CAPÍTULO 1 Terminología, microscopia y técnica … · 1 1.1 Terminología básica Citología La...

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1.1 Terminología básicaCitología La citología investiga todas las estructuras y lasfunciones de la célula. Las estructuras de las células se estu-dian con microscopios y las funciones celulares por mediode métodos bioquímicos, biomoleculares, inmunohistoquí-micos e histoquímicos. La citología también se denominacitobiología y en la actualidad se conoce sobre todo comobiología celular. Es una clave fundamental para la compre-sión de todas las funciones de los tejidos y los órganos.

Correlación clínica El término citología se utiliza en clíni-ca para referirse al diagnóstico de extendidos celulares uotros preparados de células individuales.

Histología En sentido estricto la histología es el estudio delos tejidos. Los tejidos corresponden a un plano intermediode organización del cuerpo y consisten en “asociaciones decélulas con diferenciación semejante y sus derivados, las sus-tancias intercelulares” (W. Bargmann, 1906-1976), que pue-den clasificarse según determinados criterios. En la actuali-dad se distinguen 4 tejidos básicos: tejido epitelial, tejidoconjuntivo (incluidos los tejidos de sostén), tejido musculary tejido nervioso. Esta clasificación se remonta a AlbertKölliker (1817-1905). Todos los órganos están compuestospor variantes específicas de los cuatro tejidos básicos. Dadoslos conocimientos citobiológicos y ontogénicos modernoslos límites entre estos tejidos se desdibujan: los miofibro-blastos, por ejemplo, poseen características específicas de losfibroblastos y de las células musculares lisas, en algunos ani-males invertebrados las células musculares estriadas puedenser células epiteliales y el tejido nervioso exhibe coinciden-cias específicas con el tejido epitelial.

Anatomía microscópica La anatomía microscópica seocupa del estudio de cada una de las configuraciones espe-

cíficas que adoptan los grupos de células y tejidos en losórganos individuales. En consecuencia también se conocecomo “histología de los órganos” o histología especial,dado que requiere el conocimiento de la citología y la his-tología y lo aplica a los órganos. Consiste en la compren-sión de las funciones de los órganos bajo la consideraciónconcreta de las circunstancias morfológicas microscópicasópticas y electrónicas.

1.2 Microscopios

1.2.1 Microscopia ópticaEl microscopio óptico se inventó en el siglo XVII (Antonivan Leeuwenhoek, 1632-1723) y desde entonces se ha per-feccionado en forma incesante. Permite una magnificaciónde hasta 1.000 veces y es el instrumento más importantepara la enseñanza de la histología, para el diagnóstico clí-nico y anatomopatológico y para la investigación en la bio-logía celular. Funciona con una fuente luminosa eléctricacuyos rayos iluminan y atraviesan el preparado desde abajo(microscopia de luz transmitida). En la enseñanza tam-bién aparecen cada vez con más frecuencia los preparadosdigitalizados.

Estructura Un microscopio óptico en esencia está com-puesto por una fuente luminosa incorporada en el pie delmicroscopio (cuya luz atraviesa el preparado y el sistemade lentes del microscopio), un sistema de lentes condensa-dor, una platina (sobre la cual se coloca el preparado his-tológico que se desea examinar), objetivos (los aumentoscorrientes son de 4, 10, 20 y 40 ×) y un ocular (parte supe-rior del microscopio a través de la cual se mira; en la mayo-ría de los casos el aumento es de 10 ×) o mejor 2. Los sis-temas de diafragmas aumentan la claridad del preparado.

1.1 Terminología básica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1

1.2 Microscopios . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11.2.1 Microscopia óptica. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11.2.2 Microscopia electrónica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21.2.3 Poder de resolución y órdenes de magnitud. . . . . 3

1.3 Realización de preparados para la microscopia óptica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3

1.3.1 Fijación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31.3.2 Inclusión. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31.3.3 Corte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41.3.4 Coloración . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4

1.3.5 Artefactos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81.3.6 Preparados vivos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8

1.4 Realización de preparados para la microscopia electrónica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8

1.4.1 Microscopia electrónica de transmisión . . . . . . . . . 81.4.2 Microscopia electrónica de barrido . . . . . . . . . . . . . . 9

1.5 Interpretación de los cortes histológicos . . . . . 91.5.1 Mensaje de los cortes histológicos . . . . . . . . . . . . . . 91.5.2 Reglas básicas para la realización

del diagnóstico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9

CAPÍTULO

1 Terminología, microscopia y técnica histológica

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Welsch: Sobotta. Histología. 3ª EDICIÓN © 2014 Editorial Médica Panamericana

http://www.medicapanamericana.com/Libros/Libro/4782/Sobotta-Histologia.html

Aumentos La imagen aumentada que producen los objeti-vos se aumenta todavía más por la acción del ocular. Elaumento total con el que puede observarse un preparadose obtiene del producto entre el aumento del objetivo y elaumento del ocular (p. ej., un objetivo 4 × y un ocular 10 × producen un aumento total de 40 ×).

Tipos En la investigación se utilizan microscopios especia-les (Cuadro 1.1).

1.2.2 Microscopia electrónicaEl microscopio electrónico comenzó su desarrollo en ladécada del 30 del siglo XX y trajo consigo un aumento con-siderable de la resolución óptica.

Aumento En la práctica rutinaria permite obtener aumen-tos de bastante más que 100.000 veces (100.000 ×).

Tipos Se distinguen los siguientes tipos de microscopioselectrónicos:

• En el microscopio electrónico de transmisión (MET)en lugar de usarse la luz visible, con su longitud de ondanatural, se utilizan haces de electrones, cuya longitud deonda es mucho menor. En los microscopios óptico yelectrónico el trayecto de los rayos en principio es seme-jante. En lugar de lentes de cristal en el MET se usan lasllamadas lentes electrónicas (bobinas electromagnéti-cas). La fuente de electrones es un cátodo; el haz electró-nico es acelerado por alta tensión y transcurre por untubo al gran vacío. La imagen se observa mediante unalente de aumento binocular sobre una pantalla fluores-cente. Con la ayuda del MET pueden analizarse cortes detejido pequeños (1-3 mm2), muy delgados (30-80 nm)(cortes ultrafinos), preparados mediante una técnicacostosa y, en la práctica, como continuación de lamicroscopia óptica. El MET también permite el análisisde las réplicas finísimas que se preparan en el ámbito delos métodos de criofractura.

• El microscopio electrónico de barrido (MEB) funcionasin lentes formadoras de imágenes. Un preparado seexplora (“barre”) en líneas secuenciales con un haz de

2 1 Terminología, microscopia y técnica histológica

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Cuadro 1.1 Ejemplos de microscopios ópticos especiales

Microscopio

Microscopio de contraste de fase

Microscopio de interferencia (de Nomarski)

Microscopio de fluorescencia

Microscopio de polarización

Videomicroscopio

Microscopio confocal de barrido láser

Aplicación

Observación de células (de cultivos,protozoarios) vivas (con frecuencia sinteñir)

Estudio de células vivas y también depreparados inmunohistoquímicos en losque sólo están teñidas células aisladasy su entorno carece de tinción

Análisis de estructuras celulares auto-fluorescentes o estructuras a las que seles unen fluorocromos

Detección y análisis de estructuras muybien ordenadas, por ejemplo fibrillascolágenas de distribución paralela ofascículos de filamentos de miosinaorganizados en forma paralela en lasbandas A de la célula muscular esque-lética o cardíaca

Estudio de células vivas (p. ej., puederastrearse la migración de partículasminúsculas dentro de la célula)

Análisis de preparados gruesos, determinación de la distribución subcelular de las proteínas y los metabolitos, observaciones de fenóme-nos que transcurren en el tiempo (p. ej., la reorganización dinámica delcitoesqueleto durante la fagocitosis)

Fundamentos técnicos

• Intensifica el contraste de las estructuras celulares queapenas son visibles en el microscopio de luz transmitidacorriente

• El objeto (el preparado) mismo actúa como divisor del rayoluminoso para complementar trayectos de ondas luminosascapaces de interferir

• El haz luminoso se divide antes de atravesar el preparadopor la acción de un dispositivo optomecánico específico

• De una eficacia particular es la microscopia de epifluorescencia, en la cual los rayos excitadores llegan alobjeto desde arriba

• La imagen fluorescente puede desvanecerse con rapidez

• En la luz polarizada las estructuras con un grado alto deorden se comportan birrefringentes (anisótropas); brillancon claridad cuando transcurren diagonalmente entre dosfiltros de polarización cruzados

• Los componentes estructurales con un orden irregular secomportan monorrefringentes (isótropos) y permanecensiempre oscuros en el microscopio de polarización

• Utiliza una videocámara de gran resolución; en caso necesario la imagen visible en una pantalla puede manipularse electrónicamente

• El procedimiento recibe el nombre de “contraste de interferencia diferencial videopotenciado” (VE-Dic = Video-enhanced differential interference contrast) y consisteen la intensificación de las manifestaciones (señales)luminosas débiles y de escasa magnitud.

• Un haz láser (en la mayor parte de los casos un láser decriptón-argón) barre el preparado

• La imagen obtenida se descompone en planos individualesy se rearma en una imagen tridimensional

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electrones compacto. Para la formación de la imagen sir-ven los electrones retrodispersados (electrones secunda-rios). El detector es un disquillo de centelleo. Las señalesluminosas de este disquillo son intensificadas por unfotomultiplicador y retroconvertidas en señales eléctri-cas. La imagen del MEB, que de nuevo se ve en una pan-talla fluorescente, aparece sucedáneamente a través deun barredor de líneas. Con el MEB se observan superfi-cies naturales (o también artificiales) de objetos (epite-lios, células, fibras extracelulares, sustancias duras, órga-nos, animales enteros, etc.). Antes de la observación en elMEB el objeto tiene que deshidratarse y cubrirse conuna película delgada de metal noble (sombreado).

• El microscopio electrónico de barrido de efecto túnelpermite el análisis de superficies con una resolución ató-mica. Aquí sólo pueden examinarse superficies de barri-do minúsculas (de alrededor de 1 μm2).

1.2.3 Poder de resolución y órdenes de magnitud

El límite de resolución del ojo desnudo es de alrededor de0,08 mm, por lo cual puede identificar estructuras de nomenos de 100 μm de diámetro. El microscopio óptico omicroscopio de luz tiene un límite de resolución de apro-ximadamente 0,3 μm (en la práctica, un aumento de alre-dedor de 1.000 veces), con lo cual pueden identificarsebien células y bacterias. Los órdenes de magnitud habitua-les de la microscopia óptica oscilan entre unos pocos milímetros (mm) y algunos micrómetros (μm, 1 mm =1.000 μm). El microscopio electrónico tiene un límite deresolución de alrededor de 0,3 nm; esto permite el estudiode virus y de la ultraestructura de las células y de las aglo-meraciones proteicas grandes (filamentos citoplasmáticos)o los biopolímeros (p. ej., glucógeno). Los órdenes de mag-nitud de la microscopia electrónica de rutina en su mayorparte oscilan entre varios micrómetros y unos pocos nanó-metros.

El Cuadro 1.2 ofrece un panorama general sobre los órde-nes de magnitud de diferentes células y componentes celu-lares.

1.3 Realización de preparados para lamicroscopia óptica

Los métodos reseñados a continuación se utilizan para rea-lizar los preparados histológicos habituales en la prácticade la anatomía, la anatomopatología y la investigación clí-nica así como en los cursos de histología (Fig. 1.1):• Fijación• Inclusión• Realización de los cortes• Coloración

1.3.1 FijaciónObjetivo La fijación debe:• Mantener en la medida de lo posible el tejido en su esta-

do natural y evitar su desintegración o su autólisis,• Endurecer el material y así conseguir una mejor capaci-

dad de corte,• Eliminar las bacterias u otros agentes etiológicos de

enfermedades que existan en la muestra para el examen.

Procedimiento Con frecuencia las muestras de tejido sen-cillamente se sumergen en las soluciones fijadoras (fijaciónpor inmersión). Un resultado mejor se consigue con laayuda de la fijación por perfusión, mediante la cual elórgano que debe fijarse se infiltra con el medio de fijacióna través de su propio sistema vascular y así se fija.

Imagen de equivalencia Muchos medios de fijación, porejemplo, la solución de formaldehído neutra al 5%, el ácidopícrico, el sublimado corrosivo y el alcohol, son precipitantesde las proteínas y formadores de redes proteicas. En conse-cuencia, con estos fijadores se produce una transformaciónmás o menos obvia de la estructura natural de la célula vivay la imagen histológica sólo constituye un equivalente deltejido vivo que no es idéntico a él. Con la imagen de equiva-lencia puede trabajarse bien pero es imprescindible reunirintelectualmente los resultados de muchos métodos diferen-tes para hacerse una idea de la célula viva y su dinámica.

Nota Ni siquiera la mejor de las técnicas de preparaciónde células y tejidos puede lograr jamás una reproduc-ción perfecta de la célula viva. Por consiguiente, se hablade una imagen de equivalencia.

1.3.2 InclusiónObjetivo Las muestras de tejido fijadas se colocan en undisolvente adecuado para poder incluirlas en parafina líqui-da y luego cortarlas, una vez que la parafina se solidifica.

Procedimiento En primer lugar las muestras fijadas sesumergen en un disolvente adecuado, una serie gradual dealcoholes de concentración creciente. En esta fase de la rea-lización del preparado pueden surgir diversos artefactos,como retracciones y desgarros del tejido. A continuaciónlas muestras se incluyen en parafina o mejor en Paraplast.En forma alternativa para la inclusión puede utilizarse unaresina sintética (p. ej., metacrilato; en el texto que sigue y

1.3 Realización de preparados para la microscopia óptica 3

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Cuadro 1.2 Ejemplos de órdenes de magnitud de diferentes células y componentes celulares.

Célula/componente celularÓvulo diferenciado

Célula del epitelio intestinal(altura)

Célula epitelial del hígado(según el estado funcional)

Linfocitos

Eritrocitos

Mitocondrias (longitud)

Microvellosidades (intestino delgado)

Bacterias

Virus

Partícula de glucógeno (partícula β)

Filamento de queratina (diámetro)

Tamaño≅ 250-300 μm

≅ 20-25 μm

≅ 15-30 μm

≅ 8 μm

≅ 7,6 μm

≅ 2-5 μm

≅ 1-1,5 μm

≅ 1-2 μm

≅ 10-100 nm

≅ 20 nm

≅ 10 nm

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en los epígrafes de las figuras, los preparados incluidos enesta forma se identifican con la palabra “plástico”). Loscortes de material incluido en plástico tienen un espesor desólo 1-2 μm y muestran las estructuras celulares e hísticasmás claramente que los cortes de material incluido enparafina, en los cuales muchas estructuras aparecen super-puestas. Otra posibilidad es la congelación (criomicrosco-pia), en la cual se logra el endurecimiento de la muestra detejido mediante la colocación de los fragmentos de órga-nos frescos en nitrógeno líquido. Luego se procede al cortedel material congelado en un micrótomo de congelaciónespecial. Este procedimiento evita la extracción del agua(deshidratación), que se asocia con el peligro de retraccióndel tejido, y los solventes orgánicos que disuelven los lípi-dos. Así, muchos componentes moleculares de los tejidosse mantienen en su configuración natural y luego puedendemostrarse con métodos histoquímicos, por ejemplo, lasenzimas de la cadena respiratoria. La preparación de cortespor congelación puede realizarse con mucha rapidez, demodo que es posible, por ejemplo, efectuar un diagnósticohistológico intraoperatorio.

1.3.3 CorteObjetivo Se realizan cortes finos que luego puedan colo-rearse.

Procedimiento Para la microscopia óptica de rutina serealizan cortes de unos 5-8 μm de espesor; con inclusiónen resinas sintéticas los cortes pueden ser de sólo 1-2 μm.La realización de los cortes requiere instrumentos especia-les (micrótomos). La criomicroscopia exige micrótomosde congelación especiales.

1.3.4 ColoraciónObjetivo Los diversos elementos celulares e hísticos captanlos colorantes con afinidad variable y así pueden distin-guirse mejor.

Procedimiento Las soluciones colorantes habituales en sumayoría son soluciones acuosas. Por esta razón, el corte tieneque desparafinarse y rehidratarse en pasos intermedios adi-cionales. Luego los diversos elementos celulares e hísticos


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Obtenciónde tejido fresco

Fragmentodel tejido obtenido

Cortes delfragmento aptospara la fijación

Fijación, porejemplo en formaldehído

Deshidratación en seriealcohólica de

concentración creciente

Inclusión, por ejemploen parafina o Paraplast

Bloque deparafina listo

Corte en micrótomo concuchilla de acero

Colocación y secadodel corte sobreun portaobjetos

Eliminación de la parafinacon xileno

Serie alcohólica deconcentración decreciente

Coloración de los cortes

Serie alcohólica deconcentración creciente

Montaje del cortecoloreado en un medio de

montaje bajo un cubreobjetos(preparado durable)

Fig. 1.1 Realización de preparados. Representación de los pasos consecutivos que se requieren para obtener, a partir deuna muestra de tejido fresco, un corte histológico coloreado (5-8 μm de espesor) apto para el examen microscópico óptico.(De [1])

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captan los colorantes de modo diferente. Los componentescon cargas eléctricas negativas (componentes aniónicos),como el DNA, captan colorantes básicos (catiónicos), porejemplo, la hematoxilina, y se llaman basófilos (p. ej., elnúcleo celular, algunas mucinas, proteoglucanos extracelula-res y las granulaciones de Nissl). Los componentes celularese hísticos con cargas eléctricas positivas, o sea los componen-tes catiónicos, captan los colorantes ácidos (aniónicos) y sedenominan acidófilos o eosinófilos, porque el coloranteácido de uso más frecuente se llama eosina. Los colorantesácidos tiñen, por ejemplo, los eritrocitos y el colágeno.

Nota• basófilo = aniónico (cargas eléctricas negativas),

capta colorantes básicos (p. ej., cromatina nuclear,algunas mucinas, proteoglucanos extracelulares ygranulaciones de Nissl)

• eosinófilo = catiónico (cargas eléctricas positivas),capta colorantes ácidos (p. ej., eritrocitos, colágeno).

Coloración de rutinaLa coloración de rutina típica es la tinción con hematoxi-lina y eosina (H-E) (Fig. 1.2). Otras coloraciones de rutina(Cuadro 1.3) son la tinción con Azán, la tricrómica deMasson (Fig. 1.3) y la tricrómica de Goldner (Fig. 1.4), lascuales permiten identificar particularmente bien la distri-bución del colágeno. Las tinciones para elastina tornanvisible la elastina de las fibras elásticas (Fig. 1.5).

Métodos histoquímicosEntre las tinciones especiales los métodos histoquímicosocupan una posición prioritaria; en el Cuadro 1.3 se rese-ñan las tinciones de uso frecuente. Con la ayuda de la his-toquímica de sustrato y enzima puede demostrarse unagran cantidad de las más variadas sustancias químicas defi-nidas, como muchas enzimas, glucógeno, ácidos ribonu-cleico y desoxirribonucleico, proteínas, proteoglucanos,lípidos, etcétera, en el sitio de su ubicación natural en célu-las y tejidos, con lo cual se obtiene una buena idea de losacontecimientos celulares dinámicos (Fig. 1.6).

Histoquímica de lectinas Con las lectinas disponibles enel comercio pueden demostrarse componentes sacáridosespecíficos en las células y los tejidos, por ejemplo, en elglucocáliz y en el moco.

Inmunohistoquímica Con la ayuda de esta técnica puedendemostrarse enlaces químicos específicos, sobre todo depéptidos y proteínas, por medio de una reacción antígeno-anticuerpo (Fig. 1.7). Lo fundamental es que el corte detejido en cual se desea demostrar un componente químicodeterminado (un antígeno) siempre se incuba con unasolución que contiene un anticuerpo específico contra elantígeno buscado. El anticuerpo se une a los sitios de lascélulas o del espacio extracelular en los cuales está el antí-geno. Esta reacción puede visualizarse de modos diferen-tes; por ejemplo, el anticuerpo puede marcarse con una


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Fig. 1.2 Tinción con hematoxilina y eosina (H-E). Lahematoxilina tiñe de azul oscuro o violeta los núcleos celula-res y las regiones del citoplasma que poseen abundancia deretículo endoplasmático rugoso. La eosina tiñe de rojo otrasregiones del citoplasma, así como muchos componentesextracelulares fibrosos. Glándulas cutáneas de un antílope(Aepyceros melampus): 1 glándulas odoríferas (apocrinas); 2 glándulas sebáceas (holocrinas); 3 tejido conjuntivo. 250 ×.

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Fig. 1.3 Tinción tricrómica de Masson. Semejante a lacoloración con azán (azocarmín + azul de anilina) (Fig.1.8). Fibras colágenas del tejido conjuntivo (1) en azuloscuro; componentes celulares en diversos tonos de rojo.Glándulas cutáneas de un antílope (Aepyceros melampus): 2 glándulas odoríferas (apocrinas); 3 glándulas sebáceas(holocrinas). 250 ×.

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Fig. 1.4 Tinción de Goldner, coloración tricrómica de usocorriente que tiñe las fibras colágenas del tejido conjuntivo(1) de verde turquesa y las porciones celulares de rojo vio-leta a rojo pardo. Duodeno de un gato: 2 mucosa; 3 glán-dulas de Brunner en la submucosa. 200 ×.

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Fig. 1.5 Tinción para elastina (orceína), detección selec-tiva de membranas y fibras elásticas (→). Arteria muscular:1 luz vascular; 2 membrana elástica interna, compuesta poruna lámina elástica gruesa de trayecto ondulado; 3 túnicamedia; 4 túnica adventicia. Ser humano; 400 ×.

Fig. 1.6 Tinción con PAS (ácido peryódico-reactivo deSchiff), identificación de moco y glucoproteínas neutras,así como glucógeno. Aquí el moco de las células mucosasde la glándula submandibular está teñido de púrpura inten-so; otras estructuras poseedoras de glucoproteínas, entreellas las membranas basales, aparecen más tenues. Serhumano; coloración de contraste de los núcleos celularescon hemalumbre (tono semejante al de la hematoxilina).200 ×.

Fig. 1.7 Determinación inmunohistoquímica de la cito-queratina 19 (CK19), un componente del citoesqueleto, enun bronquio pequeño. Sólo una parte de las células epite-liales muestra una reacción positiva (coloración parda); ensu mayoría se trata de células basales o células en creci-miento. Ser humano; 250 ×.

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Cuadro 1.3 Tinciones histológicas. (De [1])

Tinción

H-E (hematoxilina-eosi-na) (Fig. 1.2)

Tricrómica de Masson(Fig. 1.3)

Azán (azocarmín/azul deanilina/naranja G) (Figs.3.1.2 a 3.1.9)

Para elastina (resorcina-fucsina u orce-ína) (Fig. 1.5)

van Gieson (hematoxilinaférrica/ácido pícrico/fuc-sina ácida)

Tricrómica de Goldner(hematoxilinaférrica/azofloxina/verdeluz) (Fig. 1.4)

Hematoxilina férrica deHeidenhain

Método de impregnaciónargéntica de Gomori parafibras reticulares (impreg-nación con sales deplata)

Núcleos

Azul violeta

Rojo brillante

Semejante a la tinción tricrómica de Masson

−

Azul negro

Pardo negro

Heterocroma-tina y nucléolo azul negro

−

Citoplasma

Rojo; regiones con abundancia de ribosomasy RER azul violeta

Rosa pálido a azul tenue

−

Amarillo a pardusco claro

Rojo ladrillo

Algunos componentes, porejemplo centríolos, hacesde filamentos intermediosy estriaciones transversa-les en los músculos cardí-aco y esquelético, apare-cen de color negro pro-fundo

En varios tonos de gris

Fibras colágenas

Rojo; las fibras tipo I setiñen con intensidad, lasfibras tipo III se tiñen enforma tenue y delicada

Azul

−

Rojo

Verde

Sin tinción especial o gris amarillento

Fibras reticulares (decolágeno tipo III) decolor negro; fibras colá-genas típicas (de coláge-no tipo I) de color pardo

Fibras elásticas

Sin tinción o rosa

Sin tinción (sólo si estánpresentes en grandes canti-dades, como en las membra-nas elásticas o los ligamen-tos elásticos: rojo a azulrojizo)

Negro violeta (resorcina-fuc-sina); rojo pardo (orceína)

Sin tinción especial (sólo siestán en aglomeracionesgruesas, como en las mem-branas elásticas o los liga-mentos elásticos: amarillo)

A menudo sin tinción espe-cial (en parte, verdoso arojo claro)

Gris tenue

−

• Tinción rojo violeta• El ácido peryódico forma grupos aldehído en las moléculas con muchos residuos sacáridos (p. ej., glu-

cógeno, mucinas y glucoproteínas); el reactivo de Schiff los tiñe de rojo violeta• Dan una reacción positiva, por ejemplo, el glucógeno, el moco intracelular y extracelular y las lámi-

nas basales

• Tinción azul.• Diversos componentes con carga eléctrica negativa (polianiones), por ejemplo moco sulfatado, gluco-

saminoglucanos, hialuronano

• Según el colorante, por ejemplo naranja-rojo o pardo• Lípidos, por ejemplo triacilgliceroles o lípidos de las vainas de mielina

• Tinción púrpura• El HCl forma grupos aldehído en la desoxirribosa, la pentosa del DNA. Los grupos aldehído reaccionan

con el reactivo de Schiff, el cual tiñe selectivamente de púrpura la cromatina que contiene DNA

• Tinción azul• El azul de toluidina, un colorante básico, se une selectivamente a los grupos fosfatos de carga nega-

tiva del DNA y del RNA• En consecuencia, se tiñen la cromatina (DNA), el nucléolo y los ribosomas (RNA)

Tinciones histoquímicas

Reacción de PAS (ácido peryódico-reactivo de Schiff)

Azul alciano

Tinciones para lípidos (p. ej., Sudán III; Sudánnegro; aceite rojo O)

Tinción de Feulgen para DNA

Azul de toluidina (basofilia selectiva)

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sustancia fluorescente o puede demostrarse, en un segun-do paso, en una reacción con otro anticuerpo marcado conuna enzima (a menudo peroxidasa). Luego se realiza ladeterminación de la enzima con métodos enzimohistoquí-micos clásicos.

Hibridación in situ Con la hibridación in situ puedenlocalizarse ácidos nucleicos en el corte histológico median-te sondas complementarias (oligonucleótidos de DNA oRNA marcados radiactivamente o no radiactivamente).Las sondas permiten demostrar en el corte secuencias deDNA o RNA específicas. El método también puede practi-carse en cromosomas, en extendidos celulares o en prepa-rados de cuerpo entero de animales pequeños.

1.3.5 ArtefactosLos artefactos son de causa técnica y surgen, por ejem-plo, por mala fijación o una fijación demorada, solucio-nes colorantes viejas, mellas en la cuchilla del micróto-mo o una deshidratación agresiva. Las consecuencias fre-cuentes son las grietas pequeñas o grandes en el límiteentre tejidos de consistencia diferente, por ejemplo entreel cartílago y el pericondrio. También aparecen con fre-cuencia hendiduras de retracción entre tejidos de estruc-turas diferentes, por ejemplo, entre el tejido epitelial y eltejido conjuntivo (Fig. 1.8). Otras causas posibles son lascontusiones o los desgarros hísticos (Fig. 1.9). El conoci-miento de estos artefactos es muy importante en el exa-men de un preparado.

1.3.6 Preparados vivosCon el microscopio también pueden estudiarse células ytejidos vivos: la microscopia de contraste de fase y lamicroscopia de interferencia intensifican el contraste de lasestructuras celulares vivas (Fig. 1.10), el cual en el micros-copio de luz transmitida corriente es muy débil. Medianteel uso de sustancias coloreadas o marcadas con colorantesfluorescentes es posible, entre otras cosas, seguir la dinámi-ca de los procesos de endocitosis o la reestructuración delas prolongaciones celulares. Las variantes de la microsco-pia vital son, por ejemplo, la aplicación de la luz ultravio-leta, la microscopia de polarización y la microscopia decampo oscuro.

1.4 Realización de preparados para lamicroscopia electrónica

1.4.1 Microscopia electrónica de transmisiónFijación En la microscopia electrónica de transmisión(MET) se necesitan procedimientos de fijación particular-mente cuidadosos para obtener una imagen lo más fielposible al original de la estructura de las células vivas. Eltejido debe colocarse rápidamente en la solución fijadora,en lo posible de inmediato o al menos a los pocos minutosde la extracción o la muerte. Si se trabaja con animales deexperimentación, lo óptimo es la fijación por perfusión delanimal anestesiado. La solución fijadora es el glutaraldehí-


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Fig. 1.8 Hendidura por retracción (∗) entre la base delepitelio y el zócalo de tejido conjuntivo de las vellosidadesintestinales, el denominado espacio de Grünhagen. Yeyuno,ser humano. Azán; 270 ×.

Fig. 1.10 Fibroblastos vivos en un cultivo celular,microscopia de contraste de fase. Además del núcleo,algunos orgánulos granulares y el límite celular general, losdetalles de la estructura de estas células apenas puedendistinguirse. 450 ×.

Fig. 1.9 Defectode corte.

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do amortiguado y a la fijación le sigue una posfijación contetróxido de osmio. El metal pesado osmio se une a loslípidos y aumenta, por ejemplo, el contraste de las mem-branas biológicas.

Inclusión, corte Luego de la deshidratación se realiza lainclusión en resinas sintéticas como Araldita o Epon. Conultramicrótomos se realizan cortes de 30 a 80 nm de espe-sor.

Tinción Estos cortes son tan finos que las estructuras celu-lares que contienen deben contrastarse (“teñirse”) (Fig.1.11) con acetato de uranilo, citrato de plomo y en ciertoscasos ácido fosfotúngstico.

Acoplamiento metálico En la investigación experimentalpueden utilizarse sustancias acopladas a metales (oro, hie-rro, cobre). Los metales en los preparados para el METposeen un gran contraste y, en consecuencia, se identificanbien. Así, por ejemplo, puede seguirse el trayecto de unaglucoproteína, en sí misma invisible, desde su captación enla célula hasta su degradación y pueden localizarse enforma precisa proteoglucanos o glucosaminoglucanos.

Inmunoelectromicroscopia En la inmunoelectromicros-copia pueden demostrarse in situ, por ejemplo, proteínasmediante el uso de anticuerpos marcados con oro.

Contraste negativo En un procedimiento especial, lageneración de contraste negativo, pueden colocarse sobreuna película transparente finísima partículas celulares,bacterias o virus. Los objetos se rodean de precipitados demetales pesados, con lo cual aparecen claros en un entor-no oscuro.

Criofractura En el método de la criofractura las superficiesliberadas de pequeñas muestras hísticas congeladas a muybaja temperatura se cubren con una película metálica finí-sima. La réplica obtenida de ese modo se observa con elMET. Las membranas celulares se parten a lo largo de sucentro hidrófobo, de modo que las caras interiores de lashojuelas externa e interna de la membrana quedan libres ypueden analizarse.

1.4.2 Microscopia electrónica de barridoLa microscopia electrónica de barrido tiene su fundamen-to en principios propios y permite el análisis de superficiescelulares y epiteliales genuinas (Fig. 1.12).

1.5 Interpretación de los cortes histológicos

1.5.1 Mensaje de los cortes histológicosEl mensaje y el valor diagnóstico de los cortes histológicossiempre deben evaluarse en forma crítica:• El corte histológico siempre provee sólo una instantá-

nea de un todo vivo en cambio continuo.• La gran mayoría de los cortes representan sólo una roda-

ja finísima de una parte casi siempre pequeña de unórgano tal vez muy grande, por ejemplo, el hígado. Enlos órganos grandes las estructuras pueden estar distri-

buidas en forma irregular y no es obligatorio que seencuentren en cada corte.

• El corte histológico genera una imagen bidimensionalde las células y los tejidos siempre tridimensionales. Lastres dimensiones se infieren, por ejemplo, recién cuandose utilizan cortes gruesos que se “transenfocan” o cuan-do se realizan cortes seriados.

No obstante, las conclusiones inmediatas sobre la formareal de los elementos estructurales de las células y los teji-dos en el corte individual sólo son posibles en casos excep-cionales: si un huevo cocido (duro) se corta en sentidotransversal en la región de uno de sus dos polos en el corteno estará contenida la yema central, lo cual no niega suexistencia. Un corte tangencial, es decir un corte plano através de la superficie de una estructura, da como resulta-do una imagen completamente diferente a la de un cortetransversal, o sea un corte por el centro de la misma estruc-tura. Por otra parte, el corte transversal puede atravesarestructuras totalmente distintas a las de un corte longitu-dinal: un tubo curvo seccionado en sentido transversal seve completamente diferente al mismo tubo en un cortelongitudinal (Fig. 1.13). La aparición de 2 cortes nuclearesen una célula no constituye una demostración de binu-clearidad, sino que casi siempre tiene su origen en unnúcleo contorneado que se ha cortado en dos sitios.

1.5.2 Reglas básicas para la realización deldiagnóstico

La identificación y el diagnóstico diferencial de un prepa-rado histológico desconocido con frecuencia pueden reali-zarse con el aumento menor o, a lo sumo, con un aumen-to mediano.

Observación a simple vista Ciertos órganos pueden diag-nosticarse a simple vista por la orientación típica del corte,por ejemplo un corte sagital de la hipófisis, un corte trans-versal de la suprarrenal o un corte longitudinal del intesti-no delgado.

Examen con el objetivo más débil Con el objetivo másdébil del microscopio se buscan principios organizativosconcretos: ¿hay una zona interna y una zona externa(correspondientes a médula y corteza)?, ¿se encuentra unasuperficie natural (cubierta por epitelio) o una cápsula?,¿hay regiones con propiedades tintoriales completamentediferentes?, ¿aparece alguna luz?, ¿hay elevaciones regularesde la superficie, por ejemplo, pliegues?Además, con el objetivo más débil se examinan (¡todos!)los bordes libres para verificar si hay algún epitelio. Encaso afirmativo el epitelio puede brindar los mejores indi-cios para el diagnóstico diferencial. Si se encuentra un“epitelio simple cilíndrico” teóricamente habría que pensaren un corte de una parte del tubo digestivo, de la trompauterina o del útero. La organización en capas típica deltubo digestivo clasifica el preparado como perteneciente altubo gastrointestinal. La falta de estas capas pero la presen-cia de cilios son características de la trompa uterina y de lamucosa del útero en determinadas fases del ciclo; los plie-gues muy ramificados son prueba de que el preparadocorresponde a la trompa uterina mientras que la invagina-ción del epitelio para formar túbulos glandulares indicaque corresponde a la mucosa del útero. Si no hay cinocilios

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Fig. 1.11 Ultraestructura celular en el microscopio electrónico de transmisión. Célula epitelial del hígado de la ratacon un núcleo grande (1) y los orgánulos típicos; 2 retículo endoplasmático rugoso; 3 retículo endoplasmático liso; 4 apa-rato de Golgi; 5 mitocondrias; 6 lisosomas. Estas células contienen mucho glucógeno (7) en forma de inclusiones. En lasuperficie que forma los canalículos biliares (8) la célula posee microvellosidades. → Nucléolo. 12.000 ×.

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ni glándulas tubulares pero en la superficie aparecen plie-gues delgados cubiertos de epitelio simple cilíndrico, debeconsiderarse el diagnóstico diferencial de vesícula biliar.

Ejemplo glándulas serosas En el diagnóstico diferencialde las glándulas serosas, también debe incluirse en las con-sideraciones el páncreas. El páncreas contiene islotes deLangerhans y células centroacinosas abundantes, pero

carece de conductos estriados y de células mioepiteliales enlos ácinos. Sin embargo, dado que los islotes de Langerhansson poco frecuentes y faltan por completo en algunos cor-tes, hay que pensar en las células centroacinosas. Para iden-tificar estas células se necesita una resolución relativamen-te alta y también algo de experiencia –con poca resoluciónes mucho más fácil verificar la ausencia total de conductosestriados–.

Nota Diagnóstico de un preparado histológico• Primero mírese el preparado a simple vista y deter-

mínese si es de un órgano macizo o hueco, si losbordes del corte son artificiales (rectos) o corres-ponden a superficie naturales.

• Luego mírese en el microscopio con el aumentomenor y determínese si hay una organización defi-nida, por ejemplo, en corteza/médula, en lobulilloso configuraciones luminales determinadas y quéepitelios se encuentran en las superficies naturales.

• Examínese minuciosamente de todo el corte conlos aumentos menor y mediano. Procédase a undiagnóstico hístico específico cuidadoso y a laidentificación de los cortes tangenciales y de losartefactos.

• Sólo utilícese gran aumento para los detalles celu-lares, por ejemplo, para la diferenciación entrecinocilios y borde en cepillo.

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Fig. 1.12 Microfotografía electrónica de barrido de polende avellano levemente deshidratado. 1.700 ×.

Fig. 1.13 Interpretación de las imágenes de los cortes. Los cortes transversal y longitudinal de un tubo curvo (a) orecto (b), de un huevo de gallina (c) pueden permitir −tomados por sí solos− la deducción tanto de la forma espacial comode la composición de cada una de las imágenes en cuestión. (De [6])

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