Universidad de Alcal Departamento de Bioqumica y Biologa Molecular EFECTO DE LOS CANNABINOIDES EN CLULAS TUMORALES DE PRSTATA PC-3. PAPEL DEL RECEPTOR CB2 Tesis Doctoral Nuria Olea Herrero Madrid, 2010 Financiacin FINANCIACIN Financiacin EstaTesisDoctoralhasidorealizadagraciasalafinanciacindelossiguientesproyectosde investigacin por diferentes organismos pblicos: TTULO DEL PROYECTO: "Efectodeagonistasyantagonistasdecannabinoidesyvanilloides sobrelaproliferacindeclulastumoralesdeprstata.Estudioin vitro e in vivo. ENTIDAD FINANCIADORA: CAM, GR/SAL/0640/2004DURACIN: 2005 INVESTIGADOR PRINCIPAL: Ins Daz-Laviada Marturet TTULO DE PROYECTO:"Efectodelosagonistasdecannabinoidesyvanilloidessobrela diferenciacin neuroendocrina de clulas tumorales de prstata. ENTIDAD FINANCIADORA: MEC, SAF 2005-00602DURACIN: 2005-2008 INVESTIGADOR PRINCIPAL: Ins Daz-Laviada Marturet TTULO DE PROYECTO: Mecanismosdeaccindeloscannabinoidessobreclulas tumorales de prstata. Diferenciacin neuroendocrina. ENTIDAD FINANCIADORA: CCG06-UAH/SAL-0562DURACIN: 2007 INVESTIGADOR PRINCIPAL: Ins Daz-Laviada Marturet TTULO DE PROYECTO: ESTUDIO DE LA NEUROFARMACOLOGA Y POTENCIAL TERAPUTICO DEL SISTEMA ENDOCANNABINOIDE ENTIDAD FINANCIADORA :CAM S-Sal-0261-2006 DURACIN:2007-2010 INVESTIGADOR PRINCIPAL:Manuel Guzmn Pastor Financiacin TTULO DEL PROYECTO: EstudioDelSistemaEndocannabinoideenClulasTumorales. RegulacindelaSecrecindeCitoquinaseImplicaciones Metablicas. ENTIDAD FINANCIADORA:SAF2008-03220DURACIN: 2009-2011 INVESTIGADOR PRINCIPAL: Ins Daz-Laviada Marturet

TITULO DEL PROYECTO:Accindecomponentesnaturalessobrelaproliferaciny secrecin de citoquinas en clulas tumorales de prstata. ENTIDAD FINANCIADORA:Comunidad Castilla-LaMancha, PII1/09-0165-0822DURACIN: 2009-2011 INVESTIGADOR PRINCIPAL: Ins Daz-Laviada Marturet TITULO DEL PROYECTO: Propiedadesantitumoralesdelosvanilloidesenclulas tumorales de prstata ENTIDAD FINANCIADORA:CAM/UAH, CCG08-UAH/BIO-3914DURACION: 2009 INVESTIGADOR PRINCIPAL: Sophie Malagarie-Cazenave Agradecimientos AGRADECIMIENTOS Agradecimientos EnprimerlugartengoqueagradeceramiDirectoradeTesis,laDoctoraInsDaz-Laviada, habermedadolagranoportunidaddecumplirestesueo.Graciasporllevarmedelamanoenelarduo camino de la ciencia, pero sobre todo por tu aliento. Gracias por aceptar ser mi maestra, por ensearme lo que es el rigor cientfico y gracias tambin por tu gran calidad humana. AlaUniversidaddeAlcalyalDepartamentodeBioqumicayBiologaMolecular,porpermitirme realizaraqulaTesisDoctoral.TambinatodoelpersonaldelDepartamentodeBioqumicaascomode los Centros de Apoyo de la Universidad de Alcal. Gracias a Anglica por facilitarme tantsimo lo relativo a la burocracia. A Juan y Guillermo, por sus lecciones deseguridad en el laboratorio, as como por su gran ayuda y disposicin. A Rafa por su amable ayuda con los trmites de las becas. Y a Aurora por su diligente labor en la gestin. A mis compaeros de laboratorio, sin los cuales este trabajo habra sido irrealizable. Gracias a Lidia yMara,pormisprimerasleccionessobrecienciaempricayporsuinfinitacomprensinenmisprimeros dasdelaboratorio.AAna,porsermiguadurantetodaestaTesis;quhubierahechoyosinellaY tambinporserelejemplodelesfuerzo,eltesnyelamoraltrabajo.ASophie,porsugrancarioy camaradera, siempre dispuesta a pararlo todo para escucharme y regalarme su comprensin, adems de por todas sus sabias lecciones. A Diana, por ensearme tantas cosas, por sus infinitos nimos y su enorme confianza,perosobretodo,porsudulceafectotanreconfortante.Yamisltimoscompaerosde laboratorio, Sergio, Marta y Cecilia, por renovar con su mpetu mi ilusin por laciencia. Gracias a todos y cada uno tambin por ser adems de compaeros, amigos. Gracias igualmente a todos mis compaeros del Departamento de Bioqumica. No puedo dejar aqu de nombrar a algunos, los ms cercanos. Gracias a Ana Fernndez, Ana Valdehta, Ana Bajo, Eva Vacas y a todos los dems miembros de su laboratorio por la solicitud y el compaerismo. A Borja, Lus y Eva por su inestimable ayuda y sus nimos. Y especialmente, gracias a Alberto por ilustrarme en tantas ocasiones, porsersiempreunareferenciayporestarentodomomentomsquedispuestoaayudar;aLus,porsu grandsimo apoyo y su desinteresado y desmedido favor; y a Arantxa, por su increble mpetu, su alegra y, ante todo, por su especial cario. Gracias a todos por regalarme adems su enorme amistad. Agradecimientos AlgrupodeBioqumicadelHospitalRamnyCajal.GraciasalDoctorJavierMartnezBotasyal DoctorDiegoGmez-Coronadopordarmelaoportunidaddetrabajarensugrupoyporinstruirmeenla BiologaMolecular.AlDoctorMiguelngelLasuncin, por permitirme tambin formar parte de su grupo y por lo mucho que aprend durante sus seminarios. Y a todos mis compaeros, por nuestras innumerables charlas sobre ciencia, vuestro gran apoyo y acertado consejo. Gracias necesariamente tambin por vuestra amistad, de forma especial a Alberto, Carolina, David y Andrea. GraciastambinalDoctorNeilPerkinsyasugrupo,poracogermeensulaboratorioyponer ademsamidisposicintodoslosmediosdelmismo.Laestanciaensulaboratoriosignificparamuna nica y valiossima oportunidad. GraciasalDoctorJorgeMontserrat,aMiguelyaLeticia,porsuinestimableayudaesclareciendo mis dudas sobre Inmunologa y por guiarme en los experimentos con los linfocitos. Gracias aqu tambin a todos los voluntarios que hicieron posible estos experimentos. Tengo demasiado asimismo que agradecer a todos mis amigos fuera del mbito laboral, tanto de la universidadcomodeGuadalajara,sincuyoapoyoestetrabajohabrasidomuydifcilderealizar.Gracias porcompartirtantoconmigo,porregalarmevuestrasmagnficasrisasyporcalmarmislgrimas.Gracias por estar siempre ah y, ms an, por contar siempre conmigo. Tard en encontrarles en mi camino, pero desde luego la espera no fue balad. Porltimo,amifamilia,especialmenteamimadreyamihermana.Mesientoterriblemente afortunada de contar con su proteccin, cario y comprensin. Gracias por darme tanto y por apoyarme en cada uno de los pasos que me han llevado hasta aqu. Abreviaturas ABREVIATURAS Abreviaturas AAcido araquidnico AEAAnandamida 2-AG 2-Araquidonil-glicerol AP-1Protena activada 1 ARReceptor de andrgenos A-SMasaEsfingomielinasa cida ATCC American Type Culture Collection ATF4Factor de transcripcin 4 ATF6 Factor de transcripcin 6ATP Adenosina trifosfato BAFFRFactor activador de clulas B BCRReceptor de clulas B BPHHiperplasia benigna de prstata BSAAlbmina srica bovina cAMP Adenosin monofosfato cclico CB1 Receptor de cannabinoides tipo 1 CB2Receptor de cannabinoides tipo 2 CBCCannabicromeno CBDCannabidiol CBGCannabigerol CBNCannabinol CD40Cluster de diferenciacin 40 CerSCeramida sintasa CerKCeramida quinasa C1PCeramida 1 fosfato CPZCapsazepina cox-2Cicloxigenasa tipo 2 CREBProtena de unin a elementos de respuesta a AMP cclico CTLClulas T citotxicas CYP450s Citocromo P-450 s DAGDiacilglicerolDAGLDiacilglicerol lipasa DAPI4, 6-diamidino-2-fenilindol DCFH-DA6-carboxi-2,7-diclorodihidrofluoresceina acetoximetilesterDETAPACcido dietilenotriaminopentactico DEDDominio efector de muerte DDDominio de muerte DMSODimetil sulfxido DOPGDileoyl-fosfatidilglicerol dpmdesintegraciones por minuto EGFFactor de crecimiento epidrmico ERSAElemento de respuesta a estrs de retculo ERKQuinasa regulada por seales extracelulares FADDDominio de muerte asociado a Fas FAAH Enzima aminohidrolasa de cidos grasosFAK Quinasa de adhesin focal Abreviaturas FBSSuero fetal bovino FITCIsotiocianato de fluoriscena gp130glicoprotena 130 GRP78Chaperona regulada por glucosa 78 HDLLipoprotenas de alta densidad HRPPeroxidasa de rbano IkBProtena inhibidora de NFkB IKKQuinasa de los inhibidores de NFkB IL-1Interleuquina 1 IL-1RReceptor de IL-1 IL-6Interleuquina 6 IL-6RaReceptor de IL-6 alfa IPIoduro de propididio IRE1 Enzima dependiente de insitol 1 ITSInsulina, transferrina, selenio JakJanus quinasa JNKc-Jun N-terminal quinasaKSRQuinasa supresora de Ras MAPKProtena quinasa activada por mitgenos MAP2KProtena quinasa activada por mitgenos MAP3KProtena quinasa quinasa quinasa activada por mitgenos MAP4K Protenaquinasaquinasaquinasaquinasaquinasaactivada pormitgenos MEKQuinasa activada por mitgenos METMetanandamidamRNARNA mensajeromTORProtena diana de rampamicina en los mamferos MTTBromuro de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difenil-tetrazol NADA N-araquidonil-dopamina NACN-acetil- cistenaNAPE N-araquidonoil-fosfatidiletanolaminaNAPE-PLD Fosfolipasa D selectiva para NAPENEMOModulador esencial de NFkB NGF Factor de crecimiento nervioso NIDDMDiabetes mellitus no insulino dependiente NIKQuinasa inuctora de NFkB NFBFactor nuclear kappa B N-SMasaEsfingomielinasa neutra LOX LipoxigenasaO-AEA O-araquidonil-etanolamina o virodhamina PAcido fosfatdico PAKProtena quinasa activada por p21 PAPFosfatasa cida prosttica PBSTampn fosfato salino PEA N-palmitoiletanolamina PERKQuinasa del retculo endoplasmtico PCFosfatidil colina Abreviaturas PIFosfatidilinostidos PIAAtrofia proliferativa inflamatoria PINNeoplasia intraepitelial prosttica PIPFosfatidilinositol 4-fosfato PI3KFosfatidil inositol 3-quinasa PKAProtena quinasa A PKBProtena quinasa B PKCProtena quinasa C PMSFFenil metilsulfonilfluoruro PLA1 Fosfolipasa 1 PLD Fosfolipasa A PLCFosfolipasa C PLD Fosfolipasa D PP1Protean fosfatasa 1 PP2AProtean fosfatasa 2A PSAAntgeno prosttico especfico RHDDominio homlogo a Rel RTKReceptor tirosina quinasaSDSDodecil sulfato sdico sgp130glicoprotena 130 soluble sIL-6RReceptor de IL-6 soluble SMEsfingomielina SMasaEsfingomielinasa SPTSerina palmitoil transferasa siRNARNA de interferenciaSTAT Factor de transcripcin transductores de la seal y activadores de transcripcin STI Inhibidor de tripsina de soja THC9- Tetrahidrocannabinol TEATrietanolamina TCAcido tricloroactico TLCCromatografa en capa fina TLRReceptor similar a Toll TMB3,3,5,5- tetrametilbenzidina TNFFactor de necrosis tumoral TNFRReceptor de TNF Tris 2-amino-2-(hidroximetil)-1,3-propanediolTRPCanal activado por potencial transitorio TRPACanal activado por potencial transitorio tipo ankirina TRPCCanal activado por potencial transitorio cannico TRPMCanal activado por potencial transitorio tipo melastatina TRPMLCanal activado por potencial transitorio tipo mucopolina TRPPCanal activado por potencial transitorio tipo policistina TRPVCanal activado por potencial transitorio tipo vanilloide UPRRespuesta al mal plegamiento de protenas VEGFFactor de crecimiento del endotelio vascular XBP1Protena 1 de unin a X-box ndice NDICE ndice NDICE INTRODUCCIN 1 1.- LA PRSTATA3 1.1.- Prstata normal3 1.1.1. Anatoma de la prstata3 1.1.1. Histologa de la prstata4 1.2.- Patologas de la prstata5 1.2.1.Prostatitis 5 1.2.2.Hiperplasia benigna de prostta (HBP)6 1.2.3.Cncer de prstata7 1.2.3.1.Estados premalignos7 1.2.3.2.Desarrollo y evolucin del cncer9 1.2.3.3 Fases del cncer de prstata9 1.2.3.4 Modelos celulares11 2.- MECANISMOS MOLECULARES Y CELULARES IMPLICADOS EN ELCNCER DE PRSTATA. POSIBLES DIANAS TERAPUTICAS14 2.1.Sealizacin celular 14 2.1.2.Vas de sealizacin que conducen a apoptosis14 2.1.2.Vas de proliferacin implicadas encrecimiento y supervivenciacelular20 2.2.Sistema inmune: Inmunoterapia23 2.2.1.Papel de las clulas T24 2.2.2.Papel de la IL-626 2.2.3.Papel del factor nuclear kappa B29 3.- CANNABINOIDES Y SISTEMA ENDOCANNABINOIDE32 3.1.Resea histrica32 3.2.Tipos de cannabinoides33 3.2.1.Compuestos bioactivos de Cannabis sativa34 3.2.2.Ligandos endgenos34 3.2.3. Ligandos sintticos35 3.3.Receptores de cannabinoides36 ndice 3.3.1.CB1 y CB237 3.3.2.GPR-5537 3.3.3. TRPV138 3.4.Mecanismos de transduccin a travs de CB1 y CB2 39 3.5.Cannabinoides y cncer40 3.5.1.Cannabinoides y cncer de prstata42 3.5.2.Cannabinoides y sistema inmune42 HIPTESIS Y OBJETIVOS45 MATERIALES Y METODOS49 1.- MATERIALES 51 1.1.- Materiales empleados en cultivos celulares 511.2.- Reactivos empleados en la elaboracin de tampones51 1.3.- Agonistas, antagonistas e inhibidores52 1.4.- Lneas celulares52 2.- MTODOS53 2.1.- Medida de la viabilidad celular medianteMTT53 2.2.- Medida de la divisin celular mediante incorporacin de [3H]-timidina54 2.3.- Tincin de clulas con Ioduro de Propidio para anlisis del cilo c elular por citometra de flujo54 2.4.- Unin de Ioduro de Propidio y anexina V-FITC54 2.5.- Tincin de ncleos con DAPI55 2.6.- Medida de los niveles de ceramida 55 2.6.1.- Extraccin de lpidos55 2.6.2.- Cuantificacin de ceramidas56 2.7.- Determinacin deniveles de IL-6 57 2.8.- Determinacin deniveles de IL-17 57 2.8.1.- Aislamiento de clulas mononucleares57 2.8.2.- ELISA de IL-1758 2.9.- Separacin de fraccin particulada y solube de las clulas58 2.10.- Separacin ncleo / citosol59 2.11.- Cuantificacin de protenas59 ndice 2.12.- Electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS e inmunopredeteccinde protenas 60 2.13.- Silenciamiento con RNA de interferencia62 2.14.- Aislamiento de RNA63 2.15.- Retrotranscripcin(RT)63 2.16.- PCR a tiempo real (RT-PCR qPCR)64 2.17.- Ensayo de inmunoprecipitacin de la cromatina (CHIP)65 2.17.1.-Fijacin de la unin DNA-protenas y fragmentacindel DNA65 2.17.2.- Inmunoprecipitacin66 2.17.3.- Aislamiento de DNA66 2.17.4.- Cuantificacin de las muestras66 2.18.- Experimentacin animal67 2.18.1.- Animales67 2.18.2.- Induccin de tumores67 2.18.3.- Tratamiento de las muestras68 2.19.-Anlisis estadstico68 RESULTADOS69 1.-EFECTO DE MET Y JWH015 SOBRE EL CRECIMIENTO Y MUERTECELULAR71 2.- PAPEL DEL RECEPTOR CB2 EN EL EFECTO ANTIPROLIFERATIVODE LOS CANNABINOIDES 77 3.- ESTUDIO DE LA SEALIZACIN CELULAR ACTIVADA PORCANNABINOIDES81 3.1.- Sntesis de ceramida81 3.2.- Cascadas de sealizacin intracelulares85 4.- EFECTO ANTITUMORAL IN VIVO DE JWH01587 5.- ESTUDIO DE LA SECRECIN DE IL-689 5.1.- Papel de CB291 5.2.- Papel de la sntesis de ceramida en la secrecin de IL-698 5.3- Sealizacin celular implicada en la secrecin de IL-693 5.3.1.Ruta de selaizacin de NFB93 ndice 5.3.2. Ruta de selaizacin de PI3K/Akt97 5.3.3. NFB controla la expresin de IL-699 6- PAPELDE IL-6 EN EL CRECIMIENTO Y MUERTE CELULAR100 6.1.- Funcionalidad de la IL-6 secretada por las clulas PC-3100 6.2.- Efecto de IL-6 sobre la viabilidad celular102 6.3- Expresin y actividad de STAT3102 7- ACTIVACIN DE LA RESPUESTA TH17103 DISCUSIN105 1.-EFECTO ANTIPROLIFERATIVO DE LOS CANNABINOIDES107 2.- MECANISMO DE ACCIN DE LOS CANNBINOIDES SOBRE LAS C LULAS PC-3111 3.- SECRECIN DE IL-6 INDUCIDA POR LOS CANNABINOIDES115 4.- PAPEL DE IL-6 SOBRE EL CRECIMIENTO Y LA MUERTE CELULAR118 4.- ACTIVACIN DE LA RESPUESTA TH17121 4.- PAPEL DE DEL RECEPTOR CB2122 CONCLUSIONES127 BIBLIOGRAFA131 ANEXO I: SUMMARY149 ANEXO II: PUBLICACIONES A LAS QUE HA DADOLUGAR ESTA TESIS DOCTORAL155 La utopa est en el horizonte. Camino dospasos,ellasealejadospasosyel horizontesecorrediezpasosmsall. Entoncesparaqusirvelautopa?Para eso, sirve para caminar. Eduardo Galeano Jams el esfuerzo desayuda a la fortuna Fernando de Rojas Introduccin INTRODUCCIN Introduccin 1.-LA PRSTATA 3 Figura 1. Ubicacin regional de la prstata. 1.1.- Prstata normal Laprstataesunaglndulatbulo-alveolardelrganoreproductormasculino,depequeo tamao,situadadebajodelavejigaydelantedelrecto,queenvuelvelaprimeraporcindelauretra (figura1).Sedesarrollaporinvaginacindelepiteliodesdelauretraduranteeltercermesdegestacin bajolainfluenciadelmesnquima.Permanecesincambioshastalapubertad,cuandoseproduceun aumentodesutamaoquepuedealcanzarunos20genunadultode2530aos.Sufuncines segregar un lquido ligeramente alcalino que forma parte del semen y que protege a los espermatozoides, neutralizando el pH cido de la vagina y aumentando as su supervivencia. PrstataUretraPeneTestculosEpiddimo EscrotoTnicatesticularAnoVesculaseminalRectoVejiga1.1.1Anatoma de la prstata SegnlaclasificacindeMcNeal,laprstataestformadaporunazonafibromuscularanteriory unazonaglandular,divididaasuvezentreszonas:lazonacentral,cruzadaporlosconductos eyaculadoresquesuponeun25%delaglndula,lazonadetransicin,querodeaalauretraposterior con un 5% del volumen glandular y la zona perifrica, con un 70% del volumen glandular (McNeal, 1968). En la zona de transicin es dnde se origina la hiperplasia benigna de prstata (BPH), mientras que en la perifricaesdndesedesarrollaprincipalmenteelcncerdeprstata(DeMarzoetal.,2007).Tambin Introduccin existeotraclasificacin,menosutilizada,quedivideanatmicamentealaprstataencincolbulos: anterior, posterior, medio y dos laterales (figura 2). Lbulos lateralesLbulo anteriorCpsula prostticaLbulo medioLbulo posteriorConductos eyaculadoresUretraB) A)Zona centralZona de transicinZona perifrica Figura2.Anatomadelaprstata.A)Esquemadelaszonasdelaglndulaprostticasegnlaclasificacinde McNeal (vista anteroposterior). B) Esquema de la clasificacin de la prstata en lbulos. 1.1.2 Histologa de la prstata Laglndulaprostticaestformadapordostiposdetejidos:estromayepitelio-glandular(figura 3).Elestromarodeaelepitelioyambostejidosinteraccionanentresmediantelasecrecinde andrgenos, hormonas esteriodeas, factores de crecimiento y mediadores que regulan el crecimiento y la diferenciacin,manteniendoaslahomeostasisdelaprstata.Losseparaunamembranabasal,una capa de tejido conectivo y una capa de glicosa-aminoglicanos, polisacridos y glicolpidos que conforman la denominada matriz extracelular. Dicha matriz tiene una funcin conectora y de comunicacin que es fundamental (Nieto et al., 2007; Cunha, 2008). Elestromaseconformademsculoliso,colgenoyfibroblastos,ademsdecontenerterminales nerviosos, vasos sanguneos y clulas infiltradas del sistema inmune. El epitelio est formado por distintas capas de clulas: -Las clulas luminales secretoras son las ms cercanas a la luz de la glndula y las ms abundanteseneltejidonormal.Formanuncompartimentoexocrinoquesecretaantgenoespecfico prosttico (PSA) y fosfatasa cida prosttica (PAP) en el lumen glandular. Estas dos protenas sirven de 4 Introduccin marcadortumoral,yaquesusnivelessemodificanenelcncer.Sonlasclulasmsdiferenciadasy expresan altos niveles del receptor de andrgenos (AR), dependiendo as de la presencia de andrgenos para su supervivencia.marcadortumoral,yaquesusnivelessemodificanenelcncer.Sonlasclulasmsdiferenciadasy expresan altos niveles del receptor de andrgenos (AR), dependiendo as de la presencia de andrgenos para su supervivencia.-Lasclulasbasalesformanlamembranabasal.Estnrelativamenteindiferenciadasy noposenactividadsecretora.PresentannivelesbajosonulosdelAR,porloquesonandrgeno independientes. S expresan receptor de estrgenos (ER) y responden a stos proliferando.-Lasclulasbasalesformanlamembranabasal.Estnrelativamenteindiferenciadasy noposenactividadsecretora.PresentannivelesbajosonulosdelAR,porloquesonandrgeno independientes. S expresan receptor de estrgenos (ER) y responden a stos proliferando.-Tambinexisteunpequeonmerodeclulasneuroendocrinasenelcompartimento basal, que secretan serotonina y otros neuropptidos (Lang et al., 2009).-Tambinexisteunpequeonmerodeclulasneuroendocrinasenelcompartimento basal, que secretan serotonina y otros neuropptidos (Lang et al., 2009).5 Figura-Ademshayunreducidonmerodeclulasmadre,queoriginantodoslostipos celulares del epitelio al diferenciarse, dependiendo del balance entre estrgenos y andrgenos (Sun et al., -Ademshayunreducidonmerodeclulasmadre,queoriginantodoslostipos celulares del epitelio al diferenciarse, dependiendo del balance entre estrgenos y andrgenos (Sun et al., 3. Histologa de la prstata. Clulas que conforman la unidad epitelial y estromal. 2009). est provocada por una infeccin bacteriana y puede ser aguda o crnica, si se reitera. La no bacteriana suele ser la ms frecuente, y a su vez se divide en in itos en el fluido Clulas que conforman la unidad epitelial y estromal. 2009). est provocada por una infeccin bacteriana y puede ser aguda o crnica, si se reitera. La no bacteriana suele ser la ms frecuente, y a su vez se divide en in itos en el fluido 1.2.- Patologas de la prstata1.2.- Patologas de la prstata 1.2.1Prostatitis1.2.1Prostatitis Esunamanifestacinqueincluyedistintosprocesosdenaturalezainflamatoriaoinfecciosaque afectan a la glndula prosttica. Se puede clasificar en dos clases, bacteriana y no bacteriana. La primera prosttico,ynoinflamatoria,quesedaenausenciadeinflamacinurogenital.Tambinexisteuna tercera,noasintomtica,queslosemanifiestaalexplorarlaprstataacausadeotraspatologas (Krieger et al., 2008) . Esunamanifestacinqueincluyedistintosprocesosdenaturalezainflamatoriaoinfecciosaque afectan a la glndula prosttica. Se puede clasificar en dos clases, bacteriana y no bacteriana. La primera prosttico,ynoinflamatoria,quesedaenausenciadeinflamacinurogenital.Tambinexisteuna tercera,noasintomtica,queslosemanifiestaalexplorarlaprstataacausadeotraspatologas (Krieger et al., 2008) . flamatoria, con presencia de leucoc flamatoria, con presencia de leucocAR AR AR ARClulas luminalessecretorasClulas basalesClulasneuroendocrinasClulas estromalesClulas madreEpitelioEstroma Introduccin 6 cin.Unacontinuaexposicindelaprstataalainflamacinpuedeconducira cambios ecaracterizaporunaproliferacinanormaldelas clulasdelaprstata,ynormalmenteaconteceenlazonadetransicinperiuretraldelaglndula (Ember Laprostatitiscrnicapuedeocasionardaocelularenelestromayenelepitelio,causando frecuentementeinflamadramticosenlaestructurayfuncindelasprotenas,ascomoalteracionesgenticas, produciendodaotisularquepuedeinducirneoplasia(Karanetal.,2009;Khandrikaetal.,2009). Distintasfuentesasociandehecholaprostatitisconelinicioyprogresindelahiperplasiabenignade prstata(Begleyetal.,2008;Delongchampsetal.,2008;Pennaetal.,2009)ascomodelcncerde prstata (De Marzo et al., 2007; Sciarra et al., 2007; Rebbeck et al., 2008; Wong et al., 2009), pudiendo ser tambin esta alteracin el eslabn que une ambas patologas.

1.2.2Hiperplasia Benigna de prstata Lahiperplasiabenignadeprstata(BPH)ston et al., 2008). Existen distintos factores que pueden influir en la aparicin de esta patologa. El msrelevantedeelloseslaedad,ocurriendofrecuentementeunaremodelacintisularenlaprstata, principalmenteenlazonadetransicin,quevieneacompaadadelaalteracindelasdelicadas interacciones entre el estroma y el epitelio. Estas modificaciones suelen afectar sobre todo a las clulas basales,quecambiansumetabolismoyseconviertenenhipertrficas(Geramoutsosetal.,2004).Las alteraciones hormonales tambin estn presentes en el desarrollo de la BPH. Existe un incremento de la sealizacinandrognicaenlaBPH,queafectaalasclulasluminalessecretoras,quedependende andrgenosparadiferenciarse(Robertsetal.,2004a;Robertsetal.,2004b).Porotrolado,unaumento delaestimulacinestrognicapuedeproducircrecimientoaberranteenlasclulasepitelialesyun aumento en la proliferacin de las clulas estromales (Prins et al., 2008). Por ltimo la asociacin entre la BPHyelsndromemetablicohasidoestudiadarecientemente,considerndoseladiabetesmellitusno insulinodependiete(NIDDM),lahipertensin,laobesidadylosaltosnivelesdelipoprotenasdealta densidad (HDL) factores de riesgo para la BHP (Briganti, 2009). La BPH, aunque no es considerada un estado premaligno, s puede ser empleada como un factor de prognosis del cncer de prstata (Alcaraz et al., 2009). Introduccin 7 1.2.3 Cncer de prstata l cncer de prstata es el tumor maligno ms diagnosticado en varones en el mundo occidental, el segun1.2.3.1 Estados premalignos Lapatognesisdelcncerdeprstataincluyetantoelementoshereditarioscomoambientales. Dentro trofia proliferativa inflamatoriaLa atrofia proliferativa inflamatoria (PIA) es una atrofia focal de la glndula prosttica ocasionada por daunquelamayoradelasatrofiasfocalesseconsideranquiescentes,algunasdelasclulas daad Edo tumor maligno ms frecuente del sexo masculino y la segunda causa de muerte por cncer en el varn (Crawford et al., 2009; Sorensen et al., 2010). de stos ltimos, el 20 % de todos los cnceres en adultos derivan de un estado de inflamacin crnica.Estainflamacinpuedeprovocarunaatrofiaenelepitelioqueterminadesarrollandounestado premalignoprevioalcncer(DeMarzoetal.,2007;Rebbecketal.,2008;Vindrieuxetal.,2009).Se diferencian dos estados premalignos que secuencialmente pueden dar lugar al desarrollo del tumor. A os repetidos en el epitelio derivados de la inflamacin crnica. Las caractersticas principales de este estado premaligno son la presencia de clulas inflamatorias tanto en el epitelio como en el estroma, queproducendaoymuertecelular,causandounaremodelacindeltejidoquemorfolgicamentese manifiestacomounaatrofiadelestromaconcantidadvariabledefibrosis(Joshuaetal.,2008).Los agentes oxidantes provenientes de las clulas inflamatorias infiltradas que no se destoxifican, las toxinas derivadasdeladieta,olaorinaquerefluyedentrodelaprstata,puedenocasionarlaproliferacin discretadelepitelioglandularconaparienciamorfolgicadeunasimpleatrofiaounahiperplasiapost-atrfica (Sciarra et al., 2007). Aaspuedenproliferardandolugaraldesarrollodelcncero,mscomnmente,alsegundodelos estados premalignos, la neoplasia intraepitelial prosttica. Introduccin Neoplasia intraepitelial prosttica La neoplasia intraepitelial prosttica (PIN) es una proliferacin preneoplsica que suele darse en lazonaperifricadelaglndulaprosttica,conservndoselaestructuradelacinoydelosductos,pero existiendodaosymodificacionescelulares.Sepuedeproducirpordaosrepetidosenelepitelioque ocurren principalmente durante la PIA, induciendo una excesiva proliferacin al intentar ser reparados que en ocasiones conduce a daos irreversibles en el genoma. Adicionalmente se produce un incremento declulasepitelialesqueposeenunfenotipointermedioentreclulasbasalesyluminales.Enalgunasde estasclulasocurrenmodificacionessomticasqueincrementanlainestabilidadgenticainduciendo cambiosirrevocablesquedanlugaraldesarrollodelcncer(DeMarzoetal.,2007).Porotroladose incrementa la secrecin de enzimas proteolticas que causan degradacin de la membrana basal, lo que permitelainvasindelestromay,enelpeordeloscasos,lainvasinaotrostejidos(Kryczeketal., 2009a) (figura 4). Mutaciones somticasCambios gnicos agresivosPIA PINPrstatanormalCncer de prstata no agresivoCncer de prstatainvasivoFigura4.Modelocelular deprogresinenel cncerde prstata.Existendosestadospremalignosanterioresala aparicindeltumor,laatrofiaproliferativainflamatoria(PIA)ylaneoplasiaintraepitelialprosttica(PIN)quepueden terminar dando lugar al cncer de prstata. En el primero existe una atrofia celular en la zona epitelial y una inflamacin crnica y en el segundo hay un estado precanceroso de las clulas epiteliales, con cambios citolgicos anticipatorios del cncer,aunqueseconservalamembranabasal,sibienmsreducida.Enltimotrminosedesarrollaun adenocarcinoma. (Modificado de Witte, 2009). 8 Introduccin 9 1.2.3.2Desarrollo y evolucin del cncer Como ya se ha descrito, las patologas benignas y los estados premalignos de la prstata pueden ser factores biolgicos de riesgo en la progresin del cncer de prstata. An as, la etiologa del cncer deprstataestlejosdeserelucidada.Entrelasposiblescausasmolecularesqueinfluyenensu desarrolloseencuentrantantomutacionesycambiosenlafuncindediversosoncogenesygenes supresoresdetumores(Ramsayetal.,2009),comoalteracionesenlasdistintasinteraccionesentrelos componentesestromalyepitelialdelaprstata.Estasalteracionesinvolucranadiversashormonasy factores de crecimiento que en condiciones normales regulan adecuadamente los procesos de desarrollo, maduracin y crecimiento tisular prosttico (Liu et al., 2009). En ltimo trmino se desarrolla un cncer de prstata,siendoelmsfrecuenteeladenocarcinoma(sedaenmsdel95%deloscasos),aunque tambin pueden surgir otros tumores como sarcomas y pequeos carcinomas celulares (van Bokhoven et al., 2003). El adenocarcinoma es un tumor maligno de las clulas secretoras en el cual las clulas pierden sufuncinyestructura,desapareciendolalminabasalyocurriendouncrecimientodescontrolado.Se desarrollaendosfases,unadependientedeandrgenos,enlacuallaprivacinandrognicafrenala progresindeltumoryotraindependientedeandrgenos,enlaquelaprstatarespondeaotras hormonas que normalmente no son ligandos del AR. 1.2.3.3Fases del cncer de prstata Fase andrgeno dependiente Losandrgenossonunimportantefactordecrecimientoenlaprstatanormal,donde ejercen sus efectos por unin al AR localizado en el citoplasma de las clulas estromales y secretoras del epitelio. El AR es un factor transcripcional miembro de la familia de receptores de hormonas esteroideas. Al producirse la unin con los andrgenos, el AR se transloca al ncleo, donde regula la expresin de una grancantidaddegenesinvolucradosenprocesostalescomoproliferacin,diferenciacin,apoptosisy secrecin. Los andrgenos, por tanto, regulan el balance entre proliferacin y supervivencia dentro de la prstata, controlando su homeostasis (Nieto et al., 2007). Introduccin 10 Losandrgenosadems,estimulandistintosprocesosinflamatoriosquedanlugaralasya mencionadas lesiones benignas y estados premalignos los cuales, si adquieren caractersticas malignas, evolucionan a un cncer de prstata. Por ello, el tratamiento ms comn en la primera fase del cncer de prstata es la terapia por ablacin de andrgenos. Hay dos aproximaciones para conseguir esta ablacin. Laprimeraserealizamediantelaadministracinoraldeanti-andrgenos,queinhibendirectamentela unin de los andrgenos a su receptor y la liberacin de la hormona liberadora de gonadotropina (GnRH), queactaaniveldelejehipotalmico-pituitario-gonadal,disminuyendolaproduccindeandrgenos indirectamentealreducirlosnivelesdegonadotropina.Lasegundaseconsiguemedianteciruga, practicando una orquidectoma y/o prostactectoma radical, que se realiza cuando el tumor est localizado (Vindrieux et al., 2009). Desafortunadamente el 20 % de los pacientes no tienen una buena respuesta, o inclusocuandoeltratamientofunciona,finalmenteenel80%deloscasossedaunaregresinclnica, resurgiendo el proceso canceroso esta vez comoun tumor capaz de crecer en ausencia de andrgenos (Ramsay et al., 2009). Fase andrgeno independiente Laindependenciaaandrgenossedefinecomounestadoclnicodentrodelcncerde prstataenelcuallasclulassoncapacesdesobreviviryproliferarsinparticipacindelasseales producidas por los andrgenos circulantes. La reduccin en los niveles de andrgenos que se provoca en laterapiahormonaloenlaprostactectomaradicalpuedefavorecerlaseleccindeclulasminoritarias capacesdecrecerenausenciadeandrgenos.Estaresistenciapuedeocurrirpordistintascausasque afectan a la regulacin de la sealizacin del AR, haciendo que ste est activo en ausencia de ligando, como son: sobreexpresin del AR, mutaciones activadas por los bajos niveles de andrgenos o por otros ligandos esteriodeos, activacin del AR por ligandos no esteroideos tales como factores de crecimiento y citoquinas,expresinalteradadeco-activadoresoco-represoresyprocesamientoproteolticodelAR transformndose en una isoformano dependiente de andrgenos (Devlin et al., 2009). Adems tambin pueden activarse oncogenes o bloquearse genes supresores de tumores, permitindose de esta forma la proliferacin descontrolada en independencia de andrgenos (Ramsay et al., 2009). Anivelhistolgico,enelestadofinaleltumorsevuelveheterogneo,dndoseunamezclade clulasalteradascapacesdeproliferarymetastatizarqueincluyennosoloclulasluminales,sino tambinclulasbasales,neuroendocrinasoclulasconunfenotipointermedio(Kellyetal.,2008).En este contexto, estudios recientes han demostrado que las clulas madre pueden promover la malignidad Introduccin 11 enlasltimasfasesdelaenfermedad.Sobreelpapeldelasclulasmadreeneldesarrollodelcncer existen dos teoras. La teora clsica defiende que todas las clulas cancerosas son igualmente malignas, perosloalgunosclonesposeencaractersticasbiolgicasfavorablesquepermitenqueeltumorsiga creciendo.Lasegundateorasugierequeeneltumorsemantieneunajerarquasimilaraladeltejido normal,existiendoslounasubpoblacindeclulasenlacimadeestajerarquaquesoncapacesde promoverlamalignidad(Lawsonetal.,2007;Langetal.,2009).Estasclulaspresentanpropiedades caractersticasdelasclulasmadreadultas,incluyendomecanismosanti-apoptticos,resistenciaa quimioterapia e independencia de andrgenos (Antonarakis et al., 2010a). Unavezelcncersevuelveandrgeno-independientelasopcionesteraputicassonmuy limitadas.Frecuentementeseadministranalpacienteunavariedaddecompuestosquimioteraputicos paracombatirlaenfermedad,peroestetratamientosueletenerslounxitomodesto,debidoa problemasdetoxicidadyalaadquisicindeunaresistenciaadrogasalaqueesparticularmente propensa el cncer de prstata (Lee et al., 2008). 1.2.3.4Modelos celulares Lanaturalezaheterogneadelcncerdeprstatadificultalacomprensindelosfactores involucrados en la iniciacin y progresin de la enfermedad. Esta compleja naturaleza hace necesario el usodemodelosexperimentalesinvitrorepresentativosdelosdiferentesestadosdelaenfermedadque ayude al estudio de los mecanismos involucrados en la iniciacin y progresin del tumor.La mayora de losestudiosinvitrosehanfocalizadoentreslneascelulares,LNCaP,PC-3yDU145.Todastienen morfologa epitelial y fueron desarrolladas entre 1977 y 1980. La lnea LNCaP es una lnea bien establecida procedente de una metstasis a un ndulo linfticosupraclaviculardeunadenocarcinomaprosttico.EstasclulasexpresanelARyson dependientesdeandrgenosparasucrecimiento,aunqueencondicionesdecultivopuedenllegara perder el AR tras un gran nmero de pases. Mantienen las caractersticas propias de las clulas normales de prstata. Por tanto, esta lnea se podra considerar representativa de un estado temprano del cncer de prstata andrgeno-dependiente. La lnea PC-3 deriva de una metstasis sea de un adenocarcinoma de prstata de grado IV.Poseecaractersticastpicasdelasclulasepitelialesneoplsicas,presentandonumerosas Introduccin microvellosidades,unionescelularescomplejasyorgnuloscomoelncleo,nucloloymitocondrias anormales.Exhibebajaactividadfosfatasacidaalcalina,ascomonivelesreducidosde5-alfa-reductasa. Es una lnea casi tripliode con un nmero modal de 62 cromosomas. Su tiempo de replicacin es aproximadamente de 33 h, y generan tumores de 1-3 cm de dimetro aproximadamente a los 60 das alserinyectadassubcutneamenteenratonesatmicosdesnudos.Norespondenalaausenciade andrgenos,glucocorticoides,factordecrecimientoepidrmico(EGF)ofactordecrecimientode fibroblastos(FGF),presentandounaceleradocrecimiento(Dozmorovetal.,2009).Enlatabla1se recogen los principales genes relacionados con tumorognesis cuya expresin vara en esta lnea celular. GEN FUNCINGRADO DE EXPRESIN EN PC-3 REFERENCIA H-rasProto-oncogenSobre-expresado(Yamazaki et al., 1994) c-mycProto-oncogenSobre-expresado(Rijnders et al., 1985) p53Supresor tumoral, factor de transcripcin, protena pro-apopttica Inexistente en este tipo celular (Navone et al., 1993) Bin1Supresor tumoral, inhibe la transformacin maligna por interaccin con c-myc Expresin reducida(Ge et al., 2000) NFBFactor de transcripcinActividad elevada(Lindholm et al., 2000) IKKIncrementa la actividad de NFBConstitutivamente activa(Palayoor et al., 1999) Bcl-2Protena anti-apopttica Sobre-expresado(Fahy et al., 2005) Bcl-XlProtena anti-apopttica Sobre-expresado(Li et al., 2001) PTENSupresor tumoral Inexistente en este tipo celular (Davies et al., 1999) p-glicoprotenaAsociada con resistencia a drogas Altos niveles(Theyer et al., 1993) ARReceptor de andrgenosMutado(Kaighn et al., 1979; van Bokhoven et al., 2001) P16(INK4)Supresor de tumoralBaja expresin(Yang et al., 1998) Activador de plasmingeno Implicado en angiognesisBaja expresin(Vaarala et al., 2000) MXBGTPasaBaja expresin(Vaarala et al., 2000) Tabla 1: Alteraciones genticas en la lnea celular PC-3. 12 Introduccin La lnea DU 145 proviene de una metstasis cerebral de un carcinoma prosttico. Son las clulasmsagresivas,nopresentansensibilidadaandrgenos,sondbilmentepositivasparala fosfatasa cida alcalina y no expresan antgeno prosttico. Presentan microvellosidades, desmosomas y mitocondrias anormales. LaslneascelularesDU145yPC-3tienenunfenotipomsagresivoysoncapacesdecreceren ausencia de andrgenos, representando un avanzado estado de la enfermedad (Dozmorov et al., 2009). La lneaRWPE-1 son clulas epiteliales derivadas dela zona perifrica de una prstata histolgicamente normal inmortalizada con una copia simple del virus del papiloma humano(HPV-18). La transfeccin con el virus del papiloma humano tiene un especial inters ya que este virus est involucrado en una gran variedad de cnceres anogenitales, pudiendo tambin estar implicado en la carcinognesis del cncer de prstata. Figura 5. Lneas celulares comnmente usadas en el estudio del cncer de prstata. La lnea LNCaP responde a andrgenos y por tanto representa una fase temprana de la enfermedad. Las lneas PC-3 y DU 145 son insensibles a andrgenosporloqueseusancomomodelosdelafaseindependientedeandrgenos.LalneaRWPE-1seutiliza como modelo de clula epitelial no tumoral. En este trabajo se ha empleado principalmente la lnea PC-3 y ocasionalmente LNCaP, DU 145 y RWPE-1 para comparar los efectos de los cannabinoides en otras clulas de prstata. 13 Introduccin 14 2.- MECANISMOSMOLECULARESYCELULARES IMPLICADOSENELCNCERDEPRSTATA. POSIBLES DIANAS TERAPUTICAS. Comoyasehavisto,lostratamientosparaelcncerdeprstataensufaseindependientede andrgenos son muy limitados y, adems de su elevada toxicidad suelen ser ineficaces, recurriendo en el 95%deloscasoselprocesotumoral.Enestesentido,continuamenteseestnbuscandodianas teraputicasalternativasqueestninvolucradasenlosdistintosprocesosbiolgicosdelcncerde prstata,centrndoselainvestigacinenfactoresdesupervivencia,apoptosis,resistenciaadrogas, angiognesis,regulacinepigentica,evasinypotenciacindelarespuestainmune.Enmuchosde estos procesos la modificacin aberrante de la sealizacin celular tiene un papel clave. Por todo ello, los avancesenelconocimientodelasrutasdesealizacinimplicadasenlacarcinognesisdeprstata permitenabrirunanuevavaenlainvestigacinparaeldesarrollodenuevosfrmacosselectivos, capaces de afectar nicamente a una de estas vas de sealizacin sin interferir inespecficamente en el resto (Ramsay et al., 2009). 2.1.- Sealizacin celular 2.1.1Vas de sealizacin que conducen a apoptosis La apoptosis, o muerte celular programada, es un tipo de muerte celular inducida genticamente a travs de un programa de suicidio celular. Juega un papel crucial durante el desarrollo, perotambin en lacarcinognesis,yaquealfuncionarcomounmecanismodeproteccincontralaformacinyel desarrollodeltumorsudesregulacinpuedepropiciarelprocesotumoral(Russoetal.,2010). Teraputicamentepuedeinducirsepormltiplestratamientos,entreellosradiacin,quimioterapiay drogas inductoras de seales apoptticas (Mahmood et al., 2010). Existen dos vas apoptticas, la intrnseca o mitocondrial y la extrnseca. Ambas se llevan a cabo principalmenteatravsdelaactivacindeunacascadadereaccionesproteolticasmediadaspor distintosmiembrosdelafamiliacisteinil-aspartatoproteasas,tambinconocidascomocaspasas.Estas protenassesintetizancomopro-enzimasqueseactivanporprotelisisenrespuestaaestmulos Introduccin 15 externos(vaextrnseca)talescomoligandosdelosreceptoresdemuertecelular,ointernos(va intrnseca), incluyendo dao en el DNA, privacin decitoquinas y factores de crecimiento, que provocan daos en distintos componentes celulares. Se organizan dentro de una cascada compuesta de caspasas iniciadoras, caspasa 8 en la va extrnseca o caspasa 9 en la intrnseca, que al ser activadas provocan la ruptura de las caspasas efectoras, principalmente la caspasa 3. stas ltimas llevan a cabo la ruptura de muchas protenas celulares y subsecuentemente, alteraciones morfolgicas y cambios en el metabolismo queculminanconlamuertecontroladadelaclula(Kumar,2009;Duncanetal.,2010;Lamkanfietal., 2010) Lavaextrnsecaseproduceatravsdelasealizacintransducidaporreceptoresdemuerte celular. Estos receptores pertenecen a la familia de receptores del factor de necrosis tumoral (TNFR) que poseenunaregindeunos80aminocidosllamadadominiodemuerte(DD),quejuegaunpapel principal en la transmisin de la seal apopttica. Sus ligandos son miembros de la familia del factor de necrosis tumoral (TNF), que incluyen a FASL, TNF- y ligandos inductores de apoptosis relacionados con TNF-(TRAIL).Launinligando-receptordesencadenaunagrupamientodelosreceptores, generalmente mediado por la ceramida localizada en lamembrana celular, que permite la formacin del complejodesealizacindemuertecelular(DISC).Estecomplejoestformadoporunaprotena adaptadora con un dominio de muerte asociado a Fas (FADD), procaspasa-8 y el inhibidor apopttico c-FLIP. Cuando FADD se une al receptor por medio de su dominio de muerte (DD) y a la procaspasa 8 por sudominioefectordemuerte(DED),seproducelaactivacindelaprocaspasa8,desencadenandola cascada de activacin de caspasas, en este caso de las caspasas 3 y 7, induciendo en ltimo trmino la muerte celular (Schwarze et al., 2008; Mahmood et al., 2010) (figura 6). Lavaintrnsecarequiereladisrupcindelamembranamitocondrialporprotenasdelafamilia Bcl-2, formndose un poro en la membrana mitocondrial y liberndose protenas mitocondriales como el citocromo c. La familia Bcl-2 se caracteriza por poseer regiones especficas de homologa a Bcl-2 (BH1, BH2,BH3yBH4).Puededividirseenprotenaspro-apoptticasyanti-apoptticas.Lasprotenaspro-apoptticasincluyenprotenastalescomoBax,Bcl-Xs,Bak,Bok/Mtd,quecontienen23dominiosde homologa a Bcl-2 (BH), y otras como Bad, Bik/Nbk, Bid, Hrk/DP5, Bim/Bod y Blk, con slo un dominio 3 de homologa a Bcl-2 (BH3). Las anti-apoptticas incluyen protenas como Bcl-2, Bcl-XL, Bcl-w, A1/Bfl-1, Mcl-1 y Boo/Diva, que contienen 3 4 regiones de homologa con Bcl-2. La sobre-expresin de protenas anti-apoptticas inhibe la liberacin del citocromo c de la mitocondria, mientras que la sobre-expresin de Introduccin protenas pro-apoptticas induce su liberacin. Al liberarse el citocromo c del espacio intermembrana de lamitocondriapasaalcitoplasmadnde,juntoaotrosfactorescitoslicos,comofactor1activadorde proteasasapoptticas(Apaf-1)yprocaspasa9,promuevelaformacindelcomplejoactivadorde caspasas,elapoptosoma,desencadenandolaactivacindecaspasa9,queasuvezactivaasus caspasas efectoras, caspasa 3, 6 y 7,iniciando as la cascada apopttica (Liao et al., 2007; Russo et al., 2010). 16 Figura 6. Esquema de las principales rutas apoptticas. La va extrnseca se induce por factores externos capaces de unirse a los receptores de muerte celular, formndose el complejo de muerte celular y activndose la caspasa 8. La va intrnsecaseactivaenpresenciadeestmulosapoptticosinternos,comodaoenelDNA,permeabilizndosela membranamitocondrialyproducindoselaliberacinalcitoplasmadelcitocromoc,queactivaelapoptosomayala caspasa 9. Papel del estrs de retculo en la apoptosis El retculo endoplasmtico (ER) es el sitio de sntesis y plegamiento de un tercio de lasprotenas celulares, principalmente protenas secretoras y de unin a membrana. Es tambin un elemento clave en eltrficodevesculas,ademsdeparticiparenlasntesisdelpidosydeesteroides,biognesisde membranayalmacenamientodelcalciointracelular.Ademsdeesteamplionmerodefunciones biolgicas, se comporta como un sensor de daos celulares, a los que responde mediante una respuesta llamada estrs de retculo (Schwarze et al., 2008). El estrs de retculo se produce por alteraciones de la homeostasis celular que causan deplecin de Ca2+ o de molculas donadoras de energa, as como por infecciones virales, bloquendose la sntesis de protenas. Se produce de esta forma una acumulacin de protenas mal plegadas que inducen un mecanismo conocido como respuesta a protenas mal plegadas DDReceptor de muerteFactores de crecimientoprocaspasa 9procaspasa 8FADDc-FLIPCaspasa3,6,7Bcl-2Caspasa 8Caspasa 9ApafCitocromo cVa extrnsecaVa intrnsecaDISDED DEDCDD Introduccin (UPR).EstaUPRseiniciapormediacindeunachaperonade78kDareguladaporglucosa(GRP78), que en condiciones normales est unida a tres protenas transmembrana que actan como sensores de estrs,laquinasadelretculoendoplasmticopancretico(PERK),elfactordetranscripcinactivador6 (ATF6) y la enzima dependiente de inositol (IRE1), mantenindolas en un estado inactivo. Al aumentar las protenasconunmalplegamientocompitenconlossensoresdeestrsporsuuninaGRP78, liberndosestosyactivndosedeformasecuencial.PERKactivofosforilaalfactoriniciadordela sntesis de protenas en eucariotas, eIF2, inactivndolo, inhibiendo aslatranscripcindependientede Cap, pero permitiendo la IRES dependiente y activando adems al factor de transcripcin ATF4, que se translocaalncleoyregulalaexpresindegenesimplicadosenlahomeostasisdelER.ATF6se proteolizayseactivaenelaparatodeGlogi,translocndosealncleo,dndeinducelaexpresinde genesconelementosderespuestaalestrsderetculo(ERSA),entreotrosCHOPylaprotena1de unin a X-box (XBP1). XBP1 ha de sufrir un procesamiento post-transcripcional llevado a cabo por IRE1, lo cual permite su translocacin al ncleo y la activacin de genes inducibles por estrs responsables de la degradacin de las protenas mal plegadas (Szegezdi et al., 2006; Healy et al., 2009) (figura 7). Reaccin redoxTransporte y sntesisde aaRespuesta a estrsCHOPXBP1ChaperonasCHOPChaperonasGenes de degradacin de protenasFigura7.EsquemadelasprincipalesrutasimplicadasenlarespuestaUPR.Bajoagregacindeprotenasmal plegadas,GRP78 se disocia de los tres sensores de estrs de retculo, PERK, ATF6 e IRE1, permitiendo su activacin. Laactivacindeestasprotenasocurredemanerasecuencialdelasiguientemanera:PERK,ATF6eIRE1.La activacindePERKbloqueaeIF2,loquepermitelatranslocacindeATF4alncleo,activndoselatranscripcin independientedeeIF2.ATF6seactivaporprotelisis,translocndosealncleoyregulandolaexpresinde chaperonasdelER,ascomodeXBP1.XBP1esunfactortranscripcionalcuyomRNAhademodificarseporsplicing, siendo el encargado de esta modificacin IRE1. XBP1 una vez modificado se transloca al ncleo, activando la expresin de chaperonas y de genes involucrados en degradacin de protenas (Modificado de Szegezdi et al, .2006). 17 Introduccin 18 AunquelarespuestaUPResprincipalmenteunarespuestapro-supervivencia,ensituacionesde estrsprolongadasquenologranresolverse,puedeinducirapoptosis,considerndoseinclusoelestrs deretculounanuevavadeinduccindeapoptosis(Heath-Engeletal.,2008;Repickyetal.,2008).Si bienlosmecanismosbiolgicosporlosqueocurreestrelacinnoestnclaros,sesabequedistintos miembrosdelafamiliaBcl-2puedenregularlahomeostasisdelcalciointracelular,afectandoasel intercambio de calcio entre el retculo y la mitocondria, pudiendo traducirse estos cambios en la activacin de la va intrnseca apopttica (Schwarze et al., 2008). Papel de la ceramida en la apoptosis Losesfingolpidoscomplejossonlosprincipalesconstituyentesdelamembranacelular.Adems deestepapelestructural,algunosdeellostambinposeenimportantespropiedadesbioactivas.Estn formados por esfingosina unida a un cido graso de longitud variable (entre 14 y 16 carbonos), que forma lamolculadeceramida,alqueseuneungrupopolar.Laceramida,ademsdeformarpartedelos esfingolpidos,actacomosegundomensajeroregulandovasdesealizacincelularimplicadasen procesos biolgicos como diferenciacin, trfico celular, parada del ciclo celular, proliferacin y apoptosis (Mao et al., 2008; Arana et al., 2010; Gangoiti et al., 2010). Laceramidapuedegenerarseatravsdedosrutas:porsntesisdenovoypordegradacinde esfingolmielina(SM)delamembranaplasmticaporesfingomielinasas(SMasas).Laprimerava,lade sntesis de novo, es una ruta anablica que comienza con la condensacin de serina y palmitoil coenzima A por la enzima serina palmitoil transferasa (SPT) rindiendo 3-cetoesfinganina. Posteriormente se reduce la3-cetoesfinganinaaesfinganina,einmediatamenteseacilaporladihidroceramidasintasa,tambin denominadaceramidasintasa(CerS),rindiendodihidroceramida.ExistenseisCerSconocidas,que muestrandiferentepreferenciapordistintossustratosacil-coenzimaA,generandodistintasespeciesde ceramidas.Porltimo,aconteceladesaturacindedihidroceramida,originandoceramida.Ceramida tambinpuedeformarsedirectamenteapartirdeesfingosinaporaccindelaceramidasintasa.La segundavadegeneracindeceramidaesunavacatablica.Laceramidaseoriginadirectamentea partirdelahidrlisisdeesfingomielinaporungrupodeenzimasllamadasesfingomielinasas,rindiendo tambin una molcula de fosforilcolina (Gangoiti et al., 2010) (figura 8). Introduccin Ceramida acta como precursor de distintos esfingolpidos complejos. Cerebrsidos y ganglisidos se sintetizan mediante distintas enzimas biosintticas que aaden sustituyentes especficos en la posicin C1. SM se genera a travs de la unin de un grupo de fosforilcolina proveniente de la fosfatidil colina (PC) porlaSMsintasa.Adems,ceramidapuedefosforilarseporlaenzimaceramidaquinasa(CerK), formando ceramida-1-P (C1P), regulador clave de la homeostasis celular, implicado tambin en procesos de inflamacin (Saddoughi et al., 2008; Arana et al., 2010; Gangoiti et al., 2010). serina +palmitoil-CoA19 Figura 8. Vas de sntesis de ceramida. Existen dos rutas que llevan a la generacin de ceramida: la sntesis de novo a partirdelacondensacindeesfingolpidosdelretculoendoplasmticoyelaparatodeGolgi,ylahidrlisisde esfingomielina de la membrana plasmtica por esfingomielinasas. Elpapelprincipaldeceramidacomosegundomensajeroconsisteenmediarenrespuestasque conducen a apoptosis y parada de ciclo celular, aunque tambin est implicada en la sealizacin celular queregulaotrasrespuestasmuydiversas,comoadhesin,angiognesis,trficocelulareinflamacin. Ceramidapuedeinteraccionarconfosfatasasyquinasasqueregulanimportantesvasimplicadasen crecimiento celular y la apoptosis, como protena quinasa C (PKC), MAP quinasas y protena fosfatasas 1 y2(PP1yPP2A)(Saddoughietal.,2008).Porotrolado,C1Pposeefuncionesantagnicasalasde ceramida. Presenta un papel mitognico, promoviendo respuestas de supervivencia y crecimiento celular atravsdelaregulacindediferentesvasdesealizacin,comolaprotenaquinasaquinasaactivada por mitgenos (MEK), PI3K/Akt y c-Jun terminal quinasa (JNK). Adems de esta funcin mitognica, C1P est fuertemente implicada en respuestas inflamatorias y en regulacin de fagocitosis (Saddoughi et al., 2008; Arana et al., 2010; Levi et al., 2010). ceramidaesfingomielinaEsfingomielinasasdihidroceramidaesfinganina3-cetoesfinganinaceramidasintasaSNTESIS DE NOVOHIDRLISIS DE ESFINGOMIELINA Introduccin 20 2.1.2Vasdesealizacinimplicadasenproliferacinysupervivencia celular Durantelagnesisyeldesarrollodelcncer,ademsdealterarselosmecanismosanti-apoptticos,frecuentementesemodificanlosmecanismosdesupervivenciacelular,siendoelbalance entreambosprocesosclaveenelcontrolytratamientodelaenfermedad.Entrelosmecanismosque regulanlasupervivenciacelularyquehabitualmenteestnimplicadosenelcncer,destacanlava PI3K/Akt/mTOR y las cascadas de MAPKs. Va PI3K/Akt/mTOR En el 50-80% de los casos de cncer de prstata avanzado y aproximadamente en el 20% de las lesioneslocalizadassepierdeelgensupresordetumoresPTEN(Leeetal.,2008;Antonarakisetal., 2010a).Estegenesunreguladornegativodelarutadelafosfatidilinositol3-quinasa(PI3K), encontrndoseasestavasobre-activadafrecuentementeenelcncerdeprstata.Estavaregula mltiplesprocesoscelulares,principalmentesupervivencia,progresindelciclocelularytransformacin neoplsica (Antonarakis et al., 2010a; Mahajan et al., 2010). PI3Kesunaprotenaconundominiocatalticocapazdeconvertirfosfatidilinositol4,5bisfosfato (PIP2)enfosfatidilinositoltrisfosfato(PIP3),fosfolpidoqueactacomosegundomensajero,activando indirectamentealaprotenaquinasaB(PKB)/Akt.Unavezactivada,Aktpuedefosforilarentreotros sustratosalaprotenadianaderapamicinaenlosmamferos(mTOR).mTOResunaserina/treonina quinasaqueregulalaexpresindegenes implicados en crecimiento, comoc-Myc, ciclina D1 y el factor decrecimientodelendoteliovascular(VEGF)(Leeetal.,2008;Ramsayetal.,2009;Antonarakisetal., 2010a).AdicionalmenteAkttambinescapazdetranslocarsealncleo,dondeafectadirectao indirectamente a la actividad de mltiples reguladores de la transcripcin, como CREB (protena de unin aelementosderespuestaaAMPcclico),elfactornuclearkappaB(NFB)yelfactordetranscripcin forkhead, que regulan la proliferacin y crecimiento celular. Akt tambin puede inactivar por fosforilacin variosfactoresapoptticos,comoprocaspasa9yelmiembropro-apoptticodelafamiliaBcl-2,Bad (Kitagawa et al., 2002; Fresno Vara et al., 2004; Lee et al., 2008; Qiao et al., 2008) (figura 9). Introduccin Factores de crecimientoPTEN21 Figura 9. Va PI3K/PTEN/Akt/mTOR. Distintos factores de crecimiento pueden activar a PI3K, fosforilando PIP2 a PIP3, segundo mensajero que activa a su vez a Akt. Akt posee un amplio espectro de dianas reguladoras del crecimiento y apoptosis.

Protenas quinasas activadas por mitgenos Lasprotenasquinasasactivadaspormitgenos(MAPKs)sonunafamiliadeserina/treonina quinasasquemedianlasealizacinintracelularimplicadaenunaampliavariedaddeprocesostales comoproliferacincelular,diferenciacin,supervivencia,muertecelularytransformacin.Lafamiliade MAPKsestcompuestaporvariasprotenas,entrelasquedestacanlaquinasareguladaporseales extracelulares(ERK),p38,yc-JunNH2-terminalquinasa(JNK).CadaunadeestasMAPKsonelltimo elemento de una cascada de sealizacin en la que participan al menos tres quinasas que se activan en tndem,unaMAPKquinasaquinasa(MAP3K),unaMAPKquinasa(MAP2K)ylapropiaMAPK.La sealizacin culmina con la unin de las MAPKs a factores de transcripcin, activndolos y modulando de esta forma la expresin de genes a travs de fosforilacin de residuos serina/treonina. Tambin pueden fosforilarprotenascitoplasmticas,principalmenteprotenasimplicadasenprocesosapoptticos,como algunos miembros de la familia Bcl-2 y protenas del citoesqueleto (Junttila et al., 2008; Lee et al., 2008; Huang et al., 2009) (figura 10). PI3KCREBCaspasa 9AktPIP2ppPIP3pppNFkBmTORBad Introduccin MAP4K/GTPasa RasMAP3k Raf ASK1,MEKK1,ML3MAP2K MEK M2K3/M2K6 M2K4/M2K7MAPK ERK p38 JNKRespuestas celulares Proliferacin celularMigracinDiferenciacinProliferacin celularDiferenciacin y apoptosisRespuestas inflamatorias22 Figura 10.Ruta de sealizacin celular de las vas MAPKs. LarutadelasMAPKestcompuestaporunaseriede activacionessecuencialesdeMAPK:primeroMAP3K,segundoMAP2KyporltimoMAPK.Enocasionesexisten adicionalmenteotrasquinasasqueactivanaMAP3K,lasMAP4K.Losefectoresltimosdeestaruta,lasMAPK,son ERK,p38yJNK.MAPKactivanunampliorangodesustratosimplicadosendiversasfuncionescelulares,entreellas supervivencia celular, apoptosis e inflamacin. La sealizacin regulada por MAPK ha sido implicada en la patognesis de varias enfermedades, incluido el cncer (Kim et al., 2010). Aunque en el cncer de prstata no ha sido una ruta muy estudiada, enlostrabajosrealizadossobreeltemaexistedivergencia,relacionndolaunosconeldesarrollodel cncer, y otros con su regresin, siendo necesariosms estudios para aclarar su papel en el cncer de prstata (Lee et al., 2008). Va de ERK Estavaseconsideraunavapromotoradesupervivencia.Seactivaporunagranvariedadde mitgenosydesteresdeforbol.LasealseiniciaporRas,unaGTPasaqueseactivaporreceptores tirosin-quinasa (RTK), seguida de activacin de Raf. Raf tambin puede activarse, as como inhibirse, por variasquinasas,comoPKC,protenaquinasaA(PKA)yprotenaquinasaactivadaporp21(PAK).Una vezactivada,Rafseuneyfosforilaasussustratosdiana,MEK1yMEK2,conmediacindelaquinasa supresoradeRas(KSR).MEK1/2activadirectamentealasquinasasERK1yERK2,queregulanla actividad de mltiples dianas, entre ellas diferente miembros pro-apoptticos de la familia Bcl-2 y factores de transcripcin como FOXO3A, CREB, NFB y c-Fos (Lee et al., 2008; Kim et al., 2010). Introduccin 23 Va de JNK LavadeJNKpuedeparticiparenprocesosdeapoptosis,supervivenciaoproliferacin dependiendo de los distintos estmulos. Se activa en respuesta a estrs y citoquinas. Existen numerosas MAP3Kscapacesdeactivarestava,entreellasASK1,HPK1,MLK-3,M3K14,TAK-1yTPL-2.Estas activan dos MAP2K, M2K4 o M2K7, ambas necesarias para activar JNK. El principal sustrato de JNK es c-Jun, pero tambin puede activar otros factores de transcripcin tales como ATF-2, Elk-1, MEF-2c, p53 y c-Myc.Adems,JNKpuedeactivarprotenasanti-apoptticas,entreellasBcl-2yBcl-x(Junttilaetal., 2008; Kim et al., 2010). Va de p38 Estavaestimplicadaenunampliorangodefuncionescelulares,incluyendoapoptosis, regulacindelciclocelular,induccindelaexpresindecitoquinasydiferenciacin.Seactiva principalmente en respuesta a estrs y por molculas proinflamatorias, como TNF e interleuquina 1 (IL-1)(Fengetal.,2009).EstosestmulosactivanlasmismasMAP3KqueactanenlavadeJNK,como ASK1 y TAKI, que a su vez activan las MAP2K, M2K3 y M2K6, que por ltimo activan a p38 (Junttila et al., 2008; Feng et al., 2009). 2.2.- Sistema inmune: Inmunoterapia Enlosltimosaoslaimplicacindelsistemainmuneeneltratamientodelcnceresttomando unagranrelevancia.Esampliamenteconocidoquelospacientesinmunosuprimidosposeenmayor susceptibilidad a generar distintos tipos de cncer (Arnon et al., 2008). En este sentido el sistema inmune puede generar respuestas antitumorales que eviten el desarrollo del tumor, siendo la supresin de estas respuestasunodelosfactoresclaveparalasupervivenciatumoralylainvasin.Portanto,entrenaral sistemainmuneparainducirunarespuestacontraeltumoreselprincipalobjetivoentodaslas aproximaciones inmunoteraputicas (Arnon et al., 2008; Shields et al., 2010). En el caso del cncer de prstata el xito de la inmunoterapia es ms conflictivo debido al papel ya mencionado de la inflamacin en el origen y progresin de esta enfermedad. Este hecho induce a pensar queelcncerdeprstatanoesuntipodecncersusceptiblealusodeinmunoterapia.Noobstante, Introduccin 24 evidenciasrecientessugierenqueelcncerdeprstataesmsinmunognicodeloquesepensaba, habiendo pacientes que generan autoanticuerpos espontneamente. Adems, al ser una enfermedad de lenta progresin permite que la estimulacin del sistema inmune genere con el tiempo una respuesta anti-tumoral eficaz. As, aunque el uso de inmunoterapia en el cncer de prstata ha de hacerse de manera altamentecontrolada,nosloestimulando,sinotambinmodulandoelsistemainmune,actualmente existen varias terapias inmunolgicas en fase clnica de desarrollo, entre ellas dos vacunas y un inhibidor de un factor regulador negativo de la activacin de los linfocitos (Harzstark et al., 2009; Antonarakis et al., 2010a). 2.2.1Papel de las clulas T Elusodeunaestimulacinglobaldelsistemainmunepodraaumentarlasreaccionesinmunes inespecficas en el cncer de prstata y aumentar la respuesta inflamatoria. Los principales mediadores y efectores inespecficos del sistema inmune son las citoquinas, el sistema del complemento y las protenas defaseaguda,ademsdealgunoscomponentescelularescomolosneutrfilos,macrfagosyclulas natural killer. En contraste, la inmunidad adaptativa puede usarse como especfica en inmunoterapia, ya que este componente del sistema inmune puede ser amplificado y dirigido propiamente contra las clulas tumorales.LasclulasquemedianprincipalmenteenlasrespuestasantitumoralessonloslinfocitosT (Carlsson et al., 2007). As, la generacin de reacciones tumor-especficas ejecutadas por los linfocitos T, yaseaatravsdeunavacunaoporelusodeanticuerpos,esunadelasaproximacionesms prometedoras en inmunoterapia dirigida (Kubler et al., 2008; Reiter et al., 2009). En el caso del cncer de prstata,concurrenvariosfactoresquepotencianelusodelasclulasTcomoposiblesantitumorales; existe un gran nmero de protenas con expresin especfica o preferencial en la prstata que pueden ser usadas como antgenos asociados al tumor contra los que lanzar la respuesta inmune y, al mismo tiempo, la prstata es un rgano prescindible no vital, lo cual permite una inmunoterapia dirigida (Carlsson et al., 2007). Los linfocitos T se originan en el timo, como clulas T nativas o nave, que circulan por el torrente sanguneoymigranalosrganoslinfoidesperifricos,desdedndevuelvenalasangre,recirculando entreambaslocalizacioneshastaqueencuentranalantgeno.Estasclulasparticipanenlarespuesta inmunitaria adaptativa, pero para ello han deproliferar y diferenciarse a clulas T efectoras, capaces de destruirlosagentespatgenos.ExistendosclasesdeclulasTefectoras,quesediferencianporla Introduccin 25 expresinenmembranadedosmolculasdesuperficiediferentesquevanadeterminarsusfunciones efectoras (figura 11). ClulasTcitotxicas(CTL)sonclulasCD8+.Reconocenylisanlasclulasque presentanantgenosanormalesensumembrana,yaseanclulasanormalesdelorganismo,como clulas neoplsicas, o clulas infectadas por microorganismos intracelulares. ClulasTcolaboradorasohelper(Th)sonclulasCD4+.Activan,pormediodela secrecindecitoquinas,alasclulasBymacrfagosquehancapturadoelantgeno,ayudndolosa destruirlosmicroorganismosextracelularesoquevivenenvesculasfagocticas.Traslaactivacin, pueden diferenciarse a su vez en tres subtipos. Las clulas Th1 conducen la respuesta inmune mediada por clulas implicada en dao tisular e infeccin contra parsitos intracelulares. Las clulas Th2 median laproduccindeIgE,estandoparticularmenteinvolucradasenlarespuestadeloseosinfilos,alergiae infecciones por helmintos y otros parsitos extracelulares. El tercer subtipo de Th son las clulas Th17, definidasporlaproduccindeIL-17yestnrelacionadasconinflamacinautoinmuneeinmunidad antimicrobiana (Harrington et al., 2006; Stockinger et al., 2007; Awasthi et al., 2008). Entodaslaspoblacionesdelinfocitos,B,Tonaturalkiller,existenclulasreguladoras especializadas en suprimir la respuesta inmune contra antgenos propios especficos. Los linfocitos T que formanpartedestasclulasmoduladorasseincluiranenotrosubtipodeclulasTdistintasdelas clulasefectoras,lasclulasTreguladoras(Treg).stasexpresanensumembranalamolculade superficieCD25(Amarnathetal.,2007;Lietal.,2010)ysonlasresponsablesdedesencadenarla respuesta especializada en mantener la tolerancia a lo propio. Adems se ha visto que pueden participar como supresores de la respuesta antitumoral (Sfanos et al., 2008).Se cree que los linfocitos Treg y Th17 tienen un origen comn y son mutuamente excluyentes. Su activacinesdependientedelccteldecitoquinaspresente,enelquejuegaunpapelrelevantela interleuquina-6(IL-6),quedirimeladiferenciacinhaciaTh17 (Bettellietal.,2006;O'Garraetal.,2008; Volpe et al., 2008; Basso et al., 2009). Introduccin 26 Apesardequelasclulasdelsistemainmuneconmayorrelevanciaenlaluchacontraeltumor son los linfocitos T citotxicos, cada vez existen ms evidencias de la implicacin de los linfocitos Th17 en estarespuestaantitumoral.Recientementesehademostradoestacapacidadantitumoraltantoen experimentosinvitro,dndelasclulasTh17soncapacesdeinducirregresintumoral,comoenunmodelo in vivo, en el que ratones deficientes en IL-17 presentan un crecimiento tumoral mayor (Kryczek etal.,2009b).Adems,loslinfocitosTh17podrancontribuirtambinalaaccinantitumoraldelos linfocitos T citotxicos (Martin-Orozco et al., 2009). 2.2.2Papel de Interleuquina-6 Elpapeldelascitoquinascomoprincipalesmoduladorasdelsistemainmunehacedestasun factor crucial en la inmunoterapia, siendo el uso de frmacos que regulan sus niveles, junto con el de las vacunas,unadelasestrategiasmsempleadasenlasaproximacionesinmunoteraputicasdirigidasal tratamientodelcncer.Enelcncerdeprstataelusodevacunasparagenerarefectosantitumorales pareceserinsuficiente(Slovin,2008).Estosugierequeesnecesarioelusodeunaterapiacombinada concitoquinasoinhibidoresespecficosparaaumentarsignificativamentesueficacia,ademsdepara validar el papel de las clulas inmunes en la respuesta antitumoral (Kubler et al., 2008; Antonarakis et al., 2010b). Por otro lado, las clulas de prstata pueden secretar citoquinas proinflamatorias que participan Figura11.DiferenciacindelinfocitosTinducidaporcitoquinas.LasclulasTnativaspuedenactivarseporlas clulas dendrticas y formar distintas poblaciones de clulas T efectoras segn el cctel de citoquinas presente, originando as clulas Th1, Th2, Th17 y Treg (Modificado de OGarra et al., 2008). Th17TregTGFTGFIL-6Th2Th1IFNIL-4Cl ul a T nati vaCl ul adendrti ca Introduccin 27 activamenteenelreclutamientoyactivacindeclulasdelsistemainmune(Wongetal.,2009),factor claveeneldesarrolloderespuestasantitumoralesinducidasporlainmunidadadaptativa(Evansetal., 2008; Reiter et al., 2009). La IL-6 es una citoquina pleiotrpica que participa en distintos aspectos biolgicos del cncer. En prstata es una de las citoquinas con mayor relevancia, ya que no slo regula respuestas inflamatorias, sinotambincrecimientocelularyresistenciaadrogas(Puetal.,2004;Culig,2005).Estconsiderada unacitoquinaproinflamatoria,locual,juntoconelhechodequesesobre-expreseenelcncerde prstatahahechoqueselarelacioneconsupatognesis(Nakashimaetal.,2000;Cabrespineetal., 2007;Bouraouietal.,2008).Sinembargo,estudiosrecientesrefutanestahiptesis,alnoencontrar relacin entre el incremento en los niveles de IL-6 circulante y el riesgo en el cncer de prstata, as como tampocounincrementodelaproliferacininvitrodeclulasdecncerprstataenrespuestaalaIL-6 (Xing et al., 2001; Pierce et al., 2009). Es ms, el papel proinflamatorio de esta citoquina podra resultar beneficioso,yaquelasrespuestasinflamatoriaspuedentenerunpapeladaptativosiestncircunscritas en el tiempo. As, en pacientes sometidos a radioterapia ocurre un aumento de los niveles de citoquinas proinflamatoriascomopartedeunarespuestacoordinadadiseadaparacontrolarlosdaosinducidos por la radiacin, promoviendo la reparacin tisular (Hagemann et al., 2007; Sepah et al., 2009). Sealizacin celular inducida por IL-6 IL-6 ejerce sus efectos celulares a travs de la formacin de un complejo receptor localizado en la membrana,compuestoporelreceptordeIL-6alfa(IL-6R),protenatransmembranaglicosilada pertenecientealasuperfamiliaclsicadelosreceptoresdecitoquinastipo1,yporlaglicoprotena130 (gp130), un receptor de citoquinas transmembrana. IL-6 se une a IL-6R y la formacin de este complejo atraeagp130,quedimerizapermitiendolatransmisindelasealintracelular.NiIL-6niIL-6Rpors solos son capaces de unirse y activar gp130 (Bouraoui et al., 2008). Principalmente la seal se transduce atravsdetirosinasquinasasdelafamiliaJanus,tambinconocidascomoJanusquinasa(Jak1,Jak2, Jak3 y Tyck2) y factores de transcripcin de la familia STAT (transductores de la seal y activadores de transcripcin). Otras vas alternativas de transduccin son la va de PI3K/Akt y MAPK (Yang et al., 2003; Hodge et al., 2005; Cabrespine et al., 2007; Santer et al., 2010). Introduccin Existe una forma soluble del IL-6R (sIL-6R), generada por splicing alternativo o por ruptura del IL-6R unidoalamembrana,capazdeunirsealacitoquina.ElcomplejoIL-6/sIL-6Rpuedeactivargp130 enausenciadeIL-6R.Estasealizacinalternativaseconocecomotrans-sealizacindeIL-6.En contraste con otros receptores de citoquinas solubles sIL-6R facilita la actividad de la IL-6, pudiendo tanto amplificarlasealproducidaporIL-6R comoactivarlaenclulasquenopresentanestereceptor. Tambin existe una forma soluble de la protena gp130(sgp130), pero sta slo inhibe la activacin del complejo IL-6/sIL-6R, sin interferir en la actividad del complejo IL-6/ IL-6R (Santer et al., 2010). IL-628 STAT3 Gp130estasociadaadistintasJak(Jak1,Jak2yTyk2),queseactivancuandoestadimeriza, fosforilandoalapropiagp130ensuextremocitoplasmtico.Estafosforilacin,queocurreenvarios residuos,esreconocidaporlosmiembrosdelafamiliaSTAT,queseunenagp130.EntoncesJak fosforilaalosdistintosSTAT,activndolosypermitiendolaformacindedmeros.Estosdmerosse translocanalncleo,dnderegulanlatranscripcindemltiplesgenes.Posteriormentesoninactivados por desfosforilacin, volviendo al citoplasma (Bromberg, 2002; Hodge et al., 2005). Figura 12. Sealizacin celular de IL-6 va STAT3. La unin de IL-6 al receptor IL-6R produce la dimerizacin de gp130, yactivacindeJak.Jakactivadofosforilaagp130,queesreconocidoporSTAT3,quesefosforilaporJak,permitiendola formacin de dmeros activados, que se translocan al ncleo para regular la transcripcin. JakpJakpSTAT3 STAT3STAT3pS T A T 3pSTAT3pS T A T 3pIL-6Rgp130gp130p p Introduccin 29 LasprotenasSTATsonunafamiliadefactoresdetranscripcinformadaporsietemiembros: STAT1,STAT2,STAT3,STAT4,STAT5a,STAT5bySTAT6,estandoalgunosdeellosasociadoscon diversostiposdecncer.STAT1ySTAT5seencuentranconstitutivamenteactivadosenalgunas leucemias, aunque es STAT3 el que con ms frecuencia se altera en varios tipos de cncer, entre ellos el cncerdeprstata(Horvath,2000;Turksonetal.,2000;Bartonetal.,2001;Hodgeetal.,2005),porlo que incluso es considerado un oncogn (Levy et al., 2006). Ms an, STAT3 modula la transcripcin de diversos genes que promueven supervivencia y proliferacin, entre ellos protenas anti-apoptticas como Bcl-xyBcl-2ygenesimplicadosenlaprogresindelciclocelular,comolaciclinaD1(Bowmanetal., 2001; Garcia et al., 2001). Adems, la inhibicin de STAT3 est implicada en el mecanismo de accin de diversas drogas antitumorales (Bispo de Jesus et al., 2008; Chesnokov et al., 2009; Hahm et al., 2010). 2.2.2.1Papel del factor nuclear kappa B NFB es un factor de transcripcin pleiotrpico que desempea una funcin central en la respuesta inmuneinnatayenlaadquirida,induciendolaexpresindegenesquecodificancitoquinas proinflamatorias,quimioquinasymolculasdeadhesin.Perotambinparticipaenotrasfunciones biolgicas,entreellasproliferacincelularyapoptosis.Supapelenestosfenmenoscelulareses controvertido y, aunque normalmente participa en procesos anti-apoptticos, en ciertas ocasiones posee una funcin antitumoral (Perkins et al., 2006; Chen et al., 2008b). Este factor y muchas de sus mltiples protenasreguladoras,enteellasmiembrosdelafamiliaBcl-3,estnfuertementeimplicadosenvarios tipos de tumores slidos y hematolgicos (Sun et al., 2007). Todo esto hace de NFB un posible eslabn de unin entre inflamacin yprogresin del cncer (Kim et al., 2006). EnmamferosexistencincogenesNFBrelacionadosporundominioN-terminalde aproximadamente300aminocidosllamadodominiohomlogoaRel(RHD)enelqueselocalizan secuencias tanto de unin a DNA y a inhibidores, como de dimerizacin. Estos cinco genes (tabla 2) dan lugarasieteprotenasdiferentes,quesedividenendosclasessegnsudominioRHD,queforman distintas subunidades de NFB: Clase I: incluye NFB1 (p50 y su precursor p105) y NFB2 (p52 y su precursor p100) Clase II: RelA (p65), RelB y c-Rel Introduccin LassubunidadesdeclaseI,p50yp52,sesintetizancomoprecursores,p105yp100 respectivamente, que son procesados por el proteosoma, donde se elimina su extremo carboxilo-terminal dandolugaralasformasactivasp50yp52.LassubunidadesdeclaseIIposeenundominiode transactivacin en su extremo C-terminal, que es el responsable de la activacin gnica.ClaseProtenaOtros nombresGen I NF-B1p105 p50NFKB1 NF-B2p100 p52NFKB2 II RelAp65RELA RelBRELB c-RelREL Tabla 2. Protenas de la familia NFB.Estas subunidades forman varios homodmeros y heterodmeros, siendo el ms comn el formado porlassubunidadesp50/p65.Alsereldmeromscomn,eltrminoNFBgeneralmenteseusapara referirseaesteheterodmerop50/p65,aunqueestenombrepuedeaplicarsetambinaotrosdmeros compuestospordiferentessubunidadesdeNFB.Enausenciadeactivacin,losdmerospermanecen secuestradosenelcitoplasmaporprotenasinhibidorasllamadasIBs.Cuandoexisteunestmulo activador estas protenas inhibidoras son fosforiladas por la familia de las quinasas de los inhibidores de NFB(IKKs),activndosesudegradacin.LafamiliaIKKestconstituidaporIKK,IKKe IKK, tambinllamadamoduladoresencialdeNFB(NEMO).CuandosedegradaelinhibidorIBse producelaliberacindeNFB,permitiendoassuactivacinytranslocacinalncleo,donderegulala transcripcin de distintos genes (Hayden et al., 2008; Mohamed et al., 2009). NFBseactivaporvariosestmuloscomolipopolisacridosbacterianos,steresdeforbol,virus, estrsoxidativo,luzultravioleta,radiacinionizanteydrogasgenotxicas.Suactivacinseproducepor lasvasdesealizacindelreceptor1delfactordenecrosistumoral(TNFR1),elreceptor1de interleuquina1(IL-1R1),elreceptorsimilaraToll(TLR),elreceptordeclulasB(BCR),elreceptorde clulas T (TCR), receptor de linfotoxina b (LTbR), el factor activador de clulas B (BAFFR) y el cluster de diferenciacin 40 (CD40) (Gloire et al., 2006). 30 Introduccin Existen dos vas principales de activacin de NFB (figura 13): Lavaclsicaocannica,enlaqueparticipaelheterodmerop50/p65,quepermanece secuestrado en el citosol por el inhibidor IB. El complejo IKK/ fosforila al inhibidor de NFB, IB, liberando as al heterodmero p50/p65, que se transloca al ncleo. En esta ruta tambin interviene NEMO, elcualesrequeridoparalainteraccindelcomplejoIKK/conprotenasanterioresenlacascadade transduccin de la seal. La va no cannica es independiente de IKK y en ella participa el dmero p52/RelB y la quinasa inductoradeNF-B(NIK).NIKfosforilaalhomodmeroIKKdesencadenandosuactivacinyla fosforilacindep100porIKK,loqueconducealaproteolizacindeestasubunidadap52yla translocacin al ncleo del dmero p52/RelB (Perkins et al., 2006; Mohamed et al., 2009). 31 IKKNEMOIKKNEMOp50p65pp105p65IBp100RelBNIKp52RelBpp IBp ppVa cannicaVa no cannicapFigura13.VasprincipalesdeactivacindeNFB.Enlavaclsicaocannica,IKKactivaalinhibidordeNFB, IB,liberando as al heterodmero p50/RelA, que se translocaal ncleo, regulando la transduccin de distintos genes. LavanocannicaesindependientedeIKK,activndosep100porIKK,loqueconducealaproteolizacindeesta subunidad a p52, y la translocacin al ncleo del dmero p52/RelB. Introduccin 32 3.-CANNABINOIDES Y SISTEMA ENDOCANNABINOIDE 3.1.- Resea histrica Lamarihuanayelhachs,componentesdedistintaspartesdelaplantaCannabissativa, constituyenunadelasdrogasmsantiguasusadasporelhombreyunadelasmsempleadasenlos pases occidentales. La popularidad de la marihuana como droga de recreo se debe a su capacidad para alterar la percepcin sensorial provocando euforia y jbilo. Adems de este uso ldico, los constituyentes delaplantatambinhansidousadosdurantedcadascomodrogasmedicinales,debidoasus propiedadessobreprocesosneuroconductalestalescomolamemoria,elhumoryelapetito(Pacheret al., 2006; Greineisen et al., 2010). Sin embargo en 1937, debido a los peligros derivados del uso de esta droga, se prohibi en los Estados Unidos. El aislamiento en 1964 del mayor componente psicotrpico de laplantaeldelta-9-tetrahidrocannabinol(THC),estimulduranteladcadadelossetentalageneracin de un amplio rango de anlogos sintticos con propiedades similares a las del componente de la planta.MsdedosdcadasdespusdeldescubrimientodelTHCseidentificelprimerreceptorde cannabinoidesenelorganismollamadoCB1 (Devaneetal.,1988)Porsuhomologaseidentificun segundoreceptordecannabinoidesllamadoCB2 (Munroetal.,1993).Eldescubrimientodereceptores especficosdecannabinoidesimplicabaquedebandeexistirligandosendgenoscapacesdeunirsea estos receptores. El primer cannabinoide endgeno descubierto fue la anandamida y su hallazgo permiti observar que otro metabolito previamente conocido era capaz de unirse con gran afinidad a CB1 y CB2, el2araquidonilglicerol(2AG).Losendocannabinoidespuedenreproducirlamayoradelosefectos descritos para fitocannabinoides, mostrando una actividad cannabinoimimtica (Di Marzo, 2009). TantoeldescubrimientodelaestructuradelTHC,comoelhallazgodeloscomponentes endgenos capaces de unirse o actuar como los cannabinoides de la planta, despert de nuevo el inters sobre el uso teraputico de loscannabinoides, existiendo en la actualidad en uso mdico dos agonistas delosreceptorescannabinoides(eldronabinolylanabilona),unextractodecannabis(elSativex) (Gerra et al., 2010). Introduccin 3.2.- Tipos de cannabinoides Loscannabinoidessepuedendividirporsuorigenentresclases:losprovenientesdelaplantaofitocannabinoides,losendgenosoendocannabinoidesyloscannabinoidessintticos,sustancias sintetizadasenellaboratoriocapacesdeunirsealosreceptoresdecannabinoides.Estosltimosse dividenasuvezendosclasesenbaseasuestructura:cannabinoidesclsicos,queposeenuna estructura parecida a la de los fitocannabinoides y cannabinoides no clsicos, con una estructura qumica que difiere altamente de la del THC (tabla 3). Naturales Endgenos SintticosClsicosNo cl si cosTHCAEAHU-210Cannabivariol2-AGNabilonaVirodamina(-)-Cannabidiol(CBD)WIN 55,212-2NADA CP55940cido ajulmicoFigura 14. Distintos tipos de cannabinoides 33 Introduccin 34 3.2.1Compuestos bioactivos de Cannabis sativa Delosaproximadamente500compuestospresentesenlaplantaCannabissativa,slounos70 son considerados cannabinoides. Poseen una estructura tricclica con hidrocarburos oxigenados de 21C formadosgeneralmenteportresanillos,ciclohexeno,tetrahidropiranoybenceno.Detodosellos,el principalcomponenteactivoeselTHC.Presentapropiedadeshidrofbicasalposeerunaestructura comntricclicaconunanillofenlico,unanillodepiranocentralyunanillociclohexilomonoinsaturado (Nahas, 2002), lo que le proporciona una particular farmacocintica en el organismo. Otros cannabinoides presentesenlaplanta,enmenormedidaqueelTHC,sonelcannabigerol(CBG),elcannabicromeno (CBC),elcannabidiol(CBD)yelcannabinol(CBN).Laconcentracindecannabinoidesvarasegnla variedaddelcannabisyporlogeneralseencuentranenunaplantasolamentetresocuatro cannabinoidesenconcentracionessuperioresal0.1%.AunqueelTHCeselmayorresponsabledelos efectos farmacolgicos del cannabis, incluyendo sus consecuencias psicoactivas, otros compuestos de la plantatambinposeenefectobiolgico,especialmenteelCBD,unfitocannabinoidenopsicoactivoque tienepropiedadesantiinflamatorias,analgsicasyansiolticas(Nahasetal.,2002;DeBackeretal., 2009). 3.2.2Ligandos endgenos Losendocannabinoidesencontradoshastalafechapertenecenalafamiliadeloseicosanoides quepresentanafinidadporlosreceptoresdecannabinoides.Sonderivadosdecidosgrasos poliinsaturadosdecadenalargaunidosaungrupomspolarmedianteenlaceamida,steroter. Incluyen la anandamida (N-araquidonoil etanolamina, AEA), 2-araquidonoil glicerol (2-AG), 2-araquidonoil glicerileter(noladina,2-AGE),O-araquidonoiletanolamina(virodamina)yN-araquidonoildopamina (NADA) (De Petrocellis, 2004; Singh and Budhiraja, 2006). Existen otros dos metabolitos estructuralmente relacionados con los anteriores, laN-oleoiletanolamina (OEA) y laN-palmitoiletanolamina (PEA), que se distribuyenenbajasconcentracionesporelsistemanerviosocentral,perosuclasificacindentrodelos endocannabinoides est sujeta a debate, ya que no tienen afinidad ni por CB1 ni por CB2 (Burstein et al., 2009; Sagar et al., 2009; De Petrocellis et al., 2010). Introduccin 35 Los endocannabinoides se consideran una nueva clase de reguladores lipdicos. No se almacenan envesculas,comolosneurotransmisoresclsicos,sinoquesesintetizanrpidamenteapartirdeun precursor lipdico, siendo inmediatamente liberados al espacio extracelular o actuando directamente en la mismamembranacelular(Sagaretal.,2009).AEA,OEAyPEAsesintetizanapartirdesu correspondiente precursor, N-araquidonoil fosfatidil etanolamina (NAPE), N-oleoil fosfatidil etanolamina o N-palmitoilfosfatidiletanolaminarespectivamente.Elprecursoreshidrolizadoporunafosfodiestarasa especfica,muysimilaralafosfolipasaD(PLD)denominadaNAPE-PLD,quehasidoclonaday caracterizada(Okamotoetal.,2004).Existentambindosvasalternativasenlasqueparticipanla fosfolipasa C (PLC) y la hidrolasa (H4)-GDE (Sagar et al., 2009). El precursor inmediato de 2-AG es el diacilglicerol (DAG). El DAG se produce por hidrlisis de los fosfoinostidosdemembrana(PI)odelcidofosfatdico(PA)dependiendodeltipocelular.Existendos diacilglicerollipasas(DAGL)especficas,DAGLyDAGL,quecatalizanlahidrlisisdelDAGa2AG, liberandoelAGdelaposicin1.Tambinsehapropuestoquelasntesisde2-AGpuedadarseporla fosfolipasa A1 (PLA1) y fosfolipasa C (PLC) (Sagar et al., 2009). LafinalizacindelasealdeanandamidaserealizamediantetransportedeAEAalinterior celularyposteriorhidrlisisporunaamidohidrolasadecidosgrasos(FAAH)querindecido araquidnico(AA)yetanolamina,mientrasqueel2-AGsehidrolizarafundamentalmenteporuna monoacilglicerollipasa.AEAy2-AGpuedentambinsersustratosdelascicloxigenasastipo-2(cox-2), lipoxigensas (LOX) y citocromo P-450s (CYP450s) (McFarland et al., 2004; Burstein et al., 2009; Sagar et al., 2009). 3.2.3Ligandos sintticos Sehadesarrolladounamplioespectrodecannabinoidessintticoscondiferentesactividadesy afinidades por los receptores, lo que supone una herramienta muy til para el estudio de las posibilidades teraputicasdeloscannabinoides.Dentrodestoscompuestosseencuentrantantoagonistascomo antagonistasdelosdosreceptoresdecannabinoides,oselectivamentedeunodelosdostiposde receptores (Kogan et al., 2006; Petrosino et al., 2009). Los dos cannabinoides empleados en esta Tesis doctoralseenglobandentrodeestetipodesustanciassintticas.Elprimerodeelloseselanlogo modificadodelendocannabinoideanandamida,(R)-(+)-araquidonoil-1-hidroxi-2-propilamidao(R)-(+)- Introduccin metanandamida(MET).Laintroduccindelosgruposmetiloenelcarbonodosdelaanandamida produceunaumentodesuestabilidadmetablicayunamayorafinidadporlosreceptoresde cannabinoides. Posee afinidad por ambos receptores aunque se une con mayor afinidad a CB1 (Abadji et al.,1994;Linetal.,1998;Goutopoulosetal.,2001;Goutopoulosetal.,2002).ElsegundoesJWH015, agonista selectivo del receptor CB2 (Showalter et al., 1996; Griffin et al., 1997; Huffman, 2000; Petrosino et al., 2009). JWH015 Metanandamida36 3.3.- Receptores de cannabinoides Figura 15: Estructura qumica de MET y JWH015 LafuertehidrofobicidaddelTHChizopensarinicialmentequelosefectosdeloscannabinoides podranestarcausadosporperturbacionesenlamembranaoporinteraccionesconsitiosdeunin inespecficos.Sinembargo,eldescubrimientodelosreceptoresCB1yCB2demostrqueestonoera as, aunque no se descarta un mecanismo adicional por insercin en la membrana plasmtica. Adems, cada vez son ms abundantes los datos que sugieren la existencia de otros receptores de cannabinoides entre los receptores hurfanos GPCRs (Petrosino et al., 2009). Todosestosreceptores,juntosconlosendocannabinoidesylasenzimasencargadasdesu sntesis y metabolismo constituyen el llamado sistema endocannabinoide (figura 16) (Pacher et al., 2006; Pertwee, 2009; Pisanti et al., 2009a). Introduccin CB2GPR55CB1TRPV137 3.3.1CB1 y CB2 Lasprincipalesdianasmolecularesdelosendocannabinoidessonlosreceptoresde cannabinoidestipo1(CB1)ytipo2(CB2).Ambosestnformadosporunnicopolipptidoconsiete pasostransmembrana-hlice,unextremoN-terminalglicosiladoyunextremoC-terminalintracelular. Son receptores acoplados a protenasG,fundamentalmenteaGi/o. CB1 est principalmente expresado enclulasneuronalesdelsistemanerviosocentral,dondemedialaliberacinyrecaptacindevarios neurotransmisores.CB2presentaunaexpresinmsperifrica,localizndoseespecialmenteenclulas delsistemainmune,afectandoalaliberacindemensajerosqumicos,comolascitoquinas,pudiendo tambinregulareltrficointracelular.Apesardeestasdoslocalizacionespreferenciales,ambos receptoresseencuentrantambinexpresadosendistintostejidosperifricos(Koganetal.,2006; Pertwee, 2009; Greineisen et al., 2010). 3.3.2GPR-55 Recientementesehasugeridolaexistenciadeunposibletercerreceptordecannabinoides,el receptorhurfanoGPR-55,quereconocevarioscannabinoidesyfitocannabinoides,aunquela farmacologadeestereceptornopermiteincluirlodentrodelosreceptoresdecannabinoides.GPR-55 pareceserunreceptordelisofosfatilinositolquepuederespondertambinaanandamida.Estereceptor Figura 16: Sistema endocannabinoide GDPGTPGi/oGDPGTPGi/o GDPGTPGi/oMGLCa2+FAAHAA AAAEAEtanol ami da+ +2-AGGl i cerol Introduccin 38 activaaG12 yG13. Porhibridacininsitusutrnscritohasidodetectadoenelncleocaudadoy putamen,peronoenelhipocampo,tlamo,cerebelo,puentenicortexfrontal(Brownetal.,2009; Godlewski et al., 2009; Ross, 2009). Tambin existe otro receptor hurfano identificado mediante aproximaciones informticas, el GPR-119, que une OEA. Su mRNA ha sido localizado en tejido pancretico e intestinal (Godlewski et al., 2009; De Petrocellis et al., 2010). 3.3.3TRPV1 Algunos de los endocannabinoides pueden unirse, adems, al receptor de vanilloides TRPV1 que constituye un canal catinico no selectivo de cationes divalentes. Por ello se ha considerado a CB1 y CB2 comoreceptoresmetabotrpicosdecannabinoides,mientrasqueTRPV1seraelreceptorionotrpico. Estereceptorpertenecealafamiliadeloscanalesactivadosporpotencialestransitorios(TRP),quese dividenenlassiguientessubfamilias:TRPC(cannica),TRPA(tipoankirina),TRPM(tipomelastatina), TRPP (tipo policistina), TRPML (tipo mucolipina) y TRPV (tipo vanilloide). LoscanalesTRPposeenseis dominios transmembrana con una puerta de entrada para varios tipos de cationes, incluyendo Ca2+. Son estimuladosporagentesfsicos,comolatemperatura,laluzypresinmecnica,oqumicos,como cidos,lcalisyxenobiticos.Estnformadosensuformaactivaportetrmeros,dependiendosu actividaddefosforilacionesejercidasporquinasasqueregulansufuncin,comoPKC,PKAycalcio-calmodulina quinasa (Sagar et al., 2009; De Petrocellis et al., 2010). ExistenseistiposdereceptoresTRPV,numeradosdel1al6.TodoselloscanalesdeCa2+o cationes, aunque nicamente TRPV1 puede ser activado por AEA. Entre los ligandos exgenos capaces de activar TRPV1 destaca la capsaicina, el componente picante de los pimientos, que al unirse a TRPV1 loactiva,produciendolasensacindecalorcaracterstica(DePetrocellisetal.,2010).Existenvarios antagonistas de TRPV1, siendo la capsazepina (CPZ) uno de los ms utilizados. Introduccin 39 3.4.- Mecanismos de transduccin a travs de CB1 y CB2 Como ya se ha comentado los receptores de cannabinoides son miembros de la superfamilia de los GPCRs.Inicialmentesedescribiqueejercansusefectosbiolgicosacopladosprincipalmentea protenas Gi/o, pudiendo tambin activar Gs y Gq/11. Este acoplamiento genera un intercambio guanosina trisfosfato(GTP)/guanosinadifosfato(GDP)ysubsecuentementelaliberacindelassubunidades y ,quepuedenregularlaactividaddemltiplesefectoresentrelosquedestacalaadenililciclasa.El receptor CB1 tambin puede inhibir varios canales inicos, entre ellos de calcio, potasio y sodio, a travs de la subunidad . Los distintos miembros de la familia MAPK tambin pueden ser activados por los dos receptoresdecannabinoidespormediodetresposiblesmecanismos:transactivacindereceptores tirosina quinasa (RTKs), activacin de la ruta de la PI3K/Akt y activacin de la quinasa de adhesin focal (FAK), regulando as el crecimiento celular (Cabral et al., 2009; Turu et al., 2010). AdemstambinpuedenregularlosnivelesdecalciointracelularmediantelaactivacindePLC, metabolismodelcidoaraquidnico,sntesisdeceramidayproduccindexidontrico.Asimismo pueden regular la transcripcin por medio de distintos factores de transcripcin, entre ellos c-Fos, Kros-24 y NFB (Diaz-Laviada et al., 2005; Pacher et al., 2006; Dalton et al., 2009). Los dos receptores de cannabinoides poseen una sealizacin extremadamente compleja. Ambos estnacopladosaprotenasGsensiblesatoxinapertusis,peronoparticipanenidnticassealesde transduccin. Por ejemplo, mientras que el receptor CB1 puede activar distintos tipos de canales inicos, el receptor CB2 es incapaz de activarlos, o lo hace dbilmente. Esta divergencia en la sealizacin puede estar debida a que cada receptor puede acoplarse a un subtipo distinto de protenas G. Otros niveles de complejidadenlasealizacinderivandelaposibleinteraccinconlipidraftscapacesdecontrolarel trficoylasealizacindelosreceptores,delaexistenciadeunagranvariedaddemecanismosde desensibilizacinquelimitanladuracinyamplituddelasealy,porltimo,delacapacidaddelos GPCRs de organizarse dentro de una nueva unidad de sealizacin (McAllister et al., 2002; Bosier et al., 2010). AunqueejercensusefectosprincipalmenteatravsdeprotenasG,enciertasocasionespueden actuardeformaindependienteaestasprotenas.As,loscannabinoidespuedeninducirhidrlisisde esfingomielina a travs de la interaccin con la protena adaptadora FAN, sin mediacin de protenas G. Introduccin 40 La sealizacin a travs de arrestinas tambin podra estar ser regulada por los cannabinoides de forma independiente de protenas G (Diaz-Laviada et al., 2005). 3.5.-Cannabinoides y cncer Elhechodequeelsistemaendocannabinoideestaltamenteconservadoentreespeciesas como la ubicua expresin de los endocannabnoides y su papel como moduladores de protenas y factores nuclearesqueregulanlasupervivencia,proliferacinyladiferenciacincelular,sugierequelos endocannabinoidespuedenestarinvolucradosenelcontroldeprocesosfundamentalestalescomola homeostasis celular y posiblemente tambin en transformacin neoplsica (Pisanti et al., 2009a). Losefectospaliativosdeloscannabinoidesenenfermedadesdecncerestnbien caracterizados;entreellosdestacanlainhibicindenuseasyemesis,estimulacindelapetitoyalivio deldolor.Tresdelosmedicamentosderivadosdelcannabis,Marinol,CesamentySativex,estn indicadoseneltratamientodeestasalteraciones.Suaplicacincomoagentesanticancergenosse encuentraanenfasedeinvestigacinpreclnica,peronumerososestudiossugierenquelos cannabinoidestambinpuedeninhibirelcrecimientotumoral.Losmecanismosporlosquelos cannabinoidesejercenesteefectoantitumoralsonvariadoseincluyenlainduccindeapoptosisen clulas tumorales, efectos antiproliferativos y antimetastsicos a travs de la inhibicin de angiognesis y migracin celular, y efectos citotxicos y citoestticos (Pacher et al., 2006; Vidinsky et al., 2006; Pisanti et al., 2009a; Pisanti et al., 2009b). Laplasticidaddelsistemaendocannabinoidebajodeterminadasalteracionespuedeseruna reaccinadaptativaconelfinderestaurarlahomeostasisperturbadaporestasalteraciones.Eneste sentido, se han detectado niveles elevados de cannabinoides en varios tipos de tumores comparando con tejidos sanos como por ejemplo en glioblastoma, menangioma, adenoma pituitario, adenoma de prstata, adenomadecolonysarcomaendometrial.Tambinsehadescritoenalgunoscasosunincrementoen losnivelesdelasenzimasencargadasdelmetabolismodelosendocannabinoides,existiendouna correlacin entre los niveles de estas enzimas y la progresin del cncer como ocurre en adenocarcinoma prosttico y adenocarcinoma pancretico. En lo que respecta a los receptores de cannabinoides existen varias evidencias que sugieren que alteraciones en su nivel de expresin juegan un papel importante en tumores hematolgicos y en varios tumores slidos. Esto ocurre entre otros en el cncer de prstata y en Introduccin 41 tumoreshepticos,dondelosdosreceptoresdecannabinoidessesobre-expresanrespectodeltejido normal. En los tumores hematolgicos existen datos contradictorios, encontrando clulas de leucemia que expresanCB2peronoCB1,yenalgunoscasosexpresindeCB1 enlinfomas,peronoenclulasB normales(McKallipetal.,2002;Sarfarazetal.,2005;Gustafssonetal.,2006;Xuetal.,2006).La expresin diferencial de estos receptores entre el tejido normal y el tumoral puede ser de especial inters para entender mejor el papel del sistema endocannabinoide en la generacin y el mantenimiento de las neoplasias, pudiendo tambin resultar ventajosa en la terapia farmacolgica