Capítulo I - UNIVERSIDAD DE CALDAS · ¿Puede el plasma sanguíneo bovino, sustituir aditivos...
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1 Capítulo I. 1. Introducción Diferentes investigadores han propuesto el aprovechamiento del plasma sanguíneo bovino (fracción líquida de la sangre), como fuente de proteínas con propiedades funcionales y en medios de cultivo para fermentaciones industriales. En Colombia, estas alternativas de aprovechamiento no se han estudiado suficientemente. No obstante, la utilización del plasma como fuente de nitrógeno en medios de cultivo para fermentaciones sumergidas, es una alternativa biotecnológica orientada a la obtención de productos de valor agregado. Uno de estos productos, ampliamente utilizado en la industria de alimentos, corresponde a los cultivos iniciadores de la maduración en productos cárnicos (cultivos starter), los cuales son mayoritariamente especies de lactobacilos (Rul et al., 2013). A nivel internacional, se ha reportado un reducido número de estudios sobre el uso del plasma en medios de fermentación, dentro de los cuales cabe destacar y mencionar los de Barboza et al. (1994) y Hyun y Shin (1998). La sangre bovina es uno de los más importantes subproductos obtenidos en la cadena cárnica, concretamente por ser una fuente potencial de proteínas de alto valor biológico, y por ello se utiliza en varios países para alimentación humana (Silva y Silvestre, 2003). No obstante, en Colombia las plantas de beneficio en su mayoría, se limitan al sacrificio de ganado, el deshuese de la canal en cortes primarios y la limpieza de vísceras, y no realizan un aprovechamiento a los subproductos del sacrificio. Uno de estos subproductos con volúmenes elevados de producción en las centrales de sacrificio es la
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Capítulo I.
1. Introducción
Diferentes investigadores han propuesto el aprovechamiento del plasma sanguíneo
bovino (fracción líquida de la sangre), como fuente de proteínas con propiedades
funcionales y en medios de cultivo para fermentaciones industriales. En Colombia, estas
alternativas de aprovechamiento no se han estudiado suficientemente. No obstante, la
utilización del plasma como fuente de nitrógeno en medios de cultivo para fermentaciones
sumergidas, es una alternativa biotecnológica orientada a la obtención de productos de
valor agregado. Uno de estos productos, ampliamente utilizado en la industria de alimentos,
corresponde a los cultivos iniciadores de la maduración en productos cárnicos (cultivos
starter), los cuales son mayoritariamente especies de lactobacilos (Rul et al., 2013). A nivel
internacional, se ha reportado un reducido número de estudios sobre el uso del plasma en
medios de fermentación, dentro de los cuales cabe destacar y mencionar los de Barboza et
al. (1994) y Hyun y Shin (1998).
La sangre bovina es uno de los más importantes subproductos obtenidos en la
cadena cárnica, concretamente por ser una fuente potencial de proteínas de alto valor
biológico, y por ello se utiliza en varios países para alimentación humana (Silva y Silvestre,
2003). No obstante, en Colombia las plantas de beneficio en su mayoría, se limitan al
sacrificio de ganado, el deshuese de la canal en cortes primarios y la limpieza de vísceras, y
no realizan un aprovechamiento a los subproductos del sacrificio. Uno de estos
subproductos con volúmenes elevados de producción en las centrales de sacrificio es la
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sangre, la cual presenta un gran poder contaminante, debido a su alta cantidad de sólidos
totales (18%) y a su elevada demanda química de oxígeno (DQO) que puede alcanzar
500.000 mg O2/L (Del Hoyo et al., 2008).
En Colombia la situación es crítica, en el 2016, de 500 frigoríficos activos que
procesan carne bovina, solo 11 cumplen los requisitos exigidos por el Decreto 1500 de
2007. La disponibilidad promedio anual de sangre bovina en Colombia, para el período
2011-2023 se estima en 95´.017.500 L, pero solo se cuenta con siete plantas procesadoras
de subproductos legalmente reconocidas (Gómez et al., 2013; FEDEGAN, 2015).
La información publicada sobre utilización del plasma como medio de cultivo de
lactobacilos, no incluye resultados sobre el efecto combinado de la fuente de carbono, de la
hidrólisis de las proteínas del plasma y del porcentaje de incorporación del mismo al medio
de cultivo.
Asimismo, no se han encontrado reportes de estudios sobre la aplicación del plasma
sanguíneo bovino hidrolizado enzimáticamente, en la elaboración de productos cárnicos no
tradicionales como el jamón de conejo.
Considerando lo anterior, la presente tesis doctoral está orientada a responder las
siguientes preguntas de investigación:
¿Cuál es el efecto del contenido de aminonitrógeno de hidrolizados enzimáticos de las
proteínas del plasma sanguíneo bovino, sobre la producción de biomasa celular de cultivos
iniciadores de la maduración de productos cárnicos?
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¿Cuál es el desempeño de los medios de cultivo a base de hidrolizados de plasma sanguíneo
bovino, en relación con el crecimiento de lactobacilos iniciadores de la maduración a nivel
de banco?
¿Cómo afecta la hidrólisis de las proteínas del plasma sanguíneo bovino sus propiedades
funcionales de emulsificación, capacidad de retención de agua?
¿Puede el plasma sanguíneo bovino, sustituir aditivos químicos con actividad
emulsificantes en un sistema alimentario como jamón cocido de conejo?
La sangre animal obtenida en las centrales de sacrifico es una fuente de proteína de
alto valor biológico con muchas posibilidades de uso industrial. Particularmente, en la
mayoría de trabajos de aprovechamiento de la fracción plasmática de la sangre para el
cultivo de lactobacilos, se reportan resultados obtenidos a nivel de laboratorio (menos de un
litro de medio); por ello, se realizaron estudios de fermentación a nivel de banco con miras
al futuro escalamiento comercial de este proceso.
Los resultados obtenidos en esta tesis doctoral sirven de base para consolidar, en el
mediano plazo, un paquete tecnológico para el aprovechamiento del plasma sanguíneo
bovino en la industria alimenticia no solamente por sus propiedades funcionales, sino
también como fuente de nitrógeno asimilable para cultivos iniciadores de la maduración de
productos cárnicos. Adicionalmente, esta tesis contribuyó a la consolidación de la línea de
trabajo en aprovechamiento de residuos pecuarios por métodos biotecnológicos del grupo
de investigación en Alimentos y Agroindustria, conducente a mitigar el impacto ambiental
en los cuerpos de agua y conferir valor agregado a estos residuos. El conocimiento
generado permitió disponer de un ingrediente funcional de bajo costo derivado de un
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residuo de la industria cárnica para el sector alimentario, así como de una fuente de
nitrógeno de bajo costo para la industria microbiológica.
La presente tesis doctoral se desarrolló en el marco del proyecto denominado
“Implementación de una estrategia integral a través de innovación biotecnológica para el
aprovechamiento de residuos en el Departamento de Caldas” financiado por el Fondo de
Ciencia, Tecnología e Innovación del Sistema General de Regalías, ejecutado por el grupo
de investigación en Alimentos y Agroindustria.
Como hipótesis de esta tesis doctoral se planteó que el aumento de la disponibilidad
de grupos amino terminales como resultado de la hidrólisis enzimática de las proteínas del
plasma sanguíneo bovino mejora la asimilación de este sustrato como fuente de nitrógeno
orgánico favoreciendo el crecimiento de Lactobacillus plantarum en un medio líquido de
fermentación.
La incorporación del plasma sanguíneo bovino en sistemas alimentarios permite
sustituir los emulsificantes comerciales en productos como embutidos cárnicos a base de
carne de conejo.
La desnaturalización y el acortamiento de la cadena proteica resultantes de la
hidrólisis enzimática de las proteínas del plasma sanguíneo bovino, modifican sus
propiedades funcionales de emulsificación y de retención de agua en sistemas alimentarios
como embutidos cárnicos provocando cambios en sus atributos sensoriales y en su textura.
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En la presente tesis doctoral, se plantea como objetivo general estudiar las
propiedades del plasma sanguíneo bovino como componente de medios líquidos de
fermentación y fuente de proteínas con propiedades funcionales en sistemas alimentarios. Y
como objetivos específicos evaluar la eficiencia del plasma sanguíneo bovino como
componente base de un medio líquido de fermentación para el crecimiento de cultivos
lácticos iniciadores de la maduración en productos cárnicos. Igualmente evaluar la cinética
del crecimiento de Lactobacillus plantarum ATCC 8014 a nivel de banco en un medio a
base de plasma sanguíneo bovino hidrolizado enzimáticamente y su aplicación como
cultivo iniciador en un producto cárnico tipo madurado. Y finalmente evaluar las
propiedades funcionales del plasma sanguíneo bovino y el efecto de su incorporación, con o
sin tratamiento enzimático, en un producto cárnico embutido no tradicional.
Referencias
Barboza Y., Marquez E., Arias B., Faría J., Castejón O. (1994). Utilización del plasma
sanguíneo de bovino como fuente proteica en la formulación de un medio de cultivo
para Lactobacilos. Revista Cientifica Facultad de Ciencias Veterinarias-
Universidad del Zulia, 4(1): 55-59.
Del Hoyo P., Rendueles M., Díaz M. (2008). Effect of processing on functional properties
of animal blood plasma. Meat Science, 78(4): 522-528.
FEDEGAN. (2015). Mercado de la carne: Coyuntura y perspectivas Disponible en:
http://es.slideshare.net/Fedegan/coyuntura-y-perspectivas-sector-carnico-marzo-de-
2015. [Visitada en de
Gómez L.J., Figueroa O.A., Zapata J.E. (2013). Actividad antioxidante de hidrolizados
enzimáticos de plasma bovino obtenidos por efecto de Alcalasa® 2.4 L.
Información tecnológica, 24(1): 33-42.
Hyun C.-K., Shin H.-K. (1998). Utilization of bovine blood plasma obtained from a
slaughterhouse for economic production of probiotics. Journal of Fermentation and
Bioengineering, 86(1): 34-37.
6
Isaza J., Londoño L., Restrepo D., Cortes M., Suárez H. (2010). Producción y propiedades
funcionales de plasma bovino hidratado en embutido tipo salchichón. Revista
Colombiana de Ciencias Pecuarias, 23: 199-206.
Liu D.-C. (2002). Better utilization of by-products from the meat industry. Taichung,
Taiwan: Food and Fertilizer Technology Center. 15.
Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural. (2009). Agenda Prospectiva de Investigación
y Desarrollo Tecnológico para la Cadena Cárnica Bovina en Colombia. Bogotá:
200 p.
Rul F., Zagorec M., Champomier-Vergès M.-C. (2013). Lactic acid bacteria in fermented
foods. En: Proteomics in Foods. Springer. p. 261-283.
Signorini M. (2007). Evaluación de riesgos de los rastros y mataderos municipales.
Nacameh, 1(1): 118-141.
Silva V.D.M., Silvestre M.P.C. (2003). Functional properties of bovine blood plasma
intended for use as a functional ingredient in human food. LWT - Food Science and
Technology, 36(7): 709-718.
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Capítulo II.
2. Revisión de literatura
2.1. Sangre bovina
La sangre bovina es un líquido generalmente de color rojo, que circula por las
arterias y venas del cuerpo del animal y que se compone de una parte líquida o plasma y de
células en suspensión: eritrocitos, leucocitos y plaquetas. La sangre tiene varios usos
importantes: consumo humano (alimenticio y farmacéutico), animal e industrial (Oficina
Nacional de Normalización, 2009). La composición química de la sangre no es igual en la
población bovina y depende principalmente de factores como la raza, la edad, el estado
fisiológico y la alimentación, entre otros. En la tabla 1 se presenta la composición media de
la sangre bovina, el plasma y células. La sangre bovina se divide en dos fracciones, el
plasma y el paquete celular, este último constituido por los glóbulos rojos, los glóbulos
blancos y las plaquetas. En el bovino, la fracción plasmática representa del 60 al 65% del
total y el paquete globular del 35 al 40% (Linden y Lorient, 1996).
Tabla 1. Composición de la sangre, plasma líquido y paquete celular bovino (g/100 mL).
Componente Sangre Plasma
(60%)
Paquete celular
(40%)
Agua
Proteínas
Lípidos
Hidratos de carbono
Sales minerales
Otras sustancias
Materia seca
80-85
15-18
0,15
0,10
1,00
0,55
15-20
90-92
6-8
0,5-1
0,08-0,12
0,8-0,90
0,20-0,30
8-10
70-78
25-29
0,20
---
Trazas
---
22-30 Fuente: Linden y Lorient (1996).
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2.1.1. Obtención de sangre de bovino
La obtención de la sangre como subproducto proveniente de las diferentes
operaciones de faenado debe realizarse de forma profusa y completa, lo más rápido posible
después de la insensibilización, del trabado y de la elevación en el riel de sangría, y antes
de que el animal recobre la conciencia (Veall, 1993). En esta etapa se ocasiona la muerte
del animal por pérdida rápida de sangre (seis minutos en bovinos) y la consiguiente falta de
oxígeno en el cerebro (Madrid, 1999; López y Casp, 2004). La sangre debe ser de animales
aprobados por el control sanitario y recogida en condiciones higiénicas. Para su uso
industrial y humano, es oportuno conservarla en estado líquido, para lo cual se somete a un
proceso de desfibrinado por agitación mecánica (Paltrinieri, 2001; López y Casp, 2004).
En la sangría solo se recupera más o menos la mitad del volumen de sangre total
disponible en el animal. El rendimiento de la sangre obtenida en los vacunos depende del
período de inserción del cuchillo de sangría. Con un tiempo de 60 segundos se suele
recoger de 10 a 14 L de sangre por bovino adulto, si la sangre sale del animal por impulso
propio de los latidos de su corazón. Si se amplía este tiempo a 90 segundos se suele recoger
unos 2 L más de sangre (Ockerman y Hansen, 1994). El sistema higiénico de recolección
de sangre para consumo humano, consta de un cuchillo hueco para el degüelle que se
introduce en el animal, el cual está conectado a una bomba de vacío para succionar la
sangre y depositarla en un tanque intermedio. Luego la sangre pasa por un colador y un
intercambiador de placas que la enfría en un rango de 4 a 8°C. El sistema más higiénico de
desangrado es de posición vertical con el animal levantado con un tecle hacia un riel sobre
el cual puede deslizarse con la ayuda de un gancho. Si la sangre se va a destinar a la
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obtención de plasma para aplicaciones especiales, es preciso recurrir al sistema cerrado de
recogida de la sangre que se ilustra en la Figura 1.
En la mayoría de los mataderos tradicionalmente se ha aprovechado una mínima
parte de la sangre obtenida para la fabricación de morcillas, el gran volumen de ella se
destina para la producción de harinas para alimentación animal. Sin embargo, actualmente
el mercado de las harinas cárnicas es muy reducido, debido a su prohibición en la
producción de concentrados para alimentación de rumiantes, como consecuencia de la crisis
ocasionada por la Encefalopatía Espongiforme Bovina (López y Casp, 2004). En Colombia,
cuando la sangre se destine para consumo humano o para elaboración de medicamentos,
debe realizarse con previa autorización del INVIMA, posterior al análisis de laboratorio
(Ministerio de la Protección Social, 2007).
Figura 1. Sistema cerrado e higiénico de recogida de sangre. Fuente: Madrid (1999).
Una vez obtenida y acopiada la sangre entera en fosa o tanque, dependiendo de su
uso, se puede conservar en su estado natural o recurrir a la separación de la fracción líquida
o plasma y del paquete celular. En tal sentido se requiere la incorporación de soluciones
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anticoagulantes, dentro de las más utilizadas está el citrato de sodio y ácido etilen-
diaminotetracético (CPTS, 2009). Estos anticoagulantes se seleccionan según la finalidad
del proceso (ver Tabla 2).
Tabla 2. Principales anticoagulantes de la sangre bovina y concentraciones requeridas.
Anticoagulante
Concentración
Referencia
Heparinato de amonio, litio o
sodio
0,2 a 0,75 mg o 10 unidades / mL sangre Álvarez (2001)
EDTA disódico (ácido etilen-
diaminotetracético), cloruro de
potasio
1 mg / mL de sangre, 0,02 mL de una solución de
5 g en 100 mL de H2O / 100 mL de sangre.
2ml de solución al 10% /100 mL de sangre.
Álvarez (2001)
Silva y Silvestre
(2003)
Fluoruro sódico 2 mg / mL Álvarez (2001)
Citrato sódico Solución de 2,0 y 2,50% / L sangre
5 mg / L de sangre, un volumen de una solución
de 3,8 g de citrato de sodio dihidratado en nueve
volúmenes de sangre.
0,10-0,15 y 0,20 g/ 100 mL de sangre
0,60%
2% p/v
Isaza et al. (2010)
Álvarez (2001)
Rangel et al. (1995)
Hyun y Shin (1998)
Barboza et al. (1994)
Oxalato de sodio 1 – 2 mg / L de sangre, un volumen de una
solución de 0,75 g de oxalato de sodio en nueve
volúmenes de sangre
Álvarez (2001)
Polietanolsulfonato sódico 1,25 mg / mL de sangre Álvarez (2001)
Ácido cítrico 0,20 %
Álvarez (2001)
Ockerman y Hansen
(1994)
Mezcla de fosfatos 22% de ortofosfato, un 22%de fosfato
tetrasódico, un 16% de difosfato disódico y un
40% de cloruro sódico
Ockerman y Hansen
(1994)
Tripolifosfato de sodio 0,10-0,15 y 0,20 g/ 100 mL de sangre Rangel et al. (1995)
Todos estos anticoagulantes actúan por diferentes mecanismos de acción. En el caso
de la heparina, considerada un anticoagulante natural presente en la sangre, su uso se
realiza en forma de sales sódicas, líticas o cálcicas, las cuales inhiben la conversión de
protrombina en trombina evitando así la coagulación de la sangre. El oxalato de sodio y
potasio actúa precipitando el calcio necesario para la coagulación. El citrato sódico
convierte el calcio en formas no ionizadas, previniendo la coagulación. El ácido etilen-
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diaminotetracético (EDTA), cloruro de potasio actúa como quelante de calcio (Ockerman y
Hansen, 1994). También se ha reportado el efecto anticoagulante de enzimas proteolíticas a
través de la hidrólisis de la fibrina (Quaglia y Massacci, 1982).
2.1.2. Aprovechamiento de la sangre bovina
La sangre recolectada higiénicamente en los mataderos en el mundo tiene muchas
posibilidades de aprovechamiento, ya sea de forma entera o fraccionada, en la industria
alimenticia o la industria farmacéutica, entre otras (ver Tabla 3). Por este motivo ha
cobrado importancia en los últimos años el aprovechamiento de la sangre y sus
subproductos en China, la Unión Europea, Argentina y Brasil. Otro factor importante para
promover el aprovechamiento de los subproductos del sacrificio de animales de abasto
público hace referencia al impacto producido a nivel ambiental en el mundo. Por ello a
nivel industrial se han identificado principalmente cuatro sistemas de procesamiento para el
aprovechamiento de la sangre animal: la separación en plasma y corpúsculos o
hemoglobina, la obtención de harina de sangre por eliminación de agua, la producción de
sangre soluble y la producción de plasma en polvo (Madrid, 1999). En la Figura 2 se
muestran esquemáticamente las diferentes opciones para el procesamiento de las proteínas
de la sangre bovina, porcina y aviar.
2.1.2.1. Harina de sangre
La harina de sangre se considera una fuente de proteína animal derivada del
tratamiento térmico de la sangre o fracciones de sangre. La importancia nutricional de la
harina de sangre para alimentación animal se fundamenta en su contenido de lisina. Este
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aminoácido se identificó como de referencia por ser el primer aminoácido limitante en la
mayoría de las dietas de pollos de engorde para lograr el mantenimiento y ganancia máxima
de proteína corporal; lo anterior, reduce su uso como fuente de energía y disminuye la
excreción de nitrógeno (Waldroup, 1985; Campos et al., 2008).
Figura 2. Proceso de separación de los constituyentes de la sangre bovina. Fuente:
Ockerman y Hansen (1994).
Para la utilización de la sangre en alimentación de algunas especies animales se
requiere recurrir a su conservación. El secado es un método de conservación de la sangre y
tiene igualmente como objeto principal la obtención de harina de sangre de buena calidad
nutricional y microbiológica. La harina de sangre es utilizada principalmente en la industria
avícola, porcícola y piscícola como suplemento de alimento balanceado en la etapa de
iniciación. Existen numerosos métodos de secado de la sangre desde el secado al sol de
poca eficiencia, hasta complejos sistemas de secado como la liofilización que tienen un
mayor costo. El sistema más utilizado en el mundo, es el secado por aspersión de sangre o
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plasma sanguíneo bovino, porcino y aviar entre otros. Este sistema en el momento es
considerado como una de las alternativas eficientes de la ingeniería y adecuada para
garantizar la estabilidad microbiológica a los productos alimenticios (Gharsallaoui et al.,
2007).
2.1.2.2. Obtención de proteínas de sangre bovina
Las proteínas de la sangre presentes en el plasma sanguíneo, como la seralbúmina y
la globulina tienen una gran importancia para la industria alimenticia por presentar
propiedades funcionales emulsificantes de grasas y de retención de agua en sistemas
alimentarios como emulsiones cárnicas o embutidos de pasta fina (Benítez et al., 2003;
Barboza et al., 2005). Dentro de los emulsificantes de origen animal, las proteínas del
plasma sanguíneo bovino presentan una menor actividad emulsificante que la caseína, pero
mayor que la de la harina de soya y que las proteínas cárnicas (Ockerman y Hansen, 1994).
La albúmina de suero bovino, es obtenida de la fracción líquida de la sangre coagulada, sin
células, fibrina o factores de coagulación, contiene un gran número de factores
macromoleculares y nutricionales esenciales para el crecimiento celular y constituye el
componente más abundante del suero fetal bovino. Su importancia se debe al contenido de
factores de crecimiento, los cuales son esenciales para el mantenimiento y crecimiento de
células en cultivo (Shah, 1998; Even et al., 2006). Se utiliza también como patrón de
proteína, aditivo en diluyentes específicos, producción de vacunas, agente bloqueador en
inmunoensayos, estabilizador de proteínas y obtención de drogas biotecnológicas de
consumo humano y animal (Li et al., 2008; Stoikos et al., 2008; Santa Cruz P et al., 2014).
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En cuanto a la obtención de la globina, existen cinco métodos para su extracción;
por acción enzimática, con solventes, por precipitación con carboximetilcelulosa, por
precipitación del grupo hemo con alginato de sodio y decoloración del grupo hemo con
peróxido de hidrógeno (Ockerman y Hansen, 1994).
2.1.2.3. Utilización de la sangre bovina en sectores no alimentarios
Son diversos los usos que se le ha dado a la sangre de los animales de abasto
público diferentes a sus aplicaciones en la industria de alimentos. Se destaca su uso como
material de laboratorio, en aplicaciones médicas, como aditivo industrial y como
fertilizante, entre otros (ver Tabla 3). Los constituyentes de la sangre bovina en el
laboratorio son las fuentes más comunes de proteínas para medios de cultivo celular y como
componente de diferentes tipos de agar para fines bacteriológicos. Estos componentes
modificados de la sangre bovina también se emplean en el ensayo biológico de la heparina
y como soluciones patrón de proteínas en la calibración de equipos en hematología
(Ockerman y Hansen, 1994). En la industria de los pegantes se utiliza como aditivo por su
capacidad para formar películas en papeles, litografías, fibras y plásticos y como
componente de algunos adhesivos. La sangre también se aprovecha como fertilizante del
suelo, ayudando al aporte de nitrógeno y a la formación de humus mejorando su estructura
(Divarkaran, 1980).
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Tabla 3. Usos de la sangre bovina en aplicaciones no alimentarias.
Usos Aplicaciones
Fertilizantes Revestimiento de semillas, estabilizante del pH del suelo,
componentes minerales.
Laboratorio
Medios de cultivo, análisis de taninos, carbón activado, hemina agar
sangre, peptonas, glicerofosfatos, albúminas, globulinas,
esfingomielina, catalasa.
Medicina
Pruebas de aglutinación, inmunoglobinas, técnicas de
fraccionamiento, factores de coagulación, suturas, fibrinógeno,
productores de fibrina, serotonina, plasminógeno, aditivos de
plasma.
Industria
Adhesivos, aditivos para resinas, finalizadores para cuero y tejidos,
coadyuvantes en insecticidas pulverizables, hormigón poroso,
sustituto de la clara del huevo, extintores de incendios, fabricación
de cerámica y plástico, formulaciones base de plásticos y
cosméticos. Fuente: modificado de Divarkaran (1980).
2.2. Plasma sanguíneo bovino
El plasma sanguíneo bovino es un líquido translucido más denso que el agua y
ligeramente alcalino, con pH de 7,4; en algunos casos puede presentar un ligero color
rosado y está constituido por un 90% de agua conteniendo alrededor de 7,2% de proteína
(Duarte et al., 1999). En general el plasma contiene principalmente las proteínas circulantes
(albúminas y globulinas), sales, lípidos, hidratos de carbono (glucosa) y aminoácidos, entre
otros componentes. Dentro de estos constituyentes, las proteínas plasmáticas han cobrado
gran importancia por ser sustratos de alto valor biológico. Ellas están formadas de una
mezcla de diferentes cuerpos proteicos cuya composición aproximada es de 44% de
albuminas, 14% de α-globulinas, 11% de β-globulinas, 31% de γ-globulinas y 0,6% de
fibrinógeno (Duarte et al., 1999). Debido a sus aplicaciones en la industria alimenticia, el
plasma sanguíneo se comercializa en forma de polvo deshidratado cuya composición
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incluye un 79,54% de proteínas, 6,67% de humedad, 7,26% de cenizas, 1,45% de lípidos y
5,08% de carbohidratos (Duarte et al., 1999).
El plasma bovino sanguíneo es una fuente potencial de proteínas de alto valor
nutricional, biológico e industrial, con altas posibilidades de aplicación de sus proteínas en
más sistemas alimentarios, lo cual constituye una tarea relevante para los investigadores de
la industria alimenticia. Su incorporación en alimentos contribuye al mejoramiento de su
valor nutricional de una manera relativamente significativa y económica por la alta
disponibilidad de esta fuente de proteína en el mundo. Es así que desde el punto de vista
nutricional (fortificación y aumento de la digestibilidad), el plasma sanguíneo bovino se ha
propuesto en la incorporación en bebidas refrescantes (bebida a base de arroz), dada la
cantidad y calidad sus proteínas. Se ha obtenido un aumento de la digestibilidad proteica en
este tipo de bebida (Montero et al., 2012). Dadas las propiedades físico-químicas (ver Tabla
4) de las proteínas del plasma sanguíneo bovino y su interacción con los constituyentes de
los alimentos (carbohidratos, proteínas, lípidos, minerales, etc.) en forma natural y durante
el procesamiento de los alimentos es posible su incorporación tecnológicamente para
mejorar sus atributos sensoriales y propiedades funcionales.
Las aplicaciones tecnológicas del plasma sanguíneo bovino en sistemas alimentarios
se han orientado principalmente a su uso como agente emulsionante y estabilizante debido
a su contenido de proteínas como albúminas y globulinas presentes en su estructura
molecular. También el plasma tiene una excelente capacidad de formación de espuma, y se
puede utilizar para sustituir las claras de huevo en la industria de panificación. Igualmente,
el plasma, por su contenido de 60% de albúminas, es un buen agente gelificante y sus geles
son similares a los de las claras de huevo (Liu, 2002).
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Tabla 4. Principales propiedades físico-químicas de algunas proteínas del plasma.
Proteína Punto isoeléctrico Peso molecular Albúmina - 61.000
Albúmina sérica 4,70 69.000
α –Globulinas 5,06 200.000-300.000
α-ácidoglucoproteína (orosomucoide) 2,70 44.100
α-lipoproteínas - 435.000
Haptoglobina 4,10 85.000
α-2-glicoproteína 3,80 -
Plasminógeno 5,60 143.000
Ceruloplasmina 4,40 151.000
β-globulinas 5,12 93.000
β-lipoproteína - 3,2×106
Transferrina 4,40 88.000
γ-globulinas 6,85 160.000 a Fibrinógeno 5,80 330.000
a Separado por efecto salino con NaCl 1.5 M. Fuente: Haurowitz (1959, 1963).
2.2.1. Obtención del plasma sanguíneo bovino
Para la obtención del plasma sanguíneo se debe partir de sangre de animales sanos y
en condiciones higiénicas adecuadas. Inmediatamente después, la sangre debe mezclarse
con anticoagulantes y transportarse a tanques de refrigeración a baja temperatura (5ºC)
hasta la planta de procesamiento (López y Casp, 2004). Posteriormente se somete a
centrifugación para separar el plasma (60-70% de la sangre original) del paquete celular o
glóbulos rojos (30-40%) tal como se observa en la Figura 2. Tanto el plasma como el
paquete celular sanguíneo obtenido pueden conservarse en refrigeración o congelación o
someterse a secado por aspersión, lo cual permite la obtención de productos con sus
proteínas intactas y completamente solubles y con una óptima calidad microbiológica y
bromatológica.
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2.2.2. Propiedades funcionales del plasma sanguíneo bovino
Las propiedades funcionales se definen como aquellas propiedades físico-químicas
de los componentes de los sistemas alimentarios que son relevantes desde el punto de vista
de su producción y procesamiento, las cuales afectan y modifican las características de un
alimento contribuyendo a la calidad final del producto. A este respecto, las proteínas del
plasma sanguíneo bovino exhiben varias propiedades funcionales relevantes para el
procesamiento de diferentes sistemas alimentarios (ver Tabla 5).
2.2.2.1. Propiedades emulsificantes
Una propiedad funcional de superficie de las proteínas empleadas en los alimentos
es la emulsificación. Para los sistemas aceite/agua, las proteínas tiene un buen
comportamiento a diferencia de los sistemas agua/aceite en donde no actúan
adecuadamente. El mecanismo general de emulsificación consiste en la orientación de los
aminoácidos apolares hacia la fase lipídica y la de los polares hacia la fase acuosa (Badui,
1993). En tal sentido Satterlee et al. (1973) estudiaron la capacidad de emulsificación con
proteínas de sangre en polvo para ser utilizada en la emulsificación de productos cárnicos;
posteriormente Caldironi y Ockerman (1982) estudiaron la capacidad emulsificante de la
carne, el plasma y las globinas, así como diferentes mezclas. De estos estudios se concluyó
que las proteínas del plasma tienen unas propiedades de emulsificación muy aceptables,
equivalente a las de la carne, cuando las pruebas de emulsificación se realizaron a
concentraciones de 0,4% de la proteína total. Igualmente se encontró que es factible la
sustitución de carne por el plasma como agente emulsificante. Sin embargo, estos autores
advirtieron que es importante observar que a medida que se reducen los niveles de carne,
19
disminuye la estabilidad de las emulsiones principalmente en aquellas donde no se utiliza
plasma para compensar la disminución de carne. En la Tabla 5, se presentan algunas
aplicaciones del plasma sanguíneo bovino como agente emulsificante en sistemas
alimentarios. Como fuente de proteína funcional en el procesamiento de alimentos para
consumo humano, algunos autores han estudiado el plasma bovino en el proceso de
emulsificación y de sustitución de grasa en los mismos.
En estudios similares, Dias Ornellas et al. (2001), con el objetivo de utilizar el
plasma sanguíneo bovino como agente funcional en los alimentos, estudiaron el efecto de la
hidrólisis enzimática y el pH sobre la solubilidad, hidrofobicidad y capacidad para formar y
estabilizar emulsiones del plasma en el intervalo de pH de 3,0 a 8,0. Para este caso,Silva y
Silvestre (2003) se determinaron la capacidad emulsionante (CE), el índice de actividad
emulsionante (EAI) y la estabilidad de la emulsión (ES). Se utilizó como proteasa la
tripsina para preparar cinco hidrolizados enzimáticos. Los resultados mostraron que la
hidrofobicidad y el EAI se afectaron a un valor máximo de pH 3,0 y 7,0, respectivamente,
mientras que las otras propiedades prácticamente no se vieron influenciadas por la
variación del pH.
20
Tabla 5. Propiedades funcionales de las proteínas del plasma sanguíneo bovino.
Propiedad
Funcional Sistemas Alimentarios Referencias
Gelificación Galleta (harina de yuca)
Hamburguesa
Benítez et al. (2008)
Rodriguez et al. (2011b)
Emulsificación Salchichón de pollo
Embutido de pollo
Jamón cocido, mayonesa
Sistema modelo
Isaza et al. (2010); Márquez et al. (2006)
Rodas et al. (1998)
Rodríguez (1986)
Liu (2002); Rodriguez et al. (2010)
Fijación de agua Sistema modelo
Hamburguesa
Rodriguez et al. (2011a)
Textura
Color
Aroma
Sabor
Masa harina galletas
Producto cárnico de pollo
Barboza et al. (1994)
Benítez et al. (2002)
Sustitución de grasa Paté Viana et al. (2005)
Estabilizante Carne de res, cerdo y pollo
Alimentos en general
Alimentos en general
Márquez et al. (2008)
Liu (2002)
Rodriguez et al. (2010)
Espumante Productos panificables
Alimentos como; aderezos
para ensaladas, helados,
productos de confitería o de
carne.
Liu (2002)
Rodriguez et al. (2011b)
Digestibilidad y
fortificación
Bebida refrescante a base de
arroz
Montero et al. (2012)
Fortificación Salchicha
Galleta escolar
Montero et al. (2015)
Alizo y Márquez (1994)
La hidrólisis con tripsina produjo una reducción de la solubilidad y la CE, pero no
tuvo ningún efecto sobre el EAI y la ES, y mejoró solo la hidrofobicidad en algunos
períodos de reacción. Silva y Silvestre (2003) realizaron un trabajo investigativo modelo
muy similar al anteriormente descrito con el fin de determinar el efecto del pH, la hidrólisis
enzimática y la adición de NaCl sobre la solubilidad, hidrofobicidad y propiedades
emulsionantes de plasma sanguíneo bovino. Los resultados mostraron que la hidrofobicidad
y el EAI de plasma de sangre bovina alcanzaron un máximo a pH 3,0 y 7,0,
respectivamente, mientras que los otros parámetros permanecieron casi constantes con
21
cambios de pH. La hidrofobicidad, hidrólisis enzimática a diferentes tiempos, la solubilidad
y la CE no mostraron ningún efecto sobre el EAI y la ES. La influencia del NaCl probada a
pH 5,0 y 6,0 fue beneficiosa para el EAI del plasma a pH 5,0 en la formulación y redujo
significativamente la solubilidad, hidrofobicidad y la CE a pH de 5,0 y 6,0. Para la ES, la
adición de NaCl no produjo ninguna modificación a ambos valores de pH.
2.2.2.2. Propiedades gelificantes
Al proceso de agregación ordenada de proteínas desnaturalizadas para formar una
red proteica se le denomina gelificación (Fennema, 1993). Esta propiedad de las proteínas
se utiliza en los sistemas alimentarios no solo para formar geles sólidos viscoelásticos, sino
también para mejorar la absorción de agua, los efectos espesantes, la fijación de partículas
(adhesión) y para estabilizar emulsiones y espumas (Fennema, 1993).
El grado de gelificación de algunas proteínas, como las del plasma sanguíneo
bovino, se puede predecir midiendo la hidrofobicidad correspondiente, pues esta
característica favorece la interacción proteína-proteína; en el caso de la asociación de la
albúmina de suero bovino, se ha comprobado que los enlaces disulfuro que se presentan en
la creación del gel dependen del pH. Estos enlaces desaparecen por debajo del punto
isoeléctrico de las proteínas, dando lugar a los enlaces hidrófobos e hidrófilos (Badui,
1993).
Otras investigaciones han demostrado que al incorporar plasma sanguíneo bovino y
porcino a productos cárnicos cocidos aumenta el rendimiento debido a que sus proteínas
poseen propiedades funcionales de gelificación, y de capacidad de retención de agua (Isaza
et al., 2010), aumentando el rendimiento del producto final (Camacho et al., 2014). Por
22
ello, el uso de las proteínas del plasma como ingrediente funcional se ha extendido en la
elaboración de productos cárnicos como agente emulsificante o gelificante (Thakur et al.,
2008).
Por sus propiedades gelificantes, se ha aplicado el plasma sanguíneo bovino
obtenido por centrifugación en la elaboración de emulsiones cárnicas o embutidos de pasta
fina (embutido tipo salchichón). Los resultados de su incorporación evitan la reducción de
la retracción y aumentan el rendimiento o disminución de las pérdidas por cocción
(aproximadamente 4-5%), además de producir un incremento en la humedad y la textura
del producto. Silva y Silvestre (2003) llevaron a cabo un estudio modelo de las propiedades
funcionales del plasma sanguíneo bovino, en el cual se analizó el efecto de la hidrólisis
enzimática, el pH y la adición de NaCl sobre la hidrofobicidad del plasma sanguíneo
bovino como medida de predicción del grado de gelificación; lo anterior, con el objeto de
utilizar sangre bovina como ingrediente funcional. Se encontró que la hidrofobicidad del
plasma se ve afectada significativamente a un pH cercano a 3,0. De hecho, cuando las
proteínas se acercan a su punto isoeléctrico se afecta la capacidad de retención de agua y
por lo tanto pueden conducir a la formación de geles inestables o con rigidez variable.
2.2.2.3. Mejorador de textura y propiedades sensoriales
Son diversas las aplicaciones del plasma sanguíneo bovino en la industria
alimenticia como mejorador de atributos sensoriales. Cuando el plasma sanguíneo bovino
se utiliza a concentraciones superiores al 2% en embutidos, se adquiere una textura elástica
como la de goma (Isaza et al., 2010). En productos de panadería el plasma tiene una gran
capacidad espumante, similar a la de la albúmina de huevo, y de inflamiento, esto debido al
23
carácter anfifílico de las proteínas que les permite su interacción en la interfase aire-agua
evitando la coalescencia de las burbujas y así aumentando su estabilidad , por lo cual se ha
propuesto su uso como sustituto de la clara de huevo (Ockerman y Hansen, 2000;
Rodriguez et al., 2011a).
Entre los trabajos dirigidos a la utilización del plasma como mejorador de textura,
cabe destacar el realizado por Yousif et al. (2002) para evaluar el efecto de la incorporación
de plasma sanguíneo bovino deshidratado sobre el color, textura, aroma y sabor en una
masa de harina de galletas. Los resultados de la evaluación sensorial indicaron que la
adición de plasma secado mejoró la textura y la intensidad del color, aroma y sabor. Las
evaluaciones subjetivas y objetivas de las formulaciones de las galletas con harina
mezclada con plasma deshidratado indicaron que la formulación que contiene 2,2 g de
plasma/100 g de pasta, presentó un balance adecuado entre el contenido de proteína de la
pasta y la aceptabilidad organoléptica.
2.2.2.4. Retención de agua
Las proteínas, por ser sustancias polares, se hidratan en soluciones acuosas. Este
grado de hidratación (agua de hidratación / g proteína) es variable. Por ejemplo, para la
albúmina de huevo en sulfato amónico es de 0,22, para la β-lactoalbúmina es de 0,8 y para
la hemoglobina es de 0,3 (Grosch y Belitz, 1997). La absorción de agua (también llamada
afinidad o fijación de agua), el hinchamiento, la humectabilidad y la capacidad de retención
de agua se ven influenciadas por factores como la concentración proteica, el pH, la
temperatura, el tiempo, la fuerza iónica y la presencia de otros componentes que toman
parte en las interacciones proteína- proteína y proteína-agua (Fennema, 1993).
24
Para la determinación de las propiedades de hidratación se utilizan cuatro grupos de
métodos: (a) método de la humedad relativa que mide la cantidad de agua absorbida a una
aw dada; (b) método instrumental de hinchamiento (aparato de Bauman), consistente en un
capilar graduado, unida a una placa de vidrio porosa a través de la cual se absorbe
espontáneamente el agua; (c) método de agua en exceso en el cual la muestra se somete a
una cantidad de agua mayor de lo que esta muestra puede retener para separar luego el agua
retenida de la que no lo ha sido mediante filtración o aplicación de una fuerza centrífuga
moderada; y (d) método de saturación en el cual se determina por centrifugación la cantidad
de agua necesaria para lograr el estado de saturación de la proteína (Fennema, 1993).
En general y dado el creciente interés en el plasma bovino como fuente potencial de
proteínas de alto valor biológico y con propiedades funcionales, se han promovido estudios
para su uso en la industria alimentaria especialmente en productos como pates, embutidos y
mayonesas (Dias Ornellas et al., 2003). Dentro las propiedades más estudiadas se destacan
las siguientes: capacidad de retención de agua (CRA), solubilidad, capacidad de ligamento
de grasa (CLG), capacidad emulsionante (CE), estabilidad de la emulsión (EE) y capacidad
espumante (CES). Estas propiedades se han estudiado en diferentes sustratos proteicos
(leche bovina parcialmente descremada, leche de soya y plasma bovino) y se realizan
generalmente a temperatura ambiente y pH de 7,4 a 7,8 como se ilustra en la
Tabla 6. Se puede observar que el plasma bovino sanguíneo presentó las mayores
CRA y CES (Rodríguez et al., 2007).
25
Tabla 6. Comparación de las características de los diferentes concentrados proteicos.
Propiedades de las proteínas Plasma Leche bovina Leche de soya
Contenido de proteínas totales (%) 27,8 ± 0,4 34,8 ± 0,3 28,8 ± 0,2
CRA (mL de agua /g de producto) 7,31 ± 0,03 1 ± 0,05 2,05 ± 0,06
CLG (mL de aceite/ g de producto) 2,4 ± 0,1 3,90 ± 0,11 2,30 ± 0,08
CE (mL de aceite/ g de producto) 445 ± 5 790 ± 9 260 ± 7
CES (mL/ml) 1,22 ± 0,02 0 0
EE (%) 50,6 ± 0,4 - -
*CRA: capacidad de retención de agua, *CLG: capacidad de ligamento de grasas, *CE: capacidad
emulsionante, *CES: Capacidad emulsionante y estabilizante, *EE: estabilidad de la emulsión. Fuente:
Rodríguez Furlán et al. (2007).
2.2.2.5. Propiedades antioxidantes
Se ha evaluado la actividad antioxidante de hidrolizados de plasma de bovino
(HPB) obtenidos con Alcalasa 2.4 L a diferentes grados de hidrólisis. Se encontró, además,
que la actividad antioxidante se incrementa en función del grado de hidrólisis, y que dicha
actividad se mantiene después de someter los hidrolizados a condiciones de digestión in
vitro. Los resultados mostraron que los HPB obtenidos bajo las condiciones de hidrólisis
planteadas, poseen una fuerte capacidad de captación de radicales ácido 2,2´-azino-bis-(3-
etilbenzotiazolin)-6-sulfónico y un alto poder de reducción comparado con las proteínas del
plasma no hidrolizadas. Los procesos descritos permiten obtener un péptido con una
actividad antioxidante similar a la presentada por algunos antioxidantes comerciales
(Gómez et al., 2013). Esta importante actividad antioxidante del plasma de bovino
representa una oportunidad también de aprovechamiento de una buena fuente de proteínas
26
altamente disponible en la industria cárnica. La sangre y, en especial, el plasma sanguíneo
son fuentes reconocidas de péptidos con propiedades bioactivas como actividad
antimicrobiana, opioide, antihipertensiva y antioxidante, entre otras (Gómez et al., 2013).
Estos hidrolizados del plasma de sanguíneo bovino se han propuesto como antioxidantes en
la elaboración de películas de proteínas de soya y girasol (Salgado et al., 2011).
2.2.2.6. Suplementación proteica con plasma bovino
El plasma sanguíneo bovino constituye una fuente importante de proteína, por lo
que se ha planteado su utilización para suplementar alimentos. Lo anterior, considerando
que el plasma ofrece una elevada disponibilidad de una fuente de proteína animal de alta
calidad nutricional y de relativo bajo costo. Benítez et al. (2000) y Benítez et al. (2002)
realizaron estudios preliminares para formular y evaluar características de productos
cárnicos elaborados con carne de pollo mecánicamente deshuesada con incorporación de
plasma sanguíneo bovino y glóbulos rojos considerando la importancia nutricional y el
aprovechamiento de estos constituyentes básicos de la sangre en la formulación de
embutidos. Se evaluó el rendimiento del producto, humedad, proteínas, aminoácidos y
calidad microbiológica de cuatro productos formulados. Los resultados no mostraron
diferencias significativas en el rendimiento del producto, humedad, proteínas, y calidad
microbiológica de los cuatro productos. Lo anterior indica que las proteínas del plasma se
pueden utilizar para sustituir las proteínas de la carne. Estos resultados fueron similares a
los encontrados por Márquez et al. (1995), quienes sustituyeron 50% de carne de res por
plasma en la elaboración de productos cárnicos emulsificados sin afectar el rendimiento y
contenido de proteico del producto final. Posteriormente, Benítez et al. (2002) realizaron la
27
evaluación de la calidad nutricional y aceptabilidad de un producto formulado con carne de
pollo deshuesada mecánicamente, plasma y glóbulos rojos de bovino para alimentación
animal. Se encontró que las proteínas del producto son altamente digeribles con un 92,40%
de digestibilidad aparente y un índice de eficiencia proteica probado en ratas de 2,18 g / g
de proteína ingerida; lo anterior, sustenta que las fuentes de proteínas utilizadas en la
formulación del producto son capaces de favorecer y sustentar el crecimiento de animales
jóvenes.
Benítez et al. (2008) también propusieron la suplementación de harina de yuca con
plasma sanguíneo bovino en sustitución de la harina de trigo para elaboración de un
producto panificable (galleta) y se evaluó la composición proximal y las características
microbiológicas de este producto. Se demostró la alta aceptabilidad sensorial y
microbiológica de este tipo de producto que puede ser susceptible de ser elaborado en
países en desarrollo utilizando harina de yuca en sustitución de harina de trigo y
enriquecido por un subproducto con proteína de alto valor biológico como el plasma
sanguíneo bovino. Una ración de 100 g de galleta formulada con harina de yuca y plasma
bovino sanguíneo aporta de 10% a 11% de los requerimientos proteicos diarios para un
escolar de 10 a 12 años.
En Colombia en investigaciones más recientes se ha estudiado el aprovechamiento
del plasma sanguíneo bovino en la alimentación humana, incorporándolo a los alimentos
como fuente de proteína de bajo costo. Isaza et al. (2010) investigaron la influencia del
método de extracción, purificación y concentración del plasma bovino hidratado como
reemplazo de la proteína cárnica en la elaboración de salchichón, comparado con una
fuente comercial por medio de análisis bromatológico, microbiológico, sensorial e
28
instrumental. Se encontró que el plasma obtenido por centrifugación presentó mayor
porcentaje de proteínas que el obtenido comercialmente y que el incremento en la
incorporación de plasma sanguíneo bovino implica una disminución en el porcentaje de
grasa en el producto final y una disminución de mermas o aumento de rendimiento después
del tratamiento térmico del producto. La evaluación microbiológica del producto formulado
con plasma sanguíneo bovino hidratado demostró el cumplimiento de los requisitos
sanitarios y no presenta riesgo para el consumidor.
Se reporta un estudio reciente de crioprotección de la estructura nativa de las
proteínas del plasma relacionada con las propiedades funcionales de las proteínas del
plasma sanguíneo bovino realizado por Rodriguez Furlán et al. (2012) en donde se propuso
la utilización del oligosacárido inulina como agente protector y se comparó con la glucosa y
la sacarosa durante el proceso de liofilización. Se investigó la estabilidad térmica de la
proteína en un intervalo de concentración de azúcar protector de 5-15% (p/v) y a diferentes
pH. Los resultados de las propiedades térmicas de las proteínas (temperatura de
desnaturalización y entalpía), demostraron que el efecto estabilizador de la inulina es mayor
que el de la glucosa y la sacarosa. Los cambios en las propiedades funcionales pueden
determinar el uso de una proteína como un aditivo de un producto alimenticio o invalidar su
uso. Los resultados también mostraron que el intercambio iónico y la ultrafiltración
mejoran la capacidad emulsionante de las proteínas plasmáticas mientras que tiene poco
efecto sobre las otras propiedades funcionales.
29
2.2.3. Plasma como componente de medios para cultivos sumergidos
El plasma sanguíneo bovino tiene un contenido importante de proteínas (6 a 8%),
las cuales pueden servir como fuente de nitrógeno en medios de cultivo para
fermentaciones sumergidas industriales. De esta manera, el plasma puede aprovecharse en
la industria microbiológica para la obtención tanto de biomasa celular (por ejemplo, en el
caso de los cultivos iniciadores), como para la obtención de diferentes metabolitos.
Tabla 7. Composición del medio MRS.
Componente Concentración (g/L)
Polipeptona 10,00 g
Extracto de carne 10,00 g
Extracto de levadura 5,00 g
Glucosa 20,00 g
Tween 80 1,08 g
Fosfato diácido de potasio 2,00 g
Acetato de sodio 5,00 g
Citrato de amonio 2,00 g
Sulfato de magnesio 0,20 g
Sulfato de manganeso 0,05 g
pH: 6,4 ± 0,2 8 a 25ºC
Fuente: Man et al. (1960).
2.2.3.1. Cultivo de bacterias probióticas
En la búsqueda de medios de cultivo económicos para la producción de
Lactobacillus sp., varios investigadores han estudiado la posibilidad de sustituir los
componentes nitrogenados del medio comercial MRS (Man, Rogosa y Sharpe) por las
proteínas del plasma sanguíneo bovino enteras o hidrolizadas enzimáticamente. Este medio
contiene como fuentes de nitrógeno peptona, extracto de carne y levadura que proporcionan
los niveles adecuados de este elemento para el crecimiento de lactobacilos. Como fuente de
30
carbono contiene glucosa, fosfato de sodio como regulador del pH y como inhibidor de
bacterias gram negativas acetato de sodio (ver ).
Se ha observado que, al utilizar las proteínas del plasma bovino la masa celular de
lactobacilos obtenida es significativamente alta, de alrededor del 74% respecto al
crecimiento obtenido en medio MRS. Así es factible utilizar esta valiosa fuente de proteína
en la producción económica de probióticos Hyun y Shin (1998). Se han reportado un muy
pequeño número de estudios sobre la utilización del plasma sanguíneo bovino como
sustrato de medio de cultivo a fin de promover la producción de productos de valor
agregado en la industria cárnica. Barboza et al. (1994) utilizaron plasma sanguíneo bovino
entero a diferentes niveles de incorporación (25%, 50% y 75%), adicionando glucosa y
sacarosa como fuente de carbono y lo enriquecieron con extracto de levadura. Se comparó
la eficiencia del medio elaborado con plasma sanguíneo bovino con el medio MRS. Los
resultados mostraron que la incorporación del plasma bovino sanguíneo como fuente de
nitrógeno y la adición de sacarosa o glucosa como fuente de carbono, es suficiente para
soportar un crecimiento adecuado de L. plantarum y L. casei. Hyun y Shin (1998)
propusieron la utilización del plasma sanguíneo bovino para la producción económica de
probióticos; también estudiaron la tasa de sobrevivencia de las cepas producidas en este
medio conservadas por liofilización. Para tal fin se prepararon hidrolizados enzimáticos de
plasma de sangre bovina usando una proteasa seleccionada industrialmente a fin de sustituir
la fuente de nitrógeno orgánico por el hidrolizado de plasma. Se comparó el crecimiento
celular de Lactobacillus sp. en el medio a base de hidrolizados de plasma con el medio
comercial MRS. La producción de masa celular de cepas de Lactobacillus sp en el medio a
base de hidrolizados de plasma sanguíneo bovino fue significativamente alta 5,2×l09
31
UFC/mL. El hidrolizado de proteína de la sangre en el medio también mejoró la tasa de
supervivencia de la cepa durante la liofilización y la sacarosa fue seleccionada como el
estabilizador más eficaz del medio en el mismo proceso. Es de aclarar que en este estudio
no se medió el grado de hidrólisis del plasma, el contenido de nitrógeno asimilable del
hidrolizado enzimático y se trabajó con un máximo de contenido inicial de proteína en los
medios de cultivo de 30,2 g/L.
2.2.3.2. Componente de medios de cultivo especiales
El plasma sanguíneo bovino puede suministrar también nutrientes valiosos para
medios de cultivo especiales requeridos para la producción de sustancias de interés
farmacológico. En particular, se ha patentado la utilización del plasma sanguíneo bovino en
medios líquidos de fermentación para la producción de ácido hialurónico (Chong y Mun,
1988), el cual es ampliamente utilizado en cirugías estéticas y en la industria cosmética.
Asimismo, se ha patentado el uso del plasma como componente de medios para la
producción de sustancias anticoagulantes (Nagoya y Saiono, 1988) y para el cultivo de
células animales (Kazuo et al., 1991).
2.3. Vida útil de productos cárnicos
La vida útil es el período durante el cual los productos alimenticios, bajo
condiciones definidas recomendadas, conservan características sensoriales, químicas,
físicas y microbiológicas deseables y seguras durante su almacenamiento (Kilcast y
Subramaniam, 2000). Estas características integran en gran parte la calidad de los
alimentos, además de las nutricionales declaradas en la etiqueta. En el momento en que
32
alguna de ellas se considere como inaceptable, el producto ha llegado al fin de su vida útil
(Singh, 2000).
El proceso de deterioro de la carne y sus derivados es causado principalmente por el
crecimiento de una pequeña fracción de bacterias iniciales, que son llamados organismos
específicos de deterioro (SSO, por sus siglas en inglés), los cuales producen alteraciones
por acumulación de subproductos metabólicos durante las etapas de proceso, distribución y
almacenamiento (Nychas et al., 2007; Kreyenschmidt et al., 2010). Cuando los SSO
superan el nivel máximo aceptable causan decoloración, cambios en la textura, el olor, el
sabor y la formación de superficie babosa. Por ello, el final de la vida útil puede ser
definido por un cierto nivel máximo aceptable de SSO o un nivel inaceptable en los
atributos sensoriales del producto (Borch et al., 1996; Nychas et al., 2007; Kreyenschmidt
et al., 2010).
En estudios de flora microbiana alterante en productos cárnicos envasados se ha
encontrado que las bacterias ácido lácticas (BAL) son consideradas como los principales
microorganismos responsables. Estas bacterias intervienen en los procesos de alteración de
los alimentos por la fermentación de los azúcares formando ácido láctico, limo y dióxido de
carbono, que desencadenan en la caída del pH y en la aparición de olores y sabores
extraños. Este hecho afecta sus atributos sensoriales y el grado de aceptación del producto
(in't Veld, 1996; Pérez, 2003). Los cambios sensoriales producidos por las BAL aparecen
después que ellas alcanzan la fase de crecimiento estacionario (Korkeala y Björkroth,
1997). Se ha demostrado que cinco grupos de bacterias de ácido láctico pueden causar la
formación de baba viscosa (Korkeala y Björkroth, 1997). Sobre la base de homología de
ADN-ADN, cuatro de estos grupos contienen cepas de Lactobacillus sake, mientras que
33
solo una cepa de Leuconosoc gelidum toc (amelibiosum Leuconostoc) formó el quinto
grupo. La que más incidencia tiene en el aumento de la viscosidad superficial o lodo
viscoso son las cepas de L. sake pertenecientes al grupo uno (Mäkelä et al., 1992).
2.4. Microorganismos alterantes en jamón
Los microorganismos alterantes del jamón cocido, son generalmente adquiridos en
etapas posteriores a la cocción en el momento de tajado y empaque. En general la calidad
final del jamón depende de la materia prima utilizada (pH, contenido microbiano, o grasa) y
las condiciones de procesamiento (Talens et al., 2013). En Colombia, la Norma Técnica
define el jamón como “Producto cárnico procesado, cocido, embutido, moldeado o
prensado, elaborado con músculo sea éste entero o troceado, con la adición de sustancias de
uso permitido” NTC 1325 (2008). Las alteraciones de la carne, el jamón y otros productos
cárnicos está causada principalmente por microorganismos psicrótofros, levaduras y mohos
que son responsables de la producción de sustancias de mal olor como acetoína y los ácidos
acético, butírico, isobutírico e isovalérico, entre otros, afectando al grado de aceptación del
alimento ((Dainty y Hibbard, 1980; Pérez, 2003; Rodríguez, 2004). Dentro de este grupo de
microorganismos alterantes se destacan las BAL. Específicamente, Leuconostoc
mesenteroides se ha aislado frecuentemente como microorganismo responsable de
alteración en diversos tipos de productos cárnicos tales como jamón cocido, salami,
productos curados, salchichas cocidas tipo viena y Frankfurt, entre otros (Korkeala y
Alanko, 1988; Björkroth y Korkeala, 1996; Holley y McKellar, 1996; Samelis et al., 1998;
Zhang y Holley, 1999).
34
En productos cárnicos, el desarrollo de estos microorganismos reaparece en la cadena
de producción por contaminación post-proceso luego de que el producto ha sido sometido a
tratamiento térmico (78±0,2°C). Esta contaminación cruzada se da principalmente en las
etapas de corte y el envasado del producto (Hwang y Huang, 2010; Liu et al., 2012). El
desarrollo y la velocidad de crecimiento de dichos microorganismos y la alteración del
producto dependen de la temperatura de almacenamiento,(Ossa et al., 2010). En estudios de
evaluación del grado y tipo de contaminación bacteriana durante las etapas de elaboración
de jamón cocido tajado y almacenado a 4°C y 12°C, se ha encontrado que L. sake y L.
mesenteroides sbsp. mesenteroides son los principales agentes causantes de deterioro
debido a la recontaminación en la sala de corte (Samelis et al., 1998). Por ello, se ha
propuesto el crecimiento de BAL para la estimación de vida útil de jamón cocido tajado.
2.5. Métodos de estimación de vida útil en productos cárnicos
La vida útil se puede determinar al someter a estrés un producto, siempre y cuando
las condiciones de almacenamiento sean controladas. Se pueden realizar las predicciones de
vida útil mediante modelos matemáticos (para evaluación de crecimiento y muerte
microbiana), pruebas en tiempo real (para alimentos frescos de corta vida útil) y pruebas
aceleradas (para alimentos con mucha estabilidad) (Charm, 2007). Para predecir la vida útil
de un producto es necesario en primer lugar identificar o seleccionar la variable cuyo
cambio es el que primero identifica el consumidor como una baja en la calidad del producto
(Brody, 2003). Posteriormente es necesario analizar la cinética de la reacción asociada a la
variable seleccionada, que depende en gran medida de las condiciones ambientales. Una
vez identificadas las principales vías de deterioro y los factores intrínsecos y extrínsecos
35
que limitan el tiempo de estabilidad de los alimentos y modifican sus atributos sensoriales,
se puede aplicar el modelamiento matemático para la estimación de la vida útil
(Gudmundsson y Kristbergsson, 2009; Buelvas, 2013).
La vida útil de las carnes empacadas al vacío se define como el tiempo necesario para
que la concentración de BAL alcance aproximadamente 106 UFC/g (Borch et al., 1988).
Esta determinación de la vida de anaquel es un tema de debate: Samelis et al. (1998),
reportaron que el deterioro no fue visible en jamón empacado al vacío que contenían más
de 108 UFC/g de BAL después de dos semanas de almacenamiento a 4°C y 12°C. Estos
resultados concuerdan con los reportados por,Korkeala y Lindroth (1987); Korkeala et al.
(1989) quienes sugirieron un nivel de 107 UFC/g para que un embutido sea considerado
como inaceptable para el consumo.
2.5.1. Modelos utilizados para determinar la vida útil de productos cárnicos
En las últimas décadas, para el estudio y análisis de la microbiología de alimentos se
hecho uso de las matemáticas y la estadística para desarrollar modelos que describan y
predigan la evolución de los microorganismos en los alimentos. Estos modelos se clasifican
en modelos primarios, secundarios o terciarios, los cuales, después de ser consolidados y
aplicados, logran predicciones robustas y seguras sobre el comportamiento de los
microorganismos en alimentos que son reproducibles interpolando entre puntos para
condiciones que no se han ensayado (Tejedor et al., 2000; Yarce, 2014). Al desarrollo de
modelos matemáticos que describen la evolución del crecimiento, supervivencia e
inactivación en el tiempo de unidades formadoras de colonia viables bajo condiciones
ambientales y de cultivo determinadas, se les ha denominado modelos primarios (Aguirre,
36
2013). En estos modelos, el objetivo es describir la evolución del número total de células de
una población bacteriana (cinética de crecimiento) a través de un sencillo conjunto de
parámetros cinéticos: fase de latencia (LDP), velocidad de crecimiento específica (µmax) y
máxima densidad poblacional (Nmax) (Swinnen et al., 2004). Los parámetros más
estudiados con estos modelos primarios son la temperatura y el pH, por ser factores
fundamentales en el crecimiento de microorganismos. Su selección obedece a la facilidad
relativa para ser determinados sin requerir demasiado tiempo o equipos instrumentales
avanzados, además de estar siempre presentes en cualquier proceso de producción de
alimentos (Davey, 1993; McMeekin y Ross, 1996; Fernández et al., 2011; Yarce, 2014).
Para la estimación de la vida útil en productos cárnicos refrigerados, el modelo que más se
utiliza es la ecuación de Gompertz modificada (Zwietering et al., 1990):
{ } (1)
donde Nt es el logaritmo decimal del número de microorganismos al tiempo t; A es el valor
asintótico cuando el tiempo decrece indefinidamente (equivale aproximadamente al
logaritmo decimal del número inicial de microorganismos ); C es la diferencia entre la
máxima línea asintótica de la curva de crecimiento y la línea asintótica menor [(equivale a
Nmax – No) (log UFC/mL)]; M es el tiempo requerido para alcanzar la máxima velocidad de
crecimiento; B es la velocidad de crecimiento máxima relativa al tiempo M.
Para describir el efecto de la temperatura y otros factores intrínsecos sobre los
parámetros de crecimiento, es necesario inicialmente realizar ajustes al modelo primario,
para poder calcular los parámetros cinéticos derivados de la ecuación de Gompertz,
37
mediante las ecuaciones propuestas por Buchanan (1990) que describen la velocidad de
crecimiento máxima (µmax), el tiempo de generación (tg), la fase de latencia (LPD) y la
población máxima (M):
(2)
(3)
(4)
. (5)
Otro modelo propuesto para la estimación de la vida útil es la ecuación de Monod-
Hinshelwood, debido a que ésta ecuación considera que el tiempo en el cual ocurre o se
desarrolla la alteración de los alimentos está directamente relacionado con el tiempo de
generación del microorganismo predominante, que en productos cárnicos se ha
considerado el consorcio de BAL (McMeekin y Ross, 2002), la cual depende de μmax y se
calcula con las siguientes expresiones (Cabezas y Enrique, 2015):
(6)
⁄ (7)
donde ts es el tiempo necesario para que se desarrolle la alteración (tiempo de vida útil); Ns,
es la población de seguridad (UFC/g), es decir, la concentración a la cual las BAL producen
38
cambios apreciables en productos cárnicos y que es reportada por Borch et al. (1988) como
106; No es la población inicial presente en el producto (UFC/g); y Tg es el tiempo de
generación de la población alterante especifica (días).
De otro lado, los modelos secundarios permiten estimar y modelar el
comportamiento de la población microbiana en un alimento a través del tiempo, hallando
los parámetros cinéticos del crecimiento de dicha población, haciendo uso de los factores
propios del producto como: pH, actividad de agua, concentración de sales y nitritos, entre
otros y condiciones de almacenamiento como temperatura, humedad relativa y atmósfera,
entre otros (McMeekin, 2007).
Generalmente se utiliza una combinación de modelos primarios y secundarios para
la predicción de la vida útil bajo condiciones dinámicas. Con esta práctica se han realizado
predicción de los recuentos microbianos utilizando el modelo logístico modificado y la
ecuación de Arrhenius (Kreyenschmidt et al., 2010). Para su aplicación se ha consolidado
un enfoque de dos pasos así: se utilizan modelos primarios para describir el crecimiento de
los organismos específicos de deterioro en función del tiempo como el modelo modificado
Gompertz, Baranyi y Roberts o el modelo logístico y modelos secundarios para describir la
dependencia de la temperatura sobre el crecimiento de los organismos específicos de
deterioro tales como, el modelo de Arrhenius, el modelo de raíz cuadrada (SRM) o las
superficies de respuesta (Labuza y Riboh, 1982; Bratchell et al., 1990; Ross y McMeekin,
1991; Whiting, 1995; McDonald y Sun, 1999) El modelo de Arrhenius presenta el
inconveniente de no ajustar adecuadamente cuando el crecimiento microbiano se mide por
debajo o por encima de la temperatura óptima de crecimiento del microorganismo de
39
estudio (Nuñez de Villavicencio, 2011). Sin embargo, este modelo se ha utilizado para
modelar el crecimiento de Staphylococcus aureus en hamburguesa (Beldarraín et al., 2007).
Asimismo, Limbo et al. (2010) emplearon este modelo para predecir la vida útil de
carne picada envasada en atmósfera modificada a diferentes temperaturas de
almacenamiento.
Para la estimación de la vida útil en productos refrigerados, la mayoría de modelos
desarrollados están referidos a los SSO y describen su crecimiento en función de la
temperatura, ya que este es el factor más importante (Zwietering et al., 1991; McMeekin et
al., 1992). Para su aplicación, se ha consolidado un enfoque de dos pasos. En el primer
paso, se utilizan modelos primarios para describir el crecimiento de los SSO en función del
tiempo como el modelo modificado Gompertz, Baranyi y Roberts o el modelo logístico
(Zwietering et al., 1990; Whiting, 1995; McDonald y Sun, 1999) y, en el segundo paso, se
emplean modelos secundarios para describir la dependencia de la temperatura sobre el
crecimiento de los SSO tales como el modelo de Arrhenius, el modelo de raíz cuadrada
(SRM) o las superficies de respuesta (Labuza y Riboh, 1982; Bratchell et al., 1990; Ross y
McMeekin, 1991; Whiting, 1995; McDonald y Sun, 1999).
Los modelos terciarios incorporan los dos primeros niveles de modelos (primarios y
secundarios) a softwares informáticos con el fin de facilitar la resolución de las ecuaciones
de estos modelos. Un ejemplo de estos softwares es el Pathogen Modelling Program, que
hace uso de modelos con múltiples variables basados en el uso de la función de Gompertz
en combinación con el análisis de superficie de respuesta (Pérez, 2003; Santíesteban y
López, 2008). Dentro de este grupo de predictores de vida útil se encuentra también el
Seafood Spoilage Predictor (empresa, país) el cual permite cuantificar los efectos de la
40
temperatura, en productos perecederos como carne, productos del mar y lácteos, a través de
microorganismos específicos de deterioro en estos alimentos (Dalgaard et al., 2002).
2.5.2. Microbiología predictiva
La microbiología predictiva es un nuevo método de estimación de vida útil; ha sido
definida por Santíesteban y López (2008) como una rama de la microbiología de alimentos
que estudia las respuestas microbianas frente a varios factores ambientales que se pueden
controlar dando como resultado respuestas que son cuantificables mediante ecuaciones
matemáticas. La microbiología predictiva está basada en la premisa de que las respuestas de
poblaciones de microorganismos a factores medioambientales son reproducibles y que, por
lo tanto, es posible, interpolando entre puntos, predecir el comportamiento de esos
microorganismos para condiciones que no han sido ensayadas. Lo anterior significa que es
posible estimar la calidad y seguridad alimentaria por monitoreo de las condiciones de
almacenamiento (temperatura, atmósfera gaseosa, humedad, etc.), o las propiedades
intrínsecas del alimento (aw, valor de pH, potencial redox, etc.) y, posteriormente, aplicar
una base de modelos predictivos (McMeekin et al., 1993). Los modelos de predicción
microbiológica se pueden derivar de teorías mecánicas o de la teoría de probabilidades, lo
cual definirá el fundamento matemático de cada modelo que terminará siendo cinético o
probabilístico. La elección y su aplicación específica, está ampliamente determinada por el
tipo de microorganismo y la variable de respuesta. Los investigadores de la microbiología
predictiva se han enfocado en modelar el efecto de la fluctuación de temperatura a la que se
almacenan los alimentos, sobre las primeras dos fases de desarrollo microbiano, bajo el
supuesto de que si la población microbiana alcanza la fase estacionaria, el producto está
deteriorado o presenta riesgos para la salud del consumidor (Buchanan, 1993; McMeekin et
41
al., 1993; Baranyi y Roberts, 1995; Ross, 1996). Si se conoce el comportamiento de la flora
bacteriana durante una operación de procesado en un producto cárnico, se podría estimar la
supervivencia y crecimiento de un microorganismo de interés. Estas estimaciones, se basan
en la relación matemática que existe entre la velocidad de crecimiento microbiana y las
condiciones ambientales (Baranyi y Roberts, 1995).
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49
Capítulo III.
LACTIC ACID BACTERIA IN THE FOOD INDUSTRY AND THEIR CULTURE MEDIA
Bacterias ácido lácticas en la industria alimentaria y sus medios de cultivo
Pedro J. Barragán**; Óscar J. Sánchez*; Liliana Serna***
Abstract
Lactic acid bacteria (LAB) are currently of great importance given their increasing use in
the improvement of human and animal health and nutrition. They present complex
nutritional requirements, reason why their production costs are high. Research efforts are
being made aimed at evaluating different substrates for their production as well as the
production of valuable metabolites from them. The purpose of this paper is to expose the
main research and development trends for LAB production for industrial purposes with
emphasis on the culture media required for their growth. Web of Science databases as
well as Google Patent Search tool were used in order to gather and analyze the scientific
and technical information published in the last twelve years related to LAB and their culture
media. The use of milk, industrial cheese whey, cane molasses, hydrolyzed starches,
lignocellulosic materials, organic food waste and bovine blood plasma, among others, has
been proposed for Lactobacilli cultivation with the purpose of reducing costs and
increasing performance for their production. Research groups and centers have the
responsibility of intensifying their efforts to offer highly efficient technological alternatives to
the industry that allow the production and application of LAB as a factor of growth for the
food sector. In addition, research in prebiotic ingredients or additives derived from LAB
allowing the enhancement of the benefits to the consumer must be continued. In this
* PhD, Research Group on Food and Agro-industry, Universidad de Caldas, Calle 65 No. 26-10, 170004, Manizales,
Colombia. E-mail: [email protected]
** PhD(c), Universidad de Caldas, Calle 65 No. 26-10, 170004, Manizales, Colombia. E-mail: [email protected]
*** PhD, Research Group on Lactid Acid Bacteria and their Bio-technological Industrial Applications, Faculty of Engineering
and Business, Universidad Nacional de Colombia at Palmira, Colombia, E-mail: [email protected]
50
regard, it is necessary to increase the international visibility of Colombian scientific
production in this area.
Key words: Lactobacillus, patent search, probiotics, starter culture, submerged
fermentation.
Introduction
At the beginning of the 20th century the concept of lactic acid bacteria (LAB) emerged as
an independent group. Today this group shows a huge biotechnological potential, and it is
present in a large number of fermentative food processes destined for human consumption
such as dairy, vegetables, meat and bakery products, as well as in silage for animal food
(Ramírez et al., 2011; Lee et al., 2013). These bacteria not only contribute to the
development of the organoleptic, rheological and nutritional characteristics of foods, but
also generate unfavorable environments for the development of pathogenic
microorganisms such as Bacillus, Pseudomonas, Listeria and Escherichia among others,
given their bio-conservative capacity to produce antimicrobial substances (Topisirovic et
al., 2006; Cizeikiene et al., 2013). In addition to this important role in bio-conservation
processes, some strains of lactic acid bacteria belonging to the genus Lactobacilli are
beneficial to human and animal health due to their potential to reduce enteric diseases in
humans and farm animals, and the subsequent contamination of food products derived
from them (Axelsson, 1998; Ávila et al., 2010; Argyri et al., 2013). The purpose of this
paper is to expose the main research and development trends for production of lactic acid
bacteria for industrial purposes with emphasis on the culture media required for their
growth.
Search procedure In this review, focused on presenting the alternatives of culture media for the production of
Lactobacilli in the last 12 years, the study was divided into two parts: A synthetic literature
review on the generalities of LAB, and a systematic review on specific media for cultivation
of Lactobacilli. With this purpose, the Web of Science databases, consisting of KCL
(Korean Journal Database), Russian Science Citation Index, SciElo Citation Index,
51
Springer and ScienceDirect, was used. The following search terms were used: 1) for the
Title field: "Lactobacillus" with connector "AND" and in Topic field: "culture media"; 2)
published between 2005 and 2016; 3) type of document: articles; 4) language (English,
Portuguese and Spanish). Once the records were obtained, filters were used focused on
the ten research areas in which this type of studies are done. In order to reduce the search
size, the results were refined by taking as research domain "Science and Technology" and
even more specific research areas of this type of studies such as: "Food Science and
Technology", "Applied Biotechnology and Microbiology", " Microbiology", "Applied
Chemistry", and "Chemical Engineering".
Using the Web of Science search engine the internal analysis of articles obtained in the
last twelve years (a reduced sample greater than 500 articles) was performed using the
following criteria: 1) The ten most important research areas; 2) the thirteen authors
registered as the most important in these research areas; 3) the record of publications in
the same period of time; and 4) the ten most important countries in this type of study. From
this reduced sample, about 60 articles were selected using the following exclusion criteria:
1) Reports that do not contribute to the objective of this review by not making explicit the
culture media for LAB; 2) papers that do not report the type of microorganism, substrate or
supplement, type of fermentation, fermentation conditions, and biomass production. The
extracted information was compiled in a MS Excel spreadsheet, designed with the search
criteria used. In this format, some works published prior to the time period covered by this
review were also included given their relevance and pertinence. In addition, patents
reported between 2000 and 2016 on Lactobacilli were consulted through the Google
Patent Search using the same search criteria indicated above.
Search results on culture media for lactic acid bacteria
The initial search performed on Lactobacillus culture media, once the search criteria and
the respective filters were applied, showed 594 records, which were analyzed for this
review. Figure 1 illustrates the 13 authors who have published on Lactobacilli more
frequently in the last twelve years. These authors belong to research groups from Canada,
Italy, South Africa, England, Poland, Japan, Argentina, Belgium, and the United States.
Table 1 shows the 25 affiliation organizations of these authors. Taking into account the
52
classification of research areas used by Web of Science, the articles found belong to the
following five research areas in descending order: Applied Microbiology and Biotechnology
(196), Microbiology (176), Food Science and Technology (163), Molecular Biology and
Biochemistry (31), Agriculture (28).
The ten countries with the highest participation in studies on culture media for Lactobacilli
in the world in the last twelve years are shown in Figure 2. It is noteworthy that only three
records corresponding to Colombian researchers appear in Web of Science in the last
twelve years, ie a 0.5% share. The amount of publications in the last twelve years was
also consulted for this search in the selected databases and the results are illustrated in
Figure 3.
Patents
The literature reports an important amount of patents on new Lactobacillus strains,
processes for differentiating and quantifying lactic bacteria in some natural products, the
composition and enrichment of media for their cultivation, and processes for producing,
characterizing and applying products with probiotic properties obtained from Lactobacilli,
among others. Table 2 presents the list of patents found from 2005 to August 2016
regarding Lactobacilli.
Figure 1. Most frequently published authors working on culture media for Lactobacilli in
the period 2005-2016.
53
Table 1. Amount of publications of the 25 main organizations to which the research groups
working on Lactobacilli belong between 2005-2016.
Organization (Country) Records Participation
percentage
Institut National de Recherche Agronomique (INRA, France) 13 2.180
Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas
(CONICET, Argentina)
11 1.852
Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC, Spain) 11 1.852
Universidad of São Paulo (Brazil) 11 1.852
Agriculture and Agri-Food Canada (Canada) 10 1.684
Istituto di Scienze di Alimentari (Italy) 9 1.515
Universidad Nacional de Tucumán (Argentina) 9 1.515
Universiti Putra Malaysia (Malaysia) 8 1.347
Islamid Azad University (Iran) 7 1.178
Jiangnan University (China) 7 1.178
Seoul National University (South Korea) 7 1.178
Technische Universitat Munchen (Germany) 7 1.178
Centro de Referencia de Lactobacilos (CERELAC, Argentina) 6 1.010
Instituto de Investigación de la Leche (Uruguay) 6 1.010
Tohuko University (Japan) 6 1.010
University of Manchester (United Kingdom) 6 1.010
Universidad de Vigo (Spain) 6 1.010
Università della Basilicata (Italy) 5 0.842
Universiteit Gent (Belgium) 5 0.842
Universidad of Helsinki (Finland) 5 0.842
Université Laval (Canada) 5 0.842
Universidad Nacional del Litoral (Argentina) 5 0.842
54
Stellenbosch University (South Africa) 5 0.842
University of Tehran (Iran) 5 0.842
Wageningen University (Netherlands) 5 0.842
Figure 2. Distribution by country of the institutions to which the authors of articles on
culture media for Lactobacilli belong in the period 2005-2016.
Figure 3. Amount of papers published on culture media for Lactobacilli in the period 2005-
2016.
It should be noted that the patents on Lactobacilli granted in the period 2000 to August
2016, show a great interest in the identification of new strains based on their natural
55
substrates (mainly dairy and meat products), as well as their potential use as preventive or
therapeutic agents against pathologies related to the human intestinal tract (Anonymous,
2005; Connolly, 2008; Bojrab, 2011; Farmer, 2014; Anonymous, 2016a). The companies
patenting in this topic aim their resources towards economic methods for production of
Lactobacilli cultures at industrial level. Most patent documents refer to the use of whey
(Yun et al., 2015), corn starch (Li y Liu, 2014) and even whole milk (Chen et al., 2013;
Anonymous, 2014b). In other cases, the inventors resort to the design of synthetic media
for the isolation of bioactive molecules, functional metabolites or production of LAB of
interest (Elli et al., 2002). For the enrichment of these media, the use of free bases,
ribonucleosides, deoxyribonucleosides, casein hydrolysates, hydroxyproline, and glutamic
acid is reported. Some patents introduce in their invention preservatives, which enable the
protection of Lactobacillus culture, both in the subculture and during storage. It should be
highlighted that, because of the recognized importance of probiotics, efforts are made to
design growth media enriched with constituents such as sulfur amino acids, ovalbumin,
bile powder, trehalose, and raffinose.
Table 2. Patents on Lactobacilli in the period registered 2000-2016.
Patent number Country Description Reference
EP 2316278
South Korea Method for producing fermented edible
plants or animals and foods containing
them
Choi et al. (2013)
US 8613964 United States Method for making shelf-stable poi food
products from dryland and wetland taro
Day y Boiser
(2013)
CA 2598539
Canada Lactic acid and Bacillaceae fertilizer and
method of producing it
Blais (2013)
CN 103857297 China Probiotic fruit drinks Anonymous
(2016b)
EP 0698347 Sweden Food composition containing reuterin Dobrogosz y
Lindgren (2006)
US 8697055 United States Probiotic based on lactic acid-producing
bacteria
Farmer (2014)
56
CN 103224895 China A novel strain of Lactobacillus reuteri for
use by improving autoimmune diseases
Anonymous
(2014a)
US 8748124 United States Biodegradation process and composition López et al.
(2014)
CN 101919879 China Method for preparing probiotics preparation
by taking attapulgite as carrier
Anonymous
(2012)
US 8815539 United States Methods for producing melanin and
inorganic fertilizer from fermentation
leachates
Popa y Nealson
(2014)
CN 103154235 China Improvement of Lactobacillus strains
immunomodulatory properties
Anonymous
(2016a)
CN 102994644 China Quantitative detection method and kit for
Lactobacillus plantarum and its application
Anonymous
(2014c)
US 7888062 United States Process and composition for the
manufacture of a microbial-based product
Garner y Flint
(2011)
CN 103550258 China Lactobacillus strains for regulation of the
immune response
Anonymous
(2015b)
US7344867 United States Selection and use of lactic acid bacteria for
reducing inflammation in mammals
Connolly (2008)
US 7901925 United States Strain of Lactobacillus delbrueckii ssp.
bulgaricus and compositions
Bojrab (2011)
CN103275921 China Method for improving cholate tolerance of
Lactobacillus
Anonymous
(2015a)
US 6340585 United States Synthetic medium for cultivation of
Lactobacillus and Bifidobacteria
Elli et al. (2002)
CA 2534013 Canada Lactobacillus as a preventive or therapeutic
agent against infections
Anonymous
(2005)
US 7901925 United States Strain of L. delbrueckii ssp. bulgaricus and
its composition
Bojrab (2011)
CN 102952772 China Enrichment of culture medium for L.
bulgaricus and method of preparation
Chen et al. (2013)
CN 103305435 China Method for preparation of L. plantarum
culture
Anonymous
(2014b)
CN 104212743 China Culture medium and method for high Li y Liu (2014)
57
density culture of L. amylolyticus
CN 104531596 China Improved culture medium with whey
proteins and their applications Yun et al. (2015)
CN 104560799 China Method of active bacterial preparation of
bacteriocins by L. plantarum ssp. plantarum
Zhang-LL
Hongxing (2015)
US 9265270 United States Lactobacillus culture and method for
producing it
Hoshi et al.
(2016)
Features of lactic acid bacteria
Lactic bacteria are chemo-organotrophic microorganisms. Their morphology appears as
cocci or bacilli, commonly associated in short chains, are Gram positive, non sporulated,
and aerotolerant. They are negative in the oxidase, catalase and benzidine tests. They
lack cytochromes and generally do not reduce nitrate to nitrite. These bacteria synthesize
lactic acid as the main product of carbohydrate fermentation (Axelsson, 2004; Waldir et al.,
2007; Stieglmeier et al., 2009; Vásquez et al., 2009; Bovo et al., 2014).
The LAB exhibit two metabolic pathways for fermentation of monosaccharides: Homolactic
fermentation or glycolysis (pathway Embden-Meyerhof-Parnas) and hetereolactic
fermentation of the 6-phosphoglucanate (6FG) or pentoses pathway. Consequently, LAB
have been classified as obligatory homofermentative, facultative heterofermentative, and
obligatory hetereofermentative microorganisms (Axelsson, 2004; Gänzle, 2015),
Acidolactic bacteria show slight proteolytic activity due to the proteases and peptidases
attached to the cell wall or released by them, as well as weak lipolytic activity due to the
action of intracellular lipases.
The culture media and main fermentation conditions for production of the main species of
Lactobacilli used for production of probiotics, starter cultures, and bacteriocins, are shown
in Table 3. Among the most individually studied Lactobacilli or mixture of them, isolated
from natural substrates, the following species should be highlighted for their probiotic and
bio-preservation activities: L. acidophilus, L. casei, L. delbruecki, L. plantarum, L.
helveticus, L. rhamnosus, and Bifidobacterium bifidum.
58
Culture media for lactic acid bacteria
A culture medium must contain the nutrients and growth factors required by the
microorganism and be free of contaminating microorganisms (Garcia et al., 2010). These
requirements are characteristic of each species. LAB present complex nutritional
requirements such as amino acids, peptides, derivatives of nucleic acids, vitamins, salts,
fatty acids or esters of fatty acids, and fermentable carbohydrates (Parra, 2010). These
requirements are usually met when the culture medium contains fermentable
carbohydrates, peptone meat, and yeast extract. In general, for Lactobacilli, it is desirable
for the nitrogen to be organic in the form of amino acids or peptides. In this sense,
glutamic acid, isoleucine and valine are considered growth factors and must be present in
the culture medium (González et al., 2008). Many species require the presence of
manganese, acetate and esters of oleic acid, especially Tween 80 (Berbegal et al., 2015).
According to Table 3 and Figure 4, it can be observed that most studies on the production
of Lactobacilli biomass still make use of whey and sugar cane molasses as source of
carbon and energy. In recent years, the use of fruit juices, as well as of by-products and
agro-industrial waste has gained importance for media formulation. The above
corroborates the research trend in the search for feedstocks of high availability and lower
cost with the purpose of reducing the sale price of the final products derived from the
Lactobacilli biomass.
In Latin America, different research efforts aimed at the use of native products for LAB
growth have been reported given the great availability of biological resources and the
economies with high weight of the agriculture and agro-industry in these countries. For
example, the growth kinetics of Lactobacilli with probiotic potential in the intestinal tract are
being studied in Mexico using the agro-industrial residue derived from the fermentation of
agave honey, a pre-Hispanic drink called pulque in that country (Yépez et al., 2013).
59
Table 3. Culture media and fermentation conditions for Lactobacillus production.
Microorganism Substrate Supplements Fermentation
conditions Biomass production
Type of
fermentation References
L. plantarum
WS417
Sterile molasses (5%,
10%, 20%, 25% and
30% )
25ºC, 30°C and
35ºC, 24 h, pH
5.2, 100 rpm
43×109 UFC/mL Discontinuous Ossa et al.
(2010)
L. plantarum 1 H1
L. plantarum 1
H2 (isolated from
pig large
intestine)
Medium 1: MRS
Medium 2: 20 g/L
sugar, 14 g/L soy
milk, 130 g/L whey,
30 g/L wheat bran
Medium 3: 15 g/L
sugar, 12 g/L soy
milk, 120 g/L whey,
10 g/L wheat bran
Medium 4: 10 g/L
sugar, 15 g/L soy
milk, 150 g/L whey,
15 g/L wheat bran
32°C, 24 h,
without pH
control
MRS: 1.0×108 UFC/mL
L. plantarum 1 H1 and
4.0×1012
UFC/mL L.
plantarum 1 H2
Medium 2: Not shown
Medium 3: 1.0×1013
UFC/mL L. plantarum 1
H1
Medium 4: 4.0×1014
UFC/mL L. plantarum
1 H2
Discontinuous Jurado et al.
(2013)
L. acidophilus, L.
casei, L.
delbruecki, L.
plantarum, L.
reuteri and
Bifidobacterium
bifidum
Medium 1: Sugar
cane molasses 32 g/L
Medium 2: UHT
wastewater 45 g/L
Medium 3: Sugar
cane molasses 32 g/L
YE: 5.0 g/L
YE:5.0 g/L
Lactobacillus
spp.: 37°C, 48 h,
100 rpm, 5-10%
oxygen
B. bifidum in
anaerobiosis
4.5 g/L-2.8 g/L B.
bifidum
3.8 g/L-3.4 g/L B.
bifidum
5.5 g/L Lactobacillus
spp.
Discontinuous Vargas et al.
(2004)
60
YE:5.0 g/L
Casein peptone:
10 g/L
Lactobacillus reuteri
DSPV002 of
porcine origin
(ileum)
Whey
Whey
PSQ
PSQ
<5% YE and
0.003% MnSO4
5% YE and 0.003
% MnSO4
<5% YE and
0,003% MnSO4
5% YE and 0.003
% MnSO4
37°C, 18 h Discontinuous Fusari et al.
(2014)
Lactobacillus sp.
(isolated from
pulque)
Medium1: Whole
UHT milk with 7%
lactose
Medium 2: Whole
UHT milk with 7%
lactose
Medium 2: 100%
salts of MRS
medium
Medium 4: 100%
salts of MRS
Medium 5: 100%
23°C, 29°C and
37°C, pH 6.4,
without agitation,
with 2 and 5%
inoculum, 34 h
35 to 42 g/L Discontinuous Yépez et al.
(2013)
61
Media 3-6: whey with
7% lactose
salts of MRS
medium and
0.25% YE
Medium 6: 100%
salts of MRS
medium and 5
g/L YE
Lactobacillus
plantarum
ATCC8014
Media 1 and 2: Sugar
cane molasses 3%
Medium 1: 0.5%
YE, ammonium
citrate and
sodium acetate
Medium 2: 0.5%
YE, sodium
acetate,
ammonium
phosphate and
ammonium
citrate, 0.1%
Tween 80 and
0.005% MnSO4
35 °C, 24 h,
150 rpm, 0.7
vvm
Medium 1: 0.0507
g/(L×h)
Medium 2: 0.0768
g/(L×h)
Discontinuous Villavicencio et
al. (1999)
Lactobacillus
plantarum
(NCIMB 11718)
and Lactobacillus
casei (NRRL -
1445)
Juice of Aloe vera
variety barbariensis:
25, 50, 75 and 100%
30 °C,150 rpm,
initial pH of
medium: 6,5
L. plantarum: 1×109
UFC/mL
L. casei: 1×1011
UFC/mL
Discontinuous González et al.
(2008)
Lactobacillus
helveticus
Whey permeate
(48g/mL of lactose)
YE: 20 g/mL,
casein peptone:
42 °C, controlled
pH 5.9, 25 h
μmax =0.477 h-1
Discontinuous Amrane (2005)
62
5 g/mL X= 4.0 g/L
Lactobacillus
acidophilus ACC,
L. acidophilus
IBB 01, L. casei
Imunitas, L.
casei YIT 9029,
L. gasseri K7, L.
johnsonii La1, L.
rhamnosus GG
Milk YE: 0.3, 0.5 and
1%
37 °C, 100 rpm,
controlled pH 6.5
UFC/ mL: 7.94×107-
6.30×109
Xmax: 1.2-3.5 g/L
μmax: 0.36-0.92 h-1
Discontinuous Avonts et al.
(2004)
L casei Shirota, L.
jonhs
Sugar cane juice
Coconut milk
Orange juice
Whey
37°C, 24 h 3.98×107 UFC/mL
1.58×108 UFC/mL
3.16×109 UFC/mL
1.58×108 UFC/mL
Discontinuous Magaña et al.
(2008)
L. delbrueckii ssp.
bulgaricus RR
(Univ. of
Minnesota)
Medium 1: MRS
Medium 2: glucose
(20g/L), Tween 80
(1.0 g/L), ammonium
citrate (2 g/L), sodium
acetate (5 g/L),
MgSO4 7H2O (0.1
g/L), MnSO4 (0.05
g/L), K2HPO4 (2 g/L)
Medium 2: Yeast
nitrogenous base
(5 g/L) and Bacto
casitone (10 g/L)
42°C, 12 h, pH
6.56
Medium 1: 1.62×108
UFC/mL
Medium 2: 1.28×108
UFC/mL
Discontinuous Kimmel y
Roberts (1998)
Lactobacillus casei
IMAU60214,
Lactobacillus
rhamnosus GG,
Wastewater from
corn nixtamalization
37°C, 48 h By absorbance (650
nm): L. casei 0.740, L.
helveticus 0.735, L.
Discontinuous Ramírez et al.
(2013)
63
Lactobacillus
helveticus
IMAU70129
(isolated from
commercial dairy
products)
rhamnosus 0.770
Lactobacillus
plantarum
LPBM10
(isolated from
fermented
cabbage),
Lactobacillus
casei ATCC 393
Uchuva pulp and
glucose solution
(14% p/p)
37 °C, 72 h,
microaerophilic
conditions
L. plantarum: from
1.64±1.57×109 to
3.23±3.35×109
UFC/mL
L. casei: from
5.40±2.36×108 to
7.34±7.88×108
UFC/mL
Discontinuous Cortés R
(2009)
Lactobacillus casei Deproteinized whey Glucose (0 %
and 5%)
Initial pH=6.05,
93 h
5.9×1010
UFC/mL Discontinuous Escobar et al.
(2010)
Lactobacillus
rhamnosus
ATCC 7469
Medium 1: Glucose
50 g/L and YE 60 g/L
Medium 2: Glucose
40 g/L and YE 60 g/L.
KH2PO4 2.7 g/L;
MgSO4.7H2O 0,2
g/L; MnSO4.H2O
0.05 g/L; Tween-
80 1 ml/L;
vitamins in
solution (g/L):
12.8 pyridoxine
HCl; pantothenic
acid 1.0, niacin
1.0, riboflavin 1.0
and folic acid 1.0.
37 °C, constant
pH 6.9, stirred-
tank fermenter,
N2 injection,
environment
without O2
Dilution rates:
from 0.05 to 0.4
h-1
; constant
volume 600 mL
Max cell viability.:
1.3×1010
UFC/mL
(from 5.86 to 7.61 g/L)
Yx/s from 2.9 to
3.7×1011
UFC/g
glucose (from 0.15 to
0.22 g/g glucose)
Continuous Ling et al.
(2006)
64
Lactobacillus casei WP from goat milk Batch regime: 37
ºC, pH 5.5,
effective volume
2 L, 300 rpm,
inoculum concn.
0.5-1.0 g/L,
concn., initial
substrate concn.
33-50 g/L, 20 h
Fed-batch
regime: 1 L
supernatant
replaced by 1 L
fresh culture
medium at 14 h
Productivity: 0.067
0.46 g biomass/(L×h)
X: 2.5-3.5 g/L
YX/S: 0.0990-0.16 g
biomass/g substrate)
5.17×109 UFC/mL
Fed-batch: 2.43×1010
UFC/mL
Discontinuous
Fed batch
Aguirre et al.
(2009)
Lactobacillus
paracasei HA9-2
(isolated from
humans)
Media 1 and 4: Whey
with 70 g/L
carbohydrates
Media 2 and 3: Whey
Medium 2:
MgSO4.7H2O
(0.3 g/L),
MnSO4.4H2O
(0,03 g/L)
Medium 3:
MgSO4.7H2O
(0.3 g/L),
MnSO4.4H2O
(0.03 g/L) and
Concn.
inoculum:
1.0×108
UFC/mL, pH:
5.0, 5.5 and 6.0
1.5 to 3.53×109
UFC/mL
Discontinuous Vázquez et al.
(2009)
65
YE (0.5%).
Medium 4: 0.5%
and 1.0% acacia
gum
Lactobacillus
plantarum
CIDCA 83114
(isolated from
Kefir grains)
Medium 1: WP with
80% lactose, 6% ash,
3% protein
Medium 2: WP
Galacto-
oligosaccharides
37°C,18 h Medium 1: 4.75×108
±7.07×107 UFC/mL,
μmax = 0.110 h-1
Medium 2: 4.0×108
UFC/mL
μmax = 0.160 h-1
Discontinuous Ayelén et al.
(2016)
Lactobacillus casei
var. rhamnosus
Whey 35-70 g/L lactose 37°C, pH 5.5,
300 rpm, volume
2 L, inoculum
concn. 0.5-1.0
g/L
YX/S = 1.5819 g/g
YP/S = 0.5684 g/g
X: 5 g/L
Discontinuous Alvarez et al.
(2010)
Lactobacillus
ramnosus
Apple juice
concentrate
Molasses
YE; tryptone;
wheat; soy; YE
and wheat; YE
and soy
YE; tryptone;
wheat; soy; YE
and wheat; YE
Initial pH 6.0, 2L
fermenter, 500
rpm, 4.3 L/min
air
Medium without
supplements: DOmax
=0.21, µmax=0.27 h-1
Max. biomass concn.
for medium with YE
and wheat: DOmax
=0.51, µmax=0.39 h-1
Medium without
supplements: DOmax
=0.21, µmax=0.13 h-1
Max. biomass concn.
Discontinuous Champagne y
Gardner
(2008)
66
and soy for medium with YE
and wheat: DOmax
=0.51, µmax=0.47 h-1
µmax: maximum specific speed of growth; X: concentration of cellular biomass; YP/S: product yield from substrate; YX/S: biomass yield from
substrate; YE: yeast extract; WP: whey permeate.
67
Figure 4. Type of substrate and percentage of use in media of culture for lactobacilli in the
last fifteen years.
In Colombia, the use of wastewater sludge from sugar cane processing as well as the sugar
cane molasses has been proposed as feedstocks given the importance of the sugar
industries including the industry for production of non-centrifugal sugar or solid brown sugar
(called panela in that country) (Ossa et al., 2010). Likewise, the utilization of lignocellulosic
materials for LAB production with probiotic functionality by submerged fermentation, such as
wheat bran, has been reported (Jurado et al., 2013). Obtained Lactobacilli may be used to
produce probiotics, which can colonize the intestine when consumed orally. This would open
new possibilities in the diversification of the feedstocks basis for industrial fermentation
processes. Other researchers have proposed the use of cereals like barley and malt for the
development of lactic acid bacteria with probiotic potential such as L. plantarum NCIMB 8826
and L. acidophilus NCIMB 8821 (Rathore et al., 2012). Complex or enriched liquid media are
currently used supplemented with some components that increase the production costs of
lactic cultures. Particularly, as can be seen in this review, the nitrogen sources used such as
the yeast extract, tryptic casein peptone, and meat extract are of high cost in industrial
fermentations. Table 3 shows the most widely used substrates in the last twelve years,
supplements added to the media, conditions of fermentation, type of fermentation, and data
on production of biomass obtained.
68
Culture conditions for Lactobacilli
The temperature for the cultivation of mesophilic and thermophilic LAB found in this study
range from 23 to 37°C and 42°C, respectively, with incubation times from 18 to 93 hours and
pH from 5.2 to 6.9. The discontinuous cultivation was the type of fermentation used in almost
all the studies reviewed (Table 3), which does not allow a more precise evaluation of other
alternative regimes that are more efficient like the continuous culture. The highest production
of viable cells (4.0×1014 CFU/mL) found during the preparation of this review corresponded to
a batch system for two L. plantarum strains in a medium with 10 g/L white sugar, 15 g/L soy
milk, 150 g/L whey and 15 g/L wheat bran. More research efforts are required at bench and
pilot levels in continuous and discontinuous fermentations in order to assess the efficiency of
alternative cultivation regimes for Lactobacilli production.
Applications of LAB
Lactic acid bacteria are increasingly used in the improvement of human and animal health
and nutrition (Süle et al., 2014; Senz et al., 2015). It has been known for several decades
that LAB have an inhibitory potential in food against the development of altering
microorganisms and pathogens, which is useful for prolonging shelf-life and increasing the
hygienic quality of foods (Forney et al., 2004; Concha-Meyer et al., 2011; Siamansouri et al.,
2013). Therefore, LAB are widely investigated as natural biological agents because of their
antimicrobial potential and as a response to the demand for safe, fresh or minimally
processed foods, without preservatives and with a longer shelf-life (Serna y Enríquez, 2013).
In general, from the industrial viewpoint, LAB are being applied in the production of
antimicrobial substances, sugar polymers, sweeteners, aromatic compounds, vitamins, and
are used as probiotics (Leroy y De Vuyst, 2004; Aro y Rojas, 2013).
The term probiotic was redefined in 2002 by the United Nations Food and Agriculture
Organization (FAO) and the World Health Organization (WHO) as a "living microorganism
that ingested in the right amounts confers a healthy benefit to the host" (Miranda et al., 2013;
Colombo et al., 2014). Fermented dairy products are the most used foods to carry probiotic
bacteria. The probiotic strains predominating in these dairy derivatives are L. acidophilus, L.
casei, and B. lactis (Geng y Boyer, 2014; Tabasco et al., 2014). These bacteria have been
69
used in recent decades as probiotic supplements in functional food and animal nutrition
(Senz et al., 2015). Also, a limited amount of LAB species are used as starter culture in the
meat industry; the main cultures are L. sakei, L. curvatus, L. plantarum, Pediococcus
pentosaceus, and P. acidilactic .
Conclusions
Most papers on Lactobacilli production are focused on the production of lactic acid and, in
some cases, on evaluating the growth of Lactobacilli of industrial importance, mainly for
human and animal health, and food. Research efforts are being made all over the world to
improve the production systems, as well as cultivation methods and media for LAB
production. In the case of Colombia, research groups and centers have the responsibility of
intensifying their efforts to offer highly efficient technological alternatives to the national
industry that allow the production and application of LAB as a factor of growth for the food
sector. In this regard, among other aspects, it is necessary to increase the international
visibility of Colombian scientific production in this area, as it is evident from the results of this
review. Thus, national researchers will contribute to supply the demand for high quality
scientific knowledge on starter microorganisms for fermented foods such as meat, dairy and
vegetables, among others, as well as on the culture media in which they are grown (including
the use of agro-industrial wastes as raw materials). In addition, research in prebiotic
ingredients or additives derived from LAB allowing the increase of the benefits to the
consumer must be continued.
Acknowledgements
The authors express their gratitude to the Fund of Science, Technology and Innovation of the
Colombian General System of Royalties for the financing of this work, through the project
"Implementation of an integral strategy through biotechnology innovation for the utilization of
waste in the Department of Caldas ".
70
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77
78
79
80
81
82
Capítulo V
Diseño y optimización de un medio de cultivo a base de plasma sanguíneo bovino
hidrolizado enzimáticamente para el crecimiento de Lactobacillus plantarum ATCC
8014 por fermentación sumergida
Pedro J. Barragán PhD. (c) 1, Óscar J. Sánchez PhD.
1*, Lorenzo J. Martínez H. M.Sc.
2
1 Profesor Asociado, Integrante Grupo de Investigación en Alimentos y Agroindustria, Departamento de
Ingeniería, Universidad de Caldas, Manizales, Colombia. 1* Profesor Asociado, Director de Grupo de Investigación en Alimentos y Agroindustria, Departamento de
Ingeniería, Universidad de Caldas, Manizales, Colombia. 2 Profesor Asociado, Departamento de Matemáticas, Universidad de Caldas, Manizales, Colombia.
RESUMEN
Dada la importancia y el creciente uso de los lactobacilos en la salud y alimentación
humana, se requiere la búsqueda de medios alternativos más económicos para su cultivo. Los
subproductos del sector agroindustrial se han constituido en una fuente de estudio para este
fin dado su bajo costo y alta disponibilidad. El plasma sanguíneo bovino es uno de estos
residuos, proveniente de centrales de sacrificio que causa un impacto ambiental negativo
cuando es vertido en cuerpos de agua naturales. Sin embargo, tiene potenciales aplicaciones
biotecnológicas como fuente de nitrógeno en cultivos microbianos. La hidrólisis enzimática
de las proteínas del plasma utilizando endoproteasas conduce a la producción de péptidos de
diferentes tamaños con varias aplicaciones en la industria. A pesar de haberse realizado muy
pocos estudios sobre la utilización de plasma en la formulación de medios para el crecimiento
de probióticos y cultivos homolácticos, no se ha reportado en la literatura disponible el
empleo de hidrolizados enzimáticos del plasma como fuente de nitrógeno asimilable para su
crecimiento en fermentación sumergida. El objetivo de este trabajo fue evaluar la mayor
viabilidad de Lactobacillus plantarum ATCC 8014 en 18 medios de cultivo económico a base
83
de hidrolizados proteicos del plasma sanguíneo bovino por fermentación sumergida con
contenidos de nitrógeno asimilable desde 582 a 1097 mg/L, y de sacarosa de 20 a 80 g/L hasta
un tiempo de 60 horas a través de la metodología de volumen de respuesta y un método
numérico de optimización de Matlab (fmincon). Durante el estudio se encontró que el
tratamiento óptimo que permite maximizar la concentración celular de L. plantarum ATCC
8014 se asocia a una concentración de sacarosa de 80 g/L, un contenido de aminonitrógeno de
825 mg/L y un tiempo de cultivo hasta 34horas.
Palabras clave: Plasma sanguíneo bovino, Medio de cultivo, diseño, optimización,
fermentación sumergida.
INTRODUCCIÓN
La sangre bovina es un subproducto de la industria cárnica obtenido en el proceso de
producción de carne con un alto valor biológico representado en su contenido de proteína, sin
embargo, es considerado como un residuo en las centrales de sacrificio. La mayor parte de
esta sangre es vertida a los cuerpos de agua, lo que genera un gran poder contaminante debido
a la alta cantidad de sólidos totales (18%) y a una elevada demanda química de oxígeno
(DQO) cercana a los 500.000 mg O2/L (Park y Hyun, 2002; Del Hoyo et al., 2007; Rodriguez
et al., 2011). La mayor fracción de la sangre bovina está representada por el plasma (fracción
líquida de la sangre una vez removida las células) que corresponde al 60-65% (Linden y
Lorient, 1997). En particular, en los últimos años el uso de la fracción plasmática se ha
84
extendido en alimentación humana y animal para la formulación de embutidos, pudines,
panes, galletas y bebidas refrescantes, entre otros (Rodas et al., 1998; Figueroa et al., 2012;
Montero et al., 2012). En este contexto, el plasma sanguíneo bovino representa una materia
prima con potencial aplicación para el cultivo sumergido de lactobacilos a gran escala. Pero
esta alternativa ha sido poco explorada en la industria alimentaria. Barboza et al. (1994),
utilizaron el plasma sanguíneo bovino entero como fuente de proteína en la formulación de un
medio de cultivo para Lactobacillus casei y L. plantarum, preparando soluciones de plasma al
25, 50 y 75% y utilizando como fuente de carbono glucosa y sacarosa. Este medio fue
enriquecido con extracto de levadura y demás minerales del medio MRS, no se presentó
diferencias significativas en los promedios de crecimiento expresados como log10 UFC/mL
para glucosa y sacarosa (7,35 y 7,36). Se observó un mayor crecimiento de los
microorganismos de estudio en los medios formulados con 75% (log10 UFC/mL 7,42) y 50%
(log10 UFC/mL 7,38) de plasma y no se encontró diferencias entre los medios formulados con
50% y 25%, pero sí entre 25% (log10 UFC/mL 7,23) y 75%. Otros investigadores, como Hyun
y Shin (1998), han propuesto los hidrolizados de plasma de sangre bovino para sustituir las
fuentes de nitrógeno del caldo MRS y la glucosa como fuente de carbono para la producción
económica de probióticos. Estos hidrolizados, obtenidos luego de dos horas de digestión,
fueron usados para la preparación de varios medios con diferentes proporciones de plasma
hidrolizado y de caldo MRS preparado sin sus fuentes de nitrógeno; la evaluación
correspondiente se inició con un medio concentrado que contenía una parte en volumen de
hidrolizado de plasma por una parte de caldo MRS sin sus fuentes de nitrógeno, y se terminó
con un medio diluido que contenía una parte de hidrolizado de plasma por diez partes de
caldo MRS sin fuentes de nitrógeno. Los resultados mostraron que el crecimiento celular fue
85
directamente dependiente del nivel de digestión y del contenido de proteína en el medio a
base de hidrolizado de plasma. La concentración máxima de células viables se presentó a las
24 horas con 5,2×109 UFC/mL que corresponde a un 74% del obtenido en el medio control
MRS. Para un aprovechamiento más eficiente de este residuo, la hidrólisis enzimática parcial
de sus proteínas tiene un gran potencial en la preparación de medios de cultivo a base de
plasma. En esta reacción, consistente en la ruptura, catalizada por enzimas, de los enlaces
peptídicos que estructuran las cadenas proteicas, se consume una molécula de agua en el
ataque nucleofílico por cada enlace roto, y se liberan grupos aminos y carboxilos terminales
(Adler-Nissen, 1986; Figueroa et al., 2015); estos grupos aminos liberados constituyen una
fuente importante de nitrógeno asimilable para fermentaciones industriales. En el medio
comercial MRS de propagación de lactobacilos, estas fuentes de nitrógeno orgánico están
conformadas por peptona, extracto de carne y extracto de levadura (Hyun y Shin, 1998;
Kimmel y Roberts, 1998) pero estos componentes son de elevado costo. Por lo tanto, adquiere
relevancia sustituir estas fuentes de nitrógeno por los hidrolizados enzimáticos de proteínas
del plasma sanguíneo bovino que son de bajo costo, al igual que la sustitución de glucosa del
medio MRS por sacarosa comercial. Sin embargo, estos estudios no tuvieron en cuenta el
control y seguimiento al grado de hidrólisis de las proteínas del plasma, la concentración de
nitrógeno asimilable aportada por el hidrolizado de proteínas del plasma y para un mayor
aprovechamiento del plasma, no trabajar concentraciones de proteínas bajas.
El objetivo del presente trabajo consistió en el diseño y optimización de un medio de
cultivo para Lactobacillus plantarum ATCC 8014, a base de hidrolizados enzimáticamente de
proteínas del plasma sanguíneo bovino. Para ello se sustituyeron las fuentes de nitrógeno del
medio MRS original por el plasma hidrolizado, y se sustituyó la fuente de carbono (glucosa)
86
por un azúcar de menor costo (sacarosa). En particular se evaluó el efecto de la fuente de
nitrógeno medida como nitrógeno asimilable por los lactobacilos (aminonitrógeno), la fuente
de carbono y el tiempo de fermentación. Este estudio se orienta a la obtención de un medio de
cultivo a base de un residuo de la industria cárnica de menor costo y alta disponibilidad, que
pueda potencialmente ser ofrecido a empresas productoras de cultivos iniciadores de la
industria alimenticia.
MATERIALES Y MÉTODOS
Obtención del plasma sanguíneo bovino
El plasma sanguíneo bovino fue suministrado por la empresa Frigodán Ltda. (Bogotá,
Colombia) en una presentación en polvo de partícula fina con un contenido proteico de 70±2
g/L y se reconstituyó con agua destilada hasta una concentración aproximada de 70 g/L
similar a la de plasma obtenido de las centrales de sacrificio. Al plasma reconstituido se le
determinó antes de su uso la humedad por Gavimetría, grasa por el método Soxlhet, minerales
por Absorción atómica y pH, igualmente microbiológicos (recuento de Staphylococcus
coagulasa positivos, recuento de esporas de Clostridium sulfito reductor, detección de
Salmonella spp. y recuento de Escherichia coli, de acuerdo con los procedimientos de la
Norma Técnica Colombiana NTC 1325 (ICONTEC, 2008). La determinación de proteína de
los preparados proteicos de plasma se realizó por él método de Biuret (1960).
87
Obtención y conservación de la cepa
Se utilizó una cepa liofilizada de Lactobacillus plantarum ATCC 8014 que se obtuvo
del banco de cepas de la ATCC (American Type Culture Collection, EUA). Para la activación
de la cepa se realizaron suspensiones del liofilizado en solución salina estéril (1% p/v) para su
posterior siembra en agar MRS (Oxoid, Inglaterra) e incubación a 37ºC durante 48 horas.
Luego de este período de incubación, se trasfirieron alícuotas de 0,5 mL de estos cultivos a
criotubos de 1,5 mL con adición de 15% de glicerol (v/v) como crioprotector para su posterior
conservación mediante congelación a -70 ºC. Se prepararon lotes de varios tubos para cada
cepa a conservar utilizando en su totalidad un tubo para cada prueba evitando que las cepas se
congelen y se descongelen varias veces. Estos procedimientos se realizaron en el Laboratorio
de Microbiología de Alimentos de la Unidad Tecnológica de Alimentos del Departamento de
Ingeniería de la Universidad de Caldas. Para su activación, la cepa se transfirió de los
criotubos a un medio enriquecido de infusión cerebro corazón BHI, por sus siglas en inglés;
(Oxoid, Inglaterra) y se incubó por 24 horas a 37°C. Posteriormente, se realizó la propagación
de la misma en caldo MRS por 36 horas de incubación a 37°C sin agitación y en aerobiosis,
para su posterior uso como inóculo. Los medios a base plasma con proteínas hidrolizadas y el
medio control (MRS) se sembraron con un volumen de inóculo de 2,5% (v/v) y se incubaron
en matraces de 250 mL con un volumen de trabajo de 150 mL a 37°C en aerobiosis, sin
agitación durante 60 horas con muestreo a intervalos de 12 horas para determinar el
crecimiento celular como Unidades Formadoras de Colonia por mililitro (UFC/mL) (Ossa et
al., 2010). Para la identificación de los lactobacilos, se realizaron pruebas bioquímicas de
88
observación microscópica (tinción de Gram), oxidasa para la determinación de la enzima
citocromo oxidasa con reactivo de Kovacs y prueba de Catalasa.
Hidrólisis enzimática del plasma sanguíneo bovino
La hidrólisis enzimática de las proteínas del plasma sanguíneo bovino se llevó a cabo
en un reactor de vidrio de 3 L con camisa de recirculación de agua. Se empleó una serina
endoproteasa (EC 3.4.21.62), la subtilisina A, que es una enzima bacteriana denominada
comercialmente como Alcalase 2.4 L FG (Novozymes, Dinamarca) grado alimenticio. La
hidrólisis se realizó a una temperatura de 61°C y a un pH de 8,5 según ficha técnica de la
enzima Novozymes (2012), Alcalase 2.4 L FG Novozymes, Bagsvaero (Denmark). Para el
control y registro del pH programado del proceso se utilizó un titulador automático con
agitador magnético (SI Analytic TL7000, Alemania) con electrodo combinado de vidrio
(temperatura de 0 a 100°C), el cual emplea una solución estandarizada de NaOH 1,53 N en
agitación constante acoplado a un baño termostatado (Lauda RE 420S, Alemania) con
termocupla PT100, tal como se observa en el montaje de la Figura 1. La inactivación de la
enzima se realizó por calentamiento a 90°C.
Para la obtención de los seis niveles de nitrógeno asimilable para la formulación de los
medios a base de hidrolizados de proteínas del plasma, inicialmente se preparó una solución
de plasma reconstituido con un contenido inicial de 73,20 g/L de proteína, la cual sirvió de
base para la preparación de los medios. Estos medios se prepararon mezclando un porcentaje
de volumen de plasma con agua destilada (ver Tabla 2). A los medios así obtenidos se les
determinó su concentración inicial de aminonitrógeno como su concentración inicial de
89
proteína, a fin de definir la dosis de la enzima comercial que se usó durante los ensayos de
hidrólisis columna cuatro de la Tabla 2.
Figura 1. Montaje para hidrólisis enzimática de las proteínas del plasma sanguíneo bovino.
A los hidrolizados obtenidos se les determinó el aminonitrógeno final y la proteína
final. Estos hidrolizados enzimáticos se emplearon para sustituir las fuentes descritas de
nitrógeno del medio comercial MRS de propagación de lactobacilos. Para la determinación
del nitrógeno asimilable a cada uno de los seis hidrolizados de proteínas del plasma sanguíneo
bovino obtenidos, se empleó el método potenciométrico de AOAC (1980).
Diseño experimental
A fin de determinar el efecto de la incorporación de hidrolizados de proteínas del
plasma sanguíneo con diferentes concentraciones de proteína y de la fuente de carbono sobre
el crecimiento celular de Lactobacillus plantarum ATCC 8014, se estructuró un diseño
90
experimental con tres factores (concentración de sacarosa, contenido de aminonitrógeno y
tiempo). La concentración de sacarosa tuvo tres niveles: C1 (20g/L), C2 (50g/L) y C3 (80 g/L).
La concentración de aminonitrógeno (AMN) de los hidrolizados tuvo seis niveles: AMN1
(1097 mg/L), AMN2 (1024 mg/L), AMN3 (802 m/L), AMN4 (645 mg/L), AMN5 (632mg/L) y
AMN6 (582 mg/L). El tiempo con seis niveles (en h):0, 12, 24, 36, 48 y 60. Se realizaron 18
tratamientos con tres repeticiones para un total de 54 observaciones de la variable de
respuesta para cada uno de los seis tiempos de fermentación analizados (ver Anexo 1). Cada
tratamiento correspondió a un medio de cultivo al cual se le evaluó la concentración de
células viables en UFC/mL durante la fermentación. Las variables fijas fueron la temperatura,
nivel de inóculo y concentración de los demás constituyentes del medio MRS distintos al
extracto de carne, extracto de levadura y peptona.
Para la identificación de los efectos significativos de cada factor de estudio y, por
tanto, los mejores tratamientos, se aplicó un análisis de varianza (ANOVA) mediante el
software Statgraphics Centurion versión XVI (Statistics Graphical Corporation, EUA) que se
ilustra en la tabla 4.
Preparación de medios de cultivo
Para la preparación de los medios de cultivo se utilizaron medios líquidos formulados
de hidrolizados de proteínas de plasma sanguíneo bovino de acuerdo con los niveles del
diseño experimental descrito, con el fin de sustituir las fuentes de nitrógeno del medio
comercial MRS (peptona, extracto de carne y extracto de levadura). La concentración de los
componentes de los medios líquidos para 1 L de hidrolizado de proteínas del plasma
91
sanguíneo bovino que no se variaron en el diseño experimental (en g/L) fue: sacarosa (20, 50
y 80), fosfato diácido de potasio (2,0), acetato de sodio (5,0), citrato de amonio (2,0), sulfato
de magnesio (0,20) y sulfato de manganeso (0,05). El contenido de la fuente de nitrógeno
viene determinada por el diseño experimental. La fuente de carbono original del medio MRS
se sustituyó por sacarosa comercial a fin de disminuir costos, y se adicionó a los medios de
acuerdo con el diseño experimental descrito en la sección anterior. Para evidenciar la
viabilidad de la sustitución de la fuente de carbono, se realizará ensayos previos de
crecimiento celular de Lactobacillus plantarum ATCC 8014 por duplicado mediante
fermentaciones en medios líquidos en matraces de 250 mL con incorporación de plasma
entero entre el 50 y 75% con concentración de sacarosa y glucosa de 20g/L iguales a las del
medio MRS. Los demás constituyentes del medio se dosificaron según composición proximal
del medio MRS. Los medios se ajustaron a un pH de 6,2 con ácido cítrico y finalmente se
esterilizaron en autoclave vertical (Tecnik, Colombia) a 120°C por 15 minutos a una presión
de 14 psi, incluido el medio control MRS. Se usaron erlenmeyer de 250 mL con un volumen
efectivo de 150 mL y se sembraron con un nivel de inóculo de 2,5% (v/v). Estos medios
inoculados se incubaron a 37°C en cámara (Binder, Alemania) sin agitación durante 60 horas
con muestreo a intervalos de 12 horas para monitorear el crecimiento celular como UFC/mL.
Análisis de volumen de respuesta
Encontrados los efectos e interacciones significativas del diseño experimental, se planteó el
modelo de regresión multivariado de segundo orden que permite describir el comportamiento
adecuado de los datos de acuerdo con la siguiente ecuación:
92
(1)
Donde Y=concentración celular en (UFC/mL), X1=concentración de sacarosa (g/L),
X2=contenido de aminonitrógeno en (mg/L) y X3=tiempo (h).
Se empleó el software Matlab versión R2015b (Mathwors, EUA) el cual generó un
sistema de coordenadas tridimensional en el que se asocia a cada eje un factor de estudio y en
escala de colores se irradia o propaga la variable de respuesta, obteniendo así el volumen
correspondiente. Para hallar una región óptima de proceso, se recurrió a realizar cortes
transversales al volumen de respuesta sobre los ejes de cada factor de estudio, haciendo uso
del mismo software. Se realizó un ensayo para corroborar el óptimo.
Lo anterior, implicó obtener una ecuación de regresión considerando toda la región
experimental estudiada en el diseño. Con el fin de mejorar el ajuste del modelo, se acotaron
los rangos de experimentación de los tres factores de tal manera que se incluyeran las
observaciones con mayor valor de la variable de respuesta (concentración de células vivas). A
fin de obtener los valores de X1, X2 y X3 que maximice la variable de respuesta en el rango
experimental señalado, se aplicó una función de optimización fmincon o método numérico
de Matlab. Se realizó una comprobación experimental de punto óptimo calculado por el
método numérico en matraces de 250 mL por triplicado midiendo las UFC/mL.
93
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Los análisis microbiológicos realizados al plasma sanguíneo bovino deshidratado
como sustrato inicial para el diseño de los medios de cultivo de crecimiento de Lactobacilos
plantarum, se muestran en la Tabla 1. En esta tabla se observó ausencia de microorganismos
alterantes y patógenos en el plasma. Esto permitió el desarrollo de los lactobacilos sin
posibles barreras de inhibición o competición por el sustrato. Lo anterior posibilita la
utilización del plasma deshidratado comercial para la elaboración de medios de cultivo
líquido para el crecimiento de Lactobacillus plantarum ATCC 8014.
Tabla 1. Análisis físico-químicos y microbiológicos del plasma sanguíneo bovino entero
deshidratado.
Análisis Físico-químicos
pH 9,67
Grasa 1,01 %
Humedad 4,28 %
Proteína 73,28 %
Análisis Microbiológicos
Recuento de Staphylococcus coagulasa positiva, UFC/g < 10
Recuento de esporas Clostridium sulfito reductor, UFC/g < 10
Detección de Salmonella spp. /25 g Ausencia
Recuento de Escherichia coli /g < 3 bacterias/g
UFC: Unidades formadoras de colonias
Los resultados obtenidos en la hidrolisis enzimática de proteínas del plasma sanguíneo
bovino para la preparación de los medios se observan en la Tabla 2, en ella se muestran que
existe una relación directa entre la dosis de enzima (columna cuatro) y el contenido de
aminonitrógeno final (columna seis) en el hidrolizado de plasma, e inversa con el contenido
final de proteína (columna cinco). Este comportamiento durante la hidrólisis de las proteínas
94
del plasma es posible explicarlo, dado que en la reacción hidrolítica de las proteínas del
plasma sanguíneo bovino con proteasas, el contenido de aminonitrógeno en el medio es
función de la disociación de los grupos α-NH2 (grupos aminos liberados en la reacción) y
estos valores aumentan con el tiempo y luego tienden a valores constantes, que son
directamente proporcionales a la concentración inicial de enzima e inversamente
proporcionales a la concentración del sustrato (contenido de proteína) (Figueroa et al., 2012).
Tabla 2. Formulación de medios de cultivo a base de hidrolizados enzimáticos de proteínas
del plasma sanguíneo bovino y su contenido de aminonitrógeno. Incorporación
de Plasma
entero
(%)
Proteína
inicial
(g/L)
Aminonitrógeno
inicial (mg/L)
Dosis de
enzima (g
Alcalasa /g
proteína)
Proteína
final
(g/L)
Aminonitrógeno
final (mg/L) Codificación
100 73,20 534 0,05 66,20 1097 AMN1 75 52,90 424 0,06 45,00 1024 AMN2 75 52,90 424 0,10 30,33 802 AMN3 50 36,30 254 0,05 43,10 582 AMN6 50 36,30 254 0,06 32,40 632 AMN5 50 36,30 254 0,10 29,33 645 AMN4 Observaciones: los valores reportados corresponden al promedio de tres repeticiones
De otro lado, el grado de hidrólisis como una relación entre el número de enlaces
peptídicos escindidos y el número de enlaces peptídicos totales en la proteína nativa por
unidad de peso, aumenta en la reacción hidrolítica cuando se incrementa la dosis de enzima y
por ende la formación del complejo sustrato-enzima, lo cual es un comportamiento típico en
cinética enzimática de proteínas (He et al., 2002).
Los ensayos previos para evaluar la sustitución de la fuente de carbono original del
medio MRS (glucosa) por otra fuente alternativa de menor costo (sacarosa) arrojaron los
resultados que se muestran en la Tabla 3. Estos datos indican que no se presentó diferencia
95
significativa en el crecimiento por el tipo de azúcar utilizado. Estos resultados son
relativamente cercanos a los obtenidos por Barboza et al. (1994) en un medio de plasma
sanguíneo bovino entero con 17 g/L de proteína, pero suplementados con extracto de levadura
a diferencia de los presentados en estos ensayos que no fueron suplementados; en el caso de
glucosa obtuvo 2,23×107
UFC/mL y de 2,29×107
UFC/mL para sacarosa. Esto se debe a que
los lactobacilos están caracterizados por poseer un metabolismo netamente fermentativo, en
donde su desarrollo celular y obtención de energía para su crecimiento y desarrollo está
asociado a la degradación de las hexosas, en el caso particular del medio formulado con
sacarosa, este azúcar es susceptible de ser desdoblado por los lactobacilos en glucosa y
fructuosa y entrar a la ruta metabólica utilizada para la fermentación de hexosas (vía Embden-
Meyerhof-Parnas; Axelsson, 2004; Gänzle, 2015), por lo que los azúcares formados son
fácilmente incorporados en la ruta metabólica, permitiendo la sustitución de la glucosa por la
sacarosa en el medio. Por lo anterior se decidió continuar el estudio utilizando como fuente de
carbono la sacarosa comercial de menor costo.
Tabla 3. Crecimiento celular de Lactobacillus plantarum ATCC 8014 con glucosa y sacarosa
en plasma entero reconstituido a las 24 horas de fermentación.
Medio UFC/mLR1 UFC/mLR2 UFC/mLR3 Promedio Desviación
estándar
50% incorporación de plasma
entero (36 g/L proteína) con
sacarosa (20 g/L)
2,36×107
2,31×107 2,35×10
7 2,34×10
7 2,65×10
5
50% incorporación de plasma
entero (36 g/L proteína) con
glucosa (20 g/L)
2,50×107 2,48×10
7 2,47×10
7 2,48×10
7 1,53×10
5
75% incorporación de plasma
entero (53 g/L proteína) con
sacarosa (20 g/L)
3,13×107 3,26×10
7 3,22×10
7 3,20×10
7 6,66×10
5
75% incorporación de plasma
entero (53 g/L proteína) con
glucosa (20 g/L)
2,86×107 2,95×10
7 2,89×10
7 2,90×10
7 4,58×10
5
MRS 2,97×108 2,94×10
8 2,95×10
8 2,95×10
8 1,53×10
6
UFC/mLR1, R2, R3: unidades formadoras de colonia repetición uno, dos y tres.
96
Los resultados de biomasa viable de L. plantarum ATCC 8014 en los ensayos previos
en medios líquidos de plasma entero (ver Tabla 3), indican que no se presentó diferencia
significativa en el crecimiento por el tipo de azúcar utilizado. El mayor crecimiento promedio
se presentó en el plasma con mayor contenido de proteína y como fuente de carbono sacarosa.
Una vez realizado el análisis de varianza y tenido en cuenta que todos los efectos de
interacción están activos, se procedió a obtener el modelo de regresión con base en la
ecuación (1) la expresión correspondiente es la siguiente:
(2)
Tabla 4. Análisis de varianza del diseño experimental.
Efectos Suma de cuadrados Grados de
libertad
Cuadrado Medio F-Razón p-valor
X1 8,96906E15 2 4,48453E15 177,04 0,0000
X2 1,97983E15 5 3,95967E14 15,63 0,0000
X3 7,06547E15 5 1,41309E15 55,78 0,0000
X1*X2 4,96446E15 10 4,96446E14 19,60 0,0000
X1*X3 1,79636E16 10 1,79636E15 70,92 0,0000
X2*X3 5,11738E15 25 2,04695E14 8,08 0,0000
X1*X2*X3 1,16942E16 50 2,33884E14 9,23 0,0000
Residuo 5,47153E15 216 2,53311E13
Total 6,32255E16 323
El coeficiente de determinación hallado explica el 44,63%, de variabilidad del modelo,
indicando que no es una variabilidad adecuada para la obtención de un tratamiento óptimo.
Los valores promedio que toma la variable de respuesta en el diseño experimental realizado,
con sus respectivos tratamientos, se muestran en el Anexo 1. El tratamiento con mayor valor
97
promedio de concentración de celular correspondió a una concentración de sacarosa de 80 g/L
y un contenido de aminonitrógeno de 802 mg/L a un tiempo de 24 h. Este máximo de
concentración celular a las 24 h coincide con el máximo obtenido cuando se emplea el medio
MRS comercial (que contiene 867 mg/L de aminonitrógeno), el cual alcanzó un valor
promedio de 1,49 ×109 UFC/mL. Cabe destacar que no necesariamente tiempos prolongados
de cultivo y contenidos altos de aminonitrógeno, dan lugar a las mayores concentraciones de
células como se puede observar para los tratamientos con 1097 mg/L de AMN y tiempos de 48
y 60 h (ver Anexo 1).
En el volumen de respuesta hallado con el modelo (Figura 2a), se puede apreciar que
los mayores crecimientos de unidades formadoras de colonia están presentes en las regiones
asociadas con contenidos de sacarosa superiores a 70g/L, contenido de aminonitrógeno
mayores a 800 mg/L y tiempos mayores a 30 horas. En la Figura 2a, se puede observar una
región de proceso más adecuada, para el caso del factor tiempo, a medida que trascurre el
tiempo se observa un incremento en las UFC/mL, lo cual es típico en el crecimiento de
lactobacilo, considerando que estos tiempos corresponden a la fase de crecimiento
exponencial, encontrándose que hidrolizados de proteínas del plasma con altos contenidos de
proteína (entre 66 y 45 g/L) pueden ser adecuados para el crecimiento de Lactobacillus
plantarum ATCC 8014 como se observa en la Figura 2b. Se puede apreciar en la Figura 2b,
que las regiones que favorecen un mayor crecimiento bacteriano se asocian a tiempos
cercanos a 36h, niveles de sacarosa mayores a 75 g/L y contenidos de aminonitrógeno
mayores a 800mg/L. Es de aclarar que concentración de aminonitrógeno del medio comercial
MRS es de 867 mg/L la cual se encuentra en la región estudiada.
98
Figura 2. (a) Volumen de respuesta para concentración de células en UFC / mL Lactobacillus
plantarum ATCC 8014 en medios a base de hidrolizados de plasma sanguíneo bovino.
Figura 2. (b) Vista lateral del volumen de respuesta para concentración de células en UFC/L
Lactobacillus plantarum ATCC 8014 en medios a base de hidrolizados de plasma sanguíneo
bovino.
Dado los resultados anteriores, se posee una región de proceso adecuada, mas no un
óptimo por lo anterior se procedió a acotar los rangos experimentales de los tres factores de
estudio, que permita identificar el óptimo hallado experimentalmente, estos rangos fueron;
concentración de sacarosa de 50 a 80 g/L, contenido de aminonitrógeno de 645 a 802 mg/L y
20
40
60
80
600
700
800
900
1000
0
10
20
30
40
50
60
Sacarosa[g/L]
Aminonitrógeno[mg/L]
tiem
po[h
]
UF
C/m
L
-0.5
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
x 107
20
30
40
50
60
70
80
500
600
700
800
900
1000
1100
0
10
20
30
40
50
60
Sacaarosa [g/L]
Aminonitrógeno [mg/L]
tiem
po [
h]
UF
C/m
L
-0.5
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
x 107
99
tiempo de 12 a 36 horas. De esta región acotada, se obtuvo un nuevo coeficiente de
determinación de 0,9094 que explica un 90,94% de la variabilidad del nuevo modelo que se
ilustra en la siguiente ecuación:
(3)
Con la ecuación (3) se generó un volumen de respuesta que se observa en la Figura 3a.
Es de anotar que el modelo obtenido a partir de la acotación de la región de proceso, contiene
un máximo local obtenido numéricamente de 56.737.000 UFC/mL, y un máximo
experimental de 48.606.060 UFC/mL. Este óptimo obedece al siguiente tratamiento: X1=80
g/L de sacarosa, X2= 825 mg/L de aminonitrógeno y X3=33,69 horas de cultivo.
Figura 3 a. Volumen de respuesta acotado en contenido de aminonitrógeno entre 645 a 802
mg/L y en tiempos entre 12 a 36h, para concentración de células en UFC/mL Lactobacillus
plantarum ATCC 8014 en medios a base de hidrolizados de plasma sanguíneo bovino.
En el volumen de respuesta acotado (Figura 3a), se observan dos áreas de proceso en
donde presumiblemente se ubica un óptimo global. En la vista superior izquierda, se tiene un
mayor crecimiento celular a tiempos mayores a 40 h, concentración de sacarosa cercana a
20
40
60
80
600
700
800
900
1000
20
30
40
50
60
Sacarosa[g/L]
Aminonitrógeno[mg/L]
tiem
po[h
]
UFC
/mL
-0.5
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
x 107
100
80g/L y contenidos de aminonitrógeno superiores a 800 mg/L. En la zona de proceso inferior
derecha se aprecia un mayor crecimiento celular con concentraciones altas de sacarosa
cercana a 80 g/L, contenido a de aminonitrógeno menores a 800 mg/L y tiempos inferiores a
30 h. El óptimo global se ubicó en dicha región del volumen de respuesta acotado a través de
la maximización de la función objetivo, tal como se puede apreciar en la Figura 3c.
Figura 3 b. Vista lateral del volumen de respuesta acotado en contenido de aminonitrógeno
entre 645 a 802 mg/L y en tiempos entre 12 a 36 h, para concentración de células en UFC/mL
de Lactobacillus plantarum ATCC 8014 en medios a base de hidrolizados de plasma
sanguíneo bovino.
Por otro lado, es importante anotar que con valores bajos de concentración de sacarosa
(50 a 20 g/L) y de aminonitrógeno (800 a 600 mg/L) la concentración celular promedio tiende
a disminuir, como se ve en la tabla 5. Este comportamiento es similar al obtenido por Hyun y
20
30
40
50
60
70
80
500600
700800
9001000
1100
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
Sacarosa [g/L]
Aminonitrógeno [mg/L]
tiem
po [
h]
UF
C/m
L-0.5
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
x 107
101
Shin (1998), quienes utilizaron hidrolizado enzimático de plasma sanguíneo bovino mezclado
en proporciones iguales con caldo MRS con todos los constituyentes del medio MRS excepto
las fuentes de nitrógeno, pero con una concentración de glucosa de 40 g/L y con un contenido
de proteína del medio de cultivo de 30,20 g/L, en donde el crecimiento celular fue mayor en
medios que contienen más hidrolizado enzimático de plasma. Esto indica que el contenido de
aminonitrógeno disponible en el medio tiene un efecto significativo sobre el crecimiento
celular, tal como se corroboró con los resultados del análisis de varianza del diseño
experimental propuesto ver tabla 4. No obstante, cuando se utiliza hidrolizados enzimáticos
de plasma con contenidos muy altos de aminonitrógeno, se requieren altas concentraciones de
sacarosa para una adecuada producción celular, a diferencia del medio MRS comercial control
de propagación de lactobacilos, que con concentraciones de 20 g/L de sacarosa y 867 mg/L de
contenido de aminonitrógeno se obtuvo mayores concentraciones celulares(1,49×109
UFC/mL), posiblemente por la complejidad de las diferentes fuentes de nitrógeno amínico
presentes en este medio como el extracto de levadura, peptona de caseína y extracto de carne
que es un multisustrato con proteínas parcialmente hidrolizadas, altamente eficientes para el
cultivo de diferentes grupos de bacterias. También, muchas cepas de lactobacilos presentan
ligera actividad proteolítica debido a proteasas y peptidasas ligadas a la pared celular (Law y
Kolstad, 1983; citados por Bergey, 1992), que les permite realizar el procesos de proteólisis y
transporte de péptidos y aminoácidos al interior de la célula Poolman et al. (1995).
102
Figura 3c. Volumen de respuesta con el tratamiento óptimo, acotado en contenido de
aminonitrógeno entre 645 a 802 mg/L y en tiempos entre 12 a 36h, para concentración de
células en UFC/mL Lactobacillus plantarum ATCC 8014 en medios a base de hidrolizados de
plasma sanguíneo bovino.
El modelo matemático acotado muestra que existe una relación significativa de la
generación de biomasa viable respecto al tiempo; lo anterior, producto del crecimiento celular
típico del microorganismo fermentativo en donde a medida que transcurre el tiempo hay un
incremento en la biomasa viable. Los mayores registros de biomasa viable se encuentran en
tiempos superiores a 30 h hasta que se alcance la fase estacionaria a las 36 h.
En la Tabla 5 (representación de un subconjunto de los datos del diseño experimental
que se relacionan en el Anexo 1) se puede observar que la mayor concentración celular para
L. plantarum ATCC 801 correspondió a un medio con 80 g/L de sacarosa y un contenido de
802 mg/L de aminonitrógeno evaluado a un tiempo de 24 horas con valores de 48.606.060
UFC/mL para el resultado experimental; en este punto, el modelo de regresión para el modelo
acotado predijo una concentración de 46’929.000 UFC/mL, lo que demuestra su validez.
Una vez se definió el modelo de regresión acotado para la zona de interés, se halló el
óptimo global mediante un método numérico empleando la función fmincon de Matlab. Este
50
60
70
80 650700
750800
15
20
25
30
35
Aminonitrógeno[mg/L]
Sacarosa[g/L]
tiem
po[h
]
UF
C/m
L
0
1
2
3
4
5
x 107
X1=80
X2=825
X3=33.69
103
óptimo correspondió a un medio de cultivo con 80 g/L de sacarosa y 825 mg/L de
aminonitrógeno para un tiempo de 33,69 h (ver Figura 3c). A fin de validar estos resultados,
se realizó un cultivo por triplicado bajo las mismas condiciones predichas por el modelo
acotado; el valor de la variable de respuesta para el óptimo calculado (56’737.000 UFC/mL)
fue muy cercano al obtenido experimentalmente a nivel de laboratorio para las mismas
condiciones (55.106.060 UFC/mL) como se observa en la Tabla 5. Estos resultados confirman
la validez del enfoque metodológico aplicado.
Tabla 5. Concentración celular para Lactobacillus plantarum ATCC 8014 calculada por el
modelo de regresión acotado y promedio de concentración celular obtenida
experimentalmente a nivel laboratorio en UFC/mL. Se resaltan los resultados para el medio
óptimo.
Concentración de
sacarosa (g/L)
X1
Contenido de
aminonitrógeno
(mg/L)
X2
Tiempo
(h)
X3
Promedio
Crecimiento
celular (UFC/mL)
a nivel laboratorio
Y
Crecimiento celular
(UFC/mL) calculado
por el modelo
acotado
Y
Desviación
estándar
50 645 12 9.060.606 7.185.000 1326254
50 802 12 20.636.364 17.879.000 1949751
80 645 12 25.454.545 27.617.000 1529086
80 802 12 15.075.758 17.549.000 1748846
50 645 24 11.106.061 14.859.000 2653729
50 802 24 21.439.394 26.956.000 3900830
80 645 24 32.348.485 28.026.000 3056458
80 802 24 48.606.061 43.663.000 3495272
50 802 36 15.939.394 13.183.000 1949065
80 632 36 7.303.030 3.943.000 2375900
80 645 36 3.424.242 5.588.000 1530008
80 802 36 44.454.545 46.929.000 1749704
80 825 33,7 55.106.060 56.737.000
90 825 33,7 53.567.980 68.802.500
100 825 33,7 52.308.780 79.311.000
Utilizando el modelo de regresión acotado (ecuación 3), se extrapoló el
comportamiento del sistema a concentraciones de sacarosa mayores a las definidas en el
104
diseño experimental obteniéndose los resultados que se muestran en las dos últimas filas de la
Tabla 5. Sin embargo, se observa que concentraciones de sacarosa mayores a 80 g/L no
conducen a un aumento en la concentración celular, posiblemente, como resultado de la
inhibición por sustrato. Lo anterior indica que el modelo acotado no puede extrapolarse por
fuera de las condiciones para las cuales fue definido; asimismo, se corrobora que los rangos
de variación de los factores estudiados fueron escogidos apropiadamente para el
planteamiento del diseño experimental.
CONCLUSIONES
En este trabajo se diseñó y optimizó un medio de cultivo a base de hidrolizado
enzimático de proteínas del plasma sanguíneo bovino para el crecimiento de L. plantarum
ATCC 8014 por fermentación sumergida a nivel de laboratorio. Para tal fin, se hizo uso de la
metodología de volumen de respuesta que permitió identificar las condiciones del medio
óptimo: concentración de sacarosa de 80 g/L, contenido de aminonitrógeno de 825 mg/L y
tiempo de fermentación de 33,7 h; estas condiciones se definieron para una temperatura de
37°C, con agitación y un nivel de inóculo del 2,5% (v/v). La mayor concentración celular
calculada para este óptimo predicho por el modelo de regresión acotado fue de 5,67×107
UFC/mL, mientras el valor experimental promedio obtenido por triplicado fue de 5,5 ×107
UFC/mL. Las interacciones dobles y triples entre la concentración de sacarosa, el contenido
de aminonitrógeno y el tiempo de cultivo tuvieron un efecto significativo sobre el crecimiento
de la bacteria estudiada en medios a base de hidrolizados enzimáticos de proteínas del plasma.
105
Lo anterior demuestra la validez del enfoque metodológico utilizado para hallar un medio que
maximice la concentración celular del L. plantarum ATCC 8014.
Los resultados obtenidos permiten recomendar el estudio de la cinética de la
fermentación empleando el medio definido en este trabajo, con el fin de hallar los perfiles en
el tiempo de las principales variables del proceso. Este estudio cinético permitirá conocer el
rendimiento celular, la velocidad de crecimiento de la bacteria y las fases de su crecimiento a
nivel de banco. Esta información es relevante para el futuro diseño de un paquete tecnológico
basado en el aprovechamiento del plasma sanguíneo bovino en la obtención de cultivos
iniciadores de productos cárnicos.
ARADECIMIENTOS
Los autores expresan sus agradecimientos al Fondo de Ciencia, Tecnología e
Innovación del Sistema General de Regalías por la financiación del presente trabajo, a través
del proyecto “Implementación de una estrategia integral a través de innovación biotecnológica
para el aprovechamiento de residuos en el Departamento de Caldas” Igualmente, se agradece
el apoyo prestado por la Unidad Tecnológica de Alimentos de la Universidad de Caldas.
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108
Anexo 1. Resultados de la variable de respuesta (concentración de biomasa celular) de los 18
tratamientos del diseño experimental para cada uno de los seis tiempos de muestreo.
Concentración de
sacarosa (g/L)
X1
Contenido de
aminonitrógeno
(mg/L)
X2
Tiempo (h)
X3
Promedio
Crecimiento
celular (UFC/mL)
Y
DS
20 582 0 1.075.757 159.631
20 582 12 181.818 45.454
20 582 24 696.969 353.066
20 582 36 4.015.151 3.298.613
20 582 48 13.484.848 13.476.819
20 582 60 27.621.212 19.388.392
20 632 0 1.212.121 183.702
20 632 12 106.060 69.432
20 632 24 8.833.333 1.091.224
20 632 36 5.818.181 9.449.299
20 632 48 18.969.696 11.926.889
20 632 60 44.727.272 9.837.208
20 645 0 681.818 314918
20 645 12 133.152 76007
20 645 24 136.363 0,002099456
20 645 36 6.969.696 2727398
20 645 48 11.757.575 6711334
20 645 60 40.954.545 5505069
20 802 0 454.545 181.818
20 802 12 651.515 378.484
20 802 24 742.424 258.465
20 802 36 5.181.818 5.612.670
20 802 48 11.863.636 3.386.592
20 802 60 41.166.666 5.663.850
20 1024 0 5.575.757 8.909.825
20 1024 12 439.393 386.586
20 1024 24 742.424 769.153
20 1024 36 3.438.636 5.252.403
20 1024 48 6.090.909 9.489.119
20 1024 60 23.545.454 10.076.258
20 1097 0 4.212.121 6.980.689
20 1097 12 696.969 183.702
20 1097 24 590.909 6.914.073
20 1097 36 9.363.636 15.550.437
20 1097 48 1.742.424 1.022.811
20 1097 60 8.000.000 2.142.158
109
Concentración de
sacarosa (g/L)
X1
Contenido de
aminonitrógeno
(mg/L)
X2
Tiempo (h)
X3
Promedio
Crecimiento
celular (UFC/mL)
Y
DS
50 582 0 8.075.757 1.773.504
50 582 12 12.575.757 3.280.399
50 582 24 18.363.636, 4.323.919
50 582 36 6.893.939 659.221
50 582 48 1.303.030 617.133
50 582 60 2.181.818 681.818
50 632 0 7.681.818 1977664
50 632 12 10.666.666 2540715
50 632 24 11.984.848 1985657
50 632 36 1.757.575 886460
50 632 48 106.060 26243
50 632 60 1.575.757 114391
50 645 0 10.090.909 5.705.767
50 645 12 9.060.606 2.271.059
50 645 24 11.106.060 3.059.443
50 645 36 3.424.242 2.543.966
50 645 48 287.878 189.242
50 645 60 1.560.606 378.484
50 802 0 5.212.121 3.738.434
50 802 12 20.636.363 3.968.626
50 802 24 21.439.393 777.170
50 802 36 15.939.393 5.249.426
50 802 48 10.666.666 1.694.871
50 802 60 7.924.242 1.380.451
50 1024 0 8.863.636 4.408.856
50 1024 12 11.696.969 4.700.609
50 1024 24 13.515.151 4.419.232
50 1024 36 15.272.727 1.614.116
50 1024 48 12.212.121 3.833.932
50 1024 60 9.590.909 416.597
50 1097 0 13.530.303 2.704.577
50 1097 12 12.757.575 5.461.044
50 1097 24 15.409.090 3.224.070
50 1097 36 19.939.393 159.631
50 1097 48 25.409.090 9.141.224
50 1097 60 16.681.818 1.071.802
110
Concentración de
sacarosa (g/L)
X1
Contenido de
aminonitrógeno
(mg/L)
X2
Tiempo (h)
X3
Promedio
Crecimiento
celular (UFC/mL)
Y
Ds
80 582 0 4.424.242 627.097
80 582 12 17.136.363 660.265
80 582 24 29.151.515 3.762.124
80 582 36 37.515.151 10.473.336
80 582 48 11.727.272 3.200.271
80 582 60 533.333 115.470
80 632 0 3.393.939 2.107.313
80 632 12 24.909.090 7.500.550
80 632 24 35.954.545 3.295.689
80 632 36 7.303.030 2.930.437
80 632 48 5.727.272 4.547.499
80 632 60 3.366.666 4.969.238
80 645 0 5.257.575 867.614
80 645 12 25.454.545 4.257.467
80 645 24 32.348.484 2.385.533
80 645 36 22.757.575 13.416.433
80 645 48 16.984.848 2.431.853
80 645 60 3.166.666 4.200.396
80 802 0 1.015.151 1.444.091
80 802 12 15.075.757 5.928.000
80 802 24 48.606.060 4.935.604
80 802 36 44.454.545 787.295
80 802 48 21.439.393 7.099.111
80 802 60 1.000.000 200.000
80 1024 0 3.000.000 624.896
80 1024 12 14.939.393 2.748.904
80 1024 24 45.818.181 4.760.590
80 1024 36 45.090.909 1.488.245
80 1024 48 36.136.363 1.681.818
80 1024 60 45.200.000 3.200.000
80 1097 0 2.363.636 714.374
80 1097 12 10.227.272 4.165.977
80 1097 24 24.651.515 3.687.799
80 1097 36 43.106.060 3.108.683
80 1097 48 34.015.151 3.323.573
80 1097 60 35.566.666 10.650.039
111
CAPÍTULO VI
Evaluación de la cinética del crecimiento de Lactobacillus plantarum ATCC 8014 a nivel
de laboratorio y de banco en un medio a base de plasma sanguíneo bovino hidrolizado y
su aplicación como cultivo iniciador en un producto cárnico
Pedro J. Barragán PhD. (c) 1, Óscar J. Sánchez PhD.
1*, Juan C. Henao M.Sc.
2
RESUMEN
Los lactobacilos son usados en una gran variedad de productos, su efecto benéfico en
salud humana y animal, así como su actividad bioconservadora en productos cárnicos
madurados está confirmado. Para su cultivo existe una gran variedad de sustratos
agroindustriales no convencionales con alto impacto ambiental, como el plasma sanguíneo
bovino. El objetivo de este trabajo fue estudiar la cinética del crecimiento a nivel de banco y
de laboratorio de Lactobacillus plantarum ATCC 8014 por fermentación sumergida
empleando un medio de cultivo a base de proteínas hidrolizadas del plasma sanguíneo bovino,
incluyendo su modelamiento matemático, y evaluar los efectos madurativos y propiedades
sensoriales de la biomasa celular obtenida sobre un producto cárnico madurado tipo
pepperoni. Se encontró que, a nivel de banco con el medio propuesto, la máxima
concentración de biomasa viable de L. plantarum ATCC 8014 fue de 9,58 log UFC/mL,
mayor a la hallada en el medio MRS (9,53 log UFC/mL). En comparación con el producto
elaborado con el cultivo iniciador comercial, la aplicación de biomasa viable de L. plantarum
adaptada y propagada en el medio de estudio, no mostró una diferencia estadísticamente
significativa durante la maduración del producto a través del seguimiento del pH y la
112
actividad del agua. El panel de expertos no encontró diferencias entre los atributos sensoriales
evaluados para el producto elaborado con L. plantarum y con el cultivo iniciador comercial.
La calidad general del pepperoni empleando como cepa iniciadora L. plantarum ATCC 8014,
fue calificada como alta por el 70% de los jueces y media por los restantes. El modelo
estructurado no segregado que se desarrolló proporciona información de los diversos factores
que influyen en la cinética de crecimiento de L. plantarum y la dinámica del comportamiento
de los carbohidratos en la fermentación por lotes a nivel de banco, en medios a base de
hidrolizados de proteínas del plasma sanguíneo bovino. La biomasa de L. plantarum ATCC
8014 obtenida en este medio puede ser utilizada en procesos de maduración en matrices
cárnicas similares a las del pepperoni.
Palabras clave: plasma sanguíneo bovino, cinética de crecimiento, modelamiento
matemático, cultivo iniciador, maduración, pepperoni.
INTRODUCCIÓN
Una cantidad limitada de especies de bacterias acido lácticas (BAL) son usadas como
cultivo iniciador en la industria cárnica. Las principales especies empleadas son Lactobacillus
sakei, L. curvatus, L. plantarum, Pediococcus pentosaceus y P. acidilactic (Rul et al., 2013).
Ellos contribuyen a la bioconservación de alimentos, prolongando la vida útil durante el
almacenamiento, mejorando el valor nutritivo y terapéutico, y promoviendo cambios en el
aroma, sabor y textura (Concha-Meyer et al., 2011; Siamansouri et al., 2013; Bogsan et al.,
2015). Según la especie, presentan requerimientos nutricionales complejos, pero en general
para los lactobacilos es deseable que el nitrógeno sea orgánico en forma de aminoácidos o
péptidos dentro de los cuales el ácido glutámico, isoleucina y valina son considerados factores
113
de crecimiento y deben estar presentes en el medio de cultivo (Crueger y Crueger, 1989;
Karoviéová y Kohajdová, 2003). Las BAL, gracias a su metabolismo fermentativo en el que
se produce ácido láctico como principal producto (Axelsson, 2004), exhiben un potencial
inhibidor en los alimentos frente al desarrollo de microorganismos alterantes y patógenos
como Listeria monocytogenes , Escherichia. coli, Clostridium spp., Staphylococcus aureus,
Shigella flexneri, S. sonnei, Salmonella enteritidis y Yersinia enterocolitica (Hassan Pyar et
al., 2013; Pragalaki et al., 2013; Abolfazl et al., 2015; Di Gioia et al., 2016). Este potencial
inhibidor de las bacterias lácticas se debe principalmente a la producción de bacteriocinas que
son péptidos con actividad antimicrobiana producidos por síntesis ribosomal (Joerger, 2003;
Katikou et al., 2005; Papagianni, 2012; Vallejo et al., 2014). Por ello, la aplicación de
cultivos iniciadores es una técnica ampliamente utilizada en la industria alimenticia. Esta
práctica consiste en la inoculación de una o varias cepas de bacterias activas capaces de
multiplicarse en la matriz alimentaria (productos cárnicos crudos, curados y madurados)
propiciando su acidificación rápida y produciendo cambios específicos en su aroma, sabor,
textura, cuerpo, acidez, humedad y digestibilidad lo que permite la conservación del alimento
(Arnau, 2011). Estos productos se caracterizan porque se consumen crudos, se conservan sin
necesidad de refrigeración y tienen un tiempo de vida útil muy prolongado (Montes et al.,
2013).
La sangre y los hidrolizados de proteínas del plasma sanguíneo bovino han sido
usados como fuente de nitrógeno en la preparación de medios para el crecimiento de cultivos
iniciadores homolácticos, producción de probióticos y bacterias acidolácticas (Duarte de
Sutherland et al., 1992; Barboza et al., 1994; Hyun y Shin, 1998), pero esta alternativa
industrial ha sido poco explorada en la industria alimentaria. Para el aprovechamiento de este
114
residuo, la hidrólisis enzimática parcial de sus proteínas que conduce a la liberación de grupos
aminos (Adler-Nissen, 1986; Figueroa et al., 2015) tiene un gran potencial en la preparación
de medios de cultivo para microorganismos de interés industrial. Sin embargo, aún no se han
reportado en la literatura disponible estudios a nivel de banco y piloto en fermentación
sumergida con medios a base de hidrolizados de plasma, que permitan conocer las
regularidades del cultivo y sus posibilidades de escalamiento.
En el capítulo anterior de la presente tesis, se obtuvo la composición de un medio de
cultivo en el que la fuente de nitrógeno se reemplazó con las proteínas hidrolizadas del plasma
sanguíneo bovino y la fuente de energía se reemplazó con sacarosa en comparación con el
medio comercial MRS. Tomando como base esta composición, el objetivo de este trabajo fue
realizar el modelamiento de la cinética de crecimiento a nivel de banco de L. plantarum
ATCC 8014 empleando el medio de cultivo mencionado y evaluar en una matriz cárnica los
efectos madurativos y propiedades sensoriales de la biomasa celular obtenida sobre un
producto cárnico madurado tipo pepperoni.
MATERIALES Y MÉTODOS
Obtención del plasma sanguíneo bovino
El plasma sanguíneo bovino fue suministrado por la empresa Frigodán Ltda. (Bogotá,
Colombia), en una presentación en polvo de partícula fina con un contenido proteico de 70±2
g/L. A este sustrato se le realizaron análisis físico-químico y microbiológico antes de su uso.
Se realizó la determinación de proteína del concentrado en polvo de plasma sanguíneo bovino
suministrado y de los preparados proteicos elaborados a partir de él por el método de Biuret
(1940).
115
Hidrólisis enzimática del plasma sanguíneo bovino
Para la hidrólisis de proteínas del plasma sanguíneo bovino, se siguió el procedimiento
descrito por Barragán et al. (2016) (ver capítulo 4 de la presente tesis). A los hidrolizados de
proteínas del plasma sanguíneo bovino obtenidos para preparar los medios, se les determinó el
nitrógeno asimilable (aminonitrógeno) por duplicado utilizando el método potenciométrico
descrito en los métodos de la AOAC (1980).
Obtención y conservación de la cepa
Se utilizó la cepa de L. plantarum ATCC 8014 que se obtuvo del banco de cepas de la
ATCC (American Type Culture Collection, EUA). Para la activación de la cepa se realizaron
suspensiones del liofilizado de la misma en solución salina estéril (1% p/v) para su posterior
siembra en agar MRS e incubación a 37ºC durante 48 horas en cámara de incubación
(Brinder, Inglaterra). Luego de este período de incubación, se trasfirieron asadas de estos
cultivos a criotubos de 1,5 mL con caldo de triptona de soya suplementado con glicerol y
sacarosa como crioprotector para su posterior conservación en congelación a -70 ºC hasta el
momento de su uso. Estos procedimientos se realizaron en el Laboratorio de Microbiología de
Alimentos de la Unidad Tecnológica de Alimentos del Departamento de Ingeniería de la
Universidad de Caldas.
Recuento e identificación de bacterias acido lácticas
Para el recuento de bacterias ácido lácticas en los tiempos de muestreo establecidos, se
utilizó la técnica de microbiología tradicional utilizando recuentos directos en placa, con agar
MRS con colorante de contraste azul de anilina al 3%, expresado como Unidades Formadoras
116
de Colonia por mililitro UFC/mL (Ossa et al., 2010). Para su identificación se realizaron
pruebas bioquímicas de observación microscópica como la determinación de la enzima
citocromo oxidasa y de la catalasa (esperando resultados negativos en ambas). Para la prueba
de catalasa, se transfirió parte del centro de una colonia a la superficie de un portaobjetos de
vidrio; posteriormente, se agregó una gota de peróxido de hidrógeno al 3% y se observó la
formación de burbujas. Para la prueba de la citocromo oxidasa, se dispersó una colonia con el
asa sobre tiras comerciales Bactident® Oxidasa (Koneman et al., 2001; MacFaddin, 2003).
Preparación de medios de cultivo
Previamente (ver capítulo V de esta tesis), se definió el medio de cultivo que
maximiza la producción de biomasa celular aplicando un diseño experimental factorial con
análisis de volumen de respuesta. Este medio óptimo, cuya composición se describe en la
Tabla 1, fue utilizado para la prueba a nivel de banco. Para su preparación, se utilizó un
hidrolizado de plasma con un contenido de aminonitrógeno de 825 mg/L a fin de sustituir las
fuentes de nitrógeno del medio comercial MRS (peptona, extracto de carne y extracto de
levadura). Los demás micronutrientes del medio fueron adicionados de acuerdo con las
recomendaciones de Man et al. (1960) para el cultivo de lactobacilos. En calidad de fuente de
carbono para los lactobacilos, se empleó sacarosa a una concentración de 80 g/L. El medio se
ajustó a un pH de 6,2 con ácido cítrico y finalmente se esterilizó en autoclave vertical
(Tecnik, Colombia) a 120°C por 15 minutos a una presión de 14 psi.
117
Tabla 1. Composición del medio a base de plasma sanguíneo bovino
Componentes Cantidad
Plasma sanguíneo bovino con proteínas hidrolizadas
(correspondiente a un contenido de AMN de 825 mg/L)
750 mL/L
Sacarosa 80,00 g/L
Fosfato diácido de potasio 2,00 g/L
Acetato de sodio 5,00 g/L
Citrato de amonio 2,00 g/L
Sulfato de magnesio 0,20 g/L
Sulfato de manganeso 0,05 g/L
pH: 6,4 ± 0,2 8 a 25ºC
AMN: Aminonitrógeno.
Cinética de fermentación de L. plantarum a nivel de banco
El estudio cinético a nivel de banco, empleando el medio de cultivo descrito
anteriormente (ver Tabla 1), se llevó a cabo en un biorreactor de 3 L (SBC, Colombia) con
agitación a 40 rpm a fin de homogenizarlo (ver montaje en Figura 1.); este cultivo se realizó
por triplicado. Adicionalmente, se realizó un cultivo de referencia por triplicado empleando el
medio MRS en erlenmeyers de 250 mL con un volumen efectivo de 150 mL sin agitación.
Todos los cultivos se sembraron con inóculos de 2,5 % (v/v) y se incubaron a 37°C durante 60
horas con muestreo a intervalos de 12 horas, en donde se midió la concentración de biomasa
celular viable por mililitro de medio (UFC/mL) y los carbohidratos totales por el método de
Dubois et al. (1956).
Modelamiento matemático del cultivo de L. plantarum
Para el modelamiento matemático de la cinética de crecimiento del cultivo de L.
plantarum ATCC 8014, se utilizó un modelo determinístico, no segregado y dinámico. Con
118
este fin, se utilizaron los datos experimentales de crecimiento celular (en log UFC/mL), y de
concentración de carbohidratos totales (en g/L), obtenidos a nivel de banco (3 L).
Como se anotó anteriormente, en el capítulo V de esta tesis se presentaron los
resultados de un diseño experimental factorial con análisis de volumen de respuesta. El
objetivo de ese diseño consistió en la definición de las concentraciones óptimas de la fuente
de carbono (sacarosa) y de nitrógeno (expresada como contenido de aminonitrógeno) que
maximizaron la biomasa celular de L. plantarum en un medio a base de plasma sanguíneo
bovino con proteínas hidrolizadas; el diseño contempló la evaluación de la concentración de
biomasa en seis tiempos (cada 12 horas hasta las 72 horas) para cada uno de los cultivos
realizados. En este trabajo, se parte de esta información para realizar el modelamiento cinético
de los cultivos a nivel de laboratorio. Para ello, se construyeron 18 perfiles en el tiempo de
biomasa y de carbohidratos totales, es decir, uno por cada tratamiento del diseño experimental
correspondiente a cada combinación de los dos factores estudiados. Con base en estas curvas
experimentales, se planteó el modelo matemático de la cinética del cultivo del
microorganismo estudiado a nivel de laboratorio.
El modelo matemático propuesto para ambas escalas (laboratorio y banco incluyó la
ecuación logística modificada (Williams, 1982) para la descripción de la formación de
biomasa celular de L. plantarum ATCC 8014 en el tiempo, de acuerdo con la siguiente
expresión:
[ (
)
] (1)
119
donde µmax es la velocidad máxima de crecimiento específica en (h-1
), Xmax es la concentración
máxima de biomasa (en log UFC/mL), X es la concentración de biomasa evaluada en un
tiempo dado (en log UFC/mL) y n es un factor de inhibición. Si n < 1, el organismo es
relativamente sensible a la auto-inhibición y ésta ocurre para valores muy bajos de X; cuando
n=1, se trata de la ecuación logística convencional, y cuando n > 1, el organismo es
relativamente resistente a la auto-inhibición y ésta ocurre solo cuando X≈Xmax.
Para el modelamiento de la dinámica del comportamiento de los carbohidratos totales
presentes en el medio líquido a nivel de laboratorio, se utilizó la siguiente ecuación de
conversión de biomasa a sustrato que incluye un factor de rendimiento:
(2)
donde Yx/s es el rendimiento de biomasa viable a partir de sustrato (en log UFC/g de
carbohidratos). Para representar el comportamiento de la dinámica de carbohidratos en el
tiempo a nivel de banco, se utilizó la ecuación propuesta por Montoya et al. (2015):
[ (
)
] (3)
donde qp es la tasa de producción de carbohidratos (en g de carbohidratos/(log UFC×h)) y
µmax es la velocidad de crecimiento específica (h-1
).
Para la resolución del modelo matemático, se utilizó el software Matlab® R2013
(MathWorks, EUA). Se realizó una regresión no lineal para la obtención de los parámetros
120
cinéticos de las ecuaciones del modelo utilizando la función lsqcurvefit de Matlab. Para
la resolución del modelo matemático planteado, se empleó la función ode45 de Matlab
basada en un método numérico que aplica una fórmula explícita de Runge-Kutta.
Validación del uso de la biomasa obtenida en la elaboración de un producto cárnico
Para la validación de la actividad madurativa de la biomasa de L. plantarum ATCC
8014 obtenida en la fermentación a nivel de banco, se procedió a su separación por
centrifugado del caldo de fermentación y lavados continuos en centrifugado con agua
destilada estéril, para eliminar interferencias de los constituyentes del medio. Posteriormente,
la cantidad de biomasa requerida para la elaboración del producto cárnico se transfirió a viales
con caldo de triptona de soya suplementado con glicerol y sacarosa para su conservación en
congelación a -20 °C, hasta el momento de su uso.
Figura 1. Montaje para la fermentación sumergida de L. plantarum ATCC 8014 a nivel de
banco.
121
Para la recepción de la materia prima cárnica, se tomó la temperatura y pH del
material inicial. En esta etapa, la temperatura no superó los 7°C y el pH varió entre 5,4 y 5,8.
Posteriormente, se almacenó la materia prima cárnica a temperatura por debajo de 0°C por 24
h para favorecer la obtención de cortes limpios en el momento de la limpieza y picado. Se
retiró de ella el tejido conjuntivo y otros tejidos indeseables y luego fueron congeladas (- 18
°C) por 24 horas. Para la elaboración de pepperoni, se utilizó 72,80% de magro de cerdo, y
23,80% de tocineta. En el caso del producto control la carne se picó en cutter (Javar-CTT15,
Colombia) hasta tamaño 1 cm de diámetro aproximadamente, mientras se adicionaba el
cultivo comercial (Lyocarni SHI-59; Sacco, Italia) constituido por Staphylococcus xilosus,
Pediococcus pentosaceus y L. plantarum para el producto de control. Paralelamente, se
elaboró un producto con la misma formulación pero empleando la biomasa celular de L.
plantarum ATCC 8014 obtenida en la fermentación a nivel de banco y conservada
previamente, la cual se reconstituyó en agua, sales, nitratos, condimentos, y sacarosa
comercial. Luego se adicionó la tocineta y se mezcló hasta obtener una pasta homogénea de
1-2 mm de diámetro. La mezcla fue embutida en embutidora hidráulica CAEH20, (Javar,
Colombia) en fundas de colágeno de res Coria de 26 mm (ALICO, Colombia). Los embutidos
fueron llevados a almacenamiento a 3°C por 24 horas para acondicionamiento de la cepa
iniciadora en la matriz cárnica. Terminado este almacenamiento, se trasladó el producto a
cámara climatizada (Memmert, Alemania) ver montaje en Figura 2, a fin de realizar su
maduración y secado. Se inició con una temperatura de 20 a 25°C y una humedad relativa de
80 - 85% por un período de 8 días. Luego la temperatura se disminuyó a 14°C con 84% - 90%
de humedad relativa por 2 días, y finalmente se modificó la humedad relativa entre 70% y
122
75% por tres días con el fin de evitar el acortezamiento de la pasta hasta una merma de 20 al
25%. Una vez finalizada la maduración, los pepperoni fueron cortados en tajadora (Omega,
Italia) en rebanadas de 3 mm de espesor dispuestas en hileras de 10 y empacadas al vacío
(Komet Plus Vac 20, Alemania) en bolsas flexibles de poliamida y capa sellante de polietileno
de baja densidad de 70 µm de espesor. Esta película presenta una transmisión de vapor de
agua de 15g/m2/día/atm a 38°C y 100% de humedad relativa, así como una permeabilidad al
oxígeno de 60 cc/m2/día/atm a 23°C y 0% de humedad relativa.
Figura 2. Montaje para maduración y secado de pepperoni en cámara climatizada.
Tabla 2. Formulación de pepperoni de baja acidez.
Ingrediente Porcentaje (%) Cantidad (kg)
Cerdo magro 90/10 72,80 3,640
Tocineta 23,80 1,190
Mezcla polifosfatos (801 ) 0,36 0,018
Ajo en polvo 0,07 0,004
Sal refinada 1,40 0,070
Nitral-sal curante (5700) 0,33 0,017
Ácido ascórbico 0,14 0,007
Sacarosa comercial 0,50 0,025
Pimienta blanca 0,28 0,014
Pimienta negra 0,28 0,014
Cultivo starter (L. plantarum ATCC 8014 y/o
cultivo comercial Lyocarni SHI-59) 0,03 0,002
TOTAL CRUDO 100,00 5,000
123
El porcentaje de humedad del pepperoni obtenido fue determinado por gravimetría en
lámpara de humedad halógena (Shimadzu, Japón). Para la evaluación de la capacidad
fermentativa de la cepa de estudio durante el proceso de reposo de masa embutida,
fermentación y secado, se realizó la determinación del pH por potenciometría (Metrohm 620
pH-Meter, Suiza) sobre muestra triturada y homogenizada del pepperoni de estudio y control.
Igualmente, se realizó por duplicado la determinación de la acidez titulable expresada como
porcentaje de ácido láctico tomando 10 g de muestra de pepperoni y homogenizando con 200
mL de agua destilada. Esta muestra se filtró y se tituló con una solución de NaOH 0,1N
utilizando como indicador fenolftaleína y empleando como blanco 100 mL de agua destilada
(Villegas de Gante, 2009). El porcentaje de ácido láctico se expresó de la siguiente manera:
(
) (5)
donde f es el factor de dilución de la muestra.
Los análisis microbiológicos tanto al pepperoni con la fórmula convencional, como al
pepperoni obtenido usando L. plantarum ATCC 8014, se realizaron según requisitos
microbiológicos para productos cárnicos madurados o fermentados exigidos por la NTC 1325
(ICONTEC, 2008) de productos cárnicos procesados no enlatados. Para la evaluación
sensorial correspondiente se aplicó una prueba triangular del sabor (Anexo 1) propuesta por
Larmond (1977). En esta prueba se presentó a un panel de 10 jueces semientrenados tres
muestras, dos de las cuales son iguales, y se les pidió que identificaran la muestra diferente.
Finalmente, para evaluar la calidad general del producto como alta, media o baja se aplicaron
pruebas descriptivas y cuantitativas descritas en la normativa colombiana NTC 5328 y 3932.
124
Se estructuró un cuestionario (Anexo 3) para el pepperoni de estudio y el producto de control.
Para el análisis de los datos obtenidos en la evaluación sensorial se recurrió al método no
paramétrico de Kruskall y Wallis, (Díaz, 1999), por tratarse de variables cualitativas
continuas.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Análisis cinético del cultivo de L. plantarum en medios a base de plasma
En las Figuras 3a y 3b se presentan los datos experimentales de crecimiento celular de
L. plantarum ATCC 8014 en dos medios a base de plasma sanguíneo bovino con proteínas
hidrolizadas a nivel de laboratorio. Estos medios corresponden a dos de los tratamientos del
diseño experimental analizados en el capítulo V de esta tesis. Ambos medios contienen 20 g/L
de la fuente de carbono (sacarosa) y difieren en su contenido de aminonitrógeno. Se observa
que la biomasa celular aumenta significativamente en las primeras 36 horas de cultivo, tiempo
a partir del cual se inicia su fase estacionaria; simultáneamente, se evidencia un decrecimiento
constante en la concentración de carbohidratos hasta el final de la fermentación; en particular,
la mayor disminución del contenido de carbohidratos corresponde a la fase de crecimiento.
Los datos respectivos de los otros 10 tratamientos del diseño experimental en los seis tiempos
de muestreo se relacionan en el Anexo 1 del capítulo V de la presente tesis.
Los datos de perfiles en el tiempo de biomasa y carbohidratos obtenidos para los 12
tratamientos, se tomaron como base para aplicar un algoritmo de regresión no lineal a fin de
determinar los parámetros cinéticos del modelo del cultivo sumergido a nivel de laboratorio
(ecuaciones 1 y 2); para ello se empleó la función lsqcurvefit de Matlab que minimiza la
125
suma de los cuadrados de los residuos de los datos experimentales y los calculados por el
modelo. Los valores de los tres parámetros del modelo (µmax, Xmax y Yx/s) para cada
tratamiento se relacionan en el Anexo 1. La solución del sistema de dos ecuaciones
diferenciales que componen el modelo matemático comprende la curva de crecimiento de la
biomasa celular del lactobacilo estudiado y la curva de consumo de los carbohidratos
presentes en el medio (sacarosa principalmente). En las Figuras 3a y 3b se observa también
cómo las curvas calculadas por el modelo se ajustan adecuadamente a los datos
experimentales obtenidos.
Figura 3. Datos experimentales (×) y calculados por el modelo cinético (líneas continuas) de
los perfiles en el tiempo de la concentración de biomasa de L. plantarum ATCC 8014 y de
carbohidratos totales en medios basados en plasma sanguíneo bovino con proteínas
hidrolizadas a nivel de laboratorio (150 mL de volumen de trabajo). Medio (a): 20g/L de
sacarosa y 802 mg/L de aminonitrógeno; medio (b): 20g/L de sacarosa y 1024 mg/L de
aminonitrógeno.
El ajuste obtenido permite concluir que, a nivel de laboratorio, la ecuación logística
captura el comportamiento del crecimiento celular tanto en su fase exponencial como en la
126
estacionaria para el sistema de fermentación estudiado. De otro lado, se comprobó la
suposición planteada en la ecuación (2) sobre la proporcionalidad directa entre la velocidad de
decrecimiento de carbohidratos y la velocidad de formación de biomasa. Lo anterior sugiere
que efectivamente la sacarosa presente en el medio es consumida por la bacteria para su
crecimiento; de hecho, la curva de carbohidratos se estabiliza cuando el cultivo entra en fase
estacionaria, reafirmando la suposición planteada en el modelo.
Empleando el medio óptimo para el crecimiento de L. plantarum en medios a base de
plasma sanguíneo bovino con proteínas hidrolizadas enzimáticamente (ver Tabla 1), se
implementó un proceso de fermentación sumergida a nivel de banco en un biorreactor de 3 L
de capacidad con un volumen de trabajo de 2,5 L con una velocidad de agitación de 40 rpm
sin suministro de aire. Los resultados obtenidos se presentan en la Figura 4 en donde se
aprecia que la biomasa celular tiene un comportamiento similar al obtenido a nivel de
laboratorio (volumen de trabajo de 150 mL). La comparación con la curva de formación de
biomasa en el medio MRS, indica que existe una fase latente apreciable en el medio basado en
plasma. Esta latencia obedece al período de adaptación requerido por los lactobacilos para
asimilar las fuentes de carbono y nitrógeno disponibles en el medio a base de plasma, que son
diferentes a las medio comercial MRS: glucosa como fuente de carbono y peptona, extracto
de levadura y extracto de carne como fuentes de nitrógeno. Lo anterior, hace que el tiempo de
fermentación, considerado como el tiempo requerido para el inicio de la fase estacionaria,
aumente de 24 h en el medio MRS a 52 h en el medio a base de plasma. Aunque es evidente
que la velocidad de crecimiento en el medio basado en el hidrolizado de proteínas del plasma
sanguíneo bovino conducido a nivel de banco presenta una velocidad menor a la del medio
MRS, en él se alcanzan mayores concentraciones de biomasa viable de L. plantarum (9,58 log
127
UFC/mL o 3.802 millones de UFC/mL frente a 9,53 log UFC/mL o 3.388 millones de
UFC/mL del medio MRS). Este resultado es relativamente similar al reportado por Hyun y
Shin (1998) para un medio a base de un hidrolizado enzimático de plasma sanguíneo bovino
mezclado con caldo MRS, con un contenido de proteína cercano al de este estudio de 30,2
g/L, en el cual se obtuvo una máxima concentración de 9,71 log UFC/mL (5.128 millones de
UFC/mL) a las 24 h de fermentación.
Cabe anotar que el medio MRS ya está optimizado para la proliferación de
lactobacilos en general, pero su uso a nivel de banco, piloto o industrial, está limitado por sus
altos costos. Precisamente, un medio a base de plasma procedente de un efluente residual
como la sangre bovina de centrales de sacrificio, constituye una alternativa atractiva de
aprovechamiento de un residuo de la industria cárnica, más aún cuando las concentraciones
finales de biomasa alcanzadas son comparables a las de un medio utilizado para investigación
a nivel de laboratorio.
Figura 4. Crecimiento celular de L. plantarum ATCC 8014 en el medio óptimo basado en
plasma sanguíneo bovino con proteínas hidrolizadas a nivel de banco y su comparación con
un cultivo a nivel de laboratorio en el medio de referencia MRS.
3
4
5
6
7
8
9
10
0 12 24 36 48 60 72
Crecim
ien
to c
elu
lar (l
og
UF
C/m
L)
Tiempo (h) Hidrolizado PSB MRS
128
El comportamiento de la concentración de carbohidratos presentes en el medio óptimo
durante los ensayos en el biorreactor de 3 L (promedio de tres repeticiones), se muestra en la
Figura 5, al igual que los datos de crecimiento celular. En particular, la concentración de
carbohidratos aumenta al inicio de la fermentación hasta las 12 h, para posteriormente
disminuir hasta las 36 h; a partir de este momento, se estabiliza la concentración de
carbohidratos, lo que coincide con el inicio de la fase estacionaria del crecimiento de los
lactobacilos. Es importante anotar que el método utilizado para la determinación de la
concentración de la fuente de carbono fue el de carbohidratos totales (Dubois et al., 1956);
este método no solamente cuantifica el contenido de sacarosa, sino el de diferentes tipos de
carbohidratos incluyendo monosacáridos, oligosacáridos y polisacáridos. De otro lado,
diferentes investigadores han demostrado la formación de exopolisacáridos durante las
fermentaciones lácticas (Pham et al., 2000; Zamudio, 2005; Champagne y Gardner, 2008), los
cuales representan un mecanismo de defensa de las bacterias contra la desecación, fagocitosis,
ataque de fagos, antibióticos, compuestos tóxicos, depredación por protozoos, y presión
osmótica, entre otros factores, además de jugar un rol en el reconocimiento celular. Esta
capacidad de los lactobacilos para sintetizar exopolisacáridos puede explicar el aumento en la
concentración de carbohidratos al inicio de la fermentación, sobre todo si se tiene en cuenta
que las condiciones de cultivo en un biorreactor son más severas que en un matraz de
laboratorio.
129
Figura 5. Datos experimentales (×) y calculados por el modelo cinético (líneas continuas) de
los perfiles en el tiempo de la concentración de biomasa de L. plantarum ATCC 8014 y de
carbohidratos totales en el medio óptimo (80g/L de sacarosa y 825 mg/L de aminonitrógeno)
basados en plasma sanguíneo bovino con proteínas hidrolizadas a nivel de banco (2,5 L de
volumen de trabajo).
Considerando lo anterior, el modelo cinético propuesto debe capturar la complejidad
de este fenómeno, por lo que se planteó que la sacarosa presente en el medio es hidrolizada en
sus dos monosacáridos constituyentes (glucosa y fructosa), los cuales son absorbidos por las
células bacterianas para su metabolismo energético y para la síntesis de exopolisacáridos. Lo
anterior implica que los azúcares reductores resultantes de la hidrólisis de la sacarosa son
consumidos para formar nuevas células y exopolisacáridos lo que conlleva a un balance
complejo de carbohidratos presentes en el medio. Montoya et al. (2015) aplicaron una
ecuación cinética que describe la formación y consumo de azúcares reductores durante la
degradación de materiales lignocelulósicos por hongos de pudrición blanca. En este trabajo,
se decidió aplicar la ecuación mencionada para modelar este balance de carbohidratos en
función de la velocidad de crecimiento de las células y, en menor grado, de la concentración
de las mismas.
130
Con los datos de la Figura 5, se aplicó el algoritmo de regresión no lineal para hallar
los cuatro parámetros del modelo (ver Tabla 3). Los resultados obtenidos se muestran en la
Figura 5 evidenciándose un ajuste adecuado de los datos experimentales tanto de biomasa
celular viable como de carbohidratos presentes en el caldo de cultivo. La velocidad específica
de crecimiento celular obtenida para el modelo del cultivo a nivel de banco (0,0545 h-1
) fue
inferior al promedio de los valores de µmax para los cultivos en matraces (0,0716 h-1
; ver
Anexo 1). Lo anterior se explica por las diferencias de la composición de los medios de
cultivo y por las particularidades del sistema tecnológico de fermentación a nivel de
laboratorio y de banco. Sin embargo, el modelo determinístico, no segregado y dinámico
propuesto, describió adecuadamente la cinética de crecimiento de L. plantarum ATCC 8014
en cultivo discontinuo a nivel de banco al igual que la dinámica de carbohidratos. Los
parámetros cinéticos hallados por el modelo permiten comparar el desempeño de L.
plantarum en medios a base de hidrolizados de proteínas del plasma con los desarrollados
convencionalmente para las BAL en términos de rendimientos (Yx/s), concentración celular
máxima (Xmax) y velocidad máxima específica de crecimiento (µmax). El modelo permitió,
igualmente, inferir que el microorganismo de estudio es resistente a la auto-inhibición a través
del valor del parámetro n. Este modelo tiene el potencial de ser usado también para el
modelamiento de la cinética de crecimiento y consumo de sustrato de lactobacilos en medios
de diferente composición.
131
Tabla 3. Parámetros cinéticos del modelo cinético de la fermentación sumergida a nivel de
banco para el cultivo de L. plantarum ATCC 8014 en un medio a base de plasma.
Parámetro Valor Unidades
µmax 0,0545 h-1
Xmax 9,4136 log UFC/mL
n 4,6357 Adimensional
Validación del uso de la biomasa obtenida en la elaboración de un producto cárnico
Los resultados de los requisitos físico-químicos y microbiológicos de la materia prima
cárnica, como de los productos terminados (ver Tablas 4 y 5), se encuentran dentro de los
índices permitidos por la norma NTC 1325, lo que indica un manejo adecuado de las
condiciones higiénicas sanitarias en etapas previas a su procesamiento y posteriores para su
elaboración, hasta el tajado y empaque. Esto permite a las materias primas tener aptitud
sanitaria para ser sometida al proceso de maduración y curso adecuado en las etapas de
acondicionamiento, secado y maduración y al producto aptitud sanitaria para su consumo. Los
valores de pH, acidez, humedad y recuento de microorganismos alterantes corresponden a un
nivel de buena calidad y ausencia de patógenos y proporcionan un medio propicio para el
desarrollo de los cultivos iniciadores (BAL), permitiendo que estas bacterias colonicen con
mayor facilidad la masa del pepperoni y desarrollen su metabolismo fermentativo
característico sin competir con otra flora microbiana.
Los resultados comparativos de los análisis físico-químicos y microbiológicos del
pepperoni elaborado con la cepa de estudio (L. plantarum) y el pepperoni de control
elaborado con el cultivo iniciador comercial, se muestran en la Tabla 5. Se observa que tanto
el producto de control como el pepperoni elaborado con L. plantarum, presentan un nivel de
132
buena calidad según la NTC 1325; además la humedad y el pH cumplen los requisitos de
composición y formulación para productos madurados o fermentados.
Tabla 4. Resultados físico-químicos y microbiológicos de la carne cerdo Análisis Físico-químicos
pH 5,8 – 6,2
Acidez 1,745%
Humedad 72,30
Análisis Microbiológicos
Recuento de Staphylococcus coagulasa positiva, UFC/g < 100
Recuento de esporas Clostridium sulfito reductor, UFC/g <100
Detección de Salmonella spp, /25g Ausencia
Recuento de Escherichia coli, /g <3 bacterias/g
Tabla 5. Parámetros físico-químicos y microbiológicos del pepperoni con L. plantarum y el
de control con cultivo comercial. Análisis Físico-químicos
Pepperoni con L. plantarum Pepperoni con cultivo comercial
pH 5,56 pH 5,28
Acidez 0,3843% Acidez 0,4240%
Humedad 23% Humedad 22,46%
Análisis Microbiológicos
Pepperoni con L. plantarum Pepperoni con cultivo comercial
Recuento de coliformes /g <10 Recuento de coliformes /g <10
Recuento de Staphylococcus
aureus coagulasa positiva, UFC/g <100
Recuento de Staphylococcus aureus
coagulasa positiva, UFC/g <100
Recuento de esporas Clostridium
sulfito reductor, UFC/g <10
Recuento de esporas Clostridium
sulfito reductor, UFC/g <10
Detección de Salmonella spp, /25g Ausencia Detección de Salmonella spp, /25g Ausencia
Detección de Listeria
monocytogenes, /25g Ausencia
Detección de Listeria
monocytogenes, /25g Ausencia
Recuento de E. coli /g <10 Recuento de E. coli /g <10
Los resultados obtenidos en el análisis sensorial en la prueba triangular del pepperoni
empleando L. plantarum ATCC 1084 y el control con cultivo comercial se presentan en la
Tabla 6, en donde el 70% de los jueces identificaron como muestra diferente al pepperoni
elaborado con L. plantarum; sin embargo, el 50% de los jueces calificaron que la muestras
133
presentan ligera diferencia y un 20% de los jueces conceptuaron que las diferencias eran
moderadas.
En la Tabla 7 se muestran los resultados de los promedios obtenidos de la evaluación
sensorial a los nueve descriptores aplicados a los pepperoni, realizada por el panel de diez
jueces semientrenados; adicionalmente, se presentan los resultados obtenidos en la prueba de
Kruskall Wallis (valor-p). Igualmente, en la Figura 5 se muestra el perfil sensorial obtenido
para el producto inoculado con L. plantarum y para el producto inoculado con cultivo
comercial. Se puede observar que no hay diferencias significativas en la percepción de la
intensidad de cada descriptor del pepperoni elaborado con el L. plantarum y con cultivo
comercial, dado que no existe diferencias entre las medianas (Tabla 7).
Tabla 6. Resultados de prueba triangular para pepperoni con cultivo comercial y con L.
Plantarum ATCC 8014 Prueba triangular:(Pepperoni control con cultivo comercial ( 622, 768) y Pepperoni L. Plantarum (577)
Panel Código muestra: 577 Código de la muestra: 622 Código de la muestra: 768
Juez Ligera
diferencia
Moderada
diferencia
Mucha
diferencia
Ligera
diferencia
Moderada
diferencia
Mucha
diferencia
Ligera
diferencia
Moderada
diferencia
Mucha
diferencia
Juez 1 1
Juez 2 1
Juez 3 1
Juez 4 1
Juez 5 1
Juez 6 2
Juez 7 2
Juez 8 1
Juez 9 2
Juez 10 1
Este resultado en las medianas halladas se evidencia en el perfil sensorial desarrollado
por los pepperoni, en donde se aprecia que la evaluación para todos los descriptores se
traslapa, a excepción del color y olor o aroma característico que aun así son muy cercanos.
134
Igualmente, en las Figuras 6a y 6b el color y la apariencia general del producto de control y el
elaborado con L. plantarum no presentan diferencia visual apreciable.
La calidad general fue evaluada por el panel semientrenado, así: 70% de los jueces
consideran el pepperoni elaborado con L. plantarum con un nivel de alta calidad y el restante
con calidad media, para el producto control el 80% de los jueces calificaron con un nivel de
alta calidad el pepperoni elaborado con el cultivo comercial y un 20% con calidad media.
Tabla 7. Resultados de la prueba de Kruskall Wallis para evaluación sensorial de pepperoni a
partir del panel semientrenado de diez jueces.
Tipo de
Pepperoni con: Descriptor Promedio
Desviación
estándar
Coeficiente
de variación
Valor-p
Kruskall-
Wallis
Cultivo comercial Color 4,1 ±1,37032 33,42% 0,310933
L. plantarum Color 4,7 ±1,25167 26,63%
Cultivo comercial Olor/aroma característico 4,6 ±1,26491 27,50% 0,785341
L. plantarum Olor/aroma característico 4,4 ±1,3499 30,68%
Cultivo comercial Olor/aroma objetable 0,9 ±1,52388 169,32% 0,966559
L. plantarum Olor/aroma objetable 0,6 ±0,699206 116,53%
Cultivo comercial Sabor característico cárnico 5,8 ±0,918937 15,84% 1
L. plantarum Sabor característico cárnico 5,8 ±1,0328 17,81%
Cultivo comercial Sabor salado 2,4 ±2,1187 88,28% 0,843768
L. plantarum Sabor salado 2,4 ±1,7127 71,36%
Cultivo comercial Sabor ácido 2,8 ±1,75119 62,54% 0,938339
L. plantarum Sabor ácido 2,7 ±1,56702 58,04%
Cultivo comercial Sabor objetable 0,3 ±0,483046 161,02% 0,887537
L. plantarum Sabor objetable 0,4 ±0,699206 174,80%
Cultivo comercial Sabor graso 3,7 ±1,49443 40,39% 0,815117
L. plantarum Sabor graso 3,8 ±1,54919 40,77%
Cultivo comercial Jugosidad 4,4 ±1,07497 24,43% 0,874162
L. plantarum Jugosidad 4,3 ±0,948683 22,06%
0=ausencia, 1 y 2=leve, 3 y 4=moderado, 5,6 y 7=intenso.
135
Figura 5. Perfil sensorial de pepperoni con cultivo comercial y pepperoni con L. plantarum.
Figura 6 Aspecto del pepperoni madurado con cultivo comercial (a) y del pepperoni
madurado con L. plantarum ATCC 8014 (b) propagado en medio a base de hidrolizado
enzimático de plasma sanguíneo bovino.
01234567
COLOR
OLOR/AROMA
CARACTERÍSTICO
OLOR/AROMA
OBJETABLE
SABOR
CARACTERÍSTICO
CÁRNICO
SABOR SALADOSABOR ÁCIDO
SABOR OBJETABLE
SABOR GRASO
JUGOSIDAD
Pepperoni control con cultivo
comercial
Pepperoni con L. plantarum
136
CONCLUSIONES
En este trabajo, se encontró que la máxima concentración de biomasa viable de L.
plantarum ATCC 8014 a nivel de banco alcanzada en una fermentación sumergida por lotes
fue de 3.802 millones de UFC/mL en un medio de hidrolizado de plasma con un contenido de
aminonitrógeno de 825 mg/L y 80 g/L de sacarosa, que corresponde a una concentración
12,2% mayor que la obtenida en el medio MRS. El modelo matemático propuesto para hallar
el perfil de crecimiento de L. plantarum ATCC 8014 puede ser usado para predecir el
comportamiento de la cinética de crecimiento de la biomasa viable de lactobacilos a nivel de
banco, así como la dinámica de carbohidratos en medios que utilicen hidrolizados de
proteínas del plasma sanguíneo bovino como fuente de nitrógeno cercanas a las del medio
comercial MRS y con concentraciones de sacarosa de 80 g/L.
El pepperoni elaborado usando como cultivo iniciador la biomasa celular de L.
plantarum ATCC 8014 obtenida a nivel de banco en el medio a base de plasma bovino, no
mostró una diferencia estadísticamente significativa para pH, actividad de agua y propiedades
sensoriales durante el transcurso de la maduración, en comparación con el pepperoni de
control elaborado con el cultivo comercial. De esta manera, se demostró la viabilidad de la
producción de cultivos iniciadores de bacterias acido lácticas (en el caso de L. plantarum),
empleando medios basados en hidrolizados de proteínas de plasma bovino. Su aplicación
como cultivos iniciadores en matrices cárnicas de productos madurados permite alcanzar una
capacidad madurativa, estabilidad sensorial y calidad general similar a que se obtiene con
cultivos starter comerciales.
137
Con el presente trabajo, se exploró y demostró la utilidad de un proceso novedoso para
el aprovechamiento de un efluente residual de la cadena cárnica. Este proceso se constituye en
una alternativa atractiva para la obtención de productos de mayor valor agregado, como los
cultivos iniciadores de la maduración empleados en la industria de alimentos.
AGRADECIMIENTOS
Los autores agradecen al Fondo de Ciencia, Tecnología e Innovación del Sistema
General de Regalías por la financiación del presente trabajo, así como a la Unidad
Tecnológica de Alimentos de la Universidad de Caldas por el apoyo recibido.
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140
Anexo 1. Prueba triangular de evaluación de sabor del pepperoni
Nombre: Fecha:
Evaluación de sabor
1. Ante usted hay tres muestras de pepperoni.
Dos de ellas son idénticas entre sí.
Indique cual es la muestra diferente
Marque con una X
622 577 768
2. En el caso de la muestra diferente, diga cuanta es la diferencia con respecto a las
muestras duplicadas: (Marque con una X)
( ) Ligera diferencia
( ) Diferencia moderada
( ) Mucha diferencia
Nota: cuando la diferencia sea ligera asigne un valor de 1, cuando sea moderada
asígnele 2 puntos, y cuando sea mucha 3.
3. Comentarios:
Muchas gracias
141
Anexo 2. Parámetros del modelo cinético del cultivo sumergido a nivel de laboratorio de L.
plantarum en 18 medios a base de plasma sanguíneo bovino con diferentes concentraciones
de sacarosa y aminonitrógeno
Sacarosa
(g/L)
Aminonitrógeno
(mg/L) µmax
(h-1
) Xmax
(log UFC/mL)
Yx/s
(UFC/mL/g)
20 1097 0,1507 6,1666 0,1493
20 1024 0,0840 6,2504 0,4930
20 802 0,0343 9,4891 0,7167
20 645 0,0755 6,8616 0,4320
20 632 0,0939 9,9700 0,3939
20 582 0,0295 7,5208 0,2498
50 1097 0,0243 7,3095 0,0132
50 1024 0,0224 7,1480 0,0058
50 802 0,1470 7,2106 0,0750
50 645 0,0714 7,0089 0,0190
50 632 0,0300 6,4770 0,0112
50 582 0,1041 6,8005 0,2700
80 1097 0,0614 7,7529 0,0819
80 1024 0,0669 7,6018 0,0740
80 802 0,0960 7,6726 0,1033
80 645 0,0954 7,5100 0,0300
80 632 0,0050 8,3920 0,0149
80 582 0,0970 7,5941 0,0583
20a
857 0,0970 7,7210 0,8670 a Medio MRS de referencia.
142
Anexo 3. Evaluación sensorial del pepperoni
Nombre: Fecha:
Usted acaba de recibir una muestra de por favor puntué con una X,
el valor de intensidad de cada descriptor según su criterio.
Escala del descriptor: Leve Intenso
0 1 2 3 4 5 6 7
Ausencia Moderado
donde 0 es ausencia, 1 y 2 leve, 3 y 4 moderado y 5, 6 y 7 intenso.
Código de la
muestra: Descriptor 0 1 2 3 4 5 6 7
Color
Olor/aroma característico
Olor/aroma objetable
Sabor característico cárnico
Sabor salado
Sabor ácido
Sabor objetable
Sabor graso
Jugosidad
Comentarios:
Muchas gracias
143
CAPÍTULO VII
Utilización de plasma sanguíneo bovino en la elaboración de un producto cárnico
procesado de carne de conejo y evaluación de su vida útil
RESUMEN
El aprovechamiento de plasma sanguíneo bovino ha tenido un uso extendido en la
industria alimentaria tanto para consumo humano como animal y ha cobrado gran importancia
el conocimiento de la vida útil de estos productos elaborados con este tipo de proteína animal.
El objetivo de este estudio se desarrolló en tres partes; una primera fase en donde se evaluó la
capacidad de retención de agua, de emulsificación y viscosidad del plasma sanguíneo bovino
como propiedades funcionales relevantes en emulsiones cárnicas. En una segunda fase se
determinó el efecto que tiene la incorporación de las proteínas del plasma sanguíneo bovino
hidrolizadas enzimáticamente o no sobre el perfil sensorial y de textura de un jamón cocido de
conejo tipo seleccionado. Evaluado este efecto, finalmente, se seleccionó el plasma que arrojó
el mejor perfil sensorial y de textura. Con este plasma se determinó la vida útil de un jamón
cocido no convencional a base de carne conejo, empleando para su elaboración tres niveles de
incorporación de este plasma. Este estudio se llevó a cabo a dos temperaturas de
almacenamiento refrigerado a 4 y 8 °C del producto, dado que son las temperaturas reportadas
para almacenamiento a nivel doméstico y en anaqueles comerciales. Se utilizó como
organismos específicos de deterioro las bacterias acidolácticas, los aerobios mesófilos y los
mohos y levaduras. Se determinó igualmente la vida útil y la calidad general de los productos
144
elaborados mediante pruebas descriptivas cuantitativas con un panel de jueces expertos. Se
modelo el crecimiento de los organismos específicos de deterioro haciendo uso de modelos
primarios y secundarios. Se halló la vida útil final para cada tratamiento. Como variables de
respuesta se obtuvo la vida útil de los jamones y el modelamiento matemático del crecimiento
del organismo específico de deterioro. Finalmente, se identificó por su perfil bioquímico
obtenido el microorganismo predominante en los jamones de estudio, el cual correspondió a
Candida parapsilosis. Los resultados obtenidos en el perfil sensorial de los tres jamones
cocidos de conejo, demostraron que existen diferencias estadísticamente significativas
(p<0,05) para los atributos de apariencia, cohesividad, color y masticabilidad evaluados. A
diferencia del aroma y sabor, textura en donde no se encontraron diferencias significativas
(p>0,05). El jamón cocido de conejo con mayor aceptación del panel sensorial frente a la
muestra control, es el elaborado con plasma sanguíneo bovino con proteínas sin hidrolizar.
Las mediciones instrumentales de dureza, cohesividad y masticabilidad en los tres jamones
presentaron diferencias significativas. Las mediciones instrumentales de elasticidad y
adhesividad no presentaron diferencias significativas. Se determinó la vida útil a un jamón
cocido de conejo tipo seleccionado, formulado con plasma sanguíneo entero. Se encontró que
el período de vida útil es de 20 a 24 días. Se obtuvo una capacidad de retención de agua
CRA=7,63 mL agua/g concentrado y una capacidad emulsificante CE=595 mL/g concentrado
y la viscosidad obtenida para plasma sanguíneo bovino fresco fue de 3,28 cP. La vida útil
máxima alcanzada sensorialmente fue de 51 días, correspondiente al tratamiento del jamón de
conejo empacado al vacío y almacenado a 4°C, elaborado empleando un nivel medio de 2,5%
de incorporación de plasma sanguíneo bovino.
145
Palabras clave: jamón de conejo, vida útil, organismo específico de deterioro, plasma
sanguíneo bovino, evaluación sensorial, propiedades funcionales.
INTRODUCCIÓN
Son diversas las aplicaciones del plasma sanguíneo bovino en la industria alimenticia
como mejorador de propiedades funcionales. Las proteínas del plasma sanguíneo bovino
exhiben varias propiedades funcionales relevantes para el procesamiento de diferentes
sistemas alimentarios, como la gelificación, capacidad de retención de agua y emulsificación
entre otras. Por ejemplo, cuando el plasma sanguíneo bovino se utiliza a concentraciones
superiores al 2% en embutidos, se adquiere una textura elástica como la de goma (Isaza et al.,
2010). Las proteínas, por ser sustancias polares, se hidratan en soluciones acuosas. Este grado
de hidratación (agua de hidratación / g proteína) es variable (Grosch y Belitz, 1997) y en
general la capacidad de retención de agua se ve influenciada por factores como la
concentración proteica, el pH, la temperatura, el tiempo, la fuerza iónica y la presencia de
otros componentes que toman parte en las interacciones proteína-proteína y proteína-agua
(Fennema, 1993). Una propiedad funcional de superficie de las proteínas empleadas en los
alimentos es la emulsificación. Para los sistemas aceite/agua las proteínas tiene un buen
comportamiento. El mecanismo general de emulsificación consiste en la orientación de los
aminoácidos apolares hacia la fase lipídica y la de los polares hacia la fase acuosa (Badui,
1993).
146
Las proteínas del plasma sanguíneo bovino tienen un potencial uso y aprovechamiento
en la industria de los alimentos, por presentar un alto valor nutritivo, buena capacidad
emulsificante, espumante y ligante y capacidad de formar geles y aumentar la rentabilidad
(Camacho et al., 2014). Particularmente, en la industria cárnica, las proteínas del plasma de
bovino están siendo utilizadas por sus excelentes propiedades funcionales, en especial su
capacidad gelificante, de retención de agua y emulsificante en los productos cocidos,
mejorando el rendimiento del producto final (Isaza et al., 2010; Camacho et al., 2014). En la
elaboración de emulsiones de pastas cárnicas finas convencionales, las proteínas del plasma
bovino ayudan a la emulsión de la grasa y estabilidad en la cocción, aportando también un
color atractivo (Rodriguez et al., 2011a).
De otro lado, la vida útil de un alimento es el período durante el cual, bajo condiciones
de almacenamiento recomendadas, se conservan deseables y seguras sus características
sensoriales, químicas, físicas y microbiológicas (Kilcast y Subramaniam, 2000). En el caso
del jamón cocido, la calidad final depende de la materia prima utilizada (pH, contenido
microbiano, o grasa) y las condiciones de procesamiento (Talens et al., 2013). En Colombia,
la Norma Técnica Colombiana NTC 1325 (ICONTEC, 2008) define el jamón como “Producto
cárnico procesado, cocido, embutido, moldeado o prensado, elaborado con músculo sea éste
entero o troceado, con la adición de sustancias de uso permitido”. Las alteraciones de la carne,
del jamón y otros productos cárnicos están causadas principalmente por microorganismos
psicrótofros, levaduras y mohos que son responsables de la producción de sustancias de mal
olor como acetoína y los ácidos acético, butírico, isobutírico e isovalérico, entre otros; estos
compuestos afectan el grado de aceptación del alimento (Dainty y Hibbard, 1980; Pérez,
2003; Rodríguez, 2004). Dentro de este grupo de microorganismos alterantes se destacan las
147
bacterias ácido lácticas (BAL). Específicamente, Leuconostoc mesenteroides se ha aislado
frecuentemente como microorganismo responsable de alteración en diversos tipos de
productos cárnicos tales como jamón cocido, salami, productos curados y salchichas cocidas
tipo Viena y Frankfurt, entre otros (Korkeala y Alanko, 1988; Björkroth y Korkeala, 1996;
Holley y McKellar, 1996; Samelis et al., 1998; Zhang y Holley, 1999). En productos cárnicos,
el desarrollo de estos microorganismos reaparece en la cadena de producción por
contaminación post-proceso luego de que el producto ha sido sometido a tratamiento térmico
78°C. Esta contaminación cruzada se da principalmente en las etapas de corte y el envasado
del producto (Hwang y Huang, 2010; Liu et al., 2012). El desarrollo y la velocidad de
crecimiento de dichos microorganismos y la alteración del producto dependen de la
temperatura de almacenamiento (Ossa et al., 2010). En estudios de evaluación del grado y
tipo de contaminación bacteriana durante las etapas de elaboración de jamón cocido tajado y
almacenado a 4°C y 12°C, se ha encontrado que Lactobacillus sake y L. mesenteroides sbsp.
mesenteroides son los principales agentes causantes de deterioro debido a la recontaminación
en la sala de corte (Samelis et al., 1998; Susiluoto et al., 2003). Por ello se ha propuesto para
la estimación de la vida útil de jamón cocido tajado el crecimiento de las BAL en las etapas
de proceso (Buelvas, 2013).
Para estimar la vida útil de un producto alimenticio es necesario, en primer lugar,
identificar o seleccionar la variable cuyo cambio es el que primero identifica el consumidor
como una baja en la calidad del producto (Brody, 2003); en algunos casos, esta variable puede
ser la rancidez, cambios en el color, sabor o textura, pérdida de vitamina C o inclusive la
aparición de poblaciones inaceptables de microorganismos. En el instante en que alguno de
estos parámetros se considera como inaceptable, el producto ha llegado al fin de su vida útil
148
(Singh, 2000). Posteriormente, es necesario analizar la cinética de la reacción asociada a la
variable seleccionada que depende en gran medida de las condiciones ambientales. Se pueden
realizar las predicciones de vida útil mediante utilización de modelos matemáticos (útil para
evaluación de crecimiento y muerte microbiana), pruebas en tiempo real (para alimentos
frescos de corta vida útil) y pruebas aceleradas (para alimentos con mucha estabilidad) en
donde el deterioro es acelerado a fin de realizar predicciones bajo condiciones más severas
(Charm, 2007). La mayoría de los modelos desarrollados están referidos a los organismos
específicos de deterioro (SSO, por sus siglas en ingles) y describen su crecimiento en función
de la temperatura, ya que este es el factor más importante que influye en la vida útil en éste
tipo de productos (Zwietering et al., 1991; McMeekin et al., 1992). Para su aplicación, se ha
consolidado un enfoque de dos pasos así: se utilizan modelos primarios para describir el
crecimiento de los SSO en función del tiempo como el modelo modificado Gompertz,
Baranyi y Roberts o el modelo logístico (Zwietering et al., 1990; Whiting, 1995; McDonald y
Sun, 1999); y modelos secundarios para describir la dependencia de la temperatura sobre el
crecimiento de los SSO tales como el modelo de Arrhenius, el modelo de raíz cuadrada
(SRM) o de superficie de respuesta (Labuza y Riboh, 1982; Bratchell et al., 1990; Ross y
McMeekin, 1991; Whiting, 1995; McDonald y Sun, 1999). También la vida útil se puede
determinar mediante la evaluación sensorial de los atributos de un producto; este método
consiste en enfocar la estimación de la vida útil hacia el rechazo del producto por los
consumidores (Novoa y López, 2008).
El objetivo del presente trabajo fue determinar la capacidad de emulsificación,
retención de agua y viscosidad del plasma sanguíneo bovino, y evaluar la viabilidad de su
utilización en la formulación de un jamón cocido de conejo. En particular, se estudió si la
149
hidrólisis enzimática de las proteínas del plasma tienen o no un efecto sobre las propiedades
funcionales del mismo en una matriz alimenticia como el jamón de carne de conejo. Para la
determinación de la vida útil se utilizó un primer método de microbiología predictiva, basado
en una de las principales vías de deterioro de los productos perecederos, la contaminación
microbiológica, la cual ocurre antes que los cambios físico-químicos (Nuñez de Villavicencio,
2011). También se empleó un segundo método predictivo con el fin de correlacionar la vida
útil del jamón con el factor de temperatura de almacenamiento e incorporación de plasma
sanguíneo bovino. Para ello, se utilizó un modelo matemático primario a fin de hallar los
parámetros cinéticos del crecimiento microbiano a través del tiempo, y un modelo secundario
con el fin de observar la relación del crecimiento microbiano con los dos factores
experimentales citados. Adicionalmente se determinó la vida útil sensorial de los jamones de
conejo elaborados con plasma sanguíneo bovino.
MATERIALES Y MÉTODOS
Propiedades funcionales del plasma sanguíneo bovino
En una primera etapa de este trabajo, se realizó la determinación de la capacidad
emulsificante (CE) y capacidad de retención de agua (CRA) en un sistema modelo, con el uso
de plasma sanguíneo bovino entero deshidratado, para lo cual se utilizó el método descrito por
Yu et al. (2007). A temperatura ambiente se solubilizaron muestras de1g de concentrado
proteico de plasma sanguíneo bovino marca (Frigodan, Colombia) por duplicado en agua
destilada hasta completar a volumen de 100 mL para ambas propiedades. Luego se
150
homogenizaron los solubilizados con agitador de alta velocidad por 2 min. A estas muestras
se le ajustó el pH entre 7,4 y 7,8 con ácido cítrico. Para la determinación de la CE, a las
muestras homogenizadas a velocidad constante se les adicionó cada 2 min 25 mL de aceite
vegetal de maíz, y se evaluó la estabilidad de la emulsión por inversión de las fases. Cuando
se observó la inversión de fases se determinó el volumen de aceite adicionado. La capacidad
emulsificante se determinó como el volumen en mL de aceite por gramo de concentrado
proteico (en este caso, plasma deshidratado), así:
CE=
(1)
Para la determinación de la CRA de los homogenizados proteicos de plasma sanguíneo
bovino preparados anteriormente, los mismos se dejaron reposar por 30 min y se
centrifugaron a 3000 rpm durante otros 30 min; posteriormente, se retiraron los
sobrenadantes, se pesaron los sedimentos del concentrado proteico húmedo y se secaron hasta
peso constante en estufa a 105°C. La CRA de cada muestra de concentrado se expresó en g
agua / g de plasma deshidratado de acuerdo con Yu et al. (2007):
(2)
donde W es el peso del tubo de centrifugación (en g), W0 es el peso del tubo más el peso de la
muestra seca (en g) y W1 es el peso del tubo más el peso del sedimento (en g).
Para la medición de la viscosidad del plasma sanguíneo bovino entero, se sometieron
dos muestras de una solución de plasma deshidratado (con contenido aproximado de 70 g/L
151
de proteína) a una fuerza interna que les indujo movimiento de rotación en un viscosímetro
rotacional (Brookfield, Canadá) a 100 rpm, y una temperatura de 23 °C con un volumen de
muestra de 16 mL. La medición de la viscosidad se realizó por lectura directa en el
viscosímetro.
Efecto del emulsificante a base de plasma sobre el jamón cocido de conejo
Los jamones cocidos de conejo tipo seleccionado se elaboraron en la Unidad
Tecnológica de Alimentos (UTA), sección de cárnicos, de la Facultad de Ingeniería,
Universidad de Caldas. En una segunda etapa de este estudio, se evaluó el efecto de la
incorporación del plasma sanguíneo bovino con proteínas hidrolizadas enzimáticamente,
sobre las propiedades sensoriales del jamón cocido de conejo utilizando como control de
referencia un polifosfato de sodio (TECNAS, Colombia) como emulsificante comercial. El
plasma entero deshidratado se incorporó con un porcentaje del 2,5% (p/v). La metodología de
hidrólisis de las proteínas del plasma se realizó según procedimiento descrito por Barragán et
al. (2016) (ver capítulo 4 de esta tesis doctoral); el porcentaje de incorporación del
hidrolizado líquido de proteína del plasma fue del 15% preparado a partir de 2,5% (p/p) de
plasma deshidratado a fin de conservar en base seca el mismo porcentaje de incorporación de
plasma. El polifosfato comercial se dosificó según norma NTC 1325 (ICONTEC, 2008). Para
adelantar esta segunda etapa del estudio, se estructuro un diseño experimental de una sola vía,
en donde el factor a considerar fue el tipo de emulsificante. El objetivo del diseño consistió en
evaluar el efecto de la incorporación de las proteínas del plasma, hidrolizadas
enzimáticamente o no, sobre el perfil sensorial y el perfil de textura instrumental en un jamón
152
cocido emulsionado de conejo. Para el estudio se estructuró un primer tratamiento (T1) con
plasma con proteínas sin hidrolizar, un segundo tratamiento (T2) con plasma con proteínas
hidrolizadas enzimáticamente y un tercer tratamiento o control (T3) empleando como
emulsificante comercial el polifosfato de sodio. El producto control se formuló según lo
especificado en la norma NTC 1325 (ICONTEC, 2008). Se realizaron tres repeticiones de
cada tratamiento. Como variables de respuesta se midieron el perfil sensorial y el perfil de
textura (conocido como Análisis de Perfil de Textura o TPA, por sus siglas en inglés) del
jamón de estudio. Para la formulación de estos jamones, se utilizó una hoja de cálculo
desarrollada por la empresa Tecnas S.A. (Colombia) en el software MS Excel (Microsoft
Corp., EUA). La formulación se determinó bajo el cumplimiento de la norma NTC 1325
(ICONTEC, 2008). Obtenido ya el hidrolizado de plasma, se procedió a la elaboración de la
pasta base de carne de conejo en un emulsificador con la adición de condimento
característico, proteína vegetal, hielo, cloruro de sodio, sal de curación, antioxidante, azúcar,
lactato de sodio, polifosfato de sodio y humo líquido. En el Anexo 1 se detalla la composición
proximal del jamón cocido de conejo elaborado con el plasma hidrolizado, el plasma entero y
con polifosfatos. Posteriormente se sometieron las pastas base a embutido, moldeado y
prensado a presión en funda de polivinilcloruro. Los embutidos se llevaron a cocción en
tanque de agua a 78ºC y a temperatura en el punto medio de 75 °C por 3 minutos. Luego los
embutidos se sometieron a choque térmico con agua sub-enfriada. Se realizó un enfriamiento
de los productos prensados por 24 horas a 4°C. Terminado el enfriamiento, se realizó corte en
lonjas de 3 mm para su empaque al vacío. Se utilizaron bolsas flexibles de poliamida y capa
sellante polietileno de baja densidad de 70 µ de espesor con transmisión de vapor de agua a
38°C y 100% de humedad relativa menor a 15g/m2/día/atm, y permeabilidad al oxígeno a
153
23°C y 0% de humedad relativa menor a 60cc/m2/día/atm. La cantidad de cada unidad
muestral empacada para cada jamón fue de 100 g para el estudio de vida útil. Todas las
unidades experimentales se empacaron a una misma presión de vacío o anaerobiosis. Las
lonjas de jamón se almacenaron a 4°C y 8°C en cámara climática (Memmert, Alemania) con
una humedad relativa del 90%. Estas temperaturas se escogieron de acuerdo con estudios
previos de Buelvas (2013), quien las considera representativas de las condiciones de
almacenamiento en neveras de tiendas (4°C) y refrigeradores domésticos (8°C).
Muestreo y variables de seguimiento
Las variables de seguimiento para evaluar el efecto del plasma con proteínas
hidrolizadas enzimáticamente o no sobre el perfil sensorial del jamón fueron la apariencia, el
color, el aroma y el sabor, la textura, la cohesividad y masticabilidad. Para el Análisis del
Perfil de Textura (TPA) se evaluaron la dureza, adhesividad, cohesividad, elasticidad y
masticabilidad instrumental.
La tercera etapa de este trabajo consistió en la evaluación del efecto del porcentaje de
incorporación de plasma sanguíneo bovino entero en el jamón de conejo (el que mostró mejor
desempeño en la segunda etapa de este trabajo) y de la temperatura de almacenamiento sobre
la vida útil de este producto. Para el muestreo en el estudio de vida útil del jamón, se
establecieron inicialmente períodos de 7 días y, posteriormente, períodos más cortos según se
presentara o no evidencia de deterioro hasta el día 45. En cada uno de estos períodos de
tiempo o muestreo se realizó conteo a la variable de seguimiento de Unidades Formadoras de
Colonia del consorcio de BAL /g de muestra y de los otros microorganismos alterativos
descritos en la sección anterior, al igual que de microorganismos patógenos como coliformes
154
totales en UFC/g, recuentos de Escherichia coli/g según norma NTC 4558 (ICONTEC,
2007b), Staphylococcus aureus en UFC/g según norma NTC 4779 (ICONTEC, 2007a),
esporas de Clostridium sulfito reductor en UFC/g según norma NTC 4834 (ICONTEC, 2000)
y detección de Salmonella spp. según norma NTC (ICONTEC, 2007c) y Listeria
monocytogenes/25 g según norma NTC 4666 (ICONTEC, 1999).
También se realizaron los análisis de las variables sensoriales más destacables en el
jamón de conejo tales como apariencia, olor/aroma, sabor y textura. Como variable de
seguimiento también se realizó simultáneamente la determinación de pH a los productos. Lo
anterior, con el fin de correlacionar la variable de deterioro microbiológico (SSO) y las dos
temperaturas de estudio, con las variables físico-químicas (pH) y sensoriales que permitan
explicar cambios y el posible deterioro o no del producto.
Análisis sensorial de las muestras
Para la evaluación de las propiedades sensoriales de los jamones elaborados con
plasma sanguíneo bovino entero, con plasma sanguíneo bovino con proteínas hidrolizados y
con polifosfato comercial (segunda etapa del trabajo), se empleó un grupo de 10 estudiantes
del programa de Ingeniería de Alimentos de la Universidad de Caldas, que recibieron
entrenamiento bajo la Norma NTC 4129 (ICONTEC, 1997b) en el método y en las
características que se analizaron. La evaluación sensorial se realizó por el método de
comparaciones múltiples con una escala de 0 a 8 modificada y recomendada para jamones
(Anzaldúa, 1994). Los atributos evaluados fueron: apariencia, color, aroma y sabor, textura,
cohesividad y masticabilidad (ver Anexo 3). Se asignaron los valores así: apariencia 8 para
155
brillante y/o homogénea, 4 para granulosa y/o veteada y 0 para grasosa y/o arenosa. En color
se asignó 8 para brillante y/o rosado, 4 para decolorado y/o rosado pálido y 0 para gris y/o
verdoso o manchas grises. En aroma y sabor se asignó 8 para a sal y/o característico y/o
cocido, 4 para insípido, salado, ácido o grasoso. En textura 8 para firme y /o compacto, 4 para
pegajosa y/o blanda con huecos y superficie húmeda. En cohesividad 8 para poco adherente, 4
para pastosa y/o adherente, 0 para pegajosos y/o gomoso. En masticabilidad 8 para firme y/o
compacto, 4 para desmenuzable y/o fibroso y 0 para seboso. Los valores obtenidos con el
panel se trataron mediante la prueba no paramétrica de Kruskall-Wallis con el paquete
estadístico Statgraphics Centurión versión 16 (Statgraphics, España), con el fin de determinar
cuál producto presenta mayor aceptabilidad en cuanto a apariencia, color, aroma y sabor y
textura.
Para la tercera etapa del presente trabajo, el análisis sensorial de las muestras se realizó
al inicio del almacenamiento, en el intermedio del estudio y, posteriormente, a períodos más
cortos según se presentara o no evidencia de deterioro hasta el día 45 de estudio. Como
atributos a evaluar se escogieron apariencia, olor/aroma, sabor y textura. Se utilizó una escala
de 10 puntos, y se fijó el valor de 5 como el inicio del deterioro del producto; por tanto, se
consideró rechazada la muestra cuando el valor promedio de calidad global asignado por los
jueces expertos asuma esta calificación. Para evaluar la aceptabilidad de las muestras se
empleó un grupo de cinco expertos del Instituto de Tecnología Alimentaria (INTAL,
Medellín) entrenados bajo la Norma NTC 4129 (ICONTEC, 1997b) en el método y en los
atributos definidos para el estudio. Adicionalmente, este grupo de expertos hizo una
descripción de atributos objetables a través del estudio. Las pruebas descriptivas cuantitativas
se realizaron bajo los lineamientos de la norma NTC 5328 (ICONTEC, 2004) y la NTC 3932
156
(ICONTEC, 1996). Se usó escala no estructurada de 10 cm y se extendió el formato para la
evaluación de la calidad general y aceptación o rechazo de la muestra (ver Anexo 3).
Finalmente, tomando los resultados sensoriales obtenidos, se determinó la calidad general del
producto, que puede o no constituirse en aceptable o inaceptable y determinar el final o no de
la vida útil.
Aislamiento e identificación del microorganismo alterante
La tercera etapa de este estudio implicó la realización de un diseño experimental cuya
variable de respuesta fue la vida útil. Lo anterior requirió que, previamente, se aislara e
identificara el o los microorganismos alterativos. Este estudio se inició el estudio con una
caracterización microbiológica y físico-química del jamón cocido de conejo según NTC 1325
(ICONTEC, 2008), al inicio del almacenamiento lo anterior, con el fin de descartar presencia
de patógenos o incumplimiento de requisitos de composición, formulación y microbiológicos
y conocer el conteo inicial de UFC/g de BAL y otros microorganismos alterantes del jamón
de estudio como aerobios mesófilos y mohos y levaduras. Posteriormente, el jamón se tajó en
lonchas de 3 mm y se empacó como se describió anteriormente. Luego se sometió a
almacenamiento refrigerado a 8°C hasta que presentó deterioro. El recuento de bacterias ácido
lácticas en UFC/g durante todo el estudio se realizó según norma NTC 5034 (ICONTEC,
2002), el recuento de aerobios mesófilos en UFC/g se llevó a cabo según la norma NTC 4519
(ICONTEC, 2009) y el recuento de mohos y levaduras en UFC/g se realizó según norma NTC
4132 (ICONTEC, 1997a). Con una asada representativa de estas colonias se realizó la
identificación de la especie aislada. Para ello estas muestras se enviaron a TecniMicrom
(Medellín) en condiciones de refrigeración para su identificación mediante pruebas
157
bioquímicas, a través del método miniaturizado y automatizado VITEK-BioMérieux
Hazelwood (Salminen y Von, 2004).
Este método consiste en una estandarización del inoculo por el método de MacFarland
que luego es introducido en equipo de análisis del metabolismo de 64 carbohidratos. Los
resultados se fundamentan en los cambios de color de los sustratos o en la producción de gas
de los cultivos inoculados en los pocillos de la tarjeta plástica que contiene los hidratos de
carbono en forma deshidratada; permitiendo así identificar género y especie del
microorganismo aislado
En esta fase del estudio se determinó la vida útil del producto a través del seguimiento
del SSO identificado. Para ello se utilizó un primer método para la estimación de la vida útil
del jamón de conejo cocido tipo seleccionado según la norma NTC 1325 (ICONTEC, 2008) a
una temperatura de 8°C. Este producto fue elaborado con un nivel medio de incorporación de
plasma sanguíneo bovino de 2,5%. Este método está basado en una de las principales vías de
deterioro de productos perecederos, la contaminación microbiológica, la cual ocurre antes de
los cambios físicos y químicos (Nuñez de Villavicencio, 2011). Por lo tanto, se realizó el
modelamiento matemático del crecimiento microbiano de los microorganismos alterativos,
que para este estudio se consideraron las BAL, aerobios mesófilos y los mohos y levaduras
que pudieran ser predominantes en el matriz de estudio. Para tal fin, se aisló e identificó el
microrganismo alterativo que predominó en esta matriz, durante el almacenamiento del
producto. Este microorganismo se consideró como el organismo específico de deterioro para
el resto del estudio. Como variable de respuesta se determinó la vida útil del jamón mediante
recuento de este microorganismo hasta que alcanzara el nivel indicativo de deterioro.
Adicionalmente, se estimó la vida útil mediante el modelamiento matemático del crecimiento
158
del organismo específico de deterioro. El estudio igualmente se acompañó de la
determinación de la vida útil sensorial.
Efecto del porcentaje de incorporación de plasma y temperatura de almacenamiento
Una vez se identificó el SSO, se evaluó el efecto de la incorporación del plasma y la
temperatura de almacenamiento del jamón sobre la vida útil del jamón de conejo. Para ello, en
esta tercera etapa de este trabajo, se estructuró un diseño experimental factorial de 3x2 con
tres repeticiones para un total de 18 corridas (ver Tabla 1). Los factores de estudio fueron
temperatura de almacenamiento y nivel de incorporación de plasma. Los niveles para
incorporación del plasma fueron: 1,5% (bajo), 2,5% (medio) y 3% (alto) en masa total de
producto crudo, y los niveles para el factor temperatura de almacenamiento fueron 4 y 8°C.
Como variable de respuesta, se determinó la vida útil de los jamones para cada tratamiento
experimental empleando dos métodos (ver siguiente sección) Las demás variables intrínsecas
de los productos como concentración de nitritos, polifosfato, lactato y demás constituyentes se
mantuvieron fijas. Para el análisis estadístico de la variable de respuesta del diseño
experimental se utilizó el software Statgraphics Centurión versión 16 (Statgraphics, España).
Se aplicó un ANOVA con la prueba de diferencia de medias para muestras pareadas entre los
métodos utilizados para la determinación de la vida útil, con el fin de identificar si existía o no
diferencias significativas entre el tiempo de anaquel de los jamones bajo estudio.
159
Determinación de la vida útil
En el diseño experimental descrito en la sección anterior, se determinó la vida útil del
producto como variable de respuesta. Para la medición de la vida útil se emplearon dos
métodos. El primer método se basó en el modelamiento matemático de los SSO alterativos. Se
propusieron como SSO las BAL, los aerobios mesófilos y los mohos y levaduras. El recuento
de BAL se realizó a partir de diluciones decimales sembrando por duplicado 1 mL de cada
dilución en agar MRS en masa. Las cajas se incubaron a 37ºC durante 48 horas en
condiciones aeróbicas. Para su identificación, se realizó tinción de Gram y microscopía para
su morfología, y pruebas complementarias de catalasa y oxidasa según MacFaddin (2003). La
determinación de UFC/g se realizó de acuerdo con la siguiente ecuación:
UFC/g = ∑
(3)
donde v es el volumen del inóculo, n1 el número de cajas de la primera dilución, n2 el número
de cajas de la segunda dilución y d es el factor de dilución de la primera dilución. El recuento
de aerobios mesófilos en UFC/g se llevó a cabo según la norma NTC 4519 (ICONTEC, 2009)
y el recuento de mohos y levaduras en UFC/g se realizó según norma NTC 4132 (ICONTEC,
1997a). Para determinar el tiempo final de vida útil para los jamones de conejo, una vez
obtenidas las cinéticas de crecimiento de los SSO alterativos, se procedió a realizar el
modelamiento matemático respectivo a fin de estimar el valor de la vida de anaquel del
producto. Para la consecución del modelo predictivo que correlaciona la vida útil del producto
con los factores temperatura e incorporación de plasma, se utilizó una combinación de
160
modelos primarios y secundarios. El modelo matemático primario se empleó para hallar los
parámetros cinéticos del crecimiento microbiano a través del tiempo y el modelo secundario
con el fin de observar la relación del crecimiento microbiano y los dos factores
experimentales (temperatura de almacenamiento y nivel de incorporación de plasma). Para el
modelamiento primario, se seleccionó la función de Gompertz modificada, la cual se clasifica
como un modelo empírico según lo reportado por Buelvas (2013), el cual se muestra en la
siguiente ecuación:
{ } (4)
donde Nt es el Log10 de los recuentos microbianos obtenidos para cualquier tiempo (t), A es el
log de los recuentos asintóticos cuando el tiempo decrece indefinidamente o tiende a cero
(equivale aproximadamente al log de los niveles iniciales de bacterias), C es la diferencia
entre la máxima línea asintótica de la curva de crecimiento y la línea asintótica menor
(equivale a Nmax – No) (log UFC/ml), M es el tiempo al cual el crecimiento es máximo (días) y
B es la velocidad de crecimiento relativa al tiempo (días-1
). Se realizó una regresión no lineal
en el Software DATAFIT (SPSS, EUA) en el cual el modelo matemático se ajustó a los datos
experimentales. Para esto, se aplicó un algoritmo de minimización donde se tuvo como
función objetivo la sumatoria de los cuadrados de la diferencia de los datos teóricos arrojados
por el modelo y los datos experimentales. Posteriormente, se estimó la velocidad de
crecimiento mediante la siguiente ecuación:
(5)
161
La fase de latencia (LDP) y la población máxima (Nmax) se calcularon mediante las
siguientes expresiones (Gibson et al., 1987; Buelvas, 2013):
(6)
(7)
La estimación de la vida útil se determinó empleando la ecuación de Monod-
Hinshelwood, que considera que el tiempo en el cual ocurre o se desarrolla la alteración de los
alimentos está directamente relacionado con el tiempo de generación del microorganismo
predominante de acuerdo con las siguientes expresiones (Cabezas y Enrique, 2015):
(8)
(9)
donde ts es el tiempo necesario para que se desarrolle la alteración (vida útil) y Ns es la
población de seguridad (UFC/g). Esta población es reportada por Borch et al. (1988) como de
, concentración a la cual los SSO alterativos producen cambios apreciables en productos
cárnicos; N0 es la población inicial presente en el producto (UFC/g) y Tg, es el tiempo de
generación de la población alterante específica (días).
Se aplicó un modelo secundario de superficie de respuesta para determinar el efecto
combinado del factor intrínseco (incorporación de plasma bovino) y del factor extrínseco
(temperatura de almacenamiento) en condiciones de anaerobiosis sobre los parámetros
162
cinéticos del crecimiento del consorcio de los SSO alterativos obtenidos del ajuste del modelo
primario.
El segundo método de determinación de la vida útil utilizado en el diseño
experimental fue el método cualitativo de análisis sensorial, cuyo objetivo es evaluar, de
acuerdo a un criterio personal-subjetivo, si la muestra presentada es aceptable o rechazable
para el consumo. Para ello se realizó pruebas descriptivas cuantitativas con jueces expertos
que evaluaron la intensidad de los descriptores de apariencia, olor/aroma, sabor y textura. Las
pruebas descriptivas cuantitativas se realizaron bajo los lineamientos de la NTC 5328 bajo los
lineamientos de la norma NTC 5328 (ICONTEC, 2004) y la NTC 3932 (ICONTEC, 1996), se
usó una escala no estructurada de 10 cm, se extendió el formato para calidad general y
aceptación o rechazo del producto.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Propiedades emulsificantes y de retención de agua del plasma
Los resultados de capacidad de emulsificación del plasma entero muestran que las
proteínas del de plasma sanguíneo presentan una buena capacidad emulsificante de 595 mL/g
concentrado que fue moderadamente cercana a la obtenida por Rodríguez Furlán et al. (2007)
de 445 ± 5 mL de aceite/ g concentrado. En el mismo sentido, las muestras tratadas para
capacidad de retención de agua (CRA) muestran un valor de 7,63 mL de agua/g de
concentrado muy cercano al obtenido por Rodríguez Furlán et al. (2007) de 7,31 mL de
agua/g de concentrado. Estos valores obtenidos de capacidad de retención de agua y
emulsificantes son mayores a los de proteínas vegetales como las de leche de soya
163
(CRA=2,05 mL de agua/g concentrado concentrado soya y CE=260 mL de aceite/g de
concentrado de soya) reportadas por Rodríguez Furlán et al. (2007). Estos índices obtenidos
para capacidad de retención de agua y emulsificación indican que el plasma sanguíneo bovino
entero puede ser tecnológicamente utilizado en tratamientos de matrices alimentarias en
donde se requiera la retención de agua y emulsificación de grasas o aceites tales como
mayonesas, salsas y aderezos y emulsiones cárnicas. Estos resultados obedecen a la presencia,
en el plasma sanguíneo bovino, de albúminas (α y β) y globulinas (α, β y γ), que son proteínas
que han sido reportadas como agentes emulsificantes y retenedores de agua (Liu, 2002; Isaza
et al., 2010; Rodriguez et al., 2011b). El efecto emulsificante se basa en el hecho de que las
cadenas laterales de los restos de aminoácidos no polares de estas proteínas se orientan hacia
la fase lipídica y los polares hacia la fase acuosa de la emulsión. Esto permite que las
moléculas de proteína emigren a la interfase aceite/agua de la emulsión y se retengan allí
proporcionando mayor estabilidad a la misma. En el caso particular de la retención de agua,
este efecto posiblemente se deba a la proporción y distribución en las proteínas del plasma de
las cadenas laterales de restos de aminoácidos polares o grupos hidrófilos que establecen
puentes de hidrógeno con el agua y permiten la fijación de la misma a su estructura.
Efecto del emulsificante a base de plasma sobre el jamón cocido de conejo
Los resultados sensoriales de apariencia de los tres jamones estudiados (el primero
elaborado con plasma sanguíneo con proteínas hidrolizadas, el segundo con plasma entero y
el control con polifosfato comercial) se pueden observar en la Figura 1 de caja y bigotes
indicando que se presentan diferencias significativas (p < 0,05) entre los mismos. Los
164
panelistas consideraron de mejor apariencia el jamón con polifosfatos y seguido del jamón
con plasma entero y en tercer lugar, el jamón con plasma con proteínas hidrolizadas
enzimáticamente.
Para el aroma y sabor, y la textura (Figuras 2 y 3) no se encontraron diferencias
significativas (p > 0,05) para la percepción de aroma y sabor y textura entre la muestra control
y los otros dos jamones de conejo. Sin embargo, los panelistas percibieron mejor aroma y
sabor y textura en el jamón de conejo con polifosfatos que en el jamón con plasma entero y
con plasma con proteínas hidrolizadas enzimáticamente.
La percepción de cohesividad y masticabilidad (Figuras 5 y 6) no presentó diferencias
significativas (p> 0,05) entre la muestra control y los otros dos jamones de conejo. Sin
embargo, se observó una mejor aceptación de los panelistas de estos atributos en el jamón de
control siendo el jamón con plasma con proteínas hidrolizadas enzimáticamente el que
registra una menor aceptación. En la Figura 12 de perfil sensorial de los tres jamones de
conejo cocidos, se observó, sobre la escala ordinal establecida de 0 a 8, que es evidente una
mayor aceptación del jamón con plasma entero sobre el que contiene plasma con proteínas
hidrolizadas enzimáticamente. Este resultado se puede explicar debido a que la hidrólisis de
las proteínas del plasma conduce a la obtención de polipéptidos y péptidos de menor peso
molecular alterando la formación de la red u ordenamiento tridimensional de las moléculas
proteicas de la emulsión, es decir, modificando sus propiedades gelificantes, claves para la
percepción sensorial del jamón. Adicionalmente, la hidrólisis de las proteínas disminuye la
viscosidad de la emulsión cárnica incrementando la dispersión, lo que también impide el
desarrollo de un gel adecuado por calentamiento al momento de la cocción del producto a
temperaturas mayores a 50 °C. Este comportamiento puede alterar las propiedades reológicas
165
y de textura del jamón por falta de formación de un gel capaz de retener la elevada cantidad
de agua presente en el jamón. Esto impartiría en el producto elaborado con proteínas
hidrolizadas del plasma una sensación blanda, menor dureza y resistencia al corte, al igual que
una baja masticabilidad y adhesividad tal como se corroboró en el perfil sensorial (ver Figura
12). La masticabilidad y la textura de los tres jamones cocidos de conejo presentan las
evaluaciones más bajas, es decir, masticabilidad desmenuzable, fibrosa y textura pegajosa y
blanda con huecos.
Figura 1. Caja y bigotes de apariencia sensorial para jamón Figura 2. Caja y bigotes de aroma y sabor para jamón de
conejo empleando tres tipos de emulsificante de conejo empleando tres tipos de emulsificante
Figura 3. Caja y bigotes de textura sensorial para jamón Figura 4. Caja y bigotes de color sensorial para jamón
de conejo empleando tres tipos de emulsificante de conejo empleando tres tipos de emulsificante
Apariencia Sensorial
Ap
arie
ncia
PSB Entero PSB Hidrolizado Polifosfato
0
2
4
6
8
Tipo de Emulsificante en Jamón
Aroma y Sabor Sensorial
Aro
ma
y S
ab
or
PSB Entero PSB Hidrolizado Polifosfato
0
2
4
6
8
Tipo de Emulsificante
Textura Sensorial
Te
xtu
ra
PSB Entero PSB Hidrolizado Polifosfato
0
2
4
6
8
10
Tipo de Emulsificante
Color Sensorial
Co
lor
PSB Entero PSB Hidrolizado Polifosfato
4
5
6
7
8
9
Tipo de Emulsificante Jamón C.
166
Figura 5. Caja y bigotes de cohesividad sensorial de jamón Figura 6. Caja y bigotes de masticabilidad sensorial de jamón
de conejo empleando tres tipos de emulsificante jamón de conejo empleando tres tipos de emulsificante
Figura 7. Caja y bigotes de adhesividad instrumental Figura 8. Caja y bigotes de dureza instrumental de jamón
de jamón de conejo empleando tres tipos de emulsificante de conejo empleando tres tipos de emulsificante
Figura 9 Caja y bigotes de cohesividad instrumental Figura 10. Caja y bigotes de elasticidad instrumental de jamón
de conejo empleando tres tipos de emulsificante de jamón de conejo empleando tres tipos de emulsificante
Cohesividad SensorialC
oh
es
ivid
ad
PSB Entero PSB Hidrolizado Polifosfato
0
1
2
3
4
5
6
Tipo de Emulsificante
Masticabilidad Sensorial
Ma
sti
ca
bilid
ad
PSB Entero PSB Hidrolizado Polifosfato
0
2
4
6
8
Tipo de Emulsificante
Adhesividad Instrumental
Ad
he
siv
ida
d (
A3
)
PSB Entero PSB Hidrolizado Polifosfato
-7,8
-5,8
-3,8
-1,8
0,2
Tipo de Emulsificante
Dureza Instrumental
Du
re
za
(N
)
PSB Entero PSB Hidrolizado Polifosfato
12
17
22
27
32
37
42
Tipo de Emulsificante
Cohesividad Instrumental
Co
he
siv
ida
d (
A2
/ A
1)
PSB Entero PSB Hidrolizado Polifosfato
0,12
0,14
0,16
0,18
0,2
0,22
Tipo de Emulsificante
Elasticidad Instrumental
Ela
sti
cid
ad
(L
2 / L
1)
PSB Entero PSB Hidrolizado Polifosfato
0,26
0,31
0,36
0,41
0,46
0,51
0,56
Tipo de Emulsificante
167
Figura 11. Caja y bigotes de masticabilidad instrumental
de jamón conejo empleando tres tipos de emulsificante
Figura 12. Perfil sensorial de los tres jamones cocidos de conejo elaborados con tres tipos de
emulsificantes: plasma sanguíneo bovino sin hidrolizar, plasma sanguíneo hidrolizado y con
polifosfatos
En el análisis del perfil de textura para las mediciones instrumentales de dureza (N),
cohesividad (Área 2/Área1) y masticabilidad (dureza x cohesividad x elasticidad) de los tres
jamones se presentaron diferencias significativas (p<0,05), como se observa en las (Figuras 8,
9, 11) de cajas y bigotes de dureza, cohesividad y masticabilidad instrumental (para dureza el
punto más alto o pico), cohesividad (Área 2 y Área 1) y masticabilidad.
Las mediciones instrumentales de elasticidad (Longitud 2 / Longitud 1) y adhesividad
(Área 3) no presentaron diferencias significativas (p> 0,05). Las figuras 13, 14 y 15 de TPA
Masticabilidad Instrumental
Ma
sti
ca
bilid
ad
(D
X C
X E
)
PSB Entero PSB Hidrolizado Polifosfato
0
1
2
3
4
Tipo de Emulsificante
168
para los tres jamones cocidos de conejo evidencian que no se observaron diferencias notables
en los resultados de las magnitudes de elasticidad (longitud 1 y 2) y adhesividad (Área 3).
Figura 13. Fuerza típica aplicada durante el tiempo en dos ciclos de compresión a
cilindros de jamón de conejo con plasma sanguíneo bovino entero para determinar
parámetros del análisis del perfil de textura. Dureza es fuerza máxima; cohesividad=
Área 2/ Área 1; Elasticidad = Longitud 2 / Longitud 1; Masticabilidad= dureza x
cohesividad x elasticidad; adhesividad = Área 3.
Figura 14. Fuerza típica aplicada durante el tiempo en dos ciclos de compresión a cilindros de
jamón de conejo con plasma sanguíneo bovino hidrolizado para determinar parámetros del
análisis del perfil de textura. Dureza es fuerza máxima; cohesividad= Área 2/ Área 1;
Elasticidad = Longitud 2 / Longitud 1; Masticabilidad= dureza x cohesividad x elasticidad;
adhesividad = Área 3.
169
Figura 15. Fuerza típica aplicada durante el tiempo en dos ciclos de compresión a cilindros de
jamón de conejo con polifosfatos para determinar parámetros del análisis del perfil de textura.
Dureza es fuerza máxima; cohesividad= Área 2/ Área 1; Elasticidad = Longitud 2 / Longitud
1; Masticabilidad= dureza x cohesividad x elasticidad; adhesividad = Área 3.
Las pruebas de textura a nivel sensorial e instrumental (método TPA), presentaron
correlación, es decir, el jamón con menor textura sensorial e instrumental obedeció para estos
dos métodos, al elaborado con plasma sanguíneo bovino con proteínas hidrolizadas
enzimáticamente (Figuras 12, 13, 14 y 15). Estos resultados concuerdan con lo reportado por
Szczesniak (2002), en donde se establecieron correlaciones significativas entre los atributos
de dureza y adhesividad medidos por método TPA instrumental y por método sensorial. En
general, las variaciones de textura en la matriz del jamón de conejo evaluado pueden
atribuirse a diversos factores de la materia prima cárnica como la edad, sexo del animal, las
características del colágeno y actividad metabólica (Combes et al., 2004), así como a la red de
tejido conectivo formada en el proceso de cocción (Renand et al., 2001).
El tratamiento evaluado sensorial e instrumentalmente que arrojó los mejores
resultados frente al producto control fue el jamón elaborado con el plasma sanguíneo bovino
170
entero. Lo anterior posiblemente se deba a que posee una alta capacidad de retención de agua,
de emulsificación y a su capacidad de formar geles a temperaturas mayores a 70°C a las que
se sometieron los jamones durante la cocción, a diferencia del plasma hidrolizado
enzimáticamente que no presentó formación de geles. De hecho, una hidrólisis excesiva de las
proteínas del plasma conlleva a la formación de polipéptidos y péptidos de bajo peso
molecular que tienen menor capacidad de gelificación debido a que se altera drásticamente el
balance de fuerzas repulsivas y de atracción entre las cadenas peptídicas impidiendo la
formación de geles estables. Igual situación ocurre en el caso de las propiedades
emulsificantes en donde una hidrólisis profunda de las proteínas del plasma puede conducir a
fragmentos peptídicos muy polares y a otros poco polares, lo que provoca que se pierda el
balance entre grupos laterales hidrofóbicos e hidrofílicos requeridos para que se manifiesten
estas propiedades de emulsificación. Por lo anterior, el jamón elaborado con plasma
sanguíneo bovino hidrolizado, presentó el menor valor de dureza tanto sensorial como
instrumental (Figuras 13 y 16). El producto de mayor aceptación por el panel semientrenado
frente al control elaborado con polifosfato fue el jamón con incorporación de plasma entero.
Dado estos resultados se siguió trabajando en este estudio con el plasma sanguíneo bovino sin
hidrolizar para el estudio de vida útil.
Aislamiento e identificación del microorganismo alterante
Los resultados obtenidos para el microorganismo alterativo predominante hallado en el
jamón con plasma sanguíneo bovino con nivel medio (2,5%) de incorporación de plasma sin
hidrolizar almacenado a 8 °C, correspondió a la levadura Candida parapsilosis. También las
171
levaduras han sido reportadas en el deterioro de productos cárnicos cocidos y en alteraciones
de la carne, del jamón y otros productos cárnicos. Estos microorganismos son responsables de
la producción de sustancias de mal olor como acetoína y los ácidos acético, butírico,
isobutírico e isovalérico, entre otros; estos compuestos afectan el grado de aceptación del
alimento (Dainty y Hibbard, 1980; Pérez, 2003; Rodríguez, 2004; Canencio et al., 2010).
Figura 16. Perfil del crecimiento de aerobios mesófilos en log UFC/mL en jamón de conejo
con nivel medio (2,5%) de incorporación de plasma sanguíneo bovino (o) datos
experimentales y línea continua () calculadas por el modelo propuesto a 4°C(a), y jamón de
control a 4 °C (b).
En la cinética de crecimiento de aerobios mesófilos como microorganismo alterativo
en este estudio para el jamón con nivel medio de incorporación (2,5%) de plasma sanguíneo
bovino almacenado al vacío a 4°C y jamón de control elaborado con polifosfato comercial y
almacenado a 4°C (Figuras 16a y 16b), al igual que jamón con nivel de incorporación alto
(3%) de plasma almacenado al vacío a 8 °C y jamón control almacenado a la misma
temperatura (Figuras 17a y 17b), se observa que el modelo describe adecuadamente el
comportamiento de su crecimiento, dado que los datos experimentales se ubican próximos a la
línea continua de datos calculados por el modelo propuesto. Este primer tratamiento obedeció
a la mayor vida útil sensorialmente obtenida en este estudio, que fue de 49 días. Los
0 50 100 150
2
2.5
3
3.5
4
4.5
X: 13.9
Y: 2.748
Tiempo (dias)
Rec
uent
o de
Aer
obio
s M
esóf
ilos
log
(UF
C/g
) a
4°C
(a)
LDP M 0 20 40 60 80 100 120
3
4
5
6
7
8
9
tiempo (dias)
LDP Mts
(b)
Rec
uent
o de
aer
obio
s M
esóf
ilos
log
(UF
C/m
L) a
4 °
C
172
resultados obtenidos en la respuesta microbiológica completa para este jamón con nivel medio
de incorporación de plasma empacado al vacío y almacenado a 4 °C en los recuentos de:
mohos y levaduras, bacterias ácido lácticas, coliformes totales, Escherichia coli,
Staphylococcus aureus, esporas de Clostridium sulfito reductor; detección de Salmonella spp
y Listeria monocytogenes cumplieron los requisitos microbiológicos de norma. Este hecho
permite afirmar que las condiciones higiénico-sanitarias durante las operaciones de proceso,
empaque y almacenamiento y de manejo general del producto fueron controladas. Lo anterior,
posiblemente impidió que porciones pequeñas de los microorganismos alterativos y de control
de manipulación y sanitarias de etapas en el proceso, colonizaran al inicio del
almacenamiento refrigerado el producto y se manifestaran alteraciones tempranas.
Figura 17. Perfil del crecimiento de aerobios mesófilos en log UFC/mL en jamón de conejo
con nivel incorporación (3%) de plasma sanguíneo bovino (o) datos experimentales y línea
continua () calculadas por el modelo propuesto a 8°C(a), y jamón de control a 8 °C (b).
Es de anotar que todos los jamones elaborados con incorporación de plasma superaron
la vida útil del jamón de control a las dos temperaturas de estudio (4 y 8°C). En el caso del
jamón de control a 4 °C, se obtuvo una vida útil sensorial de 30 días y para 8 °C de 26 días
(ver Figura 24 y 25).
0 5 10 15 20 25 30 35
2
2.5
3
3.5
4
tiempo (dias)
Rec
uent
o de
Aer
obio
s M
esóf
ilos
log
(UF
C /
g)
a 8°
C
LDP Mts
(a)
0 20 40 60 80 100 120
2.5
3
3.5
4
4.5
5
5.5
6
LDP
Mts
tiempo (dias)
Recuento
de A
ero
bio
s M
esófilo
s log (
UF
C/m
L)
a 8
°C
(b)
173
El microorganismo predominante en el cultivo de jamón en todos los tratamientos,
presentó características macroscópicas de colonias de borde entero, elevación plana,
consistencia blanda y microscopía de levaduras. Por su perfil bioquímico obtenido
corresponde a Candida parapsilosis. Para este grupo de aerobios mesófilos, según
Sablayrolles (1998), la concentración de nitrógeno asimilable es el factor más influyente sobre
la cinética en la mayoría de las fermentaciones. Según Henschke y Jiranek (1993), durante la
fase de crecimiento de las levaduras, el nitrógeno es rápidamente absorbido para sustentar la
actividad anabólica, luego, en la fase no proliferativa, los requerimientos de nitrógeno son
relativamente bajos. Un abundante nivel original en nitrógeno aumenta las tasas de
crecimiento y rendimiento en biomasa y estimula la actividad fermentativa, adiciones más
tardías de nitrógeno asimilable, tendrán un efecto más fuerte sobre la cinética del final de
fermentación que el nivel original, pero no sobre las máximas poblaciones de levaduras
(Henschke y Jiranek, 1993). Este comportamiento metabólico de las levaduras puede explicar
cómo sustratos como el plasma fuente de nitrógeno orgánico incorporado al jamón pudieran
promover el crecimiento de levaduras y estimular actividades fermentativas, y aumentar la
percepción de sabor ligeramente ácido cuando hay una ligera pérdida del vacío lo cual se
presentó al final de los períodos de muestreo de las películas de empaque del jamón. Dado
que el crecimiento de las bacterias acido lácticas no alcanzaron niveles mayores o iguales a
106 UFC/mL para causar deterioro en el jamón, las levaduras predominaron en la matriz
proteica. En un estudio de caracterización de la diversidad microbiana cultivable de las
muestras de la cadena de producción de un lote de jamón de cerdo se ha reportado presencia
de levaduras en etapas posteriores al proceso térmico (Canencio et al., 2010).
174
Efecto del porcentaje de incorporación de plasma y temperatura de almacenamiento
Los resultados obtenidos sobre el efecto del porcentaje de incorporación de plasma y
de las dos temperaturas de almacenamiento refrigerado de estudio, sobre la vida en anaquel de
los jamones se muestran en la Tabla 1. De estos resultados se desprende que el mejor
tratamiento obedeció al jamón elaborado con 2,5% de incorporación de plasma y almacenado
a una temperatura de 4°C, el cual arrojó una vida útil de 51 días. Sin embargo, el análisis de
varianza respectivo no mostró diferencias estadísticamente significativas entre los diferentes
tratamientos.
Tabla 1. Diseño experimental para la evaluación del efecto del porcentaje incorporación de
plasma sanguíneo bovino y temperatura de almacenamiento sobre la vida útil del jamón de
conejo y vida útil obtenida
No
Tratamientos
Incorporación de
plasma (%)
Temperatura
(°C)
Método No 1 Tiempo de
vida útil (días)
Método No 2 Tiempo de
vida útil (días)
1 3 4 39 39
2 2,5 4 51 49
3 1,5 4 28 35
4 3 8 36 35
5 2,5 8 36 35
6 1,5 8 39 31
Método 1: Modelamiento del crecimiento de microorganismo alterativo, Método No 2: Evaluación sensorial.
Los resultados microbiológicos obtenidos para cada tratamiento contrastados con los
requisitos microbiológicos de la norma NTC 1325, evidencian que las muestras de jamón
cocido de conejo, con incorporación de plasma sanguíneo bovino en los tres niveles
estudiados y almacenadas a temperaturas de 4°C y 8°C, cumplieron con las especificaciones
durante el tiempo de evaluación, es decir, el grupo de bacterias deteriorantes incluidas en el
estudio (mesófilas ácido lácticas y mohos y levaduras) no presentaron valores por encima de
175
los niveles límites de UFC/g de muestra estipulados en la norma menciona (Ver anexo 4). Los
valores de pH de las muestras bajo las dos temperaturas de almacenamiento, se mantuvieron
dentro de un rango estable durante el tiempo de seguimiento.
El análisis sensorial realizado a las muestras de jamón cocido de conejo con nivel alto
de incorporación de plasma, empacado al vacío, la calidad sensorial general se mantuvo
estable hasta el día 36 a 4°C y hasta el día 25 a 8°C. El fallo de las muestras se dio por la
pérdida moderada de apariencia característica debido a la aparición de tonalidades amarillas
en la superficie de las tajadas, disminución moderada del olor y sabor característico y
aparición de sabor objetable (oxidado) moderado, como se observa en la figura 19 y 20.
La calidad sensorial general se mantuvo estable hasta el día 31 a 4°C y hasta el día 25
a 8°C, como se muestra en la figura 21 y 22, el fallo de las muestras se dio por la pérdida
moderada de apariencia característica debido a la aparición de tonalidades amarillas en la
superficie de las tajadas, disminución moderada del olor y sabor característico y aparición de
sabor objetable (oxidado). Los valores de pH de las muestras bajo las dos temperaturas de
almacenamiento, se mantuvieron dentro de un rango estable durante el tiempo de
seguimiento.
176
Figura 18. Comportamiento de los descriptores sensoriales para jamón cocido de conejo con
nivel alto de incorporación de plasma almacenado a 4°C.
En el análisis sensorial realizado a las muestras del jamón cocido de conejo nivel bajo
de incorporación de plasma empacado al vacío, la calidad sensorial general se mantuvo
estable hasta el día 32 a 4°C y hasta el día 28 a 8°C. El fallo de las muestras se dio por la
disminución moderada del olor y sabor característico y aparición de sabor objetable (oxidado
y ácido), como se ilustra en la figura 5 y 6.
Figura 19. Comportamiento de los descriptores sensoriales para jamón cocido de conejo con
nivel alto de incorporación de plasma a almacenado a 8°C.
0,0
2,0
4,0
6,0
8,0
10,0
12,0
1 6 11 16 21 26 31 36
Des
crip
tore
s se
nso
rial
es
Tiempo de almacenamiento (Días)
Apariencia Olor característicoOlor objetable Sabor característicoSabor objetable Sabor ferrosoCohesividad Calidad General
0,0
2,0
4,0
6,0
8,0
10,0
12,0
1 6 11 16 21 26 31
Des
crip
tore
s se
nso
rial
es
Tiempo de almacenamiento (Días)
Apariencia Olor característicoOlor objetable Sabor característicoSabor objetable Sabor ferrosoCohesividad Calidad General
177
Figura 20. Comportamiento de los descriptores sensoriales para jamón cocido de conejo con
nivel medio de incorporación de plasma almacenado a 4°C.
Figura 21. Comportamiento de los descriptores sensoriales para jamón cocido de conejo con
nivel medio de incorporación de plasma almacenado a 8°C.
y = -0,055x + 7,4533
R² = 0,9741
0,0
2,0
4,0
6,0
8,0
10,0
12,0
1 6 11 16 21 26 31 36 41 46
Des
crip
tore
s se
nso
rial
es
Tiempo de almacenamiento (Días)
Apariencia Olor característicoOlor objetable Sabor característicoSabor objetable Sabor ferrosoCohesividad Calidad GeneralLímite Crítico para la calidad general Lineal (Calidad General )
y = -0,0889x + 7,5321
R² = 0,9992
0,0
2,0
4,0
6,0
8,0
10,0
12,0
0 5 10 15 20 25 30 35 40
Des
crip
tore
s se
nso
rial
es
Tiempo de almacenamiento (Días)
Apariencia Olor característicoOlor objetable Sabor característicoSabor objetable Sabor ferrosoCohesividad Calidad GeneralLímite Crítico para la calidad general Lineal (Calidad General )
178
Según resultados obtenidos del estudio, la muestra identificada como jamón cocido de
conejo con nivel bajo de incorporación de plasma, empacado al vacío y almacenado a 8°C
presentó una vida útil de 31 días y de 35 días a 4°C.
Figura 22. Comportamiento de los descriptores sensoriales para jamón cocido de conejo con
nivel bajo de incorporación de plasma almacenado a 4°C.
Figura 23. Comportamiento de los descriptores sensoriales para jamón cocido de conejo con
nivel bajo de incorporación de plasma almacenado a 8°C.
0
1
2
3
4
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6
7
8
9
2 7 12 17 22 27 32 37
Des
crip
tore
s se
nso
rial
es
Tiempo de almacenamiento (Días)
Apariencia Olor característico
Olor objetable Sabor característico
Sabor objetable Sabor ferroso
Cohesividad Calidad General
Límite Crítico para la calidad general
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
8,0
9,0
1 6 11 16 21 26 31 36
Des
crip
tore
s se
nso
rial
es
Tiempo de almacenamiento (Días)
Apariencia Olor característicoOlor objetable Sabor característicoSabor objetable Sabor ferrosoCohesividad Calidad GeneralLímite Crítico para la calidad general
179
Los resultados del análisis sensorial realizado a las muestras de jamón de conejo de
control empacado al vacío, la calidad sensorial general se mantuvo estable hasta el día 32 a
4°C y hasta el día 23 a 8°C. El fallo de las muestras se dio por la aparición de sabor y olor
objetable (oxidado y ácido) moderado, como se ilustra en la Figura 25 y 26.
Los resultados obtenidos del estudio muestran que el jamón cocido de conejo de
control, empacado al vacío, presentó vida útil de 25 días bajo condiciones de almacenamiento
de temperatura de 4°C y de 11 días a 8°C.
Figura 24. Comportamiento de los descriptores sensoriales para jamón cocido de conejo de
control a 4°C.
Figura 25. Comportamiento de los descriptores sensoriales para jamón cocido de conejo de
control a 8°C.
0,0
2,0
4,0
6,0
8,0
10,0
2 7 12 17 22 27 32
Des
crip
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les
Tiempo de almacenamiento (Días)
Apariencia Olor característicoOlor objetable Sabor característicoSabor objetable Sabor ferrosoCohesividad Calidad General
0,0
2,0
4,0
6,0
8,0
10,0
12,0
2 7 12 17 22 27 32Des
crip
tore
s se
nso
ria
les
Tiempo de almacenamiento (Días)
Apariencia Olor característico
Olor objetable Sabor característico
Sabor objetable Sabor ferroso
Cohesividad Calidad General
180
CONCLUSIONES
En este trabajo se demostró que la incorporación de plasma sanguíneo bovino entero
en sistemas alimentarios exhibe propiedades funcionales de retención de agua o purgas en
emulsiones aceite/agua y emulsificantes, en sistemas alimentarios como los productos
cárnicos; lo anterior, convierte al plasma entero en un emulsificante alternativo de origen
natural que puede sustituir los polifosfatos comerciales. De esta forma el aprovechamiento del
plasma sanguíneo bovino como residuo de la cadena cárnica se constituye en un recurso para
conferir valor agregado a productos para alimentación humana y animal. Considerando que el
mayor grado de dureza lo presentó el jamón cocido de conejo elaborado con plasma
sanguíneo bovino con proteínas sin hidrolizar, es posible mejorar la dureza sensorial e
instrumental en jamones utilizando este tipo de plasma. Al respecto cabe destacar, como se
comprobó en este estudio, que la evaluación sensorial e instrumental de los atributos de un
producto alimenticio son de gran importancia para estudios de sus propiedades funcionales
cuando se ha incorporado o sustituido uno o más ingredientes en un producto de estudio. De
otro lado, los estudios de determinación de la vida útil del jamón cocido de conejo con una
incorporación de plasma entero del 2,5%, realizados aplicando diferentes métodos,
permitieron establecer que el tiempo de estabilidad microbiológica y sensorial de este
producto se puede alcanzar a los 51 días. Este tiempo se considera prolongado y adecuado
desde el punto de vista comercial para productos cárnicos perecederos. Durante el estudio de
vida útil, se comprobó que el modelo matemático de Gompertz modificado, utilizado para la
predicción del crecimiento del microorganismo específico de deterioro y/o alterativo
181
(recuento de aerobios mesófilos, mohos y levaduras), describe adecuadamente el
comportamiento de su crecimiento, y puede ser utilizado para la predicción del crecimiento de
microorganismos alterativos en jamones cocidos empacados al vacío y almacenados en
refrigeración.
Estos resultados permiten establecer las posibilidades de aprovechamiento del plasma
sanguíneo bovino entero para su uso en la industria alimenticia. Como se demostró en este
estudio, el plasma es un ingrediente de alto valor biológico por su contenido en proteínas y
sus propiedades de emulsificación, capacidad de retención de agua, viscosidad y gelificación
en matrices alimentarias. De esta manera, esta vía de aprovechamiento del plasma tiene el
potencial de contribuir al desarrollo de nuevos productos alimenticios en productos tales
como salsas, aderezos, emulsiones cárnicas y vegetales que requieran ser estabilizadas con
este tipo de ingrediente funcional. Además, cabe destacar que su inclusión en productos
cárnicos procesados cocidos no presenta efectos adversos sobre la vida útil tanto desde el
punto de vista microbiológica, como del sensorial, lo que lo convierte en un insumo de alto
valor tecnológico.
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186
Anexo 1. Diseño de formulaciones de jamón cocido de conejo tipo seleccionado con plasma sanguíneo
bovino entero, con plasma sanguíneo bovino hidrolizado y con polifosfatos.
Composición: Ingredientes % Kg Totales
% ProteinaTotal 15,8409 65,00% 4,412
% Proteína Cárnica 15,1036 3,54% 0,240
% Proteína Vegetal 0,7373 1,18% 0,080
% Grasa 3,9652 2,50% 0,170
% Humedad 73,3438 26,67% 1,810
% Almidón 2,8149 0,74% 0,050
% Sal 1,6756 0,21% 0,014
% Fosfatos 0,0000 0,07% 0,005
% Eritorbatos 0,0503 0,05% 0,004
ppm NaNO2 127,1257 0,05% 0,004
Índices:
Humedad / Proteína Total 4,6300 100,00%
Grasa / Proteína total 0,2503
Sal / Humedad 2,2845
Total Crudo 6,7875
2,65 % merma 0,17986875
Producto terminado 6,6076
Agua
Plasma Entero deshidratado (PD70)
Prep. Sabor Jamón California (7300)
Extendedor Jamon (4801)
Diseño de Jamón cocido de conejo con PSB (PD70) entero deshidratado tipo seleccionado
Carne de Conejo
Tratamiento 1
Producto: Jamón cocido de Conejo tipo Seleccionado
Nitral Sal curante (5700)
Humo Liq. P50 (1802 AI)
Lactato de Sodio (604 AI)
Sal Yodada
Eritorbato de Na
Composición: Ingredientes % kg Totales
% ProteinaTotal 25,9274 64,99% 1,816
% Proteína Cárnica 25,0137 4,30% 0,120
% Proteína Vegetal 0,9136 1,43% 0,040
% Grasa 4,1745 15,00% 0,419
% Humedad 57,7927 11,71% 0,327
% Almidón 3,4880 1,79% 0,050
% Sal 4,0795 0,50% 0,014
% Fosfatos 0,0000 0,18% 0,005
% Eritorbatos 0,0534 0,05% 0,002
ppm NaNO2 315,0433 0,05% 0,002
Índices:
Humedad / Proteína Total 2,2290 100,00%
Grasa / Proteína total 0,1610
Sal / Humedad 7,0589
Total Crudo 2,7934
4,55 % merma 0,1270997
Producto terminado 2,6663
Nitral Sal curante
Humo Liquido P50
Lactato de Sodio
Sal Yodada
Eritorbato de sodio
Carne de Conejo
Tratamiento 2
Producto: Jamón cocido de Conejo tipo Seleccionado
Agua
PSB entero hidrolizado
Prep. Sabor Jamón California
Extendedor Jamon
Diseño de Jamón cocido de conejo con PSB (PD70) entero deshidratado tipo seleccionado
Composición: Ingredientes % kg Totales
% Prot.Total 14,0083 65,37% 3,630
% Prot. Cárnica 13,1191 4,32% 0,240
% Prot.Vegetal 0,8893 1,44% 0,080
% Grasa 3,9092 0,50% 0,028
% Humedad 74,2782 27,01% 1,500
% Almidón 3,3950 0,90% 0,050
% Sal 1,8034 0,25% 0,014
% Fosfatos 0,4855 0,09% 0,005
% Eritorbatos 0,0520 0,05% 0,003
ppm NaNO2 153,3241 0,05% 0,003
Índices:
Humedad / Proteína Total 5,3024 100,00% 5,553
Grasa / Proteína total 0,2791
Sal / Humedad 2,4279
Total Crudo 5,5530
1,34 % merma 0,0744102
Producto terminado 5,4786
Tratamiento 3
Eritorbato de Na
Diseño de Jamón cocido de conejo con polifosfatos tipo seleccionado
Polifosfato de sodio
Agua
Carne de Conejo
Extendedor Jamon (4801)
Prep. Sabor Jamón California (7300)
Nitral Sal curante (5700)
Humo Liq. P50 (1802 AI)
Lactato de Sodio (604 AI)
Sal Yodada
hidrolizado
hidrolizado
187
Anexo 2. Formato de evaluación sensorial para jamón de conejo
Descriptor evaluado Días de evaluación
1 7 15 31 36 39
Apariencia
Olor característico
Olor objetable
Sabor característico
Sabor objetable
Sabor ferroso
Cohesividad
Calidad general
Aceptación /
Rechazo A A A A A R
Observaciones
Método de análisis
NTC 3932 y 5328.
Evaluación de las siguientes características sensoriales: apariencia característica, sabor y olor característico, sabor y olor objetable, sabor ferroso, cohesividad y calidad general. Se usó una escala estructurada de 10 puntos.
Dónde: 0 es ausencia y 10 marcado.
A=Aceptación, R=Rechazo
Anexo 3. Resultados microbiológicos para jamón de conejo con nivel alto, medio y bajo de
incorporación plasma sanguíneo bovino almacenado a 4 y 8 °C y jamón control con polifosfato.
Resultado microbiológico para jamón de conejo con nivel alto incorporación plasma sanguíneo bovino
almacenado a 8 °C
Parámetros Días de almacenamiento
Especificaciones* 0 7 11 18 25 28 35 36
Recuento de
Aerobios mesófilos 70 60 70 160 6000 9400 10000 13000 100000 UFC /g
Recuento de
Coliformes totales <10 - - <10 <10 - - - 500 UFC /g
Recuento de
Escherichia Coli <10 - - <10 <10 - - - <10 UFC /g
Recuento de
Staphylococcus
aureus
<100 - - <100 <100 - - - 100 UFC /g
Detección de
Listeria
Monocytogenes
A. - - A A - - - Ausencia en 25 g
Detección de
Salmonella A - - A A - - - Ausencia en 25 g
Recuento de esporas
Sulfito reductor <10 - - A A - - - <10 UFC/g
Recuento de mohos
y levaduras <10 <10 <10
<10
Mohos
2500
Lev
<10
Mohos
3200 Lev
<10
Mohos
1800
Lev
<10
Mohos
3300 Lev
<10
Mohos
700 Lev
No aplica
Recuento de BAL
mesófilas 40 100 150 220 1450 2000 9500 2000 No aplica
188
Resultado microbiológico para jamón de conejo nivel alto almacenado a 4°C
Parámetros Días de almacenamiento Especificaciones
* 0 7 15 24 36 39
Recuento de Aerobios
mesófilos 1400 40 160 5500 8000 9900 100000 UFC /g
Recuento de Coliformes
totales <10 - - <10 - <10 500 UFC /g
Recuento de Escherichia
Coli <10 - - <10 - <10 <10 UFC /g
Recuento de
Staphylococcus aureus <100 - - <100 - <100 100 UFC /g
Detección de Listeria
Monocytogenes A - - A - Ausencia Ausencia en 25 g
Detección de Salmonella A - - A - Ausencia Ausencia en 25 g
Recuento de esporas Sulfito
reductor <10 - - <10 - <10 <10 UFC/g
Recuento de mohos y
levaduras <10 <10 <10
<10
Mohos
130
Levadura
<10 Mohos
400 Levaduras
<10 Mohos
210
Levaduras
No aplica
Recuento de BAL
mesófilas 70 170 190 500 800 100 No aplica
Resultado microbiológico para jamón de conejo nivel medio de incorporación de plasma sanguíneo bovino
almacenado a 8°C
Parámetros
Especificaciones* 0 7 11 18 25 28 35 36
Recuento de Aerobios
mesófilos 70 <10
50
0 1500 2200
1380
0 9700
1020
0 100000 UFC /g
Recuento de Coliformes
totales <10 - - <10 <10 - - - 500 UFC /g
Recuento de Escherichia
Coli <10 - - <10 <10 - - - <10 UFC /g
Recuento de
Staphylococcus aureus
<10
0 - - <100 <100 - - - 100 UFC /g
Detección de Listeria
Monocytogenes A - - A A - - - Ausencia en 25 g
Detección de Salmonella A - - A A - - - Ausencia en 25 g
Recuento de esporas
Sulfito reductor <10 - - <10 <10 - - - <10 UFC/g
Recuento de mohos y
levaduras <10 <10
<1
0
<10
Mohos400
0 Lev
<10
Mohos
1400
Lev
<10
Moho
s
2700
Lev
<10
Moh
os
4000
Lev
<10
Moh
os
1500
Lev
No aplica
Recuento de BAL
mesófilas 40 <10
21
0 350 1100 2800
1800
0 3100 No aplica
Resultado microbiológico para jamón de conejo nivel medio de incorporación de plasma sanguíneo bovino
almacenado a 4°C
189
Parámetros Días de almacenamiento
Especificaciones* 0 7 15 24 51
Recuento de Aerobios mesófilos 80 100 1300 1450
0 15800 100000 UFC /g
Recuento de Coliformes totales <10 - - <10 <10 500 UFC /g
Recuento de Escherichia Coli <10 - - <10 <10 <10 UFC /g
Recuento de Staphylococcus aureus <100 - - <100 <100 100 UFC /g
Detección de Listeria
Monocytogenes A - - A A Ausencia en 25 g
Detección de Salmonella A - - A A Ausencia en 25 g
Recuento de esporas Sulfito reductor <10 - - <10 <10 <10 UFC/g
Recuento de mohos y levaduras <10 <10 -
<10
Moh
os
550
Lev
<10 Mohos
650 Lev No aplica
Recuento de BAL mesófilas 10 20 140 1000 850 No aplica
Resultado microbiológico para jamón de conejo nivel bajo almacenado a 8°C
Parámetros Días de almacenamiento Especificacio
nes* 0 7 11 18 25 28 35 39
Recuento
de
Aerobios
mesófilos
70 350 910 1800 3600 14900 36000
0 40000
100000 UFC
/g
Recuento
de
Coliformes
totales
<10 - - <10 <10 - <10 <10 500 UFC /g
Recuento
de
Escherichia
Coli
<10 - - <10 <10 - <10 <10 <10 UFC /g
Recuento
de
Staphyloco
ccus aureus
<100 - - <100 <100 - <100 <100 100 UFC /g
Detección
de Listeria
Monocytog
enes
Ausencia - - Ausen
cia
Ausen
cia -
Ausen
cia
Ausen
cia
Ausencia en
25 g
Detección
de
Salmonella
Ausencia - - Ausen
cia
Ausen
cia -
Ausen
cia
Ausen
cia
Ausencia en
25 g
190
Recuento
de esporas
Sulfito
reductor
<10 - - <10 <10 - - <10 <10 UFC/g
Recuento
de mohos y
levaduras
<10 Mohos <10
Levadura
<10
Mohos
<10
Levad
ura
<10
Mohos
600
Levad
ura
<10
Mohos
18300
Levad
ura
<10
Mohos
4200
Levad
ura
<10
Mohos
3000
Levad
ura
<10
Mohos
2800
Levad
ura
<10
Mohos
2000
Levad
ura
No aplica
Recuento
de BAL
mesófilas
40 150 1300 1500 4000 8000 13000 1500 No aplica
Resultado microbiológico para jamón de conejo con nivel bajo de incorporación de plasma sanguíneo bovino
almacenado a 4 °C
Parámetros Días de almacenamiento Especificacion
es* 0 7 15 28 37
Recuento de
Aerobios mesófilos 70 260 280 12100 218000 100000 UFC /g
Recuento de
Coliformes totales <10 - - <10 - 500 UFC /g
Recuento de
Escherichia Coli <10 - - <10 - <10 UFC /g
Recuento de
Staphylococcus
aureus
<100 - - <100 - 100 UFC /g
Detección de
Listeria
Monocytogenes
Ausencia - - Ausencia - Ausencia en 25
g
Detección de
Salmonella Ausencia - - Ausencia -
Ausencia en 25
g
Recuento de
esporas Sulfito
reductor
<10 - - <10 - <10 UFC/g
Recuento de
mohos y levaduras
<10 Mohos <10
Levadura
<10 Mohos
<10
Levadura
<10
Mohos
10
Levadura
<10
Mohos
5000
Levadura
<10
Mohos
6000
Levadura
No aplica
Recuento de BAL
mesófilas 40 80 130 4500 94000 No aplica
191
Resultado microbiológico para jamón de conejo control con polifosfato almacenado a 4 °C
Parámetros Dias de almacenamiento
Especificaciones* 0 14 20 25 34
Recuento de Aerobios
mesófilos 300 - 6800 8800 128000 100000 UFC /g
Recuento de
Coliformes Totales <10 - <10 - - 500 UFC /g
Recuento de
Escherichia coli <10 - <10 - - <10 UFC /g
Recuento de
Staphylococcus
aureus
<100 - <100 - - 100 UFC /g
Detección de Listeria
Monocytogenes Ausencia - Ausencia - - Ausencia en 25 g
Detección de
Salmonella Ausencia - Ausencia - - Ausencia en 25 g
Recuento de esporas
Sulfito reductor <10 - <10 - - <10 UFC/g
Recuento de mohos y
levaduras
<10
Mohos
<10
Levadura
<10 Mohos
2100
Levadura
<10 Mohos
2500
Levadura
<10 Mohos
1800
Levadura
<10 Mohos
12000
Levadura
No aplica
Recuento de
Bacterias mesófilas
acido lácticas
30 1300 1500 350 8500 No aplica
Resultado microbiológico para jamón de conejo control almacenado a 8 °C
Parámetros Días de almacenamiento
Especificaciones* 0 11 18 25
Recuento de aerobios mesófilos 300 29400 331000 355000 100000 UFC /g
Recuento de Coliformes Totales <10 - - <10 500 UFC /g
Recuento de Escherichia coli <10 - - <10 <10 UFC /g
Recuento de Staphylococcus
aureus <100 - - <100 100 UFC /g
Detección de Listeria
Monocytogenes Ausencia - - Ausencia Ausencia en 25 g
Detección de Salmonella Ausencia - - Ausencia Ausencia en 25 g
Recuento de esporas Sulfito
reductor <10 - - <10 <10 UFC/g
Recuento de mohos y levaduras
<10
Mohos
<10
Levadura
<10 Mohos
3600
Levadura
<10 Mohos
4500
Levadura
<10 Mohos
144000
Levadura
No aplica
Recuento de Bacterias
Mesofilas acido lácticas 30 14800 8200 9500 No aplica
192
Anexo 4. Promedios de vida útil de jamón de conejo control con polifosfatos a temperaturas de
almacenamiento de 4 y 8 °C
No Tratamientos
Incorporación polifosfato (%)
Temperatura (°C)
Método No 1
Tiempo de vida útil (días)
Método No 2
Tiempo de vida útil (días)
Método No 3
Tiempo de vida útil (días)
Ds
1 0,5 4 - 25 26
2 0,5 8 35 11 23 Método N
o1: Organismo específico de deterioro, Método N
o2: Modelamiento del crecimiento de microorganismo
alterativo, Método No 3 Evaluación sensorial.
193
Anexo 5. Resultados físico-químicos de jamón control almacenado a 4 y 8°C
Resultados - Temperatura de almacenamiento a 4°C
Producto Día de almacenamiento
pH en solución a 20°C Potencial Redox (Eh)
mV
Jamón de conejo control
Inicial 6,47
-- Día 18 6,46
Día 25 6,39
Día 42 -- -14,0
Especificaciones No Aplica No Aplica
Método de análisis NTC 440 Electrodo de platino
Resultados - Temperatura de almacenamiento a 8°C
Producto
Día de
almacenamiento pH en solución a 20°C % Cloruros
Actividad de
agua (Aw) a
25°C
Potencial
Redox (Eh)
mV
Jamón de
conejo control
Inicial 6,47 - - -
Día 18 6,34 2,22 0,983
Día 26 6,28 - -
Día 42 - - - -75,0
Especificaciones No Aplica No Aplica No Aplica No Aplica
Método de análisis NTC 440 NTC 696 AOAC 978.18 Electrodo de
platino
Resultados - Temperatura de almacenamiento a 4°C
Producto Día de
almacenamiento pH en solución a 20°C Potencial Redox (Eh)
mV
Jamón de conejo con nivel alto
de
incorporación de plasma
Inicial 6,62
--
Día 8 6,58
Día 16 6,58
Día 40 6,60
Día 65 -- - 13,0
Especificaciones No Aplica No aplica
Método de análisis NTC 440 Electrodo de platino
Resultados - Temperatura de almacenamiento a 8°C
Producto Día de
almacenamiento pH en solución a 20°C
%
Cloruro
de
sodio
Actividad
de agua
(aw) a
25°C
Potencial
Redox
(Eh) mV
Jamón de conejo con nivel alto
de
incorporación de plasma
Inicial 6,62
- - --
Día 8 6,57
Día 12 6,62
Día 19 6,66
Día 26 6,56
Día 36 6,59 2,86 0,977
Día 65 -- -- -- -18,0
Especificaciones No Aplica No
Aplica
No
Aplica
No
Aplica
194
5.1.1. Resultados - Temperatura de almacenamiento a 4°C
Producto Día de almacenamiento
pH en solución a 20°C Potencial Redox (Eh)
mV
Jamón de conejo con nivel
medio de
incorporación de plasma
Inicial 6,58
-- Día 8 6,55
Día 16 6,51
Día 49 6,51
Día 65 -- -14,0
Especificaciones No Aplica No Aplica
Método de análisis NTC 440 Electrodo de platino
Resultados - Temperatura de almacenamiento a 8°C
Producto
Día de
almacenamiento pH en solución a 20°C
%
Cloruros
Actividad
de agua
(aw ) a
25°C
Potencial
Redox
(Eh) mV
Jamón de conejo con nivel
medio de
incorporación de plasma
Inicial 6,58
-- -- --
Día 8 6,54
Día 12 6,59
Día 19 6,55
Día 26 6,55
Día 36 6,55 2,81 0,977
Día 65 -- -- -- -26,0
Especificaciones No Aplica No
Aplica
No
Aplica
No
Aplica
Método de análisis NTC 440
NTC
696 AOAC
978.18
Electrodo
de
platino
5.1.1. Resultados - Temperatura de almacenamiento a 4°C
Producto Día de
almacenamiento pH en solución a 20°C Potencial Redox (Eh) mV
Jamón de conejo con nivel bajo de
incorporación de plasma
Inicial 6,54
-- Día 8 6,48
Día 35 6,43
Día 65 -- -17,0
Especificaciones No Aplica No Aplica
Método de análisis NTC 440 Electrodo de platino
195
Resultados - Temperatura de almacenamiento a 8°C
Producto
Día de
almacenamient
o
pH en solución a
20°C
%
Cloruro
s
Activida
d de agua
(aw) a
25°C
Potencial
Redox
(Eh) mV
Jamón de conejo con nivel bajo
de
incorporación de plasma
Inicial 6,54
-- -- --
Día 8 6,47
Día 12 6,53
Día 19 6,44
Día 27 6,56
Día 31 6,45 2,49 0,980
Día 65 -- -- -- -14,0
Especificaciones No Aplica No
Aplica
No
Aplica
No
Aplica
Método de análisis NTC 440 NTC
696
AOAC
978.18
Electrod
o de
platino
196
CAPÍTULO VIII
Discusión general
Las proteínas de la sangre presentes en el plasma sanguíneo bovino, como la
seralbúmina y la globulina tienen una gran importancia para la industria alimenticia por
presentar propiedades funcionales emulsificantes de grasas y de retención de agua en sistemas
alimentarios como emulsiones cárnicas o embutidos de pasta fina (Benítez et al., 2003;
Barboza et al., 2005). Dentro de los emulsificantes de origen animal, las proteínas del plasma
sanguíneo bovino presentan una menor actividad emulsificante que la caseína, pero mayor
que la de la harina de soya y que las proteínas cárnicas (Ockerman y Hansen, 1994).
En el presente estudio, se halló la capacidad emulsificante y la capacidad de retención
de agua del plasma sanguíneo bovino entero. La capacidad emulsificante obtenida en esta
tesis para el plasma bovino sanguíneo entero deshidratado fue de 595 mL de aceite/g de
concentrado proteico, superior al hallado por Rodríguez et al. (2007) de 445 mL de aceite/g
de concentrado proteico determinado con el mismo sistema. Para el caso de la propiedad
funcional de capacidad de retención de agua, se obtuvo un valor de 7,63 mL de agua/g de
concentrado proteico, cercano al reportado por Rodríguez et al. (2007) de 7,31 mL de agua/g.
Estos resultados obtenidos muestran el potencial uso de este concentrado proteico de origen
animal en la emulsificación y absorción de agua en diferentes matrices alimentarias. Al
respecto, se requiere continuar este tipo de estudios en otros productos como carnes
197
emulsificadas, pastas de panadería, sopas, salsas y demás productos en los que se requiera
aumentar su viscosidad y mejorar la textura.
No solo el uso del plasma sanguíneo bovino entero ha tomado importancia
recientemente, sino también sus proteínas parcialmente hidrolizadas. Por ello, hoy en día es
de gran interés modelar el comportamiento de sistemas que involucren reacciones de
hidrólisis enzimática a fin de dimensionar equipos industriales, pronosticar comportamientos
dinámicos, controlar tiempos de proceso y otras variables cinéticas. En el presente estudio, se
llevó a cabo el modelamiento de la cinética de la hidrólisis enzimática del plasma sanguíneo
bovino empleando una proteasa alcalina comercial, encontrándose que, al inicio de la
reacción, se presenta un aumento del grado de hidrólisis en el tiempo con una estabilización
posterior al final del proceso. Este resultado es similar al obtenido por Figueroa et al. (2012)
utilizando el mismo montaje experimental de nuestro estudio pero con preparados proteicos
de menor concentración de proteína (4 a 8 g/L). Este hecho refleja la importancia que tiene el
manejo de la relación enzima-sustrato en la reacción hidrolítica para la obtención de grados de
hidrólisis que conduzcan a fragmentos de péptidos de interés y, en particular, a niveles de
contenido de aminonitrógeno asimilable que puedan constituir fuentes de nitrógeno asimilable
adecuadas para el cultivo de lactobacilos, para lo cual es de singular importancia la utilización
de soluciones proteicas concentradas en calidad de sustrato. En general, los grados de
hidrólisis alcanzados en este trabajo son mayores que los reportados para soluciones de
plasma sanguíneo bovino de menor concentración proteica y están en un rango entre 10,0% y
17,4%, comparados a los obtenidos por Figueroa et al. (2012) de 13,3%. De otro lado, es de
aclarar que el grado de hidrólisis como una relación entre el número de enlaces peptídicos
198
escindidos y el número de enlaces peptídicos totales en la proteína nativa por unidad de peso,
aumenta en la reacción hidrolítica cuando se incrementa la dosis de enzima, lo cual es un
comportamiento típico en cinética enzimática de proteínas.
El modelo propuesto en este estudio puede ser usado para estimar el grado de
hidrólisis en el tiempo en el caso de preparados proteicos del plasma bovino sanguíneo de alta
concentración usando una proteasa alcalina comercial. Estos hidrolizados proteicos tienen el
potencial de tener niveles altos de nitrógeno asimilable (particularmente grupos –NH2
terminales de los péptidos formados. La predicción del comportamiento de la hidrólisis
enzimática con modelos matemáticos es crucial para el diseño de nuevos medios de cultivo de
bajo costo para fermentaciones industriales como los basados en plasma sanguíneo bovino.
En la presente tesis doctoral, se demostró que al utilizar las proteínas del plasma
bovino hidrolizadas enzimáticamente como base de un medio de cultivo líquido para
fermentaciones sumergidas de lactobacilos, la masa celular obtenida a nivel de banco es
significativamente alta llegando a alcanzar valores del 74% respecto al crecimiento obtenido
en el medio comercial MRS. De esta manera, se exploró la posibilidad de utilizar esta valiosa
fuente de proteína en la producción de cultivos iniciadores homolácticos y lactobacilos. Con
el fin dar un mayor aprovechamiento al plasma sanguíneo bovino, se planteó en esta tesis el
diseño de un medio óptimo de cultivo a base de hidrolizados enzimáticos de proteínas de
plasma para lactobacilos. Se utilizó, para tal fin la metodología de volumen de respuesta que
permitió hallar un medio basado en plasma con proteínas hidrolizadas que maximizó el
crecimiento celular de L. plantarum ATCC 8014. Igualmente, se evaluó el efecto del
contenido de aminonitrógeno de estos hidrolizados y la concentración de sustrato (un azúcar
199
de menor costo como la sacarosa), sobre el crecimiento celular de L. plantarum a nivel de
laboratorio. Este medio tuvo una concentración de sacarosa de 80 g/L, de aminonitrógeno de
825 mg/L evaluado a un tiempo de 33,7 h como el óptimo predicho por el modelo de
regresión. El contenido de aminonitrógeno del medio óptimo propuesto para la fermentación a
nivel de banco es muy cercano al del medio MRS de 857 mg/L. El valor de concentración
celular predicho por el modelo fue de 5,67×107
UFC/mL, mientras el valor experimental
promedio obtenido por triplicado fue de 4,8 ×107
UFC/mL. Lo anterior demuestra la validez
del enfoque metodológico utilizado para hallar un medio que maximice la concentración
celular de L. plantarum ATCC 8014. Se encontró que las interacciones dobles y triples entre
la concentración de sacarosa, el contenido de aminonitrógeno y el tiempo de cultivo, tienen un
efecto significativo en el crecimiento del lactobacilo estudiado.
Una vez obtenido el medio óptimo, se planteó en esta tesis la necesidad de escalar el
proceso de fermentación del nivel de laboratorio al nivel de banco con este medio y realizar la
evaluación del efecto iniciador (starter) en el proceso de maduración de un producto cárnico
(pepperoni) con la biomasa obtenida de L. plantarum. Los resultados mostraron que, aunque
la velocidad de crecimiento alcanzada en el medio a nivel de banco es menor a la del medio
MRS, en aquél se alcanzan mayores concentraciones de biomasa viable de L. plantarum
ATCC 8014 (3,80 × 109 UFC/mL frente a 3,38×10
9 UFC/mL del medio MRS). El modelo
determinístico, no segregado y dinámico propuesto describió adecuadamente la cinética de
crecimiento de L. plantarum ATCC 8014 en cultivo discontinuo a nivel de banco al igual que
el consumo de sustrato. De otro lado, el modelo de regresión multivariado de segundo orden
propuesto, puede ser usado para predecir el crecimiento de la biomasa viable de lactobacilos a
200
nivel de laboratorio en medios que utilicen hidrolizados de proteínas del plasma sanguíneo
bovino como fuente de nitrógeno a diferentes concentraciones de aminonitrógeno y sacarosa.
El pepperoni elaborado con el cultivo iniciador de L. plantarum ATCC 8014 obtenido
a nivel de banco (biorreactor de 3 L) en el medio a base de hidrolizado de proteínas de plasma
bovino definido en este estudio, no mostró una diferencia estadísticamente significativa en los
perfiles de pH y actividad del agua durante su maduración, frente al pepperoni de control
elaborado con el cultivo comercial. Estos perfiles no permitieron daños sensoriales en el
producto final lográndose la estabilidad sensorial del producto. La calidad general del
pepperoni empleando como cepa iniciadora L. plantarum ATCC 8014 fue calificada como
alta por el 70% de los jueces y media por los restantes miembros del panel. De esta manera, la
producción de cultivos iniciadores de bacterias acido lácticas (L. plantarum) cultivadas a nivel
de banco empleando hidrolizados de proteínas de plasma bovino es viable, lo que representa
una importante oportunidad de aprovechamiento de este residuo de la cadena cárnica.
Finalmente, se determinó la vida útil de un jamón cocido no convencional a base de
carne conejo, empleando para su elaboración tres niveles de incorporación de plasma
sanguíneo bovino. Para su estudio, se propusieron dos temperaturas de almacenamiento (4 y 8
°C) del producto tajado y empacado al vacío, representativas de las usadas para
almacenamiento a nivel doméstico y en anaqueles comerciales. Se utilizó como organismos
específicos de deterioro las bacterias acidolácticas, los aerobios mesófilos y los mohos y
levaduras. La calidad microbiológica de estos jamones indica que no hubo presencia de
patógenos durante los períodos de estudio (entre el día 1 y 51 de almacenamiento). La calidad
sensorial se conservó en niveles aceptables para el panel de expertos desde el día 25 hasta el
201
día 51, lo que representa excelentes vidas de anaquel. La vida útil máxima alcanzada
sensorialmente se presentó en el tratamiento del jamón de conejo elaborado con un nivel
medio de incorporación de plasma sanguíneo bovino, empacado al vacío y almacenado a 4°C.
Todos los tratamientos empleando plasma sanguíneo bovino para la elaboración de jamón de
conejo cocido, presentaron mayor vida útil a las dos temperaturas de estudio (4° y 8°C) que el
producto de control, sin la incorporación del mismo.
Los resultados obtenidos en esta tesis permiten establecer las posibilidades de
aprovechamiento del plasma sanguíneo bovino para su uso en la industria alimenticia no
solamente por sus propiedades funcionales, sino también como fuente de nitrógeno asimilable
por cultivos iniciadores para maduración de productos cárnicos. Como se demostró en este
estudio, el plasma es un ingrediente de alto valor biológico por su contenido en proteínas y
sus propiedades de emulsificación, capacidad de retención de agua, viscosidad y gelificación
en matrices alimentarias. Lo anterior, permitirá disponer de un ingrediente funcional derivado
de un residuo de la industria cárnica para el sector alimentario, así como de una fuente de
nitrógeno para la industria microbiológica.
Considerando los resultados obtenidos en esta tesis, se recomienda para futuros
estudios investigar en los siguientes aspectos:
Realizar estudios de cinética de hidrolisis enzimática con otros subproductos o residuos
del sector pecuario tales como plasma sanguíneo de otras especies, vísceras de pollo,
carnaza de bovino y pieles de cerdo y de otras especies menores promisorias aportantes de
fuente de nitrógeno asimilable.
202
Emplear medios a base de plasma sanguíneo bovino y sacarosa para el cultivo de otros
microorganismos de importancia industrial como levadura de panificación, proteína
unicelular y hongos micromicetos.
Evaluar materiales residuales alternativos como fuente de carbono (hidrolizados de
residuos amiláceos y lignocelulósicos, suero de leche y mucilago de café, entre otros) en
asociación con el plasma sanguíneo bovino como fuente de nitrógeno en la formulación de
medios para el cultivo de bacterias ácido lácticas.
Escalar el proceso de obtención de L. plantarum en un medio a base de plasma sanguíneo
bovino a nivel piloto aprovechando la infraestructura de la Planta de Bioprocesos y
Agroindustria de la Universidad de Caldas.
Formular y evaluar físico-química, microbiológica y sensorialmente productos
alimenticios alternativos (helados, salsas, aderezos, productos panificables, etc.)
empleando el plasma sanguíneo bovino, tanto entero como con proteínas hidrolizadas,
como emulsificante, gelificante y retenedor de agua.
REFERENCIAS
Barboza Y., Arévalo E., Márquez E., Piñero M.P., Parra K., Anderson H. (2005). Efecto de la
incorporación de proteína plasmática sobre la composición química y calidad proteica
de un producto formulado con maíz tierno. Revista Científica, 15(6): 536-542.
Benítez B., Archile A., Barboza Y., Rangel L., Ferrer K., Bracho M. (2003). Calidad
Microbiológica de un producto formulado con carne de pollo deshuesada
mecánicamente ,plasma y globulos rojos de bovino. Revista Cientifica Facultad de
Ciencias Veterinarias- Universidad del Zulia, 13(4): 293-298.
203
Figueroa O.A., Zapat J.É., Gutiérrez L.F. (2012). Modelamiento de la cinética de hidrólisis
enzimática del plasma sanguíneo bovino. Revista Escuela de Ingeniería de Antioquía,
(17): 71-84.
Ockerman H.W., Hansen C.L. (1994). Industrializacion de subproductos de origen animal.
En: Aprovechamiento de la sangre. Editorial Acribia: Zaragoza España. p. 239-262.
Rodríguez L., Rinaldoni A., Pérez A., Campderrós M. (2007). Análisis comparativo de
propiedades funcionales de concentrados proteicos obtenidos por ultrafiltración. pp
1-7
