Capítulo 10

Manual de Técnicas Analíticas en el Laboratorio de Toxicología

CAPÍTULO 10MANCHAS HEMATICAS

Autor: Dr. Rodolfo Nieto, Perito del Laboratorio de Toxicología y Química Legal de la Asesoría Pericial dependiente del Poder Judicial de la Provincia de Buenos Aires.

Introducción

Según el diccionario, se entiende por mancha a “una señal que una cosa hace en un cuerpo, ensuciándolo”. Desde el punto de vista forense, el estudio de las manchas de sangre reviste un gran interés ya que a partir de éstas, las técnicas empleadas hoy en día permiten llegar a resultados de gran certeza respecto de la persona a partir de la cual se originó la misma.

10.1 Búsqueda de las posibles manchas de sangreLa misma deberá ser sumamente minuciosa ya que estas pueden encontrarse sobre

cualquier superficie y lugar. En primer lugar debe considerarse que una mancha de sangre reciente es de color rojo brillante para, posteriormente, virar a un color pardo-rojizo y sin brillo.

El proceso de variación de su aspecto depende de diversos factores entre los cuales podemos mencionar la luz, la temperatura, la humedad y el soporte sobre el cual se encuentra asentada. En ese sentido, el color de la misma es una característica de sumo interés ya que sobre superficies oscuras, por ejemplo, la búsqueda suele complicarse y aquí hay dos elementos que resultan de utilidad: el empleo de luz con diferentes ángulos y la luz ultravioleta, aunque ésta última no es aconsejable dado las alteraciones que la misma puede ocasionar a nivel del material genético. Otra posibilidad, la constituye el empleo de las reacciones de orientación, las cuales veremos más adelante.

10.2 Recolección de las muestrasUn tema de vital importancia en este tipo de estudios lo constituye este paso, ya que de

una correcta toma de muestra en el lugar del hecho dependerán los resultados obtenidos. Un dato a tener en cuenta será el tipo de superficie sobre el cual se encuentra asentada la mancha y así, por ejemplo, sobre una superficie absorbente será fuertemente retenida mientras que sobre una superficie pintada o un mosaico pulido será fácil de desprender.

En cualquiera de los dos casos, una posibilidad para su obtención será embeber un papel de filtro o una tela blanca de algodón con solución fisiológica (S.F) o agua destilada, colocándolo sobre la mancha y presionando con cuidado. Posteriormente, el elemento utilizado se deja secar en corriente de aire. Para acelerar este proceso, puede utilizarse un secador de pelo, aunque esta operación debe hacerse con sumo cuidado a fin de evitar ocasionarle daños a ciertos componentes de la mancha que podrían, posteriormente, complicar (cuando no imposibilitar) su análisis.

En el caso de tratarse de una superficie pulida, una alternativa consiste en raspar la superficie con ayuda de un bisturí, colectando el material sobre un papel.

Cuando se trate de prendas manchadas tres precauciones son fundamentales: A – No doblar las prendas húmedas ya que podrían mancharse zonas que no lo estaban. B – Dejarlas secar en condiciones similares a las expuestas anteriormente.C – Una vez secas, las prendas deben ser envueltas preferentemente en papel madera y en forma separada.

Vale aclarar que cuando el soporte de la mancha es tal que el mismo puede ser remitido al Laboratorio, este es el camino a seguir guardando siempre las precauciones ya enunciadas. Cualesquiera sea el caso, su pronta remisión una vez obtenida la muestra es el procedimiento indicado.

183


10.3 Estudio de las manchas de sangreUna vez recepcionado el material en el laboratorio, el mismo se procesará según el

siguiente orden:1 – Descripción de las condiciones de remisión.2 – Descripción de los elementos motivo de pericia.3 – Reacciones de orientación.4 – Reacciones de certeza.5 – Determinación de especie.6 – Tipificación: Investigación del grupo sanguíneo, isoenzimas , sistema HLA, ADN

Descripción de las condiciones de remisión:La descripción de las condiciones en las cuales las muestras llegan al laboratorio resulta

un paso de sumo interés ya que el mismo debe cumplir ciertos requisitos, entre los cuales pueden mencionarse el que se encuentren correctamente rotulados y bajo condiciones de inviolabilidad, ya sea mediante lacre o bien precintos adecuados a tal efecto.

Descripción de los elementos motivo de pericia:La descripción de los elementos debe ser tal que en la misma se destaquen aquellas

características que permitan su identificación. Las manchas, en la medida de lo posible, deberán ser “ubicadas” y en ese sentido, resulta de suma utilidad acompañar la descripción con un esquema o figura de cada elemento en los cuales se indique la posición de las diferentes manchas. En este paso, al igual que en el precedente, son sumamente ilustrativas las fotografías.

Reacciones de orientación:Las reacciones de orientación, tal como su nombre lo indica, de ser positivas solo

expresan la posible presencia de sangre, adquiriendo un valor definitivo cuando resultan negativas, situación esta derivada de su gran sensibilidad.

Las mismas aprovechan la actividad peroxidásica del grupo hemo, la cual se pone en evidencia mediante el empleo de H2O2 y reactivos orgánicos que pasarán de una forma incolora a otra coloreada o bien luminiscente. Podemos representar lo antedicho de la siguiente manera:

H2O2 + peroxidasa H2O + O

O + Reactivo reducido Reactivo oxidado (coloreado o luminiscente)

Debemos tener en cuenta que diversas sustancias poseen una actividad similar a la del grupo hemo y de allí su inespecificidad. Entre ellas podemos mencionar las peroxidasas de origen vegetal y las sales de cobre y níquel.

Entre los numerosos reactivos utilizados para la realización de esta prueba, mencionaremos los siguientes (Fig. 10.1):

Ensayo de Adler: Emplea bencidina disuelta en ácido acético o bien en una mezcla de etanol y el

mencionado ácido. En caso de ser positivas dan color azul o azul-verdoso. Su sensibilidad es de 1: 250.000. Un dato de interés y que ha hecho que la misma caiga en desuso es la actividad carcinogénica de la bencidina. El reactivo se prepara en el momento de usar disolviendo 0,01 a 0,05g. del mismo en 10 ml de ácido acético glacial.

Ensayo de Pierre Medinger: Utiliza como reactivo la leucobase del verde de malaquita. De ser positiva origina un

color verde intenso. Es un reactivo que ha resguardo de la luz posee una aceptable estabilidad. Su sensibilidad es del orden de 1:100.000. Se prepara disolviendo 1g. de leucobase en 50 ml de ácido acético glacial, adicionando a continuación 150 ml de agua destilada. Guardar en frascos de color caramelo.

184


Reactivo de Kastle – Meyer: Emplea fenolftaleína reducida en medio alcalino originando, de ser positiva, el clásico

color rosado – rojizo de este colorante. Posee dos ventajas dignas de mención y que lo transforman en un reactivo altamente recomendable: su notable sensibilidad (1:1.000.000) y que el medio alcalino elimina muchas de las interferencias que afectan a estos ensayos.

El reactivo se prepara disolviendo en un matraz 20g. de KOH en 100 ml de H2O destilada, a los cuales se adiciona a continuación 2g. de fenolftaleína y 20g. de zinc en polvo. Se coloca un refrigerante a reflujo y se calienta hasta decoloración. Alcanzado este punto se filtra en caliente recogiendo el líquido en frascos de color caramelo conteniendo zinc en polvo.

Un detalle a tener en cuenta, es que la gran sensibilidad de este reactivo requiere de material estrictamente limpio para su preparación y conservación. Cualesquiera sea el reactivo a emplear, se puede proceder tal como se detalla a continuación:

a) A gotas de un macerado obtenido de la mancha en estudio en S.F. o agua destilada, se adicionan gotas del reactivo y a continuación gotas de H2O2 al 30%. La aparición del color correspondiente, según el caso, indica una reacción POSITIVA.

b) Una pequeña muestra obtenida del material en estudio se coloca en una cápsula de Petri, y se le adicionan gotas del reactivo y a continuación gotas de H2O2 al 30%. La aparición del color correspondiente al reactivo empleado indica una reacción POSITIVA.

La secuencia indicada para el agregado de los reactivos es importante ya que en algunoscasos, en forma previa a la adición del H2O2, ya se produce la aparición del color propio del indicador, situación esta que nos permite diferenciar una mancha supuestamente de sangre de otra que no lo es. En tal sentido, el cemento es un material que produce este tipo de fenómeno.

Fig. 10.1: formas químicas de las leucobases y sus formas coloreadas.

Finalmente, no podemos dejar de mencionar el ensayo del luminol (5-amino-2,3-dihidroftalazino-1,4-diona) el cual manifiesta una reacción positiva mediante la aparición de quimioluminiscencia. Resulta de suma utilidad para la localización de manchas no visibles en superficies grandes (por ejemplo pisos), las cuales se rocían con el reactivo. Posee una sensibilidad de 1:5.000.000 y una elevada especificidad aunque la misma no es total.

Para su empleo se deben preparas dos soluciones:Solución A: 0,1g de luminol y 0,5g de NaCO3H se disuelven en 50 ml de agua destilada

y se colocan en un recipiente no metálico.Solución B: Disolver 1,4g de perborato de sodio tetrahidrato en 50 ml de agua destilada

y colocar en un recipiente similar al anterior.

185


En el momento de emplear, volúmenes iguales de ambas soluciones se colocan en un rociador no metálico. Debemos recordar que el luminol reacciona con el hierro del grupo hemo y, por lo tanto, podría reaccionar con otros metales de modo similar.

Una vez preparada la mezcla, la misma es estable de 60 a 90 minutos y de allí que resulte conveniente hacerlo en pequeñas cantidades. Si bien se han detectado sustancias interferentes, en general, la intensidad, duración y color de estos falsos positivos no se corresponden con aquellos de la sangre diluída.

Un dato interesante lo constituye la estabilidad de las soluciones y su relación con la temperatura y así se ha observado que se obtiene buenos resultados cuando los reactivos se conservan separados durante 28 días a –18ºC o 4ºC, disminuyendo este período a 21 días si la temperatura asciende a 37ºC.

Reacciones de certeza:Son aquellas que nos permiten afirmar que una mancha es de sangre o bien descartar

esa posibilidad. Casi la totalidad de los estudios de este tipo se basan en la identificación del grupo hemo de la hemoglobina. La excepción la constituye la búsqueda de los elementos formes de la sangre, tal como los glóbulos blancos y/o rojos, hecho este que no es común en laboratorios forenses.

Entre las diversas técnicas que se han descripto, podemos mencionar las siguientes:

Cristales de Teichman: Se basa en la obtención de los cristales de hematina o hemina. La misma se realiza

dejando caer una gota de un macerado de la mancha en agua destilada o S.F. en el centro de un portaobjetos la que se lleva a sequedad calentando sobre un mechero en forma suave (la temperatura no debe superar los 60ºC.), repitiendo la operación (gota-secado) de dos a tres veces (Fig. 10.2).

Se cubre con un cubreobjetos y luego, por capilaridad, se adiciona ácido acético glacial (al que debe adicionarse ClNa en una concentración igual al 0.1% en caso de haber preparado el macerado con agua destilada) y a continuación calentar de manera algo más enérgica a la anterior. Repetir la operación una vez y luego observar al microscopio. La observación de cristales de color castaño a castaño claro y con forma de prismas alargados a rómbicos, indica una reacción positiva.

Una modificación digna de ser mencionada es la de Bertrand, para la cual se emplea el siguiente reactivo: Cl2Mg 1g., agua destilada 1 ml, glicerol (30% v/v) 5g. y ácido acético glacial 20 ml. La técnica se desarrolla de manera similar a la anterior pero ahora observaremos cristales algo más pequeños.

Fig. 10.2: Cristales de Teichman.

Cristales de Takayama: Se basa en la obtención de los cristales de piridino-hemocromógeno. El

hemocromógeno es un derivado obtenido por la desnaturalización y reducción consecutiva de la hemoglobina o de la oxihemoglobina, la cual posteriormente con una base origina las formas cristalinas típicas de este derivado. El reactivo a emplear está formado por 5 ml de una

186


solución de glucosa al 10%, 10 ml de HONa al 10%, 20 ml de piridina y agua destilada en cantidad suficiente para 100 ml

Se procede de modo similar al descripto precedentemente, aunque el calentamiento deberá ser suave luego del agregado del reactivo. Posteriormente observar al microscopio. La presencia de cristales de color rosado y con forma de helechos, pinceles o espinas indica reacción positiva.

Otra técnica de suma utilidad es aquella que emplea la cromatografía en placa delgada, la cual se basa en la obtención de Rf iguales para un extracto de la mancha en estudio y otro preparado a partir de una muestra de sangre (diluía 1:1000 en S.F.).

Como reactivo revelador se puede emplear una solución de leucobase del verde de malaquita en etanol al 1% adicionado de ácido acético a una concentración final del 0.5% (preparada en el momento) y H2O2 al 6%. Como fase estacionaria puede utilizarse silicagel G y como fase móvil el solvente formado por metanol : ácido acético : agua destilada en la relación 90 : 3 : 7. Cargar la cuba cromatográfica con la mezcla y aguardar no menos de 30 minutos antes de colocar la placa.

Se siembran las muestras a estudiar, el testigo y se desarrolla el cromatograma. Luego se retira la misma de la cuba y se lleva a 100ºC durante 5 minutos, operación esta que permite la destrucción de las peroxidasas de origen vegetal pero manteniéndose aquella de la sangre.

Luego rociar la placa con el reactivo del verde de malaquita y a continuación con el H2O2. La reacción se considera positiva si se observa la aparición de manchas de color verde de Rf 0,7 a 0,8.

10.4 Determinación de especieUna vez confirmada la presencia de sangre se procede a la determinación de la especie

de la misma, con el objeto de establecer si es humana o no. Estas reacciones adquieren una particular importancia en ciertos casos como, por ejemplo, de homicidio en los cuales se ha empleado un arma blanca, ya que de ser positivas, por un lado indican la presencia de sangre humana y, por otro, habilitan la investigación de parámetros conducentes a la identificación del individuo del cual procede la sangre encontrada.

De ser negativas, en cambio, deberán tenerse en cuenta una serie de factores de importancia: en primer lugar deberá evaluarse la posibilidad del uso de antisueros contra diversas especies animales ya que esta constituye, en la mayoría de los casos, la única manera de constatar que la sangre no es humana.

Por otro lado, deberán tenerse en cuenta las condiciones de la mancha en estudio ya que su antigüedad, presencia de hongos, putrefacción etc., son elementos que pueden sugerir la degradación de los elementos específicos a determinar. También deberá considerarse la cantidad de material a estudiar ya que no puede descartarse que la misma resulte insuficiente para las reacciones a practicar.

En lo que respecta a la determinación en sí, uno de los métodos, abandonado en la actualidad, se basa en la identificación de los elementos formes de la sangre tales como glóbulos rojos, blancos y / o plaquetas.

Hoy en día se emplean los métodos que utilizan los denominados sueros antihumanos, es decir, sueros capaces de reaccionar específicamente con elementos de la sangre (proteínas). Son reacciones de tipo antígeno-anticuerpo y dado los notables adelantos realizados en materia de anticuerpos monoclonales, los resultados obtenidos son altamente confiables.

De modo similar pueden emplearse antisueros capaces de reaccionar con sangre procedente de otras especies, aconsejándose, especialmente, el uso de aquellos contra animales domésticos o de campo como perro, gato, aves de corral, ganado ovino, bovino, porcino, etc.

10.4.1 Ensayo de las precipitinasComo se mencionó anteriormente, estos análisis consisten en una reacción antígeno-

anticuerpo visualizándose la misma mediante la formación de un precipitado (de allí su nombre) o bien, como ocurre con kits comerciales, por la aparición de bandas coloreadas.

187


Entre las condiciones que debe cumplir el antisuero a emplear pueden mencionarse: esterilidad; que se encuentre libre de turbiedad, en ese sentido la presencia de la misma hace desaconsejable su utilización; especificidad, es decir, debe reaccionar con muestras procedentes de la especie animal contra la cual fue preparada.

Finalmente, puede destacarse el título del antisuero como un dato de importancia siendo aquel de 1:10.000 el aconsejado.

En ese sentido, una forma de determinar el título del antisuero es la siguiente: preparar diluciones del suero a emplear en S.F., por ejemplo de 1:1.000 a 1: 32.000 en forma seriada. A continuación, en tubos de hemólisis adicionar 50 l del antisuero en estudio y luego, con sumo cuidado a fin de evitar que se mezclen, 100 l de las diferentes diluciones a ensayar y dejar en reposo.

La aparición antes de los 20 minutos de un anillo en la interfase suero-antisuero, indica una reacción positiva siendo aconsejable la utilización de un fondo oscuro e iluminación adecuada a fin de lograr una mejor visualización (Fig.10.3).

Fig. 10.3: Reacción de Precipitación.

Así, la recíproca de la última dilución que a temperatura ambiente produce una reacción visible en el tiempo mencionado será el título del antisuero.

Preparación de la muestra: Se realiza una dilución empleando Solución fisiológica siendo la concentración

adecuada de 1:1.000. A modo de ejemplo puede estimarse que 1 cm2 de tela manchada debe eluirse en 1 ml de la citada solución.Técnicas para la investigación de especie:

Método del tubo:Se procede tal como se indicó anteriormente para la valoración del antisuero, con la

salvedad que en lugar del suero diluido ahora colocamos 100 l del macerado de la muestra en estudio.

Una variante de esta técnica es aquella que emplea capilares en lugar de tubos. Para ello, uno de los extremos del capilar se sumerge en el antisuero y a continuación en el macerado. Luego se sella el otro extremo con plastilina o bien con calor. En el último caso deberá procederse con sumo cuidado a fin de evitar proyecciones.

Técnicas de difusión en agar:Una de las ventajas de ésta técnica consiste en el escaso consumo de antisuero

empleado al tiempo que permite el procesamiento de un buen número de muestras en forma simultánea.

Para su realización se prepara una solución de agar al 1-2% en agua destilada y a continuación con el auxilio de una pipeta se adicionan 5 ml de la misma sobre un portaobjeto de modo tal de lograr una capa uniforme. Debemos aclarar que la temperatura del agar debe ser próxima a aquella de su fusión y el agregado será lento y cuidadoso a fin de evitar que el mismo se derrame.

Una vez formado el gel de agar se procede a practicar orificios en el mismo pudiendo utilizar para ello un sacabocado.

188


En la figura se detalla la distribución de los mismos: Antisuero Muestra Muestra Antisuero

La cantidad de orificios en torno al central dependerá de la cantidad de muestra y de la habilidad del operador pudiendo repetirse la formación dos a tres veces por placa. Tanto el antisuero como las muestras pueden adicionarse mediante el empleo de pipetas Pasteur o bien capilares con cuidado de no rebalsar los hoyuelos. Entre muestra y muestra deberá cambiarse el elemento usado o bien realizar un buen enjuague del mismo con S.F.

Finalizada la operación se coloca la placa en cámara húmeda y se lleva a estufa a 37ºC durante 24 hs. Luego se procede a la lectura de los resultados siendo positivo aquellas en las cuales se observe un halo de precipitación entre la muestra y el antisuero (Fig. 10.4). La lectura deberá hacerse mediante el empleo de luz y fondo adecuado.

Fig. 10.4: Método de Outcherlony

Método electroforético:Esta técnica nos permite efectuar el ensayo en forma rápida y con resultados

satisfactorios. Básicamente, la técnica puede explicarse de la siguiente manera: el antisuero colocado en un orificio próximo al ánodo es enfrentado con un extracto sanguíneo ubicado en un hoyuelo del lado del cátodo.

Los antígenos presentes en el extracto son fundamentalmente albúmina y alfa y beta globulinas, mientras que los anticuerpos presentes en el antisuero son principalmente gamma globulinas. La electroforesis causa un movimiento anódico y al mismo tiempo un flujo endosmótico hacia el cátodo el cual se genera en el movimiento del líquido en sentido contrario al de la migración de la corriente.

De lo expuesto surge que mientras la corriente eléctrica “arrastra” los antígenos del extracto sanguíneo hacia el ánodo, las gamma globulinas lo hacen hacia el cátodo, pero impulsadas por el flujo endosmótico.

Sobre un portaobjeto limpio y desengrasado vertir 2 a 2,5 cc de solución de agar al 0,2 %. El agar a utilizar deberá ser grado electroforético con baja electroendosmosis, propiedades de suma importancia para la técnica a emplear. Dejar 30 a 40 minutos a temperatura ambiente y luego llevar a estufa a 65ºC por 90 minutos.

A continuación adicionar a esta capa 4,5 ml de agar al 2% de modo tal que esta tenga un espesor de 2 mm. Posteriormente practicar orificios en la capa de agar tal como se indicó anteriormente y según la siguiente distribución.

189


Los orificios deben tener un diámetro de 1.5 a 1.8 mm y separados, de a pares, una distancia de 3 mm.

Polo positivo (+) (-) Polo negativo

Una vez completada la placa colocar el antisuero de izquierda a derecha en los orificios de las hileras 1ra., 3ra., 5ta. y 7ma y las muestras en los orificios restantes, de modo tal que los líquidos queden al ras pero sin rebalsar.

A continuación agregar el buffer en la cuba electroforética y colocar el portaobjetos debiendo quedar las columnas con el antisuero del lado del ánodo. Una vez ubicada la placa hacer con papel absorbente los puentes correspondientes entre las mismas y los electrodos.

Efectuar la corrida electroforética según las siguientes condiciones: 150 voltios 20 minutos (aproximadamente 15 mAmp). La aparición de un halo de precipitación entre la muestra y el antisuero indica una reacción positiva.

Una vez leídos los resultados, puede revelarse la placa de la siguiente manera: Sumergir el portaobjetos en solución de ClNa 1 M durante una noche y luego lavar con agua durante 5 minutos (para tal operación, la placa se sumerge en una cuba conteniendo agua destilada dejándola el tiempo mencionado). A continuación secar o bien colocar papel de filtro Whatman Nº1 sobre el gel y llevar a 60ºC. Esta operación deberá ser efectuada con sumo cuidado a fin de no dañar el gel. Retirar el papel siendo conveniente que se encuentre húmedo. Concluida esta operación se expone la placa a la acción de la solución colorante (ver más adelante) durante 5 minutos. Transcurrido ese lapso, eliminar el exceso de esta solución con solución de lavado (ver más adelante), dando por concluida esta operación cuando se observa la aparición de bandas de color azul sobre un fondo claro.

De producirse precipitados inespecíficos se aconseja diluir el o los extractos.Reactivos:

Agar al 0,2 % y 2% en agua bidestilada / desionizada. Agar para inmunoelectroforesis Oxoid.

Buffer gel pH 8,6 : Barbiturato de Sodio 7,00 g ; ácido dietilbarbitúrico 1,10 g; lactato de calcio 1,00 g y agua bidestilada csp. 1 l. Conservar a 4ºC.

Gel de agar mezclar volúmenes iguales de agar al 2% y Buffer gel Buffer Cuba pH 8,6, barbiturato de sodio 8,76g ; ácido dietilbarbitúrico 1,38g; lactato de

calcio 0,38 g; agua bidestilada csp 1 l conservar a 4º C. Solución 1 M de cloruro de sodio. Solución colorante, 0,10 g de negro amido 10 B y disolverlos en 100 ml de solución de

lavado, la que está constituida por metanol: agua bidestilada: ácido acético glacial en la relación 40: 50:10.

Una variante de esta técnica emplea un buffer (pH 8,4) constituido por: tricina ( sigma T-0377) 4,5 g (0,025 M); tris base ( sigma T-1503) 9 g (0,074 M); agua bidestilada csp 1 Lt. También puede emplearse la siguiente mezcla: glicina (sigma G- 7126) 21,8 g ; tris base 4,5 g y agua bidestilada csp 1Lt .

En esta técnica se emplea agar al 0,2 % pero, a continuación, se utiliza una solución de agarosa al 1% en uno de los buffer descripto previamente. El resto de la metodología es idéntica a la ya detallada.

Por otra parte, para este tipo de estudio hoy en día pueden emplearse kit comerciales destinados al análisis de sangre oculta en materia fecal, los cuales ofrecen muy buenos resultados y poseen entre sus ventajas la velocidad en la determinación. Así, por ejemplo, el Hem-check-1 (Veda Lab-France) emplea una única combinación de anticuerpo monoclonal conjugado y anticuerpo monoclonal en fase sólida para identificar hemoglobina humana, realizándose el test en tan solo 10 minutos. Esta determinación es de carácter presuntivo.

190


Investigación de grupo sanguíneo:Una vez constatada la especie de la muestra de sangre en estudio se procede a su

tipificación, pudiendo determinarse para tal fin el grupo sanguíneo (sistemas ABO, MN, etc.), patrón de isoenzimas, proteínas polimórficas y ADN.

Con test de éste tipo, sin el análisis de ADN, la probabilidad típica que una pieza específica no pertenezca a un sospechoso particular está en el rango de 1:100 a 1:10.000 dependiendo de las proteínas particulares y el número de las mismas estudiadas. Por otra parte, el uso de ADN polimórfico puede resultar en probabilidades tan bajas como 1:1019 que dos muestras cotejadas no sean de un mismo individuo.

Sistema ABO:En las manchas de sangre seca los glóbulos rojos en general están destruidos, sin

embargo, los antígenos responsables de la especificidad de grupo mantienen su capacidad para reaccionar con los anticuerpos específicos. Claro está que, en éstas condiciones, las técnicas de aglutinación directa no son aplicables.

Pueden investigarse tanto las aglutininas (anticuerpos anti-A y anti-B) como los aglutinógenos A, B y O. Por ser las más utilizadas se detallarán aquellas técnicas orientadas a detectar la presencia de los últimos.

Método de absorción – inhibición: Esta técnica puede utilizarse no solo en manchas de sangre, sino también en otros fluidos

biológicos tales como saliva y semen. Básicamente el método consiste en enfrentar la mancha en estudio con un antisuero de título conocido, al cual transcurrido un cierto tiempo se lo retitulará. Una disminución del título original indicará la presencia del antígeno investigado. Así, si disminuye aquel correspondiente al suero anti-A, la muestra pertenecerá al grupo A, si lo hace en el anti-B será B, y, si disminuyera en ambos, será AB.

De no observarse disminución en ninguno de los dos antisueros, la muestra sería O, aunque deberá confirmarse por otra metodología dado que los aglutinógenos podrían estar destruidos.

Para la realización de la técnica se procede de la siguiente manera: Cortar 1 cm2 de tela manchada y dividirlo a la mitad, repitiendo esta operación con una zona de la tela no maculada la cual oficiará como blanco. A cada uno de los trozos se los coloca en una policubeta tal como se indica en la siguiente figura:

Muestra Blanco Blanco Muestra

Adicionar a los dos primeros trozos de tela 2 gotas de suero anti-A y a los dos últimos una gota de suero anti-B. Dichos antisueros deberán ser previamente titulados y la dilución a emplear debe ser tal, que se produzca una aglutinación visible hasta la última dilución a realizar en esta técnica. En ese sentido digamos que los autores indican la dilución de 1 / 32 como aquella a emplear pero es aconsejable la titulación previa a fin de evitar inconvenientes.

191


A continuación se fragmentan las fibras con la ayuda de agujas de disección comenzando siempre por el blanco. Luego de cada muestra es conveniente cambiar las agujas o bien enjuagarlas. Luego colocar las placas en cámara húmeda y dejar una hora a temperatura ambiente.

Trascurrido ese lapso proceder a retitular los antisueros. Para ello adicionar a cada hoyuelo de la policubeta una gota de S.F. y a continuación tomar una gota del antisuero en contacto con la muestra y adicionarlo a la primera gota de S.F. Mezclarlas y pasar una gota de esta dilución a la siguiente concavidad procediendo de igual manera hasta la última de esta, de modo tal de obtener diluciones seriadas al medio. Es conveniente practicar no menos de 7 diluciones para cada muestra.

Proceder de igual manera con el blanco y el resto de las muestras con la precaución de enjuagar bien el material empleado entre muestra y muestra. Posteriormente, adicionar a las diluciones de las muestras y blanco en las que se investiga el aglutinógeno A una suspensión de glóbulos rojos A en S.F. al 1,5%. Es aconsejable lavar previamente los glóbulos rojos 3 veces en S.F. previo a la preparación de la suspensión. Repetir la operación para aquellas muestras y blancos en las cuales se investiga el aglutinógeno B, pero con una suspensión de glóbulos rojos B.

Completada esta operación agitar con cuidado de no mezclar los contenidos de las concavidades e incubar en cámara húmeda observando, o no, la presencia de aglutinación cada 10 a 15 minutos agitando en cada caso y por un lapso de 30 minutos.

La ausencia de aglutinación en una de las muestras o una disminución de no menos de 3 concavidades del título en esta respecto de su blanco indica la presencia del aglutinógeno investigado. Para facilitar la lectura es aconsejable la utilización de un elemento de aumento como puede ser una lupa.

Como datos a tener en cuenta para obtener resultados confiables podemos mencionar los siguientes: las muestras deberán procesarse con guantes , no sólo por razones de seguridad sino porque, de ser secretor, por medio de la transpiración se transmitirían los aglutinógenos propios al material investigado.

Tanto el agregado inicial de los antisueros como su posterior dilución deben realizarse con sumo cuidado ya que cualquier error puede traducirse en un resultado incorrecto.

Método de absorción – elución:Esta técnica ofrece excelentes resultados y puede ser empleada tanto para el sistema

ABO como para el MN. También puede utilizarse para el estudio del sistema Rh aunque los resultados suelen no ser confiables y de allí que su realización sea desaconsejada por muchos autores.

El fundamento de esta técnica es el siguiente: las muestras en estudio se ponen en contacto con antisueros específicos a fin de formar los correspondientes complejos antígeno-anticuerpo. Luego se elimina el exceso de anticuerpo, y se calienta a 50ºC a fin de romper el inmunocomplejo de modo tal que los anticuerpos liberados pueden ponerse de manifiesto mediante el agregado de una suspensión de glóbulos rojos con los cuales darán lugar a la típica reacción de aglutinación.

Para el estudio del sistema ABO se procede de la siguiente manera:1- Sobre una hoja de policarbonato de 10 x 15 cm y 1 mm de espesor se marcan

cuadrados de aproximadamente 1,5 cm de lado.2- Se toman muestras de hilo de 2 a 5 mm de longitud y se adhieren a la placa por uno de

sus extremos mediante el empleo de, por ejemplo, acetato de celulosa. (ver figura).

M : MuestraBl : BlancoT : Testigo

192

Anti A Anti B Anti H Controles M

Bl

T


3- Una vez seco el adhesivo adicionar a cada hilo una gota del antisuero indicado en la columna respectiva. Para la dilución a emplear valen las mismas consideraciones hechas previamente. El hilo debe quedar totalmente sumergido en el antisuero.

4- Incubar durante no menos de 3 hs. a 4 º C en cámara húmeda siendo aconsejable dejarlo toda la noche

5 -A continuación lavar la placa con S.F. a 4º C con ayuda de una piseta. Secar con papel de filtro con sumo cuidado y sumergir a un recipiente con S.F. a 4 º C durante 30 minutos con agitación suave y constante.

6- Retirar la placa y secar con papel de filtro.7- Agregar una gota de la suspensión de glóbulos rojos adecuada según el antisuero

utilizado. La misma se prepara en S.F. con el agregado de albúmina bovina al 0,3 % con una concentración del 0,1 %. Los glóbulos rojos deben lavarse 3 veces con S.F. empleando sangre heparinizada. Llevar a cámara húmeda y luego a estufa a 50 º C durante 15 minutos.

8- Retirar de la cámara húmeda y colocar la placa en un agitador de baja velocidad durante 30 minutos.

9- Observar la presencia o no de aglutinación con ayuda de un microscopio. Así, de verificarse esta en la columna anti A, indica que esa muestra corresponde al grupo A.

En esta técnica es aconsejable el uso de controles de los grupos 0, A , B y AB.Si bien las técnicas descriptas precedentemente son de suma utilidad y ofrecen resultados confiables, la determinación de grupo sanguíneo se puede efectuar mediante una serie de métodos alternativos entre los cuales podemos citar aquellas por inmunoensayo en fase sólida, en la cuales uno de los reactantes se fija a una fase sólida dentro de las cuales el plástico constituye una de las más utilizadas. En tal sentido, tubos de 0,25 o 0,50 ml colocados en dispositivos adecuados a tal efecto o bien policubetas del citado material constituyen una buena alternativa.

Así, una metodología de este tipo, es la siguiente: En un primer paso se produce la inmovilización de los aglutinógenos ABO presentes en la mancha a la fase sólida. Para tal fin, hilos de la tela manchada o bien gasa embebida en un macerado de las manchas presente en un material diferente a una tela absorbente (por ejemplo un cuchillo, una tela sintética, etc), son colocados en las cubetas o tubos por pares a fin de investigar la presencia de antígeno A en uno de ellos y el B en el restante, cargándolo hasta las 2/3 partes de su capacidad con una solución de NH3 al 5%. Se maceran los hilos en la solución y luego se los retira (la solución idealmente debe alcanzar una coloración rojo-castaño) y se los retira con el auxilio de una pinza o un elemento adecuado a tal efecto.

Luego incubar en estufa a 70ºC durante 15 minutos (sin cámara húmeda) y otros 20 minutos a 62ºC en idénticas condiciones. Posteriormente lavar con solución de ClNa 0.15 M o S.F. sumergiendo a tal fin las policubetas en la misma y dejando en reposo durante 2 minutos. De este modo se eliminan aquellas partículas no fijadas o débilmente adsorbidas.

A continuación las cubetas se cargan con los sueros anti-A y anti-B ya sea sin diluir o diluidos 1:2 hasta las 2/3 partes de su capacidad incubando a 4ºC durante 40 minutos y con cámara húmeda. En este paso se producirá la unión antígeno-anticuerpo correspondiente.

Cumplido el tiempo de incubación se procede a efectuar dos lavados consecutivos tal como se indicara anteriormente pero durante 5 minutos cada uno. Este paso tiene por objeto la eliminación de aquellos anticuerpos excedentes.

Luego se procede a adicionar suspensiones de glóbulos rojos al 2% correspondientes al Grupo A y B según corresponda y se incuba a 55ºC durante 15 minutos. Tal como hemos visto anteriormente, en esta etapa se produce la elusión de los anticuerpos, de allí que tanto la temperatura como el tiempo de incubación resulten de suma importancia.

A continuación colocar las cubetas en un agitador mecánico durante 15 a 20 minutos. La agitación no debe ser enérgica dado que de otra manera se desorbe el material de la fase sólida provocando aglutinación de tipo inespecífico, procediendo posteriormente a la observación microscópica. Para tal fin, se resuspende el depósito de los pocillos con ayuda de una pipeta Pasteur (con precaución de no tocar las paredes de los mismos), colocar una gota

193


de cada uno en un portaobjetos y observar con objetivo de 10X. La presencia de aglutinación indica un resultado positivo para la presencia del antígeno en cuestión.

Por último, en relación a este tema, digamos que se han desarrollado numerosas técnicas de tipo electroforético que permiten no solo la determinación del grupo sanguíneo sino también el análisis del polimorfismo del sistema ABO, las cuales no serán expuestas en el presente capítulo.

Bibliografía

Manchas de sangre. Capítulo IV. Tratado de Criminalística. Tomo II. La Química Analítica en la Investigación del Delito. Editorial Policial, 1.983.

Nuevas Aportaciones a la Medicina Legal del Hemocromógeno. Gisbert Calubuig J.A. Rev. Med. Legal, 1.948 (3). Madrid.

SWAFS, IEF Workshop. Tucson, Arizona. EEUU. October 1.991. Curso de entrenamiento en el análisis de manchas de sangre. Crime Laboratory, Tucson

Police. Arizona. EEUU. La Evidencia Médico Legal en Delitos Contra las Personas y Muertes Violentas. Dr. R

Martín Laguens. Colaboradores Luis A. Ferrari, Roberto E.Federici, Néstor P. De Tomas. Suprema Corte de Justicia de la Provincia de Buenos Aires. Pp 53 – 58. 2.000.

Budowle B, Leggitt JL, Defenbaugh DA, Keys KM, Malkiewicz SF. The presumptive reagent fluorescein for detection of dilute bloodstains and subsequent STR typing of recovered DNA. J Forensic Sci 2000;45(5):1090–1092.

Inhibition of Bleach-Induced Luminol Chemiluminescence, Erina J. M. Kent,1 M.Sc.; Douglas A. Elliot,1,2 Ph.D.; and Gordon M. Miskelly,1 Ph.D., J Forensic Sci, Jan. 2003, Vol. 48, No. 1.

The effect of luminol on presumptive tests and DNA analysis using the polymerase chain reaction, Gross AM, Harris KA, Kaldun GL. J Forensic Sci 1999;44(4):837–840. Análisis Serológico. División Laboratorio FBI. Capítulo V. Examination and Typing of Bloodstains in the Crime Laboratory. LEAA 1.971, pp 62 – 66,

Culliford GJ. DNA Profiling. New Tool Links Evidence to Suspects With High Certainty. Special Report.

John I. Thornton. C&EN. November 20, 1.989. Distribution by American Chemical. Luminol. What’s Glowing On?. Perkins J.D.Swafs. Journal; Vol 13 Nº 2, October 1.991. Agarose Gels: Properties and Use for Electrophoresis. Review Serwer P. Electrophoresis

1.983, 4, 375 – 382. Hemotipificación de Muestras Proveninentes de Manchas Secas Según Sistemas de

Alutinógenos “ABO” por Inmunoensayo no Competitivo Directo en Fase Sólida. Laboratorio Químico de la Policía de Entre Ríos. II Congreso Internacional de Criminalística. Paraná 15, 16 y 17 de Agosto de 2.001.

Encyclopedia of Forensic Sciences, Three-Volume Set, Edited By Jay Siegel , Michigan State University, East Lansing, U.S.A. Geoffrey Knupfer , National Training Center for Scientific Support to Crime Investigation, Harperley Hall, Crook, UK , Pekka Saukko , University of Turku, Finland, Elsevier, 2000.

194

Capítulo 10

Documents

Transcript of Capítulo 10