“Caracterización de las variantes del gen de K-caseína en ...

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA

“CARACTERIZACIÓN DE LAS VARIANTES DEL GEN DE K-CASEÍNA EN

RAZAS DE GANADO BOVINO”

TESIS

QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE

MAESTRO EN CIENCIAS DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA

PRESENTA

I.B.Q. VÍCTOR INOCENCIO PACHECO CONTRERAS

REYNOSA, TAMPS. NOVIEMBRE, 2010

“Caracterización de las variantes del gen de K-caseína en razas de ganado bovino”

V

AGRADECIMIENTOS

Le doy gracias a Dios por haberme dado la oportunidad de realizar este trabajo.

A la Dra. Ana María Sifuentes Rincón por su apoyo constante e incondicional, por su

paciencia en su asesoría y la confianza que depositó en mí para desarrollar este trabajo.

A la comisión revisora de tesis, Dra. Ana María Sifuentes Rincón, Dr. Gaspar Manuel

Parra Bracamonte, Dr. Javier Rosales Alday, M.C. Cristian Lizarazo Ortega y al Dr.

Víctor Ricardo Moreno Medina por su disponibilidad y sus observaciones acertadas que

hicieron mejorar este trabajo.

A mis compañeros de generación, Lupita, Samanta, Perla, Eliseo, Dr. Cerezo, Luis,

Paco, Salvador, Alfonso, Camilo, por sus experiencias, conocimientos y amistad dentro

y fuera del salón de clases, les deseo un rotundo éxito en todo lo que emprendan.

A mis compañeros de laboratorio de Biotecnología Animal Dra. Ana, Dr. Manuel, M.C.

Xochitl, M.C. Williams, Brenda, Carmen, Perla, Diana, Sojan, Denisse, Gisela, Luis,

Rey David, Breidy, por su apoyo y asesoría incondicional en cuestiones prácticas y

teóricas que favorecieron a mejorar mi formación profesional y por todos aquellos

momentos de convivencia y alegría.

Al Centro de Biotecnología Genómica del Instituto Politécnico Nacional, por abrirme

sus puertas y poder ampliar mi conocimiento en el campo de la ciencia mediante todos

los medios necesarios otorgados para lograrlo.

Al Dr. Juan Carlos Martínez González y al Dr. Gaspar Manuel Parra Bracamonte, por su

asesoría en el análisis de los datos.

Agradezco a CONACYT, Becas PIFI, GRUPO FINANCIERO SANTANDER,

FORDECYT, ICEST, quienes en su momento me brindaron el apoyo para hacer mi

Maestría.

A cada uno de los académicos, quienes con paciencia supieron compartir sus

experiencias y conocimientos que encaminaron a mejorar nuestra formación profesional.

“Muchas gracias”


VI

DEDICATORIAS

Dedico este trabajo a mis padres

Eliseo Pacheco Cruz y María Natividad Contreras Osorio, quienes supieron comprender

mi deseo de continuar estudiando y por la fortaleza que me brindaron en cada momento

de la maestría.

A mi hermano Rolando y a la memoria de mi hermano Roberto,

para mis hermanas, Sinfo, Águeda, Yola, Paula, Cata, Vicky y Mary quienes nunca

dejaron de motivarme para alcanzar esta meta más de mi vida y a cada uno de mis

sobrinos.

A Cliz, Mary, Eliseo, Belinda, Josafath, Thamar, Matías, Gris, Chuy,

Rigo, Esther, Elvia, Ginette, Cheli, Llallita, Yuri, Rosita, Elim, Melina, Iran David, por

la amistad especial que me han dado y el cariño que les tengo.

A cada uno de mis amigos de San Peter, Puebla, Toño, Leo,

Javier, Luis, Peluchin, Etó, Erick, Manolo, Pavel, Tury, Hugo, Omar, Mariony, Monss,

gracias por su amistad y todos aquellos momentos de convivencia.

Y muy especialmente dedico este trabajo a una mujer tan especial en mi vida,

Gaby; gracias por brindarme tu apoyo, tu tiempo, por escucharme y comprenderme,

agradezco a Dios por darme la oportunidad de conocerte.


VII

ÍNDICE

Sección Página

AGRADECIMIENTOS ................................................................................................ V

DEDICATORIAS ....................................................................................................... VI

LISTA DE CUADROS ................................................................................................. X

LISTA DE FIGURAS ................................................................................................. XI

LISTA DE SÍMBOLOS Y/O NOMENCLATURA ................................................. XIII

RESUMEN ................................................................................................................ XVI

ABSTRACT ............................................................................................................ XVII

1. INTRODUCCIÓN ..................................................................................................... 1

2. ANTECEDENTES ..................................................................................................... 3

2.1. La ganadería bovina ............................................................................................ 3 2.2. Ganado bovino con orientación a producción de carne ...................................... 3 2.3. Ganado bovino con orientación a producción de leche ...................................... 5

2.4. Ganado bovino en sistemas de producción de doble propósito .......................... 6 2.5. Mejoramiento genético........................................................................................ 7

2.6. Mejoramiento genético en ganado bovino .......................................................... 8 2.6.1. Estrategias para la selección artificial en ganado bovino............................. 8

2.6.1.1. Selección tradicional ............................................................................. 8 2.6.1.2. Selección por pedigrí............................................................................. 9 2.6.1.3. Selección por prueba de progenie ......................................................... 9 2.6.1.4. Evaluaciones génicas ............................................................................ 9

2.7. Selección asistida por marcadores genéticos .................................................... 10

2.8. La leche como alimento y materia prima .......................................................... 12 2.9. Composición de la leche ................................................................................... 12

2.10. Marcadores asociados a la calidad de la leche ................................................ 14 2.11. Gen K-caseína (CSN3) .................................................................................... 18

3. JUSTIFICACIÓN .................................................................................................... 23


VIII

4. OBJETIVO GENERAL ........................................................................................... 24

4.1. Objetivos específicos ........................................................................................ 24

5. HIPÓTESIS .............................................................................................................. 24

6. MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................................ 25

6.1. Origen del material biológico ........................................................................... 25 6.2. Genotipificación de las nueve variantes del gen K-caseína .............................. 27

6.2.1. Extracción del ADN ................................................................................... 27 6.2.2. Cuantificación del ADN genómico ............................................................ 28

6.2.3. Diseño de la estrategia para caracterizar nueve variantes del gen K-caseína

.............................................................................................................................. 28 6.3. Análisis estadístico ............................................................................................ 32

6.3.1. Cálculo de frecuencias ............................................................................... 32

6.3.2. Equilibrio de Hardy-Weinberg ................................................................... 32 6.3.3. Análisis de asociación ................................................................................ 33

7. RESULTADOS ........................................................................................................ 34

7.1 Diseño de estrategia para caracterizar nueve variantes del gen K-caseína ........ 34 7.2 Genotipificación de las poblaciones de estudio ................................................. 34

7.2.1 Formación de los cluster A y B ................................................................... 34 7.2.2 Diferenciación de las variantes del cluster A .............................................. 37

7.2.3 Diferenciación de las variantes del cluster B .............................................. 40 7.3. Frecuencias genotípicas y alélicas .................................................................... 42

7.3.1. Frecuencias genotípicas y alélicas en la población de Carora ................... 42 7.3.2. Frecuencias genotípicas y alélicas en la población de Gyrholando ........... 42 7.3.3. Frecuencias genotipos y alélicas en la población Charolais ...................... 43

7.4. Análisis de asociación del genotipo sobre PD205 ............................................ 44

8. DISCUSIÓN ............................................................................................................ 45

8.1. Tipificación de las variantes del gen CSN3 ...................................................... 45 8.2. Análisis de frecuencias ...................................................................................... 46

8.2.1. Frecuencias genotípicas y alélicas del gen CSN3 en la población de Carora

.............................................................................................................................. 46


IX

8.2.2. Frecuencias genotípicas y alélicas del gen CSN3 en la población

Gyrholando ........................................................................................................... 47 8.2.3. Frecuencias genotípicas y alélicas del gen CSN3 en la población Charolais

.............................................................................................................................. 49 8.3. Análisis de asociación de las variantes del gen CSN3 ...................................... 50

9. CONCLUSIONES ................................................................................................... 52

10. RECOMENDACIONES ........................................................................................ 53

11. REFERENCIAS ..................................................................................................... 54

12. GLOSARIO ........................................................................................................... 68

APÉNDICES ................................................................................................................ 71


X

LISTA DE CUADROS

Cuadro Página

1 Principales variantes de los genes de caseína asociados a rasgos de

productividad…………..…………………………………………………..... 17

2 Secuencia de aminoácidos y nucleótidos de las variantes del gen CSN3…... 19

3 Iniciadores y tipos de ensayos para la detección de nueve variantes del

gen CSN3……………………………………………………………………. 30

4 Muestras de tres poblaciones bovinas agrupadas en el cluster A y B………. 34

5 Frecuencias genotípicas y alélicas de la población Carora………………….. 42

6 Frecuencias genotípicas y alélicas de la población Gyrholando……………. 43

7 Frecuencias genotípicas y alélicas de la población Charolais……………….. 43

8 Medios de cuadrados mínimos para el efecto del genotipo sobre características

de crecimiento.……………………..…………………………………………. 44


XI

LISTA DE FIGURAS

Figura Página

1 Principales estados productores de ganado bovino de carne en

México………………………………………………………………………. 4

2 Principales países productores de leche bovina en 2006……………………. 5

3 Composición de la leche en ganado bovino………………………………… 13

4 Estructura del locus de genes que codifican a las proteínas de caseína……... 15

5 Organización estructural de unidad transcripcional de CSN3………………. 18

6 Diseño de iniciadores para detección de SNP………………………………. 29

7 Estrategia basada en PCR-RFLP, para la determinación simultanea de nueve

variantes del gen K-caseína…………………………………………………. 35

8 Resultado de la amplificación por PCR de la población Charolais…………. 36

9 Patrones de la digestión con Hind III y Taq I……………………………….. 36

10 Análisis de la variante E…………………………………………………….. 37

11 Confirmación de la variante E por secuenciación………………………….... 38


XII

12 Análisis de un heterocigoto para la variante H determinado por

secuenciación………………………………………………………………… 38

13 Patrón de digestión con Alu I para determinar la variante I………………..... 39

14 Patrón de digestión con Hae III para determinar la variante J………………. 40

15 Patrón de digestión con Fok I para determinar la variante C………………... 41

16 Análisis por secuenciación para determinar la variante C…………………... 41


XIII

LISTA DE SÍMBOLOS Y/O NOMENCLATURA

˃ Mayor que

˂ Menor que

% Porciento

± Más o menos

°C Grados centígrados

µl Microlitro

µM Micromolar

A Adenina

AI Inseminación artificial

BLUP Best linear unbiased prediction

C Citosina

Da Dalton

DEP Diferencia esperada en la progenie

DNA Ácido desoxirribonucléico

dNTPs Desoxirribonucleotidos trifosfatados

EDTA Ácido etilendiaminotetraacético

G Guanina

GLM General Lineal Models (Modelos lineales generales)

HW Equilíbrio de Hardy-Weinberg

IFE Isoelectroenfoque


XIV

Kb Kilobase

Kg Kilogramo

MALDI-MS Espectrofotometría de masa-Desorcion/ionización mediante

laser asistida por matriz

SAM Selección asistida por marcadores

MgCl2 Cloruro de magnesio

min Minuto

ml Mililitro

mM Milimolar

NOM Norma oficial mexicana

OMTE Ovulación múltiple y transferencia de embriones

p/v Peso/volumen

pb Pares de bases

PCR-ACRS Creación de sitios de restricción artificial basada en la reacción

en cadena de la polimerasa

PCR-RFLP Polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción basada en la

reacción en cadena de la polimerasa

PCR-SSCP Polimorfismos de conformación de cadena simple basada en la

reacción en cadena de la polimerasa

PD205 Peso ajustado a los 205 días

pH -log [H+]

QTLs Loci de rasgos cuantitativos

QTNs Nucleótidos de rasgos cuantitativos

RP-HPLC Cromatografia líquida de alta eficiencia en fase reversa

rpm Revoluciones por minuto

s Segundo


XV

SGE Electroforesis en gel de almidón

SNPs Polimorfismo en un solo nucleótido

S-S Enlace disulfuro

SSA Secretaría de salud y asistencia

T Timina

Taq ADN polimerasa Thermus aquaticus

U Unidad

UV Ultravioleta

X Por

χ2

Chi cuadrada


XVI

RESUMEN

La ganadería bovina es una de las actividades productivas más desarrolladas y

practicadas en México, generando dos productos básicos para la dieta del hombre: carne

y leche. Actualmente, los mercados de estos productos exigen criterios de calidad

nutricional y sanitaria, entre otros. El contenido proteico en la leche ha sido considerado

como buen indicador para incidir en su calidad, y en ganado de carne; la producción de

leche es uno de los principales factores involucrados en la habilidad materna que afecta

la eficiencia productiva de las crías. De las proteínas de la leche, la K-caseína es muy

importante ya que tiene variantes que se han asociados a producción y contenido

proteico, dos de las características deseables en la industria láctea. El objetivo del

presente trabajo fue caracterizar las variantes alélicas del gen K-caseína y determinar su

efecto sobre rasgos productivos en poblaciones de la raza Carora, Gyrholando y

Charolais, para lo cual se diseñó una estrategia basada en PCR-RFLP y en algunos casos

PCR-ACRS para caracterizar las nueve variantes de K-caseína. La estrategia se optimizó

y aplicó para tipificar tres poblaciones de ganado bovino con diferente fin productivo.

En Carora las frecuencias alélicas fueron de 0.41 y 0.59 para los alelos A y B

respectivamente, en Gyrholando fueron 0.83, 0.13, 0.02 y 0.01 para los alelos A, B, E y

H respectivamente, y en Charolais fueron 0.40 y 0.60 para las variantes A y B,

respectivamente. Se realizó un análisis de asociación entre las variantes encontradas en

la raza Charolais y el peso al destete ajustado a 205 días, encontrando que el genotipo

favorable BB ejerce un efecto significativo para peso al destete ajustado. En la población

Carora y Gyrholando no se realizó este análisis por falta de datos productivos. La

aplicación de la estrategia de detección para las nueve variantes del gen de K-caseína

permitirá evaluarlas y definir su efecto sobre la calidad de la leche en ganado bovino.


XVII

ABSTRACT

The cattle producction system, is one of the activities most deloveped and

extended througrout México, providing two basic products for the human diet: meat and

milk. Upto date, the markets for these products require have nutritonal quality and health

criteria, among others. High protein content in milk has been considered as a good

indicator of quality and in beef cattle, the milk production is one of the main factors

involved in maternal ability that affects offspring productive efficiency. Among the milk

proteins, the K-casein is very important because it has variants that have been associated

to production and protein content, two of the desirable characteristics in the dairy

industry. The aim of this study was characterize the allelic variants of K-casein gene and

determine its effect on productive traits in populations of Carora, Gyrholando and

Charolais cattle, for which was designed a strategy based on PCR-RFLP and PCR-

ACRS in some cases, to characterize the nine variants of K-casein. The strategy was

optimized and applied to genotyping three populations of cattle with different productive

purposes. In Carora breed, the allelics frequencies were of 0.41 y 0.59 for A and B

alleles, respectively; in Gyrholando breed were 0.83, 0.13, 0.02 and 0.01 for A, B, E and

H alleles, respectively; and in Charolais breed, were 0.40 and 0.60 for A and B alleles,

respectively. Asociation analysis was performed between the variants of K-casein found

in Charolais breed and adjusted weaning weight to 205 days, finding that the BB

favorable genotype had significant effect on ajusted weaning weight. In Carora and

Gyrholando populations were not performed the asociation analysis due to lack of

productive data. The implementation of the strategy for detection of nine variants of K-

casein gene will allow evaluate and define its effect on milk quality in cattle.


1

1. INTRODUCCIÓN

El cambio de vida que experimentó el hombre con el paso de la vida nómada al

sedentarismo, hace aproximadamente 10,000 años; le permitió desarrollar actividades

que llevaron a la domesticación de especies vegetales y animales, dando lugar a la

agricultura y la ganadería, respectivamente (Jann et al., 2004; Hocquette y Gigli, 2005).

En la actualidad, la ganadería en México, es una de las actividades más

desarrolladas y practicadas, ocupa más del 50% de la superficie nacional, para la cría de

bovinos en sistema extensivo, donde 32 millones de cabezas de ganado bovino

aproximadamente, son explotados en este sistema. La ganadería es fuente principal de

alimento, empleo, vestido y entretenimiento. En México la ganadería contribuye con el

18% y 33% de leche y carne respectivamente de la producción total dentro del sector

agropecuario y es considerada como una de las principales actividades productivas en la

población rural (Magaña et al., 2006).

El poco desarrollo de la ganadería en México, se ha asociado a diversos factores

como el financiamiento, infraestructura, la escasa aplicación tecnológica dentro de los

sistemas de selección y mejoramiento genético de hatos para una mayor producción,

limitándose al empleo de estrategias tradicionales (Pereda et al., 2005; Gallardo et al.,

2006; Romero et al., 2009).

Como resultado de las investigaciones científicas, actualmente se cuenta con

estrategias que tienen como objetivo aumentar el rendimiento y efectividad de la

producción, y estas incluyen desde una alimentación adecuada, estrategias de mercadeo,

tratamiento del animal hasta, el mejoramiento genético asistido por marcadores (SAM)

(Cunningham y Meghen, 2001; Dekkers y Hospital, 2002; Van Eenennaam, 2006;

Canizal y Rivera, 2007). El SAM consiste en la selección de animales que son

portadores de genes o variantes génicas que les permitirán un desempeño favorable en

rasgos productivos de interés.


2

Debido a que la producción y el contenido proteico de la leche, en ganado

lechero han sido considerados uno de los principales objetivos de mejora, se han

realizado estudios encaminados a la búsqueda de genes asociados al contenido proteico

en leche (Lara et al., 2002; Matějíček et al., 2007; Rachagani y Dayal, 2008, Dogru y

Ozdemir, 2009). El gen K-caseína, ha sido ampliamente estudiado, se han descrito nueve

variantes, siendo las variantes A y B, las más frecuentemente reportadas en ganado

bovino. La variante B, es la de mayor interés debido a que se ha asociado a resistencia

térmica, menor tiempo de coagulación, mejor formación del cuajo y diferentes tamaños

de micelas, características favorables para la industria de quesos (Azevedo et al. 2008).

Gracias a la gran cantidad de estudios, sobre el efecto de estas variantes en

características productivas es bien conocido en ganado lechero y en algunos países ya

representa un criterio de selección (Lunden, 2005; Octaviano et al., 2005; Rachagani y

Dayal, 2008; Azevedo et al., 2008; Comin et al., 2008; Dogru y Ozdemir, 2009). Sin

embargo, su efecto en razas de ganado con otro fin productivo no ha sido estudiado. En

ganado de carne, la habilidad materna es uno de los principales factores que afecta la

eficiencia productiva y siendo la producción de leche un componente importante de la

habilidad materna, por lo tanto; podría ser importante evaluar si existe alguna asociación

entre los genotipos de las variantes de caseína con el desempeño materno en ganado

bovino de carne y doble propósito.


3

2. ANTECEDENTES

2.1. La ganadería bovina

La explotación del ganado bovino constituye la mayor parte de la producción

pecuaria a nivel mundial, gracias a la característica particular de su sistema digestivo,

que permite transformar su alimento en proteínas, necesarias para la dieta del hombre,

que son adquiridos a través de la carne y leche, (Cruz, 2006). La explotación del ganado

bovino se ha logrado con la implementación de tres sistemas de producción: de carne,

leche y un tercero llamado de doble propósito, aprovechando en esta último, la carne y

leche.

2.2. Ganado bovino con orientación a producción de carne

En México el ganado bovino destinado a producción de carne, representa la

principal actividad del sector pecuario y la más practicada en áreas rurales, ocupando el

53.7% de los 200 millones de hectáreas del territorio nacional (Osuna, 2002).

Entre los principales estados productores de ganado bovino de carne, se

encuentra Veracruz con un promedio de 440 mil toneladas, que representa el 14.2% de

la producción total en México, seguido de Jalisco con 350 mil toneladas con el 11.3%, y

Chiapas con 190 mil toneladas representando el 6.3%. Los estados de Baja California,

Sinaloa y Sonora representan el 13.6%. Todos ellos representan el 45.4% de la

producción nacional, mientras que el 54.6% está dividida entre el resto de los estados del

país (Figura 1).


4

Figura 1. Principales estados productores de ganado bovino de carne en México

(FUENTE: DGEAPEAS, 2009)

El mejor desarrollo del ganado bovino orientado a producción de carne, se logra

con los sistemas de manejo semi-intensivo e intensivo, donde la combinación del

suplemento alimenticio, y el confinamiento por un periodo de tiempo (90 días) permiten

que el animal adquiera una mayor ganancia de peso, obteniendo como subproductos

vaquillas o becerros en pie o la carne de bovino en canal para su venta o exportación

respecto al manejo extensivo donde la alimentación básica es el pastoreo y por ende su

actividad constante para conseguirlo, limitan su buen desarrollo(DGEAPEAS, 2009).

La producción de ganado en pie o en canal, son las dos principales actividades

que generan divisas en la ganadería bovina de carne. En el periodo 2000-2008, se ha

incrementado la producción, alcanzando una tasa media de crecimiento anual (TMCA)

de 1.89 y 2.12 % de ganado en pie y en canal respectivamente. La exportación de

animales en pie, oscila en 1.5 millones de cabezas al año. Por otro lado, el proceso de

engorda del animal, finaliza con su sacrificio, obteniendo de esta manera la carne en

canal y su destino al mercado para su comercialización (DGEAPEAS, 2009)

Vercruz 14.20%

Jalisco 11.30%

Chiapas 6.30%

Baja california 4.60%

Sinaloa 4.50%

Sonora 4.50%

Resto del país 54.60%


5

2.3. Ganado bovino con orientación a producción de leche

El inventario de ganado lechero asciende a 2 966 117 cabezas de ganado,

representando el 12.72% del total del hato ganadero bovino (SIAP, 2008).

En el año 2006, se registró una producción de más de 10 mil millones de litros,

alcanzando un incremento de 126.2 millones de litros respecto a la producción reportada

en 2004. Estas cifras posicionan a México en el lugar número 15 de los principales

países productores de leche a nivel mundial (Figura 2) (SAGARPA, 2007). Los sistemas

de producción lechera se clasifican en seis regiones: 1) la Laguna (Coahuila y Durango),

2) el Bajío (Guanajuato, Michoacán, Querétaro, y parte de Jalisco), 3) Altos de Jalisco-

Zacatecas-Aguascalientes, 4) Chihuahua, 5) Puebla-Tlaxcala y 6) México-Hidalgo. Las

regiones 1 y 3 son las principales productoras, aportando un 10.5 y 17.5%

respectivamente (Améndola et al., 2005.).

Figura 2. Principales países productores de leche bovina en 2006 (millones de

toneladas) (FUENTE: SAGARPA, 2007)

EUA 82.5

India 39.8

China 32.2

Fed. Rusa 31.1Alemania 28.5

Brasil 25.3

Francia 24.2

Reino Unido 14.6

Nueva Zelanda 14.5

Ucrania 13

Polonia 12Italia 11

países bajos 10.5Australia 10.3 México 10


6

2.4. Ganado bovino en sistemas de producción de doble propósito

El sistema de producción de bovinos de doble propósito (SPBDP), utiliza razas

Bos indicus y sus cruzas con Bos taurus, y tiene dos objetivos fundamentales, la

producción de leche que se obtiene con ordeña manual y con el apoyo del becerro que

estimula el descenso de la leche, y la producción de carne mediante la cría de becerros al

destete y el recambio o desecho de bovinos para el abasto de carne (Vilaboa-Arroniz,

2009). El SPBDP es el más importante en el trópico de México, con 64% de los

productores practicándolo (Pérez et al., 2001). En México, el inventario de ganado de

doble propósito asciende a 2 466 477 cabezas de ganado, representando el 10.6% del

total del hato ganadero (SAGARPA, 2007). El factor económico en este sistema

depende de la producción de leche pero también de su producción de carne (Lacayo,

2008).

La eficiencia reproductiva depende del intervalo entre partos, con promedio de

447 días; en cambio en vacas de doble propósito es mayor a 490 días, mediante

amamantamiento tradicional, donde el becerro permanece con su madre por 5 a 8 horas

después del ordeño (Pérez et al., 2001). El amamantamiento retrasado por 8 horas

después del ordeño reduce en 21 días el periodo parto-primera ovulación, logrando la

ovulación en los primeros 100 días de posparto alcanzando una mayor probabilidad que

las vacas queden premiadas (Pérez et al., 2001). Los becerros ganan 200-250 g/día de

peso sin afectar la producción de leche ni el peso corporal de la vaca (Pérez et al., 2001).

En México las principales razas de doble propósito están constituidos

primordialmente por cruzas Bos taurus y Bos indicus en diferentes proporciones, las

razas más empleadas son: Pardo Suizo, Holstein y Simmental con Cebú (Arellano et al.,

2006, Vilaboa-Arroniz, 2009). Las principales entidades que cuentan con este sistema de

producción son: Tamaulipas, Veracruz, Tabasco, Campeche, Quintana Roo, Yucatán,

San Luis Potosí, Guerrero, Oaxaca y Chiapas (Arellano et al., 2006; Vilaboa-Arroniz, et

al., 2009).


7

2.5. Mejoramiento genético

El objetivo principal, de todo ganadero es implementar estrategias para mejorar

el desempeño productivo, rendimiento y eficiencia de sus animales, lo que permite

obtener productos en cantidad y calidad. La implementación de programas de

mejoramiento genético contribuye a alcanzar este objetivo. Esta actividad ha sido

practicada desde la domesticación del ganado bovino, mediante la selección tradicional

basada en la diferencia de rasgos fenotípicos del animal (Van Eenennam, 2006). El

mejoramiento genético es la aplicación de la información biológica, económica y

matemática para incrementar el merito del animal a favor de una característica de interés

(productivo, reproductivo o estético) seleccionándola para su mayor rendimiento y

eficiencia (Montaldo y Barría, 1998; Dekkers y Hospital, 2002; Ravagnolo et al., 2005;

Hocquette et al., 2006).

La evaluación de mediciones fenotípicas y pedigrí del animal, es y será

información fundamental, para el mejoramiento animal. La selección intra-razas, inter-

razas y la práctica de cruzamientos, son las tres formas en que se logra el mejoramiento

animal además de conocer la estructura genética de la raza. Su aplicación es de acuerdo

a la característica de interés, objetivo para la conservación o propagación en la

población, controlando costos y la consanguinidad en su implementación (Montaldo y

Barría, 1998).

Se han desarrollado diferentes métodos para el mejoramiento genético, que

favorecen la evaluación genética y distribución del material genético seleccionado.

Dentro de estas tecnologías reproductivas se encuentran la inseminación artificial (AI),

la ovulación múltiple y transferencia de embriones (OMTE), la fertilización in vitro de

embriones, así como el uso de marcadores moleculares (Huanca, 2001; Phillips, 2001;

Ball y Peters, 2004; Keith, 2004; Van Eenennaam, 2006).


8

2.6. Mejoramiento genético en ganado bovino

La selección y los sistemas de apareamiento son la base fundamental del

mejoramiento genético animal. Una selección exitosa, se basa en el conocimiento de los

parámetros genéticos, como la heredabilidad, varianza genética y correlación genética

del rasgo de interés, así como también en identificar que animales poseen los mejores

valores genéticos y como estos pueden ser apareados para aumentar la frecuencia de los

alelos deseados en la progenie, lográndose el mérito genético deseado (Montaldo y

Barría, 1998; VanRaden, 2004; Dekkers y Hospital, 2002; Parra et al., 2005; Visscher et

al., 2008)

2.6.1. Estrategias para la selección artificial en ganado bovino

La selección consiste en determinar que individuos conformaran la base de

progenitores de un hato ganadero. Existen dos tipos de selección: la natural y la

artificial. La primera se define como cambios genéticos producidos por la fuerza de la

evolución en los seres vivos generando cambios graduales anatómicos y fisiológicos,

hasta la creación de nuevas especies (Warwick y Legates, 1992; Rodero y Herrera, 2000;

Majarrez, 2001). La selección artificial por su parte, es controlada por el hombre, y

considera dos aspectos importantes, la selección de reemplazos y la eliminación de

animales no deseados (Warwick y Legates, 1992; Rodero y Herrea, 2000; Perfectti, et

al., 2009).

Algunas de las estrategias empleadas dentro de la selección artificial son:

2.6.1.1. Selección tradicional

Esta estrategia se basa principalmente en la observación de los atributos físicos y

características biológicas del animal candidato a ser parental de la siguiente generación,

las principales características que se toman en esta estrategia son: aplomos,

temperamento, salud, metabolismo, color y pigmentación, las cuales no son

cuantificables y se basan principalmente en el conocimiento, la experiencia y la


9

percepción individual de cada ganadero, esto conlleva a resultados en tiempos

prolongados, sin embargo su aplicación ha sido base en los sistemas de mejoramiento

animal (Vergara y Truffer, 2004; Van Eenennaam, 2006).

2.6.1.2. Selección por pedigrí

La población bovina puede ser clasificada en animales reproductores (registros

de pedigrí) y productores. El pedigrí de un animal es el historial de las características

productivas de sus antepasados o emparentados, lo cual predice el mérito real del animal

a seleccionar con el fundamento de que las características heredables provienen de sus

parentales (http://intranet.uach.cl/dw/canales/repositorio/archivos/1012.pdf; SENAFAD,

1985, Warwick y Legates, 1992).

2.6.1.3. Selección por prueba de progenie

La aplicación de esta estrategia, permite evaluar el genotipo de un animal con

base a rasgos cuantitativos de su progenie (Ochoa, 1991; Warwick y Legates, 1992). Su

éxito radica en que haya un número adecuado de animales sometidas a la prueba, por lo

tanto el costo y el tiempo necesario para realizarla, son las principales limitaciones que

resultan de su implementación.

Sin embargo, comparado con la estrategia de selección tradicional genera un

resultado favorable cuando se considera rasgos que pueden ser medidos a gran escala,

por ejemplo la producción y concentración proteica de la leche (Lunden, 2005;

Ciappesoni et al., 2009).

2.6.1.4. Evaluaciones génicas

Las evaluaciones genéticas dependen de la información generada en las pruebas

de progenie. El ganadero busca la certeza de la predicción de características productivas

y reproductivas de los individuos que adquiere para el reemplazo de su hato ganadero.

http://intranet.uach.cl/dw/canales/repositorio/archivos/1012.pdf


10

Esta respuesta puede ser obtenida mediante modelos estadísticos que permiten

determinar el valor genético de los animales considerando datos productivos,

morfológicos, genealógicos, influencias ambientales y la variabilidad genética (Ramírez-

Valverde et al., 2008).

El Valor Genético Esperado (VGE) y Diferencia Esperada en la Progenie

(DEP=1/2 VGE) son la estimaciones más precisas del valor genético del animal para

rasgos de importancia económica. Son resultados de evaluaciones que se hacen con las

bases de datos donde se tiene integrada la información de pedigrí, sistemas de control y

registros de producción. La interpretación y la aplicación son relativamente fáciles

durante su implementación, como respuesta permite estimar el desempeño futuro de la

progenie y además facilita la diferenciación de individuos dentro de una raza para un

rasgo especifico (Dekkers y Hospital, 2002; Ciappesoni et al., 2009;

http://www.limousinmexico.com/DOCS/INTERPRETACION%20DE%20EVALUACI

ONES%20GENETICAS%20EN%20BOVINOS%20DE%20CARNE.pdf). En países

productores de carne como Australia, Canadá y Estados Unidos, han obtenido grandes

beneficios con su implementación (Massmann, 2004).

Los DEP´s, son obtenidos por modelos mixtos usando el Mejor Predicción Lineal

no Sesgada (BLUP, por sus siglas en ingles), metodología que permite estimar los

diferentes efectos fijos y aleatorios, que actúan simultáneamente en un rasgo específico

considerando el parentesco y los factores ambientales. El avance en programas

computacionales, ha logrado simular el intercambio genético natural de una población y

la implementación de programas de mejoramiento para sugerir las mejores cruzas que

deben realizarse (Kinghorn, 1999 citado por De la Rosa, 2003).

2.7. Selección asistida por marcadores genéticos

El amplio desarrollo y la implementación de la biotecnología en las diferentes

áreas biológicas incluyendo la industria pecuaria, ha permitido caracterizar la

variabilidad genética presente en la secuencia de DNA de los animales, lográndose tener

http://www.limousinmexico.com/DOCS/INTERPRETACION%20DE%20EVALUACIONES%20GENETICAS%20EN%20BOVINOS%20DE%20CARNE.pdf



11

una mejor comprensión de la relación del genotipo y el fenotipo observado (Casas,

2002; Dekkers y Hospital, 2002; http://www.ias.ac.in/currsci/oct25/articles19.htm). La

aplicación de la selección asistida por marcadores (SAM por sus siglas en inglés) ha

contribuido al incremento de la productividad en la ganadería. En el SAM, se integra la

información genética molecular, considerando el modelo infinitesimal y el desequilibrio

de ligamiento de los marcadores, (Dekkers y Hospital, 2002; Van Ennennaam, 2004;

Dekkers, 2005).

La mayoría de los rasgos seleccionados son rasgos cuantitativos, es decir son el

resultado de la influencia de varios genes y factores ambientales. La arquitectura

genética de las características cuantitativas, es complejo y conocer el número de genes

que participan en la variación genética, es realmente complicado. La caracterización de

los genomas con diferentes tipos de marcadores moleculares como microsatélites y

polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs por sus siglas en inglés) ha permitido

identificar QTL´s (loci de rasgos cuantitativos) y de mayor especificidad QTN´s:

(nucleótidos de rasgos cuantitativos) asociados a rasgos cuantitativos complejos o

costosos de medir (resistencia a enfermedades), y de baja heredabilidad como

fecundidad, eficiencia reproductiva, producción de leche, habilidad materna y

características de crecimiento, que son de gran interés económico y otras con alta

heredabilidad, como las propiedades organolépticas, la calidad y rendimiento de la canal

en la cual es necesario sacrificar al animal para medirlos (Casas, 2002; Casas et al.,

2003; Dekkers y Hospital, 2002; Deyoung y Honeycutt, 2005; Casas, 2006; Van

Eenennaam et al., 2006; Allan y Smith, 2008).

La información que genera un marcador genético, refuerza la decisión para

seleccionar animales altamente productivos, ya que animales que heredan el marcador,

también heredan los efectos positivos asociados a ella (Dekkers, 2004; Naqvy, 2007). El

amplio estudio de los marcadores genéticos, ha permitido definir su efecto positivo sobre

diferentes rasgos de interés económico, independientemente del grupo racial o genético.

http://www.ias.ac.in/currsci/oct25/articles19.htm


12

En el caso particular del ganado lechero, los polimorfismos del gen K-caseína,

son ampliamente empleados por tener gran influencia en las propiedades de la leche en

cuanto al proceso de manufactura de productos lácteos (Farrel, 2004; Azevedo et al.,

2008).

2.8. La leche como alimento y materia prima

La leche es un fluido biológico complejo de color blanquecino opaco con alto

valor nutricional, producida en las glándulas mamarias de los mamíferos (NOM-184-

SSA1-2002; Phadungath, 2005). La leche es la fuente única de alimento para los

becerros y para todo mamífero recién nacido, pues en ella encuentra elementos

esenciales para su crecimiento y desarrollo como proteínas, minerales, carbohidratos,

ácidos grasos y vitaminas (Figura 3) (Rijnkels, 2002; Usme-Ciro et al., 2004;

Phadungath, 2005; Kamiński et al., 2007; Requena et al., 2007). La leche además de ser

considerada como alimento, es la materia prima principal para la elaboración de una

gran cantidad de derivados lácteos. La calidad de los productos derivados de bovinos

depende de la integración de factores entre los cuales se encuentran la seguridad, rasgos

sensoriales y nutricionales, posibilidad de seguir al producto desde su origen

(trazabilidad) y características de su producción (Hocquette y Gigli, 2005).

2.9. Composición de la leche

La proteína es el componente más valioso de la leche, constituye el 3.5% del

total de los compuestos (Figura 3), su concentración y composición varia durante la

lactación y el tipo de raza (Agudelo y Bedoya, 2005). La capacidad de unirse a fosfato

de calcio permite la formación de complejos coloidales, llamados micelas de caseína, y

gracias al medio ácido del estómago, son coagulados y aprovechados por el organismo

de cualquier mamífero recién nacido y durante su infancia. (Rijnkels, 2002; Kamiński et

al., 2007). En la leche hay dos principales grupos de proteínas: caseínas y proteínas

séricas o proteínas del suero de la leche, constituyendo el 80 y 20% respectivamente.


13

Figura 3. Composición de la leche en ganado bovino (FUENTE: Usme-Ciro, et al.,

2004).

La caseína es una sustancia orgánica nitrogenada producida en las células de las

glándulas mamarias, cuyas moléculas poseen el elemento fósforo, de color amarillento

sin sabor ni olor e insoluble en agua se encuentran asociadas a calcio. Se obtienen por la

precipitación de las proteínas con agentes coagulantes biológicos (quimosina, pepsina) o

químicos (acido clorhídrico) (a un pH de 4.6 a 20 °C) que rompen el enlace químico

(Rijnkels, 2002; Requena et al., 2007). En el periodo de lactancia, inicia la agregación y

asociación de las caseínas en partículas esféricas, llamadas; micelas de caseína de

estructura sólida y esponjosa formada por un 92% de caseína y un 8% de sales

(principalmente fosfato de calcio en su estado coloidal) (Ferrandini et al., 2006). La

proporción de K-caseína varía en relación inversa con el tamaño de la micela, mientras

que la de β-caseína lo hace en forma directa (Ferrandini et al., 2006). La posición de K-

caseína en la periferia de la micela de caseína, ejerce un efecto en la regulación del

tamaño y mantenimiento de la suspensión de las caseínas de la leche (Ferrandini et al.,

2006).

Proteínas 3.5 Lípidos 4.8Carbohidratos 3.7

Vitaminas y minerales 0.7

Agua 87.3


14

Las caseínas se han agrupado en αs1-caseína (CSN1S1), αs2-caseína (SCN1S2),

β-caseína (CSN2) y K-caseína (CSN3) además de γ-caseína (γ-CN) la cual se encuentra

en menor proporción, y se deriva de la degradación de β-caseína (CSN2) (Bawden y

Nicholas, 1999; Farrell, 2004; Balteanu et al., 2008). Las proteínas de caseína se

caracterizan por la gran cantidad de variantes genéticas que se han descrito así como a la

presencia de un número variable de serin-fosfato, residuos de grupos propilo,

exponiéndose a un número mayor de procesos de fosforilación y modificación de la

estructura respectivamente (Phadungath, 2005; Ferrandini et al., 2006; Kamiński et al.,

2007).

Las proteínas séricas o proteínas del suero de la leche, son proteínas sensibles al

calor, se desnaturalizan fácilmente y se vuelven insolubles después del tratamiento

térmico. Hay dos principales tipos, α-lactoalbúmina y β-lactoglobulina, el resto en

menor proporción conformado por albúminas del suero, inmunoglobulinas, peptonas

proteasas, enzimas y proteínas con funciones metabólicas específicas como lisozimas y

lactoferrina (Phadungath, 2005; Ferrandini et al., 2006; Kamiński et al., 2007).

2.10. Marcadores asociados a la calidad de la leche

Muchos de los productos lácteos derivados del ganado bovino, dependen de las

propiedades de la proteína de la leche (Phadungath, 2005), su concentración es

considerada como buen indicador para incidir la calidad de la leche; por lo tanto,

mejorar esta característica se ha convertido en uno de los objetivos de mejora del hato

ganadero. Una alimentación apropiada de los animales favorece la producción óptima de

leche, pero limita la variación de su composición, debido a que intervienen factores

ambientales aunado a la composición genética del animal (Requena et al., 2007). La

mayoría de los aspectos de la calidad de la leche pueden estar afectados en cierto grado

por los genes, ya que la mayoría de ellos están asociados a características cuantitativas.

Por lo tanto, la búsqueda de genes asociados a rasgos de calidad de la leche es uno de los

objetivos principales para el mejoramiento de esta característica (Kamiński, 2004;

Lunden, 2005.)


15

Los genes que codifican a las proteínas de caseína se localizan en el cromosoma

6q31-33 en un locus de 250 Kb y están organizados en forma de cluster en el orden; αs1-

caseína, β-caseína, αs2-caseína y K-caseína (Figura 4), La orientación transcripcional va

en el sentido 5´ a 3´, excepto β-caseína, que lo hace en sentido 3´ a 5´ (Jann et al., 2004;

Kamiński, 2004; Azevedo et al., 2008).

Figura 4. Estructura del locus de genes que codifican a las proteínas de caseína.

(FUENTE: Bawden and Nicholas, 1999)

La secuenciación de genes de caseínas en varias especies, han clasificado en dos

grupos: caseínas sensibles a calcio y las que están físicamente y funcionalmente ligados

a ella. Los genes CSN1S1, CSN2 y CSN2S2 están relacionados evolutivamente y se

localizan en una región de 140 Kb y pertenecen al primer grupo mientras que el gen

CSN3 corresponde al segundo y se localiza en una región de 70 kb. El mapeo físico ha

revelado que el orden y orientación de los genes de caseínas son conservadas en varias

especies. El gen CSN3 es altamente conservado en humanos, bovinos, ratón y rata. Esto

puede ser explicado ya que las caseínas sensibles a calcio provienen de un mismo gen

ancestral que reclutaron exones que codifican elementos necesarios para estas proteínas

que funcionan como nutrientes y transportadores de minerales. De la misma manera

pasó con el gen ancestral de CSN3 para participar en la solubilización de las caseínas.

Otra explicación, particularmente para CSN2, su origen parte de mecanismos similares

de genes en respuesta inmunológica que fueron evolucionando para ofrecer elementos

nutricionales y modular la actividad inmune (Rijnkels, 2002; Rijnkels et al., 2003).


16

Como se muestra en el cuadro 1, los genes del locus de las proteínas de caseína,

se han estudiado en diferentes especies domésticas y en particular en el ganado bovino;

se han descrito variantes alélicas de cada uno de los genes que se han asociado a

diferentes rasgos de la calidad de la leche, que incluyen desde los productivos hasta los

relacionados con aspectos sanitarios del animal y de salud en el humano (Rijnkels, 2002;

Kamiński et al., 2007; Keating et al., 2008; Azevedo et al., 2008).


17

Cuadro 1. Principales variantes de los genes de caseína asociados a rasgos de productividad. Gen Núm. De

variantes

Principales

variantes

Posición de

aminoácidos

Genotipo Asociación a rasgos cuantitativos Razas en donde se ha

estudiado

αs1-caseína

(CSN1S1)

8

A

14-26 Eliminación

192 Glu

AB

Producción de proteínas en suero de

la leche

Holstein

Jersey

B 53 Ala

59 Gln

192 Glu

BB

BC

Elaboración de quesos

C

192 Glu

CC

Tiempo de coagulación

Contenido d proteína en leche

β-caseína

(CSN2)

12

A1 67 His A1A3 Producción de proteína en el suero de

la leche

Holstein

A2 67 Pro

137/148 Leu /Pro

A2A3

Mayor producción de proteínas en

leche A3

106 Gln

A3B

B

122 Arg

BB

Mayor firmeza en formación del

cuajo

Menor tiempo de coagulación

αs2-caseína

(CSN1S2)

4

A

33 Gln

47 Ala

130 Thr

Hay poca evidencia que las variantes de éste gen tenga

alguna asociación. El efecto antibacteriano es la principal

asociación que se ha encontrado.

Western

Cebú

C

33 Gly

47 Thr

130 Ile

K-caseína

(CSN3)

9

A

B

136 /148

Thr/Asp

136/148

Ile/Ala

AA

Mayor producción de leche

Holstein

BB

AB

BC

Tamaño de micelas

Tiempo de coagulación en la

elaboración de quesos

Producción de leche y suero de la

leche

Holstein

Jersey


18

2.11. Gen K-caseína (CSN3)

El papel importante que desempeña el gen K-caseína en la regulación del tamaño

de las micelas y en mantener en suspensión las caseínas en la leche, han sido el principal

motivo de su amplio estudio en razas lecheras. El producto de este gen constituye el

12% de las caseínas presentes en leche bovina, su tamaño es de 13 Kb y está formado

por cinco exones y cuatro intrones (Figura 5). La proteína tiene un peso molecular de

19,037 Da., y contiene 169 aminoácidos: Asp4, Asn8, Thr15, Ser12, Ser P1, Pyroglu1,

Glu12, Gln14, Pro20, Gly2, Ala14, Cys2, Val11, Met2, Ile12, Leu8, Tyr9, Phe4, Lys9, His3,

Trp1. y Arg5 (Farrel et al, 2004).

Figura 5. Organización estructural de unidad trascripcional de CSN3. Las barras

abiertas representan intrones. Las cajas de mayor tamaño y de color gris representan

exones (extremo 5´y 3´región no traducida), la caja oscura (parte del exón que codifica

el péptido señal) y cajas coloreadas (exones que codifican proteínas). Los tamaños de los

exones esta dado en pb, el número superior de cada caja; indica el número del exón.

La caracterización de sus polimorfismos ha permitido deducir su gran influencia

en las propiedades de la leche para la industria quesera. En la actualidad se han

caracterizado nueve variantes del gen K-caseína (A, B, C, E, F, G, H, I y J) (Cuadro 2) y

la mayoría de los estudios de tipificación mediante las técnicas de PCR-RFLP

(polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción basada en la reacción en cadena

de la polimerasa) y PCR-SSCP (polimorfismos de conformación de cadena simple

basada en la reacción en cadena de la polimerasa) han sido dirigidos hacia la

caracterización de la variante A y B encontrando una alta frecuencia en su segregación.

La diferencia de la variante A y B, es la sustitución de treonina por isoleucina en el

aminoácido número 136 y la sustitución de ácido aspartico por Alanina en la posición

148 respectivamente (Cuadro 2) (Neeling, 1964; Woychik, 1964; Schmidt, 1964;

MacKinlay y Wake, 1964 citados por Formaggioni et al., 1999)


19

Cuadro 2. Secuencia de aminoácidos y nucleótidos de las variantes del gen CSN3.

Polimorfismos

Posición y cambio de aminoácidos en la proteína

Método

Raza o especie

(Lugar de estudio)

Referencia

10 36 97 104 130 135 136 148 148a-151a* 155 Stop

A

Arg

CGC

Pro

CCT

Arg

CGT

Ser

TCA

Pro

CCT

Thr

ACC

Thr

ACC

Asp

GAT

Ser

AGC

TAA

SGE pH

alcalino

Bos taurus:

Holstein

(Canadá, Australia, USA)

Neeling, 1964

MacKinlay y Wake, 1964

Woychik, 1964, 1965

B

Ile

ATC

Ala

GCT

C

His

CAT

Ile

ATC

Ala

GCT

SGE a pH 8.6

Bos taurus:

. Gris alpina

. Brown

(Italia)

Di Stasio y Merlin 1978, 1979

Mariani , 1983

E

Gly

GGC

IEF

Bos taurus:

. Angler

. Alemán rojo

. Alemán blanco

(Alemania)

Erhardt y Senft, 1989

Erhardt, 1989

F

His

CAC

Val

GTT

PCR

Bos taurus:

. Yakut

(Rusia)

. Finnish Ayrshire

(Finlandia)

Ikonen, et al., 1996

Sulimova et al., 1992

G

Cys

TGT

Ile

ATC

Ala

GCT

IEF-PAGE a

pH 8.9

PCR

Bos taurus:

. Pinzgauer (Alemania,

Austria)

. Bos grunniens

(Rusia)

Erhardt,1996

Sulimova, et al., 1996

H

Ile

ATC

Hidrólisis

tríptica

SSCP

Bos indicus:

.Madagascan zebú

(Madagascar)

. Bos taurus: Pinzgauer

(Austria, Alemania)

. Bos taurus x Bos

indicus

Grosclaude et al., 1974

Prinzemberg y Erhardt, 1998

Prinzemberg et al., 1999

I Ala

GCA

SSP

Bos taurus x Bos indicus Prinzenberg y Erhardt, 1998

Prinzenberg, et al., 1999

J

Ile

ATC

Ala

GCT

Arg

AGA

Hidrólisis

tripitica

IEF

RP-HPLC

MALDI-MS

Bos taurus:

Baoulé

(Costa de marfil, Burkina

Faso)

Mahé, et a,. 1999

Yak *

Leu

CTT

Arg

CGT

Ala

GCT

Ala-Ser-Pro-Glu

CGTTCTCCAGAA

TGA

SSCP

Bos Grunniens

Yak

Prinzenberg, et al., 1999

*Dos polimorfismos, nombrados tipo 1 y 2 fueron revelados en Yak, la diferencia observada es el codón de stop, además presentan el codón (ACC)

en la posición 136 y (GCT) en 148 que codifican a treonina y alanina en la variante A y B, respectivamente, en bovinos. La posición de la

duplicación está indicada en 148a-151a, aunque podría ser desde 147a-151a.


20

Las variantes génicas de K-caseína, han mostrado ejercer un efecto en las

propiedades de la leche, especialmente en la tecnología de quesos (Lara et al., 2002;

Naranjo et al., 2007; Azevedo et al., 2008). La alta frecuencia del alelo B respecto al

alelo A, explica la mayor proporción de K-caseína en la leche (Vann Eenennaam y

Medrano, 1991). El alelo B, ha sido asociado a la resistencia térmica, menor tiempo de

coagulación, mejor cuajo y tamaño de micelas, cualidades óptimas para la industria de

quesos (Azevedo et al., 2008).

El genotipo BB es mayor respecto al genotipo AA, generando micelas de caseína

de menor tamaño, lo que contribuye a la formación de un cuajo más firme y mayor

retención de sólidos obteniendo alto rendimiento en la industria láctea (Requena et al.,

2007).Se ha encontrado que en animales con genotipo BB se obtiene una mayor

producción de quesos respecto al genotipo AA (Azevedo et al., 2008).

En Canadá, Australia y EUA, se llevó a cabo la caracterización de las variantes

A y B con muestras de ganado Holstein mediante el método Electroforesis en gel de

almidón (SGE por sus siglas en ingles) a pH alcalino y con el uso de sustancias

(mercaptoetanol) que rompen el enlace di-sulfuro (S-S), (MacKinlay y Wake, 1964;

Grosclaude, 1988; Levéziel et al,. 1988; Woychik, 1965 citados por Formaggioni et al.,

1999). Estudios posteriores encontraron que la variante A prevalece en la mayoría de las

razas lecheras del genero Bos taurus y Bos indicus a excepción en la raza Jersey en la

cual la variante B es la que predomina (Farrel et al., 2004) la primera ha sido asociado a

mayor producción de leche y la segunda a mayor contenido proteico.

El uso del mismo método pero en condiciones ácidas fue caracterizado la

variante C en razas Gris Alpina Italiana (Merlin y Di Stasio, 1982; Fornaggioni et al.,

1999), ésta misma fue encontrada también en ganado Brown Italiano (Formaggioni et

al., 1999). La determinación de una nueva variante nombrada como D en ganado

Simmental alemán fue confirmada por isoelectroenfoque (IEF) encontrando que es

idéntica a la variante C. Este resultado descarta a D, ser una variante más del gen CSN3;

la diferencia de C respecto a las variantes A y B, es que en la posición 97 presenta una


21

sustitución de Arginina (Arg) por Histidina (His), esta conformación posiblemente sea la

responsable del efecto negativo sobre el tiempo de coagulación del cuajo (Miranda et al.,

1993; Plowman et al., 1997; Smith et al., 1997 citados por Formaggioni et al., 1999).

La variante E fue caracterizada por isoelectroenfoque en la raza alemana Friesian

rojo y blanco (Erhardt y Senft, 1989; Erhardt, 1989 citados por Formaggioni et al.,

1999), y se ha encontrado que ejerce un efecto desfavorable en la calidad de la leche

(Ikonen, et al., 1997 citado por Matějíček et al., 2007). La caracterización de la variante

F fue hecha por PCR en la raza Yakut de origen ruso (Sulimova et al., 1992 citado por

Formaggioni et al., 1999), su estructura primaria reveló una sustitución de Asp por Val

en la posición 148 (Sulimova, 1998 citado por Formaggioni et al., 1999), esta variante

también lleva una segunda sustitución aminoacídica de Arg por His en la posición 10.

La variante G presenta dos cambios nucleotídicos, el primero nombrado como G1

se debe a una sustitución de Arg por Cys en la posición 97, fue encontrada por

isoelectroenfoque en las razas Pinzgauer de Austria y Alemania (Erhardt, 1996 citado

por Formaggioni et al., 1999) y la segunda denominado como G2, se debe a una

sustitución Asp por Ala en la posición 148 fue caracterizada por PCR en Yak (Bos

grunniens, Sulimova et al., 1996 citados por Formaggioni et al., 1999).

El cambio aminoacídico de Ile por Thr en la posición 135 encontrado en la raza

Madagascan zebú (Bos indicus) reveló ser una nueva variante (Grosclaude et al., 1974

citado por Formaggioni et al., 1999) el mismo cambio fue encontrado en la raza

Pinzgauer (Bos taurus) (Prinzenberg y Erhardt, 1998 citados por Formaggioni et al.,

1999). Este cambio fue confirmado por la técnica SSCP en razas Pinzgauer revelando la

presencia de heterocigotos (AH y BG) y por secuenciación de muestras homocigotas de

Brahman y heterocigotas de Pinzgauer revelaron una sustitución de A/T (transición) en

el segundo nucleótido del codón 135 (Ile/Thr), este cambio fue denominado como

variante H (Prinzenberg et al., 1999).


22

La caracterización de la variante I fue hecha con muestras Brahman x Simmental

mediante la clonación de productos de PCR, el análisis por SSCP y por secuenciación, el

64% (16 de 25) de las clonas positivas de PCR secuenciadas revelaron la sustitución

nucleotídica T/G (transversion) en la posición 104 generando un cambio de Ser por Ala

con respecto a la variante A (Prinzenberg et al., 1999). La variante J es la última que ha

sido caracterizada mediante la aplicación de diferentes métodos, desde una hidrólisis

(con carboxipeptidasa), cromatografía líquida de alta eficiencia en fase reversa (RP-

HPLC), Isoelectroenfoque, MALDI-MS, PCR hasta la secuenciación. La variante J

presenta una sustitución en el tercer nucleótido de C/A (transversión) en el codón 155

generando un cambio aminoacídico de Serina por Arginina, respecto a la variante B

(Mahé et al,. 1999).

Un incremento de 0.08% más de proteínas, mayor contenido en sólidos totales,

menor tiempo de coagulación, mejor consistencia del cuajo, mayor estabilidad al calor y

a la congelación, son efectos positivos encontrados en leche de animales con genotipo

homocigoto BB del gen CNS3 que se traduce en un rendimiento del 5 al 10 % más en la

producción de quesos respecto a la leche de aquellos animales con genotipo homocigoto

AA, que producen 173 kg más de leche (Van Eenennaam y Medrano, 1991; Barroso et.

al., 1998; Lara et al., 2002; Satyanarayana y Dayal, 2008; Matějíček et al., 2007;

Requena et al., 2007; Azevedo et al., 2008; Aranguren et al., 2008). El bajo número de

estudios de caracterización de las otras siete variantes han limitado asociarlos con alguna

característica de producción, reproducción y estética (Prinzenberg et al., 1999).

Los estudios de genotipifiación y efectos de las variantes del gen CSN3 han sido

dirigidos principalmente en razas lecheras, ignorando por completo el efecto que pueden

ejercer en ganado de carne y de doble propósito donde la producción de leche es el

componente básico de la habilidad materna, siendo esta, el principal factor para medir la

eficiencia productiva, y la capacidad que tiene la vaca durante la gestación,

amamantamiento, cuidado hasta el destete del becerro. La caracterización completa de

las nueve variantes del gen de CNS3, en el ganado bovino reforzaría las decisiones en

los programas de selección y mejoramiento genético animal.


23

3. JUSTIFICACIÓN

En México la ganadería bovina es la principal actividad en el sector

agropecuario, su aprovechamiento se ha realizado con los tres sistemas de producción

que se practican, ganado bovino destinado a producción de carne, leche y doble

propósito. Sin embargo, su crecimiento ha sido paulatino ya que aun se perciben grandes

volúmenes de importaciones de productos derivados del ganado bovino, material

genético y la escasa aplicación de estrategias de mejoramiento genético animal.

En la actualidad el mejoramiento genético animal como alternativa para

aumentar el rendimiento productivo y reproductivo, está cobrando gran auge en la

actividad pecuaria. El uso de marcadores moleculares para caracterizar genes asociados

a rasgos productivos ha permitido la identificación temprana de individuos portadores de

alelos favorables para características de importancia económica. En ganado lechero las

variantes de los genes de caseína han sido asociadas a calidad y rendimiento de leche. Su

efecto ha sido muy estudiado y en algunos países representa ya un criterio de selección y

mejoramiento genético animal.

La influencia del gen K-caseína en razas de ganado con orientación a producción

de carne y de doble propósito no ha sido estudiada. Por lo tanto es importante evaluar si

existe alguna asociación entre los genotipos de las variantes de K-caseína con el

desempeño materno (habilidad materna) en ganado bovino de carne y doble propósito.


24

4. OBJETIVO GENERAL

Caracterizar las variantes alélicas del gen K-caseína y determinar su grado de

asociación sobre rasgos productivos en ganado bovino.

4.1. Objetivos específicos

1) Diseñar y optimizar una estrategia para la determinación de nueve

variantes del gen K-caseína.

2) Genotipificar la población seleccionada para determinar las frecuencias

alélicas y genotípicas del gen K-caseína.

3) Realizar el análisis de asociación entre los genotipos y rasgos productivos

de la población bajo estudio.

5. HIPÓTESIS

La presencia de las variantes alélicas del gen K-caseína en ganado bovino, ejerce

un efecto sobre sus rasgos productivos.


25

6. MATERIALES Y MÉTODOS

6.1. Origen del material biológico

Para el presente estudio se analizaron muestras de tres poblaciones de las razas

bovinas, Gyrholando, Charolais y Carora, provenientes del estado de Tamaulipas,

Sonora y de Venezuela, respectivamente. La población del ganado Charolais es

reconocida como raza cárnica mientras que Gyrholando y Carora son utilizados en

sistemas de doble propósito.

El análisis en la raza Gyrholando se realizó a partir de muestras de animales del

rancho ganadero las Vegas, ubicado en el municipio de Aldama, Tamaulipas. Se

recolectaron muestras de sangre de 8 machos reproductores y 33 hembras en tubos

vacutainer® de 5 ml con anticoagulante EDTA, previamente identificados con el

numero de arete del individuo, las muestras se conservaron en refrigeración a 4 °C, hasta

su procesamiento.

El análisis en la raza Carora y Charolais, se llevó a cabo con el material genético

disponible en el banco de ADN del laboratorio de Biotecnología Animal del Centro de

Biotecnología Genómica. Se evaluaron 35 individuos: 22 machos y 13 hembras de la

raza Carora, provenientes de la Asociación Venezolana de Criadores de Ganado Carora

(ASOCRICA), quienes desde el año 1992 han implementado sistemas de mejoramiento

genético sobre la producción de leche en un ambiente tropical. Para la raza Charolais, se

analizaron 105 toretes candidatos a sementales de un año en promedio, estos animales

fueron sometidos a pruebas de comportamiento en dos periodos (verano de 2008 e

invierno de 2009). Todos estuvieron bajo regímenes basados en dietas isoprotéicas e

isocalóricas, el confinamiento y siete días de adaptación, fueron las características

fenotípicas consideradas durante la prueba. Se registraron cuatro tipos de características

fenotípicas en esta raza: 1) Conformación, 2) Crecimiento, 3) Ultrasonografía en tiempo

real y 4) Reproducción.


26

Para el presente, trabajo se consideraron únicamente las siguientes características

de crecimiento.

a) Peso al nacimiento (PN, kg). Es un indicador de evaluación que infiere el

desarrollo durante la gestación y es afectado por los factores que influyen sobre

la madre en ese periodo. Algunos de estos son época de nacimiento, la edad de la

madre, sexo del becerro, manejo y características de la raza. El peso al

nacimiento se recomienda pesar al becerro máximo a las 24 horas después del

nacimiento (Domínguez, 2010).

b) Peso al destete ajustado a los 205 días (PD205, kg). Es una medida para

evaluar la capacidad lechera, la habilidad materna de las vacas y el potencial que

tiene el becerro para ganar peso de una manera rápida y eficiente. El efecto del

peso al destete puede ser causado también por factores no genéticos (factores

ambientales), por esta razón es necesario realizar ajustes a estos factores

(Domínguez, 2010).


27

6.2. Genotipificación de las nueve variantes del gen K-caseína

6.2.1. Extracción del ADN

La extracción del ADN genómico se realizó únicamente con las muestras de

sangre de la raza Gyrholando, pues de las otras dos razas se contaban con el material

genético en el banco de ADN del laboratorio, siguiendo el protocolo estandarizado de un

estuche comercial de purificación Wizard® Genomic DNA Purification Kit (Promega,

Inc.) (Apéndice A y cuadro A1). En tubos eppendorf de 1.5 ml se agregaron 300 μl de

sangre y 900 μl de solución lisis I (155 mM de Cloruro de amonio (NH4Cl); 0.5 mM de

EDTA, 10 mM de Bicarbonato de sodio, pH 7.4). La muestra se mezcló por inversión de

manera suave e incubando durante 15 min en hielo, transcurrido este tiempo se procedió

a centrifugar a 2 000 rpm por 5 min. El sobrenadante se descartó por decantación y se

agregó 900 μl de solución lisis I, se incubó por 5 min en hielo y posteriormente se

centrifugó a 2 000 rpm por 5 min, este procedimiento se repitió hasta obtener una

pastilla blanca compuesta de leucocitos que fue resuspendida en 300 μl de solución lisis

nuclear mezclando por inversión hasta disolver la pastilla y se llevó al vortex para su

agitación por 20 s.

Posterior a esto, se agregó un volumen de 100 μl de solución de precipitación de

proteínas y se agitó al vortex por 20 s y se centrifugó a 2000 rpm por 5 min. El

sobrenadante se transfirió a otro tubo limpio con un volumen de 300 μl de isopropanol,

se mezcló y centrifugó descartando el sobrenadante por decantación, posteriormente se

adicionó 300 μl de etanol al 70% y fue centrifugado de 13 000 a 16 000 x g, por 20 s. El

sobrenadante de etanol fue eliminado por aspiración y se dejo secar la pastilla en el

equipo Concentrador Centrivac por 30 min. Finalmente el ADN, fue rehidratada con 50

μl de agua mili Q estéril mediante agitación suave en el termomixer por una hora a 65

°C. Las muestras fueron almacenadas en refrigeración a 4 °C hasta su procesamiento.


28

6.2.2. Cuantificación del ADN genómico

La cuantificación se realizó en gel de agarosa al 1.2% peso/volumen, utilizando

como estándar de referencia concentraciones conocidas del bacteriófago lambda (25, 50

y 100 ng de ADN). Se tomaron 5 μl de ADN genómico de cada una de las muestras y

mezclando con 5 μl de Sybr gold (SYBR® GOLD Nucleic Acid Gel Stain, Augene, OR,

USA). El volumen total de la mezcla fue depositada en los carriles del gel

respectivamente. De manera semejante, se hizo con el marcador ʎDNA para cada una de

las concentraciones indicadas. Las muestras se separaron por electroforesis aplicando un

voltaje de 80 a 100 volts por 30 min. La visualización y cuantificación de las muestras se

realizó en el fotodocumentador Kodak Digital Science mediante el programa Gel-

Imagen de Kodak Digital Science 3.0.2.

6.2.3. Diseño de la estrategia para caracterizar nueve variantes del gen K-caseína

En este estudio, se diseñó una estrategia para la caracterización de las nueve

variantes del gen K-caseína en bovinos, basada en la técnica de PCR-RFLP a partir de la

amplificación de un fragmento de 550 pb que comprende las diferentes mutaciones del

gen K-caseína empleando iniciadores F-KCAS (5´- AGAAATAATACCATTCTGCAT-3´) y

R-KCAS (5´- GTTGAATTCTTTGATGTCTCCTTAGAGT-3´), reportados por Prinzemberg et

al., (2008). La estrategia se basó en el diseño de ensayos de PCR-RFLP para ello fue

necesario la búsqueda de enzimas de restricción que permitieran la discriminación

alélica de cada una de las variantes del gen K-caseína, para lo cual se realizaron

digestiones virtuales de la secuencia de cada variante alélica utilizando el programa

NEBcutter V2.0 (http://tools.neb.com/NEBcutter2/), algunas consideraciones que se

tomaron en cuenta para la selección de la enzima fueron la disponibilidad y además del

costo de la enzima.

En algunos casos, fue necesario aplicar la estrategia de ACRS la cual permite la

creación de sitios de restricción que permita identificar las variantes alélicas de un SNP

(Figura 6).

http://tools.neb.com/NEBcutter2/


29

En estos casos para el diseño de los iniciadores se utilizó el programa WatCut

(http://watcut.uwaterloo.ca/watcut/watcut/template.php?act=snp_new), tomando como

referencia la secuencia reportada del locus del gen K-caseína, tomada del GenBank

(NCBI: [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/]), con el número de acceso X14908

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene?term=X14908).

Figura 6. Diseño de iniciadores para detección de SNP. Estrategia para el diseño de

iniciadores creando el sitio de restricción del SNP, para la enzima Alu I.

En el cuadro 3 se resumen las características de los ensayos para la detección de

cada variante del gen K-caseína.

Alelo normal Alelo mutado

* *

ADN molde 5´tttaTcAtttatggccattccaccaaag3´ 5´tttaGcTtttatggccattccaccaaag3´

* *

Iniciador 5´gaaaataccggtaaggtggtttTc3´ 5´gaaaataccggtaaggtggtttTc3´

antisentido mutado

* *

Secuencia 5´tttaTcTtttatggccattccaccaaag3´ 5´tttaGcTtttatggccattccaccaaag3´

del producto

de PCR Ausencia del sitio Presencia del sitio

de restricción para Alu I de restricción para Alu I

AG´CT

Sitio de restricción de Alu I

_ Posición del SNP

* Sitio de modificación de la secuencia del iniciador

http://watcut.uwaterloo.ca/watcut/watcut/template.php?act=snp_new


30

Cuadro 3. Iniciadores y tipos de ensayos para la detección de nueve variantes del

gen CSN3.

Variante

Posición del

cambio AA

Iniciadores

Tamaño

del

producto

de PCR

Tipo de ensayo

A

136 Thr

148 Asp

F-KCAS 5´- AGAAATAATACCATTCTGCAT-3´

R-KCAS 5´- GTTGAATTCTTTGATGTCTCCTTAGAGT-3´

550 pb

PCR-RFLP

(Hind III/Taq I)

B

136 Ile

148 Ala


R-KCAS 5´- GTTGAATTCTTTGATGTCTCCTTAGAGT 3´

550 pb

PCR-RFLP

(Hind III/Taq I)

C

97 His

136 Ile

148 Ala


RCR-5´- ATGATAAATGTGGGTGTGGGGGA-3´

324 pb

PCR-ACRS

(Fok I)

E

155 Gly



550 pb

PCR-RFLP

(Hae III)

F

10 His



550 pb

PCR-RFLP

(Rsa I/Hha I)

G

97 Cys

135 Ile


RGHM 5´- CAGTGCTCTCTACTGCTTCGGAG-3´

438 pb

PCR-ACRS

(Mnl I)

H

135 Ile


RGHM 5´- CAGTGCTCTCTACTGCTTCGGAG-3´

FGF 5´- AAGCCCAGCCAACTACCATGGGA-3´

R-KCAS 5´- CAGTGCTCTCTACTGCTTCGGAG-3´

438 pb

274 pb

PCR-ACRS

(Mnl I/Fok I)

I

104 Ala


RI 5´- CTTTGGTGGAATGGCCATAAAAG-3´

344 pb

PCR-ACRS

(Alu I)

J

155 Arg

FJH3 5´- GCTTCTCCAGAAGTTATTGAGGG-3´

R-KCAS 5´- GTTGAATTCTTTGATGTCTCCTTAGA-3´

98 pb

PCR ACRS

(Hae III)

Teniendo los iniciadores diseñados, se procedió a la optimización de las

condiciones y perfiles de amplificación (Apéndice A y cuadro A2, A3). Todas las

reacciones de PCR se llevaron a cabo en un volumen final de 25 μl, utilizando 0.1 U de

Taq DNA polimerasa, 0.4mM de dNTPs y 0.5μM de cada iniciador. La concentraciones

finales de MgCl2 fue de 1.5 mM, con excepción de las amplificaciones de las variantes C

y H donde se uso 2.5.


31

Los perfiles de amplificación para todas las variantes se basaron en la técnica

“Touch Down”, empleando las siguientes temperaturas: 95 °C durante 5 min por un

ciclo para la desnaturalización, el alineamiento se inicio con 62 °C disminuyéndose 2 °C

durante los primeros 5 ciclos por 45 s cada ciclo hasta alcanzar una temperatura de

alineamiento de 55 °C, manteniéndose por 30 ciclos y una extensión final de 72 °C

durante 10 min por un ciclo. Los productos fueron almacenados en refrigeración a 4 °C

hasta su procesamiento.

El análisis de los productos de PCR se realizó en geles de agarosa al 1.5%

(Apéndice A y cuadro A6) utilizando para la visualización el fotodocumentador de luz

UV (Electrophoresis Documentation and Analysis System 120 Kodak Digital Science)

mediante el programa Gel-Imagen de Kodak Digital Science 3.0.2.

Una vez verificada la amplificación, los productos de PCR, se sometieron a

digestión con la enzima diagnóstica para cada variante (Cuadro 3) utilizando las

condiciones de digestión especificadas por la casa comercial de cada enzima.

Dependiendo del patrón de digestión esperado, la separación de los patrones de

restricción se realizó en geles de agarosa al 2.5% o bien geles de Nussieve al 4.5%

(Apéndice B), iniciando con 35 volts para finalmente mantener a 50 volts por 6 a 8

horas.


32

6.3. Análisis estadístico

6.3.1. Cálculo de frecuencias

Las frecuencias genotípicas y alélicas de las variantes del gen K-caseína en las

tres poblaciones de estudio, fueron estimadas con la siguiente ecuación (Falconer y

Mackay, 2001).

p = 2P + H = P + ½H

2N N

q = H + 2Q = ½ H + Q

2N N

Donde:

P=AA, H=AB y Q= BB

Bajo el supuesto de un gen con dos alelos (A, B).

6.3.2. Equilibrio de Hardy-Weinberg

El análisis de frecuencias genotípicas bajo los supuestos del equilibrio genético

de Hardy-Weinberg y la comparación entre los grupos genotípicos se realizó mediante la

prueba exacta de Fisher, de acuerdo a la frecuencia mínima en cada genotipo (ƒpi ˂ 5

para prueba exacta de Fisher; donde pi es la frecuencia del iésimo alelo en un locus)

empleando el programa Genepop (Raymond and Rousset, 1995)


33

6.3.3. Análisis de asociación

El análisis de asociación entre las características productivas y los genotipos

identificados, se realizó únicamente en la población Charolais, las dos poblaciones

restantes no fueron contempladas por falta de datos productivos.

En la raza Charolais, el análisis de asociación se realizó con características de

crecimiento, que es donde se espera evaluar la influencia de las variantes del gen K-

caseína. Las variables fueron ajustadas en un análisis lineal general conforme al modelo

siguiente:

Yijk = μ + Gi.+ CEj.+ Ɛijk

Donde:

Yijk = PD205, PN

μ = Media general

Gi = Efecto fijo del i-ésimo de los genotipos de K-caseína (i= AA, AB, BB)

CEj = Efecto fijo del j-ésimo de los campos experimentales

Ɛijk = Error aleatorio asociado al muestreo

Los modelos empleados para el análisis de asociación fueron ajustados utilizando

el procedimiento GLM del paquete estadístico SAS (2002). La estimación de las medias

de cuadrados mínimos, la comparación de medias y nivel de significancia (p<0.05) de

las variables se realizó con método de mínima diferencia significativa del paquete

estadístico SAS (2002).


34

7. RESULTADOS

7.1 Diseño de estrategia para caracterizar nueve variantes del gen K-caseína

La estrategia establecida consistió en la amplificación inicial del segmento de

550 pb que contiene todos los polimorfismos que dan lugar a las nueve variantes del K-

caseína. El producto es inicialmente cortado con las enzimas de restricción Hind III y

Taq I, las cuales dan lugar al agrupamiento de las variantes en lo que se denominó

Cluster A (variante A, E, F, G, H, I) y el cluster B (B, C y J) como se muestra en la

figura 7, la discriminación entre las variantes de cada cluster de las tres poblaciones bajo

estudio, se realizó empleando diferentes ensayos basados en RFLP y ACRS.

7.2 Genotipificación de las poblaciones de estudio

7.2.1 Formación de los cluster A y B

Todas las muestras de las tres poblaciones bajo estudio fueron amplificadas con

los iniciadores para generar el fragmento de 550 pb (Figura 8), el cual posteriormente

fue digerido por las enzimas Hind III y Taq I (Figura 9 a y b). Esto dio como resultado el

agrupamiento de las muestras de cada población en cada cluster (Cuadro 4).

Cuadro 4. Muestras de tres poblaciones bovinas agrupadas en el cluster A y B.

Raza Total de muestras Muestras en el

Cluster A

Muestras en el

Cluster B

Gyrholando 41 30 11

Carora 35 4 31

Charolais 105 15 90


35

Variante

Cluster B (pb)

Hind III (550)

Taq I (550)

Hae III (98)

Fok I (324)

B 451 99 418 132 75 23 324

C 451 99 418 132 286 38

J 451 99 418 132 98

Figura 7. Estrategia basada en PCR-RFLP para la determinación simultanea de nueve variantes del gen K-caseína.

Variante

Cluster A (pb)

Rsa I/Hha I (550)

Hae III (550)

Mnl I

Fok I (274 pb)

Alu I (344)

A 367 143 40 330 220 425 13 274 204 140

E 330 145 75

F 407 143

G 438 240 34

H 438

I 204 117 23

5´ 3´

F-KCAS R-KCAS

550 pb

600 pb

550 pb

418 pb

200 pb

132 pb

M ND A B C E F G H I J

Hind III Taq I

600 pb

550 pb

451 pb

200 pb

99 pb

M ND A B C E F G H I J


36

Figura 8. Resultado de la amplificación por PCR de la población Charolais.

Electroforesis en gel de agarosa al 1.5 % de 43 muestras de la población Charolais, que

muestra la amplificación de fragmentos de 550 pb. Marcador de peso empleado λPstI,

carriles 1-43 productos amplificados de 550 pb, carril 44 control negativo.

Figura 9. Patrones de la digestión con Hind III y Taq I. Los resultados de la digestión

con la enzima Hind III se muestra en a y los de la enzima Taq I en b, obtenidos en 17

muestras de la población Charolais, marcador de peso empleado λPstI, carriles 1 y 19

producto de PCR no digerido, carriles 2-18 patrones de restricción obtenidos por

digestión.


37

7.2.2 Diferenciación de las variantes del cluster A

El análisis de discriminación de las variantes de este cluster se inició para

distinguir entre las variantes A, E, F, G, H, I. Se inició con la discriminación de la

variante F, para la cual tal como indica la estrategia se realizó la digestión con las

enzimas Rsa I y Hha I. Ninguna de las 49 muestras ensayadas se identificó como

variante F. A continuación las muestras se digirieron con la enzima Hae III, para

determinar la variante E; y solo una de las muestras de la población Gyrholando

presentó el patrón de bandeo esperado para esta variante E (Figura 10).

Figura 10. Análisis de la variante E. En esta imagen se muestra el resultado de un gel

de agarosa al 2.5% donde la muestra 11 de la población Gyrholando, corresponde a la

variante E. Marcador de peso empleado 50 pb, carril 1 producto de PCR no digerido.

Para confirmar el resultado obtenido en la población Gyrholando, se secuenció

(Apéndice C) la muestra 11, y el resultado fue confirmado por la presencia del codón

GGC que codifica el aminoácido Glicina en la posición 155 de la secuencia de

aminoácido de K-caseína, que corresponde a la variante E (Figura 11).


38

Figura 11. Confirmación de la variante E por secuenciación. Electroferograma de la

secuenciación que confirma la asignación de la variante E para la muestra 11, que

representa el genotipo homocigoto EE.

Los siguientes análisis de discriminación en las 48 muestras del cluster A se

enfocaron en las variante H y G, estas variantes comparten la presencia del aa isoleucina

en la posición 135, razón por la cual el análisis con la enzima Mnl permitiría identificar a

las muestras candidatas para estas dos variantes, y la digestión con Fok I asigna la

identidad de las variantes como H o G. Con excepción de cinco muestras de la población

Gyrholando, este análisis descartó la presencia de las variantes H y G en las muestras

analizadas.

En el caso de las 5 muestras mencionadas la asignación de la variante se

confirmó por secuenciación ya que el análisis de estas muestras por electroforesis fue

dudoso. Solo una de las muestras resultó ser heterocigoto para la variante H en la

posición 135 (Figura 12).

Figura 12. Análisis de un heterocigoto para la variante H determinado por

secuenciación. Electroferograma de la secuenciación que muestra la presencia de un

heterocigoto H/A en la posición 135 de la secuencia del gen K-caseína.


39

Finalmente, la población dentro del cluster A se sometió a digestión con la

enzima Alu I (Figura 13), el patrón de bandeo obtenido en las 47 muestras descartó la

presencia de la variante I y automáticamente estas quedaron asignadas con la variante A.

Figura 13. Patrón de digestión con Alu I para determinar la variante I. Electroforesis en gel de Nussieve al 4.5%, donde los patrones de restricción (204 y 140)

descartan la presencia de la variante I. Marcador de peso empleado Phi carril 30

producto de PCR no digerido, carriles 31-46 patrones de restricción obtenidos.


40

7.2.3 Diferenciación de las variantes del cluster B

Las 132 muestras agrupadas en el cluster B, fueron sometidas a digestión con la

enzima Hae III para discriminar la variante J, donde el patrón esperado es de 98 pb, sin

embargo el resultado mostró un patrón de bandeo de 75 y 23 pb, este último no se

visualizó durante la migración (Figura 14); esto permitió descartar la presencia de la

variante J en las tres poblaciones.

Figura 14. Patrón de digestión con Hae III para determinar la variante J. Electroforesis en gel de Nussieve al 4.5%, donde el patrón de restricción observado (75

pb) no corresponde a la variante J. Marcador de peso empleado 50 pb, carril 1 producto

de PCR no digerido, carriles 2-12 patrones de restricción obtenidos.

El siguiente análisis consistió en determinar la variante C, para ello las 132

muestras fueron digeridas con Fok I, los resultados obtenidos por electroforesis no

fueron concluyentes para la diferenciación clara de la variante B de C (Figura 15). Para

ello se secuenciaron 3 muestras representativas, las cuales mostraron la presencia del

codón CGT que codifica el aminoácido Arginina en la posición 97 de la secuencia de

aminoácido de K-caseína (Figura 16), que corresponde a la variante B. Con este

resultado, las 132 muestras del cluster B, fueron asignadas como variante B.


41

Figura 15. Patrón de digestión con Fok I para determinar la variante C. Electroforesis en gel de Nussive al 4.5%, marcador de peso empleado 50 pb, carril ND

producto de PCR no digerido, carriles 1.50-1.85 patrones de restricción obtenidos, (*)

muestras que fueron sometidas a secuenciación.

Figura 16. Análisis por secuenciación para determinar la variante C. Electroferograma de la secuenciación que muestra la presencia del codón CGT en la

posición 97, que codifica Arginina y corresponde a la variante B, esto permitió

diferenciar la variante B de C.


42

7.3. Frecuencias genotípicas y alélicas

7.3.1. Frecuencias genotípicas y alélicas en la población de Carora

Las variantes A y B fueron encontradas en esta población con una frecuencia

alélica de 0.41 y 0.59, respectivamente (Cuadro 5). Los genotipos encontrados fueron

AA, AB y BB con una frecuencia genotípica de 0.11, 0.60 y 0.29, respectivamente

(Cuadro 5). La frecuencia genotípica BB asociado a contenido proteico (Lara, et al.,

2002, Sulimova et al., 2007, Aranguren, et al., 2008) y la frecuencia genotípica AB,

resultaron ser superiores a la frecuencia genotípica AA asociado a producción de leche

(Lara, et al., 2002, Sulimova, et al., 2007, Aranguren, et al., 2008, Satyanarayana y

Dayal, 2008).La determinación del Equilibrio de Hardy-Weinberg (HW) y su

comprobación por chi-cuadrada (χ2), determinó que la población Carora se encuentra en

equilibrio para el locus de K-caseína (Cuadro 5). Aunque no haya reportes de

genotipificación para el gen K-caseína en esta población, los resultados eran los

esperados ya que la mayoría de estudios realizados en razas orientadas a producción de

leche, los alelos A y B, son de mayor frecuencia.

Cuadro 5. Frecuencias genotípicas y alélicas de la población Carora.

Raza No.

Muestras

Frecuencias genotípicas observadas Frecuencias alélicas HW

AA AB BB A B

Carora 35 0.11 0.60 0.29 0.41 0.59 NS

HW= Equilibrio de Hardy-Weinberg; NS= En equilibrio (P˃0.05).

7.3.2. Frecuencias genotípicas y alélicas en la población de Gyrholando

Las variantes A, B, E y H, fueron encontradas en esta población, con una

frecuencia alélica de 0.83, 0.13, 0.02 y 0.01, respectivamente (Cuadro 6). Los genotipos

encontrados fueron AA, AB, EE y AH con una frecuencia genotípica de 0.69, 0.27, 0.02

y 0.02, respectivamente, el genotipo BB asociado a calidad de la leche no fue encontrado

(Cuadro 6).


43

En la actualidad no hay reportes que indiquen si las variantes E y/o H muestran

alguna asociación sobre algún rasgo productivo en bovinos. La ley de HW y su

comprobación por chi-cuadrada (χ2), determinó que la población Gyrholando se

encuentra en desequilibrio para el locus de K-caseína.

Cuadro 6. Frecuencias genotípicas y alélicas de la población Gyrholando.

Raza No.

Muestras

Frecuencias genotípicas

observadas

Frecuencias alélicas HW

AA AB EE AH A B E H

Gyrholando 41 0.69 0.27 0.02 0.02 0.83 0.13 0.02 0.01 *

HW: Equilibrio de Hardy-Weinberg; *= En desequilibrio (P˂0.05).

7.3.3. Frecuencias genotipos y alélicas en la población Charolais

En esta población las variantes encontradas fueron A y B, con una frecuencia

alélica de 0.40 y o.60, respectivamente. Los genotipos encontrados fueron AA, AB y BB

con una frecuencia genotípica de 0.14, 0.51 y 0.35, respectivamente. El genotipo

favorable (BB) para la calidad de la leche fue superior al genotipo AA. Es evidente la

relevancia de la frecuencia del alelo B de 0.60 con respecto al alelo A de 0.40 (Cuadro

7). Se determinó HW y se comprobó mediante la prueba de chi-cuadrada (χ2),

encontrando que la población se encuentra en equilibrio para el locus de K-caseína.

Cuadro 7. Frecuencias genotípicas y alélicas de la población Charolais.

Raza No.

Muestras

Frecuencias genotípicas observadas Frecuencias alélicas HW

AA AB BB A B

Charolais 105 0.14 0.51 0.35 0.40 0.60 NS

HW= Equilibrio de Hardy-Weinberg; NS=En equilibrio (P˃0.05).


44

7.4. Análisis de asociación del genotipo sobre PD205

El análisis indicó un efecto significativo (p=0.0474) de los genotipos sobre

PD205 (Cuadro 8) y la determinación de medios de cuadros mínimos obtenidos durante

el análisis de varianza indicó que el genotipo homocigoto BB favorable para el

incremento del contenido proteico en la leche, ejerce un efecto significativo sobre la

ganancia de peso al destete ajustado a 205 días pero no para peso al nacimiento

(p=0.4115). La falta de datos productivos en la población Carora y Gyrholando, limitó

su análisis de asociación.

Cuadro 8. Medios de cuadrados mínimos para el efecto del genotipo sobre

características de crecimiento.

CC

Genotipo

N

x

EE

P

PN

AB

34

37.45

0.97

0.4115

BB

20

36.31

1.14

PD205

AB

34

234.65

5.44

0.0474

BB

20

218.90

6.41

CC= Característica de crecimiento; PD205= Peso al destete ajustado a 205 días; PN=

Peso al nacimiento; N= número de individuos analizados; EE= Error experimental; P=

Probabilidad, x= Peso promedio.


45

8. DISCUSIÓN

El gran desarrollo de la biotecnología molecular y la genómica en los últimos

años, ha contribuido a la implementación de marcadores moleculares para leer e

interpretar la secuencia de ADN de la mayoría de los animales domésticos de interés

permitiendo manejar y aprovechar mejor el potencial genético que ejercen efectos

significativos sobre características de interés productivo, reproductivo o estético.

La producción de leche, es considerada como uno de los principales rubros que

sostiene la rentabilidad de la industria pecuaria bovina, por lo que desde una perspectiva

genómica es prioritario el estudio de los genes que codifican a las proteínas lácteas, para

así usarlos en las estrategias de manejo asistido por marcadores dentro de los programas

de mejoramiento genético animal.

8.1. Tipificación de las variantes del gen CSN3

En este trabajo se estudio al gen CSN3, que codifica para una de las principales

proteínas lácteas: la K-caseína. Hasta la fecha, la mayoría de estudios de tipificación se

han enfocado en la detección de las dos variantes más comunes (A y B), la cual puede

realizarse utilizando ensayos basados en PCR-RFLP´s. La combinación de PCR con

diferentes técnicas electroforéticas y hasta el diseño de microarreglos ha permitido la

tipificación de al menos otras cuatro variantes del gen CSN3 (Prinzenberg et al., 1996;

Chessa et al., 2007). Barroso et al., (1998) y Naranjo et al., (2007) estudiaron las

variantes A, B, C y E usando PCR-SSCP; Soria et al., (2003) por su parte reportaron un

estudio de genotipificación basado en PCR-RFLP que permite diferenciar 5 variantes

(A, B, C, E y G) del gen CSN3, mientras que un ensayo basado en microarreglos fue

diseñado para genotipificar las variantes A, B, C, E y H (Chessa et al., 2007).

En el presente trabajo se diseñó e implementó exitosamente una estrategia basada

en PCR-RFLP que permite tipificar simultáneamente las nueve variantes del gen CSN3


46

reportadas hasta la fecha, la idea detrás de esta propuesta es que el contar con un método

diagnóstico de las nueve variantes permitirá determinar la prevalencia de cada variante

en los hatos de ganado bovino y posteriormente asociarlas con el efecto positivo o

negativo que ejercen sobre las características productivas, reforzando las decisiones en

los programas de mejoramiento genético.

Las ventajas de la estrategia diseñada sobre las previamente reportadas al menos

para seis variantes son: altamente reproducible, versátil, rápida, codominante, factible

para crear fragmentos de DNA de una región de interés que es reconocida por enzimas

de restricción, eficiente para fragmentos pequeños o grandes en pb, no es indispensable

la purificación de los productos de PCR, no requiere de cámaras de electroforesis con

sistema de enfriamiento (4 a 10 °C), la separación de los patrones de restricción puede

ser en geles de agarosa o nussieve a concentraciones bajas (2.5 o 4 %) y en tiempos

cortos (máximo 4 horas). El uso de la enzima de restricción y su digestión de manera

independiente lo convierte en una de los factores a considerar debido al costo de cada

enzima comparado con PCR-SSCP (Agarwal et al., 2008; Naranjo et al., 2007).

8.2. Análisis de frecuencias

8.2.1. Frecuencias genotípicas y alélicas del gen CSN3 en la población de Carora

En Venezuela el mejoramiento genético en bovinos para índices productivos fue

alcanzado mediante la cruza del ganado Criollo Amarillo Limonero de Quebrada Arriba

con bovinos Pardo Suizo ambos razas Bos taurus, originándose así la raza Carora; su

nombre hace referencia a la localidad en donde fue realizado tal mejoramiento (López-

Ortega et al., 2008), siendo una de sus características principales, la alta producción de

leche (Bolla et al., 1997).

En la población Carora, se observó que la frecuencia del genotipo favorable BB

fue superior al genotipo homocigoto desfavorable AA, mientras que la frecuencia del

genotipo heterocigoto AB fue de 0.60.


47

En un estudio sobre efectos de los marcadores lactoproteicos incluyendo K-

caseína, realizados por Bolla et al., (1997), con muestras de Carora, cuyo registros de

producción de leche diaria es controlada por ASOCRICA (Asociación Venezolana de

Criadores de Ganado Carora), encontraron una frecuencia genotípica de 0.261, 0.487 y

0.252 para los genotipos AA, AB y BB respectivamente; observando que el genotipo

AA es ligeramente superior al genotipo BB, sin embargo los resultados de asociación

indicaron que las variantes del gen K-caseína no ejercen un efecto significativo en la

producción diaria de leche, sino que es afectada por el alelo B de β-lactoglobulina y por

los factores ambientales. Lopéz-Ortega et al., (2008), en un estudio realizado con

becerras mestizas de la raza Carora concluyen también, que los factores ambientales

determinan la evolución de los niveles nutricionales del animal durante el primer año de

vida.

Rojas et al., (2009) en un estudio realizado en ganado criollo limonero,

encontraron una frecuencia genotípica de 0.11, 0.56 y 0.33 para los genotipos AA, AB y

BB respectivamente, y una frecuencia alélica de 0.39 para el alelo A y 0.61 para el alelo

B, declarando que el locus de CSN3 se encuentra en equilibrio de Hardy-Weinberg

(P˃0.05).

La diferencia en las frecuencias genotípicas encontradas en este trabajo respecto

a los publicados puede deberse a que las muestras corresponden a animales élite que

están sometidos a selección productiva, por lo tanto y asumiendo la asociación reportada

para las variantes del gen se esperaría que cuenten con los alelos favorables para

eficiencia y calidad lechera.

8.2.2. Frecuencias genotípicas y alélicas del gen CSN3 en la población Gyrholando

En esta población, los resultados de tipificación fueron valiosos ya que

permitieron comprobar la efectividad de la estrategia de detección/diferenciación de las

variantes del gen CNS3, se encontró una frecuencia genotípica de 0.69 para el genotipo

homocigoto AA, 0.27 para el genotipo heterocigoto AB pero no se encontró al genotipo


48

homocigoto BB, sin embargo se encontró una baja frecuencia de 0.02 para el genotipo

AH y EE, siendo el hallazgo de la variante H, relevante en este trabajo, ya que no había

sido reportado. Los resultados obtenidos son similares a los que reporta Azevedo et al.,

(2008) en un estudio de genotipificación del ganado brasileño, incluyendo razas Gyr y la

cruza de este con Holstein (Gyrholando), en la cual encontraron una frecuencia

genotípica de 0.64 y 0.26 para los genotipos AA y AB respectivamente, además de una

frecuencia de 0.10 para el genotipo AE al igual que en el presente estudio, tampoco

encontraron el genotipo BB. Mientras que en ganado Gyr encontraron una frecuencia

genotípica en un rango de 0.81 a 0.97 para el genotipo AA, de 0.03 a 0.18 para el

genotipo AB y 0.01 para el genotipo BB. Otro estudio realizado por Kemenes et al.,

(1999) en siete razas bovinas, incluyendo a Gyr, encontraron una frecuencia alélica de

0.93 y 0.07 para los alelos A y B respectivamente, sin embargo la prevalencia del alelo

A no fue significativa para producción de leche con respecto a Holstein, Nelore y

Guzerat concluyendo que el efecto del alelo A es especifico para cada raza.

En este sentido, aunque es necesario el estudio de asociación, el rendimiento en

producción de leche; es una de las características que se prefieren en el ganado lechero

mexicano, y la raza Gyrholando posee ésta característica, esto lo convierte fuertemente

en una de las razas, candidatas para la producción de leche en ambientes tropicales

donde una alimentación basada en pastoreo es suficiente para dicha productividad

aunado a las propiedades heredadas de sus progenitores como la habilidad materna

(sobrevivencia del ternero, excelente ganancia de peso y rendimiento de carcasa del

novillo), mayor precocidad (es preñada a los 18 a 24 meses), menores intervalos entre

parto (13 a 14 meses), longevidad mayor (9 a 10 partos) y una producción de leche de 15

a 20 kg en dos ordeñas en verano

(http://www.supercebu.com.bo/ver/articulo.php?num=83). Algunos estados de México,

como Tamaulipas, Veracruz, Tabasco, Campeche, Quintana Roo, Guerrero, Oaxaca y

Chiapas, cuentan con las condiciones ambientales optimas para la cría de esta raza

(Arellano et al., 2006), y en algunos hatos del estado de Tamaulipas han sido ya

establecidos


49

Las variantes E y H, encontradas en este estudio, son poco comunes y el efecto

que ejercen sobre características de interés es poco conocido, por tanto; es necesario

continuar con la tipificación y hacer el análisis de asociación para determinar el efecto

positivo o negativo para alguna característica productiva y posteriormente validar el

efecto de estas variantes.

8.2.3. Frecuencias genotípicas y alélicas del gen CSN3 en la población Charolais

La mayoría de estudios de genotipificación del gen K-caseína han sido realizados

en razas lecheras y se sabe muy poco del efecto de sus variantes en animales con otro fin

productivo, como la producción de carne. Lara et al., (2002) en un estudio de

polimorfismos del locus de K-caseína concluye que es importante evaluar la relación

que existe entre los genotipos del locus de K-caseína con el desempeño materno en

ganado de carne y doble propósito, establecidos en condiciones tropicales. En este

trabajo se estudio el efecto de las variantes del gen CSN3 sobre la habilidad materna en

la raza cárnica Charolais.

Las frecuencias alélicas analizadas indicaron que el alelo favorable B, se

presentó en mayor proporción (0.60) respecto al alelo A (0.40), los resultados obtenidos,

son similares a los reportados por Jann et al., (2004) quien encuentra en un estudio

poblacional una frecuencia alélica de 0.58 y 0.42 para los alelos B y A respectivamente.

Otro estudio realizado por Curi et al., (2005) en cuatro razas cárnicas, incluyendo la raza

Canchim (5/8 Charolais x 3/8 Zebú) encontraron frecuencias alélicas de 0.767 y 0.233

para los alelos A y B respectivamente; como puede observarse existe una mayor

frecuencia del alelo A lo que puede ser consecuencia de su trasfondo genético a pesar de

que la raza Canchim su base está constituida principalmente de Charolais.


50

8.3. Análisis de asociación de las variantes del gen CSN3

El análisis de asociación en la población Carora y Gyrholando no fue realizado

por falta de datos productivos, sin embargo, se sabe que la variante A predomina en gran

frecuencia en la mayoría de las razas lecheras a excepción en Jersey en la cual la

variante B es la que predomina (Farrel et al., 2004). Las variantes A y B han sido

asociadas a producción y contenido proteico de la leche respectivamente, el resto de las

variantes han sido encontradas en baja frecuencia y en razas específicas. Las variantes C,

E, F, G, han sido asociados desfavorablemente a las propiedades de coagulación de la

leche (Prinzenberg et al., 1999), para el resto de las variantes se desconoce el grado de

asociación hacia alguna característica productiva, esto quizás por la baja prevalencia

reportada para las variantes.

En el caso de la raza Charolais, se encontró un efecto significativo (p˂0.05) de

los genotipos AB y BB de CSN3 sobre peso al destete ajustado a 205 días pero no para

peso al nacimiento, donde el alelo A incrementa ligeramente el peso al destete y al

nacimiento (Cuadro 8). Los resultados obtenidos, coinciden con uno de los estudios

realizados en tres poblaciones de ganado Hereford por Moody et al., (1996), donde

encontraron que la variante B del gen CSN3 se asocia a bajo peso al nacimiento y al

destete a 180 días, influencia que es deseable para peso al nacimiento, pero no para peso

al destete en razas cárnicas, donde se espera un mayor desempeño de crecimiento y

rendimiento al destete.

Aunque estos efectos pueden ser atribuidos a las tres características a las que se

ha asociado las variantes del gen CSN3 en razas lecheras: cantidad y calidad proteínica,

así como rendimiento en la producción de leche; no es posible determinar de forma

precisa cual es el rasgo sobre el cual se está ejerciendo el efecto favorable en ganado

cárnico. Incluso se podría pensar que el efecto observado es también consecuencia de la

interacción entre loci. Las variantes A y B de CSN3 han sido ampliamente estudiadas en

bovinos, los haplotipos formados con las variantes de β-caseína han demostrado que

ejercen un efecto significativo sobre las propiedades de coagulación (tiempo de


51

coagulación, tiempo y firmeza del cuajo), producción de leche y proteínas; pero no sobre

el contenido de proteínas y grasas. La presencia de al menos un alelo B en ambos loci

(CSN2 y CSN3: A1BAB, A2BBB, A2BAB) ejercen un efecto significativo sobre las

propiedades de coagulación de la leche, mientras que para los haplotipos más frecuentes

A2A2AA, A1A2BE, A1A2AE, su efecto es pobre. Los haplotipos de CSN2 y CSN3 no

ejercen un efecto significativo para producción de grasa, contenido de grasa, caseínas,

proteínas y células somáticas, sin embargo son más favorables para producción de leche

y proteína(A2A2BB y A1A1AB) de acuerdo a un estudio realizado en ganado Holstein

italiano por Comin, et al., (2008).

En el caso de razas cárnicas es evidente la necesidad de realizar estudios que

permitan de manera precisa evaluar el efecto de CSN3 sobre rasgos de crecimiento ya

que la heterogeneidad de los factores ambientales y los grupos raciales con los que hasta

ahora se han realizado los trabajos no permiten llegar a una conclusión. Hasta ahora,

Regitano et al., (1999) en un estudio realizado en ganado Canchim, Tambasco et al.,

(2003) en un estudio de evaluación de genes candidatos (CSN3, GH y β-LG) para rasgos

de crecimiento en cruzas de Bos taurus y Bos indicus (Aberdeen Angus x Nelore,

Canchim x Nelore, Simmental x Nelore) y Curi et al., (2005), en cuatro razas cárnicas

incluida Canchim llegan a la misma conclusión respecto a la falta de asociación positiva

o negativa de las variantes de CSN3 sobre rasgos de crecimiento.


52

9. CONCLUSIONES

El diseño de la estrategia basada en PCR-RFLP y PCR-ACRS, permitió la

determinación simultánea de las nueve variantes del gen CSN3 reportadas hasta la fecha

a excepción de la diferenciación de la variante B de C que se hizo por secuenciación

debido a que en el análisis de electroforesis fue dudoso, la estrategia diseñada es rápida,

económica y sería reproducible en laboratorios que disponen de equipo básico en

biología molecular.

Las frecuencias genotípicas y alélicas de las variantes del gen CSN3 en la

población Carora y Charolais revelaron estar en equilibrio de Hardy-Weinberg, no así

para la población de Gyrholando, ya que los individuos muestreados están en proceso de

cruzamiento y no han llegado al nivel racial deseado (5/8 Holstein y 3/8 Gyr) además

una posible presión de selección dirigida a producción de leche haya contribuido al

desequilibrio genético.

Las variantes de CSN3, en la población Charolais, mostraron un efecto negativo

del alelo B (P=0.0474) sobre el peso al destete ajustado a 205 días.


53

10. RECOMENDACIONES

La mayoría de estudios de genotipificación han sido dirigidos a las variantes A y

B, por tanto es recomendable continuar tipificando las nueve variantes del gen K-caseína

para tener un panorama más completo del efecto que ejerce cada variante sobre los rasgo

productivos del ganado bovino independientemente de su fin productivo.

En estudios posteriores es recomendable incluir al análisis, la determinación de

proteínas, grasas, sólidos totales, conteo de células somáticas; de la leche de animales

analizados.

El resultado de asociación obtenido en Charolais es un buen indicador del efecto

que ejerce el genotipo sobre características de crecimiento (peso al destete ajustado a

205 días), por tanto se sugiere aumentar el tamaño de la población incluyendo familias

completas. En cualquier estudio se deberá considerar poblaciones con datos productivos.


54

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68

12. GLOSARIO

ADN: Molécula del ácido nucleíco que contiene la información genética de un

organismo vivo y está compuesta por pares de cuatros bases nitrogenadas denominadas

Adenina (A), Timina (T), Citocina (C) y Guanina (G).

Alelo: Forma alternativa de un gen ó una región de un marcador dentro de un

cromosoma. Se segrega durante la meiosis y el hijo recibe solo uno de cada par de alelos

de cada progenitor.

Aminoácido: Molécula orgánica compuesto por un grupo amino (-NH2) y un grupo

carboxilo (-COOH). Son los componentes básicos de las proteínas.

Aplomo: Es la relación entre el eje del miembro y sus ángulos, respecto del plano medio

del cuerpo del animal y la horizontal del suelo.

Calidad: Conjunto de propiedades de un objeto ó producto que le confieren la capacidad

de compararlo con otro de su misma especie.

Codón: Un triplete de nucleótidos adyacentes del mRNA que codifica un aminoácido

específico en la cadena polipectídica durante la síntesis de proteínas o determina el cese

de dicha síntesis.

Cuajo: Es una sustancia presente en el abomaso de los mamíferos rumiantes, contiene

principalmente la enzima llamada renina (quimosina).

Diferencia Esperada en la Progenie (DEP): Es el valor genético de un animal que

permite predecir genéticamente la superioridad productiva del animal y compararla con

otros animales para determinar el comportamiento del animal evaluado en alguna

característica de importancia económica en las hijas de generaciones futuras.

Desequilibrio de ligamiento: La propiedad de algunos genes de las poblaciones

genéticas de no segregar de forma independiente. El desequilibrio disminuye cuando

aumenta la distancia (y por tanto la recombinación) entre los loci.

Diversidad genética: Es la variación en la composición de la información genética o

unidades hereditarias (genes) contenida en todas las especies vivientes, encontradas en

un área específica y que pueden reproducirse entre sí a través del tiempo.

Electroforesis: Técnica de separación de moléculas mediante su movimiento a través de

un campo eléctrico y una matriz porosa.

Enzima de restricción: Son enzimas que reconocen secuencias de ADN en particular y

cortarlos, separar una cadena de ADN, allí donde se encuentren las secuencias que han

sido codificados a reconocer.


69

Equilibrio de Hardy-Weinberg: Modelo teórico que permite predecir el equilibrio

dado en una población grande con apareamiento aleatorio, donde las frecuencias génicas

y genotípicas permanecen constantes de generación en generación en ausencia de

migración, mutación y selección.

Exón: Región codificante de un gen que contiene la información para producir una

proteína específica.

Fenotipo: Característica física de un organismo, observable y mensurable, producida

por su composición genética (genotipo) en combinación con el ambiente.

Frecuencia alélica: Porcentaje de un alelo específico del total de los alelos posibles

observados en un locus concreto en una población determinada.

Frecuencia genotípica: Porcentaje de un genotipo especifico del total de los genotipos

posibles observados en un locus concreto en una población determinada.

Gen: Segmento de ADN que codifica un cierto producto, generalmente una proteína. La

secuencia de ADN que constituye un gen incluye intrones, exones y regiones

regulatorias.

Genotipo: Constitución genética (genes) de un individuo.

Habilidad materna (efecto materno): Es un carácter complejo, que incluye la

producción de leche y un conjunto de factores que caracterizan las formas de atención

que la vaca presta a su ternero desde el nacimiento hasta el destete. Se mide por el peso

al nacer, al destete y por la sobrevivencia o no del ternero. Es la capacidad de una

hembra de gestar, amamantar, cuidar y destetar una cría.

Haplotipo: Serie de alelos en varios loci ligados en un mismo cromosoma.

Heredabilidad: Es una proporción de la varianza fenotípica total que se atribuye al

efecto de los genes.

Heterocigoto: Individuo que porta dos alelos diferentes en un determinado locus de un

par de cromosomas homologas.

Homocigoto: Individuo que porta dos alelos idénticos en un determinado locus de un

par de cromosomas homologas.

Intron: Secuencia de nucleótidos de ADN intercaladas entre los genes de eucariotes y

que son eliminados antes de la transcripción del ARN.

Lactación: Periodo de amamantamiento del becerro entre el nacimiento y el destete.


70

Manejo asistido por marcadores (MAS): Determinación del tipo de manejo a utilizar

mediante la ayuda de marcadores moleculares identificando el potencial genético de los

animales.

Marcador genético: Son regiones conocidas dentro del ADN que están relacionadas

con características fenotípicas.

Microsatélite: Un tipo de marcador genético, consiste en secuencias de ADN repetidas

de nucleótidos en el ADN, en un locus específico y variable en el número de

repeticiones de la secuencia.

Polimorfismo: La existencia de dos o más variantes en un locus determinado. Diversas

formas de un individuo en una población.

Proteína: Molécula compuesta de una o más cadenas de aminoácidos en un orden

específico. Las proteínas son requeridas para la estructura, función y regulación de las

células, tejidos y órganos del cuerpo de un ser vivo. Por lo tanto, cada proteína tiene una

función única.

Prueba de comportamiento: evaluación del comportamiento de una población de

animales en un hato con las mismas condiciones ambientales, alimentación y manejo.

Rasgos cualitativos: Características en las que hay una diferencia marcada entre los

fenotipos, como blanco y rojo. La expresión de estas características se involucra sólo

uno o pocos pares de genes.

Rasgos cuantitativos: Característica medibles del individuo en las que intervienen

varios genes con dos o más alelos en loci diferentes.

Sistema extensivo: Aprovechamiento de las condiciones naturales, se requieren grandes

extensiones de pastizales. Los animales permanecen un tiempo más prolongado para ser

ofrecidos al mercado, pero el costo de producción es mínimo, no se requiere de mucha

mano de obra, y no exige instalaciones costosas.

Sistema intensivo: Mantienen al ganado en confinamiento por un periodo de tiempo (90

días) con alimentación a base de raciones balanceadas. No se requiere solo de una

reducida superficie y en cortos tiempos obtienen más peso debido a la tranquilidad,

menor ejercicio y por ende menor desgaste de energía.

Sistema semintensivo: Combina el sistema extensivo e intensivo mediante dos

modalidades: 1) suplementación: se le proporciona diariamente determinada cantidad de

alimentos balanceados; 2) encierro: los animales pastan medio día y el resto son

encerrados en corrales, donde se les proporciona mezclas alimenticias.

Valor genético: El promedio de la suma de los efectos de los genes que los progenitores

transmiten a su descendencia.


71

APÉNDICES

APÉNDICE A

Cuadro A1. Volúmenes de soluciones y de tamaño de muestras utilizadas del

estuche de extracción de ADN genómico Promega Wizard® Tamaño de

muestra

Soluciones de lisis Solución de

precipitación de

proteínas

Isopropanol Solución de

rehidratación de ADN Celular Núcleo

20 µl 60 µl 20 µl 6.7 µl 20 µl 10 µl

50 µl 150 µl 50 µl 16.5 µl 50 µl 25 µl

300 µl 900 µl 300 µl 100 µl 300 µl 50 µl

1 ml 3 ml 1 ml 330 µl 1 ml 150 µl

3 ml 9 ml 1.5 ml 1 ml 3 ml 250 µl

10 ml 30 ml 10 ml 3.3 ml 10 ml 800 µl

Solución de lisis I=155 nM de cloruro de amonio (NH4Cl), 0.5 mM de EDTA, pH 7.4,

10 mM bicarbonato de sodio (NaHCO3).

Cuadro A2. Optimización de la PCR para la determinación de las variantes del gen

K-caseína. Reactivos Experimento 1 Experimento 2 Experimento3 Experimento 4

Buffer 1X 1X 1X 1X

MgCl2 Bajo Alto Bajo Alto

dNTP´s 0.4mM 0.4mM 0.4mM 0.4mM

Iniciadores Alto Bajo Bajo Alto

Taq polimerasa 0.1U 0.1U 0.1U 0.1U

ADN Bajo Bajo Alto Alto

Agua Por diferenciación

Volumen final 25 μl 25 μl 25 μl 25 μl

Programa TD55 TDTG TDTG TD55

Cuadro A3. Programas evaluados para la PCR.

Tiempo

TD55

TDTG

Temperatura No. De ciclos Temperatura No. De ciclos

5min 95 1 95 1

45 s 95 95

45 s 62–2 c/ciclo 5 58-2 c/ciclo 5

45 s 72 72

45 s 95 95

45 s 55 30 50 30

45 s 72 72

10 min 72 1 72 1


72

Cuadro A4. Preparación de EDTA 0.5 pH 8.0.

Reactivo Unidad

EDTA 186.1 g

H2O destilada estéril 1 L

Cuadro A5. Preparación de TBE 10X Reactivo Unidad

Tris base 108 g

Ácido bórico 55 g

EDTA 40 ml

H2O destilada estéril 1 L

Cuadro A6. Preparación de Agarosa al 1.5%. Reactivo Unidad

Agarosa 1.5 g

Buffer TBE 1X 100 ml


73

APÉNDICE B

Protocolo de preparación de Agarosa Nussieve® al 4%

1. Pesar el matraz erlenmeyer de 500 ml vacío y registrar su peso.

2. Pesar 4 g de agarosa Nussieve en un recipiente molde.

3. Agregar al matraz 500 ml de buffer TBX 0.5X y un agitador magnético ajustando

su velocidad de agitación (la agitación debe ser rápida).

4. Poner en la placa de agitación el matraz de solución y agregar lentamente la

agarosa.

5. Dejar la mezcla durante 15 min a temperatura ambiente. Sacar el agitador

auxiliado de otro agitador magnético.

6. Pesar el matraz con la agarosa y cubrir la boca con parafilm (hacer un hueco en

el parafilm para ventilar y evitar el derramen).

7. Calentar la solución en el microondas a potencia media durante 1 min. Sacar la

solución y dejar reposar a temperatura ambiente por 15 min.

8. Calentar nuevamente la solución en el microondas a potencia media durante 2

min, transcurrido el tiempo agitarlo y calentarlo una vez más a potencia alta

durante 1 min.

9. Pesar la disolución para verificar que este completa, en caso contrario agregar

buffer 0.5X suficiente hasta alcanzar el peso inicial.

10. Dejar enfriar a temperatura ambiente y transferir la disolución al molde.


74

APÉNDICE C

Protocolo de la reacción de secuenciación en el equipo ABI

1. Purificación con EXOSAPT IT

Mezclar en un tubo eppendorf de 100 µl:

Producto de PCR 2.0 µl

ExoSAP 1.0 µl

Vol. Total 3.0 µl

Poner los tubos en el programa EXO2 (carpeta EXO-SAP) del termociclador MJ

Research.

2. Reacción de secuenciación

Preparar por muestra la siguiente reacción de secuenciación:

X

Dna templado 1.0 µl

Primer (5 µM) 0.5 µl

Readly Reacc. Premix 2X 2.0 µl

Big Dye Seq. Buffer 2.0 µl

Agua destilada 4.5 µl

Vol. Total 10 µl

Poner los tubos en el programa SEC3130 (carpeta SEC3130) del termociclador MJ

Research.

3. Purificación Xterminator

Sam buffer 22.5 µl

Xterminator* 5.0 µl

Reacción de secuenciación 5.0 µl

*IMPORTANTE: Asegurarse de mezclar al vortex la resina del Xterminator antes de

agregar a la reacción.

Asegurarse que la resina se encuentre totalmente resuspendida. Incubar con agitación en

el termonixer durante 30 min a 25 °C. Centrifugar las reacciones a 2000 rpm durante 2

min. Tomar 15 µl del sobrenadante sin tomar nada de resina y pasar a un tubo nuevo

previamente identificado, que se enviará a secuenciar en el ABI.

NOTA: Conservar las muestras a -20 °C, si no se concreta en cada etapa hasta su envío

al secuenciador.

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