Cap.13 Proteomica[1] REV

13

Proteómica

Jaime Mas Oliva, Febe Elena Cazares Raga

Introducción

La secuenciación del genoma humano y de una variedad de organismos han revoluciona-do la biología y la medicina.1, 2 Las secuencias de DNA de distintos organismos estándisponibles en las bases de datos, sin embargo, las secuencias de genes dan una infor-mación incompleta sobre las propiedades de las proteínas, que son las responsables de las funciones celulares. Por esta razón, en la actualidad el análisis exhaustivo de secuencias tam-bién se está aplicando a todas las proteínas (proteoma) presentes en la célula, tejido u organismo completo en un momento particular. Este tipo de análisis ha confirmado que elproteoma es dinámico, que las proteínas cambian según el ambiente y estado fisiológico enque se encuentre el organismo y esta información está siendo aplicada a todos los campos de la biología y la medicina. Dos o más estados diferentes de una célula u organismo (teji-do sano y enfermo) pueden ser comparados y con ello, identificar cambios en las proteínastanto cualitativos como cuantitativos. La integración de datos obtenidos del genoma y el proteoma ayudará a descubrir la identidad y funciones de las proteínas involucradas en lapatogénesis de enfermedades o en el envejecimiento, entre otros procesos. Estas proteínas se podrán utilizar como marcadores para el diagnóstico y predicción de enfermedades y comoblancos potenciales para drogas o blancos terapéuticos (figura 13-1).

La proteómica es una herramienta muy poderosa para estudiar las funciones de todaslas proteínas de una célula y obtener una visión global e integrada de la biología de losseres vivos. Es muy importante anotar que las estrategias de la proteómica deben estarenfocadas a resolver preguntas específicas en biología, más que sólo secuenciar proteínas,por ejemplo, ¿qué proteínas están modificadas en calidad o cantidad en una situaciónpatológica, en comparación a la situación normal?, ¿cuál es el estado de fosforilación deun grupo de cinasas específicas en el desarrollo de células cancerosas?, ¿qué proteínasestán involucradas en la interacción huésped-parásito que permiten una infección?Conforme la tecnología se desarrolla, aumenta la capacidad de purificar reproducible-mente proteínas de compartimientos cada vez más finos: tejidos, células u organelos; tam-bién mejora la sensibilidad de los métodos de identificación y el análisis bioinformáticopermite manejar mayores volúmenes de datos facilitando la propuesta de modelos que

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326 • Diagnóstico molecular en medicina (Capítulo 13)

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expliquen fenómenos complejos. En este capítulo se revisa someramente la tecnologíaproteómica y su aplicación dirigida a responder preguntas biológicas.

1. Definición de proteómica. El término proteomics (proteómica) fue acuñado porMarc Wilkins en 1994, durante una conferencia sobre el genoma y mapas de proteínas.3, 4, 5

El término proteome fue usado por primera vez en la literatura por Humphery-Smith en 1995.6, 7 La proteómica puede definirse como el estudio sistemático de secuencias deproteínas, su expresión, cantidad, isoformas, estado de modificación postraduccional,interacción con otras proteínas, actividad bioquímica, función celular, localización sub-celular (mapa tridimensional de la célula) y estructura en un momento dado, de algúntipo de célula.

2. Diversidad en las proteínas. En base a las secuencias analizadas en el Proyecto delGenoma Humano y usando el código genético, se propuso que el número de genes es > 30 000. Sin embargo, el número de proteínas codificadas por el genoma es difícil depredecir debido a que, entre la síntesis primaria de proteínas hecha en base a la informa-ción contenida en el DNA y las proteínas terminadas, ocurren varios procesos de modi-ficación postranscripcional y postraduccional, que las diversifican. Se ha calculado unnúmero de proteínas codificadas por el genoma (~ 100 000) de las cuales, más de 35%son sintetizadas como resultado del splicing a nivel de transcripción o como isoformasproducidas en la traducción (~ 1 000 000). Además, procesos como el doblamiento(folding), el procesamiento (enzimas que pasan de pro-péptido a enzimas activas cuandoson secretadas), la translocación que culmina en la localización y compartamentalización, ladegradación, la afinidad, o ambas, con proteínas diferentes en relación al microambiente,también aumentan la diversidad de las proteínas regulando su función (figura 13-2).Además, las proteínas sufren numerosas modificaciones postraduccionales (MPT) (unióncovalente o eliminación de un grupo funcional), como respuesta a señales intracelularesy extracelulares que con frecuencia determinan su actividad.8

3. Tipos de proteómica. La proteómica puede ser clasificada de varias formas, deacuerdo con el interés del investigador (figura 13-3).

a) Proteómica de expresión. Es el estudio cualitativo y cuantitativo de las proteí-nas en procesos biológicos complejos que involucran cambios en su expresión.Se puede comparar la expresión del proteoma completo o subproteomas paraidentificar proteínas nuevas o que aumenten su expresión, que a su vez puedenser etiquetadas como biomarcadores específicos de una enfermedad.

b) Proteómica estructural. Mapear la estructura de los complejos proteínicos o de las proteínas presentes en organelos celulares específicos. Identificar todas las proteínas que forman un complejo proteínico u organelo como el núcleo o la mitocondria; determinar su localización subcelular y la arquitectura total de la célula (figura 13-4).

c) Proteómica funcional. Describir las funciones realizadas por las proteínas codi-ficadas en el genoma. Identificar las interacciones proteína-proteína en un com-plejo proteínico o subproteoma, al determinar las vías de esas interacciones y finalmente inferir la participación funcional de proteínas individuales. Lasestrategias proteómicas específicas y dirigidas utilizadas en la proteómica fun-cional pueden dar información muy importante sobre el señalamiento de pro-teínas, mecanismos de enfermedad o interacciones de proteína-droga.

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TECNOLOGÍA PROTEÓMICA

Separación y aislamiento de proteínas

El análisis proteómico implica la separación de proteínas a partir de mezclas complejasde una línea celular, tejido u organismo en sus componentes individuales; la caracteri-zación de cada proteína, la elaboración de una base de datos y la aplicación de esta infor-mación en su identificación. Las herramientas actuales de la proteómica son las técnicas


Figura 13-2. Proteómica humana. Un gen puede dar lugar a múltiples productos genéticos.

Muchas proteínas pueden generarse a partir de un solo gen como resultado de los mecanismos

de regulación a lo largo de la expresión genética. Por esta razón, a partir de ~30 000 genes

encontrados en el genoma humano, se ha calculado que existen más de 1 000 000 de proteí-

nas. El flujo de la información genómica a las proteínas. El concepto de un gen una- enzima está

sobre simplificado, ya que un mRNA puede producir varias proteínas a partir de varios procesos

de regulación como el splicing diferencial o el editing. Además, las proteínas pueden ser afecta-

das por más de 200 tipos de modificaciones postraduccionales (MPT) diferentes. Finalmente,

como resultado de la compartamentalización y translocación, la misma proteína puede encon-

trarse con diferentes propiedades y funciones en diferentes sitios de la célula.

de separación basadas en la electroforesis y la cromatografía, y la espectrometría de masas(mass spectrometry, MS). Las dos primeras se usan para fraccionar mezclas complejas deproteínas, y la MS se utiliza para identificar rápidamente a proteínas individuales.9, 10

A. Electroforesis bidimensional. Para estudiar el patrón global de las proteínas, suexpresión, identificación, caracterización, o ambas, las proteínas deben ser separadas eidentificadas. La opción más simple para separar proteínas de muestras complejas es elmétodo de electroforesis en geles de poliacrilamida en presencia de dodecil sulfato desodio (del inglés, sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis [PAGE-SDS]) enuna dimensión (E1D).11 Este método separa a las proteínas de acuerdo a su peso molec-ular (10 a 300 kDa); sin embargo, el análisis es limitado ya que en un extracto celular,muchas proteínas pueden tener un peso molecular idéntico o muy similar y una sola“banda” resuelta mediante este sistema puede corresponder a más de una proteína. Estalimitante se resuelve utilizando electroforesis bidimensional (E2D), introducida a medi-ados del decenio de 1970-1979.12, 13, 14 La E2D combina la separación de proteínas por su punto isoeléctrico (pI, pH en el cual la proteína alcanza su carga neta0), en la primera dimensión o isoelectroenfoque (IEF) y por su peso molecular en la segunda dimensión. Las proteínas resueltas se observan como manchas en un gel (figu-ra 13-5), con las que se obtiene el perfil de las proteínas presentes en una muestra y reveladatos cualitativos (presencia o ausencia de una molécula), semicuantitativos (el tamaño


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Figura 13-3. Tipos de proteómica y sus aplicaciones a la biología. Clasificación de Proteómica

en Proteómica de Expresión, Proteómica Funcional y Proteómica Estructural. Categorías, apli-

caciones potenciales de la proteómica y beneficios de la integración de datos de genómica con

proteómica. (Reproducida con autorización de Graves PR y Haystead TAJ (2002) MolecularBiologist's guide to proteomics. Microbiol Mol Biol Rev 66: 39-63).

de la señal es proporcional a la concentración) que permiten la comparación entre mues-tras obtenidas en condiciones diferentes y corridas en paralelo.

Inicialmente, el gradiente de pH de amplio espectro (pH 3 a 10) para IEF en 2D seformaba con anfolinas acarreadoras15. El método se mejoró con la introducción de


Figura 13-4. Mapa en 3 dimensiones de la distribución de 20 proteínas en un hepatocito primario.

La imagen muestra la complejidad asombrosa de estructuras celulares y vesículas endosomales.

La tecnología utilizada es una nueva herramienta de microscopía, llamada MELK, basada en la

microscopía de fluorescencia. El método consiste en marcar a las proteínas con un anticuerpo fluo-

rescente, el colorante se destruye con luz y el siguiente ciclo se inicia añadiendo otro anticuerpo

marcado con otro colorante fluorescente dirigido contra la segunda proteína y así sucesivamente.

El análisis se realizó con un software en 3D muy sofisticado, en el que se utilizaron 20 anticuerpos

específicos a 20 proteínas, generados individualmente. Colores diferentes representan proteínas

diferentes. Con la información visual generada se pueden construir mapas de interacción de prote-

ínas funcionales. Con esta tecnología se pueden visualizar simultáneamente docenas de proteínas

en una célula o tejido estructuralmente intactos y estudiar la distribución de todas las combinacio-

nes posibles de las proteínas (50 proteínas pueden dar lugar a 250 o ~1015 patrones posibles de

combinación de proteínas). Reproducida con autorización de Koop R (2005) Combinatorial biomar-kers: from early toxicology assays to patient population profiling. Drug Disc Today 10: 781-788).

gradientes de pH inmovilizados,16 que se forman copolimerizando monómeros y deriva-dos de acrilamida que pueden formar casi cualquier gradiente de pH imaginable. El usode estos gradientes ha permitido muchas innovaciones metodológicas para E2D,17, 18, 19

que permiten analizar cientos a miles de proteínas en un solo gel, muchas muestras a lavez en geles en paralelo con resultados altamente reproducibles.20, 21

Una aplicación muy útil de E2D es resolver isoformas de proteínas del mismotamaño o proteínas que han experimentado modificaciones postraduccionales que cam-bian su carga eléctrica y con ello su pI, como sucede en la fosforilación. Las proteínas fos-foriladas pueden ser resueltas e identificadas de las no fosforiladas como una cadena demanchas nuevas en el eje horizontal en la segunda dimensión, con un pI más ácido (figu-ra 13-6). Actualmente, el análisis de la fosforilación en las proteínas ha avanzado muchísi-mo y se le llama fosfoproteómica.22


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Figura 13-5. Separación de proteínas de Plasmodium berghei por electroforesis en una y dos

dimensiones. Las proteínas de gametocitos de Plasmodium berghei, (agente causal de la mala-

ria de roedores utilizado como un modelo de investigación) obtenidos de sangre de ratón infec-

tado, se separaron por electroforesis en una dimensión (E1D) y en dos dimensiones (E2D). E1D

separa las proteínas por su peso molecular (PM) en tanto que E2D, las separa por su pI o iso-

electroenfoque (IEF) en la primera dimensión y por su PM en la segunda. Gel en 1D PAGE-SDS

al 12%. E2D realizada con anfolinas pH 3-10 y PAGE-SDS al 12%, por el método de O'Farrel

(1975). Los geles se tiñeron con plata. Para su identificación, las proteínas se digieren in situcon una enzima y se analizan por espectrometría de masas. (Cortesía de Dr. Jorge A. Torres

Monzón, CIP-INSP/Cinvestav-IPN, de un proyecto de Identificación de moléculas que intervie-

nen en el proceso de fertilización de Plasmodium berghei).

A pesar de sus limitaciones, la electroforesis bidimensional, permanece vigente desdesu surgimiento. Durante casi tres decenios ha sido la herramienta más poderosa para laseparación de proteínas a partir de mezclas complejas, además de haber contribuido alnacimiento y desarrollo de la proteómica, ofreciendo la capacidad de crear mapas de pro-teínas detallados.12, 23

B. 2D-DIGE. La tecnología llamada 2D-DIGE (del inglés, differences gel elec-trophoresis [DIGE]) ha aumentado el nivel del análisis de proteínas por 2D.24 Estametodología utiliza colorantes fluorescentes (CyDye DIGE fluors) con la misma masamolecular y espectralmente distintos para marcar las proteínas de 2 o 3 muestras difer-entes, lo que elimina las diferencias de peso entre las muestras marcadas. Las proteínasmarcadas se mezclan y se corren en un mismo gel, el patrón de proteínas se analiza bajo


a b c

BA C

Figura 13-6. Proteínas fosforiladas. Las isoformas de proteínas generadas por fosforilación

pueden detectarse como manchas del mismo peso molecular con un corrimiento lateral,

como resultado de un cambio en el pI. Aquí se muestran isoformas de la fosfoproteína stath-

min/Op18, una oncoproteína de linfoma de células de manto (mantle cell limphoma: MCL)

relacionada con procesos intracelulares que regulan la proliferación, diferenciación y otras

funciones celulares, en nódulos infáticos reactivos normales a) Op18 aumenta su expresión

en células neoplásicas b) y cuando el tumor se ha extendido a casi todo el nódulo linfático,

aparece una nueva proteína fosforilada c) Op18 es un blanco potencial de drogas antineo-

plásicas. El ensayo se realizó por medio de electroforesis 2D (IPG pH 4-7, PAGE-SDS 8-

18%) y Western blot con anticuerpos específicos anti Op18. La inmunotinción realizada con

el mismo anticuerpo muestra secciones de tejido con reacción positiva, A) Nódulos linfáti-

cos normales, B) Linfoma MCL con el 25% de progreso, C) Linfoma MCL con el 90% de pro-

greso. (Reproducida con autorización de Righetti PG et al. (2005) Proteome analysis in the cli-nical chemistry laboratory: mith or reality? Clin Chim Acta 357: 123-139).

luz fluorescente usando la longitud de onda de excitación correspondiente a cada col-orante, las imágenes de los geles se digitalizan por computadora y después se sobrepo-nen para identificar las diferencias (figura 13-7). La 2D-DIGE se puede utilizar enexperimentos con una gran cantidad de muestras (muestras clínicas de personas sanasy enfermas.)25, 26 (figura 13-8) y ya ha sido aplicado en la identificación de marcadoresprotéicos específicos de células cancerosas de esófago (figura 13-9) y el análisis pro-teómico de células de cáncer de mama.

C. Métodos de identificación de proteínas y péptidos. Una vez separadas por E2D, lasproteínas deben ser identificadas, para ello se utilizan anticuerpos específicos en experi-mentos tipo Western27 la secuenciación del extremo N-terminal, después de transferir lasproteínas a membranas hidrofóbicas (2 pmol),28 por degradación de Edman;29 secuen-ciación del extremo N-terminal de fragmentos internos generados por cortes con bro-muro de cianogeno (CNBr) sobre residuos de metionina, cuando el extremo amino estábloqueado; la secuenciacion del extremo C-terminal usando carboxipeptidasas o degradacion


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gel 1

gel 2Tratado

Figura 13-7. 2D-DIGE. Differences gel electrophoresis: DIGE, es una tecnología que utiliza mar-

cadores fluorescentes para marcar dos (o tres) muestras de proteínas con dos (o tres) coloran-

tes diferentes. Estos marcadores son reactivos a grupos amino y tienen la misma masa molecu-

lar. Las proteínas marcadas se mezclan y corren en un mismo gel 2D. La imagen se adquiere

con un escáner fluorescente con una longitud de excitación diferente correspondiente a cada

colorante, posteriormente las imágenes de los geles se sobreponen para identificar las diferen-

cias. (Reproducida con autorización de Amersham Biosciences).


con tiocianato (a nivel de μg). Los metodos mas usados en la actualidad estan basados enla MS. El analisis por E2D y MS es una estrategia efectiva para investigar el proteoma eidentificar proteinas reguladas diferencialmente y peptidos biomarcadores en tejidos,células y organelos y en tejidos normales y enfermos.

Métodos de detección de proteínas, análisis de imagen y documentación

Existen muchas maneras de visualizar a las proteínas en un gel bidimensional. El méto-do a elegir depende del objetivo del experimento y la sensibilidad requerida. Cada tipode colorante tiene sus propias características y limitaciones con respecto a la sensibili-dad de detección. Ésta se determina por la cantidad de colorante que se une a las pro-teínas y la diferencia en coloración entre proteínas teñidas y el fondo residual en el cuer-po del gel. Si el propósito es identificar proteínas de baja abundancia (bajo número decopias) debe usarse una tinción de sensibilidad muy alta, como la tinción con plata30, 31, 32

A B

C

a

b

Figura 13-8. Visualización de 2D-DIGE. En este ensayo la muestra control se marcó con el coloran-

te fluorescente Cy3 (A) y la experimental con Cy5 (B). En el tercer recuadro, las imágenes de los

geles anteriores se sobrepusieron, observándose en C las proteínas presentes en ambas muestras,

y las diferenciales conservan su color original. Las flechas y recuadros señalan algunas proteínas

diferenciales. (Reproducida con autorización de Amersham Biosciences).

o fluorescencia.33 La tinción con plata puede detectar hasta 1 ng de proteína por man-cha (p/m). Este tipo de tinción puede o no ser compatible con el análisis por MS, por loque el método debe seleccionarse antes. La tinción por fluorescencia más popular es conel colorante SYPRO Ruby, que contiene rutenio como parte de un complejo orgánicoque interactúa con las proteínas de forma no covalente,34, 35 su nivel de detección es de 1ng p/m. Este colorante se visualiza bajo luz UV o azul. El azul de Coomassie R-250 es el de menor sensibilidad (~ 100 ng de p/m), con la ventaja de ser barato y com-patible con MS.36 La sensibilidad puede aumentar con azul de Coomassie coloidal (10ng p/m;37 figura 13-10).


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Cáncer Cáncer Cáncer

1.9 × 105 6.9 × 105 5.4 × 106 4.6 × 106 3.9 × 106 2.9 × 105

GP96 regulada hacia arriba

pH

Control de tubulina Anexina I regulada hacia abajo

I

II

Figura 13-9. 2D-DIGE de proteínas de células normales y células cancerosas de esófago. I A)

Proteínas de células normales marcadas con Cy3. I B) Proteínas de células tumorales marcadas

con Cy5. I C) Proteínas teñidas con SYPRO Ruby. Las proteínas de células normales y cancerosas

marcadas se mezclaron y separaron en un gel. El mismo gel teñido con SYPRO Ruby (C) dio el per-

fil de proteína combinado de ambos tipos de células. Las diferencias entre los perfiles de proteínas

de A y C o B y C se observaron en los cambios de peso molecular (-0.5 kDa) después de las reaccio-

nes de marcaje. También se observa la eficiencia del marcaje diferencial entre proteínas debido a la

diferencia en el contenido de lisina tal como la mancha D. II. Simulación en 3D de las manchas de pro-

teínas que regulan su expresión al aumentar o disminuir (up/down) su concentración. El volumen de

cada mancha se calculó usando el software Decycler-DIA y se representa como una gráfica. Los pares

de manchas de proteínas de células cancerosas reguladas hacia arriba II A), las que se expresaron al

mismo nivel II B) y las reguladas hacia abajo III C). Los recuadros de arriba muestran las imágenes de

las manchas de proteínas en un gel en 2D, mientras que los de abajo muestran la imagen en 3D

de las manchas correspondientes y el volumen calculado de cada una de las mismas.

(Reproducida con autorización de: Zhou G, Li H, De Camp D, Chen S et al.: 2D differential in gelelectroforesis for the identification of esophageal scans cell cancer-specific protein markers. Mol

Cell Proteomics 2002;1: 117-124).


Los patrones bidimensionales son muy complejos, las imágenes de los geles se digi-talizan por escaneo de imagen o de fluorescencia y se analizan por un software especial(ImageMaster de Amersham Biosciences o PDQUEST de BioRad) para detectar proteínasexpresadas diferencialmente en geles corridos en serie, como proteínas que son reguladashacia arriba y hacia abajo (up/down regulated) o modificadas postraduccionalmente, conrespecto a un control. Las manchas seleccionadas se pueden analizar por MS.

Análisis de proteínas por espectrometría de masas

La proteómica basada en la espectrometría de masas se ha establecido como una tec-nología indispensable para interpretar la información codificada en el genoma.38 La basede esta tecnología es la conversión de moléculas a iones (moléculas eléctricamente car-gadas) y su identificación. La MS es el método a escoger para la identificación de proteí-nas en muestras complejas, por su sensibilidad (<_ 100 fmol), rapidez, aplicación a granescala y automatización.39, 40 Los pesos moleculares de biomoléculas (<_ 40 kDa) sepueden medir con precisión suficiente para detectar los cambios de masa pequeños,como la sustitución de un aminoácido o una modificación postraduccional.

A. Espectrómetro de masas. Un espectrómetro de masas consiste de tres partes esenciales,la fuente de ionización, donde las muestras se convierten a iones que son más fáciles de manip-ular que las moléculas neutras; el analizador, que separa y mide la proporción masa/carga (m/z;

A B

C D

Figura 13-10. Métodos de tinción de proteínas en geles bidimensionales. Las proteínas separadas

por E2D, se pueden teñir con diversos colorantes para ser visualizadas. Las tinciones más utiliza-

das son las realizadas con Azul de Coomassie R250 (A, extracto de E. coli), Nitrato de plata (B,

extracto celular de melanoma humano), Azul de Coomassie coloidal G250 (C, extracto de E. coli) ycon el colorante fluorescente SYPRO Ruby (D, extracto de E. coli). (Reproducida con autorización

de A, B y C de Amersham Biosciences y D de Bio-Rad.com).

peso molecular) de las muestras ionizadas; y el detector, que monitorea la corriente de iones, laconvierte en corriente eléctrica y la amplifica, registrando la señal como un espectro de masasque muestra el número, peso molecular y abundancia relativa de cada uno de los componentesde la muestra. El analizador y el detector, y con frecuencia la fuente de ionización, del espec-trómetro de masas se mantienen al alto vacío para que los iones puedan viajar de un extremo delaparato al otro sin la interferencia de moléculas de aire. La muestra puede ser introducida direc-tamente a la fuente de ionización o ser fraccionada previamente por algún tipo de cromatografía.

B. Métodos de ionización. Existen varios métodos de ionización de proteínas y su usodepende del tipo de muestra a ser analizada y del espectrómetro de masas accesible. Entre losmás utilizados para la mayor parte de análisis bioquímicos son: la ionización por desorción medi-ante láser asistida por matriz (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization; MALDI), que subli-ma y ioniza las muestras sobre un medio cristalino con pulsos de láser (figura 13-11); la ionización por electroaerosol (Electrospray Ionization; ESI), donde un campo eléctrico ioniza elanalito en una fase líquida en forma de aerosol, se acopla fácilmente a herramientas de sepa-ración en base líquida como cromatografía y electroforesis capilar; y un tercer método, el másnovedoso, la ionización por desorción de láser aumentada por superficie (Surface Enhanced LaserDesorption Ionization; SELDI), una variante de MALDI, que combina la cromatografía con MS,donde la ionización por láser se lleva a cabo sobre el analito unido a una superficie cromatográ-fica (ProteinChips). Éstas pueden ser químicas (de intercambio iónico, asociaciones hidrofóbicas,unión a metal, etc.) o biológicas (receptores, ligandos, etc.). La ionización crea iones gaseosos quese analizan en un TOF MS41 (figura 13-12). La MALDI y la ESI son métodos de ionización“suaves” ya que permiten la formación de iones sin que la muestra pierda integridad.Normalmente, MALDI se asocia con el analizador TOF que mide la masa de péptidos intactosy ESI se acopla a la trampa de iones y a un triple cuadrupolo, que se usan para generar fragmen-tos por colisión (collision-induced dissociation; CID) de los iones precursores seleccionados.

C. Analizadores de masas. En la investigación proteómica, el análisis de proteínas o pépti-dos por MS se puede dividir en dos categorías generales, el análisis de masas de péptidos y la secuenciación de aminoácidos. En el primer caso se miden las masas de péptidos individ-uales contenidos en una mezcla, creando un espectro de masas. En el segundo caso se usa unprocedimiento, conocido como MS en tándem o MS/MS, para fragmentar un péptido especí-fico en péptidos más pequeños, en los que se pueden deducir la secuencia de algunos aminoá-cidos considerada como una etiqueta (peptide sequence tag; PST), que da información estruc-tural irrefutable. Hay cuatro tipos básicos de analizadores de masas: el más simple, por tiempode vuelo (time-of-flight: TOF MS), la masa del ion se mide por el tiempo que tarda en atrave-sar el tubo de vuelo, desde la fuente de ionización hasta el detector, produciendo una señal dis-tinta, con lo que se obtiene el espectro de masas del péptido; algunos analizadores TOFincluyen un espejo de iones (reflector) al fondo del tubo, que desvía los iones hacia un detector. De esta forma el espejo aumenta la longitud del tubo de vuelo y también corrigepequeñas diferencias entre los iones (figura 13-13); le sigue MS/MS, lo que significa utilizarmás de un analizador de masas; los más complejos: la trampa de iones (ion trap), el triplecuadrupolo (triple quadrupole) una versión de MS/MS y el Fourier transform ion cyclotron resonance (FT-ICR) la trampa de iones con la definición y precisión más altas (figura 13-14 ycuadro 13-1). Estos analizadores pueden usarse solos o coordinados para aprovechar las carac-terísticas de cada uno de ellos, como es el caso del cuadrupolo-TOF en el que se combina elprimer cuadrupolo (Q1) y la celda de colisión (q) de un triple cuadrupolo y un TOF


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(QqTOF). En la celda de colisión un gas inerte (argón o xenón) colisiona con los iones de lamuestra seleccionada y los fragmenta, ya sea por CID o por disociación por transferenciaelectrónica (electron transfer dissociation; ETD). Esta última conserva las modificaciones postra-duccionales en los aminoácidos (figura 13-15).39, 42, 43, 44, 45

D. Métodos de identificación de péptidos y proteínas1. MALDI-TOF MS o huellas peptídicas. MALDI-TOF MS es la combinación más uti-

lizada para identificar a las proteínas debido a su simplicidad, excelente precisión de masa, alta


Figura 13-11. Ionización de proteínas. Para ionizar las proteínas y péptidos generados por digestión

con tripsina, se utilizan principalmente dos tipos de ionización. MALDI (Matrix Assisted LaserDesorption /Ionization), que sublima y ioniza las muestras en un medio cristalino con un pulso de láser

(nanosegundos) y se aceleran con alto voltaje hacia el tubo de vuelo (TOF) en cuyo extremo se sitúa

el detector. Las moléculas pequeñas vuelan más rápido que las mayores y se detectan en orden cre-

ciente. Los datos van hacia la computadora que muestra los resultados o espectro de masas, en el

que las masas (m/z) de los péptidos y su intensidad se observan de menor a mayor. El segundo tipo

de ionización ESI (electrospray ionization), vaporiza la muestra directamente de la fase líquida en la

que se encuentra, mediante un electrospray o nebulizador que dispersa la muestra en microgotas, las

cuales contienen los péptidos ionizados. El disolvente de las microgotas se elimina con una cortina de

N2 y los péptidos se dirigen al analizador de masas mediante campos eléctricos.

resolución y sensibilidad, y es conocido como mapeo de péptidos o huellas peptídicas (peptide-mass fingerprinting, PMF). Las proteínas se identifican al comparar las masas de los fragmentospeptídicos obtenidos por proteólisis (PMF) o fragmentación cruda (MS/MS, sequence tags), conun perfil teórico calculado de las secuencias ya conocidas contenidas en las bases de datos.Después de la resolución por E2D y el análisis de imagen, las proteínas seleccionadas (man-chas) se cortan del gel y se digieren allí mismo (in-gel digestion) con tripsina. Este analito sepone, junto con la matriz (una molécula pequeña que absorbe energía ultravioleta y la trans-forma en energía de excitación), en una placa y se deja evaporar permitiendo la formación decristales, que se ionizan con láser dentro del espectrómetro de masas. Las moléculas ionizadasson aceleradas en un campo eléctrico, entran al tubo de vuelo y se separan de acuerdo a su pro-porción masa/carga (figura 13-16). Los espectros obtenidos se comparan con los fragmentostrípticos obtenidos in silico de proteínas contenidas en una base de datos (SWISS-PROTwww.expasy.ch/sprot/). Es muy importante conocer el origen de la especie de la proteínadesconocida. Paquetes de software: MASCOT (www.matrixscience.com),46 ProFound(www.prowl.com)47 y Protein Prospector (www.prospector.ucsf.edu48; cuadro 13-2).

A menudo, algunas proteínas digeridas no pueden identificarse a pesar de producirpéptidos de tamaño aceptable, en estos casos, los datos de PST producidos por MS/MSpueden compararse con la base de datos de etiquetas de secuencias expresadas (expressed


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Figura 13-12. Ionización desorción por láser mejorado por una superficie (Surface EnhancedLaser Desorption Ionization: SELDI), SELDI es una variante de MALDI, que combina la croma-

tografía con la espectrometría de masas, donde la ionización por láser se lleva a cabo sobre el

analito unido a una superficie cromatográfica (ProtenChip® Arrays). A) En este arreglo se mues-

tran algunas propiedades fisicoquímicas de los materiales utilizados para la captura de proteí-

nas. B) Mecanismos de adsorción-desorción y ionización de las proteínas antes de entrar al

espectrómetro de masas. (Reproducida con autorización de Righetti PG et al.: (2005) Proteomeanalysis in the clinical chemistry laboratory: mith or reality? Clin Chim Acta 357: 123-139).

Cuadro 13-1. Analizadores de masas

Analizador Aplicaciones Ventajas Desventajas Disponibilidad

TOF PMF de AR Fácil de usar, AR No MS/MS Común

TOF-reflectrónico PMF de AR, Alta precisión de A veces, PSD Común

recto o curvo PSD masas, AR con dificultad

Cuadrupolo MS, MS/MS Buena MS/MS, No es de AR, Poco común

(Q)-TOF precisión de masas costo

y cuantificación

Cuadrupolo- MS, MS/MS MS/MS, múltiples rondas No es de AR Poco común,

trampa de iones (CID) de fragmentación, raro

sensible

Triple cuadrupolo MS, MS/MS Excelente MS/MS Costo Poco común,

(CID) con CID raro

TOF/cuadrupolo/ MS, MS/MS Excelente MS, MS/MS Costo Poco común

hexapolo (CID) Secuencia y precisión de masa

de novo

Sector magnético MS, MS/MS Rango amplio en las Rango de Raro

(CID) concentraciones de masas

muestra

FT-ICR MS, MS/MS Precisión de masa Muy costoso, Muy raro

(CID) exquisita, fragmentación difícil de operar

Detector por MS Detección de masas muy Costo-eficiencia Costoso,

crio-enfriamiento alta, en extremo en la ionización muy raro

AR: alto

rendimiento

Reproducido con autorización de Graham et al., 2005.

sequence tags, EST) a nivel de nucleótidos.49 Esta comparación incrementa la interacciónde las fuentes de información entre genómica y proteómica.

TECNOLOGÍA MULTIDIMENSIONAL PARA IDENTIFICAR PROTEÍNAS

Recientemente se han desarrollado métodos que involucran la combinación de técnicas de altaeficiencia para la separación de mezclas complejas de péptidos en sus componentes individuales,la llamada tecnología multidimensional para la identificación de proteínas (Multidimensionalprotein identification technology, MudPIT). La MudPIT combina la cromatografía líquida de altorendimiento (high performance liquid chromatography, HPLC) o la electroforesis capilar (sepa-ración electroforética en fase líquida) con diferentes métodos de identificación de proteínascomo UV, MS, MS/MS o fluorescencia inducida por láser. Ambos métodos poseen las ventajasde simplificar las muestras, permitir el uso de gradientes de elusión para aumentar la resolución,son sensibles, automáticos, reproducibles y cuantitativos.50 En la actualidad, un solo análisis deMudPIT puede resultar en más de 70 000 espectros51 (figura 13-17).

A. Sistema de cromatografia liquida bidimensional-MS/MS. La cromatografia liquida (liq-uid chromatography, LC), implementada hace casi dos decenios,52 se ha desarrollado hasta crear


un metodo bidimensional que permite la automatizacion en serie del análisis de proteínas,2DLC-MS (MS/MS). Las partes del sistema LC-MS son un aparato para poner las muestras enel cromatógrafo, el HPLC, una fuente de ionización y el espectrómetro de masas, todos bajo elcontrol de una computadora. El poder de resolución de la LC se multiplica por la combinaciónde dos columnas, generalmente una de intercambio ionico (Ion Exchange chromatography, IEC,separacion por carga) en la primera dimensión y otra de fase reversa (reverse phase, RP, separa-cion por hidrobobicidad) en la segunda dimensión (figura 13-18). Las fuentes de ionización máscomunes en el sistema LC-MS son ESI y ionización química, así como fotoionización a presiónatmosférica.53, 54 La tendencia actual es analizar las mezclas proteinicas en cantidades cada vezmás pequeñas, por lo cual la cromatografía se ha desarrollado a niveles de μLC y nanoLC, loque permite que muestras biológicas muy difíciles de obtener, puedan ser separadas. La capaci-dad teórica de separación del sistema 2DLC-MS puede ser > 10 000 proteínas o péptidos,55

esto se solventa repitiendo los ciclos de separación a través de las columnas.56, 57


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Figura 13-13. Analizadores de masas por tiempo de vuelo. Hay dos tipos de analizadores en

forma de tubo para TOF (time-of-flight: TOF), un tubo simple A) y otro compuesto por el tubo y

un espejo reflector B) La masa del ion se mide por el tiempo que tarda en atravesar el tubo de

vuelo; algunos analizadores TOF incluyen un espejo de iones (reflector) al fondo del tubo, el cual

desvía los iones hacia un detector. De esta forma el espejo aumenta la longitud del tubo de vuelo

y también corrige pequeñas diferencias entre los iones, separándolas con mayor exactitud.

Cuadro 13-2. Herramientas de World Wide Web para buscar bases de datos con

información de proteínas obtenidas por MS o degradación de Edman

Nombre del sitio URL Información R

MOWSE http://srs.hgmp.mrc.ac.uk/cgi.bin/mowse PMM y secuencia 1

ProFound http://prowl.rockefeller.edu/cgi-bin/ProFound PMM y secuencia 2

Pepldent http://expasy.ch/tools/pepident. PMM y secuencia 3

PepSea http://195.41.108.38/PepSeaIntro.html PMM y secuencia 4

MASCOT http://www.matrixscience.com PMM y secuencia 5

PepFrag http://www.proteomatrix.com PMM y secuencia 6

ProteinProspector http://prospector.ucsf.edu PMM y secuencia 7

FindMod http://www.expasy.ch/tools/findmod/ PTM 8

SEAQUEST http://fields.scripps.edu/sequest MS/MS N/ 9

FASTA Search Pro http://fasta.bioch.virginia.edu PNDS 10

CRphosphopeptide http://fasta.bioch.virginia.edu.crp PPSM

MSDB ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/MassSpecDB Especies múltiples 11

Nr ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/db/FASTA/nr.gz Especies múltiples

Ipi ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/IPI/current/ Humano, rata, ratón

Pataa ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/db/FASTA/pataa.gz Derivada de patente

GENESEQ http://thomsonderwent.com/products/ Derivada de patente

patentresearch/geneseq/

UniGene ftp://ftp.ncbi.nih.gov/repository/UniGene/ EST clusters

Proteome.ca http://www.proteome.ca/opensource.html 12

KEGG www.genome.ad.jp/kegg/kegg2.html Actividad,

interacciones

HPRD www.hprd.org Secuencia de

proteínas

PEDRO http://www.pedrodb.man.ac.uk/ Datos proteómicos 13

PEP http://cubic.bioc.columbia.edu/pep Predicciones 14

SWISSPROT http://www.ebi.ac.uk/swissprot/ Secuencia y

http://www.expansy.ch/sprot-top.html estructura (S y E)

EMBL http://www.ebi.ac.uk/Databases/index.html S y E

GeneBank® http://www.ncbi.nlm.nih.gov/GenBank/index.html S y E

DDBJ http://www.ddbj.nig.ac.jp/ S y E

TrEMBL http://www.ebi.ac.uk/trembl/index.html S y E

PIR-PSD http://www.pir.georgetown.edu/ S y E

PBD http://www.rcsb.org S y E


Cuadro 13-2. Herramientas de World Wide Web para buscar bases de datos con

información de proteínas obtenidas por MS o degradación de Edman (continuación)

PFAM http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam Fuentes de

anotación (FDA)

SMART http://www.embl-heidelberg.de/ FDA

PRINTS http://www.bioinf.man.ac.uk/dbbrowser/prints/ FDA

INTERPRO http://www.ebi.ac.uk/interpro/index.html FDA

ENSEMBL http://www.ensembl.org FDA

SCOP http://scop.mrcçImb.cam.ac.uk/scop/ FDA

CATH http://www.biochem.ucl.ac.uk/bsm/cath_new/ FDA

R: referencia; PMM: mapeo de masa de péptidos; N/I: no interpretado; PTM: modificaciones postraduccionales; PNDS: base

de datos para la búsqueda de proteínas y nucleótidos (Protein and nucleotide database searching); PPSM: mapeode los

sitios de fosforilación en las proteínas.

B. Separación ortogonal multidimensional

La separación multidimensional explota dos o más propiedades físicas o químicas independi-entes, de las proteínas o péptidos para alcanzar un alto nivel de resolución y mayor capacidadde muestra de la que puede lograrse en una sola dimensión. Las estrategias de separaciónpueden ser seleccionadas de tal manera que los componentes que no se separaron en unaprimera dimensión sean separados en una segunda o tercera dimensión (incluso más).56 Unrequerimiento de cualquier estrategia MudPIT exitosa es que las dimensiones seleccionadasposean diferentes, pero compatibles, mecanismos de separación (ortogonal, cuadro 13-3). Porejemplo la comparación de resultados obtenidos durante la separación de proteínas de suerohumano digeridas, la combinación 2D IEF/RP mostró 844 péptidos (437 proteínas)57 en tantoque una combinación 3D IEF/SCX/RP (Strong Cation Exchange Chromatography, SCX-LC)del mismo suero mostró 2 071 péptidos correspondientes a 1 143 proteínas únicas.58, 59

Cuadro 13-3. Métodos para fraccionar péptidos en base a sus propiedades

físicas o químicas

Método de fraccionamiento Propiedad físico/química

Ultracentrifugación Densidad

Cromatografía de exclusión por tamaño Radio de Stoke

Isoelectroenfoque Punto isoléctrico

Cromatografía de interacción hidrofóbica Hidrofobicidad

Cromatografía en fase reversa Hidrofobicidad

Cromatografía de intercambio iónico Carga

Cromatografía de afinidad Interacción específica biomolecular

Electroforesis capilar Tamaño/carga


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C. Proteómica por escopetazo. Una estrategia alternativa para analizar rápidamente unamezcla compleja de proteínas por MS es la llamada protéomica por escopetazo. Los péptidosproducidos después de la digestión de una mezcla de proteínas, se analizan por MS/MS,38, 60


B

Figura 13-14. Espectrómetros de masas utilizados en investigación. A) Tiempo de vuelo reflec-

tor (reflector time of flight, TOF). En este espectrómetro, los iones se aceleran con energía de

alta cinética y se separan a lo largo del tubo de vuelo con velocidades diferentes, los iones se

concentran alrededor de un reflector, el cual compensa las diferencias en la energía cinética e

influye sobre el detector que amplifica y cuenta los iones que van llegando. B) El espectrómetro

TOF-TOF incorpora una cámara de colisión entre las dos secciones de TOF. Los iones de una

proporción m/z se seleccionan en el primer TOF, se fragmentan en la celda de colisión y la masa

de los fragmentos se separa en el segundo TOF. C) El espectrómetro en cuadrupolo selecciona

los iones por el tiempo que varían los campos eléctricos entre las cuatro barras, lo que permite

una trayectoria estable sólo para los iones de una m/z deseada particular. Así, los iones de una

m/z específica se seleccionan en la primera sección (Q1), fragmentadolos en una celda de coli-

sión (q2) y los fragmentos se separan en otra celda (Q3). En la trampa de iones lineal, éstos se

capturan en una cuarta sección, señalada por el punto rojo en Q3. Los iones se excitan por un

campo eléctrico resonante y los fragmentos se miden, creando el espectro de masas en tándem.

D) El cuadrupolo TOF combina la parte frontal de un triple cuadrupolo con una sección TOF

reflector para medir la masa de los iones. E) La trampa de iones tri-dimensional captura los iones

como en la trampa de iones lineal, los iones fragmentados de una m/z particular se miden y

generan el espectro de masas en tándem. F) El espectrómetro FT-MS atrapa los iones con la

ayuda de fuertes campos magnéticos. La figura muestra la combinación de FT-MS con la tram-

pa de iones lineal para el aislamiento y fragmentación eficiente y la detección de fragmentos en

la sección del FT-MS. (Reproducida con autorización de Aebersold R y Mann M (2003) Mass spec-trometry-based proteomics. Nature 422: 198-207).

lo que permite conocer la secuencia de aminoácidos de cada uno de ellos. Esta estrategia haevolucionado hasta combinarse con las técnicas multidimensionales y es aplicada a sistemasbiológicos diversos, como las enfermedades cardiacas usando como modelo el ratón.61 Hoy día,hay una gran necesidad para una detección rápida e identificación positiva de agentes biológi-cos infecciosos peligrosos, así como especies microbianas en general, de muestras ambientalescomplejas y directas. La necesidad es urgente en el caso de bioseguridad en el mundo, pero tam-bién es necesaria en ciencias médicas, ambientales y agrícolas. La proteómica por escopetazo escapaz de distinguir una especie blanco entre una mezcla de varias especies de fondo, en la basede datos. Hace poco, se identificó la especie blanco Escherichia coli en una mezcla con cuatro


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B

A

C

HN2

Figura 13-15. Análisis de la secuencia de un péptido por MS/MS. Una mezcla de proteínas se sepa-

ra por LC y se ioniza por ESI para generar patrones fragmentados (espectro MS/MS). En el primer

paso, una mezcla de péptidos cargados (indicados como flechas) se separa de acuerdo a sus pro-

porciones m/z para crear una lista de los picos peptídicos más intensos. A) El instrumento se ajusta

a que sólo una especie de m/z específica (indicada con la flecha más larga) sea dirigida a la cáma-

ra de colisión para generar iones "hijos" derivados de las especies "padres". B) Los fragmentos gene-

rados de novo se separan de acuerdo a su proporción m/z, creando el espectro MS/MS. Al usar ener-

gía de colisión apropiada, la fragmentación ocurre principalmente en los puentes peptídicos, de tal

modo que se genera una escalera de fragmentos de los cuales cada uno difiere por la masa de un ami-

noácido. C) La secuencia del péptido se puede deducir por medio de una "caminata en la escalera".

(Reproducida con autorización de Zhu H et al. Proteomics. Annu Rev Biochem 2003;72:783-812).

especies contaminantes, en un tiempo de análisis de 60 a 240 min. La aplicación potencial deesta tecnología para la detección de agentes biológicos peligrosos está en desarrollo.62

5. Proteómica cuantitativa

La comprensión molecular de los procesos de enfermedad a menudo requiere la com-paración de sistemas celulares normales y en estado patológico para identificar y cuan-tificar los cambios que se efectúan en el proteoma. Por ello se ha desarrollado tecnologíaque permite la cuantificación relativa directa e identificación de las proteínas. Esta tecnolo-gía llamada proteómica cuantitativa se basa en el marcaje metabólico, químico o enzimáticode las proteínas (figura 13-19), que se combinan con LC y MS. La ventaja de estos méto-dos es el uso de cantidades de muestra muy pequeñas para su análisis (cuadro 13-4).

A. SILAC. El método llamado marcaje estable de células en cultivo con aminoá-cidos marcados isotópicamente (stable-isotope labeling with amino acids in cell culture,


:

Figura 13-16. MALDI-TOF o Huella peptídica (Peptide Mass Fingerprinting: PMF). Las proteínas

se separan en un gel en 1D o en 2D, la banda o mancha elegida se escinde del gel, se digiere

con tripsina y los péptidos producidos se ionizan en un MALDI-TOF generando un espectro de

masas. Cada proteína genera un espectro característico, "huella peptídica" o PMF que permite

identificar a la proteína en la base de datos. Estos datos son generados por el análisis in silicode secuencias de DNA.

SILAC), es una técnica cuantitativa que consiste en marcar metabólicamente célulasen crecimiento en algún estado fisiológico determinado con un aminoácido marcadode forma estable (12C6-arginina, 2H3-leucina, 13C6-arginina, 2H4-lisina (figura 13-20). Las muestras se mezclan y digieren con una proteasa para su análisis. El mar-caje incrementa la masa de las proteínas en el proteoma-SILAC, por tanto, la difer-encia de masa introducida por el aminoácido marcado permite la cuantificación relativa de la intensidad de las dos formas en el mismo espectro de masas, con lo quese pueden comparar los cambios en la expresión de proteínas. El SILAC se combinacon MudPIT y MS, que permiten el análisis de muchas proteínas en un solo experi-mento comparativo.63, 64, 65 Con este método se logró la caracterización de los componentes proteínicos de los rafts de membrana plasmática (microdominios demembrana ricos en colesterol, implicados en procesos como vías de señalización ytráfico vesicular) de células HeLa.66

B. ICAT. La estrategia de marcaje químico con isótopos estables y una etiqueta deafinidad (isotope-coded affinity tag, ICAT), es una tecnología para la cuantificación relativaprecisa de proteínas en mezclas complejas. Este marcaje usa reactivos (ICAT) que contienen


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Figura 13-17. Tecnología Multidimensional. La combinación de técnicas de separación de pép-

tidos de alta eficiencia, la llamada tecnología multidimensional para la identificación de proteí-

nas (Multidimensional protein identification technology: MudPIT) combina la cromatografía líqui-

da de alto rendimiento (high performance liquid chromatography: HPLC) con diferentes sistemas

de detección como MS y MS/MS. (Reproducida con autorización de Gingras AC et al.: (2005)

Advances in protein complex analysis using mass spectrometry. J Physiol 531.1: 11-21)

un grupo que reacciona con cisteína, un linker que puede contener ocho hidrógenos (ligero)u ocho deuterios (pesado) y una molécula de biotina como ancla de afinidad. Las muestrasproteínicas de dos estados celulares diferentes se marcan con dos reactivos idénticos quími-camente que difieren sólo en su masa debido a la composición del isótopo. Esta diferenciapermite que las proteínas de las dos muestras puedan cuantificarse por MS (figura 13-21).67 Las muestras se mezclan, se digieren con tripsina, los péptidos etiquetados se


200 nL/min

10 µL/min

Figura 13-18. Tecnología de identificación y cuantificación global de proteínas. Las muestras fueron

analizadas usando un sistema automatizado de LC/MS (cromatografía líquida/espectrometría de

masas). Los péptidos se separaron por LC, usando una columna de intercambio catiónico (strong

cation exchange, SCX) como primera dimensión, con una velocidad de flujo alta y una columna micro-

capilar de fase reversa (reverse-phase, RP) como una segunda dimensión a una velocidad de flujo

baja. Dos trampas de péptidos situadas entre las columnas SCX y RP, permiten la elusión de la colum-

na SCX hacia una primera trampa de péptidos, mientras los péptidos de la segunda trampa pueden

separarse sobre la columna RP y analizarse en el espectrómetro de masas. Puede usarse una válvu-

la a presión para cargar una trampa de péptidos, mientras se analizan los péptidos en la otra trampa.

Los péptidos eluídos se introducen directamente al analizador de masas. El espectro producido por el

análisis en tándem se correlaciona con espectros teóricos generados por una base de datos de prote-

ínas por el algoritmo SEQUEST para la identificación de péptidos. El espectro de masas totales se usa

para calcular la cantidad relativa de los péptidos. Los resultados de muestras diferentes pueden compa-

rarse para la cuantificación relativa de proteínas basada en el área de los picos de los péptidos identifi-

cados generando una lista de proteínas y su concentración relativa en dos muestras. (Reproducida con

autorización de Chelius D et al. Global protein identification and quantification technology using two-dimensional liquid chromatography nanospray mass spectrometry. Anal Chem 2003;75: 6658-6665

Copyright © (2003) American Chemical Society.)

colectan por cromatografía de afinidad a avidina, se analizan por LC-MS para cuantificar larelación de los marcadores sobre péptidos idénticos y al final los péptidos se analizan porLC-MS/MS para identificar las proteínas. La ventaja de este método es que facilita la detec-ción de proteínas que se encuentran en un número de copias muy bajo en la célula.45, 68,69 Esta estrategia ha sido utilizada en estudios de genómica funcional,70 identificación deproteínas en células de leucemia humana en diferenciación;71 proteínas de células expues-tas a estrés oxidativo en envejecimiento y enfermedad;72, 73 localización de proteínas deorganelos para estudiar el tráfico y función celular.74

C. ITRAQ e IDBEST. Son métodos que usan el marcaje químico no metabólico de lasproteínas sin la necesidad de crecer células en cultivo, para la identificación y cuantificaciónde péptidos. El ITRAQ usa etiquetas específicas para grupos amino, con masa muy peque-ña del mismo peso molecular, pero con diferentes patrones de fragmentación durante laidentificación por MS/MS.75, 76 El IDBEST permite la cuantificación e identificación conalta precisión, de los péptidos que han sido regulados en casos de enfermedad.77

Cuadro 13-4. Tecnología de separación de proteínas y sus aplicaciones

Tecnología Cuanti. PTM Separación Preparación Experiencia Prot/Pep Abundancia2

basada en

geles

E1D No1 No2 Baja Simple Poca PR/PEP Media-alta

E2D Relativa Si2 Media-alta Moderada Avanzada PR Media-alta

Cuantificación Relativa Sí N/D Simple Poca PR Media-alta

relativa

2DE-DIGE

Cromatografía No1 No2 Media Simple Intermedia PR/PEP Baja-alta

RP-HPLC

IC No1 No Media Simple Avanzada PR Media-alta

Afinidad No1 No Alta Simple Poca PR/PEP Baja-alta

EC No1 No Alta Simple Avanzada PEP Baja-alta

C2D No1 Sí2 Alta Simple Avanzada PR/PEP Baja-alta

Estrategias No1 Sí3 Alta Moderada Avanzada PR/PEP Baja-alta4

combinadas

IE/RP-HPLC

MudPIT

Cuantificación Relativa5 Sí N/D Moderada Intermedia PEP Baja-alta4

relativa /avanzada

ICAT/Itraq/

/IDBEST

/H2O18

Cuanti.: cuantitativa; PTM: modificaciones postraduccionales; * Preparación de la muestra; Prot/pep: separación de proteínas, o

ambos; ** Abundancia de proteínas (número de copias); 1 Para cuantificar debe haber una mancha, banda o pico que represente a

una sola proteína; 2 dependiente del cambio del pl en E2D, dependiente de la hidrofobicidad y pl en 2DLC, algunos cambios hidro-

fóbicos para HPLC, algunas variaciones en la masa (fosforilación/glucosilación) para E1D; 3 puede resolver diferencias en PTM entre

fragmentos de péptidos; 4un bajo límite de detección si se acopla a MS para su detección; 5 cuantificación conocida; RP: fase rever-

sa IC: intercambio catiónico; EC: electroforesis capilar; C2D: cromatografía en dos dimensiones; IE: intercambio iónico.


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D. Marcaje de los extremos N-terminal y C-terminal. El marcaje con un isótopo establede los extremos N-terminal de péptidos derivados de proteínas separadas por E2D y gene-radas por CID, facilitan la secuenciación de novo por MS/MS.78, 79 El extremo C-terminalde los péptidos se puede marcar por medio de una reacción enzimática que incorpora 18O apartir de H2-18O durante la proteólisis con tripsina. Esta etiqueta permite su cuantificaciónrelativa. La muestra control se digiere en H2-16O80, 81 (figura 13-18).

6. TECNOLOGÍA DE PUNTA EN PROTEÓMICA

A. LCM. Una estrategia alternativa para obtener y analizar muestras clínicas es la obten-ción de células por microdisección asistida por láser (laser capture microdissection, LCM).Esta técnica permite seleccionar poblaciones celulares específicas de una sección detejido heterogéneo y complejo bajo visualización directa en el microscopio, al eliminarlos problemas de heterogeneidad y contaminación en las muestras.82, 83 Aunque LCMrequiere mucho tiempo para disectar suficientes células, ya ha sido combinada con E2D-MS,84, 85 E2D-DIGE,86 SELDI-TOF MS (200-2000 células; figura 13-19)87, 88 e ICAT-SCX-RPLC-MS/MS89 (figuras 13-22 y 13-23). Con esta estrategia se podrán identificarproteínas de expresión diferencial y utilizarlas como marcadores potenciales y blanco dedrogas para diagnóstico y tratamiento de enfermedades.

B. SELDI. El descubrimiento, identificación y validación de proteínas asociadas con unaenfermedad particular es una tarea difícil y laboriosa, y con frecuencia requiere de cientos,si no miles, de muestras para ser analizadas. Para evitar estas dificultades, se desarrolló unmétodo de escrutinio muy sensible (femtomoles) para el análisis de muestras de proteínascomplejas, el ya mencionado SELDI-TOF MS, Arreglos de proteinas o Chip de Proteí-nas (protein arrays o Proteinchip®).90, 91 Las proteínas de mezclas complejas se adsorbenselectivamente a una superficie modificada químicamente, las impureza se eliminan conlavados, se aplica una matriz que absorbe energía y se ionizan e identifican por TOF-MS92,

93, 94 (figuras 13-23 y 13-24). SELDI permite analizar el perfil proteínico de muestrasbiológicas complejas (como suero, plasma, sangre, fluido intestinal, orina, lisados celulares yproductos de secreción celular) y muy pequenas (en μL o entre 25 a 50 celulas);95, 96, 97

también identifica moleculas < 20 kDa. Con esta tecnología se han descubierto marcadoresproteínicos en diferentes tipos de cáncer y otras enfermedades, es muy prometedora en eldiagnóstico y búsqueda de candidatos de drogas potenciales de muchas enfermedades,incluidas las alergias, donde deben usarse múltiples analitos.

7. PROTEÓMICA FUNCIONAL

A. Mapas de interacción de proteínas

Varias tecnologías para estudiar las funciones o procesos celulares específicos se han basa-do en ensayos enzimáticos, purificación de complejos o localización subcelular, enfocadaen un pequeño grupo de genes o proteínas. En la proteómica funcional hay estrategiasprometedoras para la identificación de nuevos blancos terapéuticos, directamente


relacionados con la función de proteínas identificadas en vías celulares relevantes en laenfermedad. En la actualidad se están usando varias estrategias que permiten la detecciónde interacciones proteína-proteína para construir mapas de interacción de proteínas o laidentificación de éstas y sus genes cuyos productos están relacionados funcionalmente yque junto con técnicas convencionales, integren complejos enzimáticos y cascadas deseñalización (vías metabólicas e interactomas) en la célula y a su vez se relacionen con losmapas funcionales obtenidos en otras áreas como genómica (figura 13-25).


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Marcaje metabólico con isótopos estables

Mar

caje

de

prot

eína

sO

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ción

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dato

sA

nális

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tos

Inte

nsid

ad

m/z m/z m/z

Inte

nsid

ad

Inte

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ad

Masa

Digestión

Marca

Digestión

Digestión

A) B) C)

LigeroPesado

Marcaje químico con etiquetas

Marcaje enzimático con isótopos estables

MS

Figura 13-19. Proteómica cuantitativa. La proteómica cuantitativa es una tecnología que permite

la cuantificación directa de proteínas así como su identificación, en base a un marcaje metabólico,

químico o enzimático. A) Las proteínas pueden marcarse metabólicamente al cultivar las células

en medio enriquecido con isótopos (sales-15N o aminoácidos-13C). B) Las proteínas pueden mar-

carse en sitios específicos con reactivos isotópicamente marcados. Estos reactivos pueden conte-

ner etiquetas de afinidad, permitiendo el aislamiento selectivo de los péptidos marcados después

de la digestión de proteínas. C) Las proteínas también se pueden marcar en el extremo carboxilo

por medio de una reacción enzimática, con 18O a partir de 18O-H2O durante la proteólisis. Las pro-

teínas o péptidos marcados se mezclan, separan y analizan por MS y/o MS/MS para identificar las

proteínas y determinar su abundancia relativa. (Reproducida con autorización de Aebersold R y

Mann M (2003) Mass spectrometry-based proteomics. Nature 422: 198-207).

1. Sistema de doble híbrido en levaduras. El ensayo de doble híbrido (yeast twohydird, Y2H) es un ensayo ex vivo que detecta interacciones físicas binarias. Desde sudescripción original Y2H ha sido usado extensamente para identificar las interaccio-nes proteína-proteína.98 Inicialmente diseñado para la detección de interacción entre dosproteínas conocidas, fue desarrollado rápidamente como un ensayo de tamizaje paraencontrar el par molecular de una proteína de interés.99, 100 En el sistema Y2H, las proteínas activadoras son responsables de controlar la expresión de genes en eucariotes.Para realizar su función, el activador transcripcional debe unirse a una secuencia de DNAcorriente arriba del gen y estimular a la enzima RNA polimerasa para copiar el gen enRNA. Estas dos capacidades están codificadas por diferentes partes del activador y ésteserá funcional aun después del corte en dos segmentos, uno que contiene el dominio de


Figura 13-20. Marcaje estable de células en cultivo con aminoácidos marcados isotópicamente

(stable-isotope labelling with amino acids in cell culture: SILAC). SILAC es una técnica cuantita-

tiva que consiste en marcar metabólicamente células en crecimiento en algún estado fisiológico

determinado con un aminoácido marcado. Este método permite la comparación directa de cam-

bios en la expresión de proteínas entre dos muestras relacionadas. Las dos muestras marcadas

diferencialmente se mezclan, digieren con una proteasa y pueden ser sujetas a cualquier tipo de

separación. Esta tecnología permite la identificación y cuantificación de muchas proteínas en un

solo experimento comparativo.

unión a DNA y otro el de activación. En la célula, los dos segmentos interactúan para for-mar el activador funcional (figura 13-26). El éxito de esta técnica se basa en su relativasimplicidad, bajo costo y su potencial para la industrialización y automatización, ya quepueden determinarse sistemáticamente cientos o miles de interacciones.

En la actualidad hay muchas variaciones alrededor del mismo principio, cuyo objeti-vo ha sido encontrar el par funcional para una o varias proteínas y construir hipótesis enbase a los datos obtenidos en ensayos Y2H.101, 102, 103 Entre algunos organismos, el inter-actoma de Drosophila melanogaster, considerado un sistema modelo para la biología, pro-cesos de enfermedad y desarrollo humano (http://www.pim.hybrigenics.com) ha sido


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S/M

S

Figura 13-21. Marcaje químico de proteínas con isótopos estables y una etiqueta de afinidad

(isotope-coded affinity tag: ICAT). Las proteínas de dos estados celulares diferentes se marcan

con dos reactivos químicamente idénticos, que difieren sólo en su masa debido al isótopo usado.

Para marcar las proteínas, se utilizan los reactivos llamados ICATs, los cuales contienen tres

elementos: un grupo reactivo tiol-específico que se une a residuos de cisteína; un linker deute-

rado (reactivo pesado, con deuterio en la posición indicada con una X) o no deuterado (reactivo

ligero, con H en la posición indicada con X); y una etiqueta de biotina que se usa para el aislamien-

to, por afinidad a avidina, de los péptidos marcados con ICAT. La marca diferencial en la masa de

las proteínas permite su cuantificación e identificación por MS y MS/MS respectivamente.

descrito (figura 13-27)104. Estos mapas de interacción constituyen el punto de inicio paracrear modelos en la biología de sistemas de organismos multicelulares, incluyendo humanos.Hoy día, la biología de sistemas describe iniciativas y tecnología enfocadas a conocer y entender las operaciones e interrelaciones (redes de señalamiento, mapas de interac-ción, entre otros) de sistemas biológicos complejos, útiles para desarrollar modelos com-putarizados para la predicción de enfermedades humanas. Sitio con redes de interacciónPIMWalker: http://pim.hybrigenics.com/pimwalker/.


Figura 13-22. Microdisección asistida por láser (laser capture microdissection: LCM). Esta téc-

nica permite seleccionar poblaciones celulares específicas de una sección de tejido heterogé-

neo y complejo, bajo visualización directa en el microscopio, para utilizarlas en análisis proteó-

micos. Aquí se muestra el aislamiento de un septo alveolar de ratón, teñido con hemalaun, por

LCM de una sección congelada de pulmón (aumento 200x). A) Se selecciona un septo para ais-

larlo. B) Las células se desconectan de otras adyacentes con fotolisis por láser. C) Las células

del septo se adhieren fuertemente a una aguja estéril que se acercó para transferirlas a un tubo

de reacción. Estas células se utilizaron en un análisis proteómico por SELDI-TOF MS MS/MS.

D) Comparación de espectros obtenidos por SELDI-TOF MS de los perfiles de proteínas de célu-

las microdisectadas y secciones de tejido de pulmón. 4 000 células microdisectadas por LCM (sep-

tos alveolares de la figura anterior) y de cinco secciones de tejido de pulmón se lisaron y unieron

a un arreglo de proteínas de intercambio catiónico (weak cationic exchanger: WCX). Se usó la can-

tidad mínima de material para poder observar tres proteínas blanco previamente identificadas con

el mismo método pero con 20 000 células y MS/MS, en este mismo trabajo. Los picos señalados

corresponden a: histona H2B F (13.8), histona H2A.I (14.0) y hemoglobina β (15.7). (Reproducida

con autorización de Kwapiszewska G, Meyer M, Bogumil R et al.: Identification of proteins inlaser microdissected small cell numbers by SELDI-TOF and tandem MS. BMC Biotechnology

2004,4: 30-39).

Muy recientemente, se han publicado versiones preliminares sobre las interac-ciones proteína-proteína en humano donde, además de la metodología Y2H, se ha uti-lizado un análisis probabilístico para integrar los datos de interactomas de organismosmodelo, dominios de proteínas, expresión genómica y proteómica en muestras de teji-dos humanos y anotación funcional obtenida del Gene Ontology (programa informáti-co que asigna funciones a las proteínas en base a su secuencia); (figura 13-28). Estos trabajos representan un inicio del proyecto del interactoma humano,105, 106 con el cualse espera avanzar en el conocimiento de los mecanismos de desarrollo y enfermedadescomo el cáncer.


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Figura 13-23. Diagrama de flujo de ICAT-LC-MS. Muestras control y de prueba se marcan con

reactivos ICAT pesado (P) y ligero (L), se mezclan y digieren con tripsina. Los reactivos marcan

uno o más grupos tiol-cisteinil en las proteínas. Para aislar los péptidos-ICAT la mezcla se pasa

por una columna de avidina (cromatografía de afinidad) y después se separan y analizan por

LC-MS-MS/MS. El espectro m/z muestra la concentración de las proteínas-P y proteínas-L en

ambas muestras y el espectro MS/MS muestra la identidad de la proteína. La incorporación de

microdisección asistida por láser (LCM) aumenta la precisión de la proteómica comparativa y

cuantitativa de muestras patológicas. (Reproducida con autorización de Somiari RI et al. (2005)

Proteomics of breast carcinoma. J Chromatogr B 815: 215-225).

2. Despliegue en fagos. La estrategia de despliegue en fagos (phage display), desarrolladaen el decenio de 1990-1999, es una técnica molecular por medio de la cual secuenciasnucleotídicas de proteínas extrañas son clonadas y expresadas en el gen de una proteína de lacubierta de partículas de fago (bacteriófagos λ, filamentoso M13 o T7) que tienen la capacidadde replicarse (figura 13-29).107, 108 Phage display es una herramienta muy poderosa que per-mite que la proteína de fusión se despliegue de tal forma que facilita la interacción con otrasproteínas que el fago encuentra, para seleccionar in vitro de una gran cantidad de variantes, pép-tidos o proteínas con propiedades de unión específica, que permite estudiar los aspectos mo-leculares de las interacciones proteína-proteína, ligando-receptor y antígeno-anticuerpo.109

B. Análisis de complejos de proteínas por nano-LC-MS/MS

Para una identificación más eficiente de los complejos proteínicos se desarrolló una nuevatecnología, el sistema LC por direct nano-flow. Este sistema se acopla con tándem MS ybioinformática para procesar los datos y asignar proteínas en las bases de datosgenoma/proteína. La característica más notoria del sistema nano-LC es su sistema deelusión en gradiente que usa una columna miniaturizada de fase reversa de alta resolución,


Sonda de proteína

Figura 13-24. Microarreglos de proteínas y sus aplicaciones. Para construir microarreglos fun-

cionales y analíticos diversos ligandos, como proteínas, péptidos, anticuerpos, antígenos, aler-

genos y moléculas pequeñas, se inmovilizan sobre una superficie modificada. Los microarreglos

de proteínas pueden utilizarse para varios tipos de análisis bioquímicos. (Reproducida con auto-

rización de Zhu H et al. Proteomics. Annu Rev Biochem 2003;72: 783-812).

con una velocidad de flujo muy lenta (_> 50 nL/min). Los péptidos separados por nLC-ESI se introducen directamente al MS (QToF2) sin difusión, para maximizar la concen-tración. El análisis de un complejo proteínico que une nucleolina se hizo en 60 min con~ 200 ng, cantidad mucho menor a la que requiere un LC-convencional.110

C. Análisis de modificaciones postraduccionales (PTM)

La proteómica está enfocada a determinar los niveles de proteínas en función de lascondiciones del crecimiento celular o los cambios inducidos por mitógenos o enfermedades.


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Figura 13-25. Interrelación de mapas funcionales. El espectro cubierto por estrategias proteómi-

cas diferentes está marcado de negro: ensayos de doble híbrido en levadura (Y2H) y ProteinChips

permiten el mapeo de interacciones binarias (interactoma). La purificación por afinidad acoplada a

la identificación por MS (AP/MS) identifica inicialmente los complejos de alto orden y sus conexio-

nes (complejoma) y contribuyen a la caracterización del proteoma. Los diferentes mapas funciona-

les se indican en color gris. Las diferentes formas regulatorias que pueden controlar la expresión

coordinada e integrada y el ensamblaje, se muestran a la izquierda. El número calculado de uni-

dades funcionales (genes, transcriptos, proteínas, interacciones binarias y complejos) se obtuvie-

ron tomando a la levadura como un organismo modelo en condiciones de crecimiento estándar.

(Reproducida con autorización de Drewes y Bouwmeester (2003) Global approaches to protein-pro-tein interactions. Curr Opin Cell Biol 15:199-205).

Sin embargo, la identificación de proteínas celulares no siempre es suficiente para inter-pretar las funciones biológicas debido a que en muchas de ellas ocurren PTM. Éstassirven como interruptores de encendido y apagado o moduladores de la actividad o eti-quetado de las proteínas, también regulan el ensamblaje-desensamblaje de complejosmacromoleculares. Existen más de 200 PTM que incluyen fosforilación, glucosilación,acetilación, desaminación, miristoilación, palmitoilación, ubiquitinación, etc.111, 112 Las


GAL1-lacZ

Región activador

r

GAL1-lacZ

GAL1-lacZ

GAL1-lacZ

G

G

G

X

Y

Y

Figura 13-26. Ensayo de doble híbrido. Modelo de activación transcripcional por restablecimiento

de la actividad de GAL4. La proteína nativa GAL4 de la levadura S. cerevisiae es un activador de

la transcripción necesario para la expresión de genes que codifican enzimas que utilizan galacto-

sa. A) La proteína nativa GAL4 contiene ambas regiones, la que se une a DNA y la que activa e

induce la transcripción de GAL1-lacZ. B) Los híbridos que contienen sólo el dominio de unión a

DNA (arriba) o la región activadora (abajo) son incapaces de inducir la transcripción. C) La interac-

ción proteína-proteína entre la proteína X y la proteína Y une los dominios de GAL4 y esto resulta

en la activación de la transcripción. (Reproducida con autorización de Fields S y Song O (1989) Anovel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature 340: 245-246).


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CG31997

CG10689

CG6340CG1138

CG6843CG6066

Tfb2

CG31211CG10324

CG5343 Spr54

CG44323CG11266

CG46174490

abs

BcDNA:GH09817

Localización subcelular

Rango de interacción

Figura 13-27. Interactoma de Drosophila melanogaster. Mapa de interacción de proteínas basado en

ensayos de doble híbrido que muestra su localización subcelular. Las proteínas están señaladas con

colores de acuerdo a la familia a la que pertenecen según el Gene Ontology Cellular Component (pro-

grama que asigna funciones a las proteínas en base a su secuencia de aminoácidos y a la formación

de dominios). El mapa muestra 2346 proteínas y 2268 interacciones. (Reproducida con autorización

de Giot L, Bader JS, Brower C, Chaudhuri A et al (2003): A protein Interaction map of Drosophila mela-nogaster. Science 302: 1727-1736).

PTMs mejor caracterizadas en eucariotes son la fosforilación y glucosilación. Los méto-dos basados en genómica y bioinformática no permiten una investigación detallada de laestructura y dinámica de las PTM, en cambio la tecnología proteómica facilita un análi-sis detallado y global.


Figura 13-28. Red de interacción de proteínas CCSB-HI1 (Center for Cancer systems BiologyHuman Interactions version 1) asociadas a enfermedades humanas. La red tiene 121 proteínas

asociadas a enfermedades OMIM (Online Mendelian Inheritance in Man) y 424 interacciones

CSB-HI1 que las envuelven (líneas negras), junto con interacciones LC (interacciones publica-

das en la literatura y analizadas -"curadas"-) conocidas (las líneas sólidas grises representan

interacciones binarias LCI y las líneas grises punteadas representan interacciones no-binarias).

Las proteínas sin una asociación OMIM se muestran como nodos grises y líneas azules finas

indican interacciones LCInon-core; las líneas grises medias muestran interacciones en el centro-

LCI y las líneas gruesas representan interacciones LCI-hypercore. De las 424 interacciones

CCSB-HI1, 94 están involucradas con proteínas relacionadas con el sarcoma de Ewing (EWSR1,

conocida también como EWS). (Reproducida con autorización de Rual JF et al.: (2005) Towards aproteome-scale map of the human protein-protein interaction network. Nature 437: 1173-1178).

1. Fosfoproteómica. El fosfoproteoma constituye la red compleja de todas las proteí-nas que son fosforiladas de forma estable o pasajera en una célula viva. Los eventos de trans-ducción de señales, basados en la fosforilación, involucran la transmisión y amplificación deseñales desde receptores de membrana al núcleo. También desempeña una función muyimportante en la adaptación a cambios ambientales, desarrollo, proliferación, diferenciacióny control del crecimiento. Ha sido implicada en varias enfermedades como diabetes, enfer-medades neurodegenerativas, autoinmunitarias y varias formas de cáncer. Tiene un poten-cial muy grande para guiar el descubrimiento de nuevos blancos de drogas contra cáncery la utilización racional de quimioterapias específicas de vías de señalamiento.

Tradicionalmente, el estudio de la relación entre estructura y función de las fosfoproteí-nas involucró estrategias clásicas de química de proteínas para mostrar que una proteína enparticular llegaba a ser fosforilada en respuesta a un estímulo. Esas incluyen la purificacióndeproteínas, mapeo de péptidos, secuenciación del extremo N-terminal, el marcaje in vivo,inmunoprecipitación (IPP) con anticuerpos específicos anti-proteínas fosforiladas y eldesplazamiento de bandas o manchas en un Western en E1D o E2D respectivamente.Recientemente se logró la identificación de una proteína, frigg, un nuevo sustrato para la pro-teína cinasa, utilizando tecnología de primera generación (IPP-E1D) combinada con MS.113

La fosforilación reversible, que transforma más de 30% del proteoma, se lleva a cabosobre los aminoácidos tirosina, serina o treonina. A pesar de que la fosfotirosina consti-tuye sólo 0.05% del contenido de fosfo-aminoácidos celulares totales, es el mecanismo deseñalamiento más potente en la regulación de proliferación celular de mamíferos y real-iza una función muy importante en el señalamiento, desarrollo y crecimiento en eucari-otes. Por tanto, la desregulación de los mecanismos de control, especialmente en el casode tirosina, lleva a transformación maligna y enfermedad.

a) Análisis por SILAC-IPP-LC-MS/MS. El fosfoproteoma-Tir se puede analizar utilizan-do la estrategia de SILAC114 combinada con IPP, ya que la fosforilación en Tir se detectafácilmente con anticuerpos específicos115 y LTQ-FT MS. La MS/MS, de sensibilidad muyalta (atomoles), aumenta las posibilidades de identificar fosfoproteínas en proteómica deseñalamiento.116 La cromatografía de inmunoafinidad con antifosfotirosina117 sería unabuena opción para este tipo de ensayos.

Hace poco se describió una extensión del método SILAC, que permite la comparaciónen un solo análisis de tres muestras de proteínas tomadas en periodos diferentes y la con-strucción de los perfiles temporales de fosforilación de una manera global. Tres lisados celu-lares marcados con tres formas diferentes de arginina, se IPP con Ac antifosfotirosina y seanalizaron por LC-MS/MS (figura 13-30).118

b) Análisis por microarreglos. Para monitorear cambios en la fosforilación de proteínas anivel de tirosina, se utilizó una plataforma de microarreglos con un anticuerpo prototipo, quecontiene una cantidad ilimitada de anticuerpos, donde cada uno reconoce una proteína celu-lar específica. El Ac se plaqueó sobre un chip, incubó con extracto celular total (tejidos o fluidos biológicos) y probó con un Mab específico anti-p-Tir marcado con un reactivo fluo-rescente (figura 13-31). El sistema puede ser útil para estudiar vías de señalamiento, clasifi-cación molecular de tumores y búsqueda de nuevos blancos para drogas contra el cáncer.119

c) Análisis por modificación química BEMAD. Las fosfoproteínas que contienen fos-foserina/fosfotreonina también se pueden enriquecer por modificaciones covalentes queincorporan una etiqueta de afinidad (affinity tag) a los fosfoaminoácidos. Éstos se marcan


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p2

g2

g1Or

p1

Figura 13-29. Principio molecular del despliegue en fagos (phage display). A) El bacteriófago M13 es

ampliamente utilizado como vehículo para el phage display. La proteína de cubierta pIII se puede usar

como un par de fusión para un número limitado de proteínas (máximo cinco), mientras que cientos de

proteínas se pueden expresar en la superficie del fago si se usa pVIII como par de fusión. En esta figu-

ra se indica el número aproximado de copias de cada proteína de la cubierta de M13. B) El genoma

de un bacteriófago hipotético simplificado muestra un origen de replicación (Or) y los genes (g1 y g2)

que codifican dos tipos de proteínas de la cubierta o envoltura, p1 y p2 respectivamente. Una proteí-

na extraña px, codificada por el gen gx, puede ser desplegada en la superficie del fago por la fusión

de gx a uno de los genes de la proteína de la cubierta del fago. El número de copias de px que se

despliega, se relaciona con la proteína de la cubierta (p1 o p2) que se escoge como par de fusión. C)

Este principio puede aplicarse a la expresión de péptidos específicos o al azar, dominios de proteínas

o proteínas completas y fragmentos de anticuerpos. D) Con el phage display, una biblioteca de

secuencia de nucleótidos se puede convertir en una biblioteca de péptidos o proteínas. Esta bibliote-

ca puede tamizarse para aislar péptidos o proteínas con propiedades específicas desplegadas en el

fago. (Reproducida con autorización de Springer Science and Business Media, Willats WGT: Phagedisplay: practicalities and prospects. Plant Mol Biol 2002;50: 837-854).

a través de la adición de Michael (beta-elimination/Michael addition: BEMAD) conditiotreitol (DTT) normal (D0) o DTT deuterado (D6) y se enriquecen por cro-matografía de afinidad a grupos tiol. La diferencia de 6 Da permite la cuantificacióndiferencial en un MALDI-MS LC-MS.120, 121 Esta estrategia podría combinarse con losdominios recombinantes que unen fosfoserina y fosfotreonina122 o con Ac antifosfoserinay antifosfotreonina o por IPP clásica, para separarlas.

d) Análisis por IMAC-LC MS/MS. Una de las estrategias para estudiar las fosfoproteínasy fosfopéptidos es el uso de cromatografía de afinidad con metales inmovilizados (Fe3+IMAC), que puede combinarse con cromatografía de intercambio aniónico. Con estaestrategia se identificaron nuevas proteínas fosforiladas en la sinapsis de ratón (figuras 13-32 y 13-33), donde varias de las fosfoproteínas identificadas están implicadas en la regu-lación de la plasticidad sináptica, proceso que se considera está involucrado en el apren-dizaje y la memoria, adicción a las drogas y el dolor, otras relacionadas con esquizofreniay otras enfermedades mentales, en neurodegeneración y patología neurofibrilar.123

APLICACIONES BIOMÉDICAS

La proteómica está íntimamente ligada a las ciencias biomédicas, el mayor interés en añosrecientes es la búsqueda de biomarcadores moleculares de enfermedades para utilizarlosen el diagnóstico y predicción de enfermedades y como blancos potenciales para drogaso blancos para tratamientos terapéuticos. Con la tecnología proteómica se están desarro-llando nuevas disciplinas en la rama de la medicina que a mediano o largo plazo traeránbeneficios en el área de la salud.

Proteómica clínica.

La proteómica clínica es una nueva subdisciplina de la proteómica, cuyo objetivo es buscar bio-marcadores de una enfermedad para utilizarlos en el diagnóstico y pronóstico además del mon-itoreo del tratamiento. Esto involucra la aplicación de las herramientas de la proteómica de lamesa de trabajo a la cama del paciente.Ya que la proteómica no tiene un equivalente a la reac-ción en cadena de la polimerasa, la identificación de células humanas enfermas en una biopsiapermanece como un reto muy difícil de alcanzar. Los cambios en el nivel de expresión, a travésdel curso de una enfermedad, podrían ser monitoreados en los fluidos corporales como el sueroy el líquido cefalorraquídeo. Si al analizar este último se observa alguna proteína alterada, estopuede indicar cambios en el sistema nervioso central, por lo que esa proteína podría utilizarsecomo un marcador para el diagnóstico o para un estudio causal (figura 13-34).124 Estos des-cubrimientos podrían reforzarse a través del análisis microproteómico de áreas específicas delcerebro implicadas en la patología. La tecnología microproteómica está en desarrollo y es estric-tamente necesaria para el descubrimiento de marcadores que faciliten el desarrollo de análisisclínico y preclínico que lleve a nuevas acciones terapéuticas selectivas y rápidas.125

A nivel clínico, alrededor de 7% de los pacientes hospitalizados tienen reaccionesadversas severas a los fármacos que les son administrados, en algunos casos el efecto colate-ral es difícil de predecir debido a que se desconoce la farmacología del agente causal. Laproteómica puede tener algún valor de predicción y puede ser muy útil en el diagnóstico,


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reconociendo un blanco para un fármaco en un tejido accesible como la sangre o unabiopsia.126 Sería muy útil desarrollar un ensayo in vitro que evite reestimular al pacientecon el fármaco que lo perjudica.127


P

P P PP

P

P

P

PP

Figura 13-30. Análisis de fosfoproteínas por SILAC e inmunoprecipitación. Las células son cultivadas

por varias generaciones en presencia de una de las tres formas de arginina isotópicamente marcadas,

así que todas las proteínas que contengan arginina serán marcadas. Las tres poblaciones de células se

estimulan con EGF durante períodos diferentes. Los lisados se extraen y se mezclan en proporciones

iguales, las proteínas fosforiladas en tirosina se purifican por afinidad con anticuerpos antifosfotirosina.

Las proteínas se digieren con tripsina y se identifican por MS. Debido a que las marcas isotópicas son

distinguibles dentro del espectro de masas, puede determinarse la cantidad relativa de proteína aislada

en cada tiempo de estimulación. Repetir el experimento con diferentes tiempos de estimulación, permi-

te obtener un perfil temporal detallado de cada proteína. (Reproducida con autorización de Johnson SA

y Hunter T (2004) Phosphoproteomics finds its timing. Nat Biotechnol 22: 1093-1094).


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Figura 13-31. Principio de la plataforma de microarreglos de anticuerpos para estudiar la fosforila-

ción en tirosina. A) La plataforma se construye en tres pasos: I) Inmovilización de 35 anticuerpos

adquiridos comercialmente sobre un chip, II) incubación del chip con un extracto celular, y III) aplica-

ción de un mAb PY-KD-1 marcado con fluorescencia que reconoce residuos de p-Tir en la proteína,

independientemente de la secuencia. B) Pruebas piloto del mAb anti-p-Tir PYKD1 en experimentos

de microarreglos. Los arreglos de fosforilación prototipo se fabricaron con cinco anticuerpos sobre

placas cubiertas de HidroGelTM. Panel superior, Los arreglos se incubaron con un extracto protéico

de células Cy5-RT10+ marcado (proteína total: 10 μg/ml). Panel inferior, otro grupo de arreglos se

incubó con un extracto de células RT10+ sin marca (proteína total: 10 ng/ml), la detección de p-Tir

se hizo con un mAb-Cy5-PY-KD1 (5 μg/ml). Las señales de la media arbitraria (± SD) se calcularon

con 6-9 replicas de Ac sobre el mismo arreglo. Se muestra una baja ampliacion de imagen de cua-

tro subarreglos 6 x 6 para ilustrar el bajo fondo en la señal de detección basado en el sandwich.

(Reproducida con autorización de Gembitsky DS, Lawlor K, Jacovina A et al.: A prototype antibodymicroarray platform to monitor changes in protein tyrosine phosphorilation. Mol Cell Proteomics

2004;3: 1102-1118.


20

15

10

5

0

B)

A)

Mr Da

Figura 13-32. Fosfoproteoma de sinaptosoma de cerebro de ratón. A) Desarrollo de la estrate-

gia de aislamiento e identificación de las fosfoproteínas por IMAC LC-MS/MS. Las fosfoproteí-

nas de extracto sinaptosomal purificadas por gradientes de sacarosa, solubles en urea, se

aislaron selectivamente usando combinaciones de IMAC metal/resina (FeCl3 o GaCl3) y se

separaron en PAGE-SDS al 12%. Las fracciones que no se unieron a la columna también fue-

ron analizadas para su comparación. Los geles se tiñeron con un colorante específico de fosfo-

proteínas (ProQ diamond phosphoprotein/Ruby total protein). Las proteínas fosforiladas se tiñen

de rosa a negro. Las proteínas no fosforiladas se tiñen de verde. En el carril 1 se muestran los

marcadores de peso molecular, en los cuales las proteínas de 23 y 45 kDa están fosforiladas y

las de 55 y 116 no lo están, por lo que sirven como un control interno para la tinción selectiva de

proteínas fosforiladas. La banda de 25 kDa señalada con una flecha es una proteína ribosomal que

se retuvo en la resina-IMAC debido a un efecto de intercambio iónico. B) Las señales de fosfopro-

teínas para los carriles 2-5 en B se compararon contra el peso molecular. IDA-Ga tiene la intensi-

dad de señal más alta lo que indica que es la fosfoproteína más enriquecida. IDA (iminodiaceticacid), NDA (nitrilotriacetic acid). (Reproducida con autorización de Collins MO, Yu L, Cobal MP et al.:Proteomic analysis of in vivo phosphorylated synaptic proteins. J Biol Chem 2005;280: 5972-5982).


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Receptores / canales

Cinasas

FosfatasasProt-G / moduladores

Señalización / enzimasVesículas sinápticas

Citoesqueleto / Adhesión celular

Scaffolders (armazones)

Figura 13-33. A) Interacciones proteína-proteína e interacciones cinasa-sustrato en el complejo

NRC de sinapsis de cerebro de ratón. Los datos de interacción proteína-proteína (28 interacciones

binarias de PPID) para 104 proteínas del NRC (NMDA receptor complex) se usaron para construir

una red de interacción proteína-proteína. Cada círculo coloreado representa una proteína y su color

a su grupo funcional. Los datos cinasa-sustrato de los sitios de fosforilación identificados por MS y

experimentos de arreglos de péptidos para ocho proteínas del NRC, fueron sobrepuestos en la red

de interacción proteína-proteína. Las líneas de la red roja (líneas que conectan dos proteínas) signi-

fican cinasas presentes en el NRC, los cuales fosforilan sustratos NRC. La red de líneas azules

representa las cinasas desconocidas hasta hoy, que están presentes en el NRC y que fosforilan sus-

tratos NRC. Los sustratos se numeran como sigue: 1, MAP2; 2, mGlur5; 3, PSD-93/Chapsina 110;

4, PSD-95; 5, SAPAP1/2; 6, proteína básica mielina; 7, Basson (proteína presináptica); 8, CaMK2B.

B) Ilustración de las vías de PKA a sus sustratos NRC (PSD-95, PSD-93/Chapsina 110 y

SAPAP1/2). Esos sustratos PKA son scaffolders sinápticos importantes, los cuales se asocian estre-

chamente uno al otro y su proximidad a su cinasa dentro del NRC implicaría un microambiente fisio-

lógico para su fosforilación. El análisis de fosforilación de proteínas sinápticas se realizó utilizando

estrategias complementarias como extracción de proteínas, enriquecimiento de fosfoproteínas y fos-

fopéptidos por IMAC, análisis por MS, ensayos de fosforilación in vitro y análisis de redes (PPID).

NMDA (N-methyl-D-aspartate); NRC (NMDA receptor complex); PSD (postsynaptic density); mGluR5

(group I metabotropic glutamate receptor). (Reproducida con autorización de Collins MO, Yu L, Cobal

MP et al.: Proteomic analysis of in vivo phosphorylated synaptic proteins. J Biol Chem 2005;280: 5972-

5982).

Monitoreo de la efectividad del fármaco en pruebas clínicas. El progreso tecnológicoreciente en genómica y proteómica ha creado una única oportunidad para mejorar significativamente el proceso de desarrollo de drogas farmacéuticas. El tratamiento con dro-gas induce una respuesta específica en células y organismos completos, esto implica quese pueden analizar los patrones de expresión únicos y huellas moleculares que indican laeficacia de esa droga y su toxicidad potencial.128, 129

El cáncer como modelo de enfermedad.

El cáncer es un excelente modelo para estudiar la aplicación de la proteómica junto a lacama del paciente. La promesa de la proteómica clínica y el desarrollo de la tecnología rela-cionada con ella, es que: a) el cáncer puede ser identificado tempranamente a través del des-cubrimiento de biomarcadores, b) una próxima generación de blancos pueda ser identifica-da y c) se pudiera aplicar este conocimiento a los pacientes con una terapia hecha a lamedida. El objetivo de la medicina personalizada es tomar ventaja del conocimiento molecu-lar de la enfermedad para optimizar el desarrollo de drogas, recursos preventivos y agentesterapéuticos en individuos en riesgo mientras están sanos.130, 131 En este tipo de proyec-tos también deben tomarse en cuenta las características genéticas individuales de los miem-bros de la población y la heterogeneidad que se presenta durante el proceso de la enfermedad.

Arreglos de proteínas en la investigación biomédica.

Los arreglos de proteínas pueden usarse para identificar biomarcadores potenciales de enfer-medades, especialmente en el área de la biología del cáncer, midiendo directamente los nive-les de cientos de proteínas en el suero, plasma, orina y tejidos, usando técnicas de imagenbasadas en fluorescencia.132, 133 La tecnología SELDI ProteinChip permite la detección compa-rativa, caracterización y validación de proteínas en muestras biológicas diferentes de individuosenfermos comparados con los sanos o tratados con drogas comparados con los controles.Aunque los arreglos de proteínas están en constante desarrollo, tanto a nivel de ciencia básicacomo aplicada, se espera que esta tecnología pronto sea utilizada en pruebas diagnósticas a nivelclínico. Con esta tecnología se han identificado, reproducible y consistentemente, marcadoresmoleculares en el suero, plasma seminal y extractos celulares en pacientes con cáncer de prós-tata (figura 13-35),95, 134, 135 en aquellos con leucemia linfocítica crónica de células-B cuyosmarcadores protegen a las células de sufrir apoptosis espontánea o inducida por drogas,136 enel suero de los que padecen cáncer de colon,137 en cáncer de ovario138 y con neuroblastoma.139

También se han obtenido buenos resultados en enfermedades neurodegenerativas como laenfermedad de Alzheimer93 y la esclerosis lateral amiotrófica o enfermedad de Lou Gehrig ca-racterizada por la degeneración de neuronas motoras.140 También se han obtenido buenosresultados así como en células troncales pluripotenciales o células madre (stem cells) que tienenun gran potencial como herramienta para estudiar el desarrollo temprano y como una posiblefuente renovable de tejido para propósitos terapéuticos.94 El avance de la terapia génica podríaacelerarse utilizando los biomarcadores moleculares identificados en estas enfermedades.

La información obtenida en reuniones recientes sobre proteómica indica que muchascompañías biotecnológicas están desarrollando una nueva generación de arreglos deproteínas con tecnología innovadora. Algunos de esos desarrollos son la producción


planeada de bioarreglos de proteínas que preserven a éstas en su conformación biológi-camente activa y que mantengan el anticuerpo en un punto fijo sobre una matriz tridi-mensional lo que incrementa el área de superficie para las interacciones antígeno-antic-uerpo (CodeLink, GE-Healthcare).141

ORGANIZACIÓN DEL PROTEOMA HUMANO

La Organización del Proteoma Humano (Human Proteome Organization, HUPO), es un con-sorcio internacional que coordina los proyectos proteómicos a través del mundo, como sehizo en el Proyecto del Genoma Humano. La HUPO se creó el 9 de febrero del 2001 eincluye organizaciones de investigación en el campo académico, de gobierno y de la industriafarmacéutica. Promueve el desarrollo de la investigación proteómica y de tecnología nuevapara estudiar y entender mejor las enfermedades humanas, además de facilitar la colaboracióncientífica entre los miembros de la organización. Actualmente se está realizando el estudioproteómico del suero, plasma, hígado, corazón, cerebro, células inmunitarias, entre otros.


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740 750 760 770 780 m/z

Figura 13-34. NanoLC de fluido cerebroespinal. Ejemplos de pequeñas partes del espectro de

masas obtenido por nanoLC FT-MS de una muestra control de fluido cerebroespinal (C, negro)

y muestras obtenidas de pacientes con tumor cerebral (A y B, gris). Se observa sobreposición

en los tres espectros, sin embargo, puede apreciarse que los picos que aparecen en los espec-

tros de los casos de enfermedad están ausentes en la muestra control (flechas). (Reproducida con

autorización de Bischoff R y Luider TM (2004) Methodological advances in the discovery of pro-tein and peptide disease markers. J Chromatogr B 803: 27-40).

Como un primer intento, recién se publicó un atlas de péptidos humanos (http://www.pep-tideatlas.org), obtenido por LC MS/MS de muestras de células y tejidos diversos (figura 13-36);142 así como el atlas del proteoma humano (www.proteinatlas.org). En este últi-mo hay > 300 000 imágenes de alta resolución que detallan los patrones de expresión de pro-teínas en una gran variedad de células y tejidos humanos sanos y enfermos (www.hpr.se).

370 • Diagnóstico molecular en medicina (Capítulo 13)In

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Figura 13-35. Evaluación y validación de proteínas del suero para la detección temprana de cán-

cer de próstata por SELDI-TOF-MS. El espectro de arriba a la derecha corresponde al ensayo de

validación de 28 muestras de suero (14 pacientes y 14 controles) realizado por SELDI-TOF-MS en

el laboratorio que organizó el proyecto interinstitucional. El espectro de arriba a la izquierda corres-

ponde a la validación de 56 muestras (28 casos de cáncer y 28 controles) realizada 17 meses

antes en el mismo laboratorio. Los otros recuadros representan los espectros obtenidos en cada

laboratorio participante para el mismo grupo de muestras, previa calibración y estandarización. El

pico (proteína) mostrado en los espectros corresponde al pico diagnóstico dominante y que tiene

el mejor resultado reproducible entre los laboratorios participantes. Las líneas moradas correspon-

den a los muestras de pacientes con cáncer y las líneas negras corresponden a controles.

(Reproducida con autorización de Semmes OJ et al. (2005) Evaluation of serum protein profiling bySurface-Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry for the detectionof prostate cancer: I. Assessment of platform reproducibility. Clin Chemistry 51: 102-112).

BIOINFORMATICA PARA LA IDENTIFICACION DE PROTEINAS POR MS

En la actualidad, las soluciones informáticas para comparar e identificar las masas y losespectros obtenidos por MS y MS/MS son accesibles, ya que hay suficientes bases dedatos de secuencias de proteínas (y genómicas) que se pueden utilizar para validar laidentificación de proteínas (cuadro 13-2). Sin embargo, hay problemas con los organis-mos que están poco representados en las bases de datos. La opción en estos casos, aunquedifícil, es realizar la secuenciación de novo y búsqueda en todas las bases de datos accesi-bles. A pesar de los grandes esfuerzos por mantener al día la información de cuantasecuencia de proteína se va obteniendo, siempre habrá una gran cantidad de espectrosque no puedan compararse e identificarse. Hoy día, es tal la cantidad de información quetanto en instituciones académicas como en la industria se están desarrollando programasbioinformáticos (software) para mejorar e innovar la captación, organización, clasifi-cación, etc. de los datos generados por la proteómica, genómica y demás “ómicas”.


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BLASTBase de datosde proteínas

PEptideAtlas database

Extracción

Muestra Proteínas

Mapa delgenoma

Búsqueda en el genoma

Base de datos delAtlas peptídico

Péptidos

Péptidos

Péptido

Vizualización

Péptido Probabilidad

Espectro de masa

DigestiónBúsqueda en labase de datos

Crom Inicio Final

Filtraciónestadistica

EspectroEspectro

Espectro

De los peptidos a la anotación del genoma

Figura 13-36. Análisis de alto rendimiento para la anotación del genoma humano. Este análisis se rea-

lizó con secuencias de péptidos de alta calidad derivados del análisis por MS de muestras biológicas.

(Reproducida con autorización de Desiere F et al. (2004) Integration with the human genome of peptide sequences obtained by high-throughput mass spectrometry. Genome Biology 6: R9-R9.12).


CONCLUSIONES

La tecnología proteómica es un componente esencial en la biología de sistemas que juntocon la genómica y metabolómica, generarán un enorme conjunto de datos que sentaránlas bases para crear modelos, utilizando herramientas bioinformáticas, que describan losestados fisiológicos de células y tejidos en salud y enfermedad.

El tema central en la proteomica es la separacion efectiva, cuantificación e identifi-cación inequívoca de péptidos y proteínas. Existe una demanda muy alta sobre la minia-turización y paralelización de las técnicas de análisis, especialmente en ProteinChips, loque permitirá el estudio de múltiples muestras minúsculas de proteínas en un soloensayo, que reducirá costos y se hará mas accesible para la investigación básica y clínica.Además, el desarrollo de tecnología de microfluidos, de MudPIT a nivel micro o nano(μRPLC o nRPLC), acoplados con los microarreglos de proteínas o a ionizadores y espec-trómetros de última generación, aumentará la sensibilidad de detección. Esta nueva tec-nología será la base para llevar la proteómica a rangos de atomoles y zeptomoles o más(figura 13-36). Junto con esta tecnología de punta, el uso de las técnicas clásicas de laproteómica como E2D o Y2H continuará vigente, ya que son metodos muy probados quetambién se encuentran en continuo desarrollo y que dan respuestas claras y concretas.

El desarrollo de tecnología de la inmunoterapia con anticuerpos monoclonaleshumanizados o nanocuerpos fragmentos moleculares muy pequeños (-120 aa) capaces deunir antígeno intacto dirigidos contra biomarcadores identificados de enfermedades diver-sas, con la colaboración de herramientas de la ingeniería genética, la espectrometría demasas en imágenes, y la utilización de los biobancos, son estrategias que aumentarán la pro-ductividad en la proteómica clínica. La identificación de proteínas de membrana quemedian la interacción molecular entre microorganismos patógenos y células huésped,aumentará las posibilidades de desarrollar nuevas y mejores vacunas. La identificación dealergenos, de proteínas responsables del envejecimiento y de enfermedades autoinmuni-tarias y neurodegenerativas, entre muchas, será más accesible con las nuevas herramientasproteómicas.

La información obtenida por la proteómica tendrá un impacto directo sobre la cali-dad de vida de los seres humanos y de su ambiente.

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http://biomikro.vscht.cz/maldiman/animation.htmlhttp://www.bioneer.com/tech/qc_qa_maldi.jsp;jsessionid


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