Capítulo 2 U/ 2.-Introducción Orientado a Laboratorios de Control de Calidad… · 2016-09-04 ·...

1220 Infinity 1260 Infinity 1290 Infinity

Agilent, WTC-BarcelonaIsidre Masana

Agilent Technologies

Especialista Productos UHPLC/MS

U/HPLC MasterClass

Orientado a Laboratorios

de Control de Calidad.

2.-Introducción

a la UHPLC.

Capítulo 2

Objetivo: Conocer las Posibilidades de la

UHPLC “versus” HPLC

2.- Introducción a la UHPLC:

2.1.- Historia, Introducción y Fundamentos de la UHPLC

• Ecuación de Van Deemter.

• Posibilidades de la UHPLC para aumentar resolución o reducir tiempos.

2.2.- La importancia del Flujo en separaciones con

gradientes de concentración.

• Ecuación de la Capacidad de Separación en Gradientes:

• Cómo ganar resolución y reducir tiempos de análisis aumentando el

flujo con gradientes de concentración.

2.3.- Conclusiones

Página: 2

Agenda Curso U/HPLC (1/3): Capítulo 2

El desarrollo y traspaso de métodos de HPLC a UHPLC se

aborda en el curso orientado a Laboratorios de

Investigación y Desarrollo 12:00h

Cap. 2





2.2.- La importancia del Flujo en separaciones con gradientes

de concentración.




2.3.- Conclusiones

Página: 3




Investigación y Desarrollo

Cap. 2

Historia* de la UHPLC Moderna

10 New UHPLC Systems in 5 Years – All different.

10 nuevos sistemas UHPLC en 5 años

Todos con características diferentes

Equipos Columnas & Filosofía

2003 Agilent 1100 Binario (400bars). Mezcla en

alta presión

Primeras columnas submicron 1.8um x 5 (10) cm

RRHT, filosofía UFLC/UHPLC.

2004 Waters Acquity U-class Binario (1000bars)

Mezcla en alta presión

Columnas 1,7 um BEH, campaña marketing

filosofía UPLC.

2006 Agilent 1200-RRLC binario, (600bars)

Mezcla en alta presión

2º generación* 1.8 um, x 10 (15) cm concepto

UHPLC. *reducen 20-30% presión de trabajo

2008 Agilent 1220/1260 binario, cuaternario

(600bar) Mezcla alta o baja presión

Rediseño 1200RRLC. Filosofía equipo hibrido

HPLC/UHPLC.

2010 Agilent 1290 binario (1200bars)

UHPLC. Mezcla en alta presión.

UHPLC con la máxima potencia del mercado (P x F).

- Poroshell 120 UHPLC 2,7um a presiones más

bajas (40-50% menor) x 10 (15) cm con 400bars

2010 Waters Acquity H-class cuaternario

(1000bar). Mezcla en baja presión

UHPLC con mezclado a baja presión.

2011 Waters Acquity I-Class binario (1000bars) Rediseño U-Class.

2011 Agilent 1290 cuaternario (1200bars)

Mezcla en baja presión

Más versátil UHPLC del mercado.

2013 Waters Rediseño Alliance (345bars).

Mezcla baja presión

Prolonga la vida de la serie Alliance.

Pre-historia: 198X ya existían en el mercado columnas de 1.5 µm (x30mm long.): UFLC

Cap. 2

Página: 4

Fundamentos UHPLC

1. Ecuación de Van Deemter:

• Capacidad de poder trabajar a flujos elevados SIN perder eficacia, con columnas:

– De pequeño tamaño de partícula totalmente porosas (TP <2µm)

– Fino espesor de fase estacionaria; columnas núcleo sólido superficialmente porosas (SP 2.7µm).

2. Ecuación de la Capacidad de Separación en Gradientes:

• La capacidad de separación de picos trabajando con gradientes de concentración es directamente proporcional al flujo de trabajo y al tiempo de gradiente subir el flujo permitirá mejorar la separación con gradientes.

Página: 5

Cap. 2

Columnas UHPLC “versus” HPLC

• UHPLC:

• Columnas que permiten trabajar a flujos elevados SIN perder eficacia:

– Rellenos totalmente porosos de pequeño tamaño de partícula (<2µm).

– Rellenos superficialmente porosos (fino espesor de fase estacionaria 0.5µm) con núcleo sólido (1.7µm). Tipo “Poroshell-120”

• Los cromatógrafos de 400 bars se pueden adaptar para trabajar con columnas de UHPLC tipo Poroshell-120 (hasta 10cm long.) y totalmente porosas de 1.8µm (hasta 5cm long.) con acetonitrilo/agua.

• HPLC:

• Columnas tradicionales de 3.5 y 5µm de tamaño de partícula.

Página: 6

Cap. 2










2.3.- Conclusiones

Página: 7





10-20mCap. 2

Efecto del Tamaño de Partícula en la Eficacia.

HPLC vs UHPLC: Gráfico Van Deemter

Columnas: ZORBAX Eclipse XDB-C18

Dimensiones: 4,6 x 50 mm (30 mm, 1,8 m)

Eluyente: 85:15 ACN: Agua - ISOCRATICO

Velocidades de flujo: 0,05 – 5,0 mL/min

Temp: 20°C

Muestra: 1,0 L octanofenona en eluyente

1/ 2.5

+

EFI

CA

CIA

-

HPLC:EFICACIA A FLUJOS ALTOS:

EFICACIA A FLUJOS ÓPTIMOS

Partícula H_min

5 μm 9,1 μm

3,5 μm 5,8 μm

1,8 μm 3,7 μm

N(1.8µm) = 2.5 x N(5µm)

1.6 x Rs(5µm)

0.0000

S.T.M.: Sub Two Microns

Ultra Fast LC

Particulas1,8 μm a 5ml/min* dan más eficacia

N(1.8µm) = 2.5 x N(3.5µm) = 4 x N(5µm)

* 5ml/min con columnas 4.6mm - 1ml/min con columnas de 2.1mm D.I.

HPLC

GC: Diám. col. cap.

Espesor film f.estac. N

/ Diámetro Columna & Espesor Film (GC)

Página 8

o Poroshell 120

YA VISTO en

Cap 1.1

Cap. 2

4.6 x 150, 1.8um

490 bar

N = 28669

RS = 1.80 (+ 57%)

S/N = 44

7 Impurezas

Las 7 Separadas

a línea de base

4.6 x 150, 5um

93 bar

N = 7259

RS = 1.15

S/N = 42

Ejemplo de un cliente

Método Impurezas Isocr.

Zoom zona critica

rango tiempo @ 7min

4.6 x 150, 3.5um

165 bar

N = 14862

RS = 1.37 (+19%)

S/N = 50

7 Impurezas

6 No Separadas

a línea de base

Aportaciones Ejemplo de Mejora de Resolución

HPLC vs UHPLC con Columnas de 150mm x 1.8µmEjemplo con muestra compleja: hasta un 60% de Mejora en la Resolución

Manteniendo Tiempo de Análisis

4 Impurezas

2 No Separadas

a línea de base

HPLC UHPLC

Página: 9

2.1mm x 50mm 1.8µm

1.00ml/min, 40°C

Grad.: 35-95% en 0.9 min

Analysis Time= 1.1min

UHPLC, 40°C

10x faster

PW = 0.5 sec

min0.2 0.4 0.6 0.8 10

Aportaciones Ejemplo de Mejora de Velocidad HPLC

vs UHPLC Agilent 1200-RRLC (UHPLC-600bars)

HPLC, 40°C

PW = 3.4sec

4.6 x 150mm, 5µm

1.20ml/min, 40°C

Grad.: 35-95% en 10.8 min

Analysis Time = 11minmin0 2 4 6 8 10

0.2 0.60 0.4 min

2.1mm x 50mm 1.8µm

2.40ml/min, 95°C

Grad.: 35-95% en 0.38 min

Analysis Time: 0.4min

Presión < 600bars

UHPLC, 95°C

27x faster

PW = 197msec

150mm > 50mm: 3x

1.2ml/min on 4.6 > 2.4ml/min on 2.1: 10x 3 x 10 = 30x

Hasta +20x más rápido que un HPLC. manteniendo la resolución

Página: 10

F xTg

/ V0

1.2 x10.8

/1.5 =

8.6

1.0 x 0.9

/0.1 =

9.0

2.4x0.38

/0.1=

9.1

Efecto de la Temperatura en Gráfico de “Van Deemter”Al aumentar la temperatura* el óptimo se desplaza a flujos mayores

25°C, 45%ACN 60°C, 40%ACN 90°C, 35%ACN 120°C, 28%ACN

uo, opt

25ºC

60ºC

90ºC

120ºC

H = f (u) – butilparaben Tamaño partícula: 5 µm

7.00

9.00

11.00

13.00

15.00

17.00

19.00

0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00

u (mm/s)

H (

µm

)

HTLC: HPLC a Alta Temperatura* permite trabajar a mayores flujos sin pérdida

de eficiencia y con mejor transferencia de masa (curva más plana a flujos altos)

*Tener en cuenta que la temperatura afecta al pH de la fase

móvil

Cap. 2








• Cómo ganar resolución y reducir tiempos de análisis

aumentando el flujo con gradientes de concentración.

2.3.- Conclusiones

Página: 12





16-14mCap. 2

El factor de Capacidad de Separación de picos con Gradientes de concentración, es DIRECTAMENTE proporcional al FLUJO y al tiempo del gradiente:

• x2 flujo gradiente x2 factor de Capacidad de Separación de picos *.

• x3 flujo gradiente x3 factor de Capacidad de Separación de picos *.

• …

Doblar el flujo produce la misma mejora en resolución que doblar el tiempo del gradiente

• Flujos elevados permiten maximizar el poder de separación en gradientepor unidad de tiempo:

• P. Petersson et al., J.Sep.Sci, 2008,31, 2346-2357

• D. Guillarme et al., Journal of Chromatography A, 1216 (2009) 3232–3243

* El nº de picos que se pueden separar aumentará algo menos con columnas de 5um (por la ligera perdida de eficacia al subir el flujo), pero aún así compensa la pérdida de eficacia.

¿Porqué es Importante en Gradiente poder trabajar

a FLUJOS Elevados en HPLC y UHPLC?

K‘ α F x Tg

Página: 13

Cap. 2

HPLC con GRADIENTES: NO es Imprescindible Cambiar

de Columna para Reducir Tiempos SIN perder ResoluciónIncluso con tamaños de partícula de 5 y 3.5µm

Columna: ZORBAX Eclipse XDB-C8

4.6x50, 3.5µm

Gradiente 45 – 90% B en 3 y 2 min

Fase Móvil: A:25mM Na2HPO4 , pH 3

B: Metanol

Flujo: 2 y 3 mL/min

Temperatura: 35°CMuestra: Fármacos Cardiacos:1. Diltiazam

2. Dipyradamole 3. Nifedipina

4. Lidoflazina 5. Flunarizina

1

2 3

4

5

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 Time (min)

F = 2.0 mL/min

Tg = 3 min

3min

1

23

4

5

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 Time (min)

F = 3.0 mL/min

Tg = 2 min

2min

• Sin cambiar de columna, ni de tiempo de gradiente, SUBIR el FLUJO, permitirá

mejorar la resolución/capacidad de separación.

• El aumento de capacidad de separación al subir el flujo, compensa la pérdida de

eficacia de las columnas de 3.5 y 5 µm.

K‘ = (87 x F x Tg) / (Δ % x V0 x S)

• La capacidad de separación no cambiará si: F1xTg1/V0 col.1 = F2xTg2/V0 col.2

Si mantenemos Tg=3 ( y F=3) obtendremos:

+Resolución y un tiempo análisis < 3min

Página: 14

Cap. 2

Columnas: ZORBAX Eclipse XDB-C18

Dimensiones: 4,6 x 50 mm (30 mm, 1,8 m)

Eluyente: 85:15 ACN: Agua

Velocidades de flujo: 0,05 – 5,0 mL/min

Temp: 20°C

Muestra: 1,0 L octanofenona en eluyente1/ 2.5

+

EFI

CA

CIA

-EFICACIA A FLUJOS ÓPTIMOS

Partícula H_min

5 μm 9,1 μm

3,5 μm 5,8 μm

1,8 μm 3,7 μm

N(1.8µm) = 2.5 x N(5µm)

1.6 x Rs(5µm)

0.0000

Ultra Fast LC

* 5ml/min con columnas 4.6mm - 1ml/min con columnas de 2.1mm D.I.

HPLC

Página: 15

El aumento de capacidad de separación al subir el flujo, compensa la pérdida de

eficacia de las columnas de 3.5 y 5 µm.:

• 5µm 0.75 mL/min: Eficacia/2.4 pero Capacidad Separación x7

• 3.5µm 0.85 mL/min: Eficacia/2 pero Capacidad Separación x6

K‘ = (87 x F x Tg) / ( Δ % x V0 x S)

Las columnas de 1.8µm NO conviene

que trabajen a flujos bajos; empiezan a

perder eficacia por debajo de

0.8mL/min (en columnas 4.6mm d.i //0.16

mL/min con 2.1mm d.i..)

La Ventaja de Subir el Flujo Trabajando con

Gradientes Incluso en HPLC (columnas 3.5 y 5µm)

ó Poroshell 120

Cap. 2

Influencia del Flujo en Gradiente con Columnas 5 µm Comparación GRADIENTE 10 min a 1-3-5 ml/min con Columna 5µm 150x4.6mm

3mL/min

1mL/min

5mL/min 1290 Infinity Cuaternario

Columna: 5µm 4.6x150mm Eclipse XDB-C8

Gradiente: H20/ACN50/50-0/100 en 10 min

Flujo: 1, 3 y 5mL/min (pruebas respetando Pmáx

columna: 400bars) 40ºC.

Inyección: 2 µl muestra (1500ppm dimetilftalato y

dietilftalato, 100 ppm bifenilo, y 300ppm o-

terfenilo en metanol)

8min

4.5min

3.3min

Al subir flujo se reduce el

tiempo y el ancho de los picos

Página: 16

FxTg= 10

FxTg= 30

FxTg= 50

Cap. 2

Influencia del Flujo en Gradiente con Columnas 5 µm Comparación en ESCALA TIEMPO NORMALIZADA GRADIENTE 10 min a 1-3-5

ml/min con Columna 5µm 150x4.6mm

3mL/min

1mL/min

5mL/minAl subir flujo en gradiente se reduce el tiempo y el

ancho de los picos y en especial de los del principio

mejora la capacidad de separación de picos

8min

4.5min

3.3min

Peak width:

0.0546

Peak width:

0.0242

Peak width:

0.0171

Peak width:

0.0496

Peak width:

0.0542

Peak width:

0.0696

Página: 17

Peak width:

0.0696

Peak width:

0.0446

Peak width:

0.0371

Flujo

mL/

min

Capacidad

Separación

Nº picos(ref.1º)

Capacidad

Separación

Nº picos(ref.3º)

1 35 30

3 45 35

5 55 40

• Nº de picos que se pueden

separar con resolución

hasta línea de base en

función del ancho en línea de

base del 1er (zona inicial) y

3er pico (zona central) del

cromatograma a distintos

flujos con la columna de 5µm

totalmente porosa.

• Eficacia (N) 5µm a 5mL/min =

½ de la N a 1mL/min

Al subir flujo aumenta el nº de picos que se pueden separar -INCLUSO con una

columna de 5µm- y además se reduce el tiempo e análisis.

FxTg= 10

FxTg= 30

FxTg= 50

¿Porqué se reduce el ancho del pico ?

min2 4 6 8 10

mAU

0

500

1000

1500

DAD1 A, Sig=240,80 Ref=360,100 of AIAFOR~1\1AA-0401.AIA\SIGNAL01.CDF (AIA imported)

1.9

63

2.6

62

5.4

15

10.6

43

min2 4 6 8 10

mAU

0

500

1000

1500


0.6

72

0.9

09

1.8

32

3.5

89

min2 4 6 8 10

mAU

0

500

1000

1500


0.4

07

0.5

50

1.1

15

2.2

04

HPLC ISOCRÁTICO: Pérdida de Eficacia con 5 µm a Flujos Elevados Comparación Isocrático a 1-3-5 ml/min con Columna 5µm 150x4.6mm

Flujo: 1 ml/min. ACN/H2O 70/30

Flujo: 3 ml/min. ACN/H2O 70/30

Flujo: 5 ml/min. ACN/H2O 70/30 Isocrático: ACN/H2O 70/30

Inyección: 5 µl muestra (isocrática:1500ppm dimetilftalato y

dietilftalato, 100 ppm bifenilo, y 300ppm o-terfenilo en metanol

Detección: DAD 240/80 nm ref:360/100nm, slit8nm y frecuencia de adquisición a 0.01 y 0.05min Celda 6mm y 5µl

N= 15.700N= 16.200

N= 10.000N= 9.900

N= 6.900

N= 6.500

• En ISOCRÁTICO Con 5µm hay una pérdida

de eficacia al pasar de 1 a 3-5 ml/min, pero

mantiene una buena resolución.

• 5ml/min con columna 4.6mm d.i.: N(1.8µm)

= 2.5 x N(3.5µm) = 4 x N(5µm)

Comparación Normalizada

min2 4 6 8 10

1mL/min

3mL/min

5mL/min

Página 18

Entre 1 y 3ml/min

apenas se aprecia

pérdida de resolución

Cap. 2

Comparación Estrategias Mejora de la Resolución

k = (87 x F x Tg) / ( % x V0 x S)

Columna: ZORBAX SB-C8

Gradiente: 20 – 60% B en 10 min o 60 min

Fase Móvil: A:H2O con 0.1%TFA, pH 2

B: Acetonitrilo

Flujo: 1.0 mL/minTemperatura: 35°C

Muestra Herbicidas: 1. Tebutiuron 2. Prometon 3. Prometryna 4. Atrazine

5. Bentazon 6. Propazina 7. Propanil 8. Metolaclor

Tg = 10 min

4.6 x 150 mm, 5 µm

N = 12,000

V0=1.5ml

15min

1,2

34 5

6

7

8

0 5 10 15Time (min)

• Aumentar Tg (el resto de parámetros no se modifican )1

Tg = 60 min a 1mL/min 4

2

0 25 50Time (min)

3

5

8

6

7 40min

4.6 x 150 mm, 5 µm

N = 12,000

V0=1.5ml

Tradicional

• Reducir V0 y Subir Flujo4.6 x 75 mm, 3.5 µm V0=0.75ml

N = 10,000

Tg = 15 min a 2mL/min

“Moderna”:

Si k se aumenta (↑Tg, ↑F, ↓V0) el poder de separación mejorará.

Página: 19

Time (min)0 5 10

2

3

45

67

8

1

7min

1x10/1.5= 6,7

2x15/0.75= 40

1x60/1.5= 40

¡¡¡Se reduce Tiempo análisis

a 1/6 pero se mantiene la

Separación !!!

¿Cómo mejorar?

Cap. 2










2.3.- Conclusiones

Página: 20





27-3mCap. 2

Conclusiones: UHPLC “versus” HPLC

Página: 21

UHPLC permite MAXIMIZAR:

• Reducción de Tiempos de Análisis SIN perder Resolución.

• Aumentar la Resolución SIN incrementar tiempo de Análisis.

HPLC (400 bars) -incluso sin cambiar de columna- permite:

• Simplemente SUBIENDO el FLUJO de trabajo* Reducir Tiempos y

Aumentar la Resolución.

* Trabajando con gradientes de concentración

Cap. 2

1220 Infinity 1260 Infinity 1290 Infinity

Serie 1200 Infinity: la Máxima Flexibilidad

para trabajar en HPLC y UHPLC,

en Todo Tipo Aplicaciones.

Hasta 5mL/min*

para máxima eficacia y

mínimo tiempo de análisis

incluso con las

tradicionales y robustas

columnas de 4.6mm d.i

*hasta 10mL/min con bombas

cuaternarias

Página: 22

Cap. 2

Estamos a su disposición en

tel.: 901.11.6890 [email protected]

[email protected] www.agilent.com/chem

¿Preguntas?

30min

12:0012:30

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