CAPÍTULO 8: EL CRECIMIENTO DE LOS MICROORGANISMOS

Un quimiostato andante

El sueño de la microbiología industrial es convertir un substrato barato y abundante en un producto de gran valor. Los microbiólogos podrían no estar de acuerdo en cuanto al producto ideal pero sí en cuanto al substrato ideal. Todos coinciden en que la celulosa — el componente mayoritario de la pared de la célula vegetal — es el compuesto orgánico más abundante en el mundo y probablemente el más barato. Sin embargo, sólo los microorganismos pueden utilizar la celulosa como substrato y, por lo tanto, convertirla en algo útil.

Al preguntarle a Robert Hungate, un microbiólogo norteamericano de primera linea, si se descubriria alguna vez una conversión microbiana de la celulosa de interés comercial, éste replicó que ya existía - la vaca. La vaca y otros rumiantes son fábricas andantes que utilizan los microorganismos para convertir la celulosa en carne y leche. Estos rumiantes obtienen la celulosa (y pequeñas cantidades de otros substratos) al ingerir hierba y otros forrajes que mastican para desmenuzarlos en pequeñas porciones que llegan al rumen, la gran cámara del estómago, constituido por cuatro compartimientos. El rumen de la vaca es rico en bacterias y protozoos. Estos -y no la vaca- son los que metabolizan la celulosa. La vaca no hace nada para obtener los nutrientes a partir de la celulosa. Sin embargo, los obtiene en su mayor parte de los productos de la fermentación microbiana producida en su rumen y de las células microbianas que pasan de manera continua desde el rumen de la vaca al intestino, donde son digeridas y absorbidas.

Hungate y sus colegas han demotrado que el rumen de la vaca funciona como un quimiostato, un aparato que se utiliza para cultivar microorganismos. Los nutrientes llegan de forma continua al rumen, donde los microorganismos crecen también sin parar, y parte de su contenido pasa continuamente al sistema digestivo. Esto no significa que las vacas estén siempre comiendo. Por el contrario, los rumiantes aportan nutrientes al rumen de manera regular, rumiando el forraje, es decir, masticando el forraje regurgitado. Cuando mastican, fluyen al rumen fragmentos de forraje suspendidos en la saliva. La vaca no rumia siempre que no esté comiendo, pero el aporte de nutrientes al rumen es esencialmente continuo porque los fragmentos sólidos de celulosa actúan como reservorios de nutrientes para los microorganismos.

Las vacas y otros rumiantes han alcanzado los objetivos que sueñan los microbiólogos industriales - convertir la celulosa en productos de valor. Además, lo hacen eficaaanente, con mayor eficiencia que cualquier proceso industrial conocido.

Comprender: 

Cómo crecen los microorganismos: el tiempo de duplicación y el crecimiento exponencial Las fases de crecimiento de un cultivo microbiano Los métodos que se pueden utilizar para mantener los microorganismos creciendo continuamente Qué tipos de nutrientes requieren los microorganismos para crecer Las condiciones ambientales que permiten el crecimiento microbiano: la temperatura, la presión

hidrostática, el pH y la fuerza osmótica Cómo medir el crecimiento de una población microbiana usando métodos indirectos - midiendo la turbidez,

el peso seco, o la actividad metabólica Cómo medir el crecimiento de una población microbiana mediante recuento directo, recuento en placa,

número más probable y mediante filtración

8.1 LAS POBLACIONES

Al estudiar el metabolismo y la genética de los microorganismos, nos hemos centrado en un individuo - la forma en que se mantiene y se reproduce una célula microbiana. En este capítulo y en el siguiente, prestaremos atención a los grandes grupos - estudiando cómo las poblaciones de microorganismos aumentan mediante el crecimiento y disminuyen o desaparecen como resultado de la muerte.

Estudiar las poblaciones requiere que observemos a los microorganismos desde una nueva perspectiva. Cuantío estudiamos individuos, lo que hacemos es describir. Describimos las partes de la célula implicadas en un proceso particular, cómo produce la célula las moléculas que necesita para originar una nueva célula y cómo protege su información genética cuando ésta pasa de una generación a la siguiente. Sin embargo, cuando estudiamos poblaciones, lo que hacemos es Contar. De las poblaciones queremos saber "¿cuánto?","¿cuánto más?"o"¿cuánto menos?". El estudio de las poblaciones, ya sean microbianas o humanas, se realiza desde un punto de vista matemático.

A menos que digamos lo contrario, usaremos el término crecimiento microbiano para referirnos al crecimiento de una población, no al incremento en tamaño de una célula individual. Las células microbianas individuales crecen, pero la mayoria solo incrementan su tamaño hasta alrededor del doble, antes de que se dividan en dos. La división celular se traduce en crecimiento o incremento en el número de celulas de la población (Figura 8.1).

 

8.2 CÓMO CRECEN LOS MICROORGANISMOS

 

En un ambiente favorable, una célula microbiana dada aumenta su tamaño; y cuando éste se duplica, la célula se divide. La mayoría de las bacterias se alargan y se dividen mediante fisión binaria, o bipartición, cerca del ecuador celular, para formar dos células hijas aproximadamente iguales. Algunos microorganismos unicelulares, incluidas algunas bacterias, se replican por gemación, formando una yema que crece y se separa de la célula parental. Aunque tratamos el crecimiento en términos de una población bacteriana que se divide mediante fisión binaria, los mismos principios se pueden aplicar para los microorganismos que se reproducen mediante gemación (Capítulo 5). El crecimiento de los microorganismos filamentosos (aquellos que forman largos tubos) y de los microorganismos con ciclos de vida complejos siguen reglas más complicadas.

 

8.2.1 Tiempo de duplicación y tasa de crecimiento

El tiempo de duplicación (también conocido como el tiempo de generación) es el período que requieren las células de una población microbiana para crecer, dividirse, y dar lugar a dos nuevas células por cada una de las que existían anteriormente. El tiempo de duplicación es, aproximadamente, el mismo para todas las células de una determinada población. No cambia hasta que se agotan los nutrientes o comienzan a acumularse los productos metabólicos tóxicos. Cuando las condiciones para el crecimiento se hacen menos favorables, el tiempo de duplicación aumenta antes de que el crecimiento se detenga.

El tiempo de duplicación varía dependiendo de la especie microbiana y de las condiciones de crecimiento de la población. Por ejemplo, el tiempo de duplicación de Escherichia coli es de alrededor de 18 minutos en un medio de laboratorio rico. Pero en el tracto intestinal de los vertebrados, en el cual los nutrientes son menos abundantes, el tiempo de duplicación es de unas 12 horas. Algunas bacterias pueden crecer un poco más rápidamente que E. coli; pero incluso en las condiciones más favorables, muchos microorganismos crecen mucho más lentamente, requiriendo horas o días para duplicar su numero.

El valor del tiempo de duplicación nos indica la rapidez con que está creciendo una población, pero la relación es inversa, Esto es, las poblaciones con un valor de tiempo de duplicación bajo están creciendo rápidamente, mientras que las poblaciones con un valor más elevado de tiempo de duplicación están creciendo más lentamente. Por esta razón, la misma informacion se expresa frecuentemente como tasa de crecimiento, o tiempo de duplicación por hora, que es elevada para las poblaciones de crecimiento rápido y baja para las de crecimiento lento. Así, la tasa de crecimiento de un cultivo de E. coli que tiene un tiempo de duplicación de 18 minutos será de 3,3 (60/18) generaciones por hora.

 

8.2.2 El crecimiento exponencial

Durante un periodo de tiempo de duplicación constante, una población microbiana se encuentra en crecimiento exponencial. Esto significa que durante cada tiempo de duplicación, el número de células de la población se incrementa en un factor de dos, es decir, se duplica.

El concepto de crecimiento exponencial se ilustra mediante un paradigma matemático acerca de los lirios acuáticos. Un lirio de agua produce una hoja nueva cada día, por cada hoja que tenía

el día anterior. Comenzando con una unica hoja, el lirio cubre un estanque de media hectárea en unos 30 días. Cuánto tardará en cubrir un estanque de una hectárea? La respuesta correcta es 31 días, no 60, porque el tiempo de duplicación es de un día. En condiciones de crecimiento exponencial, los seres vivos se multiplican con una asombrosa rapidez. Durante cada tiempo de duplicación se producen tantas nuevas células como se habían producido anteriormente de manera acumulada.

 

Figura 8.1 La mayoría de las células microbianas se dividen por fisión binaria como se muestra en esta micrografía electrónica de barrido de la bacteria Staphylococcus aureus. En la Íisión binaria, la célula replica su

DNA y proporciona una copia a cada célula hija.

 

Puesto que el crecimiento microbiano es exponencial, para la expresión gráfica del crecimiento de una población microbiana se utiliza una escala exponencial (Figura 8.2). Aunque la misma información podría expresarse utilizando una gráfica aritmética, o numerica sencilla, la gráfica exponencial tiene ventajas significativas. El numero de microorganismos de una población que aumenta exponencialmente se incrementa lentamente al principio y luego muy rápidamente. Por ejemplo, durante las tres primeras duplicaciones de una sola célula, sólo se producen siete nuevas celulas. Durante la séptima duplicación, se originan 64 células y durante la duplicación vigésimo primera, más de un millón. Si se expresa esta curva en una escala aritmética, el incremento inicial apenas se apreciará, mientras que las fases de crecimiento posteriores dispararían la gráfica. Utilizando una escala exponencial, la curva se convierte en una línea recta, con una pendiente directamente relacionada con la tasa de crecimiento de la población. Esto es lógico si recordamos que por cada duplicación la población se duplica. En otras palabras, el número total de células es igual a dos elevado a un exponente, y dicho exponente es el número de generaciones que han transcurrido desde que la población comenzo a aumentar. Así, una población que comienza como una célula (20), se incrementa a dos células (21), luego a cuatro células (22), ocho células (23), 16 células (24), y asi sucesivamente. La fórmula general es N = 2n, donde N es el número de células en el cultivo después de que pasen n tiempos de duplicación.

¿Por qué la gráfica es una línea recta y no una línea en forma de escalera? Si una población microbiana proviene de una umea célula y tiene un tiempo de duplicación constante, ¿no se mantendría la población constante durante cada tiempo de duplicación y luego se incrementaría bruscamente - en forma de escalera? De hecho, este modelo, denominado crecimiento sincrónico, no se produce en circunstancias ordinarias. Por el contrario, las células individuales de la población suelen dividirse antes o después del tiempo de duplicación de la población, según un modelo de crecimiento asincrónico. Los tiempos de división efectivos se distribuyen alrededor del tiempo de duplicación, de manera que el incremento de la población es uniforme y la gráfica aumenta como una línea recta.

aa Tiempo Células / Mililitro

Notación

Minutos Horas Número Científica Logaritmo

0 0 1000 103 3,0

20 0,33 2000 2 X 103 3,301

40 0,66 4000 4 x 103 3,602

60 1,00 8000 8x103 3,903

80 1,33 16000 1,6X104 4,204

100 1,66 32000 3,2x1O4 4,505

120 2,00 64000 6,4 x 104 4,806

140 2,33 128000 1,28 x 105 5,107

160 2,66 256000 2,56 x 105 5,408

180 3,00 512000 5,12 x 105 5,709

200 3,33 1024000 1,02 x 106 6,010

(a)

 

Figura 8.2 Crecimiento exponencial de un cultivo bacteriano. (a) El número de células por mililitro en un cultivo que crece exponencial mente se mide cada 20 minutos y se expresa como el número, de células o como el

logaritmo del número de células. (b) La expresión del logaritmo del número de células frente al tiempo es una línea recta. (c) La representación del número de células frente al tiempo es una curva que tiene una pendiente muy acusada. Puesto que el número de células se duplica cada 20 minutos, el tiempo de duplicación es de 20 minutos y la tasa de crecimiento es 3,0 (60/20) duplicaciones por hora. Un cultivo que crece con esta tasa se incrementa, en

200 minutos, desde 1000 hasta más de 1 millón de células por mililitro.

 

8.2.3 Fases del crecimiento

Un cultivo microbiano pasa típicamente por cuatro fases de crecimiento, distintas y secuenciales: la fase de latencia o fase lag (lag, en inglés, significa "retraso"), la fase log (también llamada logarítmica oexponencial), la fase estacionaria y la fase de muerte (Figura 8.3). Cuando estudiamos el crecimiento exponencial, estamos estudiando la fase log, de manera que retomaremos el tema en este punto. No obstante, el ciclo comienza generalmente con la fase lag.

No todos los cultivos presentan todas las fases del crecimiento. Las fases lag y de muerte pueden existir o no. La fase log tiene lugar casi siempre cuando las células están en un ambiente favorable, pero no puede continuar indefinidamente. De acuerdo con el ejemplo del lirio acuático, la masa de un cultivo microbiano que continuara creciendo de forma exponencial superaría rápidamente el peso del planeta. Pero siempre sucede algo; se agota un nutriente esencial, se acumula un producto tóxico, o el pH se hace desfavorable. Por lo tanto, el cultivo deja de crecer y entra en la fase estacionaria de crecimiento.

Aunque no se produce un aumento neto de la masa del cultivo durante la fase estacionaria, la composición celular cambia cuando el cultivo pasa a esta fase. Las células se hacen más pequeñas y comienzan a sintetizar

componentes que les ayudan a sobrevivir, sin crecer, durante largos períodos de tiempo. Por ejemplo, cuando Escherichia coli entra en la fase estacionaria sintetiza alrededor de 30 proteínas, que no se encuentran en las células en la fase log, y modifica la composición de algunos de los ácidos grasos de sus membranas. Las cepas mutantes que no pueden producir estas proteínas de la fase estacionaria mueren rápidamente cuando dejan de crecer. Algunas especies bacterianas han desarrollado sofisticados mecanismos, como la formación de endosporas para sobrevivir a la fase estacionaria (Capítulo 4)

 

Figura 8.3 Fases de crecimiento de un cultivo bacteriano (esta gráfica se basa en el cultivo descrito en la Figura 8.2). La fase de muerte es una fase de declive exponencial, como la fase exponencial y, por tanto, es una línea

recta, aunque se produce a una tasa mucho más lenta.

 

Después de aproximadamente un día en fase estacionaria, comienza la fase de muerte, y las células del cultivo comienzan a morir. Durante esta fase, las células de la mayoría de las especies mueren exponencialmente, pero a una velocidad lenta - mucho menor que la tasa de incremento de las células durante la fase log. Generalmente, la muerte se produce porque las células han agotado sus reservas intracelulares de ATP y no pueden reparar los componentes celulares. Las células que no crecen no pueden generar nuevo ATP y, por tanto, se produce la muerte cuando no existe suficiente energía para continuar la reparación celular o para reiniciar el crecimiento, cuando existan nutrientes disponibles.

La fase lag es, asimismo, un período en el que no hay crecimiento. Generalmente, se produce cuando las células en fase estacionaria o en fase de muerte se inoculan en un medio de cultivo fresco. Aunque en la fase lag no se produce crecimiento neto, existe una actividad metabólica considerable, ya que las células se preparan para crecer. Esta preparación es necesaria porque los daños metabólicos sufridos durante las fases estacionaria o de muerte deben ser reparados completamente, antes de que las células puedan comenzar a crecer de nuevo. Si las células empleadas para inocular (sembrar) un nuevo cultivo están en la fase log, no existe fase lag, siempre que el nuevo medio de cultivo sea el mismo que el viejo y las demás condiciones permanezcan idénticas.

La duración de la fase lag depende de cuánto tiempo haya estado el cultivo previo en fase estacionaria o de muerte, o puede depender de un cambio en el medio. Si las células han estado en la fase estacionaría sólo brevemente, la posterior fase lag podrá durar sólo unos minutos. Pero si han permanecido en la fase estacionaría durante meses, la subsiguiente fase lag de las células sobrevivientes puede durar muchas horas. Si un cultivo exponencial se pasa de un medio pobre a uno rico, no existe fase lag. Pero el paso de un medio rico a uno pobre implica una fase lag de varias horas, en la mayoría de los cultivos bacterianos.

 

Figura 8.4 El quimiostato se utiliza para mantener una población microbiana en un estado de crecimiento constante. Una bomba peristáltica añade al cultivo el medio estéril desde un reservorio a una tasa constante. El

cultivo -que contiene las células y consume el medio parcialmente- sale con la misma tasa. Un quimiostato real tiene muchos controles electrónicos.

 

8.2.4 Cultivo continuo de los microorganismos

En el laboratorio, la mayoría de los microorganismos se cultivan en sistemas cerrados, lo que significa que no se suministran nutrientes ni se eliminan los productos tóxicos. Consecuentemente, los cultivos pasan, generalmente, por las cuatro etapas de crecimiento. Cuando se inocula un cultivo en fase estacionaria en un medio fresco que contiene las concentraciones adecuadas de todos los nutrientes esenciales, éste pasa secuencialmente por una fase lag, una fase log, una fase estacionaria y una fase de muerte. Sin embargo, los microorganismos no crecen de esta manera en la naturaleza. En la mayoría de las condiciones naturales, los nutrientes entran de manera continua y a bajas concentraciones en el ambiente de una célula, y las poblaciones crecen continuamente a una tasa baja, pero uniforme. La tasa de crecimiento está determinada por la concentración del nutriente limitante, o nutriente más escaso. En la naturaleza raramente la tasa de crecimiento viene fijada por la acumulación de los productos metabólicos, porque generalmente otros microorganismos pueden usarlos a medida que se van formando.

Es posible conseguir un cultivo continuo en el laboratorio en condiciones que imitan las de la naturaleza - manteniendo la concentración de un nutriente esencial lo suficientemente baja como para que limite la tasa de crecimiento. Dicho crecimiento limitado por la concentración se consigue generalmente con un aparato de cultivo continuo denominado quimiostato (Figura 8.4). Un quimiostato consta de una bomba peristáltica, un reservorio, un recipiente de cultivo, y un sistema de desagüe. La bomba añade una cantidad controlada de medio fresco desde el reservorio, de manera continua, al cultivo. Al mismo tiempo, una cantidad idéntica de cultivo sale continuamente a través del sistema de desague. En estas condiciones, el número de células en el vaso de cultivo no cambia. El cultivo crece lo suficientemente rápido como para reemplazar las células que se pierden a través del sistema de desagüe.

La concentración del nutriente limitante en el cultivo fija la tasa de crecimiento del mismo. El cultivo crece a la misma velocidad con que se suministra el nutriente limitante, que es, asimismo, la misma con que se consume parcialmente el medio de cultivo y salen las células mediante el sistema de desagüe. En el vaso de crecimiento del quimiostato, las células permanecen indefinidamente en fase exponencial de crecimiento.

El cultivo continuo tiene aplicaciones industriales importantes (Capítulo 29). Es una forma eficaz de producir células microbianas o sus productos (tales como antibióticos y vitaminas), porque constantemente se obtiene un cultivo denso que sale por el desagüe del vaso de crecimiento.

 

8.2.5 Crecimiento de una colonia

Cuando una población de células microbianas se desarrolla a partir de una única célula en una superficie sólida - por ejemplo, en un medio solidificado con agar en una placa de Petrí - forma una masa sólida de células denominada colonia. Los distintos microorganismos forman colonias con diferentes formas y texturas. Algunas colonias tienen un aspecto tan característico que los microbiólogos pueden identificar ciertos microorganismos observando las colonias que forman.

Las células de una colonia están en diferentes fases de crecimiento, dependiendo de su localización (a diferencia de las células de un cultivo liquido, que se encuentran todas en la misma fase de crecimiento). Las células en el centro de la colonia han dejado de crecer y se encuentran en la fase estacionaria o en la fase de muerte. Estas no tienen ya acceso a los nutrientes. Por el contrario, las células del borde de la colonia están en contacto con los nutrientes y continúan creciendo activamente en fase log. Ninguna célula de una colonia visible está en fase lag, porque una vez que las células del centro de una colonia han dejado de crecer, no pueden hacerlo de nuevo hasta que se transfieren a un medio fresco.

Asimismo, la localización de una célula en una colonia determina el acceso a los nutrientes de otra forma. Por ejemplo en una colonia que crece en contacto con el aire, las células de la superficie son aerobias. Las células incluidas en el centro de la colonia son totalmente anaerobias, porque las células de la superficie de una colonia que crece en aerobiosis captan todo el oxigeno del aire que difunde a través de la colonia.

 

8.3 ¿QUÉ NECESITAN LOS MICROORGANISMOS PARA CRECER?

Cada especie microbiana requiere para crecer unas condiciones particulares. Estos requerimientos son muy variados, porque los ambientes en los que las diferentes especies se han adaptado varian enormemente.

 

8.3.1 Nutrición

Todos los seres vivos utilizan compuestos químicos presentes en el medio ambiente para construir las moléculas necesarias para fabricar nuevas células. Estos compuestos químicos se denominan nutrientes.Sabemos que la nutrición afecta al crecimiento de todos los organismos. Un ser humano, un animal o una planta bien alimentados crecen mas rápidamente que otros mal alimentados. Para los microorganismos, particularmente las bacterias, el efecto de la nutrición en la tasa de crecimiento es enorme. Por ejemplo, Eschenchia coli puede llegar a crecer 10 veces más rápidamente en un ambiente rico en nutrientes, tal como el extracto de carne que en un ambiente nutritivo pobre, como por ejemplo uno compuesto por succinato y sales. El medio con succinato y sales cubre todas las necesidades esenciales de E. coli, pero el crecimiento en dicho medio requiere que la célula realice más procesos biosintéticos. El resultado es un crecimiento más lento.

Una tasa de crecimiento más elevada significa que un cultivo alcanza sus máximos número y masa totales de manera más rápida que en un ambiente pobre en nutrientes. Sin embargo, un cultivo puede alcanzar la misma densidad, al cabo de un tiempo suficiente, siempre que esté presente la misma cantidad total de nutrientes. El rendimiento, o máxima masa total, de un cultivo es directamente proporcional a la cantidad de nutrientes,

Los nutrientes que necesitan los microorganismos para crecer incluyen una fuente de carbono, de oxígeno, de nitrógeno, de fósforo, de azufre, de elementos traza y de factores de crecimiento orgánicos. Las células utilizan estos nutrientes para generar fuerza conductora o metabolitos precursores (Capítulo 5). También se requiere hidrógeno para el crecimiento, pero nunca es un factor limitante en cualquier medio que permita el crecimiento.

Carbono El carbono es la base estructural de los compuestos bioquímicos. Los microorganismos autotrofos obtienen su carbono a partir del dióxido de carbono (C02) de la atmósfera, mientras que los microorganismos heterotrofos obtienen el carbono a partir de los compuestos orgánicos del ambiente (Capítulo 5).

Los microorganismos heterotrofos utilizan como fuente de carbono muchas moléculas orgánicas diferentes. De hecho, probablemente cualquier compuesto orgánico que se encuentra en la naturaleza es utilizado como fuente de carbono por alguna especie bacteriana. Una de las fuentes más comúnmente utilizada por los microorganismos es la glucosa, una hexosa que juega un papel central en el metabolismo. Consecuentemente, la glucosa es un ingrediente común de los medios de cultivo microbiológicos. No obstante, frecuentemente se añaden a los medios como fuente de carbono otros azúcares, así como polisacáridos, ácidos orgánicos, alcoholes y aminoácidos.

Para los quimioheterotrofos, las moléculas orgánicas que contienen carbono, como la glucosa, proporcionan tanto una fuente de energía para generar ATP, como los átomos de carbono necesarios para fabricar los compuestos bioquímicos (Capítulo 5). Las fuentes de carbono que son metabolizadas rápidamente permiten un crecimiento relativamente rápido, mientras que las fuentes de carbono que son metabolizadas más lentamente permiten sólo un crecimiento lento. Por ejemplo, en un medio de cultivo al que se añade glucosa como fuente de carbono en lugar del aminoácido lisína, Escherichia coli crece el doble de rápido que en un cultivo idéntico excepto la adición mencionada.

Oxígeno Todos los microorganismos requieren oxígeno elemental para fabricar sus componentes bioquímicos, pero no todos los microorganismos requieren oxígeno atmosférico. La mayoría de los microorganismos heterotrofos obtienen el oxígeno a partir de la misma molécula que les sirve como fuente de carbono. La fórmula química de los hidratos de carbono (una fuente de carbono común para los heterótrofos) es CH2O, que significa que cada molécula de hidratos de carbono proporciona a la célula un átomo de oxígeno por cada átomo de carbono. Los autotrofos, que generan energía a partir de la luz, obtienen la mayor parte de su oxígeno a partir del CO2 fijado durante la fotosíntesis. La mayoría de los microorganismos aerobios tienen enzimas denominadas oxigenasas que pueden añadir directamente oxígeno atmosférico a las moléculas orgánicas, pero ésta es una fuente minoritaria de oxígeno. Algunas enzimas permiten a los microorganismos utilizar el oxigeno presente en el agua mediante reacciones hidrolíticas.

 

Redescubridores de microbios

 

Los supervivientes

¿Cómo pueden sobrevivir las bacterias no formadoras de endosporas cuando dejan de crecer? Unas pocas horas después de que Escherichia coli (y otras bacterias no formadoras de endosporas) entra en la fase estacionaria de crecimiento, comienza la fase de muerte. Aunque el declive de la fase exponencial puede ser muy lento, puede ocurrir la muerte de todas las células del cultivo. Según esto, ¿sería sólo una cuestion de tiempo la eliminación de todas las especies bacterianas? De hecho, esto no ocurre porque no todas las células mueren durante la fase de muerte. Incluso después de un año de almacenamiento, un cultivo de E. coli en fase estacionaría contiene más de un millón de células vivas por mililitro. Las células del cultivo mueren exponencialmente en cuatro o cinco días, pero las células que permanecen sobreviven durante largos períodos de tiempo. Roberto Kolter, un microbiólogo de la Universidad de Harvard, encontró que las bacterias no formadoras de endosporas han desarrollado sus propios mecanismos para sobrevivir períodos prolongados de escasez de nutrientes. La mayoría de las células mueren, pero unas pocas están programadas para sobrevivir, lo cual es suficiente para preservar la especie.

 

Además de utilizar el oxígeno como nutriente, los microorganismos que son capaces de una respiración acróbica usan el oxígeno para generar energía. Pero, para algunos organismos el oxigeno atmosférico es tóxico. Algunas enzimas son destruidas rapída e irreversiblemente por la exposición al oxígeno atmosférico. Un ejemplo extremo es la nítrogenasa, enzima que permite a las bacterias fijadoras de nitrógeno utilizar el nitrógeno atmosférico. Como resultado, los microorganismos han desarrollado varios mecanismos para proteger incluso las enzimas altamente sensibles al oxigeno y, por tanto, sobrevivir en presencia del oxígeno. Algunas cianobacterias fijadoras de nitrógeno - que son acróbicas y producen oxígeno gaseoso mediante fotosíntesis - protegen la nitrogenasa, segregándola en células especializadas, denominadas heterocistes. Los heterocistes no producen oxígeno y son impermeables al mismo. La bacteria fijadora de nitrogeno Azotobacter realiza una respiración aerobica a una tasa lo suficientemente evada como para mantener anaeróbico el centro de la célula, donde está localizada la nítrogenasa.

Además del oxígeno, los organismos deben hacer frente a los compuestos tóxicos que contienen oxigeno y que se producen durante el metabolismo acróbico. Entre estos agentes tóxicos se encuentran el peróxido de hidrógeno (H2O2) y los radicales libres, que son incluso más tóxicos: superóxido (O2) y el radical hidroxilo (·OH), que se forma a partir del superóxido. Un radical libre es un compuesto con un electrón sin aparear que lo hace extraordinariamente reactivo. Si se acumula superóxido, los compuestos bioquímicos se oxidan rápidamente y las células mueren.

Los seres vivos que sobreviven en presencia del aire han desarrollado sistemas para eliminar los radicales libres. Todos los aerobios producen la enzima superóxido dismutasa, que destruye el superóxido convirtiéndolo en oxígeno y peróxido de hidrógeno

El peróxido de hidrógeno, que es el producto de ésta y de otras reacciones catalizadas por enzimas, es en si mismo un oxidante tóxico. Se convierte en agua y oxígeno mediante la enzima catalasa.

El peróxido de hidrógeno también es eliminado por las peroxidasas, enzimas que lo utilizan para oxidar ciertos compuestos orgánicos. Los organismos que pueden tolerar la exposición al oxigeno contienen superóxido dismutasa, y casi todos también contienen catalasa. Los organismos que pueden tolerar la exposición al oxígeno contienen superóxido dismutasa, y casi todos también contienen catalsa. Los organismos que carecen de ambos enzimas mueren rápidamente en un ambiente con oxígeno.

La relación entre el oxígeno y el crecimiento varia enormemente de una especie microbiana a otra. Los aerobios obligados pueden crecer tan solo en presencia de oxígeno porque para generar energía requieren oxígeno como aceptor terminal de electrones. Los microaerófilos toleran menos oxígeno (o requieren eoncentraciones mayores de CO2). Éstos pueden crecer sólo a concentraciones reducidas de oxigeno (del 2 al 10 por ciento de oxígeno, en comparación con el 21 por ciento de oxígeno presente en el aire). Los anaerobios facultativos pueden crecer tanto en presencia como en ausencia de oxígeno, porque cuando éste está disponible, lo utilizan como aceptor terminal de electrones, pero cuando el oxigeno está ausente, utilizan otras rutas bioquímicas para generar energía. Los anaerobios aerotolerantespueden generar energía sin oxígeno pero no mueren al ser expuestos al aire. Los anaerobios obligados mueren en presencia del oxígeno, porque carecen de los enzimas necesarios para eliminar el superóxido(Tabla 8.1).

Nitrógeno El nitrógeno constítuye alrededor del 14 por ciento del peso seco de la mayoría de los microorganismos. Es un constituyente de las proteínas y de los ácidos nucleicos así como de algunos metabolitos esenciales, de manera que todos los seres vivos requieren una fuente de este elemento. La forma de nitrógeno que utilizan los microorganismos depende de su capacidad metabólica y del ambiente en que se encuentran. Probablemente, todos los microorganismos pueden usar amoníaco (NH3) como fuente de nitrógeno, porque esta forma es la que se incorpora en la biosíntesis. La mayoría de los microorganismos pueden obtener amoníaco a partir de una variedad de compuestos orgánicos, incluidos los aminoácidos, y algunos pueden utilizar formas inorgánicas, entre las que se incluye el ion nitrato (NO3). Algunos pueden lijar el nitrógeno atrnosférico gaseoso (N2); estos organismos lijadores de nitrógeno prosperan en los ambientes en los que el nitrógeno es el nutriente limitante.

Tabla 8.1. Relación de las bacterias con el oxígeno

Clase Microbiana Respuesta al oxígeno CatalasaSuperóxido dismutasa

Ejemplo

Aerobios estrictos Requieren oxígeno Presente Presente Pseudomonas aeruginosa

Anaerobios facultativos

Pueden crecer con o sin oxígeno Presente Presente Escherichia coli

Microaeráfilos Crecen mejor con baja tensión de oxígeno Presente Presente Campylobacter jejuni

Anaerobios aerotolerantes

Crecen sin oxígeno, pero no mueren en presencia del mismo

Ausente Presente Streptococcus pneumoniae

Anaerobios estrictos Mueren en presencia de oxígeno Ausente Ausente Methanococcus vannielii

 

Fósforo El fósforo se encuentra en las celulas exclusivamente en la forma de ion fosfato (Pol3-4) o de compuestos

orgánicos que contienen fosfato. Constituye alrededor del 3 por ciento del peso seco de los microorganismos. Es un constituyente de los ácidos nucleicos, de los fosfolípidos y de ciertos metabolitos esenciales. El fósforo entra en la célula en forma de ion fosfato, porque la mayoría de los compuestos orgánicos que contienen fosfato no pueden pasar a través de la membrana plasmática. Cuando los microorganismos utilizan como fuente de fósforo un compuesto orgánico que contiene fosfato, generalmente liberan el grupo fosfato fuera de la célula o en el periplasma, mediante enzimas que son producidas por la propia célula. Posteriormente, el ion fosfato penetra en la célula. El fosfato es el nutriente limitante en muchos lagos y arroyos, de manera que cuando se vierte fosfato de los detergentes en estos sistemas acuáticos, se produce eutroficación, o aumento en el desarrollo de algas y de otros microorganismos.

 

Tabla 8.2. Elementos traza en las células microbianasElemento Forma iónica principal Función

Potasio K+ Mantiene la presión de turgencia; cofactor de ciertas enzimasMagnesio Mg2+ Cofactor de muchas enzimasCalcio Ca2+ Cofactor de ciertas enzimasHierro Fe2+/Fe3+ En citocromosa y en ciertas enzimasManganeso

Mn2+ Cofactor de algunas enzimas

Molibdeno Mo2+ Presente en el coenzima de varias enzimasCobalto Co2+ Presente en la vitamina B12 y coenzimas relacionadasCobre Cu2+ Presente en varias enzimasZinc Zn2+ Presente en varias enzimas

 

 

 

Azufre El azufre es un constituyente minoritario pero esencial de la célula, constituyendo alrededor del 1 por ciento del peso seco de la mayoría de las células. Es un componente de dos aminoácidos, de algunas especies de RNA de transferencia y de ciertos metabolitos esenciales. Aunque el azufre entra en la biosíntesis como sulfuro (S2-), la fuente de azufre más corriente, tanto en los medios de laboratorio como en la naturaleza, es el ion sulfato (SO42-). El sulfato es abundante en el océano, pero relativamente escaso en algunos lagos y suelos. La fuente principal de azufre en muchos suelos son los compuestos que contienen sulfato orgánico, que los microorganismos del suelo captan y convierten en sulfuro.

 

Elementos traza Además de los elementos mayoritarios que necesitan para fabricar los compuestos bioquímicos, los microorganismos requieren cantidades pequeñas, aunque esenciales, de ciertos compuestos químicos inorgánicos, los elementos traza. Entre estos se incluyen el potasio y ciertos iones metálicos como son el cobre, el cobalto, el hierro y el zinc. Los elementos traza cubren una variedad de funciones esenciales en la célula (Tabla 8.2). Algunos elementos traza son Cofactores, iones inorganicos que deben estar presentes para que una enzima sea activa. Otros elementos traza forman parte de las coenzimas, moléculas orgánicas que deben estar presentes para que una enzima sea activa.

Aunque puede ocurrir, la disponibilidad de los elementos traza raramente limita el crecimiento microbiano, porque se requieren en cantidades muy pequeñas. Por ejemplo, aunque el hierro es abundante en la naturaleza, se encuentra predominantemente en la forma de hidróxido de hierro (férrico), altamente insoluble, no disponible para los microorganismos a menos que éstos liberen compuestos que solubilizan el hierro, denominados sideróforos. Los tejidos vivos son una fuente particularmente pobre de hierro disponible. Por tanto, la mayoria de las bacterias patógenas producen sideróforos.

 

Factores de crecimiento orgánicos Muchos microorganismos pueden sintetizar todos los bloques básicos (aminoácidos, nucleótidos, monosacáridos o disacáridos) necesarios para fabricar las macromoléculas a partir de las fuentes únicas de los elementos que se acaban de estudiar. Pero si un microorganismo no puede sintetizar un bloque básico particular, éste debe ser suministrado a partir del ambiente. Estos bloques básicos preformados se denominan factores de crecimiento orgánicos. Pueden ser cualquiera de los diversos bloques básicos estudiados

en el Capítulo 5: aminoácidos, purinas, pirimidinas, ácidos grasos, etc. Las vitaminas, que son nutrientes que se requieren en muy pequeñas cantidades, fundamentalmente como precursores de los cofactores de las enzimas, son factores de crecimiento orgánicos para algunos microorganismos.

La diversidad nutricional implica los diferentes requerimientos de factores de crecimiento orgánicos de los microorganismos. Existe una gama considerable. Por ejemplo, Escherichia coli no necesita factores de crecimiento orgánicos. Por el contrario, a Leuconostoc mesenteroides, una bacteria del ácido láctico que agría la leche, deben suministrársele los 20 aminoácidos esenciales, varias purinas y pirimídínas y 10 vitaminas (Tabla 8.3).

Si se encuentran en el medio ambiente los bloques básicos preformados, la mayoría de los microorganismos los utilizan para aumentar su crecimiento. Los mecanismos de regulación permiten a los microorganismos explotar un ambiente de crecimiento rico, en el cual abundan los bloques básicos preformados. De esta manera, el microorganismo utiliza su capacidad metabólica para sintetizar sólo aquellos bloques básicos que no se encuentran disponibles en el medio ambiente. Así, utilizan la capacidad metabólica que ahorran para crecer más rápidamente. Para ello, producen más ribosomas. Por ejemplo, cuando la bacteria Salmonella tiphimurium crece rápidamente en un ambiente rico, tiene más de 10 veces más ribosomas por célula que cuando crece lentamente en un medio pobre, porque debe sintetizar las proteínas más rápidamente para crecer a mayor velocidad. Esta relación entre un medio rico, la tasa de crecimiento y el número de ribosomas por célula se muestra en la Tabla 8.4. En un medio pobre, compuesto por ejemplo, por sales y lisina (una fuente de carbono que utiliza S. Typhimuriom muy lentamente), el tiempo de duplicación es largo y las células del medio contienen sólo el pequeño numero de ribosomas que necesitan para crecer lentamente. En medios más ricos, que contienen fuentes de carbono que pueden ser utilizadas más rápidamente (como la glucosa), o que son enriquecidos con bloques básicos tales como aminoácidos y materiales que se encuentran en el extracto de came, el tiempo de duplicacion disminuye y el número de ribosomas que contiene la célula aumenta, para acomodarse al crecimiento más rápido del cultivo.

 

8.3.2 El ambiente no nutritivo

Además de la nutrición, existen otros factores que influyen en el crecimiento de las poblaciones microbianas. Entre ellos se encuentran los factores físicos - temperatura y presión hidrostática - y los factores químicos - pH y presión osmótica.

 

Temperatura Cada especie microbiana crece en un rango de temperatura, desde la temperatura mínima de crecimiento, o temperatura más baja que permite el crecimiento, hasta la temperatura máxima de crecimiento, o temperatura más elevada que permite el crecimiento. La mayoría de las bacterias crecen en un intervalo de temperatura de aproximadamente 40 grados Celsius. La mayoría de los microorganismos eucariotas tienen un intervalo más estrecho. La temperatura óptima de una especie es aquella a la cual crece el microorganismo más rápidamente. Generalmente, la temperatura óptima es tan sólo unos grados inferior a la temperatura máxima de crecimiento. La tasa de crecimiento aumenta desde la temperatura mínima a la temperatura óptima, ya que las reacciones químicas, incluidas las reacciones catalizadas por las enzimas, se realizan mas rapidamente cuando aumenta la temperatura (Figura 8.5). Sin embargo, por encima de la temperatura óptima, la tasa de crecimiento disminuye rápidamente, porque algunos componentes celulares, especialmente las proteínas, se inactivan más rápidamente de lo que pueden ser reemplazados.

Los microorganismos crecen a temperaturas extremas, temperaturas en las que la mayoría de los demas seres vivos no pueden crecer. En general, los microorganismos procariotas toleran temperaturas más extremas que los eucariotas. Ningún eucariota puede crecer en el punto de ebullición del agua, aunque algunos hongos pueden crecer a temperaturas inferiores al punto de congelación - tan bajas como las que pueden tolerar algunas especies bacterianas - y algunas algas crecen cerca del punto de congelación del agua. EI crecimiento de algunas algas rojas, denominadas algas de la nieve, origina enormes manchas rojas en las zonas montañosas nevadas, en las cuales persiste la nieve durante largos períodos de tiempo y la luz es muy intensa.

Según el intervalo de temperatura en el cual pueden crecer los microorganismos se dividen en tres categorías diferentes. Los termófilos (amantes del calor) crecen a altas temperaturas. Los mesófilos (amantes de una temperatura moderada) crecen a temperaturas intermedias, y los psicrófilos (amantes del frío) crecen a bajas temperaturas. Aunque los psicrófilos son capaces de crecer a bajas temperaturas, estos microorganismos, al igual que los otros, crecen más rápidamente cerca de la temperatura máxima de crecimiento.

Las bacterias termófilas crecen a temperaturas superiores a 50 0C - una temperatura a la cual el agua causa dolor, si se sumerge la mano en ella. El termófilo extremo Pyrodictium occultum puede crecer a 110 0C, diez grados Celsius por encima del punto de ebullición del agua pura al nivel del mar. P. occultum se encuentra en fuentes termales.

 

Tabla 8.3. Comparación de los ingredientes de los medios que se requieren para permitir el crecimiento de una bacteria del ácido láctico, Escherichia coli y una cianobacteria

Fuente del nutriente

Bacteria del ácido láctico

(Leuconostoc mesenteroides) Escherichia coli

Cianobacteria

(Gleobacter Violaceus)Carbono Glucosa 50 ga Glucosa 2 g Ninguno

Acetato sódico 40 gFuente nitrogenada NH4Cl 6 g NH4Cl 2 g NingunoSales inorgánicas KH2PO4 1,2 g Na2HPO4 6 g K2HPO4·H2O 40 mg

K2HPO4 1,2 g KH2PO4 3 g MgSO·7H2O 75 mgMgSO4·7H2O 0,4 g NaCl 3 g CaCl2·H2O 36 mgFeSO4 20mg Na2SO4 11 g Citrato férrico amónico 6 mgMnSO4 40mg MgCl2·6H2O 0,4 mg Na2CO3 20 mgNaCl 20mg CaCl2 11 mg Solución de metales trazab 1 ml

FeCI·6H2O 0,8 mgFactores de crecimiento Alanina 400 mg(aminoácidos) Arginina HCl 484 mg Ninguno Ninguno

Asparragina 800 mgAspartato 200 mgCistina 100 mgFenilalanina 200 mgGlicina 200 mgGlutamato 600 mgHistidina HCl 124 mgIsoleucina 500 mgLeucina 500 mgLisina 500 mgMetionina 500 mgProlina 200 mgSerina 100 mgTirosina 200 mgTreonina 400 mgTriptófano 80 mgvalina 50 mg

Factores de crecimiento Adenina·S04 20 mg Ninguno Ninguno(bases) Guanina HCl 20 mg

Uracilo 20 mgXantina 20 mg

Factores de crecimiento Tiamina·HCI 1 mg Ninguno Ninguno(vitaminas) Piridoxina·HCI 2 mg

Piridoxamina·HCI 0,6 mgPiridoxal·HCI 0,6 mgPantotenato 1,0 mgRiboflarina 1,0 mgNicotinato 2,0 mgp-Aminobenzoato 0,2 mgBiotina 2,0 µgFolato 20 µg

 

 

Tabla 8.4. Tasa de crecimiento de la bacteria Salmonella typhimurium en diferentes medios.

Medio Composición

Tiempo de duplicación

(minutos)Número de ribosomas por célula

Mínimo con lisina El aminoácido lisina + sales 97 7000Mínimo con glucosa Glucosa + sales 50 1700020 aminoácidos 20 aminoácidos + sales 32 42000Cerebro-corazón Extracto de cerebro y corazón de

vaca21 83000

 

El selenio: ¿Banquete o veneno?

El selenio es un elemento que se parece mucho al azufre. Cuando el selenio se encuentra a elevadas concentraciones, algunas enzimas que catalizan normalmente las reacciones de compuestos azufrados lo usan en su lugar. El resultado puede ser desastroso. El selenio se incorpora en las macromoléculas del organismo, las cuales no funcionan normalmente. El organismo podría morir, o podría convertirse en una nueva criatura. Muchos de estos organismos pueden verse en un lago cerca de Kesterton, en California (EE.UU.), que recibe el agua de

riego de suelos que contienen más selenio de lo normal. Algunos animales del lago están mutilados, y algunos pájaros tienen el pico torcido y las alas deformadas.

El selenio es un material tóxico peligroso, pero algunas bacterias del lago generan ATP oxidando el selenio, de manera parecida a como algunas bacterias obtienen su energía oxidando el azufre (Capítulo 5). Y otras bacterias, incluida Escherichia coli, incorporan el selenio en determinadas proteínas en forma de selenocisteina. La selenocisteina es un aminoácido idéntico a la cisteina, pero con un átomo de selenio en lugar del átomo de azufre de la cisteina ordinaria. E. Coli contiene un monómero de selenocisteina en una enzima, la fórmico deshidrogenasa, que participa en el metabolismo central. Si el átomo de selenio es reemplazado por un átomo de azufre, la enzima se vuelve prácticamente inactiva. Si el selenio reemplazara el azufre de otras cisteinas de esta enzima o de cualquier otra enzima, presumiblemente también se harían inactivas.

¿Cómo puede el selenio reemplazar al azufre de esta cisteina y sólo de ella? El fenómeno se produce de una manera muy poco usual. La selenocisteina se produce a partir de un tipo especial de tRNA que sirve sólo para este propósito, y su incorporación en la proteína está codificada por un codón sin sentido (UGA). ¿Por qué sólo éste codón sin sentido señala la incorporación de selenocisteina? Presumiblemente, de alguna manera la estructura del mRNA que rodea a este codón es única. Pero, sin duda, el selenio, que puede ser tóxico, también puede ser esencial.

 

Figura 8.5 Tasa de crecimiento de Escherichia coli en un medio rico a varias temperaturas. E. coli crece desde los 8oC hasta los 48oC. La tasa de crecimiento aumenta rápidamente a partir de 8oC. A 37oC, la temperatura úptima de crecimiento de E. coli, la tasa de crecimiento es de 2,8 duplicaciones por hora, y el tiempo de duplicación de unos 21,4 minutos. A temperaturas más elevadas, la tasa de crecimiento disminuye, y el crecimiento se detiene a 43oC,

su temperatura máxima de crecimiento.

Las bacterias mesólilas crecen mejor alrededor de 37 oC, la temperatura del cuerpo humano. Escherichia coli, que crece de manera natural en el intestino de los seres humanos y de otros animales, es un mesófilo, al igual que la mayoría de las bacterias que causan enfermedades.

Las bacterias psicrófilas crecen a una tasa significativa a 5 oC, o por debajo de esta temperatura - a la cual funciona normalmente un frigorífico. Cuando la leche se estropea en un frigorífico, frecuentemente tiene el olor afrutado de Pseudomonas spp. o el olor fétido de Achromobacter spp., porque estas bacterias son psicrófilas. Por el contrario, la leche que se vuehe agria a temperatura ambiente tiene un aroma más agradable, debido al agriado, semejante al yogurt o mantequilla, porque a esta temperatura predominan las bacterias del ácido láctico que son mesófilas.

Los psicrófilos se subdividen en dos grupos: estrictos y facultativos. Los termófilos se subdividen en estenotermófilos, termófilos facultativos y termófilos extremos (Tabla 8.5). Los psicrófílos facultativos también se llaman psicrotrofos ("que crecen en el frío"), para indicar que pueden tolerar, más que beneficiarse, de las bajas temperaturas.

¿Qué determina la temperatura máxima o mínima a la cual es capaz de crecer un organismo? Sin duda, la temperatura máxima de crecimiento está determinada por la estabilidad al calor de las proteínas de un organismo. Generalmente, las proteínas son las macromoléculas de una célula más sensibles al calor y no puede darse crecimiento a temperaturas a las que se desnaturalizan las proteínas de una célula (Capítulo 2). Los termófilos crecen a temperaturas elevadas porque sus proteínas son excepcionalmente estables al calor; los psicrófilos pueden crecer sólo a bajas temperaturas porque algunas de sus proteínas son inusualmente sensibles al calor. La estabilidad al calor refleja la estructura proteica total. Esto es, una mutación que cambie cualquier aminoácido de una proteína estable al calor con toda probabilidad disminuirá su estabilidad al calor.

Tabla 8.5. Respuesta de crecimiento a distintas temperaturas entre los diversos grupos de bacteriasClase Propiedades Ambiente típico

Psicrófilos (también llamados psicrotrofos) Crecen de forma apreciable por debajo de 5 oCPsicrófilos estrictos No crecen a o por encima de 20 oC Agua de mar fríaPsicrófilos facultativos Pueden crecer por encima de 20 oC Suelo y aguaMesófilos Crecen mejor a temperaturas moderadas, de unos 37 oC Animales

Termófilos Crecen por encima de 50 0CTermófilos facultativos Pueden crecer por debajo de 37 0C SueloEstenotermófilos No pueden crecer por debajo de 37 0C AbonoTermólilos extremos Crecen por encima de 80 0C (algunos por encima de 100 0C) Fuentes termales

 

Las causas de la temperatura mínima de crecimiento son más complejas, pero la mayoría tienen la misma base. Las interaciones hidrofóbicas de las proteínas se hacen más débiles cuando disminuye la temperatura, y la forma de las proteínas cambia ligeramente. La función de algunas proteínas, incluidas las que regulan el metabolismo, es particularmente sensible a dichos cambios, y por lo tanto, a bajas temperaturas, los mecanismos de regulación metabólica se distorsionan y se detiene el crecimiento. Los mecanismos de regulación de algunos termófilos comienzan a degradarse a temperaturas elevadas, del orden de 37 0C Para estos organismos, como algunas bacterias del suelo tales como Bacillus stearothermophilus, la temperatura del cuerpo humano es demasíado fría para su crecimiento. Sorprendentemente, estas bacterias se encuentran en suelos normales de climas templados, lo cual indica lo caliente que puede estar la superlicie del suelo durante un día soleado.

 

Presión hidrostática La presión hidrostática es la presión que se aplica a un líquido. Generalmente, la presión hidrostática se mide en atmósferas. Una atmósfera equivale a 1,0l3 Newton por metro cuadrado, la presión a la que estamos expuestos en la superficie de la Tierra. Las bacterias ordinarias, tal como Escherichia coli, crecen a presiones muy elevadas, del orden de 300 atmósferas. Las bacterias que se encuentran en el fondo del océano toleran hasta 1 500 atmósferas, suficientes para aplastar cualquier cosa excepto los recipientes de acero más resistentes. En cambio, la mayoría de levaduras no pueden crecer a presiones superiores a 8 atmósferas, una presión muy baja. Algunas bacterias, las barófilas (amantes de la presión), crecen más rápidamente a presiones superiores a 1 atmósfera y las barófilas obligadas crecen sólo a presiones superiores a 1 atmósfera.

Una presión elevada no destruye una célula microbiana como ocurriría con un ser humano, porque el agua pasa rápidamente a través de la membrana celular. De esta manera, se iguala la presión dentro y fuera de la célula. Una elevada presión puede detener el crecimiento microbiano, pero el efecto es bioquímico. El volumen molecular cambia durante el curso de la mayoría de las reacciones químicas. La presión elevada inhibe cualquier reacción química que conlleve un incremento en el volumen molecular y favorece cualquier reacción química que implique una disminución del volumen molecular. Algunas reacciones bioquímicas incrementan el volumen molecular y se hacen más lentas o prácticamente se paralizan al incrementar la presión. Sin embargo, las reacciones bioquímicas esenciales de los barófilos disminuyen el volumen molecular y se realizan más rápidamente cuando se incrementa la presión.

 

pH La escala de pH mide la concentración de iones de hidrógeno e hidroxilo de una solución e índica si el ambiente es ácido, por debajo de pH 7; alcalino, por encima de pH 7; o neutro, próxima al pH 7 (Capítulo 2). En general, las bacterias crecen mejor a un pH ligeramente alcalino (básico). Los hongos crecen mejor a un pH ligeramente ácido, y los protozoos y las algas a un pH neutro. sin embargo, existen excepciones, especialmente entre las bacterias. Los acidófilos (amantes del ácido), viven en ambientes con un pH extremadamente bajo. Por ejemplo, algunos acidólilos crecen en la lixiviación ácida de los desechos de las minas, en las cuales los valores de pH son muy bajos, del orden de pH 1,0 - la acidez del ácido sulfúrico. Los alcalófilos (amantes de las bases) viven en ambientes con un pH extremadamente alto. Por ejemplo, algunos alcalólilos crecen en los lagos alcalinos, frecuentes en los desiertos del oeste de Norteamérica. En éstos, los valores de pH son muy elevados, de alrededor de 12,0 - la alcalinidad de las cremas o líquidos depiladores.

La mayoría de las bacterias sobreviven en ambientes con un intervalo de pH relativamente amplio, ajustando su pH intracelular. Mediante diferentes mecanismos, bombean iones de hidrógeno fuera o dentro de la célula. Por ejemplo, Escherichia coli puede crecer en ambientes con un intervalo de pH entre 5,0 y 8,0. Pero, independientmente del pH externo, el pH interno se mantiene en un valor muy cercano a 7,6 - el valor óptimo para su metabolismo. E. coli, al igual que la mayoría de las demás bacterias, pueden realizar reacciones metabólicas vitales sólo dentro de un intervalo de pH limitado, porque muchas de sus enzimas funcionan adecuadamente sólo en un intervalo estrecho de pH (Capítulo 2).

 

Presión osmótica Todos los microorganismos necesitan agua líquida para crecer. Por esta razón, no pueden crecer a temperaturas inferiores al punto de congelación de su medio o por encima del punto de ebullición. Una presión osmótica elevada también priva a una célula del agua. Las membranas celulares son muy permeables al agua, de manera que el agua entra o sale de una célula dependiendo de la presión osmótica relativa, o concentración de solutos disueltos en la célula y en su medio ambiente. Las bacterias mantienen una presión de turgencia positiva, porque la presión osmótica de su contenido celular es mayor que la presión osmótica del medio ambiente (Capítulo 4). La presión de turgencia suministra la fuerza a la célula para crecer. En los microorganismos eucariotas, en lugar de la presión de turgencia, es el citoesqueleto el que proporciona la fuerza para agrandar la célula.

Si aumenta la concentración de los solutos en el ambiente externo, la bacteria debe mantener positiva la presión de turgencia. Para hacer esto, bombea hacia la célula iones potasio (K+) y/o compuestos osmoprotectores, tales como el aminoácido prolina, o sintetiza el disacárido trehalosa. Estos solutos mantienen dentro de la célula una presión osmótica superior a la presion osmótica del exterior. Sin embargo, eventualmente, este incremento en la presión osmótica interna daña enzimas esenciales e interfiere en el metabolismo de la célula. De esta manera los ambientes con una elevada presión osmótica inhiben el crecimiento bacteriano. Una manera tradicional de conservar los alimentos es añadir azúcar o sal, que incrementan la presión osmótica y, por lo tanto, impiden el crecimiento microbiano.

Aunque una elevada presión osmótica evita el crecimiento de la mayoría de las bacterias, algunas especies, denominadas halófilas (amantes de la sal), pueden vivir a concentraciones de sal extremadamente elevadas. Las arqueobacterias denominadas halobacterias se desarrollan en aguas saturadas de sal. Las salinas, sistemas con agua de mar que se deja evaporar para producir la sal de mesa, y algunos lagos desérticos tienen un color rojo intenso debido a su presencia. Estas bacterias no sólo toleran elevadas concentraciones intracelulares de sal, sino que también dependen de la misma para la estabilidad de sus cubiertas celulares; cuando se colocan en agua destilada, o en agua ordinaria, se lisan inmediatamente.

Cuando un incremento en la presión osmótica externa hace que salga agua de la célula, se produce la plasmolisis, encogiéndose el citoplasma (Capitulo 4). Las consecuencias de la plasmolisis difieren según el tipo de célula. En las bacterias, la membrana plasmática se separa de la pared celular rígida, pero generalmente, la célula puede recuperarse de la plasmolisis (a menos que la presión osmótica sea extrema) incrementando su presión osmótica interna (Figura 8.6). Los microorganismos eucarióticos, particularmente los protozoos, son más sensibles a la plasmolisis, porque carecen de una pared rígida.

 

LUCHANDO CONTRA EL FRIO

Puesto que los microorganismos crecen en un amplio intervalo de temperaturas, se enfrentan a desafios ambientales impensables para los seres humanos, de sangre caliente. Uno de los mayores retos es mantener una fluidez de la membrana adecuada. Las membranas están compuestas por fosfolípidos; por lo tanto, como la mayoría de los lipidos, solidifican con el frio y se hacen líquidos con el calor. Para funcionar adecuadamente, las membranas deben mantener el grado de fluidez adecuado en un intervalo de temperatura. ¿Cómo lo hacen? De la siguiente manera: la composición en ácidos grasos de los fosfolípidos de sus membranas cambia con la temperatura ambiental.

El efecto de la composidón de ácidos grasos en la fluidez de los lípidos es enorme. En el refrigerador, el aceite de oliva solídifica, pero el de maíz se mantiene fluido. Esto sucede porque el aceite de maíz, es rico en ácidos grasos insaturados (contienen dobles enlaces), y el aceite de oliva tiene ácidos grasos más saturados (no contienen dobles enlaces). A la temperatura ambiente, el aceite de maíz es más fluido que el aceite de oliva. Pero al mezclar el aceite de maíz y el de olíva en las proporciones adecuadas, se puede obtener un nivel de fluidez intermedio a temperatura ambiente, en el refrigerador o a cualquier temperatura intermedia.

Este mismo proceso ocurre en los microorganismos. Cuando disminuye la temperatura de crecimiento, una alta proporción de los ácidos grasos de los fosfolípidos de las membranas son insaturados, y así su fluidez es óptima a cualquier temperatura de crecimiento. En Escherichia coli este preciso ajuste se hace de una manera muy sencilla. Los ácidos grasos se sintetizan mediante una ruta metabólica ramificada. Una rama lleva a ácidos grasos saturados y la otra a ácidos grasos insaturados. Una enzima cerca del punto de ramificación, en la parte insaturada, es sensible a las elevadas temperaturas. Cuando aumenta la temperatura, su actividad disminuye, y se fabrican más ácidos grasos mediante la rama "saturada". Cuando disminuye la temperatura, ocurre lo contrario. El resultado es una fluidez constante a todas las temperaturas.

 

 

8.4 MEDIDA DEL NÚMERO DE MICROORGANISMOS

La medida del crecimiento y muerte de los microorganismos en el laboratorio requiere técnicas especiales. Algunas técnicas son medidas indirectas. Estas miden una propiedad - la turbidez, el peso seco, o una actividad metabólica - de la masa de células de una población. Otras técnicas son directas. Las medidas directas incluyen los recuentos directos al microscopio o recuento electrónico, el recuento en placa, o el cálculo del número más probable (NMP). (A veces la filtración es una etapa preliminar en las medidas directas.)

El recuento directo al microscopio o el recuento electrónico proporcionan un recuento de todas las células, tanto las vivas como las muertas. Un recuento de viables mide sólo las células vivas de una población, es decir, aquellas capaces de reproducirse (viable significa "que puede vivir"). Los recuentos en placa y el NMP son recuentos de viables. Cuando se usa la filtración, se obtiene un recuento de viables. Cada una de estas técnicas tienen sus ventajas y sus inconvenientes.

 

8.4.1 Turbidez

Debido a que todas las células de un cultivo axénico son aproximadamente del mismo tamaño, su numero es proporcional a su peso. En otras palabras, dos células pesan el doble que una célula, cuatro células pesan el doble que dos, y así sucesivamente. De esta manera, podemos estimar el tamaño de una población microbiana a partir de su peso total. Generalmente, los microbiólogos no recogen de manera laboriosa las células y las pesan. En su lugar, utilizan un instrumento óptico denominado espectrofotómetro (Figura 8.7). Un espectrofotómetro mide la cantidad de luz que transmite una solución o un cultivo líquido de células microbianas. Cuanto mayor masa de células tenga un cultivo, mayor será su turbídez, se transmitirá menos luz y la lectura en el espectofotómetro será mayor. Puesto que un espectrofotómetro mide con exactitud lo que vemos cuando examinamos visualmente un cultivo liquido, no es muy sensible con respecto al número de células bacterianas. Para que el líquido se vea turbio, el cultivo liquido debe contener alrededor de 10 millones de células bacterianas de un tamaño intermedio por mililitro y, por lo tanto, un espectrofotómetro no es útil para detectar una pequeña contaminación,es decir, la presencia de un pequeño número de células microbianas no deseadas. Al igual que para la mayoría de los cultivos bacterianos, el espectrofotómetro también puede emplearse para cultivos de levaduras.

 

Figura 8.6 La plasmólisis de una célula bacteriana separa la membrana plasmática de la pared celular, excepto en las uniones Bayer, lugares en los que la membrana plasmática se une a la membrana externa mediante la pared

celular (Capítulo 4). Esta micrografía electrónica de transmisión muestra la plasmolisis de Escherichia coli.

 

Generalmente, el espectrofotómetro se utiliza para estimar masa de un cultivo relativamente denso, y poder así registrar crecimiento de una población microbiana (Figura 8.7). Para medir la masa o el número de células con un espectrofotómetro, necesano, en primer lugar, preparar una curva patrón, o gráfica en la que se relacionan las medidas del espectrofotómetro con la masa celular de un determinado cultivo. Generalmente los distintos tipos de bacterias producen una turbidez diferent Posteriormente, se puede determinar a partir de la gráfica la masa celular que se corresponde con cualquier lectura en el espectrofotómetro. Las curvas patrón también pueden obtenerse para relacionar las lecturas en el espectrofotómetro con el número células de un cultivo.

 

¿POR QUÉ EL CHAMPÁN SE ENVASA EN UNA BOTELLA TAN PESADA?

La mayoría de los microorganismos pueden soportar elevadas presiones hudrostáticas. Pero las levaduras son una excepción sorprendente. Éstas dejan de crecer y de fermentar a tan sólo 8 atmósferas de presión. Aunque no se sabe por qué la levadura es tan sensible a la presión, este hecho constituye una ventaja para la obtención del vino. Los productores de vino alemanes explotan la sensibilidad a la presión de las levaduras para disminuir la tasa de la fermentación por levaduras que convierten el zumo de uva en vino. Así se previene la formación de calor y el daño que se puede causar al sabor del vino. Realizan la fermentación en tanques de acero cerrados y dejan que aumente la presión debido a la producción de dióxido de carbono, hasta que se modera la tasa de fermentacion.

La sensibilidad de las levaduras a la presión es incluso más critica en la obtención del champán. Las burbujas de dióxido de carbono del champán se forman en una fermentación secundaria que se realiza generalmente en la botella. Para asegurarse de que se producirá una determinada cantidad de dióxido de carbono, se añade una cantidad calculada de azúcar. No existe prácticamente riesgo de que se produzca demasiado dióxido de carbono y explote la botella. La fermentación se detiene cuando la presión en la botella alcanza las 8 atmósferas, una presión que la pesada botella de champán puede soportar perfectamente.

  

Como cualquier otro instrumento, el espectrofotómetro tiene ventajas y desventajas. Sus medidas son rápidas y reproducibles. Sin embargo, sólo puede utilizarse para cultivos relativamente densos, y no puede distinguir entre células muertas y vivas. Tampoco puede utilizarse con células que tiendan a formar agregados, porque dejan de suspenderse rápidamente y desaparece la turbidez.

 

Figura 8.7 El espectrofotómetro. (a) El espectrofotómetro mide la turbidez, es decir, la cantidad de luz que transmite un cultivo, expresada en unidades de absorbancia. La célula bacteriana dispersa la luz, de manera que no

es detectada por el detector sensible a la luz. (b) El tubo de la izquierda no tiene células bacterianas y está transparente. El de la derecba contiene alrededor de mil millones (109) de células por mililitro y, por lo tanto, está

turbio. (c) La curva patrón relaciona la absorbancia con el número de células bacterianas por mililitro. Una vez que se obtiene, esta curva puede usarse para convertir cualquier medida de absorbancia en número de células. Por

ejemplo, a partir de esta curva, una lectura de 1,6 unidades de absorbancia significa que el cultivo contiene 100 millones (108) de células por mililitro.

8.4.2 Peso seco

El número de células de un cultivo se puede medir dividiendo el peso seco del cultivo por el peso seco de una célula individual. El peso seco de las células de un cultivo se determina separándolas del medio, desecándolas y pesándolas. Para obtener una medida precisa, se requieren alrededor de 25 ml de un cultivo relativamente denso. Las células se separan mediante filtración (Capítulo 3) o mediantecentrifugación. Una centrífuga es un instrumento que hace girar unos recipientes denominados tubos de centrífuga a una velocidad elevada, generando una fuerza centrífuga que hace que las partículas pequeñas, incluidas las células microbianas, se vavan al fondo del tubo. Luego, se lavan las células, se resuspenden en agua destilada y se filtran o centrifugan de nuevo. Después del segundo lavado, las células se desecan en un horno a 1050C durante unas 24 horas y luego se enfrían en un desecador, para evitar que capten la humedad del aire. Un desecador es una cámara que se mantiene con una humedad muy baja, bien químicamente o mecanicamente, y que se utiliza para desecar los materiales o para mantenerlos desecados. Finalmente, se pesan las células.

La medida del peso seco es tediosa y requiere un cierto tiempo; además, la muestra debe contener más de unos 10 millones de células, No obstante, tiene ciertas aplicaciones. Por ejemplo, debe utilizarse para construir la curva patrón que relaciona las medidas en el espectrofotómetro con las de la masa celular.

 

8.4.3 Actividad metabólica

La actividad metabólica puede utilizarse, mediante varios procedimientos, para medir indirectamente la cantidad de células microbianas. La tasa de formación de productos metabólicos, tales como gases o ácidos, que produce un cultivo, refleja la masa de células presente en el mismo, Asimismo, la tasa de utilización de un substrato, como el oxígeno o la glucosa, refleja la masa celular.

Finalmente, la tasa de reducción de determinados colorantes, es otra forma de estimar la masa microbiana. Por ejemplo, el azul de metileno se vuelve incoloro cuando es reducido por los componentes de la cadena de transporte de electrones de los microorganismos. Consecuentemente, en ausencia de oxígeno, que oxida el azul de metileno, la tasa de decoloración de este compuesto mide la masa microbiana. La tasa de reducción del colorante es una medida muy indirecta y, por lo tanto, no es una medida precisa de la masa microbiana. Sin embargo, la técnica puede utilizarse con materiales complejos, como el suelo o la leche, sin necesidad de usar instrumentos.

 

8.4.4 Recuento directo

Un recuento directo es un recuento de las células individuales de una población microbiana. El recuento directo puede hacerse visualmente, utilizando un microscopio y un porta especial denominadocámara de recuento. Existen muchos tipos de cámaras de recuento, pero la cámara de Petroff-Hauser, llamada así en honor de los que la desarrollaron, tal vez sea la más utilizada en los laboratorios de microbiología (Figura 8.8). Todas las cámaras de recuento poseen una profundidad conocida y tienen marcados unos cuadrados de dimensiones también conocidas. De esta manera, cada cuadrado que observamos al microscopio representa un volumen determinado de líquido; por ejemplo, un microlitro (0,001 µl). Se puede calcular cuántas células están presentes en 1 ml o en cualquier otro volumen del cultivo, contando las células de varios cuadrados y haciendo la media. Puesto que las células vivas y las muertas tienen un aspecto parecido observadas al microscopio, el recuento directo es un recuento total de células.

El recuento directo también puede hacerse electrónicamente, con un instrumento denominado contador Coulter. El recuento electrónico es posible porque las células microbianas no conducen la electricidad tan bien como el medio en el que están suspendidas. Se coloca en una cámara del contador un volumen determinado del cultivo y se hace pasar a través de un pequeño poro (de unos 15 µm de diámetro) a otra cámara, mediante una bomba de vacío. El poro forma parte de un circuito eléctrico, de manera que cada vez que pasa una célula a través del mismo, la conductividad del circuito disminuye y la presencia de la célula es detectada electrónicamente en el contador.

Los dos métodos principales de recuento directo - microscópico y recuento electrónico - dan resultados semejantes, pero se usan en situaciones muy diferentes. El recuento microscópico no requiere de un equipo caro, tan sólo se necesita una cámara de recuento, no muy cara, además del microscopio óptico que existe en cualquier laboratorio de microbiología. Pero es un proceso tedioso y lento. Por el contrario, el recuento electrónico requiere un equipo caro, pero es muy rápido y preciso, si las células son las únicas partículas presentes (el recuento electrónico también se usa en los laboratorios clínicos para contar las células sanguíneas). El recuento microscópico es necesario si la muestra contiene partículas extrañas, como células sanguíneas o fragmentos de suelo. Una persona que realiza un recuento microscópico puede discriminar entre las células microbianas y las partículas extrañas, pero si tienen aproximadamente el mismo tamaño, el contador electrónico las contará como células.

 

Figura 8.8 Recuento microscópico directo. La cámara de recuento de Petroff-Hauser se usa, junto a un microscopio, para realizar un recuento directo de células. Consta de un porta que tiene unos pocillos superíiciales (de 0,02 mm de profundidad). En el fondo del porta hay grabada una rejilla de 1 mm2, dividida en 25 cuadrados

grandes, cada uno de los cuales está dividido en 16 cuadrados más pequeños. De esta manera, el volumen total de la rejilla es de 0,02 (un quinceavo) mm3, y cada cuadrado grande es un veinticincoavo de esta cantidad.

 

8.4.5 Recuento en placa

Para realizar un recuento en placa se utilizan los métodos de extensión o de vertido en placa, empleados para cultivar los microorganismos, que se describieron en el Capítulo 3. La técnica consiste en diluir de manera seriada, generalmente diez veces por cada dilución, una muestra del cultivo y luego sembrar una pequeña cantidad de cada dilución en una placa o bien mezclarla con el medio a sobrefusión. A continuación, la placa debe ser incubada en las condiciones adecuadas. Una vez que se han formado colonias visibles, generalmente después de un día, se seleccionan para el recuento de colonias las placas en las que éstas están bien separadas. Las placas que tienen entre 30 y 300 colonias ofrecen una buena relación entre la rapidez del recuento y la precisión en el resultado obtenido. El número de colonias de una placa, junto con la dilución de la muestra que se inoculó en ella, nos permite calcular la concentración de células presente en la muestra original (Figura 8.9). El recuento en placa es un recuento de viables, Se basa en el principio de que una única célula viable originará una colonia visible, cuando se siembre en una placa de agar.

La ventaja del método de recuento en placa es su gran sensibilidad. Si se utiliza un medio y unas condiciones de incubación adecuadas, puede detectarse incluso una única célula viva. Ademas, el recuento en placa no requiere un equipo complicado. Un inconveniente es que el recuento en placa es lento y tedioso y no es muy preciso, porque la precisión depende del recuento de un número elevado de colonias. La precisión aumenta con el número de colonias que se recuentan, ya que disminuye el error debido al muestreo.

 

Figura 8.9 Un recuento en placa es una medida directa y proporciona un recuento de viables. En primer lugar, la muestra se diluye seriadamente, transfiriendo 1 ml de la muestra a 9 ml de medio estéril y se mezclan adecuadamente. Este proceso se repite basta obtener una dilución apropiada en este ejemplo, 1:100000 (10 -5). Posteriormente se añade 0,1 ml a una placa de agar nutritivo, bien extendiéndolo en la superficie de la misma (método de extensión en placa) o mezclándolo con el medio (método de vertido en placa). Las placas se incuban y se recuentan las colonias que se desarrollan. Debido a razones estadísticas, las placas deben contener entre 30 y 300 colonias. En este ejemplo, la placa tiene 225 colonias. 

Dicho error es la imprecisión que resulta inevitable, con independencia de lo cuidadosamente que se hagan las disoluciones y las inoculaciones, porque las muestras no son siempre representativas de la población total en conjunto. Algunas muestras de un cultivo contendrán más células que otras, pero en el 95 por ciento de los casos,

el número real de células viables no difiere del número determinado en más del doble de la raíz cuadrada del número de colonias recontadas.

 

Figura 8.10 El método del número más probable (NMP) proporciona un recuento de viables. Al aumentar el factor de dilución, se alcanza un punto en el que algunos tubos contienen sólo un organismo y los otros, ninguno. A partir del número, determinado por los tubos que presentan turbidez en tres diluciones sucesivas (en este caso 5,

3, 1), puede determinarse el número más probable de células estadisticamente (11,0) en la primera de las tres diluciones, mediante una tabla de números más probables (Tabla 8.6). Este valor, multiplicado por el factor de

dilución nos proporciona el número de células viables de la muestra.

 

8.4.6 Número más probable

El método del número más probable (NMP), al igual que el método de recuento en placa, nos proporciona un recuento de viables. Se basa en el principio de que una única célula viva puede desarrollarse y producir un cultivo turbio. El NMP requiere la realizacion una serie de diluciones seriadas al décimo de la muestra de cultivo, en un medio líquido adecuado para el crecimiento de dicho organismo (Figura 8.10). Posteriormente, se incuban las muestras de dichos tubos problema. Una vez que ha pasado suficiente tiempo como para que crezca el microorganismo, se examinan los tubos. Aquellos tubos que fueron inoculados con una o más células microbianas a partir de la muestra, se pondrán turbios, mientras que los tubos que no recibieron ninguna célula permanecerán transparentes. A medida que se aumenta el factor de dilución, se alcanzará un punto en el cual algunos tubos contendrán tan sólo un organismo y otros, ninguno. Al determinar la probabilidad de que los tubos no recibieran ninguna célula, se puede determinar el numero más probable de microorganismos presentes en la muestra original, utilizando para ello una tabla estadística. La Tabla 8.6 muestra una tabla del NMP.

La precisión del número más probable aumenta con el número de tubos que se usan, aunque cinco tubos por dilución se considera como una relación apropiada entre la precisión y la economía. El método del NMP se utiliza para contar microorganismos que son dificiles de cultivar en medio sólido. También se usa para determinar el número de células de un cultivo mixto que pueden crecer en un medio líquido detcrminado. Por ejemplo, puede emplearse para determinar la contaminación del agua potable, determinando el número de bacterias que pueden crecer en un medio que contiene lactosa. Estas bacterias probablemente sean Escherichia coli provenientes de aguas residuales contaminadas, y la presencia de E. coli en el agua potable es una prueba presuntiva de contaminación.

Tabla 8.6. Tablas del número más probableNúmero de tubos con turbidez inoculados a partir

de tres diluciones sucesivasNMP

Número de tubos con turbidez inoculados a partir de tres diluciones sucesivas

NMP

0 1 0 0,18 5 0 0 2,31 0 0 0,20 5 0 1 3,11 1 0 0,40 5 1 0 3,32 0 0 0,45 5 1 1 4,62 0 1 0,68 5 2 0 4,9

2 1 0 0,68 5 2 1 7,02 2 0 0,93 5 2 2 9,53 0 0 0,78 5 3 0 7,93 0 1 1,1 5 3 1 11,03 1 0 1,1 5 3 2 14,03 2 0 1,4 5 4 0 13,04 0 0 1,3 5 4 1 17,04 0 1 1,7 5 4 2 22,04 1 0 1,7 5 4 3 28,04 1 1 2,1 5 5 0 24,04 2 0 2,2 5 5 1 35,04 2 1 2,6 5 5 2 54,04 3 0 2,7 5 5 3 92,0

5 5 4 160,0

 

 

8.4.7 Filtración

Los métodos que dependen de la formación de colonias (recuento en placa) o del desarrollo de turbidez (número más probable) pueden detectar una única célula microbiana viable, pero debido a razones prácticas, sólo se utiliza alrededor de un mililitro de la muestra corno inóculo para la placa o para el tubo. Por lo tanto, no se detectan las poblaciones con menos de una célula por mililitro. Supongamos que queremos determinar las bacterias que existen en una piscina. La muestra debe concentrarse antes de proceder al recuento. La concentración de los microorganismos de las muestras se hace, generalmente, mediante filtracion síguiendo el mismo método descrito en el Capitulo 3. Para ello, se hace pasar un volumen conocido de líquido o de aire a través de un filtro de membrana, haciendo vacio. Los poros del filtro son lo suficientemente pequeños como para que no puedan pasar las células microbianas. Posteriormente se coloca el filtro en un medio sólido adecuado y se incuba. El número de colonias que se desarrollan es el número de células microbianas viables en el volumen de fluido que se filtró. Generalmente, los resultados se expresan como organismos presentes por litro (Figura 8.11).

Los diversos métodos de determinación del número de microorganismos se resumen en la Tabla 8.7.

 

 

RESUMEN

 

LAS POBLACIONES (p. 192)

1. El crecimiento microbiano se refiere al crecimiento de una poblacion - un aumento en el número de células, no un aumento en el tamaño de una célula individual.

 

Figura 8.11 Filtración.

  

Tabla 8.7. Métodos de determinación del número de microorganismos.

MétodoMicroorganismos para

los que se utilizaTipo de recuento

Usos / Limitaciones

IndirectoTurbidez La mayoria de las bacterias

y levadurasTotal Determina la turbidez con un espectrofotómetro; rápido y reproducible;

la suspensión debe contener más de unos l0 millones de células por ml; se requiere una curva patron

Peso seco Cualquier microorganismo Total Tedioso y requiere un cierto tiempo, pero preciso y reproducibleActividad metabólica

Cualquier microorganismo viable

Viables Requiere un cierto tiempo y puede ser impreciso; puede utilizarse con materiales complejos

DirectoRecuento microscópico

Cualquier microorganismo unicelular

Total Muy útil para el recuento de un tipo de células de una mezcla; requiere un cierto tiempo; no es adecuado para cultivos diluidos

Recuento electrónico

Cualquier microorganismo unicelular

Total Muy útil para el recuento de células de un cultivo axénico; rápido y preciso; no debe estar presente material extralio

Recuento en placa

Cualquier microorganismo unicelular viable

Viables Muy sensible - puede detectar incluso una célula; lento y tedioso; para evitar el error debido al muestreo, se debe recontar un gran número de colonias

Numero más problable

Cualquier microorganismo viable

Viables Utilizado para microorganismos que son dificiles de cultivar en medio sólido y para determinar contaminación por Escherichia coli en aguas; requiere un cierto tiempo

Filtración Cualquier microorganismo viable

Viables Se concentra una muestra, de manera que se puede recontar un pequeño número de células a partir de grandes volúmenes de un líquido o de un gas

 

 

CÓMO CRECEN LOS MICROORGANISMOS (pp.192-196)

1. El tiempo de duplicación es el período que requieren las células de una población microbiana para crecer, dividirse y dar lugar a dos nuevas células por cada una de las que existían anteriormente.

2. La tasa de crecimiento se mide normalmente como el tiempo de duplicación por hora.

3. El crecimiento exponencial significa que durante cada tiempo de duplicación, el número de células de la población se incrementa por un factor de dos. La fórmula es N = 2n, donde N es el número de células en el cultivo después de que han pasado n tiempos de duplicación.

4. El crecimiento microbiano se representa gráficamente en una escala logarítmica.

5. Un cultivo microbiano pasa típicamente por cuatro fases distintas de crecimiento: la fase lag, la fase log, la fase estacionaria y la fase de muerte. Las fases lag y de muerte no se producen a veces en un cultivo determinado.

6. Generalmente, la fase lag se produce cuando las células en fase estacionaria o en fase de muerte se inoculan en un medio de cultivo fresco. Es un período de no crecimiento, pero existe una actividad metabólica considerable, ya que las células se preparan para crecer.

7. La fase log no continúa indefinidamente debido a factores como la reducción de nutrientes o a la acumulación de productos tóxicos.

8. Durante la fase estacionaria no se produce un incremento neto de la masa, pero las células se hacen más pequeñas y sintetizan componentes que les ayudan a sobrevivir durante los períodos de no crecimiento.

9. Durante la fase de muerte, las células mueren exponencialmente, pero a una tasa más baja de la que crecen en la fase log. Generalmente la muerte se produce porque las células agotan sus reservas intracelulares de ATP y no pueden reparar los componentes celulares.

10. En condiciones naturales, los nutrientes entran de manera continua en el ambiente de una célula a bajas concentraciones, de manera que la tasa de crecimiento es fijada por la concentración del nutriente mas escaso, o nutriente limitante.

11. En el laboratorio, se consigue un cultivo continuo con un quimiostato. La concentración del nutriente limitante en el cultivo fija la tasa de crecimiento del mismo.

12. Las células de una colonia están en fases diferentes de crecimiento dependiendo de su localización. Las células que crecen en la superficie de una colonia son acróbicas y las que están en el centro son anaeróbicas.

 

¿QUÉ NECESITAN LOS MICROORGANISMOS PARA CRECER? (pp. 196-203)

 

Nutrición (pp. 196-201)

1. Los nutrientes son compuestos químicos procedentes del medio ambiente que son utilizados por una célula para sintetizar las moléculas necesarias para fabricar nuevas células.

2. Todos los microorganismos requieren una fuente de carbono para crecer, porque el carbono es la base estructural de los compuestos bioquímicos.

3. El oxígeno desempeña un papel complejo en el metabolismo microbiano - como nutriente, como aceptor de electrones y como generador de productos tóxicos, Los microorganismos que son capaces de una respiración aeróbica utilizan el oxígeno gaseoso para generar energía.

4. Los compuestos tóxicos que contienen oxígeno son productos del metabolismo aeróbico. Entre ellos se encuentran el peróxido de hidrógeno y los radicales libres superóxido y el radical hidroxilo.

5. Los aerobios estrictos pueden crecer tan sólo en presencia de oxígeno. Los microaerófilos toleran menos oxígeno. Los anaerobios facultativos pueden crecer tanto en presencia como en ausencia de oxígeno. Los anaerobios aerotolerantes no requieren oxígeno pero no mueren al ser expuestos a él. Los anaerobios estrictos mueren en presencia de oxígeno.

6. Todos los seres vivos requieren alguna forma de nitrógeno (un constituyente de las proteínas y de los ácidos nucleicos, así como de determinados metabolitos esenciales), de fósforo (un constituyente de los acidos nucleicos, de los fosfolípidos y de ciertos metabolitos esenciales) y de azufre (un componente de dos aminoácidos, de algunos tipos de tRNA, y de determinados metabolitos esenciales).

7. Los elementos traza son compuestos químicos inorgánicos, que se requieren en cantidades pequeñas, aunque son esenciales, tales como el potasio, el hierro y el zinc, que los microorganismos necesitan para crecer. Algunos elementos traza son cofactores.

8. Los factores de crecimiento orgánicos son bloques básicos esenciales. Si un microorganismo no puede sintetizar un determinado bloque básico en particular, debe ser suministrado a partir del ambiente. Los factores de crecimiento orgánicos pueden ser aminoácidos, purinas, pirimidinas, ácidos grasos o vitaminas.

9. La diversidad nutricional se refiere a los diferentes requerimientos de factores de crecimiento orgánicos de los microorganismos.

10 Los microorganismos crecen en un ambiente rico, utilizando los bloques básicos preformados, incluso aunque sean capaces de fabricarlos.

 

El ambiente no nutritivo (pp. 199-203)

1. Cada especie microbiana crece en un intenvalo de temperatura, desde la temperatura mínima de crecimiento a una temperatura máxima de crecimiento. La temperatura óptima de una especie es aquella a la cual crece más rápidamente.

2. Los termófilos crecen mejor a temperaturas superiores a los 50 0C. Los mesófilos crecen mejor a temperaturas cercanas a los 37 0C, la temperatura del cuerpo humano. Los psicrófilos crecen a 5 0C o por debajo de ésta temperatura, la temperatura de un frigorífico.

3. La estabilidad al calor de las proteínas de los microorganismos determina la temperatura máxima a la cual puede crecer. La temperatura minima está determinada por el debilitamiento de las interacciones hidrofóbicas de las proteínas.

4. La presión hidrostática es la presión que se aplica a un líquido. La mayoría de los microorganismos toleran altas presiones hidrostáticas. Los barófilos crecen mejor (facultativos) o sólamente (estrictos) a presiones superiores a 1 atmósfera.

5. En general, las bacterias crecen mejor a un pH ligeramente alcalino, y los hongos crecen mejor a un pH ligeramente ácido. Los acidófilos viven en un ambiente con un pH extremadamente bajo, mientras que los alcalófilos viven en ambientes con un pH elevado.

6. Las bacterias mantienen una presión de turgencia positiva. la presión osmótica del interior de la célula es mayor que la presión osmótica de su ambiente externo. Determinadas especies bacterianas, las halófilas, requieren elevadas presiones osmóticas externas.

7. La plasmolisis se produce cuando un incremento en la presión osmotica externa hace que salga agua de la célula, encogiéndose el citoplasma.

 

MEDIDA DEL NÚMERO DE MICROORGANISMOS (pp. 203-210)

1. Algunos métodos de medida son indirectos, y miden una propiedad la turbidez, el peso seco, o una actividad metabólica - de la masa de células de una población. Otros métodos son directos, contando las células individuales.

2. El recuento al microscopio o el recuento electrónico dan un recuento total - un recuento de todas las células, vivas y muertas. Un recuento de viables es un recuento de tan sólo las células vivas, es decir, aquellas que son capaces de reproducirse. El recuento en placa y el NMP son recuentos de viables.

3. La turbidez se mide con un espectrofotómetro. El espectrofotómetro mide la cantidad de luz que transmite un cultivo líquido de células microbianas. Se utiliza una curva patrón para relacionar las medidas en el espectrofotómetro con la masa celular o con el nómero de células de un cultivo particular.

4. Para la determinación del peso seco se separan las células del medio, se desecan y se pesan.

5. Hay varios procedimientos por los que se puede usar la actividad metabólica para medir el número de células: la tasa de formación de productos metabólicos, tales como gases o ácidos, que produce un cultivo; la tasa de utilización de un substrato, como el oxígeno o la glucosa; la tasa de reducción de determinados colorantes.

6.El recuento microscópico sc hace con un porta especial determinado cámara de recuento, como la cámara de Petroff-Hauser .A partir de la prolundidad del pocillo y de la rejilla, se puede determinar el número de células de un volumen determinado de muestra.

7.El recuento electrónico se hace con un contador Coulter. El recuento electrónico es posible porque las células microbianas no conducen la electricidad tan bien como su medio.

8. En el recuento en placa, se diluye varias veces al décimo o al centésimo una muestra del cultivo, y posteriormente, se inocula o se mezcla en una placa y se incuba. Se seleccionan las placas que tienen entre 30 y 300 colonias y se recuentan.

9. El número más problable <NMP> se basa en el principio de que una única célula viva puede desarrollarse y producir un cultivo turbio. Después de varias diluciones seriadas al décimo, se incuban los tubos problema. Los tubos que se ponen turbios recibieron una o más células. Determinando la dilución media a la que los tubos no reciben células, se puede calcular, utilizando una tabla del NMP, el número de microorganismos que estaban presentes de manera más probable en la muestra original.

10. La filtración se hace antes de medir un número pequeño de microorganismos en grandes volúmenes de líquido o gas.

 

PREGUNTAS DE REVISIÓN

LAS POBLACIONES

1. ¿A qué se rofiere el término crecimiento microbiano?

 

CÓMO CRECEN LOS MICROORGANISMOS

1. ¿Qué es el tiempo de duplicación? ¿Por qué se usa frecuentemente la tasa de crecimiento, en lugar del tiempo de duplicación?

2. Explique esta frase: los microorganismos crecen exponencialmente.

3. Nombre, secuencialmente, las fases de crecimiento de un cultivo. Explique cada una de ellas.

4. Cómo se mantiene un cultivo continuo en el laboratorio?

5. En condiciones naturales, ¿qué fija normalmente la tasa de crecimiento?

6. Defina el término colonia. Cómo afecta la localizacion en una colonia a la fase de crecimiento de una célula? Cómo afecta la localización al acceso del oxígeno?

 

¿QUÉ NECESITAN LOS MICROORGANIMOS PARA CRECER?

1. ¿Qué son los nutrientes? Explique la función de cada uno de estos nutrientes: carbono, oxígeno, azufre, elementos traza, factores orgánicos de crecimiento.

2. Explique esta frase: el oxígeno juega un papel complejo en el metabolismo microbiano. Utilice el término radical libre en su explicación.

3. Explique las distintas relaciones que tienen con el oxígeno los siguientes tipos de micoorganismos: aerobios obligados, microaerófilos, anaerobios facultativos, anaerobios aerotolerantes y anaerobios obligados.

4. ¿A qué se refiere la diversidad nutricional?

5. ¿Qué es un ambiente de crecimiento rico? ¿Cómo explotan los microoroanismos un ambiente de crecimiento rico?

6. Nombre los factores físicos significativos para un microorganismo en un ambiente no nutritivo. Nombre los factores químicos más significativos.

7. Explique cómo crecen las distintas especies en un intervalo de temperaturas. Utilice estos términos en su comentario: temperatura mínima de crecimiento, temperatura máxima de crecimiento, teniperatura óptima. Explique qué determina la temperatura maxima y mínima.

8. Defina los siguientes términos: termófilos, mesófilos, psicrólilos.

9. ¿Qué es la presión hidrostática? ¿Por qué los microorganismos pueden soportar elevadas presiones hidrostráticas? ¿Hasta qué punto es perjudicial la presión hidrostática para los microorganismos?

10. ¿Qué valores de pH prefieren las bacterias? ¿Y los hongos? ¿Qué son los acidófilos y los alcalófilos? Si las funciones metabólicas requieren un intervalo de pH relativamente estrecho, cómo pueden las bacterias existir en ambientes con un amplio intervalo de valores de pH?

11. ¿Un qué se diferencian las halófilas de otras bacterias? Cómo mantienen las bacterias la presión de turgencia? ¿Qué es la plasmolisis?

 

MEDIDA DEL NÚMERO DE MICROORGANISMOS

1. ¿Un qué se diferencian los métodos directos e indirectos de medida de las poblaciones de los microorganismos? ¿Cuál es la diferencia entre un recuento total y un recuento de viables?

2. Indique si cada uno de los siguientes métodos de medida es directo o indirecto y si de un recuento total o de viables; describa el procedimiento y explique las ventajas y desventajas.

a. turbidez

b. peso seco

c. actividad metabólica

d. microscopia directa

e. recuento electrónico directo

f. recuento en placa

g. número más probable (NMP)

h. filtración

Preguntas de ensayo

1. Discuta las ventajas y desventajas del cultivo continuo para la obtención de antibióticos.

2. Discuta el efecto de la riqueza de un medio y de la concentración de un nutriente en la tasa de crecimiento.

 

 

LECTURAS RECOMENDADAS

 

Ingraham, J. L.; Maaloe, O. y Niedhardt, F. C. 1983. Growth of the bacterial cell. Sunderland, Mass: Sinauer.

Kolter, R. 1992. Life and death in stationary phase. ASM News 58:75-79

Marr, A. G. 1991. Growth rate of Escherichia coli. .Microbiological Reviews 55:3l6-33.

Mynell, G. G., y Mynell, E. 1970. Theory and practice in experimental bacteriology. New York: Cambridge University Press.

Fuente: http://aulavirtual.usal.es/aulavirtual/demos/microbiologia/unidades/documen/uni_02/58/texthtml/cap805.htm