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Genetika, Antropologia Fisikoa eta Animalien Fisiologia Saila Dpto. de Genética, Antropología Física y Fisiología Animal

Lab. Genetika; ‘Abereak’ Taldea

INFORME LIBRO DIGITAL PROYECTO POTTOKA

Euskal Herriko Unibertsitatea

Universidaddel País Vasco

eman ta zabal zazu

Caracterización de la raza equina pottoka

mediante marcadores genéticos

Andone Estonba

Fernando Rendo

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1. INTRODUCCIÓN.

Desde tiempos inmemoriales existen poblaciones de caballos salvajes en las

montañas Cántabro-Pirenaicas, algunas de las cuales se mantienen aún hoy en día en

estado salvaje o semisalvaje. Fenotípicamente son primitivos y robustos encontrándose

bien adaptados a su entorno.

Entre las razas autóctonas de la región pirenaica occidental nos encontramos:

• Euskal Herriko Mendiko Zaldia: conocido también con otros nombres como

Caballo del País y Yegua de Monte; se encuentra principalmente en Araba. Se

engloba dentro del grupo de los caballos denominados pesados.

• Burguete: se localiza en el noroeste de Navarra. Se originó a partir de cruzamientos

entre hembras Jaca Navarra y machos de razas francesas. Actualmente se considera

como caballo de tipo pesado.

• Jaca Navarra: también llamado pony Navarro; es una raza nativa localizada

principalmente en Navarra, englobada dentro del grupo de los caballos ligeros.

• Pottoka: también llamado pony vasco; representa el principal objeto de estudio de

este trabajo.

El Pottoka, también llamado pony Vasco, se encuentra en las tres provincias de la

Comunidad Autónoma Vasca, así como en el País Vasco Francés, aunque son consideradas

como razas diferentes (Álvarez, 1995). Más aún, es de sobra conocida la elevada

introgresión de material genético procedente de razas Shetland y Welsh en el denominado

Pottok francés.

Teniendo en cuenta el color de la capa y sus características morfológicas, pueden ser

clasificados en tres secciones diferentes: A, B o C, siendo A la sección que engloba a

aquellos animales con color de capa negro o castaño oscuro; B, la que engloba a animales

de color de capa pía o pinta y canela; y C, la que aglutina a caballos de raza Pottoka para

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los que se conoce o intuye morfológicamente su cruce con otras razas equinas (>50% de

sangre Pottoka).

La situación actual de los animales de raza Pottoka refleja la historia general de la

raza, encontrándonos no sólo ante una situación de riesgo respecto de su conservación,

sino también ante una evidente mezcla poblacional, donde se pueden observar animales de

raza Pottoka cuyas características morfológicas implican una clasificación de la raza en

diferentes tipos, así como una posible diferenciación racial surgida a lo largo del tiempo

debida, sobre todo, a los cambios incorporados en su manejo y cuidado.

Son estos hechos los que, en definitiva, fundamentan el interés por la realización del

proyecto aquí descrito para la caracterización de la raza mediante marcadores genéticos.

Más aún, ante la pérdida global de biodiversidad en el planeta, y en el marco de la

conservación de los recursos genéticos animales, la estrategia de “actuaciones locales para

solucionar problemas globales”, promovida por la propia FAO, se ha convertido en una de

las alternativas de mayor eficacia para responder a tales problemas. La conservación de

poblaciones locales proporciona diversidad al conjunto manteniendo combinaciones

genéticas únicas adaptadas a condiciones singulares. De ahí su interés.

Sin embargo, no es hasta después de 1996 cuando el interés por esta raza cobra cierta

fuerza, más si cabe, con la edición por parte de la Diputación Foral de Bizkaia de un libro

dedicado íntegramente al Pottoka y la aparición del Catálogo de Razas Autóctonas Vascas.

Anteriormente, tan sólo una decena escasa de trabajos se habían preocupado de la raza

Pottoka como tal, principalmente desde el punto de vista morfológico, etológico y

zoométrico (Ferreras (1935), Carreras (1983), Maguregui et al. (1992), Intxausti (1994),

Armendariz (1994),…)

Los primeros trabajos que abordaron el estudio genético de la raza Pottoka fueron

realizados hace apenas 10 años, y pueden resumirse en dos. El llevado a cabo en 1998 por

Pascual et al., y que se vio completado en el 2001 por Arruga et al., en donde

caracterizaron genéticamente diferentes poblaciones vizcaínas de raza Pottoka mediante

cuatro polimorfismos bioquímicos concluyendo la no presencia de consanguinidad dentro

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de las poblaciones y sí una divergencia genética entre ellas, lo cual podría sugerir una

subestructuración poblacional significativa dentro del conjunto de animales de raza Pottoka

de Bizkaia; y el llevado a cabo por Checa et al., en 1998, completado en el 2000 por Cañón

et al., y concretado en la Tesis Doctoral de Checa en el 2004, y en donde utilizando un

total de 13 marcadores microsatélites analizaron caballos de raza Pottoka, Jaca Navarra,

Losino, Asturcón, Caballo Gallego (denominados ponis atlánticos) y Mallorquín y

Menorquín (como ponis baleares), y utilizando como grupo de referencia el Pura Sangre

Inglés. Éstos concluyeron, que si bien la separación entre los troncos balear y atlántico es

evidente, existen demasiadas similitudes entre todas las razas de ponis atlánticas, a

excepción del asturcón que parece reflejar una diferenciación mayor respecto de las otras.

Más recientemente, Royo et al., (2005) realizó un trabajo de caracterización genética de

razas equinas ibéricas utilizando ADN mitocondrial. El análisis resultó en una

diferenciación entre los denominados ponis celtas (Gallego, Asturcón y Pottoka) y el resto

de caballos ibéricos analizados. También consideró a los ponis de la cornisa cantábrica

emparentados con los británicos, sobre todo con Exmoore, por una introgresión de machos,

mientras que el origen materno, testado mediante el ADN mitocondrial sería común para

todos los caballos ibéricos y provendría de África.

Finalmente, y centrándonos en los trabajos realizados por nuestro grupo, y

recogiendo el testigo lanzado por Jesús Altuna y Koro Mariezkurrena al respecto de la

posible aportación de la Genética en la elucidación de la historia evolutiva de la raza

equina Pottoka, desde el grupo de trabajo de Genética Animal ‘Abereak’ del Departamento

de Genética, Antropología Física y Fisiología Animal (Universidad País Vasco / Euskal

Herriko Unibertsitatea) nos gustaría destacar que se ha venido trabajando en dicha raza

desde el año 2000 como parte de un proyecto más amplio sobre el análisis de la diversidad

de las razas autóctonas Cántabro-Pirenaicas. Así, desde hace aproximadamente 10 años, se

ha venido analizando el polimorfismo genético de diversas razas equinas, centrándonos

principalmente en la raza equina Pottoka por su especial singularidad.

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Los estudios genético-poblacionales basados en marcadores genéticos o del ADN

que hemos venido realizando han pretendido aportar información útil para establecer

correctas estrategias de conservación y manejo de animales. El interés del grupo se ha

centrado en los siguientes objetivos: (1) conocer la historia evolutiva y taxonomía de las

poblaciones, (2) caracterizar la consanguinidad, diversidad genética y diferenciación de las

poblaciones, y (3) la identificación de hibridación e introgresión entre poblaciones y/o

razas.

El uso de los marcadores genéticos en los estudios realizados por este grupo de

investigación ha sido de gran utilidad para aportar la base teórica en la gestión de planes de

conservación y manejo de las poblaciones autóctonas de las siguientes especies: Ovis aries

(razas Latxa, Sasi Ardi, etc.); Bos taurus (razas Pirenaica, Terreña, Monchina y Betizu);

Equus caballus (razas Pottoka, Euskal Herriko Mendiko Zaldia, etc.); Apis mellifera (abeja

negra local, etc.); Lepus castroviejoi, L. europaeus, L. granatensis (análisis de hibridación

entre las diferentes especies de liebres de la península); Engraulis encrasicolus (anchoa

europea), Reticulitermes spp. (termitas); Thunus spp. (atún), etc.

Centrándonos en la raza equina Pottoka, objeto principal del presente trabajo, de cara

a aportar información esclarecedora a la problemática descrita, desde el grupo ‘Abereak’,

liderado por la Dra. Andone Estonba, hemos pretendido aportar la experiencia en el ámbito

de actuación requerido, adquirida desde el año 1985 en que la investigadora principal

comenzó a trabajar en aspectos genéticos, en este caso del ovino Latxo (Estonba, 1994 –

Tesis Doctoral), para el que basándose en marcadores bioquímicos llevó a cabo un análisis

poblacional de las diferentes variedades y ecotipos presentes en aquel momento en la raza

Latxa. Posteriormente, el grupo de trabajo ha continuado aumentado sus conocimientos

dentro del área de la genética de poblaciones aplicada a la caracterización y conservación

de poblaciones animales, de forma que se implementó un sistema genético basado en

marcadores de tipo microsatélite que ha venido aplicándose en los controles genealógicos

de poblaciones ovinas que llevan realizándose de forma anual desde el año 2000. Este

mismo sistema genético ha sido aplicado para la caracterización genética de diferentes

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poblaciones ovinas, estando alguna de ellas en situación de riesgo respecto de su

conservación (Rendo et al., 2004). De la misma forma, sistemas de marcadores genéticos

de tipo microsatélite han venido aplicándose rutinariamente para la realización de controles

genealógicos y de trazabilidad en diferentes razas bovinas, así como para la realización de

un estudio de caracterización genética de cuatro razas bovinas, donde tres de ellas se

encuentran en diferentes grados de riesgo respecto de su conservación (Rendo et al., 2004).

Respecto a poblaciones equinas, cabe destacar la Tesis Doctoral titulada “Markari

molekularren bidezko Euskal Autonomi Erkidegoko eta Nafarroako bertako lau zaldi-

arrazen karakterizazio genetikoa”, y la publicación del artículo “Genetic diversity within

and among four South European native horse breeds based on microsatellite DNA analysis:

implications for conservation; Solis A., Jugo B.M., Meriaux J.C., Iriondo M., Mazon L.I.,

Aguirre A.I., Vicario A., Estonba A.; J Hered. 2005 Nov-Dec; 96(6):670-8. Epub 2005

Nov 2”, donde, entre otros, se describen análisis de caracterización genética de cuatro

poblaciones equinas, a saber, Pottoka, Euskal Herriko Mendiko Zaldia, Jaca Navarra y

Burguete.

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2. OBJETIVOS.

De forma general, puesto que aquí no sólo nos referiremos a los trabajos más

recientes, sino al global de trabajos que hemos venido realizando en la raza Pottoka, los

objetivos que hemos perseguido son los que figuran a continuación:

1. Caracterización genética de la población equina fundadora de la actual raza Pottoka

mediante el uso de marcadores genéticos nucleares (microsatélites y SNPs –Single

Nucleotide Polimorphysms) y mitocondriales (Solis et al., 2005), utilizando como

grupos poblacionales a estudio los facilitados por EPOFE (Euskadiko Pottokaren

Federazioa), y que se resumen en los siguientes:

1.1. Grupos poblacionales según distribución geográfica. Observación de las posibles

divergencias genéticas entre poblaciones separadas geográficamente y bajo el

supuesto de la inexistencia de flujo genético entre ellas. Inicialmente se consideran

como poblaciones independientes las correspondientes a las tres provincias: Araba,

Bizkaia, y Gipuzkoa, incluyendo dentro de cada grupo aquellos individuos cuyo

crotal hace referencia a la provincia determinada.

1.2. Grupos poblacionales según fenotipos. Atendiendo a los diferentes caracteres

morfológicos descritos para los diferentes grupos incluidos dentro de la raza.

Observación de la posible diferenciación genética entre los diferentes grupos

fenotípicos descritos. A este respecto, inicialmente se consideran los grupos

fenotípicos que establece el estándar racial: secciones A y B.

1.3. Grupos poblacionales generacionales. Según los datos facilitados por EPOFE, se

dispone de muestras de individuos a lo largo de varias generaciones. Resulta

interesante obtener un patrón de variabilidad genética a lo largo de las

generaciones.

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1.4. Análisis comparativo de la/s población/es de raza Pottoka recogidas recientemente

con las estudiadas previamente por Solis et al. (2005): Pottoka, Euskal Herriko

Mendiko Zaldia, Jaca Navarra y Burguete (poblaciones muestreadas en el 2000).

1.5. Análisis comparativo de la/s población/es de raza Pottoka con otras razas equinas,

a saber:

1.5.1. Razas equinas de la cornisa cantábrica (Losino, Asturcón y Galego),

teóricamente consideradas descendientes de un tronco celta, común a la raza

Pottoka (utilizando datos obtenidos de Checa, 2004, Tesis doctoral).

1.5.2. Razas equinas del resto de zonas peninsulares, así como europeas, asiáticas

y americanas (utilizando datos obtenidos de Luís et al., 2007).

1.6. Análisis de ‘antigüedad’ de la raza Pottoka (en vías de desarrollo). En este caso

utilizaremos determinadas secuencias de ADN mitocondrial características de la

raza Pottoka comparándolas con las obtenidas a partir del ADN mitocondrial de

restos óseos antiguos, tratando de dilucidar un posible origen preneolítico de esta

población, lo que descartaría, por tanto, que el Pottoka actual tuviera su origen

únicamente en los caballos traídos por los celtas durante el Neolítico (ver Jesús

Altuna y Koro Mariezkurrena).

2. Identificación Individual y Control Genealógico mediante marcadores genéticos

microsatélite con objeto de obtener la huella genética de cada animal para que pueda

ser incluida entre los datos que recoja el Libro Genealógico de la raza, y utilizada en la

verificación de las relaciones de parentesco, así como en la trazabilidad del animal.

Para ello se seleccionará un panel de marcadores microsatélite altamente discriminante,

de forma que se obtengan valores mínimos de Pi (Probabilidad de Identidad, definida

como la probabilidad de que dos individuos al azar presenten genotipos idénticos para

un conjunto de marcadores dado), y máximos de Pe (Probabilidad de exclusión,

definida como la capacidad de detección de falsas genealogías). Se tratará de

seleccionar un conjunto de marcadores microsatélite dando prioridad a aquellos

recomendados por la ISAG (International Society for Animal Genetics), de forma que

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los resultados obtenidos puedan ser comparados con los obtenidos por otros grupos

investigadores.

3. Por otro lado, los datos identificativos individuales serán utilizados para:

3.1. Estima de la probabilidad de asignación racial o poblacional certera que

proporciona el conjunto de marcadores microsatélite, combinando la información

de todos ellos.

3.2. Selección de aquellos marcadores microsatélite que presenten el mayor contenido

informativo a fin de optimizar el sistema genético-molecular de caracterización

genética individual y asignación racial en raza equina Pottoka.

4. Análisis de distribución poblacional de alelos diagnósticos para la capa de color

“alazán”. Mediante el uso de marcadores genéticos, en este caso de tipo SNP (Single

Nucleotide Polymorphism), y utilizando como metodología de detección la Técnica

SnaPshot basada en una minisecuenciación diferencial, capaz de detectar hasta 10

polimorfismos tipo SNP en una sola reacción. Se tratará de observar la presencia o

ausencia de los dos alelos diagnósticos (e y eª) en la población, de forma que pueda

calcularse el porcentaje de individuos portadores. En función de dicho porcentaje, se

valorará la inclusión o exclusión de los individuos portadores dentro del registro

genealógico, y por tanto, del estándar racial, así como se dispondrá de información útil

a la hora de dirigir los cruces necesarios para la conservación de la raza.

5. Generación de Banco de Muestras Biológicas y ADN para la raza Pottoka. El total de

muestras biológicas recibidas (principalmente sangre entera), así como el ADN

extraído de cada una de ellas, serán tratadas, etiquetadas, almacenadas y conservadas

de manera óptima para que puedan ser utilizadas con posterioridad en cualquier otro

tipo de trabajo, constituyendo así un Banco de Muestras Biológicas para la raza

propiedad de E.PO.FE., pero gestionado por el grupo de trabajo de la Universidad.

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Con el fin de conseguir estos objetivos hemos elegido marcadores de tipo

microsatélite, ampliando los 12 marcadores utilizados por Solís et al. (2005) hasta un total

de 17, por su alto grado de polimorfismo y por la facilidad con la que pueden ser

analizados mediante PCR. Además hay numerosos estudios que documentan la utilidad de

los microsatélites para la estimación de la distancia genética entre poblaciones

estrechamente relacionadas. Por último, son muy útiles también para el análisis individual

y control de la paternidad. También utilizaremos secuencias de ADN mitocondrial,

concretamente los datos aportados por Solís et al., 2005. Y por último, para el análisis del

color de capa alazana utilizaremos marcadores de tipo SNP.

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3. HIPÓTESIS DE TRABAJO.

1. H01: la población equina de raza Pottoka presenta una elevada divergencia

filogenética respecto de poblaciones equinas circundantes estudiadas por Solís et

al. (2005), así como respecto del resto de poblaciones de la cornisa cantábrica,

ibéricas restantes, europeas, asiáticas y americanas, manteniendo su singularidad

genética como raza equina independiente.

2. H02: la población equina de raza Pottoka presenta una elevada diversidad

intraracial, siendo ésta una característica óptima para la puesta en marcha de un

Programa de Conservación.

3. H03: el panel de marcadores microsatélite del que disponemos actualmente

permitirá configurar un sistema genético-molecular altamente discriminante para la

caracterización genética individual y asignación racial de los individuos de raza

equina Pottoka, permitiendo, entre otras, su utilización como sistema genético de

utilidad para el control de filiación de los animales incluidos en el registro de la

raza, así como controlar la trazabilidad de los animales.

4. H04: el sistema genético seleccionado para la detección de los individuos

portadores de alelos responsables de capa alazana permitirá:

4.1. Cuantificar la incidencia en la población.

4.2. Diagnosticar la coloración de capa de los descendientes de cada cruzamiento

planificado.

De esta forma se facilitará la adopción del criterio necesario respecto al color de

capa para la inclusión de los diferentes individuos en el registro de la raza.

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4. METODOLOGÍA Y DISEÑO EXPERIMENTAL.

El grupo ‘Abereak’ posee una amplia experiencia en el uso de marcadores genéticos

para la obtención de la Huella Genética Individual, considerando como tal al conjunto de

características genéticas que identifica de forma prácticamente exclusiva al individuo a lo

largo de su vida, e incluso postmortem. La huella de ADN se asemeja a un código de

barras individual. Es el resultado del análisis molecular del ADN, una combinación única

de variantes de ADN (alelos, haplotipos) para cada individuo, heredada de sus progenitores

y que transmite a la descendencia.

Metodológicamente, la obtención de la Huella Genética implica una serie procesos

que comienzan con procedimientos generales de biología molecular como la extracción y

purificación de ADN, seguido de la PCR (Polymerase Chain Reaction), para

posteriormente proceder con la secuenciación y genotipado del ADN (microsatélites,

SNPs, marcadores mitocondriales) mediante analizadores genéticos automatizados que

vuelcan los resultados a un ordenador, donde son tratados mediante programas específicos.

MUESTRA ANIMAL.

Para la realización de los objetivos descritos en el apartado anterior, ha sido

necesaria la obtención de muestra biológica (sangre preferentemente, aunque también es

posible la utilización de otros tipos de tejido) de un número representativo de animales de

cada uno de los grupos poblacionales a considerar.

A este hecho debe unirse la información recabada por la asociación de cada uno de

los individuos de la población global, para los que, en su mayoría, podemos contar de datos

genealógicos (los cuales se verían ratificados por el propio análisis genético) así como de

resto de datos morfológicos, de distribución geográfica, etc., que servirían de base para la

generación de los subgrupos poblacionales a estudio.

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Esto supone que el estudio realizado parte de unas condiciones verdaderamente

óptimas, pudiendo definirlo, por tanto, como un análisis genético exhaustivo de la raza

equina Pottoka, evidenciando la importancia de dicho trabajo para el desarrollo de futuros

programas de conservación y mejora llevados a cabo por la asociación.

MARCADORES GENÉTICOS.

La caracterización genética de la población global de Pottoka, y de las

subpoblaciones consideradas, se llevará a cabo mediante el uso de marcadores genéticos de

tipo microsatélite (muestreo actual) y mitocondrial (Solis et al., 2005). El panel de

microsatélites a utilizar comprenderá 17 marcadores, entre los que se encuentran los 12

marcadores descritos por Solís et al. (2005) y utilizados para la caracterización genética de

una muestra representativa de la población de Pottoka presente en el año 2000, así como de

otras poblaciones equinas autóctonas de la región pirenaica occidental, como son: Euskal

Herriko Mendiko Zaldia, Jaca Navarra y Burguete. Todos los marcadores se encuentran

entre los recomendados por la International Society of Animal Genetics en los últimos

Tests de Comparación Internacionales.

Para el caso de la detección de la capa alazana, se utilizarán determinadas variantes

del gen MC1R como marcadores genéticos (Marklund et al., 1996), para el que han sido

descritas tres variantes alélicas: E, e y eª , donde la presencia en homocigosis de e y eª, así

como el heterocigoto de ambas, proporcionaría al individuo el color de capa alazana que, a

priori, podría ser un carácter no deseado, atendiendo sobre todo a la frecuencia con que

estos alelos recesivos se encuentren en la población global de Pottoka.

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DESCRIPCIÓN DE LA MUESTRA ANIMAL ESTUDIADA HASTA EL MOMENTO.

Junto a las muestras que ya disponíamos desde el año 2000 y que sirvieron de base

para el trabajo recogido, entre otros, en la Tesis Doctoral de A. Solís (1995), desde

E.PO.FE se han remitido al laboratorio de Genética un total de 883 muestras sanguíneas

correspondientes a animales de raza equina Pottoka. Tras descartar muestras repetidas, con

escaso material biológico y/o con signos evidentes de rotura y posible contaminación,

finalmente se contabilizaron un total de 820 muestras.

Con posterioridad se nos remitieron los datos correspondientes, entre otros, a

‘Taldea’ o ‘Sección’ y a ‘Matrikula’ u ‘Origen Geográfico’ para dichas muestras.

Considerando los datos correspondientes a ‘Taldea’, siendo Talde A = animales de

capa negra o castaña, Talde B = animales de capa pía o pinta, y Talde X = animales para

los que no figuraba su capa; así como los datos correspondientes a ‘Matrikula’ (tomada

como Origen), siendo Origen Bi = animales de Bizkaia, Origen GI = animales de

Guipúzcoa, Origen AR = animales de Araba y Origen SO = animales para los que no

disponíamos de dato de matrícula, se procedió a clasificar a los individuos en los siguientes

grupos poblacionales:

1. 4 caballos de raza Pottoka con capa negra/castaña y de Araba (AAR).

2. 254 caballos de raza Pottoka con capa negra/castaña y de Bizkaia (ABI)

3. 480 caballos de raza Pottoka con capa negra/castaña de Gipuzkoa (AGI)

4. 3 caballos de raza Pottoka con capa negra/castaña y origen desconocido (ASO)

5. 2 caballos de raza Pottoka con capa pía/pinta de Bizkaia (BBI)

6. 39 caballos de raza Pottoka con capa pía/pinta de Gipuzkoa (BGI)

7. 1 caballo de raza Pottoka de capa desconocida y de Gipuzkoa (XGI)

8. 37 caballos de raza Pottoka de capa y origen desconocidos (XSO)

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Lógicamente el escaso número de individuos y la falta de información nos ha llevado a

no considerar las poblaciones AAR, ASO, BBI, XGI, XSO.

Entre las muestras descritas por Solís et al. (2005) y reanalizadas para el presente

proyecto se encuentran las siguientes:

1. 35 caballos de raza Pottoka de capa negra/castaña y de Bizkaia (00ABI)

2. 53 caballos de raza Pottoka de capa negra/castaña y de Gipuzkoa (00AGI)

3. 25 caballos de raza Pottoka de capa pía/pinta y de Gipuzkoa (00BGI)

4. 15 caballos de raza Pottoka de capa pía/pinta y de Araba (00BAR)

5. 61 caballos de raza Jaca Navarra (00JCN)

6. 24 caballos de raza Euskal Herriko Mendiko Zaldia procedentes de Gorbeialdea

(00EHG)

7. 113 caballos de raza Euskal Herriko Mendiko Zaldia NO procedentes de

Gorbeialdea (00EHNG)

8. 45 caballos de raza Burguete procedentes de Navarra (00BUN)

Al total de muestras recibidas se le practicó el protocolo habitual de alicuotado y

almacenado, seguido del procesado representado en la Figura 1.

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Posteriormente, las muestras han sido también analizadas siguiendo el protocolo

representado en la Figura 2.

Descripción de los marcadores microsatélite analizados

Se ha utilizado un panel de 17 marcadores microsatélite coamplificados en una

reacción de PCR multiplex, y detectados conjuntamente en un proceso electroforético en

analizadores genéticos automatizados del tipo ABI PRISM 3100 Avant y 3130 XL –

Applied Biosystems – (ver Tabla adjunta)

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PCR / ELECTROFORESIS MICROSATÉLITE

AHT4 (analizado también por Solís et al., 2005)

AHT5 (analizado también por Solís et al., 2005)

ASB2 (analizado también por Solís et al., 2005)

ASB17

ASB23

CA425

HMS1

HMS2 (analizado también por Solís et al., 2005)




HTG4 (analizado también por Solís et al., 2005)




LEX3

17 PLEX EQUINO

VHL20 (analizado también por Solís et al., 2005)

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5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN.

Dado el carácter preliminar y divulgativo del trabajo aquí presentado, no se han

incluido el total de datos obtenidos a partir de las muestras recogidas durante 2007/08, sino

que se describen de forma didáctica y lo más comprensible posible, citando en cada punto

las conclusiones más relevantes que se han podido inferir a partir de dichos datos.

1. ANÁLISIS INTRAPOBLACIONAL

Respecto a la diversidad intrapoblacional, es decir, respecto a la variabilidad

genética presente en cada una de las poblaciones de Pottoka analizadas, se han obtenido

resultados para diferentes parámetros que muestran un alto grado de variabilidad genética

dentro de las 3 poblaciones de Pottoka actuales.

Estos parámetros resultan ligeramente superiores a los observados en otras

poblaciones equinas locales de la CAPV y Navarra, españolas y europeas (ver Solís et al.,

2005), lo cual puede ser debido a 1) un mayor número de animales utilizados, quedando

por tanto las poblaciones caracterizadas genéticamente con mayor precisión, y 2) al propio

sistema de gestión y manejo tradicionales que evita el flujo génico intra e interpoblacional.

El estadístico FIS cuantifica el exceso o defecto de heterocigotos observados en

una población respecto a una población ideal en equilibrio de Hardy-Weinberg (H-W). Los

valores positivos y significativos de FIS obtenidos en las tres poblaciones en estudio

indicarían un defecto de heterocigotos, o lo que es lo mismo un exceso de homocigotos,

para los microsatélites analizados. Son varias las causas que podrían explicar este defecto

de heterocigotos (o exceso de homocigotos): 1) consanguinidad entre los individuos y/o 2)

estructuración de las poblaciones consideradas (efecto Wahlund). A pesar de que la

primera de ellas parece evidente dado que nos encontramos ante prácticamente toda la

población muestreada en los tres casos, y por tanto, ante la presencia de animales

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emparentados, la segunda podría explicar en gran medida este exceso de homocigotos,

demostrando que dentro de las poblaciones descritas nos podemos encontrar

subpoblaciones, lo cual podría ser testado disponiendo de una mayor información al

respecto de distribuciones geográficas más precisas y/o subgrupos poblacionales

conocidos.

2. ANÁLISIS INTERPOBLACIONAL

Respecto a la diversidad interpoblacional, es decir, la variabilidad genética

existente entre las poblaciones consideradas, los valores obtenidos para el estadístico

FST muestran una ligera divergencia genética entre los individuos de capa

negra/castaña si su origen es vizcaíno o guipuzcoano, mientras que el resto de

comparaciones entre parejas de poblaciones revela una similitud genética entre los

grupos comparados. De esto se desprende el hecho de que las poblaciones resulten más

diferentes, genéticamente hablando, en función de a qué grupo poblacional (provincia)

pertenezcan que a su coloración de capa (A, castaña/negra o B, pía/pinta).

3. ANÁLISIS FILOGENÉTICO

En este punto hemos tratado de reflejar de un modo visual las diferencias o

similitudes genéticas existentes entre las diferentes poblaciones y/o razas analizadas,

resultado de los análisis previos descritos por Solís (2005) y de los preliminares

realizados hasta la fecha actual con las muestras recientemente recogidas.

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3.1. MARCADORES MICROSATÉLITES

ABI

0.001

AGI

BGI

100ABI

0.001

AGI

BGI

100

Figura 3. Árbol filogenético obtenido a partir de las frecuencias alélicas para 17 marcadores mediante POPULATION, utilizando distancia de Reynolds (unweighted), algoritmo Neiborgh-Joining y 1000 iteraciones de bootstrap.

La Figura 3 representa el árbol filogenético obtenido al considerar como unidades

taxonómicas las tres poblaciones actuales descritas. La distancia existente entre las

poblaciones refleja la cercanía o similitud entre ellas, de esta forma, destacaría una mayor

similitud entre las poblaciones de animales de raza Pottoka de origen guipuzcoano

(resaltados en azul) independientemente de su color de capa, es decir, los animales de capa

negra/castaña no se diferencian significativamente de los animales de capa pía/pinta,

mientras que sí se alejan de los animales de capa castaña/negra procedente de Bizkaia.

Falta incluir información al respecto de análisis comparativos con las poblaciones de

Solís 2005, Checa 2004 y Luis 2007.

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3.2. MARCADORES DE ADN MITOCONDRIAL

El ADN mitocondrial (ADNmt) de los mamíferos es haploide, de herencia materna, sin

recombinación entre sus genes y con una tasa de sustitución de nucleótidos 5-10 veces

mayor que el ADN nuclear. Estas características facilitan el uso del ADNmt como una

herramienta para determinar las relaciones entre individuos de una especie y entre especies

estrechamente relacionadas, con tiempos de divergencia muy recientes. La región D-loop

del ADNmt, concretamente, es la más variable en su secuencia, por lo que es muy útil para

el análisis filogenético de grupos estrechamente relacionados.

En equino el ADNmt ha sido frecuentemente utilizado para caracterizar la variación

intraracial (Kavar et al. 1999, Kim et al. 1999, Bowling et al. 2000, Mirol et al. 2002). En

cuanto al análisis de las relaciones filogenéticas interraciales, los trabajos más extensos son

los llevados a cabo por Vilá et al. (Science 291, 2001) y Jansen et al. (PNAS 99, 2002).

Vilá et al. (2001) mediante un análisis filogenético agruparon las secuencias de diferentes

razas de caballos antiguos y modernos en 6 clados (A-F), indicando un alto número de

ancestros de origen antiguo. Posteriormente, mediante el análisis de redes Jansen et al.

(2002) definieron un séptimo clado (G). A este respecto los resultados encontrados por

Solis et al., 2005 evidenciaron que:

1. Teniendo en cuenta tanto la diversidad haplotípica como la nucleotídica, la

variabilidad encontrada en las cuatro razas nativas ha sido muy alta, lo que se

asemeja con lo hasta ahora descrito para los marcadores microsatélites.

2. El análisis filogenético basado en distancias confirma la variabilidad de las razas

autóctonas analizadas en tanto que hemos encontrado haplotipos correspondientes a

los 6 clados descritos por Vilá et al. (2001). Nuevamente observamos el

paralelismo con los resultados de microsatélites.

3. Tres de las secuencias obtenidas en las cuatro razas nativas forman un nuevo clado

no descrito por otros autores. Estos haplotipos podrían ser propios de estas razas

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(ver Figura siguiente). Este resultado nos parece alentador para dilucidar el origen

de la raza Pottoka, puesto que si fueran detectados estos haplotipos en las muestras

de restos óseos antiguos (preneolíticos) existentes, revelarían un origen de nuestros

caballos anterior al establecido, sin perjuicio de una más que probable introgresión

de material genético de procedencia celta.

4. En general, el análisis del ADN mitocondrial de estas cuatro razas nativas apoya el

antiguo origen de las líneas maternas en la especie equina. El análisis en

profundidad de estas puede contribuir al esclarecimiento de la historia del caballo

doméstico en Europa.

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5. CONTROLES GENEALÓGICOS Y TRAZABILIDAD.

Respecto a los resultados obtenidos para proceder a una correcta realización de

Controles Genealógicos y de Trazabilidad de los individuos de raza Pottoka,

debemos decir, que el panel de 17 microsatélites utilizado presenta valores cercanos

a 0 de Pi (Probabilidad de Identidad, definida como la probabilidad de que dos

individuos al azar presenten genotipos idénticos para un conjunto de marcadores

dado), y cercanos a 1 de Pe (Probabilidad de exclusión, definida como la capacidad

de detección de falsas genealogías). Más aún, el hecho de aumentar de 12 a 17

marcadores, respecto a los análisis previos de Solís et al. (2005), ha provocado que

tanto el parámetro Pi como el parámetro Pe disminuya y aumente respectivamente

en varios órdenes de magnitud, dando como resultado un panel de marcadores de

mayor eficiencia aún si cabe.

6. ANÁLISIS CAPA ALAZANA. MARCADORES SNP.

En cuanto a los resultados obtenidos para el análisis de los SNPs responsables de la

coloración de capa alazana, no podemos ofrecer un dato definitivo hasta que el total

de muestras sean procesadas en su totalidad. Actualmente, y tras haber procesado

aproximadamente las tres cuartas partes del total de muestras, el porcentaje de

individuos portadores del alelo e responsable del color alazán se sitúa en torno al

45%. Consideramos que es un valor importante, sobre todo desde el punto de vista

de excluir individuos como reproductores en función de si son o no portadores de

dicho alelo. De todas formas, una gestión adecuada de los apareamientos futuros

podría resultar en una disminución de este porcentaje, lo que debe ser considerado

por los responsables de la raza una vez que les remitamos los informes individuales

al respecto.

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7. CONCLUSIONES FINALES.

1. En cuanto al análisis de microsatélites, podemos concluir que las cuatro

razas equinas autóctonas de la Comunidad Autónoma Vasca y Navarra, en

concreto la raza Pottoka, presentan una alta variabilidad genética intraracial.

El hecho de que estas cuatro razas presenten niveles de variabilidad

ligeramente mayores que otras razas equinas Europeas o Americanas puede

ser consecuencia del manejo tradicional que tienen las primeras. Respecto al

DNA mitocondrial, la diversidad nucleotídica y haplotípica nuevamente es

alta, y a su vez similar en las cuatro razas.

2. La presencia de un exceso de homocigotos en la raza Pottoka es

probablemente debida en mayor medida a una subestructuración interna de

la raza en subpoblaciones aisladas y manejadas de forma diferente, más que

por efecto de la consanguinidad entre individuos.

3. A pesar de las referencias históricas sobre reducción en el tamaño

poblacional de las razas Pottoka y Jaca Navarra, los análisis de demografía

poblacional, basados tanto en el DNA microsatélite como en el DNA

mitocondrial, no han detectado cuellos de botella en las cuatro razas

autóctonas.

4. Los resultados obtenidos en el análisis filogenético basado en microsatélites

reflejan que:

a. A nivel intraracial, la raza Pottoka es más diversa genéticamente que

las otras tres razas autóctonas. Además existe mayor diferenciación

genética explicada por su origen geográfico que por su coloración de

capa.

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b. El Pottoka y la Jaca Navarra son más parecidos entre ellos que el

resto de ponis de la cornisa cantábrica entre ellos, y además, se

diferencian de forma notable de dichos ponis cantábricos.

c. Respecto a un conjunto amplio de razas a nivel mundial, el Pottoka,

y de forma conjunta el resto de razas autóctonas, forman un grupo

independiente bien diferenciado del resto de razas, incluso de

aquellas situadas en un origen filogenético hipotéticamente cercano

como pueden ser el resto de ponis europeos de origen celta.

5. Con respecto a la domesticación caballar, el hecho de que los haplotipos

encontrados en la región D-loop del DNA mitocondrial de las cuatro razas

autóctonas se localicen junto con haplotipos de otras razas dispersos a lo

largo de los árboles filogenéticos y de la red filogenética, apoya la hipótesis

de múltiples procesos de domesticación en áreas geográficas distintas a lo

largo de un amplio lapso de tiempo. Además, los nuevos y característicos

haplotipos encontrados en las cuatro razas autóctonas, y en concreto en

Pottoka, nos presentan la posibilidad de dilucidar el origen del caballo

autóctono, en concreto del Pottoka, analizando dichos haplotipos en restos

óseos antiguos preneolíticos.

6. Teniendo en cuenta el alto valor de la probabilidad de exclusión, el panel de

17 microsatélites utilizado resulta muy adecuado para el control de

parentesco y la identificación individual de los animales de raza Pottoka, y

más aún si lo comparamos con los resultado obtenidos para los 12

marcadores analizados por Solís (2005). El aumento de 12 a 17 marcadores

ha incrementado el potencial de asignación racial en las razas analizadas,

situándolo por encima del 80%, lo cual, aún siendo satisfactorio,

consideramos insuficiente para el propósito establecido debido

posiblemente a que la estrecha relación genética y el flujo génico existente

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entre ellas dificulta su demarcación. Quizás con un panel de marcadores que

rondara los 25 microsatélites se conseguirían resultados cercanos al 98%.

7. Respecto a los resultados descritos para la coloración de capa alazana, a

pesar de estar inconclusos, los consideramos elevados para establecer como

motivo de exclusión del Libro Genealógico a aquellos individuos portadores

del alelo e responsable, pero creemos factible una reducción progresiva de

la incidencia de este alelo con una gestión adecuada de los apareamientos

futuros.

8. Finalmente, y desde el punto de vista de la conservación de los recursos

genéticos animales, además del interés científico, económico y cultural de

las cuatro razas analizadas, el alto nivel de variabilidad de las mismas y la

importante disminución de diversidad genética debida a la posible pérdida

de cualquiera de ellas hacen imprescindible la conservación de las cuatro

razas autóctonas de la Comunidad Autónoma Vasca y Navarra, y en

particular de la raza Pottoka.

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