45

CAPITULO IV

MATERIALES Y METODOS

4.1. Universo

El universo considerado para la presente investigación es el Estero Salado.

4.2. Muestra

Como muestra para diagnosticar la calidad de las aguas, sedimentos y

evaluar los impactos que ocasiona la ciudad de Guayaquil se considera la

información obtenida de un total de 93 muestras recolectadas de la cabecera

norte del Estero Salado (Puente Miraflores, Puente calle Aguirre, Puente Portete,

Puente de la calle 17 y Puente de la Isla Trinitaria).

4.3. Variables Estudiadas 4.3.1. Variables Cualitativas:

• Estado de Marea flujo y reflujo diurno

• Grado de deterioro del Estero Salado

4.3.2. Variables Cuantitativas

Para el análisis de calidad de agua se determinaron

• Parámetros Físicos: Temperatura, salinidad y pH.

• Parámetros Hidroquímicos: Oxigeno Disuelto, Demanda Biológica de

Oxigeno, Fosfato, Nitrito, Nitrato, Silicato, Hidrocarburos del petróleo.

• Parámetros Microbiológicos: Coliformes Totales y Coliformes Fecales

Para el análisis de la calidad de los sedimentos se determinaron

46

• Parámetros Geoquímicos: Materia orgánica, Carbón orgánico, Nitrógeno

orgánico, Fósforo y Azufre. 4.4. Metodología de muestreo

Para el presente estudio se colectó muestras de agua durante el lapso de

Septiembre a Diciembre del año 2000 en los lugares antes mencionados en dos

estados de marea (Flujo –Reflujo) diurno, considerando las dos riberas (Este y

Oeste) del Estero Salado, en el área de ubicación de cada uno de los puentes

estudiados y un último muestreo en el mes de Enero del año 2001 desde el área de

la Empresa Fertisa hasta la última boya de la zona de cuarentena ( lugar de fondeo

de los Barcos mercantes que llegan al Puerto Marítimo de Guayaquil), mientras que

las muestras de sedimentos se recolectaron en el mes de Diciembre del año 2000

en el área central de los puntos determinados para el estudio.

La recolección de las muestras de agua se realizó mediante la utilización de

botellas VAN-DORN de 4 litros de capacidad para el análisis de oxígeno disuelto y

micronutrientes inorgánicos. Fotos.5 - 6. El oxígeno disuelto fue analizado in-situ,

inmediatamente luego de tomar las muestras y, las de nutrientes, congeladas

para su posterior análisis por espectrofotometría de luz polarizada, mientras que

para los parámetros microbiológicos se utilizó botellas muestreadoras y envases

previamente esterilizados, preservándose las muestras a 4°C y transportándose

las mismas inmediatamente luego de ser tomadas al laboratorio de análisis para

su siembra y respectiva incubación.

Para el análisis de hidrocarburos del petróleo disueltos y dispersos, las

muestras fueron tomadas en botellas de vidrio ámbar de 4 litros de capacidad,

previamente tratadas y a una profundidad de 1 metro bajo la superficie, extraídas

inmediatamente con n-hexano y refrigeradas para su posterior análisis por

espectrofluorometría.

Las muestras de sedimentos fueron recolectados mediante el uso de una

draga Van- Veen.

47

4.5. Metodología de análisis químico

Los análisis de parámetros físico –químicos y bacteriológicos para el estudio

de la calidad de agua como los análisis de la calidad de los sedimentos se

realizaron por metodología estandarizada internacionalmente las mismas que se

detallan a continuación.

4.5.1. CALIDAD DE AGUA 4.5.1.1. Parámetros Físicos 4.5.1.1. a. Temperatura.

Las lecturas de temperatura se usan en el cálculo de varias formas de

alcalinidad en estudios de saturación y estabilidad con respecto al carbonato de

calcio, en el cálculo de la salinidad y en operaciones generales de laboratorio.

Foto. 5. Botella Van- Dorn Foto. 6. Análisis de Oxígeno Disuelto

48

En estudios ambientales, la temperatura del agua en función de la

profundidad es de mucho interés. La elevación de temperatura como resultado

de descargas de aguas calientes puede tener impacto ecológico significativo.

La identificación de fuentes de agua potable tales como pozos profundos a

menudo es posible con medidas de temperatura. En la industria es necesario

conocer la temperatura del agua en procesos o en cálculos de transmisión de

calor.

Los organismos se comportan en forma diferente con relación a la

temperatura ambiente y pueden ser afectados por lo que se denomina

contaminación térmica.

El aumento en la temperatura provoca la disminución en la capacidad del

agua para retener oxígeno al mismo tiempo que aumenta la actividad fisiológica

de los organismos acuáticos produciendo la asfixia de los mismos, siendo éste el

efecto más nocivo de la contaminación térmica.

Además de eso, los peces son sensibles a las variaciones bruscas de

temperatura, no pudiendo soportar variaciones de más de 6°C por períodos cortos

de tiempo. Los peces al estar sujetos a cambios repentinos de temperatura sufren

un colapso o choque térmico.

Normalmente, la medida de temperatura se hace en terreno mediante la

utilización de termómetros de mercurio, graduados en ° C. Como mínima esta

graduación debe ser cada 0,1 °C. El termómetro deberá tener una capacidad

térmica tal que permita un rápido equilibrio. Para terreno debe usarse un

termómetro provisto de una protección metálica para prevenir su ruptura.

Los resultados se informan al décimo de grado. (22).

4.5.1.1.b. Salinidad.

La salinidad del agua es importante para mantener una apropiada relación

osmótica entre el protoplasma de los organismos y el agua. Esta relación

osmótica varía entre las especies. Algunas diatomeas, especialmente las de la

49

zona nerítica presenta un amplio rango de tolerancia a la salinidad y son

conocidas como formas euryhalinas, mientras que las formas que viven en la

zona oceánica se denominan stenohalinas y son las que presentan poca

tolerancia a los cambios en la salinidad.

La salinidad es la cantidad total de material sólido en gramos contenido en

un kilogramo de agua de mar cuando todos los carbonatos han sido convertidos a

óxidos, los bromuros y Yoduro reemplazados por cloruros, y toda la materia

orgánica completamente oxidada. (22).

Por medio del análisis de la salinidad se consigue determinar:

• El tipo de una determinada masa de agua

• La composición o tipos de especies que constituyen los rangos de fertilidad

de los océanos

• Ayudan a interpretar los criterios de calidad de agua según sus usos

Aquellos valores que oscilan entre 10 –29 UPS reflejan aguas de estuarios,

entre 0.013 - 7.0 UPS representan aguas fluviales, cuando los valores de

salinidad se encuentran hasta 0.1UPS el agua puede considerarse aceptable

para ciertos usos. Para uso de riego el agua debe tener ausencia de salinidad.

4.5.1.1. c. pH.

La concentración de ión hidrógeno es un parámetro de calidad de gran

importancia tanto para el caso de aguas naturales como residuales. El intervalo

de concentración para la adecuada proliferación y desarrollo de la mayor parte de

la vida biológica es bastante crítico. El agua residual con concentraciones de ión

hidrógeno inadecuado presenta dificultades de tratamiento con procesos

biológicos y el efluente puede modificar la concentración del ión hidrógeno en las

aguas naturales si ésta no se modifica antes de la evacuación de las aguas.

50

La concentración del ión hidrógeno presente en el agua está relacionada con

la cuantía en que se disocian las moléculas de agua. El agua se disocia en iones

hidroxilo e hidrógeno del siguiente modo:

H2O H+ + OH-

El pH del agua de mar se mantiene normalmente entre 7,5 y 8,4, los valores

más altos se producen en las capas superficiales donde el CO2 es utilizado para

la fotosíntesis. La presencia de sales fuertes con ácidos débiles como carbónico y

bórico confiere al agua de mar una apreciable capacidad tampón.

Variaciones grandes en el pH del medio causadas por ejemplo por el

lanzamiento de ácidos fuertes pueden afectar la flora y fauna de una masa de

agua. Este fenómeno ha sido estudiado especialmente en lo que se refiere a la

mortalidad de peces, pudiéndose concluir que solamente pocas especies

soportan pH de 4 y la mayoría no soporta pH inferior a 5.

Con relación a los álcalis, pocos peces soportan pH superior a 9 quedando

entonces como condiciones favorables los límites entre 5 a 9. Otro efecto

indirecto, sobre los organismos es causado por la influencia que pueden ejercer

sobre la toxidéz ciertos compuestos tales como metales pesados, gas sulfihídrico

y también en la fijación del calcio para la formación de conchas. (23).

Precisión: +- 0.03.

4.5.1.2. Parámetros Químicos 4.5.1.2.a. Oxígeno Disuelto

Los gases presentes en la atmósfera de nuestro planeta también lo están

en las aguas de sus océanos. Estos gases se pueden clasificar en dos grandes

grupos:

51

Gases estables

Son los que conservan permanentemente su presencia invariable en las

aguas. Son biológicamente inertes, y están formados por los gases nobles: argón,

helio, criptón y neón. Están presentes en el agua en concentraciones equilibradas

con la atmósfera.

Gases inestables

Son los que tienden a variar su presencia en las aguas en función de

reacciones biológicas y químicas. Son esenciales para la vida, y están

constituidos por el oxígeno, dióxido de carbono, nitrógeno, monóxido de carbono,

hidrógeno, metano, óxido nitroso y sulfuro de hidrógeno.

Todos conocemos que el oxígeno es el directo responsable de la mayor

parte de la vida en nuestro planeta, ya que la combustión de ese gas por parte de

los seres vivos produce la energía necesaria para la vida.

El oxígeno disuelto en el agua proviene del intercambio entre la atmósfera y

el curso de agua, así como de las funciones de fotosíntesis realizadas por las

plantas verdes. Es continuamente consumido por el metabolismo de las especies

que pueblan este ecosistema.

Fig. 2

52

La cantidad de oxígeno disuelto se mide en partes por millón (ppm. Por otro

lado, la cantidad máxima de oxígeno disuelto en agua, es decir, el nivel de

saturación, depende de varios factores, como son: temperatura, salinidad y

presión atmosférica. A medida que aumenta la temperatura, va disminuyendo la

capacidad de disolución del oxígeno; en cambio esta capacidad aumenta si sube

la presión atmosférica. Con la salinidad ocurre lo mismo que con la temperatura:

una mayor salinidad conlleva una menor capacidad de disolución del oxígeno en

el agua.

La concentración de oxígeno disuelto en agua de mar puede variar desde la

sobresaturación en aguas superficiales donde la actividad fotosintética del

fitoplancton es muy alta, hasta la carencia de oxigeno en aguas profundas. Los

rangos por lo tanto pueden variar entre ( 0-10 ml/l de agua de mar). Las notables

variaciones del contenido de oxígeno que se encuentran en el agua de mar se

deben al consumo por procesos de respiración y oxidación microbiológica y

química, así como a su producción por fotosíntesis. El análisis de oxígeno

disuelto es un ensayo clave para estudios oceanográficos, ambientales, control

de contaminación de aguas y procesos de tratamiento de aguas servidas. (24).

Selección del método.

Existen diversos técnicas para la determinación del oxígeno disuelto, entre

ellos las Iodométricas (método de Winkler), gasométricas, complexométricas,

radiométricas, espectofotométricas. De todas estas técnicas solo las Iodométricas

se emplean en forma general. La mayoría de los datos de concentración de

oxígeno en estudios ambientales han sido obtenidos por el uso del método de

Winkler o modificaciones de éste. Antes de usar los métodos iodométricos hay

que considerar las interferencias de materiales oxidantes o reductores que estén

presentes en la muestra ya que ciertos agentes oxidantes liberan Iodo del

Ioduro ( interferencia positiva) y algunos agentes reductores reducen el Iodo a

Ioduro ( interferencia negativa. Ciertos compuestos orgánicos interfieren con el

método obstaculizando la sedimentación del precipitado de manganeso oxidado

53

y oscureciendo parcialmente el punto final de la titulación Iodométrica con

indicador almidón.

Métodos Iodométricos

Método de Winkler

Fundamento

La esencia del método consiste en convertir el oxígeno disuelto de la

muestra en un equivalente químico de Iodo susceptible de ser valorado

cuantitativamente.

El método consiste en tres pasos casi independientes:

1. - Toma de muestras

2.- Tratamiento

3.- Valoración

Cada uno de los pasos mencionados incluye varias reacciones químicas.

Primero el oxígeno disuelto en un volumen conocido del agua muestreada

es fijado con Sulfato Manganoso monohidratado y una solución concentrada de

hidróxido de sodio y Ioduro de potasio el cual se enlaza químicamente y forma un

precipitado blanco de hidróxido de manganeso.

Mn++ + 2 OH- m Mn(OH)2 Precipitado blanco (I)

El oxígeno disuelto presente en la muestra reacciona con el hidróxido de

manganeso (II) oxidándolo a manganeso (III), en una reacción heterogénea que

produce un precipitado de color café:

54

2 Mn (OH)2 + ½ O2 + H2O 2Mn(OH)3 Precipitado café (2)

Tras la completa fijación del oxígeno la muestra es acidificada con ácido

sulfúrico concentrado, llevándola aun pH entre 1 y 2.5. La acidificación disuelve el

precipitado, liberando los iones manganeso (III), que en medio ácido son agentes

oxidantes fuertes y reaccionan con el yoduro inicialmente añadido, oxidándolo a

iodo, el cual a su vez forma un complejo triyodado en presencia de exceso de

yoduro.

2Mn(OH)3 + 2I- + 6H+ 2Mn2 + I2 + 6H2O (3)

I 2 + I- I-3 (4)

En este momento el Iodo formado es determinado por titulación con una

solución valorada de tiosulfato de sodio. Aquí el Iodo es reducido a Yoduro y el

tiosulfato es oxidado a tetrationato:

I3 + 2 S2O3 2- 3I- + S4O6 2- (5)

El punto final de la titulación es indicado por el almidón que es un indicador

visual satisfactorio para las titulaciones de rutina.

Las relaciones químicas que han de mantenerse para que el método de

Winkler proporcione con exactitud la concentración de oxígeno disuelto son:

4S2O3 2- 2I2 O2 (6)

El par Iodo Iodurado es perfectamente reversible, presenta puntos finales

suficientemente abruptos en las titulaciones. El tiosulfato es aparentemente el

único reductor apropiado para la Iodometría. (25).

55

Rango: 0.005 - 8 mg/l.

Procedimiento de análisis

• Ensayo de blancos de reactivos Este es el primer paso que se realiza al analizar el Oxígeno disuelto y permite

verificar el buen estado de los reactivos el procedimiento es como sigue: (26) (27).

56

Volumen de agua usado = 300 ml

A

Diagrama de flujo 1. Determinación de blanco de reactivos para Oxígeno Disuelto

Tomar 2 alícuotas de 50 ml y adicionar 0.5 ml de solución de almidón

Agregar 0.1 ml de Iodato de potasio 0.01

Titular con tiosulfato de sodio 0.01 N hasta completa

Preparar nuevos

reactivos

Agregar 1 ml SO4H2 y 1 ml de Ioduro alcalino mezcle completamente adicionar 1

ml de sulfato manganoso, mezcle nuevamente

Llenar una botella de DBO con 300 ml agua destilada

V

F

F

V Color = Azul

Color = Azul

V

Blanco de reactivo = 0

Fin

F

Titulo ≤ 1 %

V A

F

A

INICIO

Definición de Variables Volumen usado, volumen de reactivos

57

• Calibración de la solución standard de tiosulfato de sodio

El estándar primario apropiado y aceptado para calibrar la solución de

thiosulfato es el Yodato de Potasio. Esta calibración se basa en la reacción de

coproporción del Yoduro para formar Iodo, el que a su vez es enlazado por el

exceso de Yoduro formando el complejo triyoduro. Esta reacción solo ocurre en

medio ácido, donde es estequimétrica y cuantitativa. La cantidad de Iodo liberado

se titula con la solución de tiosulfato, usando almidón como indicador. Las

ecuaciones comprendidas en la calibración y el flujograma de calibración son: (25)

(27). IO3

- + 5I- + 6H+ 3I2 + 3H2O (7)

I2 + I- I3- (8) I3- + 2S2O3

2- 3I- + S4O62- (9)

De la solución preparada para el blanco de reactivo. Tomar 3 alícuotas de 50 ml y adicionar 10

ml de Yodato de Potasio 0.01 N

Esperar 2 minutos hasta que se desarrolle la liberación del Iodo

Titular la solución de Tiosulfato de Sodio utilizando solución de almidón como indicador

A

Alícuotas = 50 ml F

V

Vol. Yodato de Potasio = 10 ml

V

F

Tiempo de reacción = 2 minutos

V

Utilizar el 50% de Yodato

F

FIN

Diagrama de Flujo 2. Calibración del standard para el análisis de Oxígeno Disuelto

58

Análisis de Muestras Problemas

Recolectar la muestra de agua en una botella de 300 ml ó 125 ml

Fijar adicionando 1 ml de Sulfato Manganoso y 1 ml de

Ioduro Alcalino

Agitar y esperar desde 30 minutos hasta 6 horas

Disolver el precipitado agregando 1 ml de ácido sulfúrico concentrado

Inicio

Volumen de muestra= 300 ml

Definición de variables Volumen de muestra, volumen de reactivos,

tiempo de reacción

V

F

Fijar adicionando el 50% de los reactivos

Tiempo de Reacción = ≥ 30’

ó ≤ 6 horas

V

F

A

A

Tiempo de Reacción es >6

horas

V

B B

F

Tomar una alícuota de 50 ml y titular con solución de tiosulfato de sodio 0.01 N (

previamente calibrado) utilizando almidón como indicador

Fin

Diagrama de flujo 3. Determinación de Oxígeno Disuelto

59

• Cálculo de la concentración de oxígeno disuelto Cuando se use la botella de BOD (300 ml): 300 1000 O2 ml/L = 0.056 x f x (V - b) x ------- --- x ------------- 300-2.4 50 En caso de que se use la botella de BOD (250 ml): 250 1000 O2 ml/L = 0.056 x f x (V - b) x ------- --- x ------------- 250-2 50 En caso de que se use la botella de 125 ml; 125 1000 O2 ml/L = 0.056 x f x (V - b) x ---------- x --------- 125 - 1 50 De donde: 1 ml de tiosulfato de sodio 0.01N equivale a 0.08 mg=0.005 mg-at de oxígeno, este

valor corresponde a 0.056 ml de oxígeno.

f = Factor del tiosulfato de sodio 0.01N;

V = Titulación de la muestra

b = Blanco de reactivo.

4.5.1.2.b. Demanda bioquímica de oxígeno (DBO)

El parámetro de contaminación orgánica más ampliamente empleado,

aplicable tanto para aguas superficiales como aguas residuales es la DBO a 5

días (DBO5). La determinación del mismo esta relacionada con la medición de

oxígeno disuelto consumido por los microorganismos en el proceso de oxidación

bioquímica de la materia orgánica.

Los microorganismos aerobios son los que más consumen oxígeno y lo

transforman en CO2, otros lo hacen en menor proporción y se aprovechan del CO2

para sus funciones vitales como los anaerobios.

60

Las muestras para análisis de DBO pueden sufrir una degradación

significativa durante el almacenamiento y manipulación. Algo de la demanda

puede ser satisfecha si la muestra es almacenada por varios días antes de iniciar

la determinación, esto originara una estimación bajo de la DBO real.

La magnitud de este hecho parece ser función de la cantidad de materia

orgánica (abastecimiento de nutrientes) y del número y tipo de organismos

(población biológica). Para reducir los cambios en la demanda de oxigeno que

ocurren entre el muestreo y el análisis, mantener la muestra a una Tº < 4ºC y

comenzar la incubación no más de 24h después de haber tomado la muestra. (23)

Para el análisis de la DBO se usan procedimientos estandarizados de

laboratorio para determinar los requerimientos relativos de oxigeno de aguas

naturales, contaminadas, servidas y aguas de efluentes.

El tiempo de incubación es de 5 días para una DBO baja, pero si la DBO es

alta la incubación será mayor de 5 días, esto está en relación directamente

proporcional a la cantidad de microorganismos presentes en la muestra; si hay

pocos microorganismos que consumen oxígeno disuelto en el agua su DBO será

necesariamente baja, si hay muchos microorganismos que consumen oxígeno

disuelto en el agua su DBO será alta y necesitará más de 5 días de incubación.

Selección del método

La prueba de la DBO se basa en las determinaciones del oxígeno disuelto,

en consecuencia, la precisión de los resultados está influenciada en gran medida

por el cuidado que se tenga en la medición de este último. La DBO se la puede

medir en forma directa en unas pocas muestras, pero en general, se requiere un

procedimiento de dilución.

61

Método Directo

En muestras donde el oxígeno disuelto inicial es superior a 5 mg/l no es

necesaria la dilución, este método no hace modificaciones en la muestra, y por lo

tanto da resultados en las condiciones más parecidas a las del ambiente natural.

Infortunadamente, la DBO de muy pocas muestras está dentro del margen de

oxígeno disuelto disponible en está prueba. (27) (28).

Análisis de Muestras Problemas

Cálculo de la concentración: DBO mg/l = (OD i – OD f).300 De donde: OD i = (Oxígeno disuelto inicial)

OD f = (Oxígeno disuelto final)

300 = Capacidad de botella

Recolectar dos muestras para el análisis de la DBO con las mismas

precauciones que para el análisis de oxígeno disuelto

Determinar el Oxígeno disuelto inicial por medio de Winkler indicado

anteriormente

La segunda muestra incubarla a 20°C por 5 días. Luego determinar el 0xígeno disuelto final por

medio de Winkler indicado anteriormente

Inicio

Muestra = 1era

V

F

Fin

Diagrama de flujo 4. Análisis de la Demanda Biológica de Oxígeno

62

• Método de dilución

Este método se basa en el concepto fundamental de la velocidad de

degradación bioquímica de la materia orgánica es directamente proporcional a la

cantidad de material no oxidado que existe en el momento.

Es necesario conocer la cantidad de oxígeno disuelto en la muestra para

determinar el grado de dilución que se aplicará.

Una gran cantidad de materiales residuales es sometida a la prueba de la

DBO; pueden variar desde residuos industriales que pueden estar libres de

microorganismos hasta aguas residuales domésticas con abundancia de

organismos. Muchos residuos industriales tienen valores de DBO sumamente

altos, y se deben hacer diluciones muy altas para cumplir con los requerimientos

impuestos por la solubilidad limitada de oxígeno. Las aguas residuales

domésticas tienen un gran aporte de elementos nutrientes (nitrógeno, fósforo),

pero muchos residuos industriales son deficientes en ambos elementos. Debido a

estas limitaciones y con el fin de asegurar la fiabilidad de los resultados obtenidos,

es preciso diluir convenientemente la muestra con una solución especialmente

preparada de modo que se asegure la disponibilidad de nutrientes y oxígeno

durante el periodo de incubación. Normalmente se suelen preparar diversas

diluciones para cubrir todo el intervalo de posibles valores de la DBO. En la tabla

2 se indican los valores del porcentaje de diluciones y el tipo de agua a

analizarse. (28).

DILUCIONES (%) TIPO DE AGUA 0.1 a 1.0 Residuos Industriales

1 a 5 Aguas Crudas y Sedimentadas 5 a 25 Efluentes Oxidados

25 a 100 Aguas de Ríos Contaminados Tabla 2. DBO medible con diferentes diluciones

63

Análisis de Muestras Problemas

• En primer lugar se requiere airear el agua de dilución haciendo

burbujear aire a través de un tubo difusor por 5 minutos o hasta que el OD

sea por lo menos de 7 mg/l. Para de esta manera aumentar el contenido

de OD inicial sobre el requerido por la DBO. Determinar el OD en una

porción de la muestra aireada, inocular otra porción solo si es necesario e

incubar para la determinación de DBO.(23)

Cálculo de la concentración:

P DBO mg/l = (D1- D2) x 300 ---------- 150 De donde:

Fig.3. Procedimiento de análisis de la DBO en muestras que requieren dilución

64

D1= (Oxígeno disuelto de la muestra diluida) 15’ después de la preparación

D2= (Oxígeno disuelto de la muestra diluida) después de la incubación

P = Fracción decimal de la muestra usada

4.5.1.2.c. Micronutrientes inorgánicos

La disponibilidad de nutrientes (fosfato, nitrito, nitrato y silicato) es un factor

decisivo en la fertilidad de las aguas y sus condiciones extremas, van en

detrimento del ecosistema marino, es así como, descensos en las

concentraciones traen efectos negativos en la productividad primaria, y un

excesivo incremento puede llevar a problemas de eutrofización de las aguas

provocando un fuerte desequilibrio ecológico.

Estos parámetros químicos denominados nutrientes son esenciales para la

productividad primaria en el mar, cuya presencia esta ligada a sus

concentraciones e influyendo en el medio marino.

Análisis de fósforo reactivo

El fósforo se encuentra en el agua en una diversidad de formas disueltas y

particuladas. En el mar los iones fosfatos junto con el nitrito son un factor

limitante en el crecimiento del plancton en los océanos. (29). Por otra parte una

buena disponibilidad del fósforo ayuda al desarrollo y crecimiento de

microorganismos especializados en la degradación de sustancias contaminantes

tales como los hidrocarburos.

Todos los métodos para determinar fosfato inorgánico en agua de mar se

basan en la reacción del fosfato con molibdato en medio ácido para formar ácido

molibdofosfórico (un heteropoliacido) y la posterior reducción de éste a un complejo

fosfomolibdato de color azul intenso, cuya absorbancia es medida

fotométricamente.

El uso del ácido ascórbico como reductor en el análisis de agua de mar fue

llevado a cabo por primera vez por Greenfield y Kalber (1954) pero los métodos

65

actuales, se basan esencialmente en el procedimiento de Murphy & Riley (1962),

que incorpora antimonio trivalente en un reactivo único. Normalmente la reducción

por el método ascórbico es lenta, pero el uso del tartrato de antimonio como

catalizador hace que esta reducción proceda rápidamente, proporcionando un

complejo azul que contiene antimonio en una proporción atómica de 1: 1 respecto

al fósforo.

Fundamento

El fosfato de la muestra de agua de mar reacciona con el reactivo de

molibdato acidificado para formar un complejo de fosfomolibdato lo cual se reduce a

fosfomolibdeno en presencia del ácido ascórbico. La absorbancia de esta solución

es leída a una longitud de onda de 885nm.

6 MoO4 2 - + 6 H + Mo6O21 6- + 3 H2O (1)

2 MoO21 6 - + PO4 3 - H 3 P (Mo12 O40) + H2O (2)

Al agregar el ácido ascórbico al medio, reduce de los átomos de molibdeno del

ácido molibdofósforico al estado de oxidación + 5, permaneciendo los 10 átomos

restantes en el estado +6:

H 3 P (Mo12 O40) + H2O + 2H+ 2e - H3 - P (Mo12 O38)(OH)2 - H2O (3)

Acido Ascórbico

Esto determina la presencia de 2 electrones adicionales por molécula del

complejo, determinando con ello una coloración azul cuya intensidad es proporcional

a la concentración de fosfato.

RANGO: 0.03 - 5 ug-at/l.

PRECISION: Promedio de n determinaciones +- 0.03/n1/2 ug-at/l.

66

Interferencias

La mayor ventaja del uso del ácido ascórbico como reductor está en que el

complejo fosfomolíbdico azul formado es estable por horas y que las variaciones

de salinidad no influyen en la intensidad de color. Sin embargo existen otros iones

que se encuentran en aguas naturales y cuya influencia ha de ser considerada. La

principal interferencia es el silicato, seguido por arsenato y sulfuro de hidrógeno. (25).

Procedimiento de análisis • Ensayo de blancos de reactivos

Se realiza el procedimiento exactamente igual como en el ANALISIS DE LA

MUESTRA PROBLEMA que está posteriormente explicado en el diagrama de flujo,

utilizando agua destilada en lugar de agua de mar. Debe repetirse por lo menos la

determinación de tres blancos de reactivos. (26) (27).

• Calibración de Solución Estándar

Preparar un estándar secundario de fosfato a partir de la solución original de

fosfato dihidrógeno de potasio ( 1 ml = 6.0 ug-at). Este estándar secundario debe

ser preparado fresco cada vez que se requiera de él y debe tener una

concentración de 3.0 ug-atP/L.

Determinar el Factor F del Estándar secundario aproximadamente debe ser

50. (26).

67

Análisis de muestra problema

V

INICIO

Definición de Variables Volumen de muestra, cantidad de mezcla de

reactivos, tiempo de reacción y longitud de onda

Volumen muestra =50 ml

Adicionar 5 ml de mezcla de Reactivos

Mezclar completamente

Medir la absorbancia a longitud de onda de 885 nm

Adicionar la cantidad de mezcla de reactivos proporcional al volumen

de muestra usada

F

FIN

Tiempo de Reacción = Entre 10minutos y dos

horas

A

A

V

F

Colocar muestra en un erlenmeyer

Diagrama de flujo 5. Determinación de Fosfato

68

• Cálculo de la concentración de Fosfato

El cálculo de la concentración de fosfato de muestra se realiza en la siguiente expresión; ugat P/l = ( Am - Ab) x F. Donde

Am es la absorbancia de la muestra

AB es la absorbancia de blanco de reactivo.

Análisis de silicato

El silicato se encuentra presente en el agua de mar en suspensión o como

silicato disuelto, siendo esta última fracción la que se determina analíticamente por

ser relevante para la identificación y caracterización de masas de aguas y por

representar la cantidad disponible de este elemento para el crecimiento de células

vegetales. Las concentraciones de silicato disueltos en el agua de mar tienen un

rango que va desde 1 hasta aproximadamente 150 ugat/l encontrándose casi todo

en forma de ácido ortosilícico. Todos los métodos para la determinación de silicato

disuelto en agua de mar tienen como fundamento la formación de un heteropoliácido

por reacción del ácido ortosilícico con molibdato en medio ácido, siendo medida la

absorbancia de luz resultante. Las técnicas utilizadas para el análisis se agrupan en

dos tipos: los métodos de formación de complejo amarillo y los métodos de

formación de complejo azul.

Fundamento

Al tratar la muestra con molibdato en condiciones ácidas, se forma ácido beta-

silicomolíbdico a partir de la reacción del ácido molibdíco con el silicato disuelto:

6 MoO4

2- + 9 H+ (H3Mo6O21) 3- + 3H2O (1) Si(OH)4 + 2 (H3Mo6O21)3- + 6H+ H4 (SiMo12O40) + 6H2O (2)

69

Solo el ácido silícico y sus dímeros reaccionan con rapidez, por lo que el

método no detecta silicato polimerizados. La interferencia ocasionada por la

formación simultánea de los ácidos fosfomilíbdicos y arsenomolíbdico es

suprimida agregando ácido oxálico, el cual destruye estos dos complejos. El ácido

Beta- silicomolíbdico, de color amarillo, es reducido a un heteropoliácido de color

azul con sulfato de para metil aminofenol (metol). H4 (SiMo12O40) + 4H + + 4e- H4 (SiMo12O36 (OH)4 ) (3)

RANGO: 0.1 - 140.

PRECISION: Promedio de n determinaciones+- 2.5n1/2 ug-at/l. Iinterferencias

La presencia de concentraciones altas de sulfuros interfiere en las

reacciones. Estas concentraciones elevadas se encuentran en situaciones

acentuadas de anoxia. (25).

Procedimiento de análisis • Ensayo de Blancos de Reactivo

Los blancos están contemplados para corregir el contenido de silicato de los

reactivos incluyendo el agua de mar sintética, además de la corrección por

defectos ópticos. La determinación del blanco de reactivo se realiza siguiendo el

mismo procedimiento que se indica posteriormente para el ANALISIS DE LA

MUESTRA PROBLEMA.

• Calibración de Solución Estándar

Preparar un estándar primario de Silico fluoruro de sodio, NaSiF6 que equivale a:

1 ml = 5 ug - at Si.

70

A partir de esta solución de referencia se prepara un estándar secundario

cuya concentración es de 100 ug - at Si /L.

Determinar el Factor F del Estándar secundario aproximadamente debe ser 100. (26) Análisis de Muestras Problema

INICIO

Definición de Variables Volumen de muestra, cantidad de mezcla de

reactivos, tiempo de reacción y longitud de onda

Medir la absorbancia a longitud de onda de

810 nm utilizando filtro rojo

F

FIN

Tiempo de Reacción = Entre 2 y 3 horas

A

A

V

F

Colocar solución de molibdato de amonio en una probeta con tapa

Volumen de Molibdato de amonio = 10 ml

V

Adicionar 25 ml muestra de agua

Agregar la solución reductora rápidamente hasta llevar a un

volumen de 50 ml. Mezclar rápidamente

Realizar el procedimiento de análisis utilizando la mitad tanto

de los reactivos como de la muestra

B

B

Tiempo de reacción > 3

horas V

F

Diagrama de flujo 6. Determinación de silicato

71

• Cálculo de la concentración de silicato.

El cálculo de la concentración de silicato de la muestra se realiza con la

siguiente expresión:

ug-at Si/L= (Am - Act) x F. Donde

Am es la absorbancia de la muestra

Act es la absorbancia de corrección total, Act, se puede obtener en la siguiente

expresión

Act = Ac + (ab - Ac)

Donde

Ac es la absorbancia de celda

Ab es la absorbancia del blanco de reactivo.

En caso de que se utilice la misma celda para determinar la absorbancia tanto

de la muestra como la del blanco la corrección total, Act, queda en la forma

siguiente:

Act = Ab

F: factor

Análisis de Nitrito

El nitrito representa una forma intermedia en el ciclo del nitrógeno, pueden

estar presentes en las aguas como resultado de la degradación biológica de las

proteínas o provenir de otras fuentes. (29). El fitoplancton cuando se nutre, no

asimila todo el nitrato utilizado, si no que parte de él lo reduce a nitrito y lo cede al

agua. La cantidad de nitrito producida depende de la concentración de nitrato.

72

Todos los métodos existentes para la determinación de nitrito en agua de

mar son de naturaleza fotométrica y se basan en la clásica reacción de Griess

(1879) modificada por Llosvay (1.889), mediante la cual se convierte ácido

nitroso en una tintura fuertemente coloreada, empleando una amina aromática

primaria para diazotar el ión nitrito y acoplando posteriormente el ión diazo

resultante con otra amina aromática en una reacción que lleva a la formación de

un compuesto azo rosado, cuya absorbancia es proporcional a la cantidad de

nitrito inicialmente presente.

Las combinaciones de aminas que resultan en compuestos azo con

absorbancia suficientemente altas para permitir su aplicación en el análisis de las

cantidades trazas en que se encuentra normalmente el nitrito en el agua de mar son

muy pocas. Los procedimientos empleados inicialmente consistían en

modificaciones de la técnica de Griess- Llosvay, en que se utilizaba ácido sulfanílico

para la diazotación y 1 naftilamina para el acoplamiento. La más apropiada de estas

modificaciones es la indicada por Barnes (1959), que se basa en el procedimiento

desarrollado por Rider & Mellon (1946). Una revisión de estos métodos fue realizada

por Riley (1965).

El procedimiento metodológico para el análisis de nitrito que se entrega a

continuación es el indicado en el manual de Strickland & Parson (1968). Fundamento

El nitrito presente en la muestra es sometido a la reacción en medio ácido

(pH 3-4) Lo que lleva a la formación de un ión diazonio:

SO2-NH2

NH2

NO2- + + 2H+

SO2-NH2

N = N

+ 2 H2O

73

El ión diazonio resultante es sometido posteriormente a una reacción de

acoplamiento con ( N-1 Naftil) etilendiamina, originando un color azo ( rosado

intenso), cuya máxima absorbancia, es leída a 543 nm. La diazotación del nitrito

requiere de dos minutos para completarse, transcurridos los cuales y antes de que

pasen 10 minutos se procede al acoplamiento. En caso de que la reacción de

diazotación se prolongue por más de 10 minutos se manifiestan de modo

significativo reacciones paralelas indeseables y procesos de descomposición que

acarrean consigo errores en la estimación. La reacción de acoplamiento es:

Este método es aplicable para la determinación de nitrito en todo tipo de

aguas, incluso aguas servidas y no es afectado de modo apreciable por diferencias

de salinidad. Diferencias de temperatura tampoco tienen efecto si acaso se

encuentra comprendida dentro del rango de 15 a 25 °C.

RANGO: 0.01 - 2.5 ug-at/l.

PRECISION: Promedio de n determinaciones +-0.023/n1/2 ug-at/l. Interferencias

La presencia de coloraciones fuertes, de cobre en concentraciones altas,

iones yoduros ocasionan interferencias en el método.(25)

SO2-NH2

N=N

+

+

HN –CH2 CH2 NH2 H2N-SO2 N = N NH

CH2 CH2 NH2

74

Procedimiento de análisis • Ensayo de Blancos de Reactivos

Se efectúa el proceso exactamente igual como esta descrito posteriormente

en la parte de análisis de muestras problemas, colocando 50 ml. de agua destilada

en lugar de la muestra problema.

• Calibración de Solución Estándar

Preparar un estándar secundario de nitrito a partir de un standars primario

nitrito de sodio NO2Na ( 1 ml = 5.0 ug-at N ). Este estándar secundario debe usarse

en el mismo día de su preparación y debe tener una concentración de 2.0 ug-atN/l.

Determinar el Factor F del Estándar secundario aproximadamente debe ser cerca

de 21.

Análisis de Muestras Problema

V

V

INICIO

Definición de Variables Volumen de muestra, cantidad de reactivos,

tiempo de reacción y longitud de onda

Volumen muestra =50 ml

Utilizar 50 % de muestra y reactivos

F

A

A

Colocar muestra en un erlenemeyer

Adicionar 1 ml de solución de sulfanilamida

Dejar en reposo por un tiempo de 2 a 8 minutos

Tiempo de Reacción = Entre 2 y 8 minutos

V

F Tiempo de reacción > 8

minutos

F

B

A

75

• Cálculo de la concentración de Nitrito.

El cálculo de la concentración de nitrito de la muestra se realiza con la

siguiente expresión:

ug-at N/l= (Am - Act) x F. Donde Am es la absorbancia de la muestra

Act es la absorbancia de corrección total, Act, se puede obtener en la siguiente

expresión

Act = Ac + (ab - Ac)

FIN

Medir la absorbancia a una longitud de onda de 543 nm, sin filtro.

Adicionar 1 ml de solución N –1 Naftiletilendiamina dihidrocloruro, mezclar

completamente

Tiempo de Reacción = Entre 10 minutos y 2

horas

Tiempo de Reacción > 2 horas

B

V

F

V

F

A

Diagrama de flujo 7. Determinación de nitrito

76

Donde Ac es la absorbancia de celda

Ab es la absorbancia del blanco de reactivo.

En caso de que se utilice la misma celda para determinar la absorbancia tanto

de la muestra como la del blanco la corrección total, Act, queda en la forma

siguiente:

Act = Ab F: factor de calibración Análisis de nitrato

El nitrógeno se encuentra combinado en el agua de mar como nitratos, nitrito

iones amonio y compuestos orgánicos del orden de trazas. La mayor parte del

nitrógeno en el mar se halla en forma de iones nitrato. (29).

Fundamento

El nitrato en agua de mar se reduce casi cuantitativamente a nitrito cuando

una muestra se pasa por una columna que contiene limaduras de cadmio cubierta

con cobre metálico. El nitrito producido se determina por diazotación con

sulfanilamida y por combinación con N-1 naftil etilendiamina para formar un tinte azo

(azo dye) fuertemente coloreado.

NO3

- + Cd(s) + H2O NO2- + Cd (OH)2

RANGO: 0.05 - 45 ug-at/l. PRECISION: Promedio de n determinaciones +- 0.50/n1/2ug-at/l. (29). Interferencias

La cuantificación colorimétrica del ión nitrato se hace en forma de nitrito tras

la reducción, se debe considerar la concentración de nitrito presente inicialmente

en la muestra, que debe restarse de la concentración de nitrato. Si bien a

77

concentraciones de nitrato altas la proporción de nitrito en el caso de agua de mar

es despreciable, en el caso de bajas concentraciones de nitrato, la consideración

de este efecto es crítica. La determinación de nitrato por este método en aguas

naturales en general no esta sujeta a interferencias. (25).

Procedimiento de análisis • Ensayo de Blancos de Reactivo

Se procede exactamente igual como esta descrito posteriormente en la parte

de análisis de muestras problemas, colocando 100 ml de agua destilada en lugar de

la muestra problema. (26).

• Calibración de Solución Estándar

Preparar un estándar secundario de nitrato a partir de un standard primario

de nitrato de potasio NO3K ( 1 ml = 4,0 ug-atN/l). Este estándar secundario debe

usarse en el mismo día de su preparación y debe tener una concentración de 20

ugat N/l.

Determinar el Factor F del Estándar secundario aproximadamente debe ser

cerca de 25.

78

Análisis de muestra problema

Colocar la muestra en la columna reductora de cadmio

Drenar aproximadamente 20 ml atravéz de la columna reductora la misma que servirá

para limpieza tanto del cilindro como el erlenmeyer donde se recibira la muestra

Recolectar 50 ml de muestra en un tiempo de 5 a 8 minutos

V

INICIO

Definición de Variables Volumen de muestra, cantidad de reactivos, tiempo de

recolección, tiempo de reacción y longitud de onda

Volumen muestra =100 ml

Utilizar 50 % de muestra y reactivos

F

Colocar muestra

Adicionar 2 ml de solución concentrada de

Cloruro de amonio , agitar

Tiempo de recolección =

Entre 5 y 8 minutos V

A

F Tiempo de recolección > 8 minutos y volumen recolectado < de 50 ml

V

F

Volver a calibrar tiempo de la columna reductora de cadmio

A

A

B C

79

A

Adicionar 1 ml de solución de

sulfanilamida

Medir la absorbancia a una longitud de onda de 543 nm, sin filtro.

FIN

Dejar en reposo por un tiempo de 2 a 8 minutos

Tiempo de Reacción = Entre 2 y 8 minutos

Adicionar 1 ml de solución N –1 Naftiletilendiamina dihidrocloruro, mezclar completamente

F

Tiempo de reacción > 8

minutos

V

Tiempo de Reacción = Entre 10 minutos y 2

horas

Tiempo de Reacción > 2 horas

V

F F

V

V

F

B

C

Diagrama de Flujo 8. Determinación de Nitrato

80

• Cálculo de la concentración de nitrato.

El cálculo de la concentración de nitrato de la muestra se realiza con la

siguiente expresión:

ug-at N/l = ( Am- Act) x F – 0,95 x C NO2 Donde Am es la absorbancia de la muestra

Act = Ac + (ab - Ac)

Donde

Ac es la absorbancia de celda

Ab es la absorbancia del blanco de reactivo. F: factor de calibración C NO2 Concentración de nitrito en la muestra (26). 4.5.1.2.d. Hidrocarburos del petróleo disueltos y dispersos

Los hidrocarburos pertenecen al grupo de los ” residuos químicos

orgánicos”, según el sistema de clasificación adoptado para catalogar a los

contaminantes. La contaminación por petróleo genera riesgos que inciden directa

o indirectamente sobre las características físico – químicas, biológicas y estéticas

del área afectada.

De acuerdo con sus propiedades, los hidrocarburos presentan grados

variables de toxicidad, encontrándose que alguno de ellos generan alteraciones

metabólicas y fisiológicas en organismos marinos.

Los estudios sobre toxicidad de los hidrocarburos muestran que son

causantes de efectos biológicos a corto y largo plazo causados por la disminución

de la transmisión de luz, afectando la fotosíntesis de la vida vegetal marina, la

disminución de oxígeno disuelto que afecta la fauna marina, daños a las aves

marinas y a los mamíferos acuáticos por que se impregnan en sus plumas y

81

cuerpos impidiendo el vuelo y disminuye la flotabilidad con sus consecuencias.

Por otra parte los hidrocarburos con punto de ebullición bajo. producen narcosis

en una gran variedad de invertebrados.(30).

Las siguientes cifran dan una idea de la importancia de preservar el medio

marino de la contaminación por hidrocarburos.

Nombre del sustrato

Concentración Ug/l

Hidrocarburos Contaminación

Agua 5 gasolina olor desagradable en la carne

de pescado

Agua 50.000 gasolina Las larvas de trucha pierden la

movilidad en 1 hora

Agua 100.000 gasolina Letal para larvas de truchas

Agua 1000 Derivado de

petróleo

La carne adquiere su sabor

inmediatamente

Agua 500 Derivado de

petróleo

La carne adquiere su sabor en

1 día

Agua 200 Derivado de

petróleo

La carne adquiere su sabor en

3 días

Agua 300 Petróleo Crudo Muy tóxicas para especies en

cautiverio Tabla Nº 3. Contaminación por hidrocarburos

En el petróleo y sus derivados hay muchos compuestos cancerígenos entre

estos se hallan sulfurados nitrogenados heterocíclicos, derivados metilados

policíclicos y heterocíclicos y los hidrocarburos aromáticos polinucleares (HAPN)

estos últimos se encuentran presentes en el petróleo en aproximadamente 15 %

los mismos que se encuentran en los tejidos de los organismos marinos

expuestos a descargas de hidrocarburos ingresando así a la cadena trófica, hasta

llegar al hombre.

82

Fundamento

Se determina la concentración de hidrocarburos disueltos y dispersos en el

agua de mar, mediante la medición de la fluorescencia de un extracto de éstos.

Previamente se elabora una curva de calibración del equipo, usando

estándares de criseno (u otro hidrocarburo aromático) disueltos en n-hexano, la

concentración de éstos oscila entre 0.5 a 10ppm.

Es de observar que la fluorescencia se presenta sólo en los hidrocarburos

aromáticos, por consiguiente no es exacto decir que su medición está relacionada

con la concentración de hidrocarburos en general (aromáticos y alifáticos en agua

de mar).

Alcance y aplicaciones

Este método es aplicable a aguas de desperdicio de refinerías, efluentes de

sentinas de los buques.

El alcance de este método se limita al agua comprendida entre la superficie y

una profundidad de un metro. A profundidades mayores, la concentración de los

hidrocarburos disueltos y dispersos se hace muy pequeña y difícil de detectar por

medio de esta técnica.

Procedimiento de análisis • Calibración de solución stándar

Preparar un standard primario de criseno disuelto en n- hexano cuya

concentración sea de ( 100 ppm). El criseno es bastante soluble en hexano, pero su

velocidad de disolución es lenta, por lo tanto se debe dejar una noche en reposo la

solución antes de usarla. Partiendo de esta solución patrón primaria se prepara un

grupo de standares secundarios de las siguientes concentraciones: ( 0.1, 0.5, 1.0,

2.0, 3.0 5.0, 7.0 y 10.0. ppm.) , medir la fluorescencia de los estándares

exactamente como esta detallado en la parte de análisis de muestra problema.

83

Luego se elabora una curva de calibración la misma que tiene que ser lineal por lo

menos hasta 5ppm. Es importante tener resultados comparativos con estándares de

petróleo mejor que con estándares de criseno, sobre todo cuando se tienen

muestras de petróleo derramado.

• Ensayo de blancos de reactivo

La fluorescencia de blancos se mide del mismo modo que para los

estándares usando n -Hexano puro. (31) (27).

Análisis de muestra problema

Realizar la extracción del hidrocarburo separando la parte oleosa de la acuosa

Volumen de n - Hexano= 100 ml

V

Agitar vigorosamente por 5 minutos

F Utilizar el 50 %

de n Hexano

Recolectar 4 litros de muestra

Inicio

Definición de variables Volumen de muestra, volumen de reactivo, volumen del

extracto

Volumen de muestra = 4 Lt

V

F

Fijar la muestra con 100 ml de n- hexano

A

84

A

Colectar la parte oleosa (extracto de la muestra)

Agregar el extracto de la muestra a una columna de limpieza cromatográfica y eluir con n – Hexano , descartando los primeros 6 ml que salgan de la columna, los siguientes 30 ml se recogen para

concentrar

Evaporar el extracto a baja temperatura (por debajo del punto de ebullición del n – hexano hasta un volumen de 5 ml cuidando que no

hierva

El extracto se transfiere un matraz aforado de 5 ml y se mide la fluorescencia usando un espectrofluorómetro a

una longitud de onda de excitación de 310 nm y una longitud de onda de emisión de 360 nm.

Volumen del extracto = 5 ml

V

F

Volumen del extracto < 5 ml

Diluir hasta

volumen de 5 ml

F

Evaporar hasta 5 ml

Fin

Flujograma 9. Determinación de Hidrocarburos del Petróleo

85

• Cálculos

La concentración de hidrocarburos en el extracto de la muestra, se obtiene de

la curva de calibración, corregida con la fluorescencia del blanco. La concentración

en equivalentes de criseno, de la muestra original se puede calcular así:

Conc. De HC Dis, y Disp. = Conc. En estracto, ug/L x Vol. Extracto, ml Volumen de muestra original, Litros.

El resultado es la concentración equivalente de criseno en ug/l (ppb). 4.5.1.2.e. Coliformes Totales / Fecales

El grupo de bacteria coliformes ha sido siempre el principal indicador de

calidad de los distintos tipos de agua; el número de coliformes en una muestra se

usa como criterio de contaminación y por lo tanto, de calidad sanitaria de la

misma.

Los coliformes son bastones Gram (-), aerobios o anaerobios facultativos

que fermentan la lactosa con formación de gas cuando se incuban durante 48

horas a 35ºC. Incluye los géneros Escherichia, Enterobacter, Klebsiella y especies

lactosa positivas de otros géneros. También interesa la determinación de

coliformes fecales que representan la fracción de coliformes, en general provienen

de intestinos y materias fecales de hombre y animales de sangre caliente

(coliformes termotolerantes). Esto provee información importante sobre la fuente y

el tipo de contaminación presente.

Los estreptococos fecales que incluyen especies de Estreptococos grupo D

de Lancefield (Enterococcus faecalis, E. faecium, Streptococcus equinus, S.bovis)

y algunas subespecies y una especie del grupo Q (Streptococcus avium). El grupo

Enterococos estaría incluido dentro de estreptococos fecales y comprende las

especies Enterococcus faecalis y E. faecium y sus subespecies (origen humano) y

también se usa como indicador de contaminación fecal en agua.

86

El hábitat normal de los estreptococos fecales es el intestino del hombre y

los animales de sangre caliente, por lo tanto son indicadores de contaminación

fecal, sobre todo en muestras de substratos obtenidos de lagos, estuarios, ríos,

etc. (32).

Un método muy utilizado para el recuento de coliformes en agua ha sido

siempre el NMP pero, a través del tiempo han variado los medios de cultivo, las

condiciones y las técnicas de manera de obtener cada vez mayor sensibilidad y

precisión hasta hacerlo aceptable como método standard.

Fundamento

Los distintos métodos de NMP para coliformes totales se basan, en primera

instancia, en una selección de los microorganismos que producen ácido y gas de

lactosa a 35ºC. Por ello, el primer paso es siempre la siembra en tubos de algún

caldo lactosado, con o sin inhibidores, con tubos de fermentación para recoger el

gas que pueda producirse. A esto sigue una confirmación en un medio líquido

selectivo y/o una determinación de los coliformes fecales cuya diferenciación se

realiza en base al hecho de que pueda producir gas de lactosa en un medio

apropiado cuando se incuba a 44,5ºC mientras que los demás coliformes no se

comportan de la misma manera.

La identificación de las especies puede proporcionar información sobre la

fuente de contaminación debido a que algunas de ellas son específicas de sus

huéspedes; por ejemplo, una predominancia de S. bovis o S.equinum indicaría

una contaminación por heces no humanas.

87

Análisis de Muestra Problema

Prueba Confirmativa

1.- Los tubos positivos de la prueba presuntiva se pasan una pequeña cantidad a

caldo bilis verde brillante y a caldo EC.

Fig. 4. Determinación de Coliformes Totales

Fuente : Microbiological Analysis of Water

PRUEBA PRESUNTIVA

88

2.- Las muestras sembradas en verde bilis brillante se incuban a 35°por 48 horas.

Luego de este tiempo se realiza las lecturas utilizando la Tabla de

McCrady, considerando positivos los tubos que presentan gas en el tubo Durham

y turbidez.

3.- Las muestras sembradas en caldo EC se las lleva a calentamiento en baño de

María por 24 horas a 44.5°C. Considerándose positivos los que presentan

turbidez o burbujas en el tubo Durham. De igual manera los resultados se

establecen de la Tabla McCrady según los tubos positivos. (33).

4.5.2. CALIDAD DEL SEDIMENTO 4.5.2.1. Parámetros Geoquímicos

4.5.2.1.a. Materia Orgánica / carbón Orgánico

La materia orgánica principalmente consiste de Carbono, Oxígeno,

Hidrógeno y Nitrógeno, pero también contiene pequeñas cantidades de muchos

Foto. 4. Prueba Confirmativa

89

otros elementos como Fósforo, Azufre, Silicio, Potasio y Hierro. Además todos los

elementos que se encuentran en la materia orgánica están presentes en los

constituyentes inorgánicos de los sedimentos. El principal constituyente de la

materia orgánica es el Carbón pero también está presente en los minerales

carbonatados y esto tiene que ser tomado en cuenta al determinar el porcentaje

de carbón orgánico.

Para determinar el contenido orgánico de los sedimentos se acostumbra a

determinar alguna propiedad como el carbono o nitrógeno. El carbono forma más

o menos el 50% o 60 % del total de la materia orgánica es él índice más confiable

del contenido orgánico, si la materia orgánica contiene el 50% de carbono

orgánico entonces la cantidad total de materia orgánica sería dos veces el

contenido de carbono, pero si el contenido de carbono es de 60%, la cantidad

total sería 1.67 veces la de carbono.

La cantidad de carbono orgánico en diferentes tipos de materia orgánica

varía considerablemente dependiendo las condiciones bajo las cuales los

sedimentos son depositados y de acuerdo a los diferentes tipos de plantas y

animales de las cuales provienen. Si las aguas que existen sobre los depósitos

son estancadas y de bajo contenido de oxígeno, las sustancias orgánicas

probablemente son más reducidas que si existiera mayor cantidad de oxígeno.

El porcentaje de materia orgánica se determina por pérdida de peso al

calcinar. Este método tiene el inconveniente de que algunos minerales pierden su

agua de constitución que no vuelven a recuperar.

Los valores de carbono orgánico se obtienen dividiendo los de materia

orgánica entre 1.8 este coeficiente varía algo con la naturaleza de la materia

orgánica. (34).

90

Análisis de Muestras Problemas (27) (34).

Diagrama de Flujo 10. Determinación de materia orgánica en sedimentos

V

INICIO

Definición de Variables Cantidad de muestra, temperatura de calcinación,

Cantidad de muestra usada =

Entre 1 y 5 gramos

Desecar la muestra a 110ºC hasta peso constante

Calcinar la muestra durante 12 horas

F

Temperatura de calcinación = 550ªC

A

V F

Colocar la muestra en un crisol

Una vez fría se humedece la muestra con agua y se añade 1 ml de solución de

carbonato de amónico

Se deseca a 110ºC hasta peso constante y se pesa exactamente

A

Cantidad de muestra mayor a 5 gramos g

Si temperatura de calcinación

es > 550ªC

F V

FIN

91

4.5.2.1.b. Nitrógeno Orgánico

El nitrógeno es la parte orgánica de los sedimentos, si es que la tuvieran se

encuentra unida al Carbono e Hidrógeno formando moléculas complejas las que

solo pueden ser destruidas por deshidratación y oxidación del carbono.

El nitrógeno que solo constituye alrededor del 6 % del total de la materia

orgánica, este más sujeto a oxidación que el carbono y puede desaparecer de los

sedimentos en medios oxidantes, pasando en disolución al agua de mar en forma

de nitratos y nitratos.

El nitrógeno se determina por el método de Kjeldahl

Fundamento

Este método consiste en digerir la muestra de sedimento con una mezcla

digestora formada por ácido sulfúrico concentrado y sulfato de potasio, hasta que

todo el nitrógeno orgánico se haya convertido en Sulfato amónico; destilando

finalmente con soda cáustica, la solución así obtenida, el sulfato amónico es

descompuesto y el amoniaco desprendido se determina volumétricamente. (35)

(27).

92

Análisis de Muestra Problema

Tiempo de digestión Entre 40 a 60

V

V

INICIO

Definición de Variables Peso de muestra, tiempo de digestión

Peso de muestra = 0.2 g

Adicionar 2 5 ml de solución digestora (SO4H2- SO4k2) y digerir hasta la aparición de humos blancos

Continuar con la digestión hasta la completa destrucción de la materia orgánica

F

A

V

Colocar muestra en un matraz Kjeldahl,

Dejar enfriar y diluir con 20 ml de agua destilada libre de amonio

Tiempo = < 40 minutos

A

Pasar la muestra al destilador de kjeldahl y alcalinizar con 20 ml de soda

F

Arrastar con vapor de agua y recoger 20 ml del destilado sobre 5 ml de solución ácida indicadora

Muestra >0.2 g

F

V

F

Dejar enfriar y valorar con una solución de NaOH 0.01N

FIN

Diagrama de Flujo 11. Determinación de Nitrógeno Orgánico en sedimentos

93

• Cálculo de la concentración

El porcentaje de nitrógeno se calcula a partir de la siguiente expresión.

% N = (eb – v) . f . 14.008 mg

Donde eb = Ensayo en blanco

v = mililitros de hidróxido de sodio 0.01 N gastados por la muestra

mg = miligramos de muestra utilizados

f = factor del hidróxido de sodio en el caso de que está no sea

exactamente 0.01N.

4.5.2.1.c. Fosfato

Los fosfatos de los sedimentos proceden en parte de la materia orgánica, pero

también forman parte de los constituyentes inorgánicos. Aunque el contenido de

fosfato en sedimentos puede servir como medida de la cantidad de materia

orgánica, se debe tener en cuenta que no se puede determinar la proporción exacta

entre fosfatos orgánicos e inorgánicos.

El fosfato se determinó por el método de Riley modificado

Fundamento Se basa en la formación de un complejo de fosfomolibdato y su subsecuente

reducción a compuestos de un fuerte color azul, dependiendo la intensidad de la

coloración de la cantidad de fosfatos presentes en la muestra.(35).

94

Análisis de Muestra Problema

Adicionar 2 ml de mezcla de reactivos

V

INICIO

Definición de Variables Peso de muestra, temperatura de calentamiento, cantidad de mezcla de reactivos, tiempo de reacción y longitud de onda

Cantidad de muestra =0.1 g

Adicionar 5 ml de ácido Perclórico y calentar hasta sequedad

Mezclar completamente

Adicionar la cantidad de mezcla de reactivos

proporcional al volumen de la solución usada

F

A

A

V

F

Colocar la muestra de sedimento en un crisol

Temperatura de calentamiento = Entre 130 – 140 ºC

V

F

Diluir con agua hasta 100 ml

Temperatura >140 ºC

V

F

De esta solución tomar 10 ml y adicionar 2 ml de mezcla de reactivos

Volumen de solución 10 ml

B

B

95

• Cálculo de la concentración

El porcentaje de fosfato se calcula como sigue:

L 6.10 –6 P2O5 % = ------ x ----------- .100 .42 LP S

De donde L = Lectura de la disolución de la muestra

LP = Lectura de la disolución del patrón o estándar

S = Gramos de sedimento 4.5.2.1.d. Azufre Método de Tomiyama

Medir la absorbancia a longitud de onda de 885 nm

FIN

Tiempo de Reacción = 15 minutos

B

V

F B

Diagrama de flujo 12. Determinación de fosfato en sedimentos

96

Análisis de Muestra Problema

V

INICIO

Definición de Variables Peso de muestra, tiempo de destilación

Peso de muestra =Entre 0.2 –2.0 g

Adicionar 2 ml de ClH 1:1 y agitar cuidadosamente

Poner a destilar por espacio entre 5 a 8 minutos

F

FIN

Tiempo de destilación =

Entre 5 a 8 minutos

A

V

F

Colocar muestra en un destilador Kjeldahl,

Colectar el vapor de SH2 formado sobre una solución de acetato de zinc al 10%

Tiempo = < 5

V

A

Terminada la destilación agregarle al contenido 2 ml de Iodo 0,01 N; si no hay coloración de yodo, agregarle aún más

(aproximadamente hasta 10 ml).

F

Agregar 2 ml de ClH 1:1 (6N) y se titula con la solución de Tiosulfato de Sodio 0,01 N en presencia de almidón como indicador.

Diagrama de flujo 13. Determinación de Azufre en sedimentos

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• Cálculos:

El contenido de Azufre puede calcularse en 1 Kg de sedimentos secos. S % = ( T – t ) x F x 0,1603 x 1000 S T = Titulo del blanco (blanco: adicionar 5 ml de agua destilada en lugar de la

muestra de sedimento y tratarla como se indico para la muestra).

t = Titulo de la muestra.

F = Factor de normalidad del S2O3Na2.

S = Muestra de sedimento seco. (34).