ESTRUCTURA, FUNCIÓN Y CLASIFICACIÓN DELAS ENZIMAS

4.1. CONCEPTOS GENERALESToda reacción química, biológica o inorgá-nica, es un proceso en el que una o variasmoléculas interactúan entre sí para transfor-marse en otras moléculas siguiendo unadirección determinada por leyes fisicoquí-micas (termodinámicas) hasta llegar a un es-tado de equilibrio:

A + B , ) C + D

Existen sustancias llamadas catalizadores que tienen la capacidad de acelerar las reac-ciones químicas sin alterarse al final de éstasy sin modificar el equilibrio químico; sóloacortan el tiempo en que se alcanza dichoequilibrio.Los catalizadores se dividen en dos gru-pos: orgánicos e inorgánicos. Dentro de losprimeros tenemos las enzimas y en el segun-do los iones H+, OH " o metálicos.Las enzimas son moléculas producidaspor las células de los organismos vivos conla función específica de catalizar reaccionesquímicas, las que sin ellas, ocurrirían muylentamente.Hasta hace pocos años se consideraba quetodas las enzimas eran proteínas. Sin embar-

go, recientes investigaciones realizadas porCech y colaboradores (Cech, T.R., Science,236, 1532-39 (1987) han demostrado quemoléculas de RNA pueden actuar como en-zimas con una elevada actividad catalítica.Se ha comprobado experimentalmente quela molécula de RNA L-19 derivada de un in-trón de un precursor de una RNAr de un pro-tozoario ciliado actúa como ribonucleasa y como RNA polimerasa. Esta enzima deRNA o RNA enzimático o ribozima muestralas mismas propiedades cinéticas que lasotras enzimas tradicionales, un alto grado deespecificidad y susceptibilidad a la inhibi-ción competitiva. Este descubrimiento pue-de tener importantes implicaciones sobre laevolución de las moléculas y puede contri-buir a aclarar el mecanismo de acción de loscatalizadores.La vida y el crecimiento celular requierenla continua síntesis de macromoléculas aco-plada a procesos proveedores de energía. Elacoplamiento controlado de las reaccionesquímicas mediante la acción de enzimas espropiedad única de las células vivas. Entrelas miles de sustancias presentes en una cé-lula, las enzimas constituyen la parte másimportante de las proteínas celulares. Esen-cialmente, todas las reacciones bioquímicasson catalizadas por enzimas.

cia emplean coenzimas del tipo del NAD+ ,NADP+, FAD, ácido lipoico y CoQ comoaceptores de hidrógeno; otros aceptores in-cluyen al grupo hemo y al oxígeno molecular.En este grupo se incluyen deshidrogenasas y oxidasas de gran importancia en los proce-sos oxidativos de la respiración celular. Lacatalasa es única en el sentido de que el pe-róxido de hidrógeno (H2O2) sirve tanto co-mo donador y como aceptor. La catalasafunciona en la célula eliminando el peróxidode hidrógeno que es tóxico.

2.- Transferasas.- Muchos pasos impor-tantes del metabolismo requieren la transfe-rencia de una molécula a otra de gruposámino, carboxilo, carbonilo, metilo, ácido,glucosilo, o fosforilo. Las coenzimas utili-zadas son el tetrahidrofolato (FH4) coenzimaA (CoA-SH) y fosfato de piridoxal (PPal). Lasaminotansferasas (transaminasas) transfierengrupos amino de un aminoácido a un cetoá-cido aceptor, dando lugar a la formación deun nuevo aminoácido y un nuevo cetoácido.Las cinasas catalizan la transferencia de unfosfato del ATP a grupos aceptores, alcohol o ámino, como ejemplo tenemos la glucocina-sa que forma glucosa-fosfato. La síntesis deglucógeno depende de glucosiltransferasas.

3.- Hidrolasas.- Catalizan el rompimientode una molécula, con participación de agua,entre enlaces carbono y cualquier otro áto-mo. Este grupo de enzimas se puede conside-rar como una clase especial de transferasasen las que el grupo donador se transfiere alagua. La rotura del enlace peptídico es buenejemplo de esta reacción llevada a cabo porpeptidasas. Nombres triviales de algunaspeptidasas incluyen pepsina, tripsina, qui-motripsina y dipeptidasa. Otras subclasesson las esteraseis como la lipasa, colineste-rasa, y colesterol esterasa. Las fosfatasas eliminan grupos fosfatos, como la glucosa-6-fosfatasa y las fosfatasas acida y alcalina.

4.- liosas.- Catalizan el rompimiento nohidrolítico entre carbono-carbono, carbono-azufre y algunas carbono-hidrógeno. A este

grupo pertenecen las descarboxilasas. Aldehi-do nasas como la aldolasa, fumara y otras.

5.- Isomerasas.- Incluye a todas las enzi-mas que catalizan la interconversión de todotipo de isómeros ópticos, geométricos, deposición y reacciones de oxidorreducciónintramolecular. A este grupo pertenecen lasracémosos, epimerasas y mutasas.

6.- Ligasas.- Catalizan la formación deenlaces entre carbono-oxígeno, nitrógeno y otros átomos a expensas de un enlace fosfa-to de alta energía del ATP. El término desintetasas se reserva para este grupo particu-lar de enzimas. La piruvato carboxilasa esun buen ejemplo de una ligasa. También laacetil-CoA sintetasa, la aminoacil-RNAtsintetasa, enzimas activadoras de aminoáci-dos en la síntesis de proteínas.

En la Tabla 4.4 se describen algunas enzi-mas y su clasificación de acuerdo a la comi-sión de enzimas.

4.4 LOCALIZACIÓN Y DISTRIBUCIÓNDE LAS ENZIMAS

Las enzimas dentro de un organismo se en-cuentran distribuidas en los diferentes órga-nos y tejidos donde realizan su funciónespecífica. Dentro de una célula, algunas en-zimas se encuentran compartamentalizadasy ordenadas; ejemplo: en las células hepáti-cas, las enzimas de la glicólisis están locali-zadas en el citoplasma, en tanto que lasenzimas del ciclo de Krebs en las mitocon-drias. Dentro de la mitocondria, las enzimasdel ciclo del ácido cítrico se encuentran dis-puestas en forma secuencial, lo cual da alproceso ergopoyético de la célula la máximaeficacia.

4.4.1. Nivel celular. Sistema microsomal La localización de una enzima particular enun tejido o célula es el fundamento de una

Tabla 4.4Clasificación Internacional de las enzimas

Número Nombre sistemático Nombre trivial1. Oxidorreductasas1.1 Grupos CH-OH1.1.1 NAD+ o NADP+ aceptor1.1.1.1. Alcohol NAD+ oxidorreductasa:1.1.3. O2 como aceptor1.1.3.4. p-D-glucosa: oxígeno Oxidorreductasa

(FAD)1.2. Grupos C=01.2.1.12. Gliceraldehído 3-P:NAD*

Oxidorreductasa (NAD+)1.2.3.2. Xantina:oxígeno oxidorreductasa.1.2.4.1. Piruvato: lipoato Oxidoreductasa1.3. Grupos CH-CH1.3.1.1. 4,5-Dihidrouracilo: NAD+ oxidorreductasa1.4 Grupos CH-NH21.4.1.2 L-glutamato: NAD+ oxidorreductasa1.5 Grupos C-NH-1.5.1.5 5,10-Metilenotetrahidrofolato:

NADP+ oxidorreductasa1.6. Sobre NADH o NADPH como donador1.6.2.1. NADH: citocromo C oxidorreductasa1.9. Sobre grupos hemo donadores.1.9.3.1. Citocromo C: oxígeno oxidorreductasa1.11. Con H2O2 como aceptor1.11.1.6 Peróxido de hidrógeno: H2O2

oxidorreductosa2. Transferasas2.1 Grupos de 1 carbono2.1.1 metil transferasas2.1.1.2 S-adenosil-metionina: guanidino-acetato

N-metil Transferasa2.1.2 Hidroximetil y fomil transferasa2.1.2.1 L-serina: FH4 5,10-hidroximetil trasferasa

Deshidrogenasa AlcohólicaGlucosa oxidasa

Triosa-P-deshidrogenasaXantino oxidasaPiruvato deshidrogenasa

Dihidrouracilo deshidrogenasa

Glutamato deshidrogenasa

Metilen-FH4-deshidrogenasa

Citocromo C reductasa

Citocromo oxidasa

Catalasa

Guanidometil transferasa

Serina hidroximetil transferasa

CONTINUA TABLA 4.4Número2.1.32.1.3.22.22.2.1.12.2.1.2

2.6.12.6.1.12.6.1.22.7.12.7.1.22.7.7.103.3.13.1.13.1.1.73.1.23.1.2.13.1.33.1.3.93.2.13.2.1.13.4.43.4.4.13.5.1.53.6.1.344.1.14.1.1.14.1.24.1.2.7

Nombre sistemáticoCarboxil o carbamoil transíerasasCarbamoil-P: L-aspartato transferasaTransferencia de grupos aldehídicos o cetónicos

Sedoheptulosa 7-P: gliceraldehidoglicolaldehído transferasa

Sedoheptulosa: 7-P: gliceraldehidoDihidroxiacetona transferasaAminotransferasasL-aspartato: 2-oxoglutarato aminotransferasaL-alanina: 2-oxoglutarato aminotransferasaFosfotransferasasATP: glucosa 6-P transferasaUTP: galactosa 1-P uridil transferasaHidrolasasEnlace ésterCarboxílicoAcetilcolina acetil hidrolasaTióesterAcetil CoA hidrolasaEster fosfóricoGlucosa 6-P fosfohidrolasaGlucósido hidrolasasa l -4 gluca-4glucano hidrolasaPéptido hidrolasas

Urea amidohidrolasaATPfoshidrolasaLiasasCarboxiliasas2-oxo-ácido carboxil iasaAldehidoliasasCetona 1-Paldehidoliasa

Nombre trivial

Aspartato transcarbamilasa

TranscetolasaTransaldolasa

Transaminasa glutámico oxalacéticaTransaminasa glutámico pirúvica

GlucocinasaUDP-galactosa pirofosforilasa

ColinesterasaTiolasaGlucosa 6-fosfatasa

a-amilasa

PepsinaUreasaATPasa

Piruvato descarboxilasaAldolasa

CONTINUA TABLA 4.4Número Nombre sistemático Nombre trivial4.1.3 Cetoacidoliasas4.1.3.7 Citrato oxalacetato liasa4.2.1 Hidroliasas4.2.1.2 L-malatohidroliasa5 Isomerasas5.1 Racemasas y epimerasas5.1.1.1 Alanina recemasa5.1.3.1 D-ribulosa 5-P, 3 epimerasa5.2 Cis-trans isomerasas5.2.1.1 Malea to cis-trans isomerasa5.3.1 Aldo-ceto isomerasas5.3.1.1 D-gliceraldehído 3-P cetol isomerasas6 Ligasas6.1.1 Aminoácido-RNA6.1.1.1 L-tirosina: RNAt ligasa(AMP)6.2.1 Acido tiol6.2.1.1 Acetato: CoA ligasa (AMP)6.3 Enlaces C-N6.3.4.2 UTP: amonio ligasa (ADP)6.4 Enlaces C-C6.4.1 Piruvato: C0 2 ligasa (ADP)

Citrato sintetasa

Fumarasa

Alanina racemasaEpimerasa

Maleato isomerasa

Triosa-P isomerasa

Tirosil-RNAt sintetasa

Acetil CoA sintetasa

CTP sintetasa

Piruvato carboxilasa

rama de la histoquímica denominada his-toenzimología. La distribución de las enzimasen los organelos subcelulares se estudianfraccionando en ultracentrífuga homogenei-zados de células. En células eucarióticas lasenzimas se distribuyen en la membrana ce-lular, mitocondrias (matriz y espacios inter-membranas) lisosomas, vacuolas, retículoendoplásmico, etc. (tabla 4.5). En la mem-brana celular se encuentran enzimas queparticipan en el transporte de metabolitos y

las que regulan la acción de hormonas o neurotransmisores sobre los receptoresmembranales. En tanto que muchas enzimasse encuentran solubles en el citoplasma,otras se encuentran fijas ordenadamente enalguna membrana particular y funcionan enforma secuencial, como es el caso de las en-zimas oxidativas de la mitocondria. Gene-ralmente las vías anabólicas y catabólicas selocalizan en organelos diferentes a fin demaximizar la economía celular.

Tabla 4.5Localización intracelular de las principales enzimas y rutas metabólicas

Citoplasma Glucólisis: ruta de las hexosa monofostato; glucogénesis y glucogenóli-sis: síntesis de ácidos grasos; catabolismo de purinas y pirimidinas; pep-tidasas; aminotransferasas; aminoacilsintetasas

Mitocondria Ciclo de los ácidos tricarboxílicos; oxidación de ácidos grasos; oxida-ción de aminoácidos; alargamiento de ácidos grasos; síntesis de la urea;transporte electrónico y fosforilación oxidativa acoplada.

Lisosomas Lisozima; fosfaíasa acida; hidrolasas, incluyendo proteasas, nucleasas,glucosidasas, arilsulfatasas, lipasas, fosfolipasas y fosfatasas.

Retículo NADH y NADPH citocromo c reductasas; oxidasas de función mixtaendoplasmático relacionadas con el citocromo b, y el citocromo P450; glucosa 6-fosfata-(microsomas) sa; nucleósido difosfatasa; esterasa, P-glucuronidasa, y glucuroniltrans-

ferasa; rutas de síntesis de proteínas; síntesis de fosfoglicéridos y triacilgliceroles, síntesis y reducción de esteroides

Golgi Galactosil y glucosiltransferasa; condroitina sulfotransferasa; 5-nucleo-tidasa; NADH-citocromo c reductasa, glucosa 6-fosfatasa

Peroxisomas Urato oxidasa; D-aminoácido oxidasa; a-hidroxiácido oxidasa; catalasa;oxidación de ácidos grasos de cadena larga

Núcleo Rutas de biosíntesis de DNA y RNA

a La NADH-citocromo b, reductasa se ha encontrado en el retículo endoplasmático, Golgi, membranamitocondrial externa y en la envoltura nuclear. Varias de las enzimas señaladas en la tabla son comunes a uno o más organelos membranosos.

4.4.2. A nivel de organismo La localización y distribución de enzimasque funcionan específicamente en determi-nados órganos es el fundamento de la enzi-mología clínica. Dos subclases de aminotransferasas se lo-

calizan en órganos distintos; la aspartatoaminotransferas (antes transaminasa glutá-mico oxalacética, TGO) se localiza princi-pa lmente en miocard io y la a laninaaminotransferasa (antes transaminasa glutá-

mico pirúvica, TGP) se localiza en hígado.La creatina fosfocinasa se localiza en mús-culo estriado (esquelético y miocardio). Ladeshidrogenasa láctica posee varias isoenzi-mas, algunas de ellas específicas de deter-minado órgano; la LDH-1 (H4) se localizaen miocardio y la LDH-5 (M4) se localiza enhígado y músculo esquelético; otra varianteisoenzimática la LDH-X se localiza en testí-culo. La amilasa y lipasa pancreáticas ayu-dan al diagnóstico de pancreatitis agudacuando se elevan en suero (ver más adelan-

te). Las fosfatasas, con su localización parti-cular, la fosfatasa acida en próstata y la fos-fatasa alcalina en hígado y hueso,determinan la presencia de carcinoma pros-tético y óseo respectivamente, cuando seelevan en suero.

4.5 MECANISMO DE ACCIÓNEl mecanismo de acción de las enzimas seestudiará primero desde el punto de vista ge-neral de la catálisis y luego de cada sistemaenzimático en particular.

4.5.1. Aspectos termodinámicas. Energía de activación Conviene analizar previamente los concep-tos termodinámicos, que determinan el sen-tido de una reacción y su equilibrio, envirtud de que las enzimas sólo aceleran reac-ciones espontáneas o metaestables, termodi-námicamente posibles, las cuales puedenocurrir aún en ausencia de enzimas peromuy lentamente. Las enzimas no catalizanreacciones que jamás sucederían espontá-neamente, es decir aquellas termodinámica-mente imposibles.

La realización y extensión de las reaccio-nes bioquímicas están controladas por el flu-jo energético. El estudio de esto, es el campode las termodinámica, rama de la fisicoquí-mica, cuyos conceptos principales se esta-blecen en dos p r i n c i p i o s de latermodinámica llamados primero y segun-do, los cuales permiten comprender el senti-do de las reacciones químicas, si unareacción procediera de izquierda a derecha,si es reversible, y si hay que suministrarleenergía para que ocurra, o si la libera y enqué magnitud.La aplicación del primer principio de latermodinámica (principio de conservaciónde la energía) a las reacciones químicas ha

dado origen a la termoquímica que estudia lacantidad de calor que se absorbe o se des-prende en una reacción y permite calcular laenergía libre (F) y la entalpia o contenidocalórico (H). Si en la reacción se absorbe ca-lor, los productos tendrán más energía quelos reactantes; los cambios de energía libre(AF) y de entalpia (AH) son positivos y sedice que la reacción es endergónica (o endo-térmica si es en forma de calor). En las reac-ciones en que se desprende calor, AF y AHson negativos y la reacción es exotérmica {exergónica en general).AF = LFf productos - LFf reactantesAH - LHf productos - LHf reactantes

Una reacción que es exotérmica en senti-do directo, será endotérmica en sentido in-verso. Se habla así de calor de formación y calor de reacción, ejemplo: en la fotosínte-sis, la energía solar permite la síntesis deglucosa (Ce H12 0¿) y es una reacción en-dergónica; la degradación metabólica de laglucosa por la célula, con formación de CO2y H20 es una reacción exergónica, de lamisma magnitud.Energía

C6H12°6 + °2 6C02 + ÓHjOEnergía

El segundo principio de la termodinámicadetermina la dirección de una reacción quí-mica. Este principio establece que los proce-sos espontáneos tienden al equilibrio; estodetermina que un cuerpo caliente ceda calor a otro más frío y no al revés, que el agua corrapor un declive y no suba por una pendiente.El cambio de energía libre (AF) o energíaútil se correlaciona con la constante de equi-librio (Keq), la cual a su vez se rige por laley de acción de masas. Para cualquier reac-

ción química: la ecuación que determina elcambio de energía libre respecto a la con-centración de reactantes y productos es la si-guiente:

Donde AF° es el cambio de energía libreen condiciones estándar: este valor es equi-valente al pKa de la ecuación de Henderson-Hasselbach (ver unidad 2). En el equilibrio,no hay cambio de energía libre y AF=0, porlo tanto:

AF° = -RT lnKeq

puestos orgánicos inflamables expuestos alaire, como la gasolina, que necesitan unachispa para su ignición y su transformaciónen CO2 y H2O. Esa barrera termodinámicaes la energía necesaria para alcanzar el esta-do de transición como energía de activación (fig.4.1).

La energía de activación es la energía ne-cesaria para pasar las moléculas reaccionan-tes al estado de transición y que de ahíproceda la reacción. En ausencia de catali-zadores enzimáticos, muchas reaccionesquímicas proceden excesivamente lentas a la temperatura del organismo, no reaccionancon rapidez debido a que la energía cinéticaque poseen es insuficiente para superar esabarrera de energía. Al disminuir la energíade activación, las enzimas hacen que las re-acciones termodinámicamente posibles pro-cedan con rapidez en la célula pero nomodifican la constante de equilibrio.

si AF° es negativo, el proceso se desarrollaráespontáneamente, es decir es termodinámi-camente posible; si AF° es positivo, la reac-ción sólo transcurrirá si se le proporcionaenergía (tabla 4.6).

Existen sistemas de reacción que se pre-sentan en estado metaestable, es decir ter-mod i n ám i c amen t e pos ib l e ; pe ro noespontáneo. Esto sucede con algunos com-

Tabla4.6Relación entre Keq y AF° (a 25°C)

4.5.2. Cinética enzimática Dado que las enzimas modifican la veloci-dad de las reacciones químicas, este capítulotratará de los factores que inciden en la acti-vidad de una enzima. La cinética estudia lavelocidad de cambio entre el estado inicialde reactantes y productos y su estado final.La velocidad cambia constantemente a me-dida que se aproxima al equilibrio (estadofinal) siendo cero en el equilibrio.

En un sentido cinético, los componentesiniciales del sistema enzimático (sustrato(S), cofactores y enzimas) se añaden a unaserie de recipientes en un medio con fuerzaiónica, temperatura y pH conocidos. La ve-locidad del cambio en la concentración delproducto o del sustrato en función del tiem-po, expresa la velocidad de la reacción.

En todos los procesos enzimáticos, la ve-locidad de la reacción depende de la concen-tración de enzima y de su sustrato. Si seaumenta progresivamente la concentración

de enzima, manteniéndose constante (pero enexceso) la concentración del sustrato, se ob-tiene una relación directa y lineal (fig. 4.7).A concentración fija de enzima y concen-traciones crecientes de sustrato se obtieneuna segunda relación interesante. Al princi-pio, la velocidad de la reacción aumentaproporcionalmente a la concentración desustrato; a este punto, se le designa como re-acción de primer orden en virtud de que lavelocidad depende de la concentración delsustrato (S) elevada a la primera potencia.Después, la velocidad de la reacción decreceprogresivamente hasta que permanece cons-tante (Vmax) aun con elevadas concentra-ciones de sustrato (cinética de orden cero); esto se explica porque la enzima se ha "satu-rado" con sustrato (fig. 4.8).En otras palabras, la enzima debe tener unnúmero finito de sitios catalíticos para elsustrato y cuando están todos ocupados ya

no puede aumentar la velocidad de la reac-ción.Modelo de Michaelis-Menten. Para expli-car matemáticamente este comportamientoMichaelis y Menten invocaron la existenciade un complejo intermedio enzima-sustrato:

E + S K

' [ES] • E + P K, K„

La formación del complejo enzima-sus-trato [ES] se dedujo de las siguientes obser-vaciones; a) fibrina tratada con tripsina y lavada posteriormente, seguía degradándo-se; b) la enzima sacarasa en presencia de sa-carosa resistía la desnaturalización térmica

comparada con la sacarasa sola. Por otro la-do, Keilin y Mann en 1937 comprobaronque la peroxidasa presenta un desplaza-miento de las bandas de absorción cuando seadiciona H2O2:

KiPeroxidasa + H JO J ;==? [Peroxidasa - HJOJ]

En presencia de un donador de hidróge-nos (colorante oxidable) tiene lugar una re-acción posterior:

[Peroxidasa - H 20 2 ] + R-H2 K3 Pe-roxidasa + 2H 20 + R

La observación en el espectroscopio deestas dos reacciones resultó una prueba con-vincente de que es correcta la hipótesis de laformación del complejo [ES].

La ecuación matemática que define la re-acción enzimática es una hipérbola que reci-b e e l n o m b r e d e e c u a c i ó n d eMichaelis-Menten:

_ Vmax [S] Km + [S]

El valor de Km (constante de Michaelis)que se expresa en moles/litro, resulta de lasconstantes de velocidad.

Km- - ¿ - - IAl

En términos prácticos, la Km es un valorque indica la afinidad de la enzima por elsustrato. Cuanto más baja sea Km, mayor esla afinidad. Las dos constantes de la ecua-ción de Michaelis Menten, Vmax y Km sonúnicas para cada enzima. Así, en este senci-llo modelo, la actividad de la enzima se pue-de separar en dos fases; fijación del sustratoseguida de su modificación química. Estanaturaleza bifásica se demuestra en el si-guiente ejemplo clínico: en una familia

aquejada de hiperuricemia y gota, un pa-ciente excretaba tres veces la cantidad nor-mal de ácido úrico por día y tenía tambiénniveles elevados de fosforribosil pirofosfato(PRPP) en eritrocitos. Los ensayos indica-ron que la actividad PRPP sintetasa estabaaumentada tres veces; la Km de la enzimaera normal pero la Vmax era tres veces ma-yor.

Nótese que si la velocidad (v) se haceigual a - Vmax, la Km se hace igual a [S] enla ecuación de Michaelis-Menten, Por tanto,en una curva de saturación (fig. 4.8) el valornumérico de la Km puede deducirse en lagráfica en concentración de sustrato [S],cuando la velocidad es la mitad de la veloci-dad máxima.

Modelo de Lineweaver-Burk. Debido a que en la práctica la determinación de Km a partir de la curva de saturación de Michae-lis-Menten no es muy precisa, ya que laVmax se hace asintótica, es necesario tomarel recíproco de la ecuación y transformarlaen una línea recta:

i . Km 1 + 1 v Vmax [S ] Vmax y = ax + b La gráfica que se obtiene es la de Line-

weaver-Burk o del doble recíproco (fig. 4.9),donde se puede calcular Km en la intersec-ción negativa de la abscisa.

Modelo de Eadie-Hofstee. Otra transfor-mación a la gráfica de Michaelis-Mentenque permite calcular con mayor precisión laKm es la ecuación de Eadie-Hofstee:

V v Vmax [S] ~~Km + Km La gráfica obtenida se muestra en la fig. 4.10,

donde la pendiente negativa es la inversa deKm.

4.5.2.1. Actividad enzimáticaLa actividad de una enzima se expresa habi-tualmente en términos de la cantidad de pro-ducto formado (o desaparición de sustrato)por cantidad determinada de enzima porunidad de tiempo. La unidad estándar de ac-tividad enzimática (U) es la cantidad de en-zima que cataliza la transformación de unmicromol de sustrato por minuto a 25 °C encondiciones óptimas de ensayo. La activi-dad específica se define como el número deunidades de enzima por miligramos de pro-teína (U/mg proteína). Sin embargo esto noindica si en la muestra la única proteína pre-sente es la enzima. Durante la purificaciónenzimática este valor va aumentando a me-dida que se van eliminando proteínas conta-minantes. El antiguo "número de recambio"recientemente sustituido por actividad mo-lecular o molar, se define como el número

4.1.1. Importancia de las enzimas El estudio de las enzimas en medicina es ca-da vez más importante. Son múltiples lasimplicaciones que tienen las enzimas en elorigen, diagnóstico, tratamiento y preven-ción de enfermedades. Muchas enfermeda-des se deben a la carencia o anormalidad enla síntesis de una determinada enzima (ga-lactosemia, fenilcetonuria, albinismo, pen-tosuria esencial y muchas otras que serevisarán más adelante). Estos errores estáncodificados en el genoma y se denominan:"errores innatos del metabolismo", "enfer-medades moleculares", "enfermedades he-reditarias" o "enfermedades bioquímicas".El diagnóstico de muchas enfermedades sepuede'realizar con bastante precisión deter-minando la actividad de ciertas enzimas o isoenzimas que son indicadores de la des-trucción tisular de órganos específicos. Es-tas determinaciones son tan importantes quehan dado lugar a una nueva especialidad: laenzimología clínica; que es el área de la me-dicina que utiliza las enzimas como auxilia-res diagnósticos.Otras enfermedades se deben a la carencia

de cofactores enzimáticos y la administra-ción de ellos produce la rápida curación deestas enfermedades carenciales, como suce-de con las vitaminas (procoenzimas) y algu-nos oligoelementos. En ocasiones son laspropias enzimas las que se usan para el tra-tamiento de enfermedades, esta práctica seconoce como enzimoterapia. El empleo deenzimas proteolíticas para el tratamiento dehematomas y de enzimas digestivas en casosde dispepsia, son ejemplos del uso de enzi-mas como fármacos. El empleo de enzimas inmovilizadas es otra posibilidad de terapiacuando hay carencia de enzimas en un orga-nismo evitando así las reacciones de intole-rancia y asegurando la estabilidad y lascondiciones óptimas para la actividad catalí-tica. Es indudable que la enzimoterapia tie-ne un futuro promisorio con las técnicas de

ingeniería genética que permiten introducirla información genética para la síntesis de laproteína ausente o defectuosa utilizandoplásmidos o partículas viriformes.Otra importante vinculación de las enzi-

mas con la medicina, radica en el empleo ra-cional de fármacos. La mayor parte de losfármacos que se utilizan en el tratamiento deenfermedades tienen como mecanismo de ac-ción el modificar la actividad de una o variasenzimas, ya sea, actuando como inhibidorenzimático competitivo, no competitivo, acom-petitivo o mixto, secuestrando o liberandocofactores o induciendo la biosíntesis de al-gunas enzimas. La eficacia del tratamientoterapéutico y la magnitud de las reaccionesindeseables (reacciones secundarias, contra-indicaciones, precauciones, interaccionesfarmacológicas), sólo se podrán lograr y prevenir en la medida que se conozca el me-canismo de acción de cada fármaco y lasmúltiples interacciones que pueden ocurrircon las enzimas.

4.1.2. Concepto de enzima, sustrato y productoEn una reacción enzimática se identificantres componentes: la enzima (E) específicade la reacción, el sustrato (S) que es la molé-cula sobre la que actúa la enzima y el pro-ducto (P) molécula o moléculas resultantesde la acción de la enzima sobre el sustrato.Dado que muchas reacciones son reversi-bles, los productos de la reacción directa(que procede hacia la derecha) son los sus-tratos de la reacción inversa (que procedehacia la izquierda).

directaA+B . C+D

sustratos inversa productosEn reacciones secuenciales de una vía

metabólica, el producto de una reacción ca-

de moles de sustrato transformado por unmol de enzima por minuto (mol/min/mol deenzima) (tabla 4.7). Debido a que muchasenzimas son oligoméricas, con un sitio cata-lítico en cada subunidad, la actividad molarse denomina actividad del centro catalítico: número de moles de sustrato por mol de su-bunidad activa o por sitio catalítico, por mi-nuto. La comisión de enzimas de la UniónInternacional de Bioquímica ha propuestouna nueva unidad, el Katal (Kat) que se de-fine como la conversión de un mol de sus-trato por segundo; se puede expresar enmilika tales (mKat) o microkatales (uKat).

Hasta que todos los laboratorios de análi-sis clínicos unan esfuerzos para estandarizarsus informes, es imperativo, que el médico sefamiliarice con las reglas locales en el ma-nejo de unidades de actividad enzimática.

4.5.3. Factores que afectan la actividad enzimáticaLa actividad enzimática es afectada por unaserie de factores externos e internos quepueden ser físicos, químicos y biológicos:temperatura, pH, fuerza iónica, concentra-ción del sustrato, de la enzima, del productoe inhibidores. Estos efectos son tan impor-tantes in vivo como en condiciones de labo-ratorio; en el primer caso, debido a que la

Tabla 4.7Actividad molecular de algunas enzimasEnzima Actividad molar

(moles de sustratopor mol de enzimapor minuto)Anhidrasa carbónica 36,000 000Catalasa 5,600 000p-amilasa 1,100 000p-galactosidasa 12 000Succinato deshidrogenasa 1 150

actividad enzimática aumenta con los incre-mentos de temperatura, la velocidad de losprocesos metabólicos crece notablementedurante la fiebre; si la fiebre continuaraindefinidamente sería fatal. Muchos medi-camentos actúan como inhibidores competi-tivos de ciertas enzimas. Por otro lado, estosfactores deben considerarse al realizar losensayos in vitro para medir actividades enzi-máticas en el plasma de un paciente.

4.5.3.1. Factores físicos y químicosTemperatura. Las enzimas a temperaturasbajas muestran un aumento de su actividadal incrementar la temperatura, pero a altastemperaturas la enzima sufre desnaturaliza-ción térmica y la velocidad de la reaccióndisminuye (fig. 4.11).

La gráfica de velocidad frente a tempera-turas (Fig. 4.11) revela una curva en forma

de campana con un óptimo entre 40 y 45 °Cpara enzimas humanas, denominada tempe-ratura óptima. El incremento de velocidadal acercarse la temperatura óptima se debe a una mayor energía cinética de los reccionan-tes (sustrato). El factor que resulta por cada10°C de incremento en la temperatura se de-nomina coeficiente térmico (Qio) y en lasreacciones químicas habituales es de alrede-dor de 2, o sea, se duplica la velocidad de lareacción por cada 10°C de aumento en latemperatura. Muchos procesos fisiológicos,por ejemplo, la frecuencia de contracción deun corazón extirpado, muestran un (Qio) • 2.Por arriba de la temperatura óptima, la velo-cidad de reacción decrece por desnaturaliza-ción de la enz ima . Las enz imas demicroorganismos adaptados a vivir en aguastermales muestran temperaturas óptimascercanas al punto de ebullición del agua. Porel contrario en condiciones de hipotermiamuchas reacciones enzimáticas están depri-midas lo que explica la baja demanda deoxígeno de algunos organismos durante pe-riodos de hibernación.

pH. Por ser proteínas, las enzimas poseenun punto isoeléctrico en el que su carga eléc-trica es cero; el pH del punto isoeléctrico,sin embargo, no es el pH de máxima activi-dad de la enzima (pH óptimo). Los cambiosde pH afectan profundamente el carácter ió-nico de los grupos funcionales de la enzimay, por lo tanto, alteran la conformación de laproteína y con ello, el sitio catalítico. Ade-más de los efectos puramente iónicos, losvalores altos o bajos de pH (ácidos o alcali-nos) provocan desnaturalización de la enzi-ma (fig. 4.12).El pH óptimo de la mayoría de las enzi-

mas se localiza entre los valores de 5 y 9.Sin embargo, algunas enzimas, por ejemplo,la pepsina o la arginasa son activas a valoresdepH alejados de este óptimo (Tabla 4.8).El efecto nocivo de las radiaciones, sales

y metales pesados (Ag, Pb, Hg) sobre la ac-tividad enzimática se debe a la acción desna-

turalizante sobre las proteínas en general.Esta propiedad es útil en el laboratorio clíni-co; las muestras de sangre son primero trata-das con ácidos como el tncloroacético,fosfotúngstico y otros para desnaturalizar y precipitar proteínas, la labilidad de la mayo-

Tabla 4.8Valores óptimos de pH para algunas

enzimas

ría de las enzimas a estos agentes desnatura-lizantes permite determinar si una reacciónes catalizada por una enzima.

4.5.3.2. Inhibidores enzimáticosAunque se requiere la molécula completa dela apoenzima para su actividad catalítica,existe una zona determinada donde se com-bina con él sustrato al que se llama sitio acti-vo o sitio catalítico. Este es un huecomolecular en la estructura terciaria de la en-zima con tres puntos de apoyo próximos en-tre sí (tres aminoácidos) aunque en laestructura primaria no estén próximos (fig.4.13).

El peso molecular de la mayoría de lossustratos es muy pequeño comparado con elde las enzimas. Por ejemplo, la catalasa (PM250,000) respecto al peróxido de hidrógeno(PM 34). Pueden afectarse ciertos aminoáci-

dos de una enzima sin que ello altere su acti-vidad catalítica siempre y cuando no seafecten los involucrados en el sitio activo.Quizá la prueba más evidente de la locali-zación de sitios activos proviene de estudioscon inhibidores. Un inhibidor enzimático escualquier agente químico capaz de dismi-nuir la velocidad de una reacción sin desna-turalizar la enzima. Los inhibidores soncompuestos que tienen la capacidad de unir-se a enzimas de tal forma que impiden lacombinación enzima-sustrato. Existen dife-rentes tipos de inhibidores enzimáticos:competitivos, no competitivos e incompeti-tivos.Inhibición competitiva. Está dada por unamolécula parecida estructuralmente al sus-trato (isostérica) que se une al sitio catalíticopero no se transforma. Esta molécula formaun complejo reversible con la enzima (El)que compite continuamente con el sustratopor el sitio catalítico. La magnitud de la in-

hibición dependerá de: a) la concentraciónde inhibidor, b) la concentración de sustratoy c) las afinidades relativas (Km) entre inhi-bidor y sustrato por la enzima. El grado deinhibición competitiva es proporcional a laconcentración de inhibidor (I); sin embargo,un aumento en la concentración de sustratoen presencia de una concentración fija delinhibidor llega a superar la inhibición.Un ejemplo muy conocido es la inhibicióncompetitiva de la succinato deshidrogenasa,cuyo sustrato natural, el succinato y el inhi-bidor, malonato, son parecidos (fig. 4.14).Dado que sustrato e inhibidor compitenpor el mismo sitio de la inzima, la Km mues-tra un incremento aparente en presencia delinhibidor. Esto se puede ver en la gráfica deMichaelis-Menten y en la de Lineweaver-Burk (fig. 4.15). La Km que se obtiene expe-rimentalmente es denominada Km aparente: la Vmax no varía. Ejemplos de inhibición competitiva es laque se realiza al administrar ciertos fárma-cos. Si denominamos metabolitos a los sus-tratos fisiológicos presentes o producidos enel metabolismo celular, serán antimetaboli-

tos, aquellos que impiden el aprovecha-miento y utilización de los metabolitosnaturales debido a su parecido estructural.Los animales superiores y muchos mi-croorganismos son incapaces de sintetizaralgunos compuestos necesarios para su su-pervivencia, por lo que estos adquieren lacategoría de nutrimentos esenciales. Estoscompuestos pueden ser aminoácidos, ácidosgrasos, vitaminas, etc.Los organismos utilizan ciertos metabo-litos y enzimas para sintetizar estos com-puestos esenciales, estas enzimas puedeninhibirse por medio de antimetabolitos.La investigación de los antimetabolitos seinició con la observación de Woods en1940, quien comprobó que la inhibición delcrecimiento bacteriano por sulfas era contra-rrestado por ácido paraaminobenzoico (PA-BA).

Los microorganismos que necesitan PA-BA para su crecimiento, lo utilizan comometabolito para sintetizar ácido fólico. Estecrecimiento bacteriano puede inhibirse conantimetabolitos como las sulfas. Aquellosorganismos que requieren ácido fólico peroque no lo puedan sintetizar a partir de PA-BA, no se afectarán por sulfas. La utiliza-ción eficaz de las sulfas para combatirinfecciones en el hombre depende de estehecho. Dado que el hombre adquiere fola-to en forma exógena, las sulfanilamidas noson dañinas a las dosis que inhiben a las bac-terias.Muchos antimetabolitos ejercen su accióna nivel de coenzimas o grupos prostéticoscomo los antifólicos como el metotrexate o alguna antivitaminas como la oxitiamina o la oxipiridoxina. Otro ejemplo es la inhibi-ción de ciertos tumores por 5-fluorouraciloy la de algunos virus como el herpes labialpor yododesoxiuridina. Toda o gran parte dela farmacoterapia moderna está basada enlos conceptos de inhibición enzimática.Inhibición no competitiva. Este tipo de in-hibición es irreversible aun cuando se au-mente la concentración de sutrato. Es decir,no existe relación entre el grado de inhibi-ción y la concentración de sustrato. La inhi-bición solo depende de:a) la concentración del inhibidor y b) laafinidad del inhibidor por la enzima. En

contraste con la inhibición competitiva, laformación del complejo enzima-inhibidorpuede o no ocurrir en el sitio activo de la en-zima. El inhibidor no competitivo puede serunamólecula(Ii) que no se une en el sitio ac-tivo sino cerca de él; puede unirse a uno delos tres puntos esenciales del sitio activo (I2),o incluso puede ser un análogo del sustrato(I3) pero que no puede ser desplazado por al-tas concentraciones del sustrato; puede ser uninhibidor (I4) que no intervenga en la forma-ción de ES, pero que provoque un cambio deconformación en la enzima de suerte que és-ta pierda su actividad catalítica (fig. 4.16).Algunas enzimas tienen grupos sulfhidri-lo (-SH) esenciales para su actividad; unagente que reacciona con estos grupos es layodoacetamida (I-CH2—CO-NH2):E-SH+I-O^-CO-NHj -* E-S-CH^-CO-NHj+HI

Enzimas como la peroxidasa y catalasa,que contienen hierro como grupo prostético,son inhibidas por compuestos que formancomplejos con el metal como el cianuro o elH2S. Los iones fluoruro y oxalato inhibenenzimas que requieren Ca+2 o Mg+2. El dii-sopropilfluorofosfato (DIPFP) inhibe enzi-

mas con grupos funcionales oxidrilo (Ser-OH) como la colinesterasa.En la inhibición no competitiva no se alte-ra la Km pero sí la Vmax (fig. 4.17).Inhibición incompetitiva o acompetitiva. Es una forma de inhibición no competitivapero reversible. En ésta, el inhibidor se pue-de combinar con la enzima (El) o con elcomplejo enzima-sustrato ya formado (EIS)y la reacción puede retrasarse pero no impe-dirse. Se presenta sobre todo cuando haymás de un sustrato en la reacción. La modi-ficación en la gráfica de Lineweaver-Burkde la inhibición incompetitiva es la que seobserva en la fig. 4.18.Estrictamente, los productos de la reac-ción son inhibidores específicos de la reac-ción enzimática. En otros casos, el sustratopuede inhibir o activar su propia reacción(fig. 4.19).Un ejemplo de inhibición por producto lotenemos en la deshidrogenasa láctica (LDH)de la cual existen dos isoenzimas particula-res: en el músculo predomina la isoenzimaM4, que no es inhibida por producto; en co-razón predomina la isoenzima H4 que es in-hibida por producto (lactato). Estaparticularidad permite que en corazón se in-

Figura 4.17 Inhibición no competitiva;

hiba la LDH por lactato y el piruvato se deri-ve al ciclo de Krebs, productor de energía.Esta es una ventaja fisiológica que garantizaque el corazón tenga un aporte constante deenergía para la contracción (ver unidad deBioenergética).Existen algunas aplicaciones prácticas,desde el punto de vista clínico, de la inhibi-ción enzimática. El suero contiene enzimascomo las fosfatasas acidas producidas por di-ferentes tejidos, hay una producida por lapróstata, que se eleva en el carcinoma prosté-tico. El ácido L-tartático inhibe competitiva-mente la actividad de la enzima prostática,pero tiene poco efecto sobre las fosfatasasacidas de eritrocitos, hígado, riñon y bazo.El formaldehído al contrario, inhibe la deeritrocitos, pero no a la enzima prostática.Los iones calcio inhiben no competitiva-mente muchas fosfatasas acidas, de aquí lanecesidad de agregar quelantes a muestrasde sangre destinadas a este ensayo. El etanoly ciertos narcóticos son también inhibidores

laelis-Menten (a) y Lineweaver-Burk (b).

no competitivos de la fosfatasa acida, lo cualdebe tomarse en cuenta al interpretar los re-sultados.

4.6 REGULACIÓN ENZIMÁTICAEn el tubo de ensayo, las enzimas funcionanen un sistema cerrado y se acumula el pro-ducto de la reacción. Sin embargo, en la cé-lula, los productos de la reacción no seacumulan ya que son utilizados como sus-tratos de otra enzima, y los productos de éstason sustratos de otra enzima y así sucesiva-mente hasta llegar al llamado producto final. La secuencia de reacciones entre un sustratoinicial y su producto final se denomina vía metabólica, la cual puede presentar ramifi-caciones que constituirán otras vías metabó-licas.Aunque todas las reacciones catalizadaspor enzimas son reversibles en el tubo deensayo, en la célula, la característica secuen-

cial de las vías metabólicas hace que el flujodel metabolismo celular sea irreversible y permanentemente dinámico. El carácter di-námico de los organismos vivos estableceque el verdadero equilibrio metabólico se al-canza sólo con la muerte de la célula. La cé-lula viva es un sistema abierto, en equilibriodinámico (estado estacionario), mantenidopor un flujo unidireccional de metabolitos.El estado estacionario equivale al conceptode homeostasis, propuesto por Claudio Ber-nard a finales del siglo XIX, que indica quelos organismos mantienen su medio interno-constante a pesar de las amplias variacionesen alimentación, actividad física, temperatu-ra externa, etc. (fig. 4.20).

En un sistema tan complejo como la céluladebe haber mecanismos de regulación o con-trol de la multitud de reacciones simultáneasque ocurren, reacciones que son, en su mayo-ría, catalizadas por enzimas. En todas las áreasde las ciencias biomédicas se encuentranejemplos de regulación normal o anormal:muchas células cancerosas exhiben anorma-lidades en la regulación de sus enzimas.

El conocimiento de los factores que regu-lan la acción de las enzimas es, por tanto,esencial para entender el mecanismo de ho-meostasis celular y para comprender a nivelmolecular las enfermedades.

La regulación metabólica de una vía tienelugar mediante la modulación de la activi-dad enzimática de una o más enzimas clavede la ruta, llamada enzima limitante de lavía, que generalmente corresponde a la pri-mera enzima. Uno de los primeros ejemplosde regulación fue la síntesis de CTP (citidi-na trifosfato) a partir de aspartato y carba-milfosfato (fig. 4.21).

La primera enzima del proceso de síntesisde CTP, la aspartato transcarbamilasa (a), seinhibe específicamente con CTP y UTP,productos finales del proceso. Se consideraque la acción de CTP y UTP ocurre en un si-tio regulador distinto del sitio catalítico por-que: 1) CTP o UTP y aspartato difieren

mucho en estructura, tamaño y distribuciónde cargas; 2) la inhibición por CTP o UTPpuede abolirse sin pérdida de actividad cata-lítica; 3) el ATP, que no afecta la velocidadenzimática, puede impedir la inhibición porCTP o UTP, quizá por competencia con elsitio regulador y 4) pueden fraccionarse dossubunidades una que une aspartato y otraque une CTP o UTP.

Pardee, Jacob, Monod y Changeaux, estu-diaron este tipo de inhibición y la llamaroninhibición alostérica (allos=otro) en virtudde que el sitio regulador es distinto del sitioactivo (isostérico, de isos=igual).

Conviene distinguir este tipo de inhibi-ción con la inhibición por producto, la cualsigue la ley de acción de masas. Las reaccio-nes enzimáticas, como cualesquiera otra,obedecen esta ley. Si a la reacción:

Glucosa -6-P + H 20 -» Pi + glucosase le agrega inicialmente glucosa libre o fos-fato, disminuye su velocidad; esto como yase mencionó se considera inhibición compe-titiva o isotérica. A la inhibición alostéricase le llama también inhibición por productofinal, por retroalimentación o regulación re-troactiva ("feedback").

4.6.1. Regulación alostérica La actividad catalítica de algunas enzimasreguladoras es afectada por ciertas molécu-las que producen un cambio en la actividadenzimática, pero que no se modifican por laacción enzimática. Estas moléculas se deno-minan efectores, modificadores o modula-dores; por lo general, estos tienen poca o ninguna semejanza estructural con el sustra-to. Monod, en 1963 observó esta falta de re-lación estructural inhibidor-sustrato y propuso denominar a este tipo de moléculas,efectores alostéricos. Un efector alostéricocambia la conformación de la enzima, de

manera que cambia la afinidad hacia el sus- inverso. El sitio alostérico donde se une eltrato. Los efectores alostéricos positivos (+) efector positivo se conoce como centro acti-incrementan la afinidad enzima-sustrato y vador. El efector negativo se une a un centro los efectores alostéricos negativos (-) hacen lo inhibidor. Una enzima alostérica, es una en-

talizada por una determinada enzima, deno-minado metabolito, se convierte en el sustra-to de la subsiguiente reacciónBmetabolito

4.1.3. Funciones generales 4.13.1. Catálisis enzimáticaSe ha señalado que una enzima incrementala velocidad de la reacción química pero sinmodificar la constante de equilibrio ni elsentido de la reacción, es decir, sin variar laspropiedades termodinámicas del sistema.

En un sistema catalizado por una enzima,un sustrato (A) con determinado nivel ener-gético, conocido como estado inicial, tieneque alcanzar un nivel energético superior o estado de transición antes de convertirse enun producto (B) con un nivel energético co-

rrespondiente al estado final. Para que la re-acción tenga lugar, las moléculas reaccio-nantes deben alcanzar un nivel de energíasuficiente para vencer la barrera energéticay entrar al estado de transición. La diferen-cia entre la energía libre de los reactantes y el estado de transición se denomina energía de activación. La función de un catalizador(inorgánico o enzima) consiste en disminuirla energía de activación, lo que conduce a acelerar la reacción debido a que los reac-tantes pueden alcanzar más fácilmente el es-tado de transición (fig. 4.1).

4.1.4. Catalizadores inorgánicos y biológicosLos catalizadores inorgánicos son general-mente átomos en estado iónico o metalescon propiedades similares a las atribuidas a un catalizador biológico pero, a diferenciade los catalizadores biológicos, no poseen la

REACCIÓN

Figura. 4.1. Energía de activación de una reacción no catalizada (I) y una reacción catalizada (II).

zima cuya actividad en el sitio catalítico puedeser modulada por la presencia de efectoresen los sitios alostéricos (fig. 4.22).En el ejemplo de la aspartato transcarba-milasa, el sitio catalítico radica en subunida-des diferentes, a las del sitio alostérico; estaenzima posee dos protómeros catalíticos y tres o cuatro reguladores. Aunque una enzi-ma monomérica puede, teóricamente, expe-rimentar efecto alostérico, en la prácticasólo se han encontrado dos enzimas alostéri-cas monoméricas: ribonucleósido difosfatoreductasa y piruvato -UDP-n-acetil-gluco-saminatransferasa. La mayoría de las enzi-mas alostéricas son oligoméricas.La cinética de interacción entre sustrato,enzima e inhibidor alostérico sigue una cur-va sigmoidea. Los efectos alostéricos nega-tivos desplazan la curva hacia la derecha,indicando aumento de la Km con pérdida deafinidad enzima-sustrato. En presencia de unefector positivo se alcanza la 1/2 Vmax a unaconcentración menor de sustrato y se des-plaza la gráfica de Michaelis-Menten haciala izquierda (fig. 4.23).

Las enzimas alostéricas permiten el controlfino de la actividad metabólica mediante pe-queñas fluctuaciones en el nivel de sustratos.Es frecuente la confusión entre los térmi-nos de alosterismo y coopera ti vidad. La

cooperatividad se define como la influenciaque tiene la fijación de un ligando a un pro-tómero sobre la fijación del ligando a un se-gundo protómero de una proteínaoligomérica. Anteriormente se ha discutido,en el capítulo de proteínas de transporte, lacooperatividad en la fijación de oxígeno a lahemoglobina. En la hemoglobina el centrode fijación del oxígeno de cada subunidadcorresponde al centro del sustrato y no a unsitio alostérico; por lo tanto, el cambio con-formacional que induce el oxígeno sobre losprotómeros de hemoglobina, técnicamenteno es un efecto alostérico.Las enzimas alostéricas se dividen en dosclases según la influencia del efector alosté-rico sobre la Km y la Vmax. En la clase K, elefector afecta la Km pero no la Vmax. Paralas enzimas de la clase V, el efector alostéri-co abate la Vmax sin afectar la Km aparente.

Figura 4.22 Representación esquemática de la regulación alostérica, S = sustrato; i = inhibidor; a = activador,

No obstante que las enzimas K dan gráficasparecidas a la inhibición competitiva, no esadecuado utilizar los términos competitivosy no competitivos con sistemas enzimáticosabsteneos porque el mecanismo del efector de un inhibidor alostérico sobre una enzimaV o K es diferente al de un mecanismo com-petivo o no competitivo sencillo. Puesto quelos inhibidores alostéricos actúan en un sitiodiferente (alostérico) el modelo cinético yano es válido.El hecho de que los centros inhibidores y activadores alostéricos están separados en-tre sí como del centro catalítico, se ilustra enel estudio de un paciente con gota cuyos eri-trocitos tenían altos niveles de fosforribosil-pirofosfato (PRPP). En este paciente, seencontró que la PRPP sintetasa tenía unaKm y Vmax normales. Sin embargo, mostrabamenor sensibilidad a los inhibidores alosté-ricos normales AMP, ADP, GDP y 2, 3-DPG. Los productos finales endógenos de laruta (ATP, GTP) no eran capaces de inhibiralostéricamente a la enzima y se acumula-ban el PRPP y el ácido úrico. Aparentemen-te una mutación había producido un cambio

en el centro inhibidor (I). En la fig. 4.24 queilustra el caso, se muestran los diferentes si-tios de unión para sustrato (S) activadores(A), e inhibidores (I).

4.6.2. Represión e inducción El mecanismo de control alostérico de laactividad enzimática es también aplicable a sistemas de regulación a nivel génico. Se hamencionado al inicio de la unidad III que laexpresión de la función genética se realiza a través de las enzimas (un gene - una enzi-ma). Los estudios iniciales sobre la regula-ción de la síntesis de proteínas enzimáticaspermitieron reconocer tres tipos de enzimas:

constitutivas, inducibles, y reprimibles.

4.6.2.1. Enzimas constitutivas y enzimasinduciblesLas enzimas constitutivas están presentes enconcentraciones constantes durante la vidade la célula, probablemente debido a una re-

Figura 4.24 Inhibición alostérica o por retroalimentación.

lación constante entre síntesis y degradaciónde la enzima, generalmente son las enzimas delas principales vías metabóücas como las de lavía glucolítica.Las enzimas inducibles, son aquéllas cuya

concentración en la célula normalmente esbaja y a medida que se requiere mayor canti-dad de enzima, la velocidad de síntesis au-menta con respecto a su degradación. Esdecir, la inducción implica síntesis de novo lo cual se ha demostrado puesto que siste-mas donde la síntesis de proteínas está blo-queada, no responden al estímulo inductor.Él ejemplo de inducción de síntesis enzimá-tica, más estudiado, es el sistema de la P-ga-lactosidasa de E. coli. Usualmente E. coli crece en un medio

simple, que contiene glucosa y sales, y pue-de fabricar todos sus constituyentes esencialesa partir de este medio. En estas condiciones,el cultivo sólo contiene trazas de P-galacto-sidasa. Cuando estos microorganismos setransfieren a un medio con lactosa, como úni-

ca fuente de carbono, en breve empiezan a aparecer cantidades apreciables de galactó-sido permeasa, (3-galactosidasa y tiogalactó-sidotransacetilasa (fig. 4.25). Si se quita lalactosa del medio y se vuelve a dar glucosa,se suspende la síntesis de dichas enzimas.Con este tipo de control la célula no in-

vierte energía en sintetizar enzimas para ac-tuar sobre un sustrato no presente. Elfenómeno se denomina inducción enzimáti-ca coordinada. El tercer tipo de enzimas es el de las re-

primibles. La síntesis de estas enzimas sesuspende si está presente en abundancia elproducto final de la vía metabólica dondefuncionan. Uno de los sistemas mejor estudia-dos es el que conduce a la síntesis de histidi-na en Salmonella. El aminoácido histidinase forma por una secuencia de 10 reaccionesa partir de PRPP. Cuando se agrega histidinaal medio se reprimen los 15 genes que codi-fican para 9 enzimas. El fenómeno se deno-mina represión enzimática coordinada.

Debe subrayarse que la inducción y repre-sión son mecanismos de control sobre sínte-sis de enzima y no sobre actividad de laenzima; por lo tanto, es distinto de la inhibi-ción por producto final (retroacción o feed-back). En general, la retroinhibición es unmecanismo de control ejercido a corto pla-zo, con un efecto inmediato sobre la rutametabólica, mientras que la represión nece-sita más tiempo pero con efectos permanen-tes al reducir el número de moléculas deenzima.

4.6.3. Teoría del operan En 1961, F. Jacob y J. Monod propusieron

un modelo ingenioso para explicar la induc-ción y represión de la síntesis enzimática.Por este trabajo y otras contribuciones reci-bieron el premio Nobel de medicina 1965.De acuerdo a su teoría, la regulación de

las enzimas involucradas en la inducción y represión tiene lugar a nivel de la transcrip-ción. Los genes que transcriben un RNAmensajero (RNAm) policistrónico, que a suvez codifica para las enzimas coordinada-

mente inducidas o reprimidas se denominangenes estructurales. Por "mapeo" genéticodel cromosoma involucrado se ha demostra-do que estos genes estructurales se localizanadyacentes, uno con otro, en el cromosomainvolucrado. El modelo presupone que latranscripción de genes estructurales estácontrolada por un gene operador y un sitio promotor (donde se une la enzima RNA po-limerasa), formando una unidad funcionalllamada operan. Otro gene, llamado regula-dor que codifica para una proteína represora del gene operador, se puede localizar en unsitio distante del gene operador (fig. 4.26).Para mayor comprensión de estos aspectosse recomienda revisar los conceptos genéti-cos de la unidad IX.El operón Lac. de E. Coli, es uno de los

más estudiados, consta de 3 enzimas induci-bles controladas por 3 genes estructurales(Z, Y y A). El amino terminal de la p-galac-tosidasa se sitúa del lado del operador. Así,la síntesis de RNAm transcurre desde eloperador a través del operón completo. Estefenómeno de polaridad se ha encontrado pa-ra el operón del triptófano (operón Tri) y otros. La proteína represora que actúa sobreel operador y que impide la acción de laRNA polimerasa y por tanto, la formacióndel RNAm de todo el operón Lac es un tetrá-mero de casi 150,000 daltones que se sinteti-za continuamente. Cuando se dan inductorescomo la lactosa o análogos se deforma el re-presor, y el operón Lac se transcribe y traduce.El control del operón Lac tiene otro ele-

mento efector positivo, el AMP cíclico(AMPc). Células con glucosa disponible tie-nen bajos niveles de AMPc. Al inducir conlactosa, el AMPc se une a una proteína cata-bólica activadora del gene (CAP, un dímerocon PM de 45,000 daltones, y este complejose une al sitio promotor en el DNA de talmanera que la RNA polimerasa puede ini-ciar la síntesis de RNAm. Así, la expresióndel operón Lac requiere del inductor (lacto-sa) y de AMPc.

Figura 4.26 Inducción enzimática en el operón LAC de E, coli. L = lactosa; CAP = proteína catabólicaactivadora del gene operador.

En sistemas reprimibles, el gene regula-dor elabora una proteína represora que regu-larmente no interactúa con el operador.Cuando se da el correpresor (por ejemplo,histidina), se combina éste con la proteína y seforma una sustancia efectivamente represo-ra que bloquea al gene operador (fíg. 4.27).Esto representa también un ahorro de ener-gía para la célula ya que si existe histidina,no tiene objeto la producción de enzimas pa-ra su síntesis.

El operón His. de Salmonella typhimu-rium coordina la expresión de genes estruc-turales (G, D; C, B, H, A, F, I, E.) quecodifican para 9 enzimas, que actuandocoordinadamente, participan en la biosínte-sis de histidina. La histidina es también uninhibidor alostérico de la primera enzima dela secuencia biosintética.Aunque los genes y mecanismos regula-dores mencionados sólo han sido demostra-dos en procariotes, se supone que también se

presentan en organismos eucariotes. Sin em-bargo, hay que ser prudentes en extrapolarlos conocimientos adquiridos de una a laotra clase de células (eucariotes). En esta úl-tima, los mecanismos de regulación son máscomplejos y tienen separados físicamente latranscripción de los genes de la traducción.Además, los RNAm eucarióticos son mono-cistrónicos en contraposición a los RNAmpolicistrónicos de las células procariotas.

Aspectos Clínicos de las EnzimasLa aplicación clínica de las enzimas anterior-mente se restringía a su empleo como auxi-liares en el diagnóstico; posteriormente se

vislumbró la posibilidad de emplearlas en eltratamiento de algunas enfermedades, cam-po que está en exploración muy activa. Lasenzimas se utilizan también como reactivosclínicos para detectar otro tipo de moléculascuyas concentraciones son bajísimas en elplasma o tejidos.

4.7.1. Como reactivos en el laboratorio clínicoLa disponibilidad de enzimas puras a pre-cios razonables ha convertido a algunas deellas en reactivos de enorme valor para el la-boratorio de análisis. Puede determinarseenzimáticamente la concentración de un

compuesto en una mezcla cuando se disponede una enzima específica capaz de transfor-marlo rápidamente en un producto.Muchas determinaciones enzimáticaspueden acoplarse con reacciones que utili-zan NAD+ o NADP+ como coenzimas, envirtud de que NADH y NADPH absorben a 340nm mientras que NAD+ y NADP+ no ab-sorben a esa longitud. Cuando el NAD+ sereduce, se incrementa proporcionalmente ladensidad óptica; cuando el NADH se oxida,disminuye la densidad óptica (fig. 4.28).Con este ensayo se puede determinarurea, al acoplar la acción de la enzima urea-sa con la glutamato deshidrogenasa (GDH).La glucosa se determina oxidándola a glu-conato en presencia de la enzima glucosaoxidasa, con H2O2 como subproducto. Aco-plando la reacción con peroxidasa, el H2O2oxida la O-dianisina a un compuesto colori-do (principio de la glucocinta).Para determinar alcohol etílico, se con-vierte éste en acetaldehído por medio de laenzima deshidrogenasa alcohólica (ADH):

el aumento en absorbancia a 340 nm es pro-porcional a la concentración de alcohol.Aprovechando la especificidad enzimáti-ca e inmunológica por un sustrato, se haideado un método altamente específico lla-mado enzimoinmunoensayo (EIA). El fun-damento de este método es similar alradioinmunoensayo (RÍA), basado en elprincipio de la unión competitiva, y en la se-lectividad y sensibilidad de la respuesta an-tígeno-anticuerpo. En los últimos añosexisten disponibles comercialmente las eri-

zarías inmovilizadas para usarse en sistemasde determinación automatizados.

4.7.2. Como elementos diagnósticos Una importante función de un laboratorioclínico, es la de cuantificar las alteracionesbioquímicas en el individuo enfermo, comola determinación de enzimas en líquidos ex-tracelulares (plasma y suero, orina, jugogástrico, líquido cefalorraquídeo, líquidoamniótico, líquido sinovial), y en algunostejidos o células sanguíneas.

4.7.2.1. Enzimas órgano específicasEn condiciones normales, las enzimas invo-lucradas en los procesos metabólicos (glu-cólisis, fosforilación, transaminación,oxidación, etc.) se sintetizan en las células y la mayoría ejerce su función en su interior.Si las células permanecen intactas, las enzi-mas intracelulares no pasan al torrente san-guíneo, sin embargo, como resultado de unalesión celular producida por agentes infec-ciosos, toxinas bacterianas, o incluso por elproceso de envejecimiento celular normal,se producen daños en las membranas celula-res que permiten el "escape" de enzimas a lacirculación. Este escape de enzimas de lascélulas al plasma se produce también cuan-do mueren éstas como ocurre en el infarto

de miocardio y la hepatitis infecciosa. Enpersonas normales sanas, las enzimas de ori-gen intracelular están presentes en plasmaen cantidades muy bajas pero mensurables.En el diagnóstico de la alteración de un

órgano específico en un proceso patológicosería ideal que se pudiesen identificar enzi-mas específicas para cada órgano; no obs-tante, esto es poco probable ya que elmetabolismo de muchos órganos es muy pa-recido. Esta correlación ocurre sólo para al-gunas enzimas, por ejemplo la alcohol deshidrogenasa o la sorbitol deshidrogena-sa que son casi exclusivamente de origenhepático, la acetilcolinesterasa de eritroci-tos, la fosfatasa acida de próstata, y la fosfa-tasa alcalina de osteoblastos. Una de lasaspiraciones del diagnóstico clínico es pre-cisamente lograr la asociación de una enzi-ma específica en plasma o sangre con cadatejido o situación patológica. Un grado ma-yor de conocimiento de esta relación se estáconsiguiendo con el estudio de determina-das isoenzimas.

4.7.2.2. IsoenzimasEl interés médico por las isoenzimas fue es-timulado por el conocimiento de que los

sueros humanos contenían varias isoenzi-mas de la deshidrogenasa láctica y que susproporciones relativas cambian significati-vamente en ciertos estados patológicos.

Las isoenzimas que han sido estudiadaspara aplicaciones diagnósticas son la deshi-drogenasa láctica, la creatinfosfocinasa y la fosfatasa alcalina (revisar subcapítulo4.2.4).

4.7.2.3. Perfiles enzimáticosEl plasma circulante contiene cantidadesapreciables de enzimas que tienen su origenen las células de diferentes tejidos del orga-nismo; éstas pueden dividirse en tres gru-pos:

1) Enzimas que realizan una función es-pecífica en el plasma llamadas también enzi-mas plasmáticas funcionales. Se encuentranen alta concentración y están involucradas enfunciones como la coagulación de la sangre(trombina y otras), disolución de la fibrina(plasmina) y modificación de quilomicrones(lipoproteinlipasa).2) Enzimas elaboradas por células espe-

ciales y secretadas a un conducto o dentro deun tejido especial, por ejemplo amilasa, li-pasa, fosfatasa acida y fosfatasa alcalina.

3) Enzimas que realizan su función en lascélulas que las originan y cuyas actividadesconstituyen el proceso vital celular.El segundo y tercer grupo de enzimas se de-nominan también enzimas plasmáticas nojun-donales y su presencia en plasma en cifrasmayores que las normales sugiere una veloci-dad aumentada de destrucción celular. Su cuan-tificación constituye para el médico una pruebavaliosa de diagnóstico y pronóstico clínico.

4.7.3. Alteraciones enzimáticas como causa de enfermedad Muchas enzimas se encuentran en casi todaslas células aunque algunas se encuentranpredominantemente en ciertos tejidos. Auncuando la enzima sea específica de un tejidoparticular, niveles elevados de ésta en plas-ma solo indican daño celular pero no el tipode proceso patológico. Por ejemplo, despuésde cirugía mayor o de un trauma extenso, seelevan los niveles de LDH-5, TGO y CPK a partir del músculo esquelético dañado, si sepresenta insuficiencia circulatoria debida a insuficiencia cardiaca o choque, y especial-mente después de paro cardiaco, se elevannotablemente algunas enzimas pero su valo-ración no permite establecer la causa de lainsuficiencia o del paro.

Puede localizarse el tejido dañado paraconfirmar un diagnóstico de dos formas:a) Por determinación del perfil isoenzi-mático, ejemplo: las isoenzimas de la LDH(fig.4.29).b) Por valoración de más de una enzima,ejemplo: hígado y corazón contienen altosniveles de aminotransferasas, antes llama-das transaminasa glutámico pirúvica (TGP)y glutámico oxalacética (TGO) pero el híga-do contiene más TGP que TGO mientras queen el corazón sucede al revés. En otro ejem-plo se utiliza la valoración de isoenzimas dela LDH y CPK para determinar la evoluciónde un infarto de miocardio (fig. 4.30).

Existen causas de elevación no específicade niveles enzimáticos que pueden ser; a)fisiológicas, como en el recién nacido; losniveles de TGO están elevados moderada-mente en el periodo neonatal. Los niveles defosfatasa alcalina son altos hasta después dela pubertad por la actividad osteoblástica.En el último trimestre del embarazo estánelevados los niveles de fosfatas alcalina deorigen placentario. b) inducidas por drogas.Ciertas drogas como difenilhidantoína y barbitúricos pueden inducir la producciónde enzimas, como la fosfata alcalina. Losniveles de gama-glutamiltransferasa se corre-lacionan con ingestión de alcohol, c) eleva-ciones artificiales. En general las muestrashemolizadas son inadecuadas para valora-ciones enzimáticas. Aun cuando los eritroci-tos lisados no contengan la enzima porvalorar, contienen otras que interfieren y producen falsas positivas.

Creatinfosfocinasa (CPK). Esta enzimase encuentra distribuida en músculo cardia-co, esquelético y cerebro. La enzima catali-za la siguiente reacción:CPK

CREATINFOSFATO + ADP -* CREATINA + ATP

Esta se acopla a otras dos, para determinarcuantitativamente el NADPH:ATP + GLUCOSA -+ GLUCOSA-6-P + ADP

GLUCOSA -6-P+ NADP+ -» 6-p-glucorolactona + NADPH+H+

La enzima CPK, es un dímero que consta de3 isoenzimas: CPK-1 (BB) de cerebro;CPK-2 (MB) y CPK-3 (MM) de músculo.Se eleva marcadamente en infarto de mio-cardio, en la misma proporción que la TGOy en distrofias musculares sobre todo la detipo Duchenne; moderadamente en lesionesmusculares, cirugía, ejercicio físico intenso,accidentes cerebrovasculares, hipotiroidis-

Figura 4.29 Patrones normal y patológico de las isoenzimas de la LDH en suero humano. A: paciente coninfarto de miocardio; B: suero normaj; C: paciente con enfermedad hepática.

mo (la tiroxina afecta el catabolismo de laenzima) alcoholismo (miositis alcohólica)episodios psicóticos agudos, y artificialmen-te en muestras hemolizadas.a-amilasa (AMS). La enzima está presen-te en jugo pancreático, saliva, trompas deFalopio y músculo. Se excreta por orina envirtud de su bajo peso molecular. Los nive-les urinarios se elevan paralelamente a losniveles plasmáticos, a menos que exista in-suficiencia renal. El ensayo se realiza poracción de suero, plasma u orina sobre amilo-pectina marcada con un colorante azul. Laintensidad del color azul liberado es propor-cional a la cantidad de enzima.La amilasa se eleva notablemente (5 a 10veces) en casos de pancreatitis aguda (enocasiones en carcinoma de páncreas), ure-mia grave y cetoacidosis diabética severa;moderadamente en casos de úlcera pépticaperforada, colecistitis, obstrucción intesti-

Fig. 4.30. Patrón isoenzimático de CPK y LDHdespués de un infarto de miocardio.

La isoenzima CPK2 (MB) aumenta hasta un máximodentro del primer día del infarto, CPK3, sigue máslenta alrededor de un día, a la CPK2. El nivel total deLDH aumenta muy lentamente. El incremento deLDH 1 y LDH 2, dentro de las 12-24 h junto con unincremento de CPK2; es diagnóstico del infarto demiocardio.

alta especificidad de éstos ni la capacidadpara disminuir la energía de activación (ta-bla 4.1). Una enzima puede acelerar una re-4.2.2.1. Cofactores coenzimáticosLa mayoría de las coenzimas son formasacción 105 veces más que un catalizador modificadas de las vitaminas (ver unidad de

inorgánico. nutrición). Entre las reacciones catalizadas

4.2. ESTRUCTURA DE LAS ENZIMAS4.2.1. Holoenzima y apoenzima La parte proteica de la enzima desprovistade los cofactores se denomina apoenzima. No todas las enzimas requieren cofactorespara ser activas, pero en las que los requie-ren, la apoenzima es catalíticamente inacti-va. La adición del cofactor a la apoenzimada lugar a la holoenzima, o sea la enzimacompleta y activa.

4.2.2. Cofactores Otros componentes de la enzima con bajopeso molecular, termostables y no proteicos,unidos a la apoenzima se llaman coenzimas, si la unión es débil y se separa con facilidadde la apoenzima, o grupos prostéticos, si es-tán firmemente ligados a la apoenzima. Loscofactores (coenzima o grupos prostéticos)son en general moléculas pequeñas, orgáni-cas e inorgánicas, que requiere la enzima pa-ra su actividad.

por enzimas que requieren coenzimas estánlas de oxidorreducción, las de transferenciade grupo, las de isomerización y las que for-man enlaces covalentes. Las reacciones hi-drolíticas no requieren de coenzimas.La coenzima puede considerarse como uncosustrato, por ejemplo, en las reacciones deoxidorreducción, una molécula de sustrato esoxidada (deshidrogenada) y una molécula decoenzima es reducida (hidrogenada) (fig. 4.2).De modo similar, en las reacciones detransaminación, el fosfato de piridoxal(PPal) actúa como segundo sustrato en dosreacciones combinadas (fig. 4.3).Relación entre vitaminas y coenzimas. Las vitaminas del complejo B forman par-te de numerosas coenzimas. Tal es el casode la nicotinamida, riboflavina, tiamina, áci-do pantoténico, ácido fólico y cianocobala-mina. Coenzimas de oxidorreducción,derivadas de la vitamina nicotinamida son elnicotkiamida-adenina-dinucleótido (NAD+),y el nicotinamida-adenina-dinucleótido-fos-fato (NADP+). (fig. 4.4). La vitamina C y lasvitaminas liposolubles no tienen actividadcoenzimática conocida.

nal, embarazo ectópico roto, parotiditis, cálcu-los salivales, administración de morfina (es-pasmo del esfínter de Oddi) y macro-amila-semia.Fosfatasa alcalina (ALP). Incluye isoen-

zimas que hidrolizan fosfatos a pH alcalino.Se encuentran en hueso, hígado, pared intes-tinal, glándula mamaria lactante y placenta.

En huesos se localiza en los osteoblastos(la enzima es necesaria para los depósitos defosfato en hueso). Los niveles normales enel adulto provienen específicamente de hí-gado, en niños de la fracción ósea por la ac-tividad osteoblástica. En el embarazo seelevan los niveles normales debido a laisoenzima termoestable de la placenta.

El método usado en la valoración es el deBassey Lowry-Brock que utiliza la siguientereacción.

pH 8.5-10p-NITROFENOLFOSFATO — • p-NTTROFENOL + Pi

La enzima se eleva en enfermedades he-páticas con elementos colestáticos junto conla enzima 5'-nucleotidasa (NTP) que parecetener también origen hepático. Se eleva tam-bién en enfermedades óseas con actividadosteoblástica elevada: osteomalacia y raqui-tismo, hiperparatiroidismo, enfermedad dePaget, osteocarcinoma y osteosarcoma; en elraquitismo, la fosfatasa se eleva aun antes deque aparezcan síntomas de la enfermedad.Fosfatasa acida (ACP). Se encuentra en

próstata, hígado, eritrocitos, plaquetas y hue-so. El método de determinación es similar alde las fosfatasas alcalinas excepto el pH ópti-mo que es de 5. El principal uso de la valora-ción es el diagnóstico de carcinoma prostáticometastásico. Aunque es difícil detectar sólo lafracción prostática, esta fracción tiene la pro-piedad de ser inhibida por el L-tartrato. Nor-malmente, la fosfatasa acida de la secreciónprostática drena a los conductos prostáticos y aparece poco en sangre. En el carcinoma

prostático, particularmente si es metastási-co, se elevan los niveles de ACP debido alaumento de células prostáticas ectópicas.

4.7.4. Como agentes terapéuticos Algunas enzimas se han utilizado como me-dicamentos en la terapia de problemas médi-cos específicos.

La estreptocinasa, preparada a partir deestreptococos, es útil para disolver coágulosde sangre formados en las extremidades infe-riores. Esta enzima activa el plasminógenoel cual se transforma en plasmina que es unaproteasa que ataca la fibrina y la degrada.

Utilizando fibrinolisina y estreptodornasa(una DNAsa) por vía oral o tópico se puedeeliminar el material fibrinoso y purulento deheridas infectadas o necrosadas. Varias en-zimas proteolíticas como tripsina y quimo-tripsina al igual que la estreptocinasa, seutilizan en el tratamiento de la trombosis.

Algunas enzimas digestivas (peptidasas,lipasas, amilasa, nucleasa y celulasas), seusan en la deficiencia enzimática por pan-creatitis crónica, pancreatectomía y trastor-nos gastrointestinales.

La terapia con asparaginasa se usa en al-gunos tipos de leucemia adulta. En virtud deque las células tumorales tienen un requeri-miento nutricional de asparagina, con aspa-r ag inasa los n i v e l e s de asparaginadisminuyen sensiblemente lo que lleva a disminuir la viabilidad del tumor.

En el capítulo de ácidos nucleicos se estu-diarán algunas enfermedades en las que estáalterada la codificación de algunas enzimas;su deficiencia o falta de actividad, es la cau-sa de la enfermedad. En el futuro será posi-ble el reemplazo enzimático por ingenieríagenética en individuos con deficiencia gené-tica que afecte la síntesis de una enzima da-da.

C H L - C H - COO"0 I

OH

Lactato

( Sustrato reducido

C H , - C - C O O ~3 II

O

Piruvato

( Sustrato oxidado )

NAD

coenzima oxidada

NADH + H +

( coenzima reducida )

Fig. 4.2. El NAD (nicotín-adenín-dinucleótido) actuando como cosustrato en una reacción deoxidorreducción

COO"IOH-NH9I 2

CH?I

CH 9

I ¿

COOH

Glutamato

COO"ic=oI

CH«I 2

CH«I ¿

COOHoe-Cetaglutarato

COOH

C H - N H 9I 2

Alanina

COOHIC = 0

C H 3

Piruvato

Fig. 4.3. Transferencia de grupos ámino con PPal(fosfato de piridoxal) como cosustrato.

Clasificación de coenzimas Las coenzimas pueden clasificarse como sigue:Para la transferencia de gruposdistintos del H:Uridina difosfato (UDP)Pirofosfato de Tiamina (TPP)Fosfato de Piridoxal (PPal)Coenzima A (CoA-SH)Acido tetrahidrofólico (TH4)BiotinaCoenzimas de cobamida (B12)Acido LipoicoS-Adenosil metionina (S AM)

Para la transferencia de H:NAD+,NADP+FAD,FMNAcido LipoicoCoenzima Q

Algunos autores clasifican estructuralmentea las coenzimas como: coenzimas nucleotí-dicas y no nucleotídicas. Al primer grupopertenecen los nucleósidos di y trifosfatoque participan en reacciones de transferen-cia como AMPC, AMP, ADP, ATP, S-ade-nosil metionina, NALV, NADP+, FAD y coenzima A. El resto serían las coenzimasno nucleotídicas.Otra sería la clasificación funcional quelas agrupa en coenzimas vitamínicas y novitamínicas.

4.2.2.2. Grupos prostéticosFuncionan también como cofactores o co-sustratos enzimáticos pero, a diferencia delas coenzimas, se encuentran firmementeunidos a la apoenzima, ejemplos clásicos degrupos prostéticos son el FAD (flavinade-nin-dinucleótido) y el grupo hemo. En loscitocromos, el grupo prostético hemo estáunido fuertemente y requiere ácidos fuertespara disociarse del citocromo.

42.23. ComplementosAlgunos cofactores enzimáticos no pertene-cen a coenzimas o grupos prostéticos deri-vados de vitaminas sino que representanelementos minerales por ejemplo, la lisina-oxidasa es una enzima que necesita cobre y la anhidrasa carbónica que requiere cinc.

4.2.3. Sitio activo Una propiedad muy importante de las enzi-mas es su especificidad. Todas las enzimas,por el hecho de ser micelas, son capaces deadsorber moléculas pequeñas en su superfi-

cie, lo cual favorece la interacción de lossustratos y su reacción. Sin embargo, la es-pecificidad reside en una determinada re-gión de la superficie enzimática llamadositio activo (fig. 4.5).

4.2.3.1. Tipos: Catalíticos, reguladoresEl modelo original de sitio catalítico parareferirse al sitio activo, propuesto por ÉmilFisher en 1894 representaba la interacciónsustrato-enzima en términos de la analogíaentre llave-cerradura. Sin embargo el mo-delo de Fisher consideraba al sitio catalíticorígido y las proteínas en solución son flexibles

Fig. 4.5. Sitio activo de una enzima. Ajuste inducido por un cambio conformacional en la estructura de laenzima antes y después de la unión del sustrato.

por esto, Koshland en 1967 emitió un modelodel sitio catalítico flexible, al que llamó deajuste inducido (fig. 4.5). En este modelo, elsustrato induce un cambio conformacionalen la estructura terciaria de la proteína enzi-mática como hace la mano en el guante. Estemodelo permite también explicar la influenciade otros sitios, llamados reguladores o alos-te'ricos, que modifican la actividad de la en-zima al provocar cambios conformacionalesen el sitio catalítico; esto se discutirá másadelante al hablar de efectores alostéricos.

4.2.4. Enzimas oligoméricas e isoenzimas Existen enzimas que constan de una sola ca-dena polipeptídica integrando un monóme-ro. A este grupo pertenecen la lisozima,ribonucleasa, tripsina y otras.Otro grupo de enzimas contienen dos o más subunidades asociadas por enlaces noconvalentes. A este grupo pertenecen algu-nas enzimas de la glicólisis, las isoenzimas y las enzimas alostéricas (Tabla 4.2).Las isoenzimas o isozimas son diferentesproteínas con la misma actividad enzimáticaque se originan en diferentes tejidos y presen-tan un desplazamiento electroforético diferen-te. Las isoenzimas difieren en su composiciónde aminoácidos por lo que sus diferenciasestán determinadas genéticamente.Las isoenzimas más estudiadas por susaplicaciones clínicas son la deshidrogenasa

láctica, la creatina fosfocinasa y la fosfatasaalcalina. El caso más ilustrativo es el de ladeshidrogenasa láctica, enzima tetramérica,que posee dos subunidades distintas: H (decorazón) y M (de músculo). Estas dos subu-nidades se combinan de cinco formas dife-rentes para formar cinco isoenzimas: H4,H3M, H2M2, HM3 y M4 (Fig. 4.6).La isoenzima M4 predomina en músculoesquelético y en hígado, la izoenzima H4predomina en miocardio (Tabla 4.3). La dife-rencia cinética entre estas dos isozimas se ex-plica en otros capítulos.

4.2.5. Complejos multienzimáticos Algunas reacciones requieren de múltiplesenzimas asociadas que participan secuen-cialmente para transformar un sustrato,ejemplos de este tipo son la piruvato deshi-drogenasa con un peso molecular de 4.8 mi-llones y la sintetasa de ácidos grasos.

4.3. NOMENCLATURA Y CLASIFICACIÓN DE LASENZIMAS

4.3.1. Nombres sistemáticos y nombres trivialesEn un principio se designó a las enzimas connombres triviales según el sitio anatómico

Tabla 4.2Enzimas oligoméricas

EnzimasNúmero desubunidades PM de cadasubunidad peso molecularTotal

de procedencia, como la ptialina, la pepsina, tripsina pancreática, etc. Después se les de-nominó añadiendo al nombre del sustratosobre el que actuaban, el subfíjo asa; así lasque hidrolizan el almidón (latín amilum), amilasa, las que hidrolizan las grasas o lípi-dos, lipasas, las que hidrolizan proteínas,proteasas. Más tarde se les dio el nombresegún la reacción química catalizada, ejem-plo: deshidrogenaseis, oxidaseis, descarboxi-lasas, adiaseis, esteraseis, etc.

4.3.2. Clasificación digital de las enzimas En el año de 1961, la Unión Internacional deBioquímica (UIB) adoptó el sistema de cla-sificación y nomenclatura propuesto por suComisión de Enzimas (E.C.) basado en el ti-po de reacción química y su mecanismo deacción. Según éste, cada enzima tiene un nú-mero clave de 4 dígitos de manejo interna-

cional, de manera que independientementedel país y el nombre trivial que se le dé encualquier idioma, la deshidrogenasa alcohó-lica será la enzima E.C. 1.1.1.1.El primer dígito identifica la clase a la que

pertenece la enzima. Las enzimas se clasifi-can en las seis clases siguientes:

1.- Oxidorreductasas; 2.- Transferasas; 3.-Hidrolasas: 4.- Liasas; 5.- Isomerasas: y 6.-Ligasas, el segundo dígito identifica la sub-clase, el tercero la sub-subclase y el cuartodígito para la enzima específica. El nombresistemático de la deshidrogenasa alcohólica esalcohol: NAD+.oxidorreduetasa (E.C.l. 1.1.1.)El primer dígito es por ser una oxidorredue-tasa, el segundo porque el dador electrónicoes un alcohol, el tercero porque el aceptor esla coenzima NAD+ y el cuarto por el númerode orden de la enzima.

1.- Oxidorreductasas.- Estas enzimas ca-talizan reacciones de oxidación y reducciónmuy importantes en biología. Con frecuen-