L. delbrueckii en medio MRS ..................... 22
6 Velocidad específica de crecimiento de L. delbrueckii en
medio MRS ............................................................................................. 22
7 Curva promedio de crecimiento de L. delbrueckii con
fructosa como fuente de carbono ......................................................... 24
8 Velocidad específica de crecimiento de L. delbrueckii con
fructosa como fuente de carbono ......................................................... 24
9 Curva promedio de crecimiento de L. delbrueckii con
sacarosa como fuente de carbono ....................................................... 26
10 Velocidad específica de crecimiento de L. delbrueckii con
sacarosa como fuente de carbono ....................................................... 26
11 Cinética de crecimiento con lactosa como fuente de
carbono ................................................................................................... 28
12 Velocidad específica de crecimiento con lactosa como
fuente de carbono .................................................................................. 28
iv
13 Cinética de crecimiento con inulina de dhalia como fuente
de carbono .............................................................................................. 30
14 Velocidad específica de crecimiento con inulina de dhalia
como fuente de carbono ........................................................................ 30
15 Cinética de crecimiento con inulina de chicory como fuente
de carbono .............................................................................................. 32
16 Velocidad específica de crecimiento con inulina de chicory
como fuente de carbono ........................................................................ 32
17 Curva tipo de glucosa ............................................................................ 34
18 Curva tipo de fructosa ............................................................................ 34
19 Curva tipo de sacarosa .......................................................................... 34
20 Curva tipo de lactosa ............................................................................. 35
21 Curva tipo de inulina de dhalia .............................................................. 35
22 Curva tipo de inulina de chicory ............................................................ 35
23 Curva de consumo de sustrato con glucosa como fuente de
carbono ................................................................................................... 36
24 Curva de consumo de sustrato con fructosa como fuente de
carbono ................................................................................................... 36
25 Curva de consumo de sustrato con sacarosa como fuente
de carbono .............................................................................................. 37
v
26 Curva de consumo de sustrato con lactosa como fuente de
carbono ................................................................................................... 37
27 Curva de consumo de sustrato con inulina de dhalia como
fuente de carbono .................................................................................. 38
28 Curva de consumo de sustrato con inulina de chicory como
fuente de carbono .................................................................................. 38
vi
LISTA DE TABLAS
Número Página
1 Compuestos inhibitorios producidos por bacterias ácido
lácticas y sus mecanismos de acción ................................................... 11
2 Composición del medio MRS................................................................. 13
3 Diluciones para las curvas patrón ......................................................... 18
4 Resultados de las cinéticas de L. delbrueckii con glucosa
como fuente de carbono ......................................................................... 21
5 Datos promedio de crecimiento con glucosa como fuente de
carbono .................................................................................................... 21
6 Velocidad específica de crecimiento con glucosa como fuente
de carbono ............................................................................................... 23
7 Resultados de las cinéticas de L. delbrueckii con fructosa
como fuente de carbono ......................................................................... 23
8 Datos promedio de crecimiento con fructosa como fuente de
carbono .................................................................................................... 23
9 Velocidad específica de crecimiento con fructosa como fuente
de carbono ............................................................................................... 25
10 Resultados de las cinéticas de L. delbrueckii con sacarosa
como fuente de carbono ......................................................................... 25
11 Datos promedio de crecimiento con sacarosa como fuente de
carbono .................................................................................................... 25
vii
12 Resultados obtenidos de las cinéticas de crecimiento con
lactosa como fuente de carbono ........................................................... 27
13 Datos promedio de crecimiento con lactosa como fuente de
carbono .................................................................................................... 27
14 Resultados obtenidos de las cinéticas con inulina de dhalia
como fuente de carbono ........................................................................ 29
15 Datos promedio de crecimiento con inulina de dhalia como
fuente de carbono .................................................................................. 29
16 Resultados de las cinéticas con inulina de chicory como
fuente de carbono .................................................................................. 31
17 Datos promedio de crecimiento con inulina de chicory como
fuente de carbono .................................................................................. 31
18 Velocidad específica de crecimiento de L. delbrueckiicon
diferentes azucares ................................................................................ 32
19 Curva tipo de glucosa ............................................................................ 34
20 Curva tipo de fructosa ............................................................................ 34
21 Curva tipo de sacarosa .......................................................................... 34
22 Curva tipo de lactosa ............................................................................. 35
23 Curva tipo de inulina de dhalia .............................................................. 35
24 Curva tipo de inulina de chicory ............................................................ 35
25 Datos obtenidos de la cinética de glucosa .......................................... 36
viii
26 Datos obtenidos de la cinética de fructosa .......................................... 36
27 Datos obtenidos de la cinética de sacarosa ........................................ 37
28 Datos obtenidos de la cinética de lactosa ........................................... 37
29 Datos obtenidos de la cinética de inulina de dhalia ............................ 38
30 Datos obtenidos de la cinética de inulina de chicory .......................... 38
31 Rendimientos de biomasa en base a sustrato para las
diferentes fuentes de carbono .............................................................. 39
1
I . I N T R O D U C C I Ó N
Como parte de los estudios que el Dr. Enrique Durán Páramo está efectuando sobre el
desarrollo de alimentos funcionales se plantea el siguiente proyecto, con la finalidad de
optimizar el crecimiento de Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus NRRL-734 utilizando
como fuente de carbono a la Inulina.
Debido a las propiedades que presenta la inulina, entre las que destaca su actividad como
fibra, así como sus efectos prebióticos en las bacterias lácticas y el ser un sustrato no
degradable para las enzimas del tracto digestivo humano, lo hace una fuente de carbono
muy versátil para el Lactobacillus delbrueckii.
Para determinar el efecto de dicho sustrato sobre el crecimiento del microorganismo, se
realizó una serie de experimentos sobre la caracterización del crecimiento celular y el
consumo de sustrato de diversos azúcares en un medio de cultivo comercial como lo es el
medio de cultivo MRS y en el mismo medio diseñado con la inulina como única fuente de
carbono.
Se determinó la biomasa obtenida por el método de peso seco en cultivo sumergido, así
mismo y con fines de corroborar los resultados obtenidos se realizó una cuenta de
unidades formadoras de colonias (UFC/ml.), sembrando las muestras en placas
compuestas con el medio MRS sólido. Los resultados obtenidos, en ambos casos se
compararon con relación a la composición de cada medio de cultivo.
De manera conjunta se determinó la velocidad de consumo de sustrato comparativamente
contra otros tales como la fructosa, la lactosa y la sacarosa, sustituyendo la fuente de
carbono del medio MRS con alguno de los azúcares mencionados, mediante técnicas
como la cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC). Se compararon las
velocidades de consumo del sustrato y la eficiencia en el crecimiento del volumen celular
con cada una de las fuentes de carbono mencionadas y así se determinó cual de dichos
sustratos es el que contribuye mejor al desarrollo del microorganismo en estudio.
2
De esta manera se caracterizó el crecimiento de L. delbrueckii en función de las
concentraciones de cada sustrato en un medio de cultivo diseñado para su óptimo
crecimiento en cada caso. De los resultados obtenidos de estos análisis se desprenderá
la necesidad de determinar las concentraciones adecuadas de inulina para el crecimiento
de Lactobacillus delbrueckii y de esta forma conseguir un medio de cultivo óptimo para su
desarrollo.
Como una parte adicional al trabajo aquí desarrollado, cabe la posibilidad de utilizar estos
resultados para su aplicación en la inmovilización de Lactobacillus delbrueckii en geles de
alginato o carragenina y determinar las concentraciones de inulina adecuada para
mantener su resistencia a ambientes altamente agresivos como lo es el tracto digestivo
humano.
3
I I . A N T E C E D E N T E S
2.1. Flora bacteriana y tracto digestivo
La flora intestinal es un complejo ecosistema compuesto por varios cientos de especies
de microorganismos, la mayoría de ellos del género bacteria. Este ecosistema incluye
algunos microorganismos considerados patógenos por su capacidad de invadir al
huésped, pero también contiene numerosas especies capaces de promover efectos
benéficos para la salud.
La flora bacteriana se comienza a adquirir inmediatamente después del nacimiento. A los
dos años de edad, la flora establecida es prácticamente definitiva. Hay modificaciones
transitorias derivadas del uso de antibióticos o en relación a cambios dietéticos, pero
suelen ser reversibles, de modo que cada individuo mantiene una flora predominante
relativamente estable (Guarner, 2002).
La composición de la flora bacteriana es variable de un individuo a otro, pero sus
funciones metabólicas son menos diversas. La flora del colon humano tiene una intensa
actividad metabólica por la acción de enzimas bacterianas sobre sustratos presentes en el
intestino.
Las funciones principales de la flora son:
1) Fermentación de residuos de la dieta y mucinas endógenas.
2) Recuperación de energía mediante la generación de ácidos grasos de cadena corta.
3) Protección contra la colonización e invasión de patógenos (efecto barrera).
4) Desarrollo, estimulación y modulación del sistema inmune.
Se estima que cada individuo alberga unos 100 billones de bacterias de unas 400
especies distintas (Salminen, 1998). Más del 95% de esta población de bacterias vive en
el tracto digestivo, sobre todo en el colon, donde se alcanzan concentraciones bacterianas
similares a las de una colonia que crece en el laboratorio sobre la superficie de una placa
de agar. El cuerpo humano es el hábitat natural de muchas de estas especies
bacterianas, que sólo proliferan en el individuo humano (Guarner, 2002).
4
La flora bacteriana del colon constituye un ecosistema donde muchas especies distintas
participan de ciclos vitales interrelacionados o incluso interdependientes, en un ámbito de
gran biodiversidad, comparable a los grandes hábitats naturales de la superficie terrestre,
como bosques, lagos, etc. (Salminen, 1998).
Dichas bacterias están perfectamente adaptadas a su medio natural, que es el ser
humano, porque están asociadas a la vida del hombre desde hace milenios (Bengmark,
1998). Es destacable que en conjunto esta población viva del colon puede alcanzar hasta
400 o 500 gramos (Salminen, 1998).
Su composición es muy variable de un individuo a otro, pero muy estable dentro de cada
individuo Los métodos de biología molecular sugieren que cada individuo alberga una
proporción importante de variedades bacterianas no identificadas que constituirían hasta
un 20 o 30% de su flora (Guarner, 2002).
La colonización del colon aporta al individuo un gran número de genes diversos y activos,
que codifican proteínas y enzimas muy variadas, dando lugar a actividades metabólicas
que se desarrollan continuamente en el colon. Se trata de recursos bioquímicos que no
están presentes en el genoma humano y por tanto, sus funciones no se producirían en
ausencia de vida bacteriana en el colon.
Con ello, se sabe que presenta una intensa actividad metabólica por la acción de enzimas
bacterianas sobre sustratos presentes en el intestino. Algunos autores consideran que la
actividad metabólica de la flora es comparable en su magnitud a la del hígado, pero es
mucho más diversa en funciones (Roberfroid, 1995).
Diversos estudios han demostrado la importancia de la interacción de la flora bacteriana
con su habitad. Autores como Guarner que nos muestra un compendio condensado de las
funciones que desempeñan estos consorcios microbianos y los efectos que tienen las
bacterias probióticas en el mejoramiento de estas funciones corroboran estos datos.
También es evidente que el mal funcionamiento de este microhábitat tiene consecuencias
en el huésped como el desarrollo de encefalopatía hepática, diabetes tipo 2, cáncer de
colon, entre otras muchas afecciones (Guarner, 2002)
5
2.2. Probióticos y Prebióticos
2.2.1. Probiótico
El término probiótico cuyo significando quiere decir “para la vida,” se deriva de la lengua
griega. Primero fue utilizado por Lilly y Stillwell en 1965 para describir las “sustancias
secretadas por un microorganismo que estimula el crecimiento de otro” y puesto en
contraste así con el término antibiótico.
En 1971 Sperti aplicó el término a los extractos del tejido fino que estimulan el crecimiento
microbiano. Parker fue el primero en utilizar el término probiótico en el sentido que es
utilizado hoy y definió probióticos como “organismos y sustancias de los mismos que
contribuyen al equilibrio microbiano intestinal”.
En 1989 Fuller procuró mejorar la definición de Parker de probiótico con la distinción
siguiente: “Un suplemento alimenticio microbiano vivo que afecta benéficamente al animal
huésped mejorando su equilibrio microbiano intestinal”. Esta definición revisada acentúa
el requisito de la viabilidad para los probióticos e introduce el aspecto de un efecto
benéfico en el huésped, que era, según su definición, un animal.
En 1992 Havenaar y otros ampliaron la definición de probióticos con respecto al huésped
y del hábitat de la microflora como sigue: “Un cultivo simple o mixto de microorganismos
viables que aplicado a un animal u hombre afecta benéficamente al huésped mejorando
las características de la microflora indígena”.
Salminen y Schaafsma en 1996 extendieron incluso más la definición de probióticos sin
limitar los efectos de salud propuestos a las influencias en la microflora indígena. Según
Salminen, un probiótico es: “un cultivo microbiano vivo o un producto lácteo cultivado que
afecta benéficamente la salud y nutrición del huésped”. Según Schaafsma, “los
probióticos orales son los microorganismos vivos que ingeridos en cierta cantidad, ejercen
efectos saludables más allá de la nutrición básica inherente”.
Al contrario de otras definiciones, la de Salminen considera los productos lácteos
fermentados y los cultivos microbianos como probióticos. La matriz de un producto puede
afectar la actividad de las bacterias y por tanto la supervivencia y el efecto de los mismos.
6
En la actualidad la definición más aceptada para el término probiótico nos dice: “Son
microorganismos vivos que administrados en cantidades adecuadas confieren efectos
benéficos al huésped” (Iyer, 2005).
Los géneros bacterianos de uso más frecuente como probióticos son lactobacilos y
bifidobacteria. Actualmente, los probióticos se consumen casi exclusivamente como
productos lácteos fermentados tales como yogur o cultivos liofilizados, pero en el futuro
pueden también ser encontrados en vehículos y carnes fermentadas (Roberfroid, 2000).
Después de su paso a través del estómago y del intestino delgado, algún probiótico
sobrevive y se establece en el intestino grueso. De hecho, la capacidad fermentativa del
colon se puede modificar después de la ingesta de probióticos, y la administración oral de
ciertas bacterias del ácido láctico aumentará el número de lactobacilos o de
bifidobacterias en las heces humanas (Roberfroid, 2000). Varios efectos relativos a la
salud asociados al producto de los probióticos han sido divulgados en estudios de
nutrición humana por diversos grupos de investigación (Sanders, 1993).
Los malos hábitos alimentarios inducen a la microbiota intestinal a producir sustancias con
actividad carcinogénica. Estudios epidemiológicos recientes han encontrado en cambio
que dietas suplementadas con Lactobacilos y Bifidobacterias reducen el riesgo de
contraer cáncer de colon (Marquina and Santos, 2001).
2.2.2. Prebiótico
El término prebiótico fue introducido por Gibson y Roberfroid en 1995 que intercambiaron
“pro” por “pre,” el cual significa “antes” o “para.” Definieron prebióticos como “un
ingrediente no digerible que afecta benéficamente al huésped estimulando selectivamente
el crecimiento y/o la actividad de uno o un número limitado de bacterias en el colon”
(Gibson, 1995).
Esta definición más o menos traslapa con la definición de la fibra dietética, a excepción de
su selectividad para ciertas especies. La selectividad fue demostrada para las
bífidobacterias, que se puede promover por la ingestión de sustancias tales como fructo-
oligosacaridos e inulina (Schrezenmeir, 2001).
7
Como hemos mencionado antes, los prebióticos son sustancias no digeribles que se
encuentran en los alimentos. La mayor parte de ellos se incluyen en el grupo de los
fructanos similares estructuralmente a la inulina.
Otros prebióticos son los galacto-oligosacáridos obtenidos por síntesis química a partir de
lactosa, los oligosacáridos extraídos de semilla de soja y los xilo-oligosacáridos, obtenidos
por hidrólisis química de xilanos y polidextrosas o pirodextrinas.
Estos productos son empleados en Europa y Estados Unidos como condimentos
alimenticios en helados, postres, galletas, pastas y alimentos para niños, calculándose su
consumo diario por persona entre 1 a 7 gramos (Marquina, 2001). El consumo de estos
productos de forma “inconsciente” por la población genera una serie de beneficios, pues
la configuración del carbono anomérico 2 hace que no sean digeribles, al menos en el
tracto superior del aparato digestivo, y que sean utilizados preferentemente por la
microbiota del colon, transformándolos por vía fermentativa en ácido láctico y otros ácidos
orgánicos de cadena corta que estimulan de forma selectiva la proliferación de bacterias
lácticas y bifidobacterias en el colon, con los efectos benéficos ya mencionados.
La ingestión de prebióticos es causa de la formación de ácidos orgánicos de cadena corta
en el colon, debido a la fermentación de los mismos, y el descenso de pH en el intestino
aumenta la ionización de elementos como el calcio y el magnesio lo que facilita su
absorción por difusión pasiva (Marquina, 2001).
8
2.3. Alimentos funcionales
La combinación de los deseos del consumidor, de los avances en tecnología alimenticia, y
de la nueva ciencia basada en evidencia que liga dieta a la enfermedad y a la prevención
de la enfermedad, ha creado una oportunidad sin precedente de tratar jornadas de salud
pública con dieta y forma de vida. El amplio interés en los alimentos que puedan promover
la salud ha dado lugar al uso del término “alimentos funcionales.” Si bien la mayoría de los
alimentos se pueden considerar “funcionales,” el término es reservado para los alimentos
y los componentes del alimento que se han demostrado pueden proporcionar beneficios
específicos más allá de la nutrición básica. El término alimento funcional es arbitrario,
pero es útil ya que proveerá al consumidor las características únicas del alimento y los
beneficios asociados.
Se define a los alimentos funcionales como alimentos y componentes del mismo que
proporcionan un beneficio más allá de la nutrición básica. Los ejemplos pueden incluir
alimentos convencionales; fortificados enriquecidos y suplementos dietéticos. Estas
sustancias proporcionan nutrientes esenciales más allá de las cantidades necesarias para
el mantenimiento normal, crecimiento, y desarrollo, y/o otros componentes biológicamente
activos que impartan beneficios o efectos fisiológicos deseables.
Los alimentos funcionales pueden tomar muchas formas. Algunos pueden ser alimentos
convencionales con los componentes bioactivos que se pueden ahora identificar y ligar a
los resultados positivos de la salud. Algunos pueden ser fortificados o alimentos
enriquecidos, creados específicamente para reducir el riesgo de enfermedades. Los
beneficios pueden resultar del aumento del consumo de sustancias o de agregar
sustancias nuevas a la dieta del consumidor (IFT, 2005).
9
2.4. La inulina
La inulina es un término aplicado a una mezcla heterogénea de los polímeros de la
fructosa encontrados y distribuidos extensamente dentro de la naturaleza como
carbohidratos semejantes al almidón. Debido a lo largo de su cadena la inulina es poco
soluble y tiene la capacidad de formar microcristales cuando se encuentra en presencia
de agua o leche.
Dicho componente es un prebiótico presente en gran variedad de frutas y vegetales como
parte de sus estructuras para el almacenamiento de energía, de manera similar a como se
almacena el almidón en el cuerpo humano. La inulina es un polisacárido que se puede
extraer de plantas de distintas familias Liliaceae, Amaryllidaceae, Gramineae y
Compositae, aunque la principal fuente de inulina es la achicoria (Cichorium intybus).
Se entiende por prebiótico como todo aquel componente alimenticio que estimule el
desarrollo y actividad de especies específicas de bacterias en el intestino, siendo la
inulina un polímero conformado por unidades de fructosa ligadas por enlaces y de
manera general se encuentra unida una molécula de glucosa residual por cada cadena de
fructosa mediante un enlace como podemos apreciar en la figura 1 (Niness,
1999).
Figura 1. Estructura de enlace (2-1) de fructosa y (1-2) de la glucosa en la inulina
10
De manera general, la inulina se describe como un oligosacárido que no es digerible por
las enzimas intestinales presentes en la superficie luminal del intestino delgado, alfa
amilasas, sacarasas y alfa glucosidasas, por lo tanto, alcanza el tracto final del intestino
que a partir del ileon inferior contiene bacterias. La microflora intestinal benéfica presente
es capaz de metabolizar preferentemente de forma anaerobia los fructo-oligosacáridos,
dando lugar a productos de degradación tales como ácidos grasos de cadena corta,
dióxido de carbono, aminoácidos de cadena corta y otros metabolitos.
Estudios experimentales in vitro han demostrado que los fructo-oligosacaridos son
metabolizados selectivamente por la microflora benéfica, y que esta fermentación induce
una disminución del pH debido a la producción de grandes cantidades de lactato y acetato
que inhiben el crecimiento de E. coli, Clostridium y otras bacterias patógenas como
Listéria, Shigella o Salmonella (Gibson, 1995).
11
2.5. Bacterias Lácticas
Las bacterias lácticas representan un grupo muy heterogéneo de bacterias Gram positivas
no esporuladas que tienen en común la capacidad de producir ácido láctico por
fermentación de azúcares. Son microorganismos de una limitada capacidad biosintética,
por lo tanto requieren factores de crecimiento complejos como vitaminas del grupo B,
purinas, pirimidinas y aminoácidos (JOINT GENOME INSTITUTE, 2006).
Como carecen de porfirinas y citocromos, las bacterias lácticas no realizan fosforilación
por transporte de electrones ya que reciben energía por fosforilación a nivel sustrato.
Producen energía únicamente por fermentación y carecen de la capacidad de biosíntesis
del grupo hemo, razón por la cual son catalasa negativa. Las flavoproteínas producen
peróxido de hidrógeno en presencia de oxigeno, molécula que es eliminado mediante la
enzima peroxidasa, por lo cual dan positiva la prueba de la oxidasa.
Algunas de las principales características de este género son:
Crecen en presencia o ausencia de O2.
Comúnmente no son móviles.
Forman colonias pequeñas nunca pigmentadas.
Poseen gran tolerancia a la acidez.
Viven en ambientes asociados a plantas y tracto intestinal (principalmente).
Tabla 1. Compuestos inhibitorios producidos por las bacterias ácido lácticas y sus mecanismos de
acción
Compuesto Mecanismo de acción
Ácido láctico y otros ácidos volátiles
Rompimiento del metabolismo celular
Peróxido de Hidrógeno Inactivación de biomoléculas esenciales por la reacción en
cadena anión superóxido. Activación del sistema lactoperoxidasa
Dióxido de Carbono Ambiente anaeróbico y/o inhibición de la enzima descarboxilasa
y/o rompimiento de la membrana celular
Diacetilo Interferencia con utilización de arginina
Bacteriocina (metabolitos secundarios)
Rompimiento de membrana citoplasmática (en el caso de nisina)
12
2.5.1. Lactobacillus delbrueckii
El Lactobacillus delbrueckii es un bacilo gram positivo, que no presenta movilidad, cuyo
tamaño oscila entre 0.5-0.8x 2.0-9.0 m. Las bacterias se presentan aisladas, por parejas
o en cadenas cortas, inmóviles y aflageladas. Así mismo, Lactobacillus delbrueckii
presenta resistencia a los ácidos y un metabolismo fermentativo estricto con producción
de ácido D-láctico a partir de hexosas por la vía de Embden-Meyerhof y es incapaz de
fermentar pentosas (JGI, 2006).
Lactobacillus delbrueckii crece en superficies sólidas, favoreciendo su desarrollo en
ambientes con el 5-10% de CO2. El intervalo de temperatura y pH óptimos para su
crecimiento se sitúa entre 35-38ºC u 5.5-5.8 respectivamente.
Figura 2. Vista al microscopio de barrido electrónico del Lactobacillus delbrueckii
(Foto: Jeff Broadbet, Universidad del estado de Utah)
Una gran variedad de bacterias de este género es reconocida por sus efectos probióticos
en el organismo que las consume.
13
2.5.2. El medio MRS
Hasta antes de los años cincuentas no se tenía un medio de cultivo definido que tuviera
todo lo necesario para el óptimo crecimiento de las bacterias acido lácticas (lactobacilos).
De acuerdo a lo consultado en la bibliografía existe información en el sentido de que los
primeros cultivos se hacían en medios que tenían como base el jugo de tomate (Cox and
Briggs, 1954), en el cual se obtenían resultados variables dependiendo de la especie.
Por esta y otras diversas causas se tuvo la necesidad de generar un medio de cultivo que
provea los requerimientos nutricionales mínimos para el óptimo crecimiento del género de
bacterias lácticas. Rogosa, Mitchell & Wiseman en 1951 describieron un medio de cultivo
selectivo diseñado especialmente para el conteo y aislamiento de lactobacilos, siendo el
resultado de numerosos experimentos el medio MRS (Man et al, 1951), el cual permite el
adecuado crecimiento de cualquier especie de lactobacilos y cuya composición se puede
apreciar en la tabla 2.
Tabla 2. Composición del medio MRS
Fórmula (en gramos por litro)
Glucosa 20
Agar 13
Peptona 10
Extracto de carne 10
Extracto de levadura 10
Acetato de sodio 5
Fosfato dipotásico 2
Citrato de amonio 2
Twen 80 1 ml.
Sulfato de magnesio 0.2
Sulfato de manganeso 0.05
pH final: 6.4 ± 0.2
Este medio de cultivo utiliza a la peptona y glucosa como fuentes de nitrógeno, carbono y
otros elementos necesarios para el crecimiento. El Twen 80, magnesio, manganeso y
acetato, aportan cofactores y pueden inhibir el desarrollo de algunos microorganismos. El
citrato de amonio actúa como agente inhibitorio de bacterias Gram negativas.
14
I I I . J U S T I F I C A C I Ó N
En la actualidad se están desarrollando numerosos productos derivados de la leche, que
aportan beneficios basados en el mejoramiento de la flora microbiana y con el propósito
de desarrollar un alimento funcional capaz de cubrir con los requerimientos diarios se
extiende la necesidad de explorar los beneficios que puede ofrecer Lactobacillus
delbrueckii.
Para lo cual se complementará su crecimiento con un conocido y estudiado prebiótico
como lo es la inulina, para así determinar de qué manera se ven beneficiadas y/o
afectadas las características cinéticas de dicho microorganismo.
Así mismo para determinar la viabilidad de dicha cepa a las condiciones que sostiene el
tracto digestivo se está utilizando un modelo que permite simular las condiciones
extremas y el ambiente altamente agresivo del tracto digestivo, para la cual se necesitan
las relaciones que guardan las concentraciones de inulina en la optimización del
crecimiento del microorganismo y su estabilidad.
I V . H I P Ó T E S I S
La inulina como fuente de carbono dentro del medio de cultivo MRS permitirá un mejor
desarrollo de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus en una fermentación sumergida.
15
V. O B J E T I V O S
5.1. Objetivo General
Determinar el efecto de la inulina sobre el comportamiento cinético de
Lactobacillus delbrueckii.
5.2. Objetivos Específicos
Caracterizar del crecimiento de Lactobacillus delbrueckii subp. bulgaricus
en el medio de cultivo MRS.
Determinar el efecto de la inulina en el medio de cultivo MRS sobre el
crecimiento de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus.
Determinar el efecto de otros azúcares (Fructosa, Lactosa y Sacarosa) en
el medio de cultivo MRS sobre el crecimiento de Lactobacillus delbrueckii
subsp. bulgaricus.
Determinar la concentración óptima de inulina para el crecimiento de
Lactobacillus delbrueckii subp. bulgaricus.
16
V I . M A T E R I A L E S Y M É T O D O S
6.1. Materiales
• Inulina, grado reactivo Sigma I-2255.
• Lactobacillus delbrueckii subp. bulgaricus NRRL-734.
• Reactivos para la preparación del medio MRS.
• Diversos azúcares (Lactosa, Fructosa, Sacarosa).
6.2. Métodos
En principio para evaluar la capacidad de metabolizar la inulina y el impacto en el
crecimiento de Lactobacillus delbrueckii se obtendrán datos experimentales de
crecimiento en fermentación sumergida en caldo MRS variando la fuente de carbono. De
manera conjunta se determinará el consumo de los diferentes sustratos mediante el
empleo de técnicas como se describen a continuación:
6.2.1. Peso seco
Como ya se describió anteriormente, esta técnica esta basada en la diferencia de pesos al
pasar una muestra por un medio filtrante previamente pesado. En la obtención de las
muestras y con los fines que dispone este proyecto se procedió como sigue:
1. Se tomaron 5mL del caldo de fermentación con una pipeta automática en
condiciones de esterilidad.
2. La muestra es depositada en un vaso de precipitados de 10mL.
3. Posteriormente fue extraída mediante una jeringa de 10mL.
4. La muestra obtenida se filtró en una membrana de papel filtro whatman de
0.22 m. de poro previamente pesado en una charola de aluminio.
5. Una vez quedó filtrada la muestra, se colocó en un horno a 60ºC por dos horas.
6. Pasado este tiempo se pesaron nuevamente los filtros y se determinó la cantidad
de biomasa por diferencia de pesos.
17
6.2.2. Cuenta en Placa
Al mismo tiempo que la determinación de biomasa se procedió a determinar las unidades
formadoras de colonias como se describe a continuación:
1. Se obtuvo 1mL de muestra de la fermentación en condiciones de esterilidad.
2. Se hicieron diluciones seriadas hasta 10-6 en tubos de solución salina al 0.9%.
3. De las ultimas dos diluciones se tomaron 0.1mL y se sembraron en placas de agar
MRS extendiendo perfectamente la muestra sobre la superficie, cuidando en todo
momento la esterilidad del proceso.
4. Las placas así obtenidas se incubaron a 37ºC por 24 horas.
5. Pasado este tiempo se contó el número de colonias presentes en cada muestra y
se determinó así las UFC/mL.
6.2.3. Técnica del DNS
Se basa en la reducción del compuesto nitrogenado acido 3,5-dinitrosalicílico a un
compuesto conocido como acido 3-amino-5-nitrosalicílico con la respectiva oxidación del
azúcar en cuestión como se muestra en la figura 3.
Figura 3 Reacción del DNS con un azúcar reductor
Para procesar los datos recabados por medio de esta técnica se debe establecer una
curva patrón que sirva de referencia para determinar las concentraciones de las muestras,
por lo que primero se muestra el procedimiento para la obtención de las curvas patrón de
los distintos azúcares empleados así como el procedimiento para el tratamiento de las
muestras respectivamente:
18
Dado que la técnica del DNS esta descrita para concentraciones entre 0 y 2g/L fue
necesario hacer una dilución de 1:10 a todas las muestras antes de tratarlas y siendo esto
común a todas las muestras podemos decir que la absorbencia a 540nm de la muestra
nos brinda las concentraciones multiplicando por un factor de diez.
Las curvas patrón fueron obtenidas de medio MRS con el azúcar correspondiente a una
concentración de 20g/L que fue diluido 1:10 para obtener una solución de 2g/L,
esterilizando el medio y tomando las muestras de la siguiente manera.
Tabla 3. Diluciones para las curvas patrón
Muestra Concentración de azúcar en la
muestra (g/L)
Volumen (mL) de la
solución de 2g/L
Volumen (mL) de
agua destilada
1 (blanco) 0.00 0.00 1.00
2 2.00 0.10 0.90
3 4.00 0.20 0.80
4 6.00 0.30 0.70
5 8.00 0.40 0.60
6 10.00 0.50 0.50
7 12.00 0.60 0.40
8 14.00 0.70 0.30
9 16.00 0.80 0.20
10 18.00 0.90 0.10
11 20.00 1.00 0.00
Tratamiento de las muestras para la reacción de DNS:
1. En un tubo de ensaye se mezclan 0.5mL del reactivo de DNS + 0.5mL de muestra.
2. Se homogeniza en vortex.
3. Se calienta la solución en baño de agua a ebullición durante 5min exactamente.
4. Justo después se pone la solución en baño de agua fría durante 10min
5. Posteriormente se añaden 5mL de agua destilada a la solución
6. Se homogeniza la solución en vortex.
7. Se determina la absorbencia a 540nm contra el blanco de la curva patrón.
19
Tratamiento aplicado a las muestras de sacarosa, lactosa e inulina para realizar las
curvas tipo mediante la reacción de DNS.
1. De una muestra de medio de cultivo con 20 g/L de azúcar se obtuvo 1mL
2. Se le adiciono 0.5mL de HCL 1N
3. Se llevo a un volumen de 10mL
4. Se coloco en baño de agua a 60ºC
5. A los 30min se detuvo la reacción pasando las muestras a baño de agua fría
6. Se trataron las muestras obtenidas como se describe en la tabla 3
Para las muestras se procedió de la misma manera pero se alteraron los volúmenes
empleados de la siguiente manera:
1. De las muestras filtradas se obtuvo 0.5mL
2. Se le adiciono 0.25mL de HCL 1N
3. Se llevo a un volumen de 5mL
4. Se coloco en baño de agua a 60ºC
5. A los 30min se detuvo la reacción pasando las muestras a baño de agua fría
6. Se trataron las muestras como se describe en la reacción de DNS
20
6.2.4. Cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC)
La HPLC es una técnica donde la muestra se fracciona entre una fase móvil líquida y una
fase estacionaria (Bermejo, 1991). Utiliza una presión muy elevada para forzar el paso del
disolvente por una columna de partículas muy finas (Harris, 2001). Su gran ventaja es la
disminución del tiempo de análisis, aún incluso en mezclas muy complejas. Además,
permite el análisis de sustancias termolábiles.
En esencia, la fase móvil se bombea a través de un sistema de separación compuesto por
un prefiltro y una columna que contiene la fase estacionaria, a una elevada presión. Por
su distinta interacción entre las fases, la muestra es retenida con variable intensidad.
Los componentes básicos de un sistema para HPLC son:
A) Depósitos para la fase móvil (disolventes).
B) Sistema de bombeo para proporcionar presión a la fase móvil.
C) Sistema de inyección de muestras.
D) Columna cromatográfica.
E) Termostatos para las columnas.
F) Detectores.
G) Sistema para el tratamiento de datos y registrador.
Figura 4 Componentes básicos de un sistema para HPLC (Hernández L. 2002)
21
V I I . R E S U L T A D O S
Fue realizada una cinética de crecimiento con el medio MRS con glucosa como fuente de
carbono, dicha cinética fue efectuada por triplicado.
Las concentraciones de biomasa y la cuenta de UFC se muestran en la tabla 4:
Tabla 4 Resultados de las cinéticas de L. delbrueckii con glucosa como fuente de carbono
Cinética 1 Cinética 2 Cinética 3
Tiempo (h)
Masa (mg/mL)
UFC/mL Tiempo
(h) Masa
(mg/mL) UFC/mL
Tiempo (h)
Masa (mg/mL)
UFC/mL
0 1.26 2.20E+08 0 0.98 3.90E+08 0 1.04 2.30E+08
3 1.32 2.50E+08 3 1.10 5.76E+08 3 1.14 2.30E+08
5 1.70 3.20E+08 5 1.37 7.85E+08 5 1.40 2.50E+08
6 1.98 3.70E+08 6 1.64 9.80E+08 6 1.66 3.10E+08
7 2.34 4.60E+08 7 1.96 1.20E+09 7 1.94 3.70E+08
8 2.60 5.80E+08 8 2.20 1.30E+09 8 2.20 4.30E+08
9 2.66 6.20E+08 9 2.26 1.36E+09 9 2.42 4.70E+08
11 2.70 6.50E+08 11 2.24 1.35E+09 11 2.50 4.90E+08
Con los datos obtenidos de las cinéticas, se obtuvo un promedio (Tabla 4) el cual fue
línearizado de acuerdo al modelo de Monod para determinar la velocidad específica de
crecimiento. El resultado de la regresión se muestra en la tabla 5.
Tabla 5 Datos promedio de crecimiento con glucosa como fuente de carbono
Tiempo (h) Masa (mg/mL) UFC/mL Ln(Masa) Ln(UFC/mL)
0 1.093 280000000 --- ---
3 1.187 352000000 0.171 19.679
5 1.490 451700000 0.399 19.928
6 1.760 553000000 0.565 20.131
7 2.080 677000000 0.732 20.333
8 2.333 770000000 0.847 20.462
9 2.447 817000000 --- ---
11 2.480 830000000 --- ---
Dichos datos se graficaron para observar el comportamiento del microorganismo y así
mismo identificar los puntos que caen sobre la fase exponencial para con ellos obtener el
ajuste lineal del modelo de Monod.
22
Figura 5 Curva de crecimiento de L. delbrueckii en medio MRS
Figura 6 Estimación de la velocidad especifica de crecimiento de L. delbrueckii en medio MRS
2.50E+08
3.50E+08
4.50E+08
5.50E+08
6.50E+08
7.50E+08
8.50E+08
9.50E+08
0.7
0.9
1.1
1.3
1.5
1.7
1.9
2.1
2.3
2.5
0 2 4 6 8 10 12
UF
C/m
L
Bio
ma
sa
(m
g/m
L)
Tiempo (h)
Cinetica en mg/mL Cinetica en UFC/mL
y = 0.151x - 0.347R² = 0.993
y = 0.180x + 19.04R² = 0.990
19.8
19.9
20
20.1
20.2
20.3
20.4
20.5
20.6
20.7
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
4.5 5 5.5 6 6.5 7 7.5 8 8.5
Ln
(U
FC
)
Ln
(B
iom
as
a)
Tiempo (h)
Ln (Biomasa) Ln (UFC)
23
De la regresión realizada sobre los datos de crecimiento se obtuvieron las velocidades
específicas de crecimiento que corresponden a las pendientes de las rectas ajustadas.
Tabla 6 Velocidad específica de crecimiento con glucosa como fuente de carbono
Método Velocidad específica de crecimiento (h-1
)
Peso seco 0.151
Cuenta en placa 0.180
Promedio 0.165
El experimento se llevó a cabo de la misma manera cambiando la fuente de carbono por
Fructosa de la cual se muestran a continuación los resultados obtenidos.
Tabla 7 Resultados de las cinéticas de L. delbrueckii con fructosa como fuente de carbono
Cinética 1 Cinética 2 Cinética 3
Tiempo (h)
Masa (mg/mL)
UFC/mL Tiempo
(h) Masa
(mg/mL) UFC/mL
Tiempo (h)
Masa (mg/mL)
UFC/mL
0 1.34 7.00E+07 0 1.36 4.00E+07 0 1.44 5.50E+07
3 1.44 8.00E+07 3 1.44 4.50E+07 3 1.52 6.25E+07
5 1.56 9.00E+07 5 1.64 5.00E+07 5 1.62 7.00E+07
6 1.70 1.00E+08 6 1.82 6.00E+07 6 1.70 8.00E+07
7 2.04 1.20E+08 7 2.14 7.50E+07 7 1.86 9.75E+07
8 2.40 1.40E+08 8 2.30 8.50E+07 8 2.12 1.13E+08
9 2.34 1.50E+08 9 2.40 9.00E+07 9 2.18 1.20E+08
11 2.40 1.55E+08 11 2.42 9.50E+07 11 2.19 1.25E+08
Tabla 8 Datos promedio de crecimiento con fructosa como fuente de carbono
Tiempo (h) Masa (mg/mL) UFC/mL Ln(Masa) Ln(UFC/mL)
0 1.380 55000000 ---- ----
3 1.467 62500000 0.383 17.951
5 1.607 70000000 0.474 18.064
6 1.740 80000000 0.554 18.197
7 2.013 97500000 0.700 18.395
8 2.273 112500000 0.821 18.538
9 2.307 120000000 ---- ----
11 2.337 125000000 ---- ----
Así mismo se muestran las gráficas correspondientes al análisis del crecimiento del
Lactobacilo y la regresión efectuada para ajustar dichos datos.
24
Figura 7 Curva promedio de crecimiento de L. delbrueckii con fructosa como fuente de carbono
Figura 8 Estimación de la velocidad específica de crecimiento de L. delbrueckii con fructosa como
fuente de carbono
5.00E+07
6.00E+07
7.00E+07
8.00E+07
9.00E+07
1.00E+08
1.10E+08
1.20E+08
1.30E+08
1.2
1.4
1.6
1.8
2
2.2
2.4
0 2 4 6 8 10 12
UF
C/m
L
Bio
ma
sa
(m
g/m
L)
Tiempo (h)
Cinetica promedio en mg/mL Cinetica promedio en UFC/mL
y = 0.129x - 0.202R² = 0.997
y = 0.162x + 17.24R² = 0.994
18
18.1
18.2
18.3
18.4
18.5
18.6
18.7
18.8
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
4.5 5 5.5 6 6.5 7 7.5 8 8.5
Ln
(U
FC
/mL
)
Ln
(B
iom
as
a)
Tiempo (h)
Peso seco Cuenta en placa
25
Tabla 9 Velocidad específica de crecimiento con fructosa como fuente de carbono
Método Velocidad específica de crecimiento (h-1
)
Peso seco 0.129
Cuenta en placa 0.162
Promedio 0.145
La siguiente fuente de carbono probada fue la sacarosa y en la tabla 9 podemos observar
los datos obtenidos de la cinética con este sustrato. Al igual que el promedio de dichos
valores ajustados para obtener la velocidad específica de crecimiento.
Tabla 10 Resultados de las cinéticas de L. delbrueckii con sacarosa como fuente de carbono
Cinética 1 Cinética 2 Cinética 3
Tiempo (hrs)
Masa (mg/mL)
Ln (Masa)
Tiempo (hrs)
Masa (mg/mL)
Ln (Masa)
Tiempo (hrs)
Masa (mg/mL)
Ln (Masa)
0 1.12 0.113 0 1.14 0.131 0 1.12 0.113
3 1.12 0.113 3 1.16 0.148 3 1.18 0.166
5 1.2 0.182 5 1.2 0.182 5 1.2 0.182
6 1.3 0.262 7 1.35 0.300 7 1.75 0.556
8 1.56 0.445 9 1.63 0.489 10 2.26 0.815
11 2.3 0.833 11 1.9 0.642 11 2.1 0.742
14 2.74 1.008 13 2.3 0.833 13.5 2.52 0.924
16 2.92 1.072 15 2.7 0.993 15 2.9 1.065
18 2.93 1.075 17 2.9 1.065 17.5 2.915 1.070
19 3 1.099 19 3 1.099 19 3 1.099
Tabla 11 Datos promedio de crecimiento con sacarosa como fuente de carbono
Tiempo (hrs)
Masa (mg/mL)
Ln(Masa)
0 1.127 0.119
3 1.153 0.143
5 1.200 0.182
7 1.467 0.383
9 1.8167 0.597
11 2.100 0.742
13.5 2.520 0.924
15 2.840 1.044
17.5 2.915 1.070
19 3.00 1.099
A continuación se muestran los resultados gráficos del desarrollo de dicha cinética con los
datos promedio de este experimento.
26
Figura 9 Curva promedio de crecimiento de L. delbrueckii con sacarosa como fuente de carbono
Figura 10 Estimación de la velocidad específica de crecimiento de L. delbrueckii con sacarosa como
fuente de carbono
1
1.5
2
2.5
3
3.5
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
Bio
mas
a (m
g/m
l)
tiempo (h)
y = 0.084x - 0.210R² = 0.993
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Ln (
Bio
mas
a)
tiempo (h)
27
En esta etapa de la experimentación se presentaron variaciones muy significativas en la
determinación de la velocidad especifica de crecimiento del microorganismo mediante la
técnica de cuenta en placa por lo que no se reportan los resultados obtenidos.
Del desarrollo de las cinéticas de sacarosa podemos observar que la velocidad específica
de crecimiento del lactobacilo ( es menor incluso que la velocidad reportada para
fructosa, sin embargo la concentración de biomasa es considerablemente mayor.
El cultivo realizado con lactosa como fuente de carbono arroja los siguientes resultados:
Tabla 12 Resultados obtenidos de las cinéticas de crecimiento con lactosa como fuente de carbono
Cinética 1 Cinética 2 Cinética 3
Tiempo (hrs)
Masa (mg/mL)
Ln (Masa)
Tiempo (hrs)
Masa (mg/mL)
Ln(Masa)
Tiempo (hrs)
Masa (mg/mL)
Ln(Masa)
0 0.92 -0.083 0 1.14 0.131 0 1.02 0.0198
3 0.96 -0.041 3 1.15 0.140 3 1.16 0.148
5 1.14 0.131 5 1.21 0.191 5 1.175 0.161
7 1.4 0.336 7 1.55 0.438 7 1.58 0.457
9 1.7 0.531 9 1.89 0.637 9 1.795 0.585
11 2.1 0.742 11 2.26 0.815 12 2.48 0.908
14 2.82 1.037 13 2.58 0.948 13 2.7 0.993
16 3.1 1.131 15 2.89 1.061 15 3.06 1.118
18 3.16 1.151 17 2.92 1.072 17 3.04 1.112
20 3.16 1.151 19 3 1.099 19 3.14 1.144
Tabla 13 Datos promedio de crecimiento con lactosa como fuente de carbono
Tiempo (hrs)
Masa (mg/mL) Ln(Masa)
0 1.027 0.026
3 1.090 0.086
5 1.175 0.161
7 1.510 0.412
9 1.795 0.585
11 2.280 0.824
13 2.700 0.993
15 3.017 1.104
17 3.040 1.112
19 3.100 1.131
Para este sustrato las gráficas correspondientes al crecimiento se muestran a
continuación:
28
Figura 11 Cinética de crecimiento con lactosa como fuente de carbono
Figura 12 Estimación de la velocidad específica de crecimiento con lactosa como fuente de carbono
1
1.5
2
2.5
3
3.5
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
Bio
mas
a (m
g/m
l)
tiempo (h)
y = 0.098x - 0.300R² = 0.989
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Ln (
Bio
mas
a)
tiempo (h)
29
De estas gráficas podemos apreciar que la velocidad específica de crecimiento con
lactosa ( =0.098) es mayor a la obtenida con sacarosa, pero menor aun incluso que con
fructosa como fuente de carbono.
La fuente de carbono de nuestro interés fue probada siguiendo el mismo tratamiento que
para el resto de los azúcares. Se probó inulina obtenida de diferentes fuentes: dhalia y
chicory, ambas de los laboratorios sigma.
Tabla 14 Resultados obtenidos de las cinéticas con inulina de dhalia como fuente de carbono
Cinética 1 Cinética 2 Cinética 3
Tiempo (hrs)
Masa (mg/mL)
Ln (Masa)
Tiempo (hrs)
Masa (mg/mL)
Ln (Masa)
Tiempo (hrs)
Masa (mg/mL)
Ln (Masa)
0 1.02 0.0198 0 1.12 0.113 0 1.04 0.039
3 1.24 0.215 2 1.22 0.199 2 1.18 0.166
4 1.36 0.307 4 1.38 0.322 4 1.3 0.262
6 1.44 0.365 6 1.42 0.351 6 1.43 0.358
9 1.52 0.419 8 1.58 0.457 8 1.47 0.385
11 1.69 0.525 12 1.76 0.565 12 1.64 0.495
14 1.7 0.531 14 1.75 0.560 14 1.63 0.489
16 1.72 0.542 16 1.78 0.577 16 1.62 0.482
20 1.69 0.525 20 1.74 0.554 20 1.65 0.501
24 1.71 0.536 24 1.77 0.571 24 1.66 0.507
Tabla 15 Datos promedio de crecimiento con inulina de dhalia como fuente de carbono
Inulina (dhalia)
Tiempo (hrs)
Masa (mg/mL) Ln(Masa)
0 1.060 0.0583
2 1.213 0.193
4 1.347 0.298
6 1.430 0.358
8 1.523 0.421
12 1.697 0.529
14 1.693 0.527
16 1.707 0.535
20 1.693 0.527
24 1.713 0.538
En las tablas no es posible tener una noción de que datos son útiles en el ajuste de
Monod, por lo cual es imprescindible graficar los resultados en donde podemos darnos
cuenta del comportamiento particular de la cepa frente a este sustrato. Lo cual si es
verdaderamente inusual si consideramos las fases normales del crecimiento de una cepa.
30
Figura 13 Cinética de crecimiento con inulina de dhalia como fuente de carbono
Figura 14 Estimación de la velocidad específica de crecimiento con inulina de dhalia como fuente de
carbono
1
1.1
1.2
1.3
1.4
1.5
1.6
1.7
1.8
0 5 10 15 20 25
Bio
mas
a (m
g/m
l)
tiempo (h)
y = 0.059x + 0.063R² = 0.994
y = 0.028x + 0.184R² = 0.998
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0 2 4 6 8 10 12 14
Ln (
Bio
mas
a)
Ln (
Bio
ma
sa)
tiempo (h)
primeras horas de crecimiento segundo lapso de crecimiento
31
De las gráficas se observa que la velocidad específica de crecimiento ( es baja en
comparación de los demás sustratos, sin embargo una característica que cabe destacar
es que la fase de adaptación no se logra apreciar y el crecimiento es exponencial desde
las primeras dos horas de iniciada la cinética.
Los últimos resultados reportados son los de inulina de chicory que comparativamente
con los de inulina de dhalia presentan el comportamiento ya antes mencionado.
Tabla 16 Resultados de las cinéticas con inulina de chicory como fuente de carbono
Cinética 1 Cinética 2 Cinética 3
Tiempo (hrs.)
Masa (mg/mL)
Ln(Masa)
Tiempo (hrs)
Masa (mg/mL)
Ln(Masa)
Tiempo (hrs)
Masa (mg/mL)
Ln(Masa)
0 1 0 0 1 0 0 1 0
3 1.18 0.166 2 1.18 0.166 2 1.16 0.148
4 1.32 0.278 4 1.32 0.278 4 1.31 0.270
6 1.43 0.358 6 1.45 0.372 6 1.47 0.385
9 1.53 0.425 8 1.51 0.412 8 1.52 0.419
11 1.62 0.482 12 1.62 0.482 12 1.63 0.489
14 1.66 0.507 14 1.64 0.495 14 1.62 0.482
16 1.62 0.482 16 1.65 0.501 16 1.64 0.495
20 1.63 0.489 20 1.61 0.476 20 1.62 0.482
24 1.65 0.501 24 1.63 0.489 24 1.65 0.501
Tabla 17 Datos promedio de crecimiento con inulina de chicory como fuente de carbono
Inulina (chicory)
Tiempo (hrs)
Masa (mg/mL) Ln(Masa)
0 1 0
2 1.173 0.159848701
4 1.317 0.27510329
6 1.450 0.371563556
8 1.520 0.418710335
12 1.623 0.484481648
14 1.640 0.494696242
16 1.637 0.492661653
20 1.620 0.482426149
24 1.643 0.496726699
Considerando que era posible que los resultados de dhalia como fuente de inulina se
parecieran de cierta manera a los de chicory, también se realizó la gráfica
correspondiente observando que los datos de crecimiento no presentaban una evidente
fase lag de desarrollo en los datos de las tablas.
32
Figura 15 Cinética de crecimiento con inulina de chicory como fuente de carbono
Figura 16 Estimación de la velocidad específica de crecimiento con inulina de chicory como fuente de
carbono
1
1.1
1.2
1.3
1.4
1.5
1.6
1.7
0 5 10 15 20 25
Bio
mas
a (m
g/m
l)
tiempo (h)
y = 0.061x + 0.017R² = 0.986
y = 0.018x + 0.264R² = 0.991
0.35
0.4
0.45
0.5
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0 2 4 6 8 10 12 14
Ln (
Bio
mas
a)
Ln (
Bio
mas
a)
tiempo (h)
primeras horas de crecimiento segundo lapso de crecimeinto
33
Como era de esperarse el comportamiento del microorganismo fue muy semejante con
ambas fuentes de inulina y la velocidad específica de crecimiento ( no presenta
grandes variaciones.
Los resultados completos de esta fase de experimentación se muestran condensados en
la siguiente tabla, donde se comparan las distintas fuentes de carbono empleadas para el
crecimiento del microorganismo en estudio.
Tabla 18 Velocidad específica de crecimiento de L. delbrueckii con diferentes azucares
Fuente de carbono Velocidad especifica de crecimiento (h-1
) determinada mediante peso seco.
Glucosa* 0.165
Fructosa* 0.145
Sacarosa 0.084
Lactosa 0.098
Inulina (dhalia) 0.059
Inulina (chicory) 0.061
Nota: *Promedio de la determinación entre peso seco y cuenta en placa.
Hasta este punto la fuente de carbono preferida por los organismos vivos sigue siendo la
glucosa que le aporta un mejor crecimiento, mas sin embargo hay que analizar que otras
implicaciones tiene esto, por lo cual se analizó el consumo de sustrato el cual nos puede
brindar una noción del rendimiento de biomasa en base a sustrato.
Aun cuando pareciera que en este punto nuestra hipótesis ha sido rebatida no podemos
asegurarlo por completo, pues el sencillo hecho de que la fase lag de crecimiento no sea
apreciable o bien sea tan mínima que no pueda ser detectada en lapsos de horas, implica
que el microorganismo está mejor adaptado para consumir este sustrato por encima de
los demás, y por tanto posiblemente esto le brinde beneficios reales a la investigación que
se está llevando a cabo.
Ahora bien, se realizó el análisis de consumo de sustrato por la técnica de DNS para
recabar mayor información del crecimiento en medio sumergido del microorganismo, para
lo cual se realizaron las curvas patrón correspondientes a cada sustrato.
34
Tabla 19 Datos para la curva tipo de glucosa
Glucosa
Tubo Absorbencia Concentración (g/L)
1 0 0
2 0.081 2
3 0.191 4
4 0.302 6
5 0.429 8
6 0.519 10
7 0.680 12
8 0.741 14
9 0.856 16
10 0.968 18
11 1.033 20
Figura 17 Curva tipo de glucosa
Tabla 20 Datos para la curva tipo de fructosa
Fructosa
Tubo Absorbencia Concentración (g/L)
1 0 0
2 0.064 2
3 0.151 4
4 0.242 6
5 0.343 8
6 0.420 10
7 0.520 12
8 0.667 14
9 0.755 16
10 0.803 18
11 0.937 20
Figura 18 Curva tipo de fructosa
Tabla 21 Datos para la curva tipo de sacarosa
Sacarosa
Tubo Absorbencia Concentración (g/L)
1 0 0
2 0.060 2
3 0.139 4
4 0.236 6
5 0.316 8
6 0.406 10
7 0.497 12
8 0.567 14
9 0.641 16
10 0.741 18
11 0.790 20
Figura 19 Curva tipo de sacarosa
y = 18.83xR² = 0.996
0
5
10
15
20
25
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2
glu
cosa
(g/
L)
Abs (540nm)
y = 21.95xR² = 0.991
0
5
10
15
20
25
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
fru
cto
sa (g
/L)
Abs (540nm)
y = 24.83xR² = 0.997
0
5
10
15
20
25
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
saca
rosa
(g/L
)
Abs 540nm
35
Tabla 22 Datos para la curva tipo de lactosa
Lactosa
Tubo Absorbencia Concentración (g/L)
1 0 0
2 0.050 2
3 0.125 4
4 0.225 6
5 0.290 8
6 0.380 10
7 0.485 12
8 0.536 14
9 0.634 16
10 0.673 18
11 0.729 20
Figura 20 Curva tipo de lactosa
Tabla 23 Datos para la curva tipo de inulina de
dhalia
Inulina Dhalia
Tubo Absorbencia Concentración (g/L)
1 0 0
2 0.052 2
3 0.112 4
4 0.191 6
5 0.249 8
6 0.313 10
7 0.372 12
8 0.427 14
9 0.490 16
10 0.523 18
11 0.569 20
Figura 21 Curva tipo de inulina de dhalia
Tabla 24 Datos para la curva tipo de inulina de
chicory
Inulina Chicory
Tubo Absorbencia Concentración (g/L)
1 0 0
2 0.033 2
3 0.093 4
4 0.152 6
5 0.210 8
6 0.274 10
7 0.333 12
8 0.388 14
9 0.451 16
10 0.484 18
11 0.530 20
Figura 22 Curva tipo de inulina de chicory
y = 26.39xR² = 0.993
0
5
10
15
20
25
0 0.2 0.4 0.6 0.8
Lact
osa
(g/
L)
Abs 540nm
y = 33.50xR² = 0.994
0
5
10
15
20
25
0 0.2 0.4 0.6
Inu
lina
de
dh
alia
(g/
L)
Abs 540nm
y = 36.86xR² = 0.995
0
5
10
15
20
25
0 0.2 0.4 0.6
Inu
lina
de
chic
ory
(g/
L)
Abs 540nm
36
Tabla 25 Datos obtenidos de la cinética de glucosa
Muestra Tiempo (h) Absorbencia Concentración (g/L)
0 0 1.068 20.00
1 3 0.843 15.84
2 5 0.820 15.42
3 6 0.770 14.49
4 7 0.752 14.16
5 8 0.679 12.81
6 9 0.610 11.53
7 11 0.479 9.10
Figura 23 Curva de consumo de sustrato con glucosa como fuente de carbono
Tabla 26 Datos obtenidos de la cinética de fructosa
Muestra Tiempo (h) Absorbencia Concentración. (g/L)
0 0 0.925 20.00
1 3 0.788 17.30
2 5 0.742 16.29
3 6 0.726 15.94
4 7 0.689 15.12
5 8 0.629 13.81
6 9 0.495 10.87
7 11 0.463 10.16
Figura 24 Curva de consumo de sustrato con fructosa como fuente de carbono
8
11
14
17
20
0 2 4 6 8 10 12
Glu
cosa
(g/
L)
Tiempo (h)
8
10
12
14
16
18
20
0 2 4 6 8 10 12
Co
nce
ntr
ació
n (
g/L)
Tiempo (h)
37
Tabla 27 Datos obtenidos de la cinética de sacarosa
Muestra Tiempo (h) Absorbencia Concentración. (g/L)
0 0 0.790 20.00
1 3 0.668 16.59
2 5 0.615 15.27
3 6 0.591 14.67
4 7 0.559 13.88
5 8 0.517 12.84
6 9 0.454 11.27
7 11 0.435 10.80
Figura 25 Curva de consumo de sustrato con sacarosa como fuente de carbono
Tabla 28 Datos obtenidos de la cinética de lactosa
Muestra Tiempo (h) Absorbencia Concentración. (g/L)
0 0 0.729 20.00
1 3 0.636 16.78
2 5 0.595 15.70
3 6 0.55 14.51
4 7 0.536 14.15
5 8 0.519 13.70
6 9 0.509 13.43
7 11 0.479 12.64
Figura 26 Curva de consumo de sustrato con lactosa como fuente de carbono
8101214161820
0 2 4 6 8 10 12
Saca
rosa
(g/L
)
Tiempo (h)
8
10
12
14
16
18
20
0 2 4 6 8 10 12
Lact
osa
(g/
L)
Tiempo (h)
38
Tabla 29 Datos obtenidos de la cinética de inulina de dhalia
Muestra Tiempo (h) Absorbencia Concentración. (g/L)
0 0 0.569 20.00
1 2 0.494 16.55
2 4 0.412 13.80
3 8 0.369 12.36
4 14 0.367 12.29
5 18 0.340 11.39
6 24 0.302 10.12
Figura 27 Curva de consumo de sustrato con inulina de dhalia como fuente de carbono
Tabla 30 Datos obtenidos de la cinética de inulina de chicory
Muestra Tiempo (h) Absorbencia Concentración. (g/L)
0 0 0.530 20.00
1 2 0.433 15.96
2 4 0.383 14.12
3 8 0.364 13.42
4 14 0.319 11.76
5 18 0.289 10.65
6 24 0.266 9.80
Figura 28 Curva de consumo de sustrato con inulina de chicory como fuente de carbono
8
10
12
14
16
18
20
0 5 10 15 20 25
Inu
lina
(g/L
)
Tiempo (h)
8
10
12
14
16
18
20
0 5 10 15 20 25
Co
nce
ntr
ació
n (
g/L)
Tiempo (h)
39
De estos resultados se obtiene el rendimiento de biomasa con base en el sustrato
mediante el empleo de la siguiente ecuación:
Donde: Yx/s= Rendimiento de biomasa con base al sustrato
CBF= Concentración final de biomasa en el medio
CBI= Concentración inicial de biomasa en el medio
CSI= Concentración inicial de sustrato en el medio
CSF=Concentración final de sustrato en el medio
Así podemos condensar los resultados de los rendimientos de los diversos sustratos en la
tabla 31 para comparativamente distinguir cual es el que brinda un mayor aporte al
desarrollo de la cepa estudiada.
Tabla 31 Rendimientos de biomasa en base a sustrato para las diferentes fuentes de carbono
Fuente de carbono Rendimiento de biomasa con base al sustrato (Yx/s)
Glucosa 0.126
Fructosa 0.097
Sacarosa 0.105
Lactosa 0.170
Inulina (dhalia) 0.083
Inulina (chicory) 0.084
40
V I I I . A N Á L I S I S Y D I S C U S I Ó N
De los resultados anteriormente descritos podemos observar el cambio significativo que
presenta la velocidad específica de crecimiento al alterar la fuente de carbono de glucosa
a fructosa, lo cual era de esperarse pues de manera general para todos los
microorganismos la fuente de carbono predilecta es la glucosa pues es mediante la cual
se lleva a cabo la obtención de energía de manera mas eficiente.
Esta aseveración podría debatir la hipótesis planteada para este trabajo, sin embargo
también es cierto que ésta no es una regla, por la misma razón es que se están llevando
acabo las cinéticas con la finalidad de corroborar dichas teorías, pues si bien es cierto que
los microorganismos comparten ciertas características, no todos sus mecanismos
metabólicos han sido desentrañados y esto podría suponer que realmente el Lactobacillus
delbrueckii sea capas de metabolizar alguno de dichos azúcares con mayor eficacia para
el desarrollo de la biomasa en un cultivo sumergido que la propia glucosa.
El comportamiento reportado para la cinética con sacarosa no arroja una tendencia,
siendo considerables las variaciones en la velocidad específica de crecimiento entre la
cuenta en placa y la obtención del peso seco.
Por tal motivo no se podría asegurar que la velocidad estimada por el método de cuenta
en placa sea confiable debido a esta variación. Los datos por teoría deben poder ser
ajustados a una tendencia estadísticamente por lo que se realizaron diversas cinéticas
para intentar llevar los datos a algo estable mediante las replicas del experimento, sin
embargo los intentos no fueron concisos y la variación fue demasiado grande reportando
errores por encima del 100%.
Antes de descartar el empleo de esta técnica se realizaron más de cinco cinéticas de
crecimiento para este sustrato, observando un comportamiento errático en cada
determinación lo cual puede estar relacionado a dos factores principalmente. Uno es el
comportamiento del microorganismo estudiado frente a un disacárido para lo cual no hay
resultados reportados por la literatura. Por otro lado el desarrollo de la técnica de cuenta
41
en placa puede no ser el adecuado para llevar acabo la determinación y esto provoque
que los resultados se enmascaren en algún punto del desarrollo del método empleado.
Es bueno notar que aun cuando el Lactobacillus delbrueckii es un microorganismo
ampliamente estudiado, no hay datos reportados de su velocidad especifica de
crecimiento para las condiciones descritas en este trabajo.
La comparación de las velocidades específicas de crecimiento nos muestra que la
glucosa es el sustrato más significativo en el crecimiento del microorganismo, por otro
lado la lactosa como sustrato tiene un rendimiento mayor de biomasa sobre la misma
cepa. Esto es importante para los objetivos del trabajo, pero si comparamos a la inulina
como fuente de carbono pareciera que no presenta ninguna ventaja en el crecimiento de
la cepa en un cultivo sumergido.
Esto es solo de manera aparente pues al analizar con detalle los tiempos en los que se
tomaron las muestras se aprecia claramente que la inulina le permite un mantenimiento
celular más prolongado, esto es que en un tiempo mucho mayor la inulina se mantiene
presente y por ende la viabilidad de la sepa por encima de los otros sustratos, que en
tiempos menores su concentración ha disminuido considerablemente.
También es claramente notoria la carencia de fase lag en las cinéticas de inulina, lo que
presupone que el microorganismo está mejor adaptado para metabolizar este sustrato,
más no así para desarrollar biomasa a partir del mismo.
La velocidad de crecimiento en ambas fuentes cae de manera considerable alrededor de
las primeras cuatro horas de crecimiento, pero manteniendo un crecimiento exponencial
del cual se puede obtener una segunda velocidad de crecimiento como si se tratase de
dos fuentes distintas de carbono y presentase un crecimiento de tipo diauxico.
Lo que se sugiere es que el microorganismo usa los extremos de las cadenas de inulina
para las primeras horas de su desarrollo dejando a un lado los núcleos de fructosas que
son más difíciles de desdoblar y una vez se ha agotado su primera forma de metabolizar
la inulina entonces comienza rompiendo los núcleos que presentan una mayor resistencia.
42
Esto se explica debido a que en toda literatura citada describen a la inulina como un
análogo del almidón y dado que este último presenta esta característica es probable que
también la inulina.
Tomando en consideración todo lo anterior aunado a que la inulina es el único sustrato
para el cual el tracto digestivo humano no tiene enzimas, entonces podemos decir que la
inulina realmente le brinda ventajas considerables al desarrollo de Lactobacillus
delbrueckii en una fermentación sumergida.
43
I X . C O N C L U S I O N E S
Se estudio el efecto de la inulina sobre el comportamiento cinético de Lactobacillus
delbrueckii.
Se obtuvo la velocidad específica de crecimiento ( =0.165 y el rendimiento de
biomasa (Yx/s=0.126 para el Lactobacillus delbrueckii en el medio de cultivo MRS
con glucosa como fuente de carbono.
Se analizó el efecto de la fructosa, lactosa y sacarosa, como fuente de carbono,
sobre el crecimiento de Lactobacillus delbrueckii, obteniéndose la velocidad
específica de crecimiento y los rendimientos de biomasa con base en el sustrato
para cada fuente de carbono: fructosa ( =0.145 y Yx/s=0.097), sacarosa ( =0.084 y
Yx/s=0.105), lactosa ( =0.098 y Yx/s=0.170).
Se realizaron cinéticas de crecimiento microbiano con inulina de diferentes fuentes
(dhalia y chicory), como fuente de carbono en el medio MRS obteniéndose la
velocidad específica de crecimiento y el rendimiento de biomasa con base en el
sustrato para cada una, respectivamente, ( =0.059 y Yx/s=0.083) y ( =0.061 y
Yx/s=0.084).
44
X . B I B L I O G R A F Í A
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CARACTERIZACIÓN EN MEDIO SUMERGIDO DE LA DEGRADACIÓN DE LA INULINA POR Lactobacillus delbrueckii.
Gerson Arturo Vázquez Pérez, Cesar Jiménez Sierra, Enrique Durán Páramo*. Laboratorio de Bioconversiones, Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología del Instituto Politécnico Nacional, Av. Acueducto s/n, Col. La Laguna Ticomán, México, 07340, Distrito Federal, Correo electrónico: [email protected]
Palabras clave: Lactobacillus delbrueckii, inulina. Introducción. En la actualidad el desarrollo de numerosos productos derivados de la leche que aportan beneficios basados en el mejoramiento de la flora microbiana ha tomado una importancia relevante (1). Lactobacillus delbrueckii es una bacteria láctica prebiótica ampliamente utilizada en la producción de yogurt (3). Con la finalidad de desarrollar alimentos funcionales con características prebióticas y prebióticas, el presente trabajo se enfoca en la caracterización cinética del crecimiento de Lactobacillus delbrueckii en medios de cultivo con diferentes fuentes de carbono, entre ellas el prebiótico inulina (2). Metodología. Para el presente estudio se utilizó la cepa de Lactobacillus delbrueckii NRRL-734 obtenida del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos de Norteamérica. La estimación de la biomasa se llevó a cabo tanto por cuenta en placa como por peso seco. La determinación del consumo de sustrato para los diferentes azúcares se llevó a cabo por el método del ácido 3,5-dinitrosalicílico (4). Resultados y discusión. El cuadro 1 presenta la velocidad específica de crecimiento de Lactobacillus delbrueckii bajo las diferentes fuentes de carbono. La velocidad específica de crecimiento de Lactobacillus delbrueckii fue mayor teniendo a la glucosa como fuente de carbono con respecto a los otros azúcares estudiados. Sin embargo, el rendimiento de biomasa con base en el consumo de sustrato fue mayor cuando se utilizó lactosa como fuente de carbono. Por otro lado en la figura 1 se puede apreciar que Lactobacillus delbrueckii hidroliza más lentamente la inulina, proveniente de dos diferentes fuentes, con respecto a los otros azúcares.
Figura 1.Cinética de consumo de diversos azúcares por Lactobacillus delbrueckii.
Las cinéticas de crecimiento de Lactobacillus delbrueckii realizadas con inulina como fuente de carbono, indistintamente de la fuente de procedencia, no presentaron alguna fase lag de crecimiento; lo que permite suponer que Lactobacillus delbrueckii tiene una cierta preferencia por este sustrato, aunque ello no se manifiesta en la velocidad de crecimiento de la bacteria con la inulina como fuente de carbono, ya que ésta presenta valores muy bajos. Cuadro 1.Velocidades específicas de crecimiento y rendimientos con base en el sustrato con diferentes fuentes de carbono.
Fuente de carbono adicionada al medio
Velocidad especifica de crecimiento (h-1)
Rendimiento de biomasa (Yx/s)
Glucosa 0.150 0.126
Fructosa 0.100 0.097
Sacarosa 0.084 0.105
Lactosa 0.098 0.170
Inulina dhalia 0.059 0.083
Inulina chicory 0.061 0.084
Conclusiones y perspectivas. Lactobacillus delbrueckii metaboliza más rapidamente la glucosa que cualquier otro azúcar estudiado. Sin embargo, la lactosa produce más biomasa por gramo de azúcar. Aparentemente, la inulina representa una fuente de carbono de lenta utilización por Lactobacillus delbrueckii. La carencia de fase lag en las cinéticas de inulina presupone que el microorganismo está mejor adaptado para metabolizar este sustrato, más no así para producir biomasa a partir del mismo. Lactobacillus delbrueckii hidroliza la inulina y puede ser utilizado conjuntamente para el desarrollo de alimentos funcionales simbióticos; esto es que contengan prebióticos y probióticos. Agradecimientos. Al Dr. Enrique Durán Páramo, a Cesar Jiménez Sierra y a todos mis compañeros de estudios, pues sin ellos no habría llegado hasta donde estoy. Referencias.
1. Ferrer Lorente B, Dalmau Serra J. (2001). Alimentos funcionales: probióticos. Acta Pediatr Esp; 59:150-155.
2. Gibson G. R. (1999). Dietary modulation of the human gut microflora using the prebiotics oligofructose and inulin. Journal of Nutrition (129), 1438S-1441S.
3. Joint Genome Institute (2006) L. delbrueckii Home University of California http://genome.jgi-psf.org/draft_ microbes/lacde/lacde.home.html
4. Negro MJ et al. (2006) Inulin-Containing Biomass for Ethanol Production Applied Biochemistry and Biotechnology Vol. 129-132.
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