CALIDAD MICROBIANA DE VEGETALES FRESCOS DISTRIBUIDOS BOGOTA, D.C

ADRIANA CAROLINA DIAZ TOBAR

UNIVERSIDAD DE LOS ANDES

FACULTAD DE CIENCIAS DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

PROGRAMA DE MICROBIOLOGIA OPCION DE MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS E INDUSTRIA

BOGOTA, D.C 2004

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CALIDAD MICROBIANA DE VEGETALES FRESCOS DISTRIBUIDOS BOGOTA, D.C

ADRIANA CAROLINA DIAZ TOBAR

TRABAJO DE MONOGRAFIA COMO REQUISITO PARCIAL PARA OPTAR AL TITULO DE OPCION

EN MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS E INDUSTRIA

DIRECTORA MARIA CONSUELO VANEGAS

UNIVERSIDAD DE LOS ANDES FACULTAD DE CIENCIAS

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLÓGICAS PROGRAMA DE MICROBIOLOGIA

OPCION EN MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS E INDUSTRIA BOGOTA, D.C

2004

NOTA DE ACEPTACION MARIA CONSUELO VANEGAS Directora Trabajo de Monografía Microbióloga. Laboratorio de Ecología Microbiana de Alimentos LEMA. Docente Departamento de Ciencias Biológicas UNIANDES. NOHORA DE SANCHEZ Coordinadora del programa de Microbiología Microbiologa. Departamento de Ciencias Biológicas UNIANDES.

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AGRADECIMIENTOS

Mis más sinceros agradecimientos a las personas que hicieron posible este trabajo. En primer lugar a Dios, por darme la sabiduría y fortaleza para realizarlo, a mi mami por su apoyo incondicional. Agradezco de corazón a la Directora, María Consuelo Vanegas por su apoyo, comprensión y paciencia en los momentos difíciles, a la profesora Isabel de Pico por su colaboración y orientación incondicional, y Johanna Rojas por su dedicación y apoyo en todo momento. A mis amigos de carrera y compañeros de laboratorio por su apoyo Janet Paola Vergara, Clemencia Casas y Juan Camilo Molina. Todas aquellas personas que de una y otra forma colaboraron en la culminación de este proyecto.

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TABLA DE CONTENIDO

PAGINA INTRODUCCION 2 OBJETIVOS 3 3. MARCO TEORICO 4 3.1 HORTALIZAS Y PRODUCTOS DE HORTALIZAS 4 3.1.1 Microflora inicial 5 3.2 EFECTOS DE LA RECOLECCION, DEL TRANSPORTE, DEL TRATAMIENTO

Y DEL ALMACENAJE SOBRE LOS MICROORGANISMOS 7 3.2.1 Patógenos 10 3.2.1.1 Shiguella y Salmonella 11 3.2.1.2 Yersinia 11 3.2.1.3 Escherichia coli11 3.2.1.4 Listeria monocytogenes12 3.2.1.5 Bacillus 12 3.3 CONTROL12 4. MATERIALES Y METODOS 14 4.2 MUESTREO 15 4.3 METODOLOGIA15 4.3.1 Método para Salmonella15 4.3.2 NMP para coliformes totales17 4.3.3 Método para la búsqueda de Bacillus cereus18 4.3.4 Método para la búsqueda de Enterococcus 19 5. RESULTADOS Y DISCUSION 21 5.1 Salmonella 21 5.2 Enterococcus 22 5.3 Bacillus cereus23 5.4 Coliformes totales24 CONCLUSIONES BIBLIOGRAFIA

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JUSTIFICACIÓN

El consumo de verduras mínimamente procesadas, listas para el consumo, se ha incrementado notoriamente en nuestro país y en el mundo, por ejemplo en Estados Unidos la venta de ensaladas empaquetadas

superó los 1.600 millones de dólares en 1999. En la actualidad, la falta de tiempo ha tenido como consecuencia el incremento del consumo de este tipo de productos denominados de “cuarta gamma”que son imprescindibles en un dieta equilibrada y saludable, la industria alimentaria, ha hecho llegar a los establecimientos comerciales hortalizas y verduras frescas, limpias, troceadas, lavadas, envasadas y listas para procesar o para consumo directo en forma de ensaladas. Son alimentos frescos, que aúnan a ese factor clave de la comodidad una duración aceptable y una satisfactoria calidad sensorial. Para mantener sus cualidades organolépticas (sabor, textura, color…), sanitarias y nutricionales estos productos, (con caducidad aproximadamente de siete días), requieren un estricto cuidado de la cadena de frío (entre 1ºC y 4ºC) desde el momento de su recolección hasta el de su consumo. Por tal motivo, la proliferación microbiológica (tanto patógenos como microorganismos que alteran el producto) debe ser minimizada y retardada. Es primordial determinar la calidad microbiológica de este tipo de productos, teniendo en cuenta que dentro de la economía, uno de los sectores con más fuerza, es la industria alimentaria, en Colombia representa más del 27% del total de la producción industrial (fuente tomada del DANE). A nivel mundial es importante la seguridad e inocuidad de los alimentos, ante el surgimiento de nuevos microorganismos, que atentan contra la salud del consumidor, y que a su vez son un factor importante para productores y fábricas de alimentos, esto lleva a que se desarrollen nuevas tecnologías, estrategias, y la optimización de nuevos procesos para garantizar la calidad e inocuidad de los alimentos, con el fin de evitar que estos se conviertan en un riesgo para la salud de la comunidad en general.

En Colombia, es limitado el número de estudios realizados con vegetales, ensaladas y germinados, por parte de entidades públicas y privadas, es fundamental tener conocimiento sobre los microorganismos involucrados con este tipo de alimentos, para mejorar la calidad de vida del consumidor y así mismo poder contar con una normatividad, que cubra este tipo de productos, ya que actualmente no se cuenta con esta, por lo cual proveedores, productores y comercializadores de este tipo de alimentos tienen sus normas internas para establecer sus propios parámetros de aceptación de calidad .

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OBJETIVOS

GENERAL

Estudiar la calidad microbiológica de vegetales frescos semillas germinadas y ensaladas listas para el consumo, distribuidos en supermercados y plazas de mercado en la ciudad de Bogotá, D.C. ESPECIFICOS

- Obtener la información importantes para el análisis de riesgos de vegetales, semillas germinadas y ensaladas listas para el consumo.

- Realizar recuento de coliformes totales como indicadores de calidad utilizando el método de

NMP. - Detectar, aislar e identificar Salmonella spp.

- Hacer recuento, aislar e identificar Bacillus cereus.

- Hacer recuento, aislar e identificar Enterococcus

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3. MARCO TEORICO

3.1 HORTALIZAS Y PRODUCTOS DE HORTALIZAS

Una hortaliza es el componente comestible de una planta que incluye hojas, tallos, raíces, tubérculos, bulbos, flores y semillas. Con excepción de determinadas semillas, los tejidos vegetales son pobres en proteína. Los principales componentes son el agua, fibra, almidón, algunas vitaminas, minerales y algunos lípidos. Las hortalizas y las verduras son una de las fuentes principales de nitratos en la dieta humana, especialmente la lechuga, y la espinaca. En general, el pH del tejido vegetal está comprendido en la escala 5-7. La composición general y el pH son muy favorables, si existe la humedad adecuada, es de esperar el crecimiento de numerosas especies microbianas (30).

En su mayoría, todas las hortalizas en su estado natural son sensibles a la alteración por microorganismos, con una rapidez que depende de varios factores intrínsecos y extrínsecos. La conservación de las materias vegetales se consigue por desecación, por salado, por congelación, por refrigeración, por enlatado, por fermentación, por irradiación, y por envasado al vacío o en atmósferas modificadas. Los tratamientos modifican la flora, el medio, o ambos, de modo que prolongan la estabilidad del alimento (30).

Las hortalizas crudas en buen estado, mantienen menos el crecimiento de los microorganismos de la intoxicación alimentaria. Pueden mantener el crecimiento de patógenos una vez la integridad de las células ha desaparecido por la marchitez, por el envejecimiento o por una lesión tal como el cortado, el desmenuzado, el machacamiento o la extracción del jugo. Sin embargo, a no ser que se empleen condiciones protectoras, como el envasado en atmósferas modificadas, las hortalizas están sometidas rápidamente a la alteración cuando desaparece la integridad celular , y esto reduce la posibilidad del consumo (30). En la actualidad el uso de vegetales listos para el consumo y la agricultura orgánica ha incrementado la frecuencia de enfermedades transmitidas por esta vía debido al potencial de contaminación de microorganismos patógenos a lo largo de la cadena de producción “de la granja al tenedor”. Fuentes de

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contaminación precosecha incluyen heces, suelo, agua de irrigación, abono, aire animales silvestres o domésticos y manipulación. (6, 58) Los brotes de enfermedad humana debidos a la transmisión de microorganismos patógenos suelen ser consecuencia de la contaminación del producto por el uso de aguas residuales sin tratar o de estiércol, de agua contaminada para la refrigeración o para el lavado, o consecuencia de la manipulación no higiénica. Los microorganismos patógenos, los virus y los parásitos son capaces de sobrevivir durante meses o años en el cieno de las aguas residuales y en la tierra, o sobre las hortalizas (30).

Con más frecuencia, los alimentos cultivados orgánicamente son mas apreciados. Los materiales orgánicos usados para regenerar la tierra constan de algunas partes de una sustancia que antaño tuvo vida, sea un producto animal, vegetal o un producto metabólico de las plantas. El uso de estiércoles animales naturales, de residuos de cosechas y de compost como abonos de las plantas o como acondicionadores de la tierra, sin conservantes, es probable que aumente la carga de patógenos en los alimentos orgánicos “comercializados” (2).

3.1.1Microflora inicial

La tierra, el agua, el aire, los insectos y los animales, contribuyen todos ellos en la microflora de las hortalizas, pero su importancia relativa como orígenes de la microflora difiere con la entidad estructural de la planta: por ejemplo las horas tienen mayor exposición al aire, mientras que los cultivos de raíces tienen mayor exposición a la tierra. Las actividades humanas son importantes, por ejemplo el uso de pesticidas para controlar los insectos puede limitar la diseminación de los microorganismos. El cultivo tanto manual como mecánicamente, introduce y/o distribuye microorganismos en nichos ecológicos en los cuales anteriormente no existían, y la introducción de material de restos humanos o de otros animales en la tierra o en el agua tiene un impacto evidente en la flora microbiana de las hortalizas (30). Los microorganismos presentes en las hortalizas frescas proceden de la tierra, del aire, y del agua, las Pseudomonas y Erwinia carotovora son responsables en gran parte de la alteración bacteriana de las

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hortalizas. Otros saprofitos incluyen corineformes, bacterias acidolácticas, esporógenos, coliformes y micrococcos. (19)

Generalmente las hortalizas frescas que no han estado expuestas a material de residuos humanos o de otros residuos de animales no contienen patógenos animales ni humanos, con excepción de aquellos que de modo natural existen en la tierra, en la materia vegetal en descomposición, etc. (por ejemplo, Bacillus cereus,

Listeria monocytogenes, Clostridium botulinum y Cl. perfringens). Sin embargo, el riego y el abonado de las cosechas vegetales con residuos humanos o animales pueden aportar los agentes etiológicos de la hepatitis infecciosa, de la fiebre tifoidea, de la shigelosis, de la salmonelosis, de la listeriosis, de la gastroenteritis vírica, del cólera, de la amebiasis, así como de otras enfermedades entéricas y parasitarias (30).

Las hortalizas crudas pueden ser cosechadas y enviadas directamente al mercado de venta al pormenor, o retenidas en almacenaje durante tiempos variables antes de la venta. Se pueden definir varios tipos de productos generales a base de hortalizas crudas o relativamente no tratadas (30). Las hortalizas crudas pueden no recibir tratamiento alguno o ser lavadas, seleccionadas y clasificadas antes de ser colocadas en bolsas, en cajas o en canastos. Las hortalizas recién cortadas se pueden preparar troceándolas, desmenuzándolas o pelándolas, etc., antes de ser presentadas para la venta; las hortalizas preparadas incluyen envases de un solo producto de hortalizas lavadas, hechas rodajas, troceadas o desmenuzadas y listas para comer, mezclas de ensaladas y ensaladas mixtas complejas, todas ellas sin aderezo; con frecuencia se comercializan en bandejas de poliestireno expandido o de PVC, envueltas con película tensada de PVC plastificado. Las ensaladas preparadas contienen tejido vegetal troceado, desmenuzado, o entero cocido, o tejido vegetal crudo, estos productos son perecedero y el almacenaje refrigerado es un factor importante en su estabilidad (30).

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3.2 EFECTOS DE LA RECOLECCIÓN, DEL TRANSPORTE, DEL TRATAMIENTO Y DEL ALMACENAJE SOBRE LOS MICROORGANISMOS

En las verduras crudas, la población microbiana está influida por varios factores. Además de la microflora inicial, las manos del personal que interviene en la recolección, en el recorte, en la selección, en la elección y en el envasado, y el material utilizado en estas operaciones, contribuyen en el número de microbios y su distribución en el producto. La recolección con frecuencia daña la hortaliza con el resultado de que: se liberan nutrientes que potencian el crecimiento microbiano; y se proporcionan puertas de entrada a los microorganismos de la alteración. Los recipientes y los vehículos utilizados para el transporte pueden ser otro origen de microorganismos. El lavado puede ser perjudicial en el sentido de que el agua residual permitirá la multiplicación de los microbios residentes. Cuando la hortaliza llega a los comercios de venta al por mayor y de venta al por menor se manipulan de nuevo, entonces es posible que sea desenvuelta, recortada, humedecida de nuevo, reenvasada y expuesta para la venta. Todo esto se puede realizar bajo la refrigeración adecuada y con la atención conveniente a la higiene, o en ausencia de cualquiera de las dos o de ambas. Algunas hortalizas se pican en trocitos o se desmenuzan para la inclusión en ensaladas de alimentos finos. Los microorganismos se multiplican con mayor facilidad en la hortaliza picada en trocitos, debido a la mayor disponibilidad de nutrientes y agua. La manipulación adicional de la hortaliza proporciona la oportunidad de contaminación que proviene del manipulador o de las superficies de corte o de utensilios que con anterioridad estuvieron expuestos a otras materias alimenticias (74). La humedad suficiente, la temperatura apropiada, y el tiempo conveniente garantizan un aumento continuo en la población bacteriana, aunque resulta difícil valorar la magnitud del cambio en la carga microbiana durante estas manipulaciones (30).

Los microorganismos predominantes en las hortalizas crudas sanas suelen ser bacterias (35). Los microorganismos de la alteración pueden encontrarse en la planta, en el campo, o pueden ser introducidos durante la recolección y transporte. En el campo, casi todas las podredumbres de las hojas son causadas por bacterias, por ejemplo, Pseudomonas chichorii, Ps. marginalis y Erwinia carotovora (27, 52, 72, 46, 40). Las bacterias son responsables de aproximadamente la tercera parte de las pérdidas totales por alteración microbiana de las hortalizas (8). Esta alteración puede ser debida a bacterias que causan podredumbres blandas y otras podredumbres, manchas, tizones y agostamientos. Las putrefacciones blandas, que

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aparecen durante el transporte y almacenaje, generalmente son producidas por coliformes, por Erwinia

carotovora y por determinadas Pseudomonas, por ejemplo Pseudomonas fluorescens. Los microorganismos que producen alteración que no es podredumbre blanda incluyen corinebacterias, Xanthomonas y Pseudomonas (8). La contaminación por microorganismos de la putrefacción blanda con frecuencia se produce en el campo, pero también se ha informado de la invasión del tejido de la planta después de traumatismos inducidos por el subsiguiente transporte y almacenaje (39).

Un estudio de hortalizas frescas puso de manifiesto una gran diversidad de poblaciones, los niveles de contaminación por Enterobacteriaceae, eran muy bajos, después de almacenaje durante 6 días a 4 y 20ºC,

los recuentos de coliformes fueron <100 y 1x106 /g , respectivamente (43).

La podredumbre blanda, por cuya causa la mayoría de las hortalizas frescas cortadas se deterioran, fue investigas en ensaladas frescas listas para comer que habían sido lavadas, peladas, cortadas en rodajas o en tiras, envasadas, almacenadas a temperatura por debajo de 10ºC y vendidas en un plazo de 8-10 días. El deterioro fue debido principalmente a Pseudomonas pectinolíticas fluorescentes (P. marginalis). Existe una relación evidente entre los niveles de Pseudomonas marginalis (que abunda en las hojas de las plantas) inoculada en las ensaladas y la vida de almacén Erwinia herbicola fue el segundo organismo aislado con más frecuencia (50).

En instalaciones que preparaban ensalada con lechuga, la microflora predominante estaba constituida por bacilos gram negativos, principalmente Pseudomonas spp. En las hortalizas picadas en trocitos, algunas especies microbianas se multiplican rápidamente. Por ejemplo, al final de su vida de almacén a 7-10ºC, las hortalizas preparadas tenían recuentos de Pseudomonas spp y de bacterias acidolácticas de más de 108 /g (9). En estos productos, las bacterias gram negativas son una importante causa determinante de la vida de almacén a temperaturas bajas (41).

Los brotes de semillas, que incluyen la alfalfa, y las raíces chinas, generalmente se consumen crudos por su valor útil de nutrición y por su sabor, son considerados como alimentos saludables porque ellos son bajos en grasa y calorías, además son ricos en fibra (36). La alfalfa es comúnmente encontrada en ensaladas de barra y, al igual que otros germinados, a menudo se consume cruda o cocida brevemente. La alfalfa y algunos

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germinados han sido reportados por presentar niveles relativamente altos de microorganismos. Patterson y Woodburn reportaron conteos de aerobios y coliformes totales de 108 y 106 UFCl/g respectivamente (67, 53). Durante la producción de germinados, la semilla se mantiene entre 20-24ºC en un ambiente con humedad constante (49). Se sabe que estas condiciones favorecen el crecimiento de Salmonella spp., permitiendo poblaciones entre 6-7 log10 UFC/g, cuando la alfalfa ya está madura contiene desde 3.32 log10 UFC/g. Las condiciones de crecimiento húmedo y caliente necesarias para la germinación de las semillas, más la disponibilidad de carbohidratos y otros nutrientes en la envoltura de la semilla o en las semillas dañadas, estimulan el crecimiento microbiano (31).

Por tanto, los recuentos elevados de bacterias apatógenos no indican necesariamente un problema de salud pública, o una falta de calidad. Sin embargo, también existe una posibilidad real de que los niveles bajos de microorganismos patógenos también se multipliquen y causen problemas (3, 10). En Finlandia, un brote de intoxicación alimentaria fue causado por Salmonella bovismorbificans en brotes de alfalfa (54). En los EEUU un brote de infecciones de Salmonella anatum fue relacionado con brotes de alfalfa, y en 1995 varias personas por los menos en 17 estados enfermaron como consecuencia de infecciones de Salmonella stanley

asociadas con el consumo de brotes de alfalfa (31). En 1988, las preocupaciones acerca de la inocuidad de los brotes de semillas llevó al Ministerio de Salud y seguridad Social de Inglaterra a aconsejar al público la ebullición de los brotes durante 15 segundos antes del consumo. Adicionalmente, los brotes de alfalfa y otros brotes han sido involucrados en brotes de la intoxicación alimentaria por Bacillus cereus (55)

Los tratamientos de las semillas bajo medidas sanitarias no siempre eliminan patógenos. Dentro de la microflora asociada a los germinados se encuentra una gran cantidad de gram negativos tales como Pseudomonas sp, Pantoea sp, Escherichia hermanii, Erwinia sp, Stenotrophomonas maltophila, Acinetobacter

sp, y Enterobacter pyrinus, entre otros (44).

Entre 1995-1999 se presentaron casos de enfermedades producidas por Escherichia coli O157:H7,

Salmonella spp., a causa del consumo de alfalfa cruda (49, 71), como resultado de esto, el gobierno de U.S. declaró que los germinados crudos, particularmente la alfalfa es un alimento de alto riesgo para la salud pública. La Food and Drug Administration (FDA) ahora recomienda que previo a la germinación, todas las semillas deben ser desinfectadas con lavado en solución de 20.000 ppm de hipoclorito de calcio. Sin

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embargo, este tratamiento solo permite retirar microorganismos patógenos de la superficie de la semilla, lo cual no garantiza la remoción de toda la contaminación (48), frente a esta problemática algunos estudios han demostrado que el uso de irradiación sobre las semillas no afecta el proceso de germinación, además la combinación de líquidos desinfectantes u otros agentes e irradiación puede dejar los germinados libres de riesgo. Se ha demostrado que la irradiación tiene alta efectividad sobre la población de B. cereus, Salmonella

spp., y E. coli. (57).

3.2.1 Patógenos más frecuentes en hortalizas

En años recientes se han reportado continuamente enfermedades asociadas con el consumo de frutas y vegetales frescos a nivel mundial (70). Los organismos patógenos de cuidado en vegetales frescos incluyen Salmonella spp, Campylobacter spp, y Yersinia enterocolítica (21) y Bacillus cereus (28) . Estos patógenos han sido detectados en frutas y vegetales frescos (14, 21, 29). Se han reportado enfermedades asociadas con el consumo de vegetales contaminados con Salmonella spp, y Yersinia enterocolítica (2)

En países como el nuestro donde se utilizan residuos animales como abono, sería de esperar la contaminación de las hortalizas por patógenos. Los cultivos de raíces y los cultivos de hojas y tallos de crecimiento lento están contaminados masivamente por usar efluentes de aguas residuales o agua de riego contaminada. En la mayoría de las hortalizas crudas, los tiempos de supervivencia correspondientes a coliformes, a patógenos bacterianos y a virus entéricos dependen de la humedad y de la temperatura y se prolongan significativamente más allá de la vida de almacén de los productos (26).

3.2.1.1 Shigella y Salmonella. Los brotes de shigelosis han involucrado a la lechuga en varios países (42, 16, 24, 33). Se ha aislado especies de Shigella spp, en hortalizas crudas y en ensaladas egipcias (61, 65).

En las hortalizas se ha detectado una serie de serotipos de Salmonella (20, 68, 69, 25, 32, 15). Ha habido brotes extensos de salmonelosis atribuibles a lechuga contaminada (6). También se ha encontrado Salmonella sp en una amplia gama de productos cultivados orgánicamente, que incluyen semillas, alfalfa y otros germinados (2).

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3.2.1.2 Yersinia En el 50% aproximadamente de las hortalizas crudas se han aislado serogrupos ambientales de Yersinia

enterocolítica, aunque los serugrupos que producen la enfermedad humana no fueron aislados (18). Se ha informado de porcentajes de contaminación por Yersinia enterocolítica del 3% en las ensaladas y del 43% en las hortalizas crudas (17). Este patógeno ha sido encontrado en mezclas de ensaladas de hortalizas (9).

3.2.1.3 Escherichia coli Las hortalizas crudas, especialmente la lechuga, han sido identificadas como causa frecuente de diarrea de los viejaros. La lechuga fue el origen de un brote de E. coli O157:H7 que afectó a más de 100 personas en Montana durante 1995. La sobrevivencia o el crecimiento de E. coli O157:H7 en lechuga hecha tiras no resultaron influidos por el envasado en atmósferas modificadas (6, 45 ).

3.2.1.4 Listeria monocytogenes Está muy difundida en la tierra y en el manto vegetal, donde puede persistir durante mucho tiempo por tanto, las hortalizas crudas son vehículos potenciales de la listeriosis humana (6). En Colombia se ha encontrado Listeria spp con una incidencia de 37% en aguas de riego de cultivos de repollo y lechuga en el municipio de Mosquera (13). En otro estudio en lechugas y repollos crudos se identificó L. monocytogenes con 10% y 20% de incidencia respectivamente. En repollos escaldados se aisló un 40% de L. monocytogenes. En repollos y lechugas en salsa vinagreta para ensalada no se encontró dicho patógeno (75). Estos estudios reflejan la importancia de hacer investigación en este tipo de productos, para obtener información sobre la calidad microbiológica de estos.

3.2.1.5 Bacillus Las hortalizas también han sido involucradas en la enfermedad alimentaria atribuida a patógenos esporógenos. Por ejemplo, la enfermedad alimentaria de Bacillus cereus, normalmente involucra al arroz, pero también han sido implicadas las ensaladas verdes. No se debe pasar por alto la posibilidad de que las hortalizas puedan ser portadores de patógenos oportunistas en circunstancias en las que pueden llegar a ser peligrosos. Por ejemplo, se ha sospechado que las hortalizas crudas se comportan como vehículos para introducir microorganismos como Pseudomonas aeruginosa y Klebsiella spp., en los ambientes hospitalarios

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donde su exposición a individuos que padecen heridas por quemadura o que se restablecen de una intervención quirúrgica es potencialmente peligrosa (30).

3.3 CONTROL DE MICROORGANISMOS EN HORTALIZAS

El control de microorganismos de la alteración en las hortalizas crudas requiere de técnicas para la limpieza y saneamiento del material y para el control del ambiente en el que se almacenan las hortalizas, sólo de esta manera se puede evitar un importante desarrollo microbiano. Por ejemplo, la cabeza de la lechuga rizada puede llegar al mercado con deterioro mínimo si las condiciones del cultivo y anteriores a la recolección son ideales, si la lechuga se cosecha y envasa cuidadosamente y se enfría rápidamente al vacío y se mantiene a 1-2ºC (59). La eliminación de las zonas dañadas o sucias de las hortalizas puede reducir el número de microorganismos y debe ser un primer paso en la recolección y preparación de las mismas. (1).

Por lo que se refiere a las hortalizas frescas cortadas, el daño de las células vegetales junto con las superficies de corte conduce a la reducción de la vida de almacén, si bien la puede prolongar el lavado cuidadoso para eliminar el contenido celular libre liberado por la operación de cortarlas, por ejemplo, la estabilidad de la lechuga cortada en tiras es influida por el método de la operación del cortado (7)

El uso de agua clorada a bajas temperaturas es el método que generalmente se usa para el lavado de este tipo de productos, el inconveniente es que sólo se logran inactivar los microorganismos de la superficie del producto como la lechuga. Estudios posteriores han demostrado que un tratamiento de lavado, efectivo para eliminar microorganismos en productos frescos como la lechuga es la combinación de ácido láctico con peróxido de hidrógeno al 2%, este método inactiva los microorganismos presentes en el alimento sin comprometer su calidad sensorial (11, 36, 51, 62, 63, 64). Para productos germinados como las raíces chinas y la alfalfa, la Food and Drug Administration (FDA), recomienda desinfectar las semillas con hipoclorito de calcio, para disminuir la presencia de microorganismos (73)

4. MATERIALES Y METODOS

4.1 MEDIOS DE CULTIVO

SS: Salmonella–Shiguella Agar (Laboratorios Merck, Darmstadt, Alemania). XLD: Xylose-Lysine-desoxicholate (BBL). Hecktoen: (Laboratorios Merck, Darmstadt, Alemania). Caldo Flurocoult LMX: (Laboratorios Merck, Darmstadt, Alemania). Agar m-enterococal: (Laboratorios DIFCO, Detroit, Michigan USA). Agar Bilis Esculina: (Oxoid Ltda. Basingstoke, Hampshire, England). Agar base selectivo de Bacillus cereus: (Oxoid Ltda. Basingstoke, Hampshire, England). Agua peptona estéril al 1%: (APE; Laboratorios Merck, Darmastadt, Alemania). Caldo Rapaport – Vassiliadis peptona de soya: (RVS; Oxoid Ltda.,, Basigntoke, Hampshire, Inglaterra). Sistema de identificación de Enterobacterias y otros bacilos Gram-negativos. API 20 E (bioMérieux, Inc). O.B.I.S Salmonella (Oxoid Ltda., Basigntoke, Hampshire, Inglaterra).

4.2 MUESTREO

Se tomaron 150 muestras de vegetales frescos y ensaladas listas para el consumo como espinacas, lechugas, ensaladas listas para el consumo, perejil, se incluyeron germinados como alfalfa y raíces chinas, exhibidos en supermercados y plaza de mercado ubicados en diferentes zonas de la ciudad de Bogotá D.C; algunas muestras con empaque, otras carente de este. El muestreo se llevó a cabo durante ocho semanas continuas. Las muestras luego de ser recogidas, se mantuvieron en refrigeración y procesadas una vez llevadas al laboratorio.

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Número de Muestras Producto

Supermercado Plaza

Alfalfa Raíz china Espinaca Lechuga Ensalada lista Perejil Total muestras

17 23 16 37 17 0

========== 110

0 2 9 25 0 4

========= 40

Tabla 1. Muestreo de vegetales frescos, semillas y ensaladas listas para el consumo

4.3 METODOLOGIA

4.3.1Método para la recuperación de Salmonella spp Se tomaron 25 gr de cada muestra, se agregaron a 225 ml de agua peptona estéril al 1% (APE; Laboratorios Merck, Darmastadt, Alemania), se incubó a 37ºC por 24 horas, se tomó 1 ml para inocular 10 ml de Caldo Rapaport-Vassiliadis Peptona de Soya (RVS; Oxoid Ltda.,, Basigntoke, Hampshire, Inglaterra). Se incubó a baño maría a 42ºC durante 24 horas, posteriormente se sembró por aislamiento en los medios de cultivo SS: Salmonella–Shiguella Agar (Laboratorios Merck, Darmstadt, Alemania). XLD: Xylose-Lysine-desoxicholate (BBL). Hecktoen: (Laboratorios Merck, Darmstadt, Alemania), se incubó a 37ºC por 24 horas. A las colonias sospechosas se les realizó el test O.B.I.S Salmonella (Oxoid Ltda., Basigntoke, Hampshire, Inglaterra). Posteriormente se identificaron con el Sistema de identificación de Enterobacterias y otros bacilos Gram-negativos. API 20 E (bioMérieux, Inc).

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PROTOCOLO PARA EL AISLAMIENTO DE Salmonella spp A PARTIR DE MUESTRAS DE ALIMENTOS Protocolo modificado de la norma ISO 6579 de 1993 tomado de METODOS DE ANÁLISIS MICROBIOLOGICOS (2002), Corrie Allaert Vandevenne y Marta Escolá Ribes.

] Enriquecimiento no selectivo

Enriquecimiento selectivo

I. Siembra en placa

Pesar 25 g de muestra

Adicionar la muestra a225 ml de caldo de pre-enriquecimiento APE(Agua de peptona buferada al 1%)

Incubar a 37°C +/- 2 x 24 hr.

Sembrar por aislamiento en un medio de cultivo para Salmonella sp. (SS, XLD, VB)

Incubar las cajas a 37°C x 24 hr.

Adicionar 1ml del preenriquecimiento a 10 ml de caldo de enriquecimiento selectivo (Caldo Rappaport)

Incubar a 42°C +/- 2 x 24 hr. BañoMaría

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II. Confirmación

4.3.2 NMP (Número Más Probable) para coliformes totales Se tomaron 10 gr de cada muestra, se agregaron a 90 ml de agua peptona estéril al 0.1% (APE; Laboratorios Merck, Darmastadt, Alemania), se realizaron diluciones de 10-1 10-2 y 10-3 . Se adicionó 1 ml de cada dilución en 10 ml de Caldo Flurocoult LMX (Laboratorios Merck, Darmstadt, Alemania). se incubó a 37ºC por 48 horas. La lectura de coliformes totales se realizó utilizando la tabla del NMP para aguas y para alimentos (series de tres tubos) (Tomado del Manual de Control de Calidad de Alimentos, FAO, 1976).

NMP PARA COLIFORMES TOTALES y E. coli EN MUESTRAS DE VEGETALES

Pasar 5 colonias sospechosas (3 H2S (+) y 3 H2S (-) a Mck por aislamiento (37°C +/- 2 x 24 hr).

Confirmar los cultivos L (-) con pruebas bioquímicas. (Urea, TSI, Fenilalanina). Incubar los tubos a 37°C +/- 2 x 18 -24 h.

Confirmar los cultivos negativos con API.

Pesar 10 g de muestra

Adicionar la muestra a 90ml de APE (Agua depeptona buferada al0 1%)

Hacer dilución 10-2, 10-3, 10-4 , respectivamente, en 9 ml de ADE

Prueba de NMP, adicionar 1 mlde cada dilución, por triplicado,en 10 ml de caldo LMX. Incubara 37ºC +/- 2 x 48hr.

Positivo para ColiformesTotales los tubos de colorazul. Revisar tabla NMP.

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4.3.3 Método para el aislamiento e identificación de Bacillus cereus. A partir de la dilución 10-1 se sembró en superficie 0.1 ml en Agar Base Selectivo de B. Cereus (Oxoid Ltda. Basingstoke, Hampshire, England). Se incubó a 37ºC por 48 horas. Se hizo el recuento de colonias color azul turquesa con bordes irregulares y halo opaco. Escogiendo tres colonias sospechosas se llevó a cabo su identificación con las pruebas bioquímicas de Nitratos, Voges Proskauer, Glucosa, Lecitinasa y Manitol. Se incubó a 37ºC por 24 horas.

RECUENTO DE Bacillus cereus EN MUESTRAS DE VEGETALES

0.1 ml

Pesar 10 g de muestra

Adicionar la muestra a 90 ml deAPE (Agua de peptona buferadaal 0.1%).

Dilución 10-1

Siembra en superficie con rastrillo estéril en Agar Base Selectivo de Bacillus cereus

Incubar a 37°C +/- 2 x 48 hr.

Hacer recuento de colonias color azul turquesa, bordes irregulares, con halo opaco

. .

.

22

IDENTIFICACIÓN DE Bacillus cereus PROVENIENTES DE MUESTRAS VEGETALES

4.3.4 Método para el aislamiento e identificación de Enterococcus. A partir de las diluciones 10-1, 10-2 y 10-3 se sembró en superficie 0.1 ml respectivamente en Agar m-enterococal (Laboratorios DIFCO, Detroit, Michigan USA) , se incubó a 37ºC por 48 horas. Se realizó el recuento de colonias color vinotinto, posteriormente se llevó a cabo la identificación escogiendo al azar varias colonias sospechosas, las cuales se sembraron en caldo BHI con azida, a 42ºC y 50ºC. Los tubos con crecimiento fueron sembrados en medio Agar Bilis Esculina, las colonias crecidas fueron identificadas como S.

faecium, y las que no crecieron en este medio se identificaron como S. faecalis.

Escoger 3 coloniassospechosas del medioAgar Base Selectivo deBacillus cereus

. .

Nitratos Voges Proskauer

Glucosa

Incubar a 37°C +/- 2 x 24 hr.

23

RECUENTO DE ENTEROCOCCUS EN MUESTRAS DE VEGETALES

1 ml

Pesar 10 g de muestra

Adicionar la muestra a 90 ml deAPE (Agua de peptona buferadaal 0.1%).

Dilución 10-1

Hacer dilución 10-1, 10-2, 10-3 , respectivamente, en 9ml de ADE

Pasar 0.1 ml a agar m-enterococal (siembra en superficie con rastrillo esteril)

Incubar a 37°C +/- 2 x 48 hr.

Hacer recuento de colonias de color vinotinto

Escoger 3 colonias sospehosas del medio m-enteroccocal

42°C S. faecalis

50°C S. faecium

Sembrar por aislamientoen Agar Bilis Esculina

0.1 ml

24

5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Uno de los principales problemas en alimentos de cuarta gama es que la contaminación bacteriana de los vegetales no se ve reducida significativamente con el lavado ordinario durante su proceso, debido a la gran adherencia de los microorganismos a las estructuras del vegetal, en las hojas se encuentra una alta concentración de patógenos, por tanto es posible que se mantenga al momento de la ingestión de las mismas.

Respecto al número de cepas de los microorganismos estudiados, se obtuvieron los siguientes resultados de las 150 muestras de vegetales analizadas, de los diferentes supermercados y plazas de mercado muestreadas:

Número de cepas

Microorganismo Supermercado Plaza

S. faecium 51 cepas 0 S. faecalis 5 cepas 0 B. cereus 4 cepas 6 cepas Salmonella spp 1 cepa Ausencia

Tabla 1. Cepas aisladas de muestras de supermercado y de plaza

5.1 Salmonella spp Se sabe que las condiciones de producción de los germinados favorecen el crecimiento de Salmonella spp., en otros estudios con germinados han encontrado una alta incidencia de Salmonella spp (4), en este estudio se logró aislar una cepa de Salmonella spp de las 150 muestras analizadas, se utilizó el test O.B.I.S Salmonella

(Oxoid Ltda., Basigntoke, Hampshire, Inglaterra) para descartar las cepas sospechosas, las cepas positivas se confirmaron con el sistema de identificación de Enterobacterias y otros bacilos Gram-negativos. API 20 E (bioMérieux, Inc), la cepa fue identificada como Salmonella arizonae perteneciente a una muestra de raíz china de supermercado (tabla 1). En estudios anteriores se ha demostrado que el control estricto de la temperatura es un factor importante en el mantenimiento de la calidad de los vegetales listos para el consumo

25

(60), debido a determinados patógenos, como Salmonella spp, son capaces de multiplicarse en la superficie o en el interior de algunas hortalizas (30).

Utilizando el método de la microbiología clásica para la recuperación de Salmonella spp, se observó que se favorece la recuperación de flora acompañante como Citrobacter, Proteus entre otros, por lo cual se puede deducir que la baja recuperación de este microorganismos puede ser debido a que es un microorganismo poco competitivo frente a la flora acompañante, sin embargo hace falta desarrollar métodos rápidos y específicos con una alta sensibilidad para la detección de Salmonella spp que inhiban flora acompañante. Respecto a este microorganismo como indicador de calidad se puede concluir que este tipo productos son de un nivel de calidad aceptable para el consumo.

5.2 Enterococcus

0

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

6000000

7000000

8000000

9000000

UFC

/g

Alfalfa Raiz china Espinaca Lechuga Ensalada Perejil

Recuento de Enterococcus Supermercado

Plaza

Figura 1. Recuento de Enterococcus en muestras de supermercado y plaza.

Se obtuvo un máximo recuento de Enterococcus 61x105 UFC/g, las muestras que presentaron estos resultados fueron las raíces chinas de supermercado. Se observó que las ensaladas listas para el consumo al igual que las raíces presentaron un recuento de 29x105 UFC/g. Se logró identificar 51 cepas de S. faecium y 5 de S. faecalis, pertenecientes en su mayoría a muestras de lechuga de supermercado (tabla 1, Figura 1). En cuanto a las muestras de plaza se observó que el recuento más alto de Enterococcus 10 x 105 UFC/g se presentó en las espinacas.

26

Los resultados obtenidos de Enterococcus, pueden ser debido a contaminación cruzada durante el proceso de recolección, lavado, empaquetamiento, o en el almacenamiento, esta contaminación puede estarse originando en las aguas de riego o de lavado, abonos, o ser causa de manipulación inadecuada. Los recuentos tanto de supermercado como de plaza fueron muy similares. Las muestras de lechuga pertenecientes a plaza de mercado presentaron un recuento máximo de Enterococcus de 25x104 UFC/g mientras que las de supermercado mostraron un máximo de 26x104 UFC/g, cabe resaltar que no se logró aislar e identificar ninguna cepa de Enterococcus de las lechugas de plaza de mercado.

5.3. Bacillus cereus

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

UFC/

g

Alfalfa Raiz china Espinaca Lechuga Ensalada Perejil

Recuento de B. cereus SupermercadoPlaza

Figura 2. Recuento de Bacillus cereus en muestras de supermercado y plaza

En cuanto al recuento de Bacillus cereus se obtuvo un máximo de 16x104 UFC/g, en muestras de raíz china y lechuga de supermercado, en plaza las muestras que mostraron un mayor recuento fueron las muestras de espinaca y de perejil (figura 2). Se aislaron e identificaron 10 cepas de B. cereus, pertenecientes a 1 muestra de espinaca, y 3 de lechuga de supermercado, y 1 lechuga, 2 espinacas y 3 de perejil de plaza de mercado (tabla 1), para un total de 10 de 150 muestras, lo cual corresponde a un 6.66%, este resultado es muy satisfactorio, ya que realmente es muy bajo, frente al número de muestras tomadas. Sin embargo, en Colombia la Resolución Número 4241 del Ministerio de Salud Pública, define las características de las especias o condimentos vegetales y se dictan normas sanitarias y de calidad de estos productos y de sus mezclas, de los productos analizados en este trabajo, esta resolución cubre únicamente el perejil donde establece como norma, un máximo de100 UFC/g de B. cereus para un nivel de aceptación de calidad, de

27

acuerdo a esto los recuentos obtenidos de B. cereus en el perejil (500 UFC/g) (Fig 2), están fuera de los niveles de aceptación, se debe tener en cuenta que las muestras de perejil fueron tomadas de la plaza de mercado, a temperatura ambiente, sin un proceso de lavado y con algunos residuos de suelo. Por otra parte también cabe resaltar que el perejil es un producto que debido a sus características morfológicas, favorece el establecimiento de microorganismos, haciendo difícil su eliminación con el proceso de lavado. La presencia de Bacillus cereus en las muestras indica deficiencia en el proceso de lavado, ya que en las muestras analizadas se observaron residuos de suelo, tanto en las de supermercado como en las de plaza, sin embargo su recuperación fue baja si se considera que es un microorganismo esporulado del suelo, y uno de los agentes causantes de ETAs.

5.4 Coliformes totales En general, se obtuvo un recuento de coliformes >2400 coliformes/g, tanto para las muestras de supermercado como para las muestras de plaza. La mayoría de las muestras colectadas de supermercado se encontraban en refrigeración mientras que las de plaza se encontraban exhibidas a temperatura ambiente, es decir entre 18 y 25ºC, según estudios anteriores con lechugas, muestreadas a temperatura ambiente se presentaron conteos de enterobacteriasceae bastante altos (37). En nuestro estudio se obtuvieron recuentos altos de coliformes tanto para las muestras de supermercado como para las de plaza. Para las muestras de plaza los resultados son acordes con los anteriores estudios, sin embargo las muestras de supermercado al presentar recuentos tan altos, puede sugerir que se están presentando problemas de contaminación cruzada o manejo de temperaturas de refrigeración inadecuadas. Se recomienda tener en cuenta las Buenas Prácticas Agrícolas, dentro de las cuales se encuentran aspectos a tener en cuenta como la manipulación de los productos, aguas de riego y uso de abonos de origen animal. (12, 22, 23, 34 )

Enterobacteriaceae como Enterobacter y Erwinia spp., son parte de la microflora de muchos vegetales sin procesar. Entre el 80 – 90 % de las bacterias mesofílicas aisladas de vegetales frescos sin procesamiento son Enterobacter spp., o Erwinia spp., y también Pseudomonas spp., donde el rango de conteo es entre 103 – 106

organismos por gramo (51), por lo tanto, los altos niveles de Enterobacteriaceae son probables en vegetales

28

sin preparar, como en la lechuga, donde son parte de la microflora pero también puede derivarse de contaminación con el suelo o como resultado de un mal manejo durante la recolección o empacado. Los altos recuentos obtenidos de Enterobacteriaceae en este estudio, puede ser debido a la presencia de esta microflora. La presencia de coliformes en las muestras puede ser parte de la carga microbiana normal del producto con origen en la granja y de las condiciones de cultivo, uso de abono y agua como fuente de contaminación. Para futuros estudios se propone cuantificar específicamente E.coli como indicador de contaminación fecal, pero se sugiere no utilizar medios de cultivo cromogénicos que permitan el crecimiento de Pseudomonas sp, debido a que se puede presentar interferencia en los resultados, lo cual podría generar falsos positivos. Se recomienda confirmar los resultados que sean sospechosos de E. coli. Es importante llevar a cabo la cuantificación de E. coli ya que en estudios previos se han detectado diferentes serotipos de E.

coli no patogénica asociada con raíces de vegetales como lechuga, demostrando que el agua de irrigación es la fuente de contaminación precosecha (76.) Existen normas en Colombia como la Resolución Número 4241 del Ministerio de Salud Pública la cual define las características de las especias o condimentos vegetales y se dictan normas sanitarias y de calidad de estos productos y de sus mezclas, dicha resolución exige como nivel de aceptación de calidad para el perejil un máximo de 4 UFC/g de E. coli (47). Sin embargo para los demás productos analizados en este trabajo no se cuenta con una normatividad, con respecto a la problemática anterior los proveedor y productor de la industria de alimentos establecen normas internas de calidad.

La transmisión de bacterias patógenas como Salmonella spp., E. coli, Enterobacteriaceae, es posible que sea debido a la utilización de abonos a base de estiércol como fertilizantes, a la irrigación de cultivos con aguas contaminadas, o a la contaminación directa con heces de aves u otros animales, incluso la contaminación puede darse durante el proceso de manipulación, o por contaminación cruzada con otros productos durante el almacenamiento, transporte y/o distribución. Es fundamental tener bajo control los anteriores factores desde el principio de la producción de este tipo de productos, por ejemplo desde la cosecha de lechuga, para minimizar los focos de contaminación, y obtener productos de mejor calidad.

29

Es difícil establecer las normas de calidad microbiológica para reglamentar productos exhibidos frescos es difícil, tales como vegetales y frutas que son de modo alguno el mismo artículo agrícola, listos para el consumo de manera cruda. La lechuga entera se vende con un mínimo procesamiento para el consumo. Sin embargo, un adecuado lavado de la lechuga durante la preparación puede minimizar la presencia de bacterias patógenas. Algunos tratamientos de desinfección a los cuales son sometidos este tipo de alimentos solo reducen carga microbiana de la superficie del producto, esto no asegura la eliminación total de la contaminación. Se llevar a cabo la optimización de nuevos procesos donde los productos sean sometidos a tratamientos que permitan obtener alimentos inocuos y de optima calidad, que no pongan en riesgo la salud del consumidor. A partir de los resultados obtenidos es importante resaltar que al no haber diferencia en el recuento de coliformes totales entre vegetales de plaza de mercado y supermercado es recomendable que antes de consumir este tipo de alimentos sean lavados con agua hervida y bajo buenas condiciones higiénicas. Es importante continuar con estudios similares, haciendo búsqueda de otros patógenos, como Listeria

monocytogenes, para obtener un amplio conocimiento sobre la incidencia de los microorganismos indicadores de calidad microbiológica en este tipo de productos alimenticios, y que esta información pueda ser útil para establecer normatividad para la calidad microbiológica de estos productos en nuestro país y de esta forma garantizar su calidad a los consumidores. Este trabajo logró cumplir los objetivos planteados, se estudió la calidad microbiológica de vegetales frescos, semillas germinadas y ensaladas listas para el consumo, distribuidos en supermercados y plazas de mercado de la ciudad, se obtuvo información sobre la calidad microbiológica en este tipo de productos y la incidencia de diferentes microorganismos, tales como Salmonella, B. cereus, Enterococcus y coliformes totales, los datos obtenidos sirven como base para la continuación de estudios similares, y hacen un gran aporte sobre algunos aspectos a mejorar.

30

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