Canales iónicos

Luciano Moffatt

INQUIMAE

Tópicos de Fisicoquímica en Sistemas Biológicos

16 de noviembre 2004

• Qué son los canales iónicos?

• Cuáles son sus roles fisiológicos?

• Cómo se los estudia?

Que son?

• Proteínas de membrana que tienen permeabilidad selectiva por ciertos iones.

• Son multiméricas con varios dominios trans-membrana

• Comprenden de:– Poro– Compuerta (gate)– Filtro (selectivity filter)– Sensor (voltage, neurotransmisor, etc)– Mecanismo de transduccion

Que no son?

• Transportadores (2 gates)

• Receptores metabotropicos (no ionotropicos)

Bomba sodio

Ionotropico vs metabotropico

Que hacen?

• Son responsables de la permeabilidad selectiva de la membrana

• Permiten cambios rápidos en la concentración de iones (calcio) y del potencial de membrana (transmisión de la información a distancia).

Que no hacen?

• Mantener la concentracion diferencial ambos lados de la membrana, esto lo hacen las bombas

Como se los estudia

• Se mide la corriente que pasa a través de ellos. Como solo se puede medir la corriente total, se deben eliminar otros canales.

Dos estrategias• Se buscan células que expresen el canal de

interés, los otros canales se bloquean farmacológicamente

• Se usan células que expresen naturalmente pocos canales, se sobre-expresa el canal de interés. (Util para mutagénesis).

Como se los estudia

• Se miden diferentes parametros:– Conductancia– Permeabilidad relativa a distintos iones– Probabilidad de apertura en distintas condiciones

• Se analiza la modulación por distintos factores (potencial de membrana, concentracion de agonistas, ph, concentracion de iones, temperatura, etc)

• Se analizan transitorios y situaciones de steady state

Sistemas de expresion

• Se tiene el gen o genes clonados y se los expresa en algun sistema, tipicamente:– Oocytos de Xenopus: se inyecta RNA.– Celulas HEK-293: se transfecta con el

plasmido con un promotor fuerte. Se usa lipofectamina.

Oocytos de Xenopus

• Lupa, no microscopio• Expresion a 20C• Corrientes grandes:

µA• Aplicación lenta del

agonista (10ms-1s)• Voltage clamp lento

Celulas HEK 293

• Mas parecido al mamifero: expresion a 37C

• Microscopio• Patch clamp: voltage

clamp rapido• Uso de EGFP para

detectar la eficiencia de la transfeccion

• Aplicación del agonista hasta 100µs

Sistemas nativos

• Cultivos primarios: modificaciones post-traduccionales, distribucion celular

• Fetas de tejidos (slices): conexiones sinápticas

• In vivo: patrones de actividad sinaptica

Voltage clamp

voltage clamp vs current clamp

• Voltage clamp: como las propiedades del canal dependen del potencial de membrana, conviene mantenerlo constante.

• Current clamp: estudiar los canales en un contexto natural

Modelo RC de la membrana

• Capacidad de las membranas: 0.01pF/µm2

• Densidad de canales: 1-1000/µm2

• 1 canal-0.5ms

• En voltage clamp a Vm=cte la capacidad de la membrana no influye

• Se corrige la capacidad para saltos de Vm

Patch clamp• Gigaseal• Canal

unico

Whole cell vs patch

• Whole cell: mas fisiologico.

• Isolated Patch: mas versatil (1 µm2)

Canal unico

Equipamiento

Amplificador de patch

Ejemplo de estudio de canal unico

Estrategia de analisis cinetico

• Obtener datos de canal unico y/o de macrocorrientes en distintas condiciones de Vm, concentracion de agonista, etc

• Proponer un modelo cinetico markoviano• Optimizar los parametros del modelo que

minimicen la suma de los cuadrados de los residuos.

• Si la prediccion no resulta buena cambiar el modelo cinetico.

Modelos cineticos

• Ver apunte de Sigworth

Ejemplo de modelo cinetico

Ejemplo de estudio de macrocorrientes

100%

100 ms

100%

100% 1 ms

100%

100%

1 ms

100%

100%

100 ms

100%

AB

C D

C13kon

C2 C3 C4 O52kon kon

2koffkoff 3koff

C1/2/3 C4 O5

3koff

C13kon

C2 C3 C42kon kon

A Scheme I

B sub-Scheme Ia

C sub-Scheme Ib

C13kon

C2 C3 C4 O62kon kon

2koffkoff 3koff

D Scheme II

F5k+

3k-

Alosterismo

C1

O9

F6 F7 F8

O14 O15 O16

EB-1 EB-1 EB-1 EB-1

EEE

K 1/3K

1/3KK3K

2KA 1/2KA

1/2KA2KAEB-3

C2 C3 C4

O10 O11 O12

E

3KA

3KA

F5

O13EB-3

3K

FA-3 FA-2 FA-1 F

FA B-3 FA B-2 FA B-1 FB

Scheme III

C1

O11

F5 F6 F7

O15 O16 O17

F8 F9

O18 O19

F10

O20

EB-3 EB-3 EB-3 EB-3

EB-2EB-2EB-2

EB-1EB-1

E

KFB

3K 1/3K

1/3KK3K

2K 1/2K

1/2K2K

K

K

2FB 3FB

3F2FF

C2 C3 C4

O12 O13 O14

1/2F F

1/2FB FB

1/3FB

1/3F

SCHEME IVB

Performance de modelos

Applied ATP (µM s)

0.01 0.1 1

Nor

mal

ized

Am

plitu

de

0.001

0.01

0.1

1

Applied ATP (µM s)

0.01 0.1 1

rise

(m

s)

0.1

1

Applied ATP (µM s)

0.01 0.1 1

dela

y (m

s)

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

Applied ATP (µM s)

0.01 0.1 1

deca

y(m

s)

10

100

I

II

IV

III

II, 4 steps

III

IIIIV

II, 2 steps

I

II

III

IV

III

IVIII

Resumen

• Mediante los modelos cineticos se puede describir y predecir cuantitativamente el comportamiento de un canal en condiciones arbitrarias de los factores que definen su comportamiento (Vm, concentracion, etc)

• El paso siguiente hacia arriba es construir una celula virtual donde se puede predecir la interaccion entre distintos canales

• Para abajo se puede tratar de determinar la base estructural de las diferentes constantes cineticas obtenidas.