Campylobacteriaceae

Mg. Benites Azabache Juan Carlos

Campylobacteriosis

Es una zoonosisEs una de las principales causas de gastroenteritis en el

mundo enteroPrincipales reservorios: animales de granja, que se infectan en

los primeros años de vida y la mayoría de ellos permanecen como portadores.

Principales vías de infección:Ingestión de carnes mal cocidas (principalmente aves de

corral, pero también cerdo, ganado bovino, etc.),leche no pasteurizadaagua u otros alimentos contaminados con excretas de

animales infectadoscontacto con mascotas.

Campylobacter

Pertenecen a la familia CampylobacteriaceaeBacilos gram negativos curvos en cultivos viejos adoptan formas esféricas o cocoides.Miden de 0,3 a 0,6 um de diametrooxidasa +No forman esporasMoviles por un flagelo polarNo-fermentativoLa mayoría de las especies son microaerofilicasCrecen bajo un atmosfera reducida en O2 y

concentraciones de 10 % de CO2

Especies de interés clínico

Se reconocen ahora 18 especies y subespecies; 13 se han asociado con enfermedades humanas.

Si bien varias especies de Campylobacter spp. fueron aisladas de muestras clínicas son pocas las reconocidas con rol patógeno

Especies Termófilas: Campylobacter jejuni principales Campylobacter coli enteropatógenos (aisladas fundamentalmenteCampylobacter lari de muestras intestinales)Campylobacter upsaliensis•Especies No Termófilas: (aislada fundamentalmente de muestras de

sangre)Campylobacter fetus

Factores de virulencia

EnterotoxinaEndotoxinaAdhesinasSupervivencia intracelularHabilidad para invadir células

Mecanismos por lo cual puede producir enfermedad:Adherencia intestinal de los organismos ingeridos y producción

de enterotoxinas induciendo diarrea secretoriaInvasión y proliferación dentro de la mucosa intestinal con daño

celular y respuesta inflamatoriaTraslocación extraintestinal en que los microorganismos cruzan

la mucosa intestinal y migran vía el sistema linfático hacia diferentes localizaciones.

Mayor número de casos se producen durante el veranoreservorio natural es el tracto intestinal de los animalesLa infección se adquiere por ingestión de alimentos o agua

contaminada o por contacto con animales infectados (aves o mamíferos)

Dosis infectiva aproximadamente 10³ microorganismos.

El período de incubación de 1 a 7 días (2-4 días)El microorganismo invade el epitelio e intestino delgado y se multiplica. La invasión produce una respuesta inflamatoria que puede ser

responsable de muchos de los síntomas.Los síntomas y signos de una enteritis por Campylobacter no se

diferencian de los producidos por otros patógenos entéricos y pueden ir desde una alteración gastrointestinal moderada que dura alrededor de 24 horas hasta una colitis fulminante similar a una colitis ulcerosa. Inicialmente el paciente tiene fiebre alta que puede durar hasta 2 días, malestar general, dolor de cabeza, escalofríos, náuseas y calambres abdominales. Estos síntomas son seguidos por una diarrea acuosa profusa con aparición de sangre en materia fecal 2 ó 3 días después. La diarrea aguda dura 2 a 3 días y todo el proceso tiene una duración de 1 semana.

Preferentemente son afectados lactantes y niños menores de 2 años.Algunas de las complicaciones que se pueden presentar son:

megacolon tóxico, colitis pseudomembranosa, hemorragia intestinal masiva, adenitis mesentérica y apendicitis en niños y adolescentes; la gravedad de la infección depende de la dosis ingerida. También se informaron infecciones del tracto urinario y asociación con el síndrome de Guillain-Barré.

C. fetus se asocia con septicemia y diseminación a múltiples órganos.

Recolección y transporte de Muestras

Las muestras de materia fecal son las adecuadas. Si las muestras no se van a procesar antes de las dos horas, se deben colocar en un medio de transporte como Campy-Tio o Cary-Blair. Cuando las muestras en Cary-Blair no se procesan inmediatamente se deben

guardar en la refrigeradora; a 4 ºC la bacteria permanece viable hasta 3 semanas.

DETECCIÓN DIRECTA EN MUESTRA DE HECESMicroscopía de campo oscuro o de contraste de fases.Coloración de Gram, pero usando carbol-fucsina o fucsina básica.Coloración de Vago.

La detección microscópica por observación de BGN curvados está siendo usada con buenos resultados: hasta 94% de sensitividad y hasta 99% de especificidad.

La presencia de leucocitos en heces indica una alta probabilidad de patógenos enteroinvasivos, pero su ausencia no descarta la infección por Campylobacter.

CULTIVO Y AISLAMIENTO

El aislamiento de Campylobacter spp. puede hacerse de 2 maneras:

por filtración o mediante el uso de medios selectivos.

En países industrializados para la detección de Campylobacter a partir de heces, se utilizan diferentes métodos como cultivo, ELISA y PCR.

MEDIOS DE CULTIVO

Selectivos :Charcoal Cefoperazone Deoxycolate Agar (CCDA)Butzler AgarBlaser Agar

Filtración con medios no selectivos :Agar (Brucella agar, TSA o BHIA,etc)+ sangre (carnero o caballo) +

filtro 0.45 mu

Necesitan una atmosfera de microaerofilia con CO2La temperatura óptima de incubación es 42ºC durante 48

horas; aunque también crecen a 37ºC Las colonias visibles aparecen generalmente después de 24-

48 horas aunque a veces desarrollan después de 72-96 horas de incubación.

Las colonias pueden ser ligeramente aplanadas con bordes irregulares cuando la humedad del medio disminuye las colonias pueden ser

convexas con bordes enteros, transparentes de 1-2 mm de diámetro como gotas de rocío; con mayor incubación se vuelven parduzcas con el centro opaco.

IDENTIFICACIÓN EN CULTIVO

Dependiendo del medio usado, de las condiciones del medio, las colonias pueden tener diferente apariencia. Los Campylobacter son grises, irregulares y tienden a extenderse. Cuando hay una prolongada exposición al aire en los cultivos, las células tienden a ponerse esféricas o cocoides y se hace difícil su identificación.Métodos no culturalesPruebas inmunológicas, detectan C.jejuni y/o C. coli (ID Campy y

Campyslide)

RNA Campylobacter, detecta C. jejuni jejuni y doyle, C.lari y C.coli, es muy sensitivo (Accuprobe)

ELISA para detectar antígeno directo de hecesPCR, método evaluado para detección directa de Campylobacter

en muestra de heces

PRUEBAS DE IDENTIFICACIÓN A PARTIR DE CEPAS

Pruebas Fenotípicas : Oxidasa, catalasa, hidrólisis del hipurato y del indoxil acetato, reducción de

nitratos, producción de H2S, sensitividad a Cf y NA, y el estudio de crecimiento a diferentes Tº.

Pruebas Genotípicas : Métodos moleculares basados en el polimorfismo de ciertos genes. PCR y

RFLP

Esquema de Biotipificación para Campylobacter jejuni, coli y lari

+ + + + - - - -

- - + + - - + +

- + - + - + - +

IV

laricolijejuni

I II I III II III

Test rápido del H2S

Hidrólisis del DNA

Hidrólisis del Hipurato

BIOTIPOS

SISTEMAS DE TIPIFICACIÓN EPIDEMIOLÓGICA

SEROTIPIFICACIÓN

Esquema de Penner : Basada en antígenos “O” (Lipopolisacáridos)Esquema de Lior : Basada en heat labile antígeno Son los sistemas más comunes de serotipificación.Una combinación de serotipificación y métodos moleculares (RFLP)

deberían ser usados para la investigación de vigilancia y brotes.

SISTEMAS DE TIPIFICACIÓN EPIDEMIOLÓGICA

SEROLOGÍA Puede ser usada en el estudio de Epidemiología de infección por

Campylobacter, pero su rol en el diagnóstico de Campylobacter enteritidis es limitado. Los niveles de IgG, IgM e IgA se elevan en respuesta a la infección por Campylobacter. La sensitividad y especificidad varía de acuerdo a la población

Tratamiento

En la gastroenteritis, la infección es autolimitada y se trata con reposición de líquidos y electrólitos.

La gastroenteritis grave y la septicemia se tratan con eritromicina, tetraciclinas o quinolonas.

Vacunas contra Campylobacter

Vacunas:Célula completa muerta Ha sido obstaculizada, pues muchos serotipos han demostrado

contener ácido siálico cuya estructura semeja al GM1. Célula completa muerta+LT(adjuvante), es una elección contra el

desafío homólogo,pero no contra múltiples serotipos de C. jejuni.Una sola proteína, construcción recombinante : P-flaA Sin similitudes antigénicas que induzcan GBS.

Helicobacter pylori

Desde su cultivo en 1983 ha recibido diferentes denominaciones hasta adquirir el nombre definitivo:

CLO (Campylobacter like organism). GCLO (Gastric Campylobacter like organism). Campylobacter pyloridis. Campylobacter pyloric. Campylobacter pylori. Helicobacter pylori: (1989) especie tipo de un nuevo género,

Helicobacter.

Las especies del género Helicobacter se han dividido en las que viven en el estómago y las que viven en el intestino tanto del hombre como de animales.

EspeciesFlagelos

Huésped habitual AsociaciónNúmero Tipo a

Gástricas        

bH. pylori

(especie tipo)

4-8 Up/Bp Hombre Gastritis crónica activa; fuerte asociación con úlcera péptica y cáncer gástrico

H. mustelaeH. nemestrinaeH. acinonyx

4-84-84-8

Bp,LUp/BpUp/Bp

HuronesMacacoLeopardo

No patología, a veces gastritis y ulceraciónNo patologíaGastritis

H. felisH. bizzozeroniiH. salomonisbH. heilmannii

14-2010-205-7> 9

Bp,FBpBpBp

Gato, perroPerroPerro¿Gato y perro?

No patología/a veces gastritis¿No patología?¿No patología?Gastritis crónica activa (no común en hombre) ¿gastritis en gatos y perros?

Intestinales        

bH. cinaedi

bH. fennelliae

bH. canis

bH. westmeadii

1-21-221

Up/BpUp/BPBpUp

Hámster?Perro?

No patología en hámster; proctocolitis en hombres homosexualesProctocolitis en hombres homosexuales¿Enteritis, hepatitis?Aislado de un niñoBacteriemia en hombres con SIDA

bH. pullorum

H. pametensis

12

Up (noE)Bp

PolloGaviotas, cerdo

¿Hepatitis vibrionica? ?

H. cholecystusH. hepaticusH. bilisH. rodentiumH. muridarumH. trogontumb"Flexispira rappini"

123-14210-145-710-20

UpBpBp,FBp (noE)Bp,FBp,FBp,F

HámsterRatonesRatonesRatonesRoedoresRataOvejas, ratones

Colangiofibrosis, pancreatitisHepatitis; coloniza en ciego y colonHepatitis; coloniza en ciego y colon?No patología, puede colonizar en estómago y causar gastritis en roedores viejosNo patología conocidaAbortos ovinos; ha sido aislado de pacientes con diarrea crónica

LEYENDA:a Up: unipolar, Bp: bipolar, L: lateral, F: fibrillas periplásmicas, (noE): no envainadosb infecciones en el hombre

Helicobacter pylori se puede observar en forma de bacilos curvados o espirales cuando se encuentran en la mucosa gástrica, aunque algo más rectos cuando se encuentran en medios de cultivo artificiales.

Helicobacter pylori (Hp) existe en dos formas: una forma espiral cultivable y una forma cocoide. Ambas pueden encontrarse en el estómago y en el duodeno, aunque la mayoría presentan la morfología bacilar espiral. La forma cocoide prácticamente no se adhiere a las células epiteliales y, además, tampoco es capaz de inducir la producción de interleucina 8.

La conversión morfológica de la forma espiral a la forma cocoide se ha descrito en Hp cultivado bajo diversas condiciones adversas: aerobiosis, pH alcalino, alta temperatura, incubación prolongada, tratamiento con inhibidor de la bomba de protones o antibiótico, óxido nítrico, etc.

Como el modo de transmisión de Hp aún se desconoce, se especula con la posibilidad de que la forma cocoide sea una forma de resistencia, capaz de soportar las condiciones adversas que encuentra Hp en el medio ambiente, y reversible a la forma espiral en el momento en que se vuelvan a dar las condiciones óptimas.

Diversos resultados de distintos estudios apuntan a favor o en contra de esta teoría.

El hecho de que cuando Hp se encuentra en cultivo durante tiempo prolongado se produzcan cambios degradativos en su composición (baja la cantidad de ADN, ARN, ATP, proteínas inmunogénicas) y cambios en las propiedades de la superficie de la membrana (aumenta la hidrofobocidad), apuntan a que la forma cocoide es manifestación de la muerte de Hp.

Sin embargo el ADN no se encuentra fragmentado, es decir, puede teóricamente ó conservar la información genética que le da la capacidad de pasar otra vez a la forma espiral, siendo así una forma viable. Aunque lo cierto es que numerosos intentos de cultivar la forma cocoide han fracasado, lo que ha llevado a denominar a la forma cocoide como "forma viable pero no cultivable" de Hp.

Ureasa – Facilita la supervivencia en el estómago por disminución del pH, y el NH4+ y los productos finales pueden causar daño e inflamación

Mucinasa –degrada la mucosa gástrica, exponiendo al epitélio gástrico a los ácidos del estomago

La estructura espiral - le permite introducirse a través de la capa de moco gástrico actuando de forma similar a un sacacorchos.

La movilidad. H. pylori posee de 4 a 6 flagelos polares que le confieren una gran movilidad y le permiten llegar a la mucosa y no ser eliminado por los mecanismos defensivos del huésped.

Las adhesinas. Posee una gran variedad de adhesinas que reconocen de forma específica a los receptores de la mucosa gástrica y se unen a ellos comenzando la colonización bacteriana. (genes, hpaA e iceA)

La toxina vacuolizante. produce la formación de grandes vacuolas en las células eucarióticas. aquellos que poseen la toxina se han asociado con cuadros más graves de enfermedad. La toxina está codificada por un gen denominado vacA que está presente en todos los aislamientos, produzcan o no la toxina, aunque la secuencia del gen parece ser diferente.

La proteína CagA. Se ha descrito la presencia de una proteína codificada por el gen cagA que podría estar implicada en el proceso de activación de la toxina vacuolizante (cagA= gen asociado a citotoxina). La presencia de esta proteína podría influir en la respuesta inflamatoria y aumentar la secreción de interleuquina. Algunos autores han observado una clara diferencia en cuanto al proceso de enfermedad que se produce cuando se trata de una cepa cagA+ o cagA-, sin embargo, para otros autores la diferencia no es tan importante.

El gen cagA se encuentra localizado en una región del cromosoma que se conoce como Isla de patogenicidad (PAI).

Factores de virulencia

Manifestaciones clínicas

Enfermedades digestivas Está asociado a gastritis, úlcera péptica, dispepsia no

ulcerosa, cáncer gástrico y linfoma gástrico tipo MALT.

Manifestaciones extradigestivas Entre éstas se incluyen manifestaciones cardiovasculares

(aterosclerosis, cefalea primaria, fenómeno de Raynaud primario), de piel (rosacea, alopecia areata, urticaria idiopática crónica), autoinmunes (Síndrome de Sjögren, neuropatía isquémica óptica anterior no arterítica), hepáticas (encefalopatía hepática) y respiratorias (bronquitis crónica, asma bronquial, cáncer de pulmón).

Diagnóstico

Existen diferentes métodos para diagnosticar la infección producida por H. pylori. Los métodos pueden diferenciarse según el tipo de muestra que se utiliza, si requieren o no la endoscopia (agresivos o no agresivos) y a la forma de detectar el microorganismo (directamente la propia bacteria o de forma indirecta).

DIRECTOS AGRESIVOS

Cultivo:Es necesario para la identificación definitiva de H. pylori, para determinar la sensibilidad a los antimicrobianos utilizados para su erradicación y también para caracterizar o tipar estas bacterias. Imagen de cultivo de H. pylori.

Histología:Ofrece información sobre la densidad de la colonización de H. pylori, la gravedad de la gastritis, y la presencia de leucocitos polimorfonucleares, metaplasia y/o de atrofía.

Técnicas moleculares: .Permiten detectar el ADN de H. pylori de diferentes tipos de muestras. Sirven también para la búsqueda de posibles factores de patogenicidad, la presencia de mutaciones en los genes que codifican la resistencia a los antimicrobianos y las posibles infecciones mixtas por diferentes cepas de H. pylori en el mismo paciente.

UREASA RÁPIDAPermite detectar la presencia de la ureasa de H. pylori,

directamente de la biopsia en poco tiempo.

DIRECTOS-NO AGRESIVOS

Aplicadas a muestras obtenidas de forma menos agresiva que la endoscopia como jugo gástrico:

Técnicas moleculares: .jugo gástrico, saliva o heces (en investigación). La mayoría de los estudios indican que el ADN de Helicobacter pylori se puede encontrar en la cavidad oral o en las heces

Antígeno en heces: . La detección del antígeno en heces es un método en investigación que parece presentar una muy buena sensibilidad y especificidad y sería un método no agresivo para detectar la infección por H. pylori.

INDIRECTOS-NO AGRESIVOS

Prueba del aliento con urea (UBT): .Se basa en la capacidad que tiene H. pylori de hidrolizar urea gracias a su ureasa. Después de ingerir urea marcada, con carbono 14 o con carbono 13, se puede medir la cantidad de CO2 marcado liberado, que se producirá cuando el paciente está infectado con H. pylori.

Serología:Permite detectar la presencia de anticuerpos anti-H. pylori en el suero de los pacientes (ELISA, Inmunoblot)

Cultivo

Condiciones de transporte

El transporte de la biopsia desde la sala de endoscopias hasta el Servicio de Microbiología se puede realizar de dos formas:

Se puede colocar la biopsia en la pared de un tubo estéril que contenga 1ml de solución salina para evitar la desecación de la biopsia. Se puede utilizar cuando el tiempo que transcurre desde que se toma la muestra hasta que se siembra es de menos de 4 horas.

Se puede colocar la biopsia dentro de un medio de transporte

Condiciones de cultivo

Es una bacteria exigente y necesita: Una atmósfera adecuada, microaerofílica, con una baja concentración de oxígeno y alta concentración de anhídrido carbnico (5-10%).    Un medio de cultivo rico en nutrientes y que contenga sangre de carnero, caballo o humana o productos derivados de la sangre

Un periodo de incubación extraordinariamente prolongado(de 7 a 10 dias a 35º) comparado con el resto de las bacteria Gram negativas.

Cuando esta bacteria crece en los medios de cultivo se observan como colonias pequeñas, brillantes y transparentes.   Se recomienda la utilización de un medio selectivo para evitar la contaminación con otros microorganismos.   H. pylori puede conservarse, una vez crecido en un congelador a -80ºC o en nitrógeno líquido.   El transporte de los microorganismos ya crecidos entre diferentes centros, puede realizarse mediante transporte urgente sin atmósfera especial

Características bioquímicas

Ureasa:Es una enzima capaz de hidrolizar la urea produciendo amonio y como consecuencia se produce una alcalinización del ambiente próximo. Esta característica puede detectarse en el laboratorio mediante el cambio de color (rosa) que se produce al variar el pH del medio que contiene urea.   Catalasa:Es un enzima capaz de descomponer el agua oxigenada y convertirla en agua liberando oxígeno. Esta liberación de oxígeno se observa visualmente como producción de burbujas.   Oxidasa: Es un enzima capaz de oxidar un determinado sustrato formando un compuesto coloreado (púrpura) en presencia de oxígeno.

Tratamiento

Compuestos no antibióticos: Sales de bismuto. Inhibidores de la bomba de protones de las células parietales

gástricas (Omeprazol, Lansoprazol, Pantoprazol, Rabeprazol). Antagonistas de los receptores H2 (Ranitidina, Famotidina,

cimetidina). Ranitidina citrato de bismuto (RBC).

Antibióticos: Betalactámicos: Amoxicilina. Macrólidos: Azitromicina, Claritromicina y Roxitromicina. Nitroimidazoles: Metronidazol, Tinidazol. Tetraciclina.