1

Instituto Politécnico Nacional

Escuela Nacional de Ciencias Biológicas

Sección de estudios de posgrado e investigación

Canales de potasio activados por sodio en las neuronas aferentes vestibulares de rata

Tesis

QUE PARA OBTENER EL GRADO DE:

Maestra en Ciencias Quimicobiológicas

PRESENTA:

Q.F.B. Blanca Aurora Cervantes Sánchez

Directores de Tesis:

Dr. Enrique Soto Eguibar

Dr. Sergio Roberto Zamudio Hernández

México, D.F. Agosto 2008

2

Agradezco al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyt) por el apoyo que me

brindó para realizar estudios de Maestría en la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas

del Instituto Politécnico Nacional mediante la beca no. 202188.

3

Índice de figuras

Figura 1.1. Localización de las divisiones vestibular y coclear

del oído interno 1

Figura 1.2. Células ciliadas tipo I y II 2

Figura 1.3. A. Microscopía electrónica de barrido del sáculo de la rana toro

B. Esquema de la deflexión de los cilios y consecuente activación

de las uniones de punta ("tip links") de los

canales mecanotransductores 3

Figura 1.4. Dibujo esquemático de una neurona aferente

vestibular y sus relaciones sinápticas 5

Figura 1.5. Subunidades de Slack y Slick 21

Figura 7.1. Registro de corrientes de K+ dependientes de Na+ en

configuración de célula completa 36

Figura 7.2. Registro de corrientes totales en condiciones control

y cuando se aplicó TTX 200 nM 38

Figura 7.3. Registro de corrientes totales en condiciones control y

cuando se aplicó TTX 100 nM 39

Figura 7.4. Corriente saliente y corriente entrante en presencia de

Na+ extracelular, cuando se perfundió TTX 100 nM

y cuando se aplicó la solución de lavado 41

Figura 7.5. Corriente de Na+ y corriente entrante de potasio dependiente

de Na+ en condiciones control en negro y después de

aplicar la toxina de anémona CgNa 10 µM 42

Figura 7.6. Registro de corrientes totales en condiciones control

y cuando se perfundió ouabaína 1 mM para

dos células con capacitancia de 23.65 pF y 11.67 pF 44

Figura 7.7. A. Relación densidad de corriente entrante contra voltaje

B. Curva de conductancia normalizada contra el

voltaje para la corriente saliente en condiciones control

4

y cuando se perfundió oubaína 1mM 45

Figura 7.8. Corriente saliente y corriente entrante en condiciones

control y cuando se perfundió 1 mM de ouabaína

para bloquear la ATPasa Na+/K+ 46

Figura 7.9. Registro de corrientes totales en condiciones control

y cuando se reemplazó Na+ por Li+ 47

Figura 7.10. Registro de corrientes de K+ dependientes de Na+

en configuración de célula completa, en presencia

de Na+ extracelular, cuando el Na+ fue sustituido por Li+

y cuando se reincorporó el Na+ a la solución extracelular 48

Figura 7.11. Potencial de acción generado con una inyección

de corriente de 1.6 nA 49

Figura 7.12. Registro en fijación de corriente de la respuesta de la

membrana ante pulsos de corriente de corriente de

-0.5 a 0.1 nA 50

5

Índice de tablas

Tabla I. Propiedades de los canales de KNa en células

excitables de diferentes vertebrados 13

Tabla II. Distribución de canales Slack y Slick en el cerebro de rata 23

Tabla III. Soluciones utilizadas en el registro electrofisiológico 30

Tabla IV. La TTX modificó la activación de la corriente

de K+ dependiente de Na+ 37

Tabla V. La eliminación de Ca2+ no modificó la activación de los

canales KNa 40

Tabla VI. La toxina CgNa no modificó significativamente a los canales KNa 42

Tabla VII. El bloqueo de la bomba Na+/K+ con ouabaína aumentó

la amplitud de la corriente KNa 43

Tabla VIII. Parámetros del potencial de acción en las neuronas aferentes 49 Tabla IX. Efecto del Li+ sobre la resistencia de membrana de

las neuronas aferentes vestibulares 51

6

Abreviaturas

Ach acetilcolina

ADP del inglés, despolarizing afterpotential

AHP del inglés, afterhiperpolarization

ASIC del inglés, Acid Sensing Ionic Channels

ATP trifosfato de adenosina, siglas en inglés

ATPasa enzima que hidroliza el ATP

BK canales de alta conductancia

CgNa condylactis gigantea

CO2 dióxido de carbono

dv derivada del voltaje

d-TC d-tubocurarina

E embrionario

EC50 activación media máxima

Ek potencial de equilibrio

Extra. extracelular

FS del inglés, fast-spiking

gmax conductancia máxima

HVA corriente de Ca2+ dependiente de voltaje de alto umbral

IB del inglés, intrinsically bursting

Ih corriente activada por hiperpolarización

IK canales de conductancia intermedia

IKA corriente de potasio transitoria de salida

IK(Ca) corriente de potasio dependiente de Ca2+

IK1 corriente de potasio rectificadora de entrada

IK,RD corriente de potasio rectificador retardado IM inhibición metabólica

Intra. intracelular

IR canales resistentes a bloqueadores

Iss corriente en el estado estable

7

[ K ]ext concentración de potasio extracelular

[ K ]int concentración de potasio intracelular

K+O potasio extraceluar K+i potasio intracelular

KNa canales activados por sodio

LVA corriente de Ca2+ dependiente de voltaje de bajo umbral

mOsm miliosmoles

[Na]i concentración de Na+ intracelular

ND no fue determinado

NMCT neuronas del núcleo medio del cuerpo trapezoide

P postnatal

RCK del inglés, regulator of K+ conductance

Rm resistencia de membrana

RS del inglés, regular- spiking

s pendiente

SK canales de baja conductancia

Slack del inglés, sequence like a Ca2+-activated K+ channel

Slick del inglés, sequence like an intermediate conductance K+

channel

TTX tetrodotoxina

UV ultravioleta

V voltaje

VH potencial de sostenimiento

Vm voltaje de membrana

V1/2 potencial al cual ocurre el 50% de la conductancia

Tau constante de tiempo

8

Resumen Las neuronas aferentes vestibulares transmiten información acerca de las aceleraciones angulares y lineales durante los movimientos de la cabeza. In situ, estas neuronas muestran patrones de descarga heterogéneos, que podrían ser producidos por sus propiedades intrínsecas, razón por la cual es importante definir el conjunto de conductancias iónicas que se expresan en ellas. Es por eso, que decidimos estudiar si las neuronas aferentes vestibulares expresan una conductancia de potasio activada por sodio que pueda estar influyendo en su patrón de descarga. Los canales de potasio activados por sodio (KNa) se describieron por primera vez en miocitos cardiacos de cobayo; posteriormente fueron caracterizados en varios tipos neuronales. Se ha reportado que en neuronas piramidales de la capa V de la corteza cerebral, la sustitución extracelular de Na+ por Li+ genera una corriente entrante a través de los canales de Na+ dependientes de voltaje que no altera los potenciales de acción y sin embargo, inhibe la posthiperpolarización que sigue a eventos cortos tales como ráfagas individuales de potenciales de acción. El objetivo de este trabajo fue conocer si la corriente de potasio activada por sodio se expresa en las neuronas aferentes vestibulares y determinar su papel funcional. Para estudiar la expresión funcional de la corriente KNa se utilizaron técnicas de fijación de voltaje y de corriente, en cultivo primario de neuronas aferentes vestibulares de rata neonata (P7 a P10). Se usaron varias estrategias experimentales para evidenciar la presencia y el papel fisiológico de la corriente de KNa. Se usó tetrodotoxina (TTX) a una concentración de 200 nM, para determinar la corriente de Na+ entrante medida al pico. Se encontró que ésta se bloqueó. La corriente saliente después de la aplicación de TTX fue substraída de la corriente control mostrando una corriente transitoria la cual duró cerca de 20 ms y la corriente al pico fue de 2.3 ± 0.7 nA (n = 4). La aplicación de la toxina de anemona CgNa la cual se ha demostrado que hace más lenta la inactivación de los canales de Na+, incrementó la constante de tiempo de inactivación 128.8 ±19.7 % y concomitantemente la corriente saliente medida en la cola se incrementó 5.6 ± 2.4% (n = 4). Cuando se reemplazó extracelularmente el Na+ por la colina, la corriente entrante de Na+ disminuyó completamente y la corriente saliente al pico se redujo 40.1 ± 1% (n = 5). Cuando se bloqueó la bomba Na+-K+ con ouabaína (1 mM) se encontró que la amplitud de la corriente saliente medida al pico se incrementó significativamente 31 ± 12%, y que la corriente entrante de Na+ disminuyó significativamente 30 ± 5.4% (n = 9). Cuando se reemplazó extracelularmente el ión Na+ por Li+, la integral de la corriente saliente medida al pico disminuyó significativamente 33 ± 8.5%. Mientras que la integral de la corriente entrante fue medida donde los valores de corriente entrante con Na+ y con Li+ no fueran diferentes significativamente (n = 10). En registros de fijación de corriente la sustitución extracelular de Na+ por Li+ disminuyó, de forma reversible, la posthiperpolarización del potencial de acción en un 6 ± 0.8% (n = 4). Estos resultados sugieren que la corriente de KNa se expresa en las neuronas aferentes vestibulares participando en la fase de posthiperpolarización del potencial de acción.

9

Abstract Vestibular afferent neurons transmit information about the angular and linear accelerations during movements of the head. In situ, these neurons show heterogeneous discharge patterns, which may be due to their intrinsic properties, so it is important to define the ionic conductances that are expressed by them. Therefore, we decided to study whether the vestibular afferent neurons express a sodium activated potassium conductance that may be influencing their discharge pattern. Sodium activated potassium channels (KNa) were described for the first time in cardiomyocytes of guinea pig; subsequently they were characterized in different neuronal cells. In pyramidal neurons in the V layer of the cerebral cortex, has been reported that, replacement of extracellular Li+ by Na+ generates an inward current across Na+ voltage-dependent channels that does not alter the action potential but inhibits posthyperpolarization following events such as short bursts of action potentials. The aim of this study was to determine whether sodium activated potassium current is expressed in vestibular afferent neurons and determine their functional role. To study the expression of KNa channels, we used voltage clamp and current clamp techniques. We utilized vestibular afferent neurons from Wistar rats (postnatal days (P) 7 to 10). Several experimental strategies were used to reveal the presence and functional role of KNa current. By using tetrodotoxin (TTX) 200 nM, the peak inward Na+ current was completely blocked. Outward current after TTX application was subtracted from control current showing a transient current with duration of 20 ms and peak amplitude of 2.3 ± 0.7 nA (n = 4). The application of the anemone toxin CgNa, which has been shown to slow the Na+ channel inactivation, increased the Na+ current inactivation time constant 128.8 ±19.7 % without significantly affecting the peak inward current, and concomitantly the outward current measured in the tail increased 5.6 ± 2.4% (n = 4). We found that by replacing Na+ by choline in the extracellular solution there was a complete reduction of the inward Na+ current and the peak outward current decreased 40.1 ± 1 % (n = 5). Subtraction of the current after choline application and control current shown that choline affected both a sustained and transient components, thus indicating a complex action of choline on the outward currents. Oubain (1 mM) decreased the peak inward Na+ current by 30.4 ± 5.4% and the peak outward increased 30.6 ± 11.8% (n = 9). We found that by replacing Na+ by Li+ in the extracellular solution the outward current decreased 32.9 ± 8.5 % (n = 10 ) and the inward Na+ current did not significantly change. In current clamp, the replacement of Na+ by Li+ decreased 6 ± 0.8% (n = 4) the after-posthiperpolarization amplitude in a reversible form. These results suggest that KNa is expressed in the vestibular afferent neurons and, it may contribute to the afterposthiperpolarization process of the action potential.

10

Índice Índice de figuras i

Índice de tablas ii

Lista de abreviaturas iii

Resumen iv

Abstract v

I. INTRODUCCIÓN 1

I. 1. Estructura del sistema vestibular 1

I. 2. Mecanotransducción 3

I. 3. Potencial receptor de la célula ciliada 4

I. 4. Neurotransmisión aferente 4

I. 5. Neurotransmisión eferente 6

I. 6. Conductancias iónicas de las aferentes vestibulares 6

I. 9. Canales de potasio activados por sodio intracelular 9

I. 10. Propiedades de los canales de potasio activados 9

por sodio en miocitos cardiacos de mamífero

I. 11. Propiedades de los canales KNa en neuronas 10

I. 12. Evidencia de una corriente macroscópica de K+ 13

dependiente del influjo de Na+ en neuronas

I. 13. Propiedades de los canales Slack y Slick 18

I. 14. Localización de los canales Slack y Slick en el cerebro 21

I. 15. Farmacología de los canales de potasio activados por sodio 24

I. 16. Papel de los canales KNa en condiciones patológicas 26

II. JUSTIFICACIÓN 27

III. HIPÓTESIS 27

IV. OBJETIVO GENERAL 27

V. OBJETIVOS PARTICULARES 28

VI. MATERIAL Y MÉTODOS

VI. 1. Preparación de cultivo 28

VI. 2. Registro de fijación de voltaje en neuronas aferentes

vestibulares 29

11

VI. 3. Reactivos 30

VI. 4. Se emplearon las siguientes estrategias para evidenciar

la corriente de KNa 31

VI. 5. Análisis de datos 32 VI. 6 Análisis estadístico 34

VII. RESULTADOS 35

VII. 1. La sustitución extracelular de Na+ por colina

reveló una corriente de K+ sensible a Na+ 35

VII. 2. La inhibición de la corriente de Na+ por TTX

modifica la activación de la corriente de K+ dependiente de Na+ 37

VII. 3. La concentración de calcio extracelular no modificó

significativamente a la corriente de potasio dependiente de sodio 38

VII. 4. La toxina CgNa no modificó significativamente a la corriente

saliente de K+ 41

VII. 5. El bloqueo de la ATPasa Na+-K+ con ouabaína aumentó

la amplitud de la corriente de K+ dependiente de Na+ 43

VII. 6. La corriente de potasio activada por sodio no es activada

por litio 46

VII. 7. Papel funcional de la corriente de potasio activada por sodio 48

VIII. DISCUSIÓN 52

VIII. 1. Concentración de Na+ necesaria para la activación

de los canales de KNa 54

VIII. 2. Comparación de los canales de KNa con los genes

clonados que codifican para las corrientes de KNa 55

VIII. 3. Papel funcional de los canales de KNa 56

IX. CONCLUSIONES 57

X. PERSPECTIVAS 57

XI. BIBLIOGRAFÍA 58

12

I. INTRODUCCIÓN I. 1. Estructura del Sistema vestibular El sistema vestibular detecta las aceleraciones lineales y angulares de la cabeza,

desempeñando un papel importante en el control del equilibrio. La información

detectada por el sistema vestibular es enviada a núcleos vestibulares del tronco

encefálico integrándose con información visual y propioceptiva, para así poder

determinar una orientación espacial en tres dimensiones.

El vestíbulo está formado por el utrículo, el sáculo y los tres canales

semicirculares (Fig. 1.1.). El utrículo y el sáculo detectan las aceleraciones

lineales, incluidas las producidas por gravedad, y los canales semicirculares

sensan las aceleraciones angulares debidas a la rotación de la cabeza.

Cada uno de estos órganos que conforman el sistema vestibular está

revestido de una lámina continua de células epiteliales. En este epitelio hay

células de soporte, terminaciones nerviosas aferentes, eferentes y las células

sensoriales conocidas como células ciliadas que tienen estereocilios y un cinocilio

Figura 1.1. Localización de las divisiones vestibular y coclear del oído interno (Modificado de

Goldberg y Hudspeth, 2001).

13

en la parte apical. Este último le confiere a la célula una polaridad morfológica.

Las células ciliadas son células epiteliales especializadas. Funcionalmente

son mecanorreceptores secundarios o no neuronales, pues no generan

potenciales de acción y se relacionan con las neuronas aferentes por medio de

sinapsis. Desde el punto de vista morfológico se diferencian dos tipos de células

ciliadas en el vestíbulo de los mamíferos (Fig. 1.2.). Las células ciliadas tipo I y las

tipo II. Las diferencias más importantes entre estas células consisten en su forma

y en la sinapsis aferente. Las células ciliadas tipo I tienen forma redondeada, con

un adelgazamiento en su parte superior. Las fibras aferentes hacen sinapsis con

ellas formando un cáliz que rodea completamente la porción basal de la célula.

Las fibras eferentes hacen contacto con la fibra aferente, no con la célula ciliada.

En cambio, las células tipo II tienen forma cilíndrica y tanto la fibra aferente como

la eferente establecen contacto directamente con la célula ciliada.

En la superficie apical existen uniones estrechas entre las células ciliadas y

células de soporte que separan endolinfa (un líquido rico en K+ y pobre en Na+ que

baña la parte apical del epitelio) y la perilinfa (un líquido extracelular rico en Na+ y

Ca2+ y que es pobre en K+ que baña la superficie basolateral del epitelio)

(Goldberg y Hudspeth, 2001).

Las células sensoriales del utrículo y del sáculo están localizadas en una

placa elipsoide denominada mácula. Los cilios de estas células están embebidos

Figura 1.2. Células ciliadas tipo I y II. Las neuronas aferentes forman terminaciones en cáliz sobre las células ciliadas tipo I y terminaciones en botón terminaciones sobre las células ciliadas tipo II. Chen y Eatock, 2000).

14

en una matriz gelatinosa que contiene cristales de carbonato de calcio

denominados otoconias. De esta forma se acopla el desplazamiento del otolito a la

flexión de los cilios. Cuando la cabeza se acelera linealmente el otolito se

desplaza sobre la mácula del utrículo y sáculo provocando la inclinación de los

cilios, y una respuesta eléctrica en las células ciliadas (Goldberg y Hudspeth,

2001).

Los canales semicirculares están orientados en tres planos perpendiculares.

Cerca del utrículo existe un ensanchamiento en los canales denominado ámpula.

En el ámpula se encuentra un área donde las células ciliadas están localizadas,

denominada cresta ampular. Las células ciliadas están cubiertas por la cúpula, la

cual es una masa gelatinosa en la cual están embebidos los cilios de las células

sensoriales. La endolinfa se desplaza cuando hay una aceleración angular,

desplazando la cúpula. Debido a la flexibilidad de la cúpula esta se arquea y

mueve los cilios que están insertados en ella, estimulado así a las células ciliadas

(Goldberg y Hudspeth, 2001).

I. 2. Mecanotransducción La célula ciliada transforma los movimientos mecánicos en señales eléctricas

mediante un proceso llamado mecanotransducción (Fig. 1.3.). Pickles y cols., en

1984, encontraron las uniones de punta (tip links) entre los cilios.

membrana actina

eslabón canal

unión de punta

B

Figura 1.3. A, Microscopía electrónica de barrido del sáculo de la rana toro. En el sáculo, los cilios de las células sensoriales se distinguen sobre la mácula. B, esquema de la deflexión de los cilios y consecuente activación de las uniones de punta ("tip links") de los canales mecanotransductores (Holt y Corey, 2000).

15

Las uniones de punta son filamentos finos que unen el ápice de un cilio con la

pared lateral del que le sigue en magnitud. Se ha encontrado que en el extremo de

dichas uniones hay canales mecanosensibles considerados como catiónicos

inespecífico, pero debido a que el K+ se encuentra en mayor concentración en la

endolinfa se ha considerado que la corriente entrante que despolariza la

membrana citoplasmática es acarreada mayormente por K+. Al desplazarse los

cilios, las uniones de punta se tensan provocando un aumento de la probabilidad

de apertura de los canales mecanotransductores que están acoplados a ellas. El

movimiento de los cilios en dirección al cinocilio provoca un aumento en la tensión

de las uniones de punta, mientras que un movimiento en la dirección opuesta da

lugar a una disminución de la tensión, provocando una disminución en la

probabilidad de apertura de los canales mecanotransductores (Goldberg y

Hudspeth, 2001).

I. 3. Potencial receptor de la célula ciliada La activación de los canales mecanotransductores provoca un cambio de potencial

eléctrico en la célula ciliada. El movimiento de los cilios en dirección del cinocilio

provoca una despolarización en estas células, mientras que un movimiento en la

dirección opuesta da lugar a una hiperpolarización. La despolarización de la

membrana celular de la célula ciliada provoca la activación de los canales de Ca2+

dependientes de voltaje ubicados en la porción basolateral de la célula y los

cuales están acoplados a la liberación del neurotransmisor. Contrariamente,

cuando los cilios se desplazan hacia el lado opuesto del cinocilio, disminuye la

probabilidad de apertura de los canales mecanotransductores reduciendo la

liberación del neurotransmisor y en consecuencia también disminuye la actividad

de la neurona aferente vestibular (Goldberg y Hudspeth, 2001).

I. 4. Neurotransmisión aferente Las neuronas aferentes vestibulares, se encuentran agrupadas en el ganglio de

Scarpa, hacen sinapsis periférica con las células ciliadas y, a nivel central, con las

16

neuronas de los núcleos vestibulares en el tallo cerebral y con neuronas del

cerebelo.

El neurotransmisor entre la célula ciliada y la neurona aferente vestibular es un

aminoácido excitador del tipo del glutamato que activa los receptores ionotrópicos

del tipo AMPA y NMDA. En el vestíbulo del axolotl se han descrito respuestas a

kainato, quiscuálico y NMDA. Se ha demostrado que en condiciones de bajo Ca2+

y alto Mg2+ en el baño de la preparación, los agonistas glutamatérgicos

incrementan la frecuencia de disparo de las fibras aferentes vestibulares y los

antagonistas en solución normal inhiben la actividad en reposo y la respuesta a

estimulación mecánica. La potencia mostrada por los agonistas y antagonistas,

sugirió que el transmisor liberado por la célula ciliada en el sistema vestibular del

axolotl interactúa con receptores del tipo no-NMDA postsinápticamente (Soto y

Vega, 1988a).

Mediante técnicas inmunocitoquímicas se ha detectado la presencia de

glutamato y aspartato en las células ciliadas vestibulares (Harper y cols., 1995).

En el sistema vestibular se ha reportado que las neuronas aferentes

vestibulares también expresan receptores a péptidos opiodes del tipo µ (Vega

2001), receptores histaminérgicos del tipo H3 (Chávez y cols., 2000), receptores a

cannabinoides (Carrillo, 2005), receptores sensibles a cambios de pH (Mercado y

cols., 2006), y receptores a sustancia P y al péptido relacionado con el gen de la

calcitonina (Sewell, 1996).

Figura 1.4. Dibujo esquemático de una neurona aferente vestibular y sus relaciones sinápticas. A nivel periférico hace sinapsis con la célula ciliada. A nivel central con neuronas de los núcleos vestibulares del tallo cerebral y con neuronas del cerebelo.

17

I. 5. Neurotransmisión eferente La actividad vestibular es modulada por el sistema eferente. Los cuerpos celulares

que proceden de las fibras eferentes se encuentran a nivel del tronco cerebral,

bajo el suelo del IV ventrículo. Las eferentes vestibulares pueden ser excitadoras,

inhibidoras o mixtas.

El principal transmisor en las sinapsis eferentes es la acetilcolina, esto ha

sido demostrado por estudios inmunocitoquímicos, farmacológicos y

electrofisiológicos. La acetilcolina actúa sobre dos clases de receptores:

nicotínicos y muscarínicos. La mezcla de excitación e inhibición que producen las

eferentes sobre la actividad aferente podría depender de diversos subtipos de

receptores colinérgicos. Estudios histológicos y moleculares han demostrado la

expresión de receptores nicotínicos y muscarínicos en órganos vestibulares en el

humano y la rata. Se han identificado los cinco subtipos de receptores

muscarínicos a ACh (M1-M5) así como los receptores nicotínicos especialmente

del tipo α9/α10 (Wackym y cols., 1995).

Además de ACh, son coliberados por las neuronas eferentes otros péptidos como

el péptido relacionado con el gen de la calcitonina, las encefalinas, la sustancia P

y el neuropéptido Y.

I. 6. Conductancias iónicas de las aferentes vestibulares En neuronas aferentes vestibulares aisladas del axolotl (Ambystoma tigrinum) se

determinaron cuatro tipos de corrientes de potasio (transitoria de salida IKA,

rectificador retardado IK,RD, dependiente de Ca2+ IK(Ca) y una corriente rectificadora

de entrada de tipo IK1. También se encontró una corriente de Na+ (Cebada, 1997).

En neuronas aisladas de ganglios vestibulares de ratones se distinguieron

dos tipos de corrientes de Ca2+ activadas por voltaje, de alto y bajo umbral. La

corriente de Ca2+ dependiente de voltaje de bajo umbral (LVA) sólo se expresó en

un grupo pequeño de neuronas. Con base en sus propiedades farmacológicas las

corrientes de Ca2+ dependientes de voltaje de alto umbral (HVA) se caracterizaron

como corrientes tipo L, N, Q y P. Estos resultados sugieren que las neuronas

aferentes primarias expresan una variedad de corrientes de Ca2+ con distintas

18

propiedades farmacológicas. Se ha propuesto que esta diversidad en la expresión

de canales de Ca2+ podría estar relacionada con sus características sinápticas

funcionales, y con las propiedades intrínsecas de cada clase de aferentes

vestibulares (Desmadryl y cols, 1997).

El mismo grupo de investigadores reportó que existen modificaciones

significativas en la expresión de los canales de Ca2+ de las neuronas aferentes

vestibulares de ratones durante el desarrollo embrionario (E-14, 15, 17). Se

caracterizaron dos grupos de neuronas basándose en la amplitud de la corriente

LVA. En la primera población, la densidad de la corriente LVA disminuyó entre E-

17 y el nacimiento, y posteriormente desapareció. La segunda población de

neuronas tuvo una alta densidad de LVA en E-17 y aumentó la densidad durante

el desarrollo. La corriente tipo L permaneció constante entre E-15 y el nacimiento.

La densidad de las corrientes tipo N y Q incrementaron su magnitud en forma

continua en el mismo periodo que la corriente tipo L. Por otra parte la corriente tipo

P aumentó entre E-15 y E-17 y después disminuyó. Los cambios en la expresión

de la corriente LVA y el aumento transitorio de la corriente de HVA tipo P ocurre

durante un periodo caracterizado por un crecimiento neuronal masivo y la

formación de la sinapsis, por lo que sugiere un papel específico de las corrientes

de Ca2+ en la ontogenia de las neuronas aferentes vestibulares (Chambard y cols.,

1999).

En las aferentes vestibulares de ratón se ha reportado una corriente activada

por hiperpolarización (Ih). La Ih se activa a bajos umbrales por lo que no está

involucrada en el establecimiento del potencial de membrana en reposo, ni

tampoco en el proceso de la posthiperpolarización del potencial de acción, por lo

que su papel funcional no ha sido dilucidado (Chabbert y cols., 2001).

Se ha encontrado que la densidad de la corriente de K+ activada por Ca2+

(IKCa) está correlacionada con el diámetro del soma de neuronas aferentes

vestibulares en cultivo. In situ, estas neuronas tienen patrones de descarga

heterogéneos que podrían ser causados por las diferencias en sus propiedades

intrínsecas. Se encontraron dos poblaciones de neuronas aferentes vestibulares,

éstas se clasificaron de acuerdo a la expresión de la corriente de Ca2+ de bajo

19

umbral (LVA). Las neuronas pequeñas no expresaron la corriente LVA y las

neuronas medianas y grandes presentaron la corriente LVA. La IKCa en ambos

grupos fue acarreada a través de canales de alta (BK), intermedia (IK), baja

conductancia (SK) y un canal resistente a bloqueadores (IR). En las células que

presentaron la LVA se expresaron los canales BK y la expresión de IR fue mayor

en neuronas que no tuvieron la corriente LVA. Por otra parte, no hubo una

correlación entre el tamaño de la neurona y la expresión de los canales SK e IK.

En experimentos de fijación de corriente los canales BK participan en la

adaptación de la descarga y en la duración del potencial de acción. Sin embargo

son pocas las neuronas aferentes vestibulares que disparan en forma repetitiva

(Limón y cols., 2005).

En nuestro laboratorio, utilizando la técnica de fijación de voltaje e

inmunocitoquímica, se ha caracterizado en las neuronas aferentes vestibulares en

cultivo de rata una corriente activada por protones que es acarreada a través de

canales sensores a acidez (ASIC: de Acid Sensign Ionic Channels). La corriente

activada por protones se caracteriza por tener una rápida activación y completa

desensibilización, y es acarreada casi exclusivamente por iones sodio. Esta

corriente disminuyó de manera reversible por la aplicación de amilorida, gadolinio,

plomo, ácido acetilsalicílico y al aumentar la concentración de Ca2+ extracelular y

aumentó cuando se aplicaron el neuropéptido FMRFamida y zinc. Cuando se

acidificó el medio extracelular se generaron potenciales de acción en las neuronas

vestibulares, por lo cual se propuso un papel funcional de los ASICS en la

excitabilidad de estas neuronas. La inmunoreactividad a las subunidades ASIC1a y

ASIC2a fue encontrada en neuronas del ganglio vestibular y fibras aferentes que

corren a través de la mácula del utrículo y de la cresta ampular de los canales

semicirculares lateral y anterior. Estos resultados indicaron que la corriente

activada por protones contribuye a las respuestas de las neuronas aferentes

vestibulares (Mercado y cols., 2006).

20

I. 9. Canales de potasio activados por sodio intracelular Varias corrientes de K+ juegan un papel importante en el control de la excitabilidad

neuronal, éstas influyen en el potencial de membrana en reposo, así como

también otras controlan el patrón de disparo durante una despolarización. Los

canales de K+ han sido ampliamente estudiados; en algunos, su apertura depende

de voltaje, sin embargo, otros son activados por la acumulación intracelular de

iones, Ca2+ y Na+.

Los canales activados por sodio (KNa) intracelular fueron descritos por

primera vez en células cardiacas de cobayo (Kameyama y cols., 1984).

Posteriormente, estos canales KNa fueron hallados en diferentes tipos neuronales.

I. 10. Propiedades de los canales de potasio activados por sodio en miocitos cardiacos de mamífero Los canales de potasio activados por sodio (KNa) fueron descritos por primera vez

en miocitos ventriculares de cobayo, utilizando la técnica de “inside out”. Estos

canales se caracterizaron por poseer una gran conductancia (207 pS), tener

propiedades de rectificación entrante y su probabilidad de apertura no ser

dependiente de voltaje. Estos canales no son afectados por Ca2+ o ATP y

necesitan al menos 20 mM de Na+ para activarse. La probabilidad de encontrar los

canales en estado abierto está en función de la concentración de Na+, con una

activación media máxima (EC50) de 66 mM y un coeficiente de Hill cercano a 3

(Kameyama y cols., 1984).

Wang y cols. (1991) demostraron en registros de canal único que la

rectificación entrante de los canales KNa en células ventriculares de cobayo se

debe al Mg2+ y Na+ intracelular. El ión divalente de manera dependiente de voltaje

bloquea la corriente saliente de los canales KNa y el Na+ además, de activar la

conductancia de K+ también, puede paradójicamente bloquear la corriente saliente

a través de los canales KNa dependiendo de la concentración y del voltaje.

21

I. 11. Propiedades de los canales KNa en neuronas Los canales KNa han sido observados en registros de canal único de distintos tipos

neuronales. En neuronas aisladas del mesencéfalo de pollo se reportó un canal de

K+ que fue activado cuando el Na+ sustituyó al Li+ intracelularmente en registros de

“inside out”; este canal se caracterizó por tener múltiples estados de conductancia

cuyo valor máximo fue de 50 pS cuando se utilizaron las siguientes

concentraciones [ K ]ext = 150 mM y [ K ]int = 5 mM; 100 pS cuando se utilizó [ K ]ext = 150 mM y [ K ]int = 75 mM, y su corriente se caracterizó por tener una ligera

rectificación entrante. Se demostró que estos canales KNa no son activados por 1

mM de Ca2+ (Dryer y cols., 1989, Dryer, 1991). Otra característica distintiva de

estos canales KNa en esta preparación es su falta de "run down" (disminución de

las corrientes debido a cambios celulares) después de separar el parche de la

célula. Estos canales KNa presentan una cinética compleja ya que cuando se abren

lo hacen en forma de ráfagas; cada una de éstas separadas por breves cierres del

canal o por la transición a subestados de conductancia. Además los canales KNa

de manera ocasional permanecen cerrados por varios segundos aun cuando se

encuentran en presencia de una concentración alta de Na+ (Dryer, 1993).

En neuronas del ganglio trigémino de codorniz, los registros de canal único

se realizaron a -50 mV, el cual es el potencial de membrana en reposo de estas

células. Aquí el canal KNa presentó una actividad en ráfagas con una rápida

transición entre el estado abierto y cerrado y grandes periodos sin actividad

separando las ráfagas. De la misma forma que las neuronas aisladas del

mesencéfalo de pollo las neuronas del ganglio trigémino presentaron subestados

de conductancia. El valor para el principal estado de conductancia de los canales

KNa fue de 174 pS [ K ]ext = 150 mM y [ K ]int = 75 mM. La actividad de los canales

KNa permaneció cuando se utilizó una baja concentración de Na+ intracelular (12.5

mM) y cuando la concentración de Na+ aumentó la probabilidad de apertura del

canal incrementó. La EC50 fue de 30 mM. Debido a que el coeficiente de Hill fue

cercano a 3 se sugirió que posiblemente 2 o 3 iones Na+ se unen al canal antes de

abrirse. Otra característica distintiva de los canales KNa en esta preparación es que

el Li+ no puede sustituir al Na+ para activarlos (Haimann y cols., 1990).

22

Se ha registrado la actividad de los canales KNa en cultivos celulares

primarios preparados de cerebelo, hipocampo, bulbo olfatorio, corteza olfatoria,

protuberancia, septum, médula espinal y corteza visual de rata. Los canales KNa

encontrados en todas las regiones comparten una dependencia absoluta del Na+

intracelular, tienen conductancias de 140-170 pS en una concentración simétrica

de K+ 150 mM y presentan múltiples subestados de conductancia (Egan y cols.,

1992a). Posteriormente las propiedades y run-down de los canales KNa

encontrados en los cultivos de células mitrales del bulbo olfatorio de rata fueron

investigados utilizando la técnica de “patch clamp” en la modalidad de

“cell attached” e “inside out”. Se encontró que estos canales iónicos son altamente

selectivos al K+, requieren de 10-180 mM de Na+ intracelular para su activación, el

Li+ no puede sustituir al Na+ para activar los canales de KNa y a voltajes más

positivos que el potencial de equilibrio del K+, las corrientes del canal KNa

presentan una rectificación entrante debido a que el Na+ bloqueó la corriente de

potasio saliente.

En registros de cell attached en condiciones normales no se activaron los

canales KNa, esto sólo fue posible cuando el Na+ intracelular se aumento con

veratridina. Esta droga previene la inactivación de los canales de Na+

dependientes de voltaje permitiendo que el Na+ entre a la célula. La preincubación

de las células en TTX o la eliminación del sodio extracelular previnieron el efecto

de la veratridina, con lo que se confirmó que los canales en efecto eran KNa.

La apertura de los canales KNa en esta preparación se presentó en ráfagas,

durante las cuales existieron fluctuaciones entre los estados abierto, cerrado y

subestados. Los canales KNa en parches desprendidos de neuronas del bulbo

olfatorio pierden de manera irreversible su actividad ("run down"). El tiempo para

que se presente este fenómeno varía desde 1 minuto hasta 1 hora. Una posible

explicación a este fenómeno es que algún factor intracelular necesario para que el

canal permanezca abierto se pierde cuando se retira el parche de la célula. Esta

hipótesis es respaldada por el hecho de que el "run down" de la actividad del canal

KNa en células tratadas con veratridina no ocurre. La pérdida del factor que se

difunde aparentemente cambia la sensibilidad del canal para la concentración de

23

Na+ intracelular ya que la actividad del canal momentáneamente se recupera del

"run down" cuando se aumenta la concentración de Na+ intracelular, mostrando

que el canal aún puede abrirse pero sólo en presencia de concentraciones altas

de Na+ intracelular. La naturaleza de este factor es desconocido. El run down de

los canales KNa en parches desprendidos de la membrana celular no es

dependiente de la actividad del canal y la apertura del canal no fue afectada por la

aplicación de cAMP, cGMP, ATP, proteína cinasa dependiente de cAMP a la

superficie interna de la membrana del parche (Egan y cols., 1992). El Li+ no puede

sustituir al Na+ para activar los canales KNa. La conductancia unitaria de 172 pS en

soluciones simétricas de K+ 150 mM. En estas condiciones el canal presentó un

comportamiento lineal en la relación corriente del canal completamente abierto

contra voltaje en el rango de potencial de -100 a 0 mV. A voltajes más positivos

que el potencial de equilibrio del K+, las corrientes del canal KNa presentan una

rectificación entrante debido a que el Na+ bloqueó la corriente de potasio saliente.

En otro tipo celular donde se describieron a los canales KNa fue en el soma

de motoneuronas de rata. Estos canales presentaron una conductancia de 44.8 pS

en [ K ]ext = 5.6 mM y [ K ]int = 106 mM y 139.2 pS en [ K ]ext = 155 mM y [ K ]int = 85

mM. En estas células los canales KNa fueron independientes del voltaje y

necesitaron una concentración alta de Na+ para activarse (EC50 = 39.9 mM). De

forma similar a las neuronas del bulbo olfatorio, el Li+ no puede sustituir al Na+

para activar a los canales KNa, que en su mayoría fueron encontrados en las

regiones donde probablemente se acumula más Na+ citoplasmático. En esta

preparación los canales KNa mostraron actividad en algunos parches por más de

50 minutos. Los periodos de alta actividad fueron generalmente seguidos por

periodos de 10-30 segundos de baja actividad pero no se presentó un efecto

convincente de "run down" (Safronov y Vogel, 1996).

Los canales KNa en las neuronas de la raíz dorsal de rata presentan una

conductancia de 142 pS con [ K ]ext = 142 mM y [ K ]int = 85 mM. En este caso no

se observó un pronunciado "run down" en los parches desprendidos y su actividad

no se redujo significativamente durante varios minutos (Bischoff y cols., 1998).

Algunas de las propiedades de los canales KNa se resumen en la tabla I.

24

Tabla I. Propiedades de los canales de KNa en células excitables de diferentes

vertebrados. Tipo celular Conductancia

unitaria Dependencia de voltaje

EC50 para el Na+ Run-down

Ref.

Miocitos ventriculares de

cobayo

210 pS con

varios

subestadosa

Ninguno 66 mM

pendiente de Hill = 2.8

Ninguno Kameyama y

cols., 1984; Wang

y cols., 1991.

Neuronas del

mesencéfalo de pollo

105 pS con

varios

subestadosb

Ninguno 30-75 mMd Ninguno Dryer y cols.,

1989; Dryer,

1993.

Neuronas sensoriales de

ganglios sensoriales

170 pS con

varios

subestadosb

Ligeramente

incrementa la hPo con

despolarización

30 Mm

pendiente de Hill = 2.7

Ninguno Haimann y cols.,

1990.

Neuronas del bulbo

olfatorio de rata

170-200 pS

con varios

subestadosc

Ligeramente

incrementa la Po con

despolarización

40-80 mMd Marcado

Run-down

Egan y cols.,

1992.

Neurona espinales de

embriones de Xenopus

No reportado Marcado incrementa la

Po con despolarización

7.3 mM

pendiente de Hill = 4.6

Ninguno Dale, 1993.

Motoneuronas de rata 44.8 pSf

139.2 pSf’

Ninguno 39.9 mM Ninguno Safronov y Vogel,

1996.

Neuronas de los ganglios

de la raíz dorsal

142 pSg Ninguno 38.7 Mm

pendiente de Hill = 3.9

Ninguno Bischoff y cols.,

1998.

Modificado de Dryer, 1994. aRegistros con [ K ]ext = 150 mM y [ K ]int = 49 mM. bRegistros con [ K ]ext = 150 mM y [ K ]int = 75 mM. cRegistros con 150 Mm de KCl simétrico. dSaturación a altas concentraciones de Na+, raramente observadas. eRápido run down también vistos en neuronas del bulbo olfatorio de pollo. fRegistros con [ K ]ext = 5.6 mM y [ K ]int = 106 mM. f’,gRegistros con [ K ]ext = 155 mM y [ K ]int = 85 mM. hP0 = Probabilidad de apertura. I. 12. Evidencia de una corriente macroscópica de K+ dependiente del influjo de Na+ en neuronas Ha sido difícil demostrar, que el influjo de Na+ a través de los canales sensibles al

voltaje, causa la activación de los canales KNa bajo condiciones normales. Las

primeras evidencias provienen de estudios realizados en motoneuronas gigantes

de cangrejo de río (Hartung, 1985), neuronas de los ganglios parasimpático y

trigémino de codorniz (Bader y cols., 1985), y neuronas del cerebro medio de pollo

(Dryer y cols., 1989). En estas últimas células un pulso de voltaje despolarizante

provocó corrientes entrantes seguidas por corrientes salientes transitorias y

25

sostenidas. En cada caso, se eliminaron las corrientes salientes transitorias al

bloquear las corrientes de Na+ por la aplicación de TTX, o por la reducción de Na+

extracelular. Sin embargo, hay evidencia de que estos resultados son artefactos

causados por una falla en la fijación de voltaje (Dryer y cols., 1989).

La presencia de una corriente de KNa en las neuronas aisladas del ganglio

ciliar de pollo (Bader y cols., 1985) y cultivos de neuronas del tallo cerebral de

pollo (Dryer y cols., 1989) fue reexaminada por Dryer usando varias técnicas de

registro. Encontró que en ambas preparaciones la presencia de una corriente

saliente transitoria sensible a TTX es un artefacto causado por una inadecuada

fijación de voltaje y fue probablemente provocado por una compensación

incompleta de la resistencia en serie. La presencia de este artefacto fue detectada

por el uso de un segundo electrodo, un electrodo pasivo de registro de voltaje, por

la determinación de la relación de la corriente de Na+ al pico y el potencial

comando, o por la examinación de los efectos de TTX sobre la cinética de la

corriente de Na+. En estas preparaciones no hay evidencia de una corriente de K+

sensible a TTX. Experimentos realizados utilizando la técnica de canal único

demostraron que las neuronas del ganglio ciliar no tienen canales de KNa, aunque

estos sí fueron detectados en cultivos de neuronas del tallo cerebral registrados

bajo las mismas condiciones (Dryer, 1991).

La mejor evidencia de que los canales KNa contribuyen a las corrientes

macroscópicas activadas por voltaje fue presentada en experimentos en agudo

hechos con neuronas espinales aisladas de embriones de Xenopus (Dale, 1993).

En estas células se reemplazó el Na+ extracelular por grandes cationes orgánicos,

tales como N-metil-D-glucamina, colina o lisina. Éstos causaron una reducción en

la corriente de K+ producida por pulsos de voltaje despolarizantes. En neuronas

espinales de embriones de Xenopus también se expresa un canal de fuga

permeable a Na+. Algunos datos cuantitativos sugieren que esta fuga puede

proporcionar suficiente concentración de Na+ para permitir la activación de los

canales KNa.

Además los canales KNa fueron estudiados en las neuronas de la raíz dorsal

de rata utilizando la técnica de célula completa. La corriente del canal KNa fue

26

identificada como una corriente de fuga adicional selectiva a K+, la cual apareció

al estimular con un pulso de voltaje. La amplitud de esta corriente se incrementó al

aumentar las concentraciones de Na+ en la pipeta. La EC50 fue de 39 mM y el

coeficiente de Hill de 3.5. La corriente de KNa no fue activada por Li+ intracelular;

ésta fue bloqueada por Cs+ pero no por tetraetilamonio. En estas células también

se realizaron experimentos utilizando dos electrodos; uno de estos electrodos se

utilizó para registrar corrientes macroscópicas en la configuración de célula

completa, con el otro electrodo se registraron corrientes unitarias con la técnica de

célula adherida. Se observó una correlación directa entre el aumento de la

amplitud de la corriente total del canal KNa y la activación de canales únicos de KNa

cuando se incrementaba la concentración intracelular de Na+ (Bischoff y cols.,

1998).

Se han descrito corrientes KNa en neuronas corticales del gato (Foehring y

cols., 1989). En estas células, los trenes de espigas son seguidas por una

posthiperpolarización lenta (AHP, del inglés afterhiperpolarization) de hasta 10 s.

La excitabilidad de la célula se reduce marcadamente durante la AHP (Foehring y

cols., 1989). El componente sostenido de estas AHPs persiste cuando el influjo de

Ca++ se bloquea, pero se elimina con TTX. Sin embargo, estas células expresan

una corriente de Na+ que no inactiva y es bloqueada por TTX (Kubota y Saito,

1991); por lo tanto, se ha propuesto que las AHPs lentas se deben a la activación

de la corriente de KNa. Además, se realizaron estudios de fijación de voltaje que

indicaron que la AHP lenta sensible a TTX en neuronas corticales está asociada a

la activación de una corriente de K+ y que la AHP lenta persiste después de la

inhibición de la ATPasa Na+-K+ (Schwindt y cols., 1989; Foehring y cols., 1989).

Para conocer la función de la corriente de K+ activada por Na+ se realizaron

registros de fijación de corriente en el soma de motoneuronas de rata en

rebanadas de médula espinal. Se compararon potenciales de acción únicos y

trenes de potenciales de acción registrados en soluciones extracelulares con Na+ y

con Li+. La forma del potencial de acción no cambió después de sustituir

extracelularmente Na+ por Li+. En contraste, trenes de potenciales de acción

registrados en una solución sin Ca2+ fueron seguidos por una posthiperpolarización

27

lenta (1-2 s) que desapareció cuando el Na+ extracelular fue reemplazado por Li+.

La acumulación de Na+ en el soma de motoneuronas causa una AHP (Safronov y

Vogel, 1996). Este tipo de AHP activada por Na+ puede ser debida a acumulación

local de Na+ intracelular en la región del cono axónico que podría activar los

canales KNa. De manera alterna, la acumulación intracelular de Na+ podría activar

la bomba electrogénica Na+-K+ dando como resultado la hiperpolarización de la

membrana. Para distinguir entre estas dos posibilidades se aplicó ouabaína, un

bloqueador especifico de la bomba Na+-K+. Las posthiperpolarizaciones activadas

por Na+ continuaron después de aplicar ouabaína; la amplitud se incrementó con

una solución Ringer sin K+ y desaparecieron cuando el potencial de membrana fue

igual al potencial de equilibrio del K+. Esto indicó que las AHP fueron el resultado

de la activación de una conductancia de K+ dependiente de Na+. En este estudio

los canales KNa fueron activados por concentraciones relativamente altas de Na+

que no se producen en el soma de las motoneuronas durante un único potencial

de acción. Los cálculos teóricos han mostrado que trenes de potenciales de acción

largos y de alta frecuencia (250 Hz) producen un aumento intracelular de Na+ en

compartimentos restringidos, suficiente para activar los canales KNa del cono

axónico (Koh y cols., 1994). La AHP activada por Na+ fue observada en el soma

de las motoneuronas después de trenes de potenciales de acción con una

frecuencia más baja de 15-30 Hz. Varios factores podrían facilitar la acumulación

local de Na+ y la activación de los canales KNa en las motoneuronas. Estos canales

KNa se encuentran principalmente en regiones de membrana adyacentes a los

axones. No se excluye la posibilidad de que los canales KNa estuvieran presentes

en regiones de membrana adyacentes a las dendritas de las motoneuronas,

debido a que se ha demostrado que las dendritas de neuronas piramidales CA1

poseen alta densidad de canales de Na+ dependientes de voltaje (Magee y

Johnston, 1995) los cuales son activados por potenciales de acción generados en

el soma celular (Stuart y Sakmann, 1994). Por lo tanto las dendritas finas de las

motoneuronas podrían ser otro sitio de acumulación de Na+ y activación de los

canales KNa. Se ha llegado así a la conclusión de que los canales KNa juegan un

papel importante en la excitabilidad de las motoneuronas. Siendo activados

28

durante trenes de potenciales de acción, de manera que las AHP pueden

estabilizar la membrana y proteger a esta de una despolarización siendo capaces

de reducir la excitabilidad de la membrana y contribuir a la regulación del disparo

de potenciales de acción en las motoneuronas (Safronov y Vogel, 1996).

Para estimar la contribución de los canales KNa en el potencial de acción de

neuronas intactas de los ganglios de la raíz dorsal (GRD) de rata, se realizaron

registros de fijación de corriente. Lo que se observó fue que al reemplazar

extracelularmente el Na+ por Li+ no cambio la forma del potencial de acción. En

contraste con las motoneuronas de rata, las neuronas de los GRD generan

potenciales de acción sólo a muy bajas frecuencias 0.5-2 Hz (neuronas tipo C;

Harper y Lawson, 1985b). En registros de fijación de corriente se encontró que el

aumento de Na+ intracelular produjo una depolarización que se saturó hasta

–68 mV el cual correspondió al potencial de equilibrio de potasio para las

condiciones experimentales utilizadas (5.6 mM K+O\85 mM K+i). En cambio, en

neuronas con un potencial de membrana en reposo relativamente bajo, el Na+

intracelular indujo una hiperpolarización de –68 mV. Estos experimentos indicaron

que la perfusión de una neurona con Na+ intracelular puede activar una

conductancia de K+ y estabilizar el potencial en reposo en las neuronas de los

GRD, hacia el potencial de equilibrio del potasio. Por lo que se sugiere que los

canales KNa en neuronas de los GRD participan estabilizando el potencial de

membrana bajo condiciones fisiológicas (Bischoff y cols.,1998).

Las neuronas piramidales de la neocorteza pueden generar diversos

patrones de disparo, dependiendo de su morfología, propiedades pasivas y

corrientes iónicas activas. Las neuronas de la neocorteza no son fisiológicamente

homogéneas. Se han reconocido tres tipos básicos de neuronas sobre la base de

su actividad; neuronas RS (del inglés regular-spiking), neuronas FS (del inglés

fast-spiking) y neuronas IB (del inglés intrinsically- bursting). Las neuronas IB se

distinguen porque sus espigas parecen estereotipadas, y agrupadas (ráfagas)

(Connors y Gutnick, 1990). Las ráfagas tienen 2 ó 6 potenciales de acción que

ocurren aproximadamente a 200 Hz (Lisman, 1997). Las espigas individuales de

las células IB son seguidas a menudo por una importante despolarización

29

postpotencial (ADP, del inglés, despolarizing afterpotential), la cual puede sumarse

para formar una onda lenta despolarizante de baja amplitud durante una ráfaga.

Dentro de cada ráfaga, cada espiga sucesiva declina en amplitud porque la

despolarización sostenida inactiva la conductancia de sodio.

Se ha reportado que en las neuronas piramidales IB de la capa V, la

substitución extracelular de Na+ por Li+ genera una corriente entrante a través de

los canales de Na+ dependientes de voltaje y no altera los potenciales de acción,

sin embargo inhibe la posthiperpolarización (AHP) que sigue no solo a trenes de

espigas, sino también a eventos cortos tales como ráfagas individuales. Además,

el mismo procedimiento induce un incremento en la frecuencia de repetición de

ráfagas durante la aplicación de un estímulo despolarizante prolongado. Estos

hallazgos sugieren que una corriente de K+ activada por Na+, pero no por Li+

participa en la generación de la AHP postexcitatoria regulando la frecuencia de

aparición de ráfagas en las neuronas IB. En experimentos de fijación de voltaje en

neuronas IB aisladas se demostró que un pequeño componente de las corrientes

de K+ evocadas por un pulso despolarizante depende de la activación de la

corriente de Na+ pero no de Li+ generada a través de los canales de Na+

dependientes de voltaje. Estos resultados apoyan que la activación de la corriente

de KNa por el influjo de Na+ inducido por un potencial de acción contribuye a la

posthiperpolarización pos ráfaga y a la actividad rítmica de las ráfagas en las

neuronas IB (Franceschetti y cols., 2003).

I. 13. Propiedades de los canales Slack y Slick Todos los datos descritos sobre los canales KNa denotan una heterogeneidad de

sus propiedades y éstas pueden ser explicadas por las diferencias en las

condiciones de registro, localización subcelular, unión a subunidades auxiliares o

podría deberse a las diferencias intrínsecas entre las isoformas del canal.

Se ha demostrado que los canales de K+ rectificadores salientes codificados

por el gen Slack son activados por Na+ y la distribución de Slack en el cerebro

coincide con varios tipos neuronales donde se ha reportado la corriente KNa (Joiner

y cols., 1998; Yuan y cols., 2003). Además, se ha encontrado un segundo canal

30

KNa que es codificado por el gen Slick, el cual es selectivamente expresado en el

sistema nervioso y en el corazón (Fig. 1.5.) (Bhattacharjee y cols., 2003).

En 1998, Joiner y cols., aislaron el gen que codifica una subunidad de un

canal de K+. A esta subunidad se le llamó Slack (“sequence like a Ca2+-activated

K+ channel; también conocida como Slo2.2). Esta subunidad está compuesta por

seis segmentos transmembrana (S1-S6) y una gran región C-terminal

citoplasmática. Desde el N-terminal hasta la región P (poro) existe una mala

alineación aminoacidica entre la subunidad Slack y la subunidad de los canales de

K+ Slo dependiente de calcio-voltaje y Slo 3 sensible a pH. Además la secuencia

de aminoácidos de los segmentos transmembrana de las subunidades de los

canales de K+ antes mencionados no coincide. La región P y partes limitadas de la

región C- terminal de los canales Slack, Slo y Slo 3 son semejantes en su

estructura primaria.

La subunidad del canal de potasio conocida como Slack es muy grande, la

característica que tiene en común con la gran familia de canales de potasio

Shaker es que tiene seis dominios transmembrana. El canal Slack es sensible al

voltaje a pesar de carecer del sensor de voltaje S4, característico de los canales

Shaker; sin embargo su secuencia tiene algunas regiones homólogas al Slo, el

canal activado por Ca2+ de gran conductancia (canal BK). Ambas tienen una gran

región C-terminal que contiene dos dominios RCK (regulador de la conductancia

de K+) que son probablemente sitios de unión a Na+ y controlan la apertura del

canal. El dominio S0 transmembrana que interactúa con la subunidad beta está

presente en la subunidad Slo pero no en la Slack (Joiner y cols., 1998, Jiang y

cols., 2001). En los canales Slo2, usando mutagénesis directa se ha identificado

una región en la cola análoga al sitio de unión a Ca2+, la cual sensa Cl-. Por esto

que se ha sugerido que el canal Slo2 es activado por Ca2+ y Cl- en Caenorhabditis

elegans (Yuan y cols., 2000). Por otra parte el canal Slo2.2 de mamífero (rSlo2) no

requiere Cl- para activar el canal expresado en oocitos de Xenopus; este anión

puede facilitar la activación del canal cuando el Na+ está presente, por lo que se

ha demostrado que las acciones de Na+ y Cl- son sinérgicas (Yuan y cols., 2003).

31

El canal Slick (“sequence like an intermediate conductance K+ channel; también

conocido como Slo2.1) es activado también por Na+ y Cl-. Los canales Slick y

Slack presentan un 74% de homología en su secuencia aminoacídica. El

segmento N-terminal del Slick es la mitad que el del Slack. Ambos contienen un

dominio PDZ altamente conservado; sus segmentos transmembranales y los

dominios RCK son casi idénticos. El canal Slick posee un sitio consenso de unión

para ATP, que al estar ocupado se inhibe la actividad del canal (Bhattacharjee y

cols., 2003).

A nivel de canal único, los canales KNa nativos son heterogéneos al igual que

los expresados en sistemas heterólogos. En los primeros, el rango de valores de

EC50 para el Na+ es de 7 a 80 mM; su conductancia unitaria varía de 100 a 200

pS y presentan múltiples subestados de conductancia (Dryer, 1994). Expresados

en oocitos de Xenopus en condiciones de K+ simétrico, los canales Slack tienen

una EC50 de 41 mM para la activación por Na+, la conductancia unitaria es de

~180 pS y muestran múltiples subestados de conductancia). Los canales Slick

tienen una conductancia unitaria de ~140 pS y presenta varios subestados de

conductancia (Yuan y cols., 2003; Bhattacharjee y cols., 2003). Los canales Slack

como los canales nativos de KNa no pueden ser activados por la sustitución de Na+

por Li+.

El Slick difiere del Slack en su cinética de apertura rápida. Los canales Slack

necesitan del Na+ para la apertura del canal mientras que los canales Slick tienen

un nivel basal de actividad en la ausencia de Na+ (Bhattacharjee y cols., 2003).

Esta heterogeneidad de las subunidades de canales de potasio activados por

sodio, puede explicar la variedad observada en las corrientes macroscópicas y en

las corrientes nativas KNa de canal único.

Es importante mencionar que se ha reportado que la subunidad del canal de

K+ Slack puede interactuar directamente con las subunidades Slo para formar

heteromultímeros Slack/Slo. Las propiedades farmacológicas y las conductancias

unitarias de los canales formados por la coexpresión de Slack y Slo son diferentes

de las propiedades que caracterizan a cada canal de manera individual. Los

canales Slack/Slo tienen una conductancia entre 60-180 pS y son activados por

32

Ca2+, por lo que algunos canales de conductancia intermedia presentes en el

sistema nervioso central podrían ser el resultado de la interacción entre las

subunidades de los canales Slack y Slo (Joiner y cols., 1998).

I. 14. Localización de los canales Slack y Slick en el cerebro Experimentos de hibridación in situ e inmunocitoquímica han demostrado que el

canal Slack está ampliamente distribuido en el sistema nervioso central

(Bhattacharjee y cols., 2002). Un anticuerpo contra el N-terminal de un canal Slack

clonado mostró niveles altos de la proteína en el bulbo olfatorio, cerebro medio y

tallo cerebral. Sin embargo se encontró una limitada inmunoreactividad en ciertas

regiones de la neocorteza, cerebelo e hipocampo (tabla II).

Estos hallazgos contrastan con lo reportado en experimentos de hibridación

in situ. La clonación de una isoforma alternativa del Slack resolvió esta

discrepancia, ya que se encontró una alta inmunoreactividad a Slack en estas

regiones usando un anticuerpo panSlack (Bhattacharjee y cols., 2004).

El canal Slick está ampliamente distribuido en el cerebro, específicamente en

el cerebro medio, tallo cerebral, hipocampo y en la neocorteza, con una abundante

expresión en la corteza somatosensorial y la corteza visual. Estos hallazgos son

consistentes con los reportes de los canales KNa encontrados en áreas corticales

específicas (Franceschetti y cols., 2003). Además, se detecta una alta

Figura 1.5. Subunidades de Slack y Slick. Hay dos isoformas de Slack (Slack A y Slack B). Slack A tiene un N-terminal que es casi idéntico que el del Slick (representado por el ovalo gris). Ambos Slack A y Slack B tienen una gran región C-terminal que contiene dos dominios que regulan la conductancia de K+ (RCK), un dominio de unión a ATP y un dominio PDZ. (Bhattacharjee y cols., 2003).

33

inmunoreactividad en regiones sensoriales del cerebro, especialmente en

neuronas auditivas del tallo cerebral (Bhattacharjee y cols., 2005).

34

Tabla II. Distribución de canales Slack y Slick en el cerebro de rataab. Localización en el cerebro Hibridación in situ Inmunocitoquimica

Slack Slick Slack Slick

Cangiano y cols., 2002 Bhattacharjee y cols., Cangiano y cols., 2002 Bhattacharjee y cols.,

Joiner y cols.,1998 2002 Joiner y cols.,1998 2002

Bulbo olfatorio ND ++++ ++ ++++

Corteza cerebral

Corteza frontal ++ ++ ++ ++

Corteza piriforme ++ ++ - ++

Cuerpo calloso - - - -

Núcleo de la banda

diagonal

ND ++ +++ ++

Núcleo medio Septal ND ++ ++ ++

Amígdala ++++ ++ +++ ++

Hipocampo

CA1 ++ ++++ - ++++

CA2 ++ ++++ - +++

CA3 ++++ ++++ + +++

Giro dentado + ++++ + +++

Habenula ++ ++++ + ++

Tálamo ++ ++ +++ ++

Hipotálamo ++ ++ ++ +++

Sustancia nigra +++ ++ +++ +++

Núcleo rojo +++ +++ ++++ +++

Núcleo oculomotor +++ +++ ++++ +++

Núcleo trapezoide ++++ +++ ++++ +++

Núcleo ventral

coclear

+++ ++ +/- +++

Trigémino motor +++ ++ +++ +++

Núcleo facial ND +++ +++ +++

Núcleo vestibular ND +++ ++++ ++

Celular de Purkinje

del cerebelo

+++ ++ +/- +

Núcleo cerebelar

profundo

+++ +++ ++++ +++

aUn mayor número de símbolos + indica una gran expresión, el signo – indica que

no hay expresión y +/- indica que la expresión fue reportada por [Cangiano y cols.,

2002] pero no por [Joiner y cols.,1998]. bLa abreviación ND indica que no fue determinado.

35

I. 15. Farmacología de los canales de potasio activados por sodio Hasta ahora no se ha encontrado una molécula capaz de bloquear de manera

específica los canales KNa. Desarrollar un antagonista específico para estos

canales ayudaría a entender su papel funcional. Sin embargo, existen ciertas

drogas que bloquean este canal de manera inespecífica.

En células cardiacas el R-56865 (N-{1- [4 (4-fluorofenoxi) butil]-4-piperidinil}-

N-metil-benzotiazolamina) inhibe la corriente del canal KNa. (Luk y Carmeliet,

1990). Sin embargo, este bloqueador también inhibe la corriente de Na+ en células

cardiacas (Wilhelm y cols., 1991), la corriente de potasio rectificador retardado (IK)

y la corriente transitoria (Ito) (Leyssens y Carmeliet, 1991). Se ha estudiado el

efecto de dos drogas antiarrítmicas clase III, MS-551 (1,3-dimetil-6-{2-N-(2-

hidroxietil)-3-(4-nitrofenil)propilamino[etilamino}-2,4-(1H,3H)-clorhidrato

pirimidinediona] y E-4031 (N-[4-[[1-[2-(6-metil-2-piridinil)etil}-4-piperidinil}

carbonilfenil} diclorhidrato dihidrato metanesulfonamida) sobre los canales KNa en

células ventriculares de cobayo utilizando la técnica de canal único en la

modalidad de parche con el interior hacia afuera (inside out) (Mori y cols., 1996).

Estas drogas en concentraciones altas (300 mM) inhibieron la corriente de KNa al

disminuir el tiempo de apertura del canal. Sin embargo, estas drogas también

bloquean canales de K+ dependientes de voltaje (Sanguinetti y Jurkiewicz, 1990;

Nakaya y cols., 1991).

En esta misma preparación se estudió el efecto de la amiodarona (la cual

ejerce acciones antiarrítmicas clase I, II, III y IV) sobre los canales KNa. Se

encontró que esta droga en concentraciones relativamente bajas (0.1-10 µM)

inhibió la corriente de KNa disminuyendo la probabilidad de apertura. La IC50 de

amiodarona para la corriente de KNa fue de 1.0 µM (Mori y cols., 1996). Sin

embargo, la amiodarona es una droga inespecífica ya que también afecta varios

canales iónicos.

En miocitos ventriculares de cobayo se analizó el efecto del bepridil sobre la

actividad del canal KNa utilizando la técnica de canal único "inside out". El bepridil

(0.1-30 µM) inhibió los canales de KNa de manera dependiente de la

concentración. La IC50 fue de 2.2 µM. Además, en preparaciones de ventrículo

36

derecho se estudió el efecto de esta droga sobre el acortamiento de la duración

del potencial de acción inducido por inhibición metabólica (IM). Esta IM se produjo

eliminando la glucosa de la solución de perfusión y por la aplicación 0.1 µM de

carbonil-cianida-p-(trifluorometoxi)-fenilhidrazona (FCCP), un desacoplador

mitocondrial de la fosforilación oxidativa. El bepridil evitó el acortamiento de la

duración del potencial de acción durante la IM.

El bepridil es un agente antiarrítmico con propiedades antianginales; bloquea

un canal de sodio (Yatani y cols., 1986; Sato y cols., 1996), un canal de potasio

rectificador retardado (Berger y cols.,1989; Prystowsky, 1992) y un canal de

potasio sensible a ATP.

En células mitrales del bulbo olfatorio se encontró que la d-tubocurarina (d-

TC) disminuye la apertura de los canales KNa en registros de inside out. La

aplicación interna de d-TC (10-100 μM) disminuye la probabilidad de apertura de

los canales KNa cambiando la media del tiempo que el canal se encuentra en el

estado abierto y cerrado. La d-TC no modifica la conductancia del canal.

La piperidina R56865 (2.5 μΜ) y R58735 (sabeluzol; 2.5 μΜ) en neuronas

del bulbo olfatorio actúan de manera similar a la d-TC reduciendo la probabilidad

de apertura de los canales KNa cuando se aplican a la superficie interna de la

membrana. Concentraciones similares de ambas piperidinas también, disminuyen

la probabilidad de apertura de los canales KCa en cultivos de neuronas del bulbo

olfatorio. De este modo R56865 y R58735 no pueden ser considerados como

bloqueadores selectivos de los canales de KNa. La tetrodotoxina que bloquea

canales de Na+ dependientes de voltaje (1-10 μM), la caribdotoxina bloqueador del

canal KCa, la estrofantidina (1 mM) la cual inhibe la bombra Na+/K+ son capaces de

bloquear los canales KNa cuando se aplican a cualquier superficie de membrana

interna o externa (Egan y cols., 1992).

37

I. 16. Papel de los canales KNa en condiciones patológicas Las altas concentraciones de Na+ que se necesitan para activar los canales KNa en

miocitos cardiacos (Kameyama y cols., 1984) conducen a concluir que este tipo de

canal podría llegar a estar activo exclusivamente en condiciones patológicas.

En miocitos ventriculares de cobayo, la hipoxia e isquemia se conoce que causan

un acortamiento de la duración del potencial de acción (Isenberg, 1983). Este

efecto puede ser mimetizado por drogas tales como pinacidil, que incrementa la

actividad de los canales de potasio dependientes de ATP (Nakaya y cols., 1991), o

por la inhibición de la ATPasa Na+-K+. Ya que durante la isquemia o la hipoxia en

células cardiacas se produce un incremento de la concentración de Na+, debido a

la interrupción de la bomba de Na+, es posible que los canales KNa contribuyan al

acortamiento del potencial de acción. Es más, la inhibición de la ATPasa Na+-K+

por glicósidos cardiacos causa una activación de la corriente de KNa en miocitos

ventriculares de cobayo (Luk y Carmeliet, 1990). Los canales KNa también tienen el

potencial para prevenir el influjo de Ca2+ por el intercambiador Na+-Ca2+ en

condiciones donde la concentración de Na+ es anormalmente alta (Kameyama y

cols., 1984). Así la corriente de KNa podría desempeñar un papel importante en la

respuesta de los miocitos cardiacos en condiciones tales como la isquemia e

hipoxia, o en la toxicidad causada por fármacos digitálicos. De manera similar, la

exposición de miocitos cardiacos a soluciones salinas sin cationes divalentes

causa un influjo de Na+ a través de los canales de Ca2+ tipo L, dando como

resultado un incremento substancial de Na+ intracelular. El bloqueo de los canales

de Ca2+ hace evidente una corriente de K+, la cual se relaciona directamente con

el incremento de la concentración intracelular de Na+, sugiriendo así que esta

corriente es mediada por los canales KNa. También, se ha descrito que la hipoxia o

la isquemia causan la activación de una corriente de K+ en varias neuronas

centrales de vertebrados. Esta corriente tiende a reducir la excitabilidad de la

membrana y la magnitud de la despolarización que puede ocurrir durante la

hipoxia. Hay evidencias farmacológicas que sugieren la contribución de los

canales dependientes de ATP a esta corriente de K+, pero se ha descrito también

que es posible que la corriente de KNa participe en este proceso. Como en las

38

células cardiacas, la hipoxia en neuronas centrales de vertebrados causa una

disminución en la actividad de bomba de Na+-K+ y un incremento en la

concentración de Na+ intracelular. Acoplado con la despolarización de la

membrana, la disminución resultante en el gradiente electroquímico del Na+ podría

causar que el intercambiador Na+-Ca2+ opere de manera invertida, conduciendo a

un incremento en la concentración de Ca2+ y la muerte celular. Este proceso

podría ser prevenido por la corriente de potasio activada por ATP y por las

corrientes de potasio dependiente de Na+.

II. JUSTIFICACIÓN Se ha observado en las neuronas aferentes vestibulares, en registros de fijación

de voltaje en la configuración de célula completa, la disminución de una corriente

de potasio cuando en el medio extracelular se sustituye Na+ por colina. Esto

sugiere la existencia de una corriente activada por Na+ y debido a que no hay

reportes hasta el momento que demuestren su presencia en las neuronas

aferentes vestibulares, es de nuestro interés conocer si la corriente de KNa está

presente en estas neuronas. En tal caso, caracterizarla para compararla con las

propiedades de otros tipos neuronales para establecer su contribución al proceso

de posthiperpolarización del potencial de acción y a la determinación del patrón de

descarga de las neuronas aferentes vestibulares y así dilucidar su papel funcional.

III. HIPÓTESIS En las neuronas aferentes vestibulares se expresa la corriente de KNa y ésta

contribuye al proceso de posthiperpolarización del potencial de acción y a la

determinación del patrón de descarga de las neuronas aferentes vestibulares.

IV. OBJETIVO GENERAL Conocer si la corriente de potasio activada por sodio se expresa en las neuronas

aferentes vestibulares de la rata y determinar su papel funcional en estas

neuronas.

39

V. OBJETIVOS PARTICULARES

Determinar si la corriente de KNa se expresa en las neuronas aferentes

vestibulares.

Caracterizar las propiedades cinéticas de la corriente de potasio

activada por sodio y compararla con las ya reportadas en otras

preparaciones.

Estudiar el papel funcional de los canales de KNa en las neuronas

aferentes vestibulares.

VI. MATERIAL Y MÉTODOS VI. 1. Preparación de cultivo Para la realización del cultivo primario de las neuronas aferentes vestibulares se

utilizaron 6 ratas neonatas por cultivo, de la cepa Wistar sin distinción de sexo de

edades 1P7-P10 (Soto y cols., 2002). La disección del ganglio vestibular se realizó

en una campana de flujo laminar y el instrumental utilizado se esterilizó con luz

ultravioleta (UV). Para obtener el ganglio vestibular se sacrificó a la rata por

decapitación y se quitaron los huesos de la bóveda craneal y posteriormente se

retiró el encéfalo con la finalidad de exponer los nervios vestibulares; éstos se

cortaron distalmente en la separación del nervio acústico y justo antes de la

entrada de las fibras al laberinto membranoso. Los ganglios vestibulares fueron

colocados en medio de cultivo L-15 al 100%. Después, los ganglios se colocaron

por 30 minutos a 37o C en una solución que contenía tripsina 0.125% y colagenasa

0.125% para la disgregación del tejido. Pasado este tiempo la solución enzimática

fue reemplazada por medio de cultivo L-15 fresco. Posteriormente, los ganglios se

centrifugaron por 5 minutos y se retiró el sobrenadante; éste fue reemplazado por

1 Postnatal

40

medio L-15 al 100%. Este procedimiento se realizó dos veces más. Después para

obtener la suspensión celular los ganglios vestibulares fueron pasados varias

veces por pipetas Pasteur cuyo diámetro de la punta fue de orden decreciente.

Finalmente, una gota de la suspensión celular fue puesta en el centro de una caja

de plástico que previamente había sido tratada con poli-D-lisina 10 mg/ml (Sigma)

y la caja fue transferida a una incubadora que se encontraba a 37 oC con una

atmósfera con 95% de aire y CO2 al 5%; las células permanecieron ahí por 45

minutos para que se adhirieran a la caja, pasado este tiempo fueron bañadas por

medio de cultivo L-15 modificado preincubado en CO2 5%. Las células estuvieron

en la incubadora 24 horas y posteriormente se realizó el registro electrofisiológico.

VI. 2. Registro de fijación de voltaje en neuronas aferentes vestibulares Las neuronas fueron observadas con microscopio invertido con contraste de fases

y se identificaron como neuronas aquellas células redondeadas o elipsoidales

refringentes. Los registros de fijación de voltaje y fijación de corriente se realizaron

utilizando la configuración de célula completa. Los electrodos de registro fueron

hechos a partir de capilares de vidrio utilizando un estirador horizontal. Para

registros de célula completa se utilizaron aquellos que tuvieron resistencias de 1 y

3.5 MΩ. Estos electrodos fueron llenados con una solución interna para rata (tabla

III). Al momento de tocar la célula, se procedió a formar un sello de alta resistencia

succionando ligeramente. Una vez formado el sello de alta resistencia (mayor a 1

GΩ), se succionó hasta romper la membrana celular y establecer contacto

eléctrico con el interior de la neurona y así formar la configuración de célula

completa. Para el registro se utilizó un amplificador Axopatch 200B y los registros

se digitalizaron con un conversor analógico digital de 12 bits (Digidata 1200), la

señal se filtró a 2 KHz. Los parámetros experimentales se controlaron con una

interface usando el programa pClamp versión 9.0 y los datos se almacenaron en

una computadora compatible.

En todos los experimentos, una vez abierta la célula se realizó la

compensación electrónica al 80% de la capacitancia y la resistencia en serie. Los

protocolos que se utilizaron para los registros de fijación de voltajes fueron

41

diseñados para generar corrientes totales y los protocolos de fijación de corrientes

se diseñaron para generar potenciales de acción en las neuronas aferentes

vestibulares.

VI. 3. Reactivos Todas las soluciones se ajustarán a una osmolaridad de 300 mOsm.

Las soluciones de registro que se usarán son las siguientes (concentraciones en

mM ):

Tabla III. Soluciones utilizadas en el registro electrofisiológico. Solución KCl NaCl ColinaCl LiCl CaCl2 MgCl2 HEPES Glucosa MgATP NaGTP Ouabaína TTX

*Extra.

normal

5.4 140 _ _ 1.8 1.2 10 10 _ _ _ _

Extra.

colina

5.4 _ 140 _ 1.8 1.2 10 10 _ _ _ _

Extra. Li+ 5.4 _ _ 140 _ 4.5 10 10 _ _ _ _

Extra.

TTX y 0

Ca2+

5.4 140 _ _ _ 4.5 10 10 _ _ _ 100

200

Extra.

ouabaína

5.4 140 _ _ _ 4.5 10 10 _ _ 10

**Intra.

normal

135 10 _ _ 0.134 _ 5 _ 2 1 _ _

Intra.

colina

135 _ 10 _ 0.134 _ 5 _ 2 1 _ _

Intra. Li+ 135 _ _ 10 0.134

_ 5 _ 2 1 _ _

Las soluciones extracelulares fueron ajustadas a pH 7.4 con 0.1 M de KOH.

La solución intracelular fue ajustada a pH 7.2 con 0.1 M KOH.

* Extracelular, ** Intracelular.

Enzimas: colagenasa 0.125% y tripsina 0.125% en medio de cultivo L-

15.

Sustratos para la fijación de células: poli-D-lisina 100 μg/ml.

42

Medio de cultivo: L-15 modificado para CO2, suplementado con

NaHCO3 10 mM, Hepes 10 mM, 10% de suero bovino fetal, penicilina 100

U/ml y fungizona dilución 1:100.

Toxinas

Tetrodotoxina 100 y 200 nM.

Toxina CgNa extraída de la anémona Condylactis gigantea 10 μM.

Sustitutos de NaCl extracelular: Cloruro de colina y LiCl.

VI. 4. Se emplearon las siguientes estrategias para evidenciar la corriente de KNa:

Se sustituyó NaCl por Cloruro de colina extracelularmente para

conocer si en un registro de corrientes totales, alguna corriente saliente era

afectada por la eliminación de Na+.

Se aplicaron 100 nM y 200 nM de TTX para bloquear los canales

de Na+ dependientes de voltaje y de este modo conocer si el influjo de Na+

a la célula, activaba una corriente dependiente de la concentración de Na+

intracelular.

En una solución sin Ca2+ extracelular, se realizaron registros

controles de corrientes totales y posteriormente se aplicó 100 nM de TTX

para conocer si a pesar de no encontrarse el Ca2+ en la solución una

corriente de K+ disminuía cuando el influjo de Na+ era bloqueado por la

toxina.

Se aplicó la toxina CgNa (Salceda y cols., 2007) ya que se ha

demostrado que hace más lenta la inactivación del canal de Na+

43

dependiente de voltaje incrementando significativamente la integral de la

corriente, por lo que al permanecer abierto el canal de Na+ por un tiempo

mayor, esperábamos que la amplitud de la corriente de K+ que depende de

Na+ aumentara.

Se utilizó ouabaína para bloquear la bomba Na+-K+, para

aumentar la concentración de Na+ intracelular y por consiguiente aumentar

la amplitud de la corriente de KNa.

Se sustituyó Na+ por Li+ en registro de fijación de voltaje y fijación

de corriente para determinar que la corriente de K+ era activada por Na+.

VI. 5. Análisis de datos Los registros se analizaron utilizando los programas computacionales, pClamp

versión 9.0, Excel y Sigma Plot versión 10.0. Se analizaron las corrientes en

condiciones control y cuando se utilizó alguna estrategia para evidenciar la

corriente de KNa.

En los registros de fijación de voltaje en la configuración de célula completa se

analizaron:

a) Corriente entrante y saliente al pico.

b) Corriente saliente en el estado estable.

c) Curvas corriente contra voltaje para corriente saliente medida al pico.

Los registros de corrientes totales donde se midió la corriente para cada voltaje se

muestran en la figura 6.1. La flecha indica donde se midió la corriente saliente al

pico para cada voltaje utilizado.

d) Curva de conductancia. Para calcular la conductancia iónica para el K+ (gion) se

utilizó la siguiente ecuación:

gK = KPRUEBA

K

EVI

−

donde IK es el valor de la corriente iónica a un paso de voltaje dado; Vprueba - EK es

la fuerza de conducción para el ión y EK es el potencial de equilibrio. Se calcularon

44

las conductancias normalizadas, las cuales fueron graficadas en función del

voltaje. A esos datos se les ajustó la siguiente función de Boltzmann:

⎟⎟⎟

⎠

⎞

⎜⎜⎜

⎝

⎛+

=−

s

VVgg

PRUEBA

K

21max

exp1

1

donde gmax es la conductancia máxima, V1/2 es el valor del potencial al cual ocurre

el 50% de la conductancia y s es la pendiente de la curva.

En los registros de fijación de corriente se midió:

Para calcular todos los parámetros mostrados se promediaron tres trazos para

cada condición experimental.

a) El potencial umbral se calculó derivando el potencial de acción respecto al

tiempo.

A los datos obtenidos se les aplicó la siguiente condición:

dv1 –dvt-1 > Media + 2 desviaciones estándar, siendo dv la derivada del voltaje.

b) La duración del potencial de acción se calculó realizando tres pasos:

El valor de amplitud fue multiplicado por 0.75menos el valor al pico.

Figura 6.1. Registro de corrientes totales utilizando la técnica de fijación de voltaje en la configuración de célula completa. Se muestra el sitio donde la corriente fue medida en cada uno de los registros. En A, corriente saliente al pico (círculo blanco), corriente saliente en el estado estable (círculo negro) y corriente entrante (flecha) la flecha muestra el sitio donde se medió la corriente entrante al pico. B, corriente saliente al pico (cuadrado blanco), corriente saliente en el estado estable (cuadrado negro) y corriente entrante (flecha punteada). La línea punteada indica el cero