Capitulo 3 Stryer: Investigación en proteínas y proteomas

Las proteínas cumplen roles cruciales en catálisis, transducción de señales y como soportes

estructurales.

El primer paso es la purificación de la proteína. Las proteínas se pueden separar en base a su

solubilidad, su tamaño, carga y capacidad de unión.

Una vez purificada se puede secuenciar o identificar mediante la medición y comparación de

su masa con una base de datos. La espectroscopia de masas efectúa esta medición. El

contexto fisiológico de una proteína puede entenderse mediante sondas (anticuerpos

monoclonales) identificación y cuantificación de proteína. La espectroscopia NMR y la

cristalografía X son utilizadas para determinar la estructura tridimensional de las proteínas.

3.1 La purificación, el primer paso

¿Cómo aislar una proteína de una mezcla compleja de proteínas? El bioquímico necesita un

ensayo para identificar alguna propiedad específica de la proteína. Este normalmente mide la

actividad enzimática, capacidad química de la enzima de inducir la reacción.

La cuestión asociada con la purificación es maximizar la actividad específica... En un enzima

puro la actividad específica será constante.

Elegido el ensayo y escogida la fuente de proteína, se debe fraccionar la célula y sus

componentes. En primer paso se forma un homogenado por ruptura de membrana celular,

fraccionándose la célula por centrifugación y dando lugar a un precipitado de material pesado

en el fondo del tubo. El sobrenadante se centrifuga luego sucesivamente en una técnica

denominada centrifugación diferencial.

Se purifica la proteína en base a la solubilidad, tamaño, carga y afinidad especifica de unión.

Precipitación Salina

La mayoría de las proteínas son menos solubles a concentraciones elevadas de sal, este

efecto es llamado precipitación salina. Las concentraciones de sal en las que se precipita una

proteína varían de una proteína a otra. Además es útil para concentrar disoluciones diluidas de

proteínas. Para eliminar la sal, se puede utilizar la diálisis.

Diálisis

Las proteínas se pueden separar de moléculas pequeñas mediante la diálisis a través de una

membrana semipermeable, por ej. membrana porosa de celulosa. Las moléculas grandes se

retienen en la bolsa, mientras que las moléculas más pequeñas y los iones atraviesan los

poros.

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Cromatografía de filtración en gel o de exclusión molecular

Se basa en discriminar por tamaño. La muestra se coloca en lo alto de una columna rellena de

bolitas porosas compuestas por un polímero insoluble, pero altamente hidratado, como son el

dextrano o la agarosa (carbohidratos) o la poliacrilamida. Sephadex, Sepharosa y Biogel son

preparaciones comerciales. Las moléculas pequeñas ingresan dentro de los poros de las

bolitas. Así, las moléculas grandes fluyen más rápidamente a través de esta columna y

aparecen antes porque tienen accesible un volumen de líquido más pequeño. Las pequeñas

siguen un camino más largo y serán las últimas en salir.

Cromatografía de intercambio iónico

Se separan en base a su carga neta. Si una proteína tiene una carga neta positiva a pH 7 se

unirá a una columna que contenga carboxilatos, si tiene carga negativa no se unirá. Luego de

unida, puede eluirse alimentando la [] de cloruro sódico u otra sal en el buffer de elución porque

los iones sodios compiten con las proteínas unidas. Si estas proteínas tienen una baja

densidad de carga positiva neta eluirán primero, si tienen alta densidad tardarán más.

La columna de CM-celulosa tiene carga (-) y la DEAE-celulosa carga (+).

Cromatografía de afinidad

Se basa en la alta afinidad de algunas proteínas por grupos químicos específicos. Por Ej.: una

mezcla proteica se eluye a través de una columna que contiene secuencias especificas de

DNA unidas a una matriz; las proteínas con mayor afinidad por la secuencia se unirán y

quedarán retenidas. Luego el factor de trascripción se libera lavando con una disolución que

contiene alta concentración de sal.

En general, se puede utilizar en el aislamiento una proteína q reconoce a determinado grupo X

por: la unión covalente de X o un derivado a la columna; la adición de un mezcla de proteínas a

esta columna, que se lava luego con buffer para eliminar proteínas no unidas; ó por la elución

de la proteína deseada añadiendo una concentración elevada de una forma soluble de X o

cambio de las condiciones para alterar la afinidad de la unión. Esta técnica es más efectiva

cuando la afinidad proteína molécula es muy especifica.

Ej. 2: una serie de residuos de His se pueden añadir al extremo amino o carboxilo Terminal de

una proteína expresada. La proteína etiquetada se pasa a través de una columna de bolitas

que contienen unido de forma equivalente Ni2+ u otros iones metálicos que se unen a la

proteína deseada mientras que las otras proteínas atraviesan la columna. Posteriormente se

pueden eluir las proteínas de la columna añadiendo imidazol u otros compuestos químicos que

se unen a los iones metálicos y desplazan a la proteína.

Cromatografía liquida de alta presión

El relleno de la columna esta mucho más finamente dividido, con lo que hay más centros de

interacción y por lo tanto mayor poder de resolución. Se debe aplicar presión para obtener

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velocidades de flujo adecuadas. El resultado neto es una elevada resolución y una separación

rápida.

Electroforesis

Constituye un método mediante el cuál se visualiza la eficacia de la purificación a través de las

proteínas que se presentan en cada paso.

En gel

Una molécula con carga eléctrica neta se desplazará en un campo eléctrico. La velocidad de

migración de una proteína en un campo eléctrico depende de la fuerza de ese campo, la carga

neta de la proteína y del coeficiente de fricción. El coeficiente de fricción depende tanto de la

masa como de la forma de la molécula que migra como de la viscosidad del medio. Las

separaciones electroforéticas se llevan a cabo sobre geles (o sobre papel) porque actúan como

tamices moleculares que potencia la separación. Las moléculas pequeñas pasan fácilmente

mientras que las grandes permanecen casi inmóviles.

Las proteínas se pueden separar de acuerdo a su masa molecular, utilizando electroforesis de

poliacrilamida pero en condiciones desnaturalizantes. La mezcla de proteínas se disuelve en

SDS dodecil sulfato sódico, un detergente aniónico que rompe casi todas las interacciones no

covalentes en las proteínas nativas. El mercaptoetanol (2-tioetanol) o ditiotreitol reduce puentes

disulfuro. Los aniones SDS se unen a la cadena principal, a razón de un anión SDS por cada

dos residuos de aminoácido. Este complejo tiene una gran carga negativa que es proporcional

a la masa de la proteína. Estos complejos se someten a electroforesis. Las proteínas se

pueden visualizar tiñéndolas con plata o Azul de Coomasie.

El desplazamiento en estas condiciones de la mayor parte de los polipéptidos es linealmente

proporcional al logaritmo de su masa. La SDS-PAGE es rápida sensible y capaz de un alto

grado de resolución

Isoelectroenfoque

Separación electroforética en base a sus contenidos relativos de AA básicos o ácidos. El PI es

el pH al cual la carga neta de la proteína es 0; su movilidad electroforética también es 0. Cada

proteína se desplaza hasta que alcanza una posición en el gel en la que el pH es igual al PI de

la proteína. El gradiente de pH en el gel se obtiene sometiendo a electroforesis precia una

mezcla de polianfolitos (polímeros pequeños con múltiple carga) con diferentes valores de PI.

Electroforesis bidimensional

Es la combinación del isoelectroenfoque y la SDS-PAGE obteniendo una separación de

resolución muy elevada. Una muestra se somete a isoelectroenfoque. Este gel de calle única

se coloca horizontalmente en la parte superior de un gel de SDS-poliacrilamida. A continuación

se somete de nuevo a electroforesis obteniéndose una distribución bidimensional de las

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manchas; horizontalmente se han separado de acuerdo a su PI y verticalmente de acuerdo a

su masa molecular.

Las tablas de purificación permiten analizar los resultados: proteína total; actividad total;

actividad especifica; Rendimiento (actividad después de cada paso de purificación) y grado de

purificación.

Un alto grado de purificación y bajo rendimiento proporciona poca proteína con la que

experimentar. Un alto rendimiento con una baja purificación deja muchos contaminantes y

complica la interpretación de los experimentos.

Ultracentrifugación

Permite determinar parámetros tales como la masa y la densidad, conocer algo sobre la forma

de la molécula e investigar las interacciones entre moléculas. Las partículas se desplazan por

la fuerza centrifuga. Para valorar la velocidad se calcula el coeficiente de sedimentación s= m

(1-vp)/f. Siendo (1-vp) la fuerza de flotación. El coeficiente se expresa en Svedberg y cuanto

menor sea más lentamente se moverá la molécula.

La velocidad de sedimentación depende en parte de la masa de la partícula. Mayor masa

sedimenta más rápido. La forma influye en el coeficiente de fricción, ya que cuanto mas

compacta sea la partícula mayor la velocidad de sedimentación. Un partícula densa sedimenta

más rápido que una de menor densidad, porque la fuerza de flotación contraria es menos para

las partículas menos densas. La velocidad de sedimentación también depende de la densidad

de la disolución, las partículas se hunden cuando vp<1 y flotan cuando vp>1, no se desplazan

cuando vp=1.

La centrifugación en gradiente se usa para separar proteínas con diferentes coeficientes de

sedimentación. Se forma un gradiente de densidad en un tubo. El papel del gradiente es evitar

el flujo de convección. La mezcla de la proteína se coloca en peq volumen en la parte superior

del gradiente de densidad. Las proteínas se separan de acuerdo a su coeficiente de

sedimentación.

La masa de una proteína se puede determinar por equilibrio de sedimentación: una muestra se

centrifuga a vel bajas para que se equilibre por difusión. Es una técnica muy precisa y se puede

aplicar en cond no desnaturalizantes manteniendo estruct cuaternarias; a diferencia de SDS-

Page que nos da una estimación del PM.

3.2 Las secuencias se determinan por Edman

La composición de AA se realiza mediante hidrólisis ácida, calor + HCl 6 M. Estos AA luego se

pueden separar por cromatografía de intercambio iónico. La identidad de los AA se averigua

por el Vol. de elución y cuantificado por ninhidrina (color azul excepto con Pro que da amarillo).

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La concentración de un AA es proporcional a la absorbancia. Se puede usar un colorante más

especifico como la fluoroescamina.

La determinación del aminoácido N-terminal se logra por la degradación de Edman, que separa

secuencialmente del extremo amino Terminal un residuo tras otro. El fenilisotiocianato

reacciona con el grupo amino Terminal no cargado del péptido para formar un derivado del

feniltiocarbamato. Posteriormente bajo condiciones ácidas suaves, se libera un derivado cíclico

del AA Terminal lo que deja un péptido intacto acortado en un AA. El compuesto cíclico es un

aminoácido feniltiohidantoína (PTH-AA) que se puede identificar por cromatografía.

El método de Edman presenta una eficiencia baja en péptidos muy extensos. Por lo que es

conveniente fragmentar la proteína selectivamente.: bromuro de cianógeno; tripsina;

quimotripsina, etc. Los péptidos obtenidos por ruptura enzimática se separan

cromatograficamente. La secuencia de cada péptido se determina por Edman. Si la muestra

inicial de proteína consta de varias cadenas se necesitan por ej. Una electroforesis SDS-gel en

cond reductoras, para una proteína consistente en 2 o más cadenas unidas no covalentemente

se utilizan ag desnaturalizantes como urea o hidrocloruro de guanidina. Los p disulfuro se

separan por mercaptoetanol o ditiotreitol; y para evitar que los residuos de cisterna se

recombinen se alquilan con yodoacetato.

Para determinar las posiciones de los puentes disulfuro originales se utiliza electroforesis en

diagonal para aislar las secuencias peptídicas que contienen estos enlaces. Se fragmenta la

proteína en péptidos bajo cond en que los p disulfuro se mantengan intactos. La mezcla de

péptidos se coloca en una hoja de papel y se somete a electroforesis de una sola calle. La hoja

resultante se expone a vapores de ácido perfórmico, que rompen los p disulfuro y los convierte

en residuos de ácido cisteico. Los péptidos unidos por disulfuro se vuelven independientes y

más ácidos debido al grupo -SO3-. Esta mezcla se somete a electroforesis en dirección

perpendicular a la anterior /pero en la mismas cond). Los péptidos q no intervienen en

disulfuros tendrán igual movilidad que en la primera por lo que se ubican en la diagonal. Por el

contrario, los péptidos recién formados q contienen el ácido cisteico migrarán diferente, fuera

de la diagonal. Estos péptidos se pueden aislar y secuenciar, para determinar la localización

del puente disulfuro.

Secuencias de Aminoácidos

· La secuencia puede indicar si pertenece a una familia de proteínas. Por ejemplo la tripsina y

la quimiotripsina son similares y pertenecen a la familia se serinproteasas.

· La comparación de secuencias de la misma proteína en diferentes especies proporciona

datos sobre las vías evolutivas. Por ej. Las albúminas séricas del ser humano y el simio

africano.

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· Las secuencias puede presentar repeticiones internas que brindan información sobre la

historia de una proteína específica. Por ej. La calmodulina contiene cuatro módulos de unión

generados por duplicación génica

· Muchas proteínas contienen secuencias que sirven como señales para indicar su destino o

controlar su maduración. Por ej. Un señal de 20 AA hidrofóbicos cerca del amino terminal

dirigen la proteína a una membrana.

· La secuencia provee datos para la síntesis de anticuerpos específicos contra la proteína de

interés.

· Las secuencias son útiles para fabricar sondas de DNA específicas para los genes que

codifican a las correspondientes proteínas

Tecnología del DNA recombinante

Para péptidos mayores a 1000 la degradación de Edman resulta inadecuada. Por ello se utiliza

la técnica del DNA recombinante: el clonado y secuenciación de hebras largas de DNA y la

secuencia de nucleótidos revela directamente la secuencia de aminoácidos codificada por el

gen. Sin embargo esta técnica revela la secuencia de la proteína naciente, pero no de la

proteína funcional, resultante de las modificaciones postraduccionales.

3.3 Inmunología como técnica de investigación

Anticuerpos monoclonales

Estos métodos aprovechan la alta especificidad de anticuerpos por sus proteínas-diana. Los

anticuerpos marcados proporcionan medios para etiquetar una proteína, y aislarla, cuantificarla

o visualizarla.

Un anticuerpo es una proteína sintetizada en respuesta a la presencia de una sustancia, el

antígeno. Las moléculas pequeñas pueden producir anticuerpos si están asociadas a un

transportador macromolecular. Un anticuerpo reconoce un grupo específico o agrupación de

aminoácidos en la molécula diana que se denomina determinante antigénico o epítopo. Los

anticuerpos en los animales se encuentran en el suero de la sangre. El obstáculo de la técnica

es que la mayor parte de los antígenos tienen varios epítopos. Los anticuerpos policlonales son

mezclas heterogéneas de anticuerpos, cada uno específico para uno de los diversos epítopes

del antígeno. Se resuelve esta barrera con anticuerpos monoclonales, anticuerpos con todos

los sitios de unión al antígeno iguales. Estos se sintetizan por medio de la fusión de una célula

productora de anticuerpo de corta vida con una célula inmortal de mieloma.

Detección y cuantificación mediante ensayo de inmunoabsorción asociada a enzima

Los anticuerpos pueden utilizarse para cuantificar proteína u otro antígeno. La técnica de

ensayo de inmunoabsorción asociada a enzima utiliza una enzima que reacciona con un

sustrato incoloro y produce un producto coloreado. La enzima se une covalentemente a un

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anticuerpo específico que reconoce a un antígeno diana. Si el antígeno está presente, el

complejo anticuerpo-enzima se unirá a él, y el componente enzimático del complejo enzima-

anticuerpo catalizará la reacción que generará el producto coloreado, la presencia del mismo

indica la presencia de antígeno. Existen dos tipos de ELISA. El ELISA indirecto se utiliza para

detectar la presencia de anticuerpo, se utiliza en la detección de HIV. Se coloca en un pocillo

proteínas del núcleo vírico, se agregan los anticuerpos del paciente. Se agregan anticuerpos-

Enzima que se unan a los anticuerpos. Se agrega el sustrato: la reacción enzimática indica la

presencia de anticuerpos para el retrovirus.

El ELISA sándwich permite la detección del antígeno y no del anticuerpo. Se adsorbe en un

pocillo un anticuerpo contra una enzima en particular, se agrega la sangre u orina q se estima

contiene el antígeno. Se añade un segundo anticuerpo (asociado a una enzima) al antígeno. La

reacción qca cuantifica la cantidad de antígeno.

Transferencia Western

Esta técnica de inmunoensayo permite detectar pequeñas cantidades de proteína. Se somete

la muestra a electroforesis en un gel de SDS-poliacrilamida. Las proteínas separadas en gel se

transfieren a la superficie de una lámina de polímero para hacerlas más accesibles a la

reacción. Se añade a la lámina de anticuerpo que sea específico para la proteína de interés y

éste reacciona con su antígeno. El complejo antígeno-anticuerpo puede ser detectado por otro

anticuerpo específico para el primero. Si este está marcado radiactivamente puede realizarse

una autorradiografía.

La fluorescencia posibilita la visualización

Los marcadores fluorescentes permiten examinar las proteínas en su entorno biológico.

También aportan datos acerca de la función que cumple la proteína.

3.4 Síntesis de péptidos en fase sólida

Estos péptidos son útiles porque: # Pueden servir como antígenos para estimular la formación

de anticuerpos específicos. Estos anticuerpos se pueden utilizar para aislar la proteína intacta,

o localizarla en la célula. # Se pueden usar para aislar receptores de hormonas y moléculas

señal, también en columnas cromatográficas # Pueden utilizarse en fármacos # Permiten

definir las reglas que gobiernan la estructura tridimensional.

¿Cómo se realiza? El grupo amino de un aminoácido se une al carboxilo de otro, para esto es

necesario bloquear algunos grupos y activar otros. El grupo α-amino del 1er AA del péptido se

bloquea con Pert-butiloxicarbonilo (t-Boc), dando t-Boc-aminoácido. El grupo carboxilo de este

mismo aminoácido se activa con el reactivo diciclohexilcarbodiimida (DCC). El amino libre del

siguiente aminoácido ataca el carboxilo activado, originando un enlace peptídico y liberando

diciclohexilurea. El grupo carboxilo del dipéptido resultante se activa con DCC y reacciona con

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el grupo amino libre del aminoácido que va a ser el tercer residuo del péptido. Este proceso se

repite hasta completar el péptido. La exposición del péptido a ácido diluido libera el grupo t-boc

protector del 1er aminoácido.

La unión de la cadena peptídico creciente a una matriz insoluble incrementa aun más la

eficiencia. La ventaja de este método es que como la cadena esta unido a la fase sólida no se

necesita purificar intermediarios y al efectuarse siempre en el mismo recipiente se evita pérdida

de producto. En el caso de utilizar la fase sólida, el carboxilo del 1er AA se une a esta, luego se

procede como lo explicado. Al final de la síntesis, se libera el péptido con ácido fluorhidrico, que

rompe el anclaje éster carboxílico sin alterar los enlaces peptidicos.

3.5 Espectrometría de masas

Permite determinar masas proteicas con una precisión de una unidad de masa. Analiza formas

ionizadas de moléculas en fase gaseosa. Es aplicable a gases o líquidos volátiles que liberan

iones en fase gaseosa. Las medidas se realizan determinando con que facilidad se acelera un

ion al aplicarle un campo eléctrico.

Dado que los péptidos y proteínas no son volátiles se debe generar una concentración lo

suficientemente alta en la fase gaseosa de proteína ionizada, pero intacta. Para esto se ha

desarrollado dos métodos: espectrometría de deserción-ionización en matriz inducida (MALDI)

e ionización por electrospray (ESI). En MALDI, la proteína o péptido se coprecipita con un

compuesto orgánico que absorbe la luz de una longitud de onda apropiada (la matriz). El

destello de una luz sobre la preparación expulsa las moléculas de la superficie. Estas moléc

capturan e- cuando salen de la matriz y por lo tanto la dejan como iones negativos. En ESI, las

disoluciones que contienen a la proteína o el péptido fluyen a través de una fina punta metálica

mantenida a un potencial eléctrico distinto de cero. Se liberan pequeñas gotículas cargadas

que contienen tanto proteína como disolvente. El disolvente se evapora, concentrando la carga.

La repulsión de las moléculas cargadas se incrementa, y los iones moleculares individuales

vuelan libres.

Después de haber generado los iones en fase gaseosa, se pueden utilizar varias

aproximaciones para determinar su masa. En el análisis de tiempo de vuelo (TOF), los iones se

aceleran en un campo eléctrico hacia un detector, los iones más pequeños viajan más rápido y

llegan primero al detector.

La masa de una proteína normalmente no es suficiente para identificarla entre un conjunto de

proteínas. Sin embargo, la masa de la proteína junto con la masa de fragmentos proteicos

producidos por un método de ruptura específico, provee una identificación única.

3.6 Determinación de la estructura tridimensional

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Cristalografía de rayos X

Fue la primera técnica en desarrollarse. Revela posiciones tridimensionales exactas de la

mayor parte de los átomos de una molécula de proteína. La radiación de rayos X proporciona la

mejor resolución porque la long de onda de los rayos es aprox. iguala la long del enlace

covalente. Para llevar a cabo una cristalografía se necesita un cristal de proteína, una fuente de

rayos X y un detector.

La adición lenta de sulfato amónico u otra sal, a una disolución concentrada de proteína

favorece la formación de cristales muy ordenados. Debe ensayarse varias veces para lograr un

cristal idóneo. Los rayos producidos por la fuente, atraviesan en parte el cristal sin cambios y el

resto se dispersa. Estos rayos dispersados o difractados se registran en una película

fotográfica o bien por medio de un detector electrónico de estado sólido. El cristal se sitúa con

una orientación precisa respecto al haz de rayos y a la película. Se hace girar para que el haz

incida en todas direcciones. Esto produce una fotografía de rayos X que consiste en una serie

de manchas llamadas reflexiones. Las intensidades y posiciones de cada mancha son los

datos experimentales, que permitirán la reconstrucción de una imagen de la proteína a partir de

las intensidades observadas. La imagen se forma aplicando la transformada de Fourier. La

resolución del análisis de rayos X viene determinada por el número de intensidades dispersas

usadas en la síntesis de Fourier.

Espectroscopia de Resonancia Magnética Nuclear

Revela la estructura atómica de macromoléculas en disolución (concentradas). Se basa en el

hecho de que algunos núcleos atómicos son intrínsecamente magnéticos (poseen spin). La

rotación de un protón genera un momento magnético, cuando se aplica un campo magnético

externo, este momento puede adoptar una de dos orientaciones. Aplicando un pulso de

radiación electromagnética se puede cambiar el spin de una posición de baja a alta energía,

obteniendo una resonancia. El espectro se obtiene manteniendo el campo constante y variando

la frecuencia de la radiación electromagnética.

El flujo de e- alrededor de un núcleo magnético genera un pequeño campo magnético local que

se opone al campo aplicado. Los núcleos absorben a frecuencias de resonancia

características, que se conoce como desplazamiento químico. Con esta información se pueden

deducir los cambios de un grupo químico determinado en diferentes condiciones, tales como el

cambio conformacional de una proteína de estructura desordenada a una hélice alfa en

respuesta a un cambio de pH.

Otra variante es el espectro bidimensional obtenido por espectroscopia de intensificación

nuclear Overhauser (NOESY), que muestra gráficamente pares de protones que están muy

cercanos, incluso aunque no estén juntos en la estructura primaria. La base de esta técnica es

el efecto nuclear Overhauser, una interacción entre núcleos que es proporcional al inverso de

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la sexta potencia de su distancia. Se induce una magnetización transitoria en una muestra por

aplicación de un pulso de radiofrecuencia, posibilitando alterar la rotación de un núcleo y

examinar el efecto producido en la rotación de otro núcleo vecino. El efecto proporciona un

medio para detectar la localización relativa de un átomo respecto a otro en la estructura

tridimensional de la proteína. La diagonal de un espectro de NOESY corresponde al espectro

unidimensional. Los picos fuera de la diagonal proporcionan una información nueva crucial:

identifican pares de protones que están separados menos de 5 Å.

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