AO DE LA INTEGRACIN NACIONAL Y EL RECONOCIENDO DE NUESTRA DIVERSIDADUNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN MARTINFACULTAD DE INGENIERA AGROINDUSTRIAL

ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERA AGROINDUSTRIAL

DETERMINACIN DE BIO-MOLCULAS DE PLANTAS MEDICINALES

EJECUTORES: CASTAEDA GARCIA, ELVIS ESTUARDO CLAVO CAMPOS, WILSON GONZALES SEGURA, RONAL LABN ARANDA, LUIS FERNANDO LAOS PEREIRA, PEDRO. A PINEDO MACEDO, CELIA TAPULLIMA PASHANARI, JHONATAN

DURACIN ESTIMADA:90 das calendarioFECHA DE INICIO: 08 de MayoFECHA DE TRMINO: 07 de Agosto

INTRODUCCIN

Las plantas han sido desde la antigedad un recurso al alcance del ser humano para su alimentacin y la curacin de sus enfermedades; estas ltimas plantas, veneradas por sus virtudes.Cientos de plantas son utilizadas en la medicina, la ciencia moderna analiza y estudia los efectos teraputicos de las plantas con el objeto de precisar, comparar y clasificar las diversas propiedades de las plantas, asimismo conocer los principios activos responsables de cortar, aliviar o curar enfermedades, separarlos de las plantas que lo contienen, determinar sus estructuras qumicas, procurar sus sntesis.La utilizacin de las plantas en la medicina no ha perdido inters, segn lo demuestra el hecho que durante alrededor de quince aos, en el mercado de Estados Unidos, el 25% de las prescripciones mdicas contenan principios derivados de plantas y extractos crudos de plantas en un 2.5%.Un gran porcentaje de los principios activos de plantas esta comprendido dentro de los llamados productos naturales o metabolitos secundarios, que son compuestos qumicos de estructura relativamente compleja y de distribucin ms restringida y de caractersticas de fuentes botnicas, los cuales no son indispensables en las plantas ya que no se ha descubierto una funcin metablica en la cual ellos intervienen; son considerados como artculos de lujo de la planta.

NDICECAPITULO I1.- JUSTIFICACIN...072.- PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA...083. OBJETIVOS....083.1.- OBJETIVOS GENERALES...083.2.- OBJETIVOS ESPECFICOS..084.- HIPTESIS...084.1.- SISTEMA DE HIPTESIS08

CAPITULO II1.- PLANTAS MEDICINALES.092.- PRINCIPIOS ACTIVOS.......092.1.- CLASIFICACIN SEGN SU ORIGEN METABLICO....093.- ESTUDIO FITOQUMICO PRELIMINAR....114.- MTODOS SEPARATIVOS Y DE PURIFICACIN...134.1.- CROMATOGRAFA LQUIDA...134.2.- CROMATOGRAFA EN CAPA DELGADA..144.3.- CROMATOGRAFA CENTRFUGA EN CAPA DELGADA...144.4.- CROMATOGRAFA EN COLUMNA..144.5.- CROMATOGRAFA GASEOSA..144.6.- CROMATOGRAFA DE CONTRACORRIENTE A GOTA A PRESIN.155.- MTODOS FSICOS EN LA DETERMINACIN DE ESTRUCTURAS ORGNICAS.155.1.- ESPECTROFOTOMETRA ULTRAVIOLETA VISIBLE..155.2.- ESPECTROSCOPIA INFRARROJA...165.3.- ACTIVIDAD PTICA Y DISPERSIN PTICA ROTATORIA165.4.- ESPECTROMETRA DE MASA.176.- ESTUDIO FITOQUMICO EN EL PAS: IMPORTANCIA Y PERSPECTIVAS..18

CAPITULO IIII.- TERPENOIDES Y ESTEROIDES1.- DEFINICIN....192.- BIOSNTESIS...193.- ACEITES ESENCIALES.....223.1.- DEFINICIN.223.2 TCNICAS RECOMENDADAS...233.2.1.- GENERAL..233.2.2.- ANLISIS ESPECTROMTRICOS....243.2.3.- DETERMINACIN DE LOS ACEITES ESENCIALES....243.3.- EJEMPLO DE APLICACIN.244.- SESQUITERPENLACTONAS...254.1.- TCNICAS RECOMENDADAS.....254.1.1.- GENERAL..254.1.2.- ANLISIS ESPECTROMTRICOS....265.- DITERPENOS..265.1.- DEFINICIN265.2.- EJEMPLO DE APLICACIN...276.- TRITERPENOIDES Y ESTEROIDES.276.1.- DEFINICIN.276.2.- TCNICAS RECOMENDADAS......286.2.1.- GENERAL...286.2.2.- ANLISIS ESPECTROMTRICOS.....296.3.- ANLISIS CUANTITATIVO DE DIOSGENINA.29

II.- COMPUESTOS FENLICOS1.- DEFINICIN....302.- FLAVONOIDES...302.1.- DEFINICIN.302.2.- TCNICAS RECOMENDADAS..312.2.1.- DE EXTRACCIN.312.2.2.- REACCIONES DE COLOR...312.2.3.- TCNICAS CROMATOGRFICAS.....312.3.- EJEMPLOS DE APLICACIN.323.- CUMARINAS....323.1.- DEFINICIN..323.2.- TCNICAS RECOMENDADAS...333.2.1.-DE EXTRACCIN...333.2.2.-DE SEPARACIN CROMATOGRFICA Y DE DETECCIN.333.2.3.-TCNICAS ESPECTROMTRICAS..333.3.- EJEMPLOS DE APLICACIN.....344.- CROMENOS Y BENZOFURANOS....344.1.- DEFINICIN..344.2.- TCNICAS GENERALES.....354.3.- EJEMPLO DE APLICACIN...355.- XANTONAS..365.1.- DEFINICIN..365.2.- TCNICAS GENERALES.366.- QUINONAS....376.1 DEFINICIN.376.2.- TCNICAS RECOMENDADAS....376.2.1.- DE EXTRACCIN...376.2.2.- DE SEPARACIN CROMATOGRFICA Y DE DETECCIN..386.2.3.- TCNICAS ESPECTROMTRICAS......386.3.- EJEMPLO DE APLICACIN.....38

III.- ALCALOIDES

1.- DEFINICIONES..402.- TCNICAS RECOMENDADAS....412.1.- DE EXTRACCIN..412.2.- REACCIONES DE COLORACIN Y DE PRECIPITACIN....412.3.- TCNICAS CROMATOGRFICAS..422.4.- TCNICAS ESPECTROMTRICAS..422.5. EJEMPLO DE APLICACIN...43

CAPITULO IV4.- MTODOS PARA EL DESARROLLO DE LA INVESTIGACIN...45CAPITULO V5.- CRONOGRAMAS DE ACTIVIDADES...45CAPITULO VI 6.- PRESUPUESTO Y FINANCIAMIENTO.....46CAPITULO VII7.-BIBLIOGRAFIA......47CAPITULO VIII8.-ANEXOS......48

CAPITULO I1.- JUSTIFICACINEl conocimiento emprico acerca de las plantas medicinales y sus efectos curativos se acumul durante milenios. Aunque a partir del siglo pasado el empuje de la industria farmacutica hizo que la teraputica fundamentada en el empleo de plantas viniera a verse como una prctica "primitiva" e irracional.Hoy da se reportan numerosos descubrimientos cientficos que confirman el enorme potencial curativo que posee el mundo vegetal. En aos recientes, las investigaciones permitieron el descubrimiento de aplicaciones insospechadas para muchas plantas y sustancias derivadas de estas. Tambin han surgido nuevas formas de preparacin y de disponibilidad. Hoy encontramos extractos de plantas medicinales en forma de cpsulas, tabletas y otras formas desconocidas para nuestros antecesores. Estos descubrimientos presentan nuevos retos. El estudio cientfico moderno de las propiedades curativas de las plantas promete descubrir propiedades que incluso van ms all de los usos tradicionales conocidos. Sin embargo, la falta de incentivos para este estudio ha sido hasta ahora un escollo formidable. Algunas universidades y entidades gubernamentales han comenzado a responder a la necesidad de estudios cientficos sobre las propiedades curativas de las plantas.

2.- PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

Desconocimiento de las propiedades e importancia de sus principios activos de cada planta con influencias al campo farmacutico.

3. OBJETIVOS 3.1. Objetivos generales: Determinar la importancia de sus principios activos de cada planta para poder ser aplicado al campo medicinal de una forma natural. 3.2. Objetivos especficos: Evaluar las diferentes propiedades que proporciona cada planta. Verificar las diversas aplicaciones curativas. Conocer los diversos procesos necesarios para que sea aplicado al campo medicinal.4.- HIPTESIS

Ho: Como y porque una determinada planta tiene propiedades curativasHi: Una determinada plantas no tienen propiedades curativas

CAPITULO II1.- PLANTAS MEDICINALES La OMS defini en un congreso realizado en China en 1980 la PLANTA MEDICINAL como todo vegetal que contiene en uno o ms de sus rganos, sustancias que pueden ser utilizadas con fines teraputicos o preventivos o que pueden ser precursores de hemisntesis quimio-farmacutica Son aquellas plantas que elaboran productos llamados PRINCIPIOS ACTIVOS, o sustancias que ejercen una accin farmacolgica sobre el organismo vivo. Su utilidad es servir como droga o medicamento. Constituyen aproximadamente la 7 parte de las especies conocidas.

2.- PRINCIPIOS ACTIVOS - Son substancias que se encuentran en las distintas partes de las plantas y que alteran o modifican el funcionamiento de rganos y sistemas del cuerpo humano y animal.2.1.- CLASIFICACIN SEGN SU ORIGEN METABLICO Metabolito primario: Producto del metabolismo general. Ampliamente distribuido en plantas y microorganismos. Ejemplo: aminocidos, nucletidos, cidos carboxlicos del ciclo ctrico, lpidos, carbohidratos y fibras, vitaminas, minerales, antibiticos etc. Metabolito secundario: No son esenciales para el metabolismo sino son sintetizadas como defensa, adaptacin Producto del metabolismo especial. Bio-sintetizados a partir de metabolitos primarios. Con distribucin restringida a ciertas plantas y microorganismos (a veces es caracterstico de un gnero dado o de una especie.) Ejemplo: alcaloides, terpenoides, flavonoides, oligosacridos, etc.

CO2

cido shiqumicoligo y polisacridosHidratos de carbono (aldosas, cetosas, etc.)

Anlogos del fenilpropano

Carotenoides Piruvato

ACETOGENINAScidos grasos, Antraquinonas, Fenoles, Macrlidos, Tropolonas, etc.

EscualenoAcetatocido mevalnico

Geraniol Genaril geraniol Ciclo de krebs

TriterpenosFarnesol

ProtenasAminocidos

MonoterpenosDiterpenos

FlavonoidesSesquiterpenosPorfobilingenoEsteroides

Porfirinas

Alcaloides

ESQUEMA GENERAL DE LAS RUTAS BIOSINTTICAS

3.- ESTUDIO FITOQUMICO PRELIMINARSe ha desarrollado una serie de mtodos para la deteccin preliminar de los constituyentes qumicos de las plantas, basados en la extraccin de stos con solventes apropiados y en la aplicacin de pruebas de coloracin.ESQUEMA PARA LA DETERMINACIN DE ALCALOIDES, SAPONINAS Y FLAVONOIDES, ANTRAQUINONAS, ETC. CUADRO. 01Muestra seca y molida 50 g

Etanol 95% reflujar 1 hora. Filtrar.

Extracto etanlico

10 g pptar. Con Pb (anhidro actico) 5%.Concentrar

20 g extraer con ter de petrleo.15 g extraer HCl 5%Alcanizar NaOH 20%Extraer con CHC y CHC: etanol (3:2)

Filtrado

Ppto.Residuo

Extraer con CHC, secar (), concentrar. CC almina neutra activada, eluir con CHC (90:10)Extraer con etanol: H (1:7), 60C

SolucinExt. Clorofrmico, y ext. Etanlico.(Por separado)

Extracto

Concentrar, extraer con HCl 5%, filtrar.

Saponinas: Prueba de la espuma.CCD silicagel: acetona (90:10). Rev. Hidroxamato frrico.Rev. Vainillina-ac. Ortofosforico.Sesquiterpenlactonas y cumarinas.

CCD silicagel: Metanol: H (87:12:1). Rev. R Raymond Cardiotnicos.

Antraquinonas: Borntrager Solucin cida Alcaloides Dragendorff, Mayer, Reineckato de amonio, otros.

Flavonoides: Shinoda

CCD: cromatografa de capa delgada. CC: cromatografa de columna.

Taninos: gelatina. FeC

CUADRO 02Muestra seca y molida 50 g

Taninos: R. gelatina y R. FeC+50 ml metanol, macerar 20 horas a temperatura ambiente, reflujar 4 horas, filtrar en caliente, lavar con metanol y llevar a 50 ml.

Separar 2 ml

Aminocidos: R de ninhidrina Flavonoides: R. shinodaExtracto metanlico

El resto, llevar a sequedad/rotavapor, extraer con 15 ml HCl 1% a 50 C, filtrar sobre celita.

Solucin cidaInsoluble

Filtrar, enfriar, alcalinizar con N, extraer en CHC (225ml)Lavar con H, secar, agregar, 5 ml CHC, calentar, filtrar, secar (), llevar a 5 ml.

Fase acuosa

Fase clorofrmicaFraccin b

Saturar con (0.1 g sal anhidra por ml de solucin) extraer con CHC: etanol (3:2), (225)Lavar con H, secar (), filtrar; a 50 ml CHC.Esteroides: R. Liebermann-Burchard.Quinonas: R. Borntrager.

Cardenolidos: R. KeddeEsteroides: R. Liebermann- BurchardEvaporar a sequedad + 2 ml HCl 1%. Filtrar.

Fraccin c

Evaporacin + 2 ml de CHCFase clorofrmica: etanlica Fase acuosa remanente

Filtrado: Alcaloides

Concentrar, extraer con HCl 5%, filtrar.

Fraccin eLavar con sol. (10 ml) secar , filtrar, llevar a 50 ml

Flavonoides: R.ShinodaLeucoantocianidina R. Rosenheim

Fraccin d

Evaporar a sequedad +2,5 ml etanol

Alcaloides: R. mayer.R. DragendorffEsteroides,Triterpenos. R. Liebermann- BurchardCardenlidos, Anillos lactona. R. Kedde.Leucoantocianidina R. RosenheimFlavonoides: R. Shinoda

4.- MTODOS SEPARATIVOS Y DE PURIFICACINEn los trabajos de investigacin sobre productos naturales (metabolitos secundarios) es preciso extraer cuidadosamente los componentes de vegetal en estudio para en seguida aislar y purificar los compuestos presentes en los extractos obtenidos.Luego los compuestos puros se analizan con tcnicas espectroscpicas y mtodos qumicos, lo que permite obtener las estructuras qumicas correspondientes.Los mtodos cromatogrficos son los procedimientos separativos ms utilizados. La cromatografa es la distribucin de los componentes de una muestra entre dos fases, una mvil (gas o lquida) y una fija o estacionaria (liquido o solida). 4.1.- CROMATOGRAFA LQUIDA (CL)1) Cromatografa de particin: Es la separacin de los componentes de una mezcla a base de los coeficientes de particin de cada uno de ellos entre dos solventes inmiscibles, uno fijo (fase estacionaria) y el otro mvil. 2) Cromatografa de adsorcin: Depende de la adsorcin del soluto sobre sobre absorbentes polares, tales como: gel de slice o almina. La cromatografa en capa delgada es una forma de cromatografa de adsorcin.3) Cromatografa de intercambio inico: Se aplica tanto a aniones como cationes, se basa en e intercambio (adsorcin) de iones entre la fase mvil y los sitios inicos del relleno. Muchas de las resinas usadas derivan de co-polmeros de estireno y divinilbenceno a los cuales se han agregado grupos funcionales, las resinas del tipo de cido sulfnico y las de amonio cuaternario se usan n la mayora de las aplicaciones. Se usan en la separacin de aminocidos.4) Cromatografa de exclusin: La separacin se basa en el tamao molecular del soluto que pasa a travs de un gel que posee una superficie porosa inerte. Las molculas pequeas pueden penetrar en los poros y quedar retenidos en ellos, mientras que las molculas grandes al no poder introducirse en los poros, son arrastrados por la fase mvil. Se usa con frecuencia el gel SEPHADEX (nombre comercial) para la separacin de metabolitos secundarios.Las cuatro formas de cromatografa liquida pueden efectuarse en capa delgada. 4.2.- CROMATOGRAFA EN CAPA DELGADA (CCD)La fase estacionaria es una capa uniforme de un absorbente mantenido sobre una placa, la cual puede ser de vidrio, aluminio u otro soporte. Se usan como adsorbentes: Sustancias inorgnicas: gel de slice, almina, cido silcico (diatomita), silicato de magnesio y calcio.Los adsorbentes inorgnicos (excepto diatomita) se usan principalmente para separar compuestos lipoflicos. Sustancias orgnicas: celulosa y derivados, almidn, sacarosa, manitol y geles de dextrano.La celulosa y derivados se aplican exclusivamente a compuestos hidroflicos como aminocidos, azucares, glucsidos, etc.La sacarosa y manitol se usan para separar pigmentos de plantas.4.3.- CROMATOGRAFA CENTRFUGA EN CAPA DELGADA (CCCD)Desde aos se ha intentado aumentar la velocidad de separacin acelerando la velocidad de flujo de la fase mvil mediante centrifugacin; se ideo un aparato cromatfugo para aplicar esta tcnica de separacin en escala preparativa, su utilidad se demostr en la separacin de purinas, cafena, teobromina, teofilina y xantina.4.4.- CROMATOGRAFA EN COLUMNA (CC)Es la ms usada en la separacin de productos naturales, se emplean absorbentes: gel de slice, almina, celulosa, florisil, poliamida, variados sephadex; se usan ms y ms materiales de relleno que permiten trabajar en fase inversa. 4.5.- CROMATOGRAFA GASEOSA (CG)Posee como fase mvil un gas inerte que generalmente es nitrgeno. La fase estacionaria puede ser un lquido o un solido. Puede usarse combinada con tcnicas espectroscpicas, como espectrometra de masa, la cual necesita de una interfase para adaptar las condiciones del cromatgrafo gaseoso a las de vaco del espectrmetro de masa y eliminar el gas portador. 4.6.- CROMATOGRAFA DE CONTRACORRIENTE A GOTA A PRESINEs un mtodo de separacin reciente y consiste en cromatografa de particin lquido lquido que se efecta pasando en forma continua, mediante bombeo gotas de fase mvil a travs de un nmero de columnas conectadas en serie llenas con la fase estacionaria.Como la mayora de los solventes apropiados para la CCCGP contienen agua, esta tcnica se usa preferentemente para compuestos polares como: saponinas, ginsensidos, glicosidos de catequinas y flavonas; tambin se utiliza para separar compuestos no polares. 5.- MTODOS FSICOS EN LA DETERMINACIN DE ESTRUCTURAS ORGNICAS5.1.- ESPECTROFOTOMETRA ULTRAVIOLETA VISIBLELos extractos en diferentes etapas de purificacin pueden ser analizados con el fin de buscar absorciones caractersticas en la regin UV y visible. El espectro UV, junto con otras constantes fsicas de un compuesto (punto de fusin, poder rotatorio, etc.), es parte integrante de la descripcin y caracterizacin del mismo. Mas an, en algunos casos como: carotenoides, porfirinas, corrinas, etc. La absorbancia a una longitud de onda dada es un indicio de la pureza del compuesto.En la determinacin de detalles estructurales, la absorcin en el UV visible puede, una vez determinado el esqueleto carbonado y el tipo de compuesto (flavonoide, carotenoide, esteroide, etc.), brindar informacin sobre la presencia de ciertos grupos funcionales.

5.2.- ESPECTROSCOPIA INFRARROJA (EI)El espectro infrarrojo de la mayora de los compuestos orgnicos puede dividirse en dos partes: Las bandas de vibracin de sustituyentes especficos entre 1300 y 4000 Las bandas de vibracin del esqueleto hidrocarbonado (C-C y C-H) entre 650 y 1400 En el anlisis estructural, la zona entre 1400 y 4000 es de gran utilidad. Las bandas entre 1650 y 1800 indican C=O y en estos ltimos, segn el valor exacto, puede inferirse el tipo el grupo de tipo funcional del que forma parte el carbonilo, si se encuentra conjugado. La presencia de dobles enlaces y de sistemas aromticos, al igual que los distintos tipos de sustitucin sobre anillos bencnicos. 5.3.- ACTIVIDAD PTICA Y DISPERSIN PTICA ROTATORIA (DOR)La actividad ptica de un compuesto es una caracterstica de su estructura molecular. La posibilidad de medir la actividad ptica en la regin UV ha permitido obtener curvas de rotacin ptica en funcin de la longitud de onda de la luz polarizada, las cuales han sido aplicadas con xito en la resolucin de problemas estructurales.Las curvas de DOR se usan para determinar si un compuesto con rotacin nula (extremadamente pequea) en la lnea D (589nm) es pticamente activo, ya que los compuestos con curvas simples presentan mayor rotacin en la regin UV que a 589 nm.Con otros mtodos es en general fcil distinguir steres y cetonas, las curvas de DOR son un arma adicional pues las cetonas tienen un efecto CATTON alrededor de 300 nm, en tanto que los steres poseen curvas simples en esa zona.

5.4.- ESPECTROMETRA DE MASA (EM)En un espectro de masa convencional cada pico indica solo la masa total del fragmento, ste puede contener distintos tipos de tomos y diversas estructuras.Con frecuencia se intenta primero localizar el ion molecular y luego caracterizar las distintas rupturas a base de los picos mas intensos. Dada una estructura probable deben analizarse sus rupturas principales y buscarlas luego en el espectro. Los mtodos instrumentales que comprende la espectrometra de masa pueden adaptarse al comportamiento qumico de la sustancia.Las sustancias sometidas a este tipo de anlisis se clasifican en: Sustancias voltiles mediante una derivatizacin: Los iones son generados en la fase gaseosa en forma uni-molecular por impacto con un haz de electrones de alta energa (20 a 70 eV) (ionizacin de campo o por impacto electrnico) o en forma bimolecular por reaccin con otros iones orgnicos. Sustancias polares y sales termolbiles:Los iones son generados a partir de la sustancia depositada sobre una superficie de donde es desorbida en forma de iones por accin de un campo elctrico muy intenso o bien disuelta en una matriz solida o liquida que es bombardeado por un haz de iones de alta energa que erosiona la superficie y desprende las partculas en forma de iones llamados iones secundarios Sustancias de elevado peso molecular:Biopolmeros como cidos nucleicos, polisacridos, etc. En este caso el estudio en general consiste en degradaciones muy suaves y en el anlisis de fragmentos estructuralmente exactos.

6.- ESTUDIO FITOQUMICO EN EL PAS: IMPORTANCIA Y PERSPECTIVASEl Per es un pas exportador de algunas plantas medicinales; sin embargo, debido a la competencia creciente de otros pases productores, su posicin como exportador tiende a decrecer en beneficio de ciertos pases de Asia, frica y Europa; estos pases han tomado conciencia del potencial de sus productos naturales y han favorecido mucho sus programas de desarrollo agrcola e industrial: La India es el principal abastecedor de gran variedad de plantas a Europa. Zaire produce papana y quinina.El pas posee gran riqueza en su flora, de la cual varios miles de especies son conocidas, con varios de cientos por descubrir y con menos del 10% estudiadas desde el punto de vista qumico y farmacolgico, un anlisis fotoqumico sistemtico dar a conocer nuevas drogas importantes. El anlisis fotoqumico podra ser orientado aprovechando las experiencias de investigaciones reportadas en la literatura. La literatura reporta varias especies de DIOSCOREA, especialmente en la regin de la Selva, y de su contenido en diosgenina, de gran importancia como materia prima para la produccin de hormonas esteroidales. Debe propiciarse y buscarse la tecnologa para la produccin de diosgenina a escala industrial. La literatura reporta varias especies de gnero Werneria en los andes peruanos, que la medicina tradicional hace uso de ellas para el tratamiento de cncer al tero, como febrfuga, para el tratamiento de reumatismo, de dolor de garganta, etc. Hay pocos trabajos realizados en la parte qumica y farmacolgica. La literatura reporta la presencia de lactonas sesquiterpnicas principalmente en los gneros Ambrosia y Artemisia, las que por ensayos biolgicos se han demostrado que presentan accin antitumoral y citotxica, podran constituir un grupo de plantas de estudio en la bsqueda de sesquiterpenlactonas biolgicamente activas.

CAPITULO IIII.- TERPENOIDES Y ESTEROIDES1.- DEFINICIN El trmino terpenoide se refiere a un grupo de sustancias que tienen un origen biosinttico comn y que siguen la llamada regla del isopreno esbozado por WALLACH en 1866. ESTRUCTURA DEL ISOPRENO

Se clasifican segn el nmero de unidades de isopreno (2,3,4,) que lo forman. Monoterpenos () - Sesquiterpenos () - Diterpenos () Sesterpenos () - Triterpenos () - Tetraterpenos ()

El amplio uso de los terpenoides, tanto en la industria como en la medicina, ha despertado el inters por encontrar nuevas fuentes y por el conocimiento de nuevas estructuras qumicas.

2.- BIOSNTESISAunque se seala la unin de unidades de isopreno como ruta biogentica se destaca que el verdadero precursor de los terpenoides es el pirofosfato de -- isopentilo, el cual es formado del acetato va cido mevalnico. El gran nmero de terpenoides aislado de plantas ha sido originado por la facilidad con que estos esqueletos carbonados sufren reacciones de ciclacin y reordenamiento del tipo ion carbonio, hidrataciones y oxidaciones, dando as lugar a compuestos de estructura cclica y aciclica, saturados o insaturados, con uno o mas grupos funcionales.

cido ActicoMevalonato o cido mevalnico

IsomerizacinPirofosfato de -- isopentiloCaucho (poli-cis-isopreno)

Pirofosfato de dimetilalilo

Pirofosfato de geranilo ( )

Pirofosfato de farnesilo ( )

Monoterpeno

DimerizacinSesquiterpenosPirofosfato de geranilgeranilo ( )

EscualenoDimerizacinGutapercha Poli isoprenoUbiquinonas

Diterpenos

Triterpenos (lanosterol)

Carotenoides

Esteroides

ESQUEMA GENERAL DE LA BIOSNTESIS DE TERPENOIDES Y ESTEROIDES

3.- ACEITES ESENCIALES3.1.- DEFINICINSon los constituyentes odorferos o esencias de una planta. El trmino aceite, probablemente se origina del hecho que el aroma de una planta existe en las glndulas o entre las clulas en forma lquida, el cual al igual que los aceites grasos son inmiscibles en el agua.Presentes en especias de las familias de las: Umbeliferae (apio, comino, perejil, ans) Rutaceae (limn, naranja, lima, mandarina) Labiateae (lavanda, romero, timol, organo) Piperaceae (pimiento, matico)Pueden estar ubicados en las diferentes partes de la planta; en las conferas esta en todo el tejido; en la rosa, slo esta en el ptalo; en el comino, en las semillas; en el clavo de olor, en el brote o yema; en la lima, en el fruto; en la menta, en los pelos glandulares de la planta y hojas.Los aceites esenciales qumicamente estn formados por la mayora de los monoterpenos y algunos sesquiterpenos y compuestos aromticos.Las aplicaciones de los aceites esenciales son muy variadas: Utilizadas en perfumera Saborizante de alimentos Medicina, los aceites esenciales del ans, menta y canela son carminativos y soporferos; el de clavo de olor es analgsico dental, el de eucalipto es expectorante.

3.2 TCNICAS RECOMENDADAS3.2.1.- GENERAL Los aceites esenciales son obtenidos del material fresco que los contiene, utilizando principalmente el clsico procedimiento de destilacin por arrastre de vapor, obtenido el aceite esencial ste es secado con sulfato de sodio anhidro.

DESTILACIN POR ARRASTRE DE VAPOR

Otros mtodos son: expresin, extraccin con solventes lipofilicos y el enflorado; el ltimo usado en perfumera, consiste en que los ptalos de una flor se colocan y presionan entre dos lminas impregnadas de grasa en las cuales se absorbe el aceite, el que luego es extrado con alcohol. Las reacciones de color y de precipitacin pueden ser utilizadas para determinar la presencia de determinados grupos funcionales: - Los alcoholes pueden determinarse por la aparicin de un precipitado amarillo debido a la formacin de xantato cuando la muestra es tratada con CS2 y KOH. - Los aldehdos y cetonas por la formacin de precipitado rojo, anaranjado o amarillo por reaccin de la muestra con 2,4-DNFH.

3.2.2.- ANLISIS ESPECTROMTRICOS El anlisis por mtodos espectromtricos de un aceite esencial constituido por una mezcla de compuestos puede ser utilizado para obtener una informacin sobre su posible composicin y asumir la ausencia o presencia de determinado grupo funcional. En el espectro UV, absorciones intensas entre 202 y 210 nm seria indicativa de compuestos saturados; entre 215 y 250 nm presencia de compuestos insaturados y entre 250 y 270 nm de compuestos aromticos. 3.2.3.- DETERMINACIN DE LOS ACEITES ESENCIALES Las caractersticas de un aceite esencial son dadas en forma general mediante valores de ndices de: Refraccin Gravedad especifica Rango de temperatura de ebullicin Punto de cristalizacin o congelacin, ndice a acidez del aceite esencial (IA): Es el nmero de mg de hidrxido de potasio necesarios para neutralizar los cidos libres contenidos en 1g de aceite esencial. ndice de ster (IE) de un aceite esencial: Es el nmero de mg de hidrxido de potasio necesarios para neutralizar los cidos liberados por hidrolisis de los esteres contenidos en 1g de aceite esencial.3.3.- EJEMPLO DE APLICACIN Aceite esencial de Eucalipto De la destilacin por arrastre de vapor de hojas frescas de eucalipto se obtuvo un aceite esencial de IA 0.4902 e IE 1.4039.El CGL presento dos picos principales con tiempos de retencin de 194 y 320 segundos correspondientes a o -pineno y cineol respectivamente.De la destilacin al vaco (5 mm Hg) del aceite de eucalipto se separ el cineol con una pureza no menor de 98%.

ANEXO 01 Aceite esencial de comino, organo, pimienta, hierbaluisa, palillo Los aceites fueron obtenidos por destilacin por arrastre con vapor de agua.

4.- SESQUITERPENLACTONASDerivadas biogenticamente de los sesquiterpenos, son substancias amargas que se encuentran en todas partes de la planta (familia Asteraceae: gnero: artemisia y ambrosia), en concentraciones que varan entre 0.01 % y 8% del peso seco, son bastantes solubles en cloroformo y ter etlico. Presentan gran importancia por la variada accin biolgica: Accin citotxica Antitumoral Analgsica Inhibidores del crecimiento de bacterias.Son de estructuras muy diversas, resultados de una variedad de ciclaciones, fusiones de anillo, esterificaciones; pero con un anillo caracterstico de -lactona-,-insaturada.

4.1.- TCNICAS RECOMENDADAS4.1.1.- GENERAL El procedimiento general para la extraccin y separacin de las sesquiterpenlactonas se indica a continuacin: A 100 gr de hojas secas y molidas se le agrega 500 ml de CHCL3 grado tcnico, y se deja en reposo durante una noche. El extracto clorofrmico se filtra, el filtrado verde oscuro se evapora a una masa resinosa, la cual es disuelta en etanol 95% (250 ml). Si el jarabe espeso no se disuelve fcilmente la solucin se calienta a bao de vapor por 5 minutos, y se deja luego a temperatura ambiente.Se adiciona 250 ml de solucin acuosa de acetato de plomo al 4% para precipitar los compuestos ms polares. Se filtra la solucin a travs de Celita, el filtrado se concentra al vaco y luego se extrae 3 veces con 75 ml de cloroformo cada vez; los extractos clorofrmicos se renen, se secan sobre MgSO4 anhidro y se concentran. Este extracto clorofrmico contiene las sesquiterpenlactonas y en algunos casos triterpenos y flavonoides altamente metilados.El nmero de lactonas se determina por CCD usando Silicagel G con sistemas como benceno: acetona (4:1) o CHCter etlico (5:1) y revelando con vapores de yodo o con solucin acuosa de KMn al 5%. La separacin de las lactonas puede hacerse por CC disolviendo 5 g del extracto en benceno: acetona (2:1) y cromatografiando sobre gel de slice empacada de benceno, por elucin con benceno y mezclas de benceno: acetona de polaridad creciente. Cada fraccin se lleva a sequedad y se comprueba por CCD. Tambin se usan las reacciones qumicas de color para detectar el anillo lactona, entre ellas la reaccin con cloruro de hidroxilamina y cloruro frrico para producir los hidroxamatos frricos coloreados, o las pruebas de Baljet y de Legal.

4.1.2.- ANLISIS ESPECTROMTRICOS.Debido a la gran variedad de esqueletos carbonados no es posible dar caractersticas espectrales de un nico esquema; sin embargo algunos valores pueden ser caractersticos como la absorcin UV entre 205-212 nm, la seal a 1750 en el IR para el anillo -lactona-,-insaturada.

5.- DITERPENOS5.1.- DEFINICIN Comprende un grupo de compuestos de 20 tomos de carbono que puede presentarse en forma de hidrocarburos, alcoholes, cetonas, lactonas y cidos carboxlicos, siendo estos ltimos conocidos desde tiempo atrs como cidos resnicos y obtenidos como componentes de las oleorresinas exudadas por cortes en los troncos de pinos y abetos. Se subdividen atendiendo al tipo de esqueleto carbonado: Bicclicos (labdano y clerodano) Tricclicos (abietano, cassano, totarona y podocarpano) Tetraciclicos (tipo kaurano, bayerano, atisano, giberalano) Son clasificados en base a sus propiedades como: cido abitico y agtico tienen una funcin protectora en la planta. Giberalinas hormonas (cido giberlico) que estimulan el crecimiento vegetal Estos compuestos pueden ser separados por las tcnicas cromatogrficas para los terpenos menores y triterpenos.

5.2.- EJEMPLO DE APLICACIN Diterpenos xido de manoilo de Werneria dactylophylla 550 g de la parte area de W. dactylophylla o Conuca, fueron extrados en un Soxlhet sucesivamente con ter de petrleo (6 g) y cloroformo (36 g). 3g del extracto clorofrmico fue cromatografiado en una columna de silicagel usando cloroformo con cantidades crecientes de metanol como solventes de elucin. Las fracciones colectadas fueron reunidas de acuerdo a su comportamiento cromatogrfico en capa delgada y posteriormente purificada por HPLC (columna de fase reversa, metanol: agua, (17:3). Obtenindose cuatro diterpenos xidos diferentes.

6.- TRITERPENOIDES Y ESTEROIDES6.1.- DEFINICIN Los triterpenoides son compuestos con un esqueleto carbonado basado en seis unidades de isopreno que derivan biogenticamente del escualeno, hidrocarburo acclico de 30 carbonos. Son de estructura relativamente compleja generalmente tetracclicos o pentacclicos, y pueden contener grupos hidroxilo, cetona o aldehdo y cido carboxlico. Muchos se encuentran como glicsidos formando las llamadas saponinas triterpenoides. Lanosterol - Escualeno - Arborano Tirucalol - Eufol - Damnarano Los esteroides, biogenticamente muy relacionados a los triterpenoides, y con un esqueleto cclico base al igual que los triterpenoides tetracclicos, de ciclopentanoperhidrofenantreno, pueden ser clasificados como esteroles (),saponinas esteroidales, glicsidos cardiacos, esteroalcaloides y las llamadas hormonas esteroidales, Sitosterol - Colesterol - Estigmasterol Progesterona - Testosterona - Androsterona Estriol - Estrona - Cortisona Triterpenoles y esteroles son slidos incoloros, cristalinos, de alto punto de fusin de fusin; los esteroles, generalmente tienen punto de fusin menor que 200 C y los triterpenoles mayor de 200 C. Las saponinas son glicsidos de ambos, triterpenos y esteroles, dan soluciones jabonosas, y algunos extractos crudos de plantas han encontrado uso como detergentes. Causan hemolisis de la sangre an en soluciones muy diluidas.Las saponinas no son fciles de aislar por ello muchas veces se prefiere hidrolizar el extracto crudo de la planta y aislar la sapogenina libre de azcar. Las sapogeninas del grupo triterpeno se encuentran extensamente distribuidas en la naturaleza; una gran variedad de ellas difieren difieren nicamente en el nmero y tipo de unidades de azcar unidas a las sapogeninas, las fuentes de saponinas triterpenoidales y sus geninas son:

Ginseng - Alfalfa - Avena Quinua - Soya, etc.Las saponinas esteroidales son materia inicial para la preparacin de productos muy potentes y ampliamente usados como productos farmacuticos, entre ellos: Cortisona - Anticonceptivos Estrgenos - Testosterona 6.2.- TCNICAS RECOMENDADAS6.2.1.- GENERAL Triterpenos y esteroides pueden ser separados por procedimientos muy similares utilizando tcnicas cromatogrficas de columna, de capa delgada, de gas lquido y de lquida de alta performance. Las identidades deben ser confirmadas por punto de fusin, rotacin especifica, infrarrojo y espectrometra de masas. Se han propuestos muchas reacciones de color para detectar la presencia de estos compuestos, siendo los ms usuales: Reaccin de Noller: Especfica para triterpenos (muestra + 0.2 ml de reactivo: cloruro de tionilo conteniendo 0.1 % de Fe), por los de color producidos en los 60 minutos siguientes Otras reacciones de coloracin usuales son aquellas usando cido fosfomolbdico (solucin etanlica al 10% de acido de cido fosfomolbdico.

6.2.2.- ANLISIS ESPECTROMTRICOS El espectro UV es muy til para deducir la presencia y ubicacin de grupos cromforos por aplicacin de reglas de WOODWARD.Compuestos triterpenoides y esteroides en general muestran en IR seales a 3650-3590 y a 1055 correspondientes a OH secundarios. Las sopogeninas esteroidales son adems caractersticas las absorciones del espiroacetal en forma de 4 bandas llamadas A, B, C y D, aproximadamente a 980, 920, 900, 860 respectivamente. La espectrometra de masas ha sido la herramienta ms fuerte y usual para elucidar el esqueleto y especialmente la localizacin del doble enlace en los triterpenos.

6.3.- ANLISIS CUANTITATIVO DE DIOSGENINASe usa para evaluar el contenido de diosgenina en tubrculos de Dioscorea y consiste bsicamente en 3 pasos: Maceracin del Tubrculo, Hidrolisis cida y extraccin. 50 g de material fresco se macera con igual peso de agua y se homogeniza en una licuadora; cuando esta macerado, se le coloca en un baln, al cual se le agrega 115 ml de HCl 3,5 N de tal manera que la mezcla es aprox. 2N. Se refluja durante 3 horas, se le agrega 250 ml de agua y se enfriar para luego filtrarlo.El residuo se lava de 8 a 10 veces con porciones de 50 ml de agua y se deja secar durante toda la noche a 65-70 C. El residuo seco se coloca en un Soxlhet y se extrae durante 8 horas con 100 ml de ter de petrleo; despus de la extraccin se reduce el volumen del solvente a aproximadamente 10 ml y se deja en reposo a temperatura ambiente durante 2 horas, tiempo en el cual los cristales de diosgenina deben precipitar.Se filtra, seca y pesa. Se debe determinar la humedad de la muestra. II.- COMPUESTOS FENLICOS

1.- DEFINICINLos compuestos fenlicos se refieren a un grupo de substancias que poseen en comn un anillo aromtico con uno o ms sustituyentes hidroxilos, y que ocurren frecuentemente como glicsidos, combinados con unidades de azcar. Pueden ser detectados por el intenso color verde, prpura, azul o negro, que produce cuando se les agrega una solucin acuosa o alcohlica al 1% de cloruro frrico. Dada la naturaleza aromtica de estos compuestos fenlicos, ellos muestran intensa adsorcin en la regin UV del espectro, siendo este mtodo espectral especialmente importante para su identificacin y anlisis cuantitativo. Los compuestos fenlicos son: Flavonoides Cumarinas Cromenos Benzofuranos Xantonas QuinonasAlgunos compuestos podran no contener el OH fenlico libre. Varios grupos de materiales polimricos de plantas como las ligninas y taninos son polifenlicos.

2.- FLAVONOIDES2.1.- DEFINICIN Se conoce como diez clases de flavonoides, todos contienen quince tomos de carbono en su ncleo bsico y estn arreglados bajo un sistema - - , en el cual dos anillos aromticos llamados A y B estn unidos por una unidad de tres carbonos que pueden o no formar un tercer anillo, que en caso de existir es llamado anillo C. Se forman biogenticamente a travs de la ruta de Shikimato y del acetato malonato, siendo la chalcona el flavonoide inicialmente. Los flavonoides se emplearon durante mucho tiempo como colorantes de lana, actualmente se usan en la conservacin de grasas o jugos de frutas debido a las propiedades antioxidantes de algunas polihidroxiflavonas.

2.2.- TCNICAS RECOMENDADAS2.2.1.- DE EXTRACCINLos solventes empleados son muy variados y pueden ser muy polares como el agua y etanol para glicsidos o agliconas muy hidroxiladas, hasta menos polares como como ter y cloroformo para flavonas. 2.2.2.- REACCIONES DE COLOR Para determinar flavonoides en un extracto de planta es necesario la reaccin de Shinoda: Al extracto alcohlico incoloro o ligeramente amarillo se le coloca un pequeo trozo de magnesio y unas pocas gotas de HCl conc., el desarrollo inmediato de coloracin es indicativo de la presencia de: Flavonas y flavonoles (amarillo a rojo), flavanonoles (rojo a magenta), flavanonas (rojo, magenta, violeta, azul), isoflavonas (amarillo); isoflavononas, chalconas y auronas no dan coloracin. En algunos casos puede hacerse pruebas directamente sobre el material; por ejemplo, si los ptalos blancos de una flor en presencia de vapores de amoniaco se ponen amarillos es indicativo de flavonas y/o flavonoles, si viran de amarillo a rojo hay presencia de chalconas y auronas.2.2.3.- TCNICAS CROMATOGRFICASLa deteccin de los flavonoides en cromatografa de capa delgada, puede hacerse por el color que desarrollan en visible o en el UV, apareciendo como manchas fluorescentes azules, naranjas, prpuras y otras; las cuales se intensifican o cambian de color luego de su exposicin a vapores de amoniaco.

2.3.- EJEMPLOS DE APLICACIN Flavonoides de Andira inermis 1.750 kg de corteza seca y molida fue macerada en 4 L de metanol durante 30 das. El extracto fue concentrado a sequedad (13.9 g) y disuelto en 160 ml Metanol: agua (2:3). Esta solucin acuosa-metanlica se someti a una extraccin exhaustiva con CHC obtenindose despus de concentrar el extracto clorofrmico 1.6 g (E1). E 1 fue cromatografiado por CCDP en Benceno: acetona (2:1), separndose entre otros, formometina y pseudobaptigenina (9.0 mg), gensteina (28.0 mg), 3-metoxidaidzena (4.0 mg) y daidzena (3.0 mg).

3.- CUMARINAS3.1.- DEFINICIN Son compuestos ampliamente distribuidos en las plantas, principalmente en las familias Umbelferas y Rutaceae; se encuentran en todas las partes de la planta, desde la raz a flores y frutos siendo ms abundantes en estos ltimos. Se presentan a menudo como mezclas, en forma libre o como glicsidos.IMAGEN DE ESTRUCTURA CUMARINA

Se denomina cumarina a todas aquellas que tienen como base la estructura sealada. Las cumarinas de las cuales el 5% aprox. Carece de oxigeno en la posicin -7-, pueden clasificarse como: Simples Furanocumarinas Piranocumarinas Cumarinas preniladas Cumarinas substituidas en el anillo pirona Todas las cumarinas se caracterizan por el sistema benzo--pirona y su carcter lactnico que hace que sean solubilizadas por soluciones alcalinas con la aparicin de un color amarillo en la solucin; el hecho de que aproximadamente el 95 % de las cumarinas poseen substituyente oxgeno en el C-7 hace que se considere a la 7-hidroxicumarina o umbeliferona como el compuesto padre, mejor que la cumarina misma. Estn biogenticamente relacionadas a los fenilpropanoides como flavonoides y ligninas as como a las substancias derivadas de acetato, como esteroides y terpenoides, ya que su biosntesis transcurre por ambas vas: va Shikimato y va polictico del acetato

3.2.- TCNICAS RECOMENDADAS3.2.1.-DE EXTRACCINLa extraccin de las cumarinas puede realizarse sobre el material vegetal fresco o seco, con solventes de diferentes polaridades dependiendo de la estructura de las cumarinas. Las cumarinas oxigenadas, son ligeramente solubles en solventes poco polares y a menudo pueden cristalizar directamente de un extracto de ter de petrleo, ya sea por enfriamiento o por concentracin del extracto. Solventes usuales son el ter de petrleo y ter etlico o sus mezclas, acetona, metanol y etanol.Si una cumarina se encuentra en cantidades apreciables en una fuente natural es posible separarla por cristalizacin directamente del extracto.3.2.2.-DE SEPARACIN CROMATOGRFICA Y DE DETECCINLa cromatografa de columna ha sido ampliamente usada, ya sea utilizando silicagel o almina neutra o cida como adsorbentes; la almina bsica no es muy recomendable pues se ha observado que produce una degradacin de las cumarinas. Como sistema de elucin han sido utilizadas mezclas variadas de solventes en diferentes proporciones como:- hexano: ter etlico- hexano: acetato de etilo- ter de petrleo: ter etlico

3.2.3.-TECNICAS ESPECTROMTRICASLas cumarinas muestran bandas de absorcin ultravioleta caractersticas a 274 y 311 nm, las cuales son atribuidas a los anillos del benceno y pirona respectivamente. 3.3.- EJEMPLOS DE APLICACIN Umbeliferona de lepidophyllum tola, tola 600 g de ramas secas y pulverizadas de L. tola, son extradas con cloroformo en un extractor Soxlhet durante 50 horas. El extracto clorofrmico se concentro y el residuo obtenido fue lavado repetidas veces con etanol; las soluciones etanlicas se reunieron y trataron con una solucin de acetato de plomo al 7% hasta la no formacin del precipitado; luego de la filtracin la solucin acuosa-etanlica fue liberado del exceso del acetato de plomo, concentrada y extrada con cloroformo. La CC de este extracto clorofrmico en silicagel G 60, por elucin con tolueno: acetato de etilo (3:2) separ un slido que luego de repetidas recristalizaciones en metanol y sublimacin posterior entre 160-170C dio agujas incoloras, que producen intensa fluorescencia azul celeste, caracterstica como las 7-hidroxicumarina o umbeliferona. En base a los resultados espectroscpicos.

4.- CROMENOS Y BENZOFURANOS4.1.- DEFINICINLos cromenos y benzofuranos son productos naturales que se han encontrado en algunas especies de: Rutaceae Liliaceae CiperaceaeEstos compuestos se encuentran presentes generalmente en hojas y tallos, y menos en races habindose encontrado en los primeros hasta un 5% sobre el peso seco.Son biogenticamente formados por combinacin de una unidad de isopreno y un sistema fenlico.Muchos cromenos y benzofuranos han demostrado ser biolgicamente activos como el toxol y la dehidrotremetona y la hidroxitremetona son txicos a los peces; el toxol y el angelato de toxilo exhiben una dbil actividad antitumor contra la leucemia linfoctica; el encecalin, el 7-hidroxiencalin y la 6-metoxieuparina son fototxicos a varios hongos y bacterias.

4.2.- TCNICAS GENERALES Varios cromenos y benzofuranos son voltiles y pueden ser extrados por destilacin por arrastre de vapor, sin embargo un procedimiento ms efectivo y ms suave es la extraccin de plantas frescas con solventes orgnicos como benceno, ter de petrleo: ter etlico (2:1), diclorometano o cloroformo. La cromatografa en columna o cromatografa en capa delgada preparativa en silicagel o cido silcico con fases mviles como diclorometano o mezclas de ter de petrleo: ter etlico, C: metanol son mtodos muy usuales para el aislamiento de cromenos y benzofuranos. Son tambin mtodos muy efectivos la utilizacin de CC usando SEPHADEX LH-20 con metanol como eluente.

4.3.- EJEMPLO DE APLICACIN Benzofuranos de Werneria ciliolata Las hojas, races y tallos secos y molidos (230 g) fueron extrados con cloroformo (2 L) en un Soxlhet. El extracto fue concentrado al vaco y el residuo gelatinoso agitado con etanol (250 ml) y filtrado. A esta solucin etanlica se le agrego solucin acuosa de acetato de plomo al 4% formndose un precipitado, el que fue separado por filtracin. El filtrado se concentr y agit con acetato de etilo; el extracto de acetato de etilo se concentro y el residuo 96,71 g se cromatografi sobre silicagel. La elucin con benceno: acetato de etilo dio cristales incoloros, por recristalizacion en ter de petrleo, de dihidroeuparina, de punto de fusin 68C. Otra muestra de 100 g de material seco y molido se macer por 30 das en una mezcla de ter de petrleo: ter etlico (2:1), obtenindose 3,2 g de extracto seco. Este extracto fue cromatografiado en columna de Silicagel y eluda en mezcla de polaridad creciente de ter de petrleo: ter etlico. La segunda fraccin se someti a CCDP en benceno: C (1:1) separndose 15 mg de cristales de color amarillo palido de 2,5-diacetil-6-hidroxibenzofurano de punto de fusin 134 C.5.- XANTONAS5.1.- DEFINICINSon pigmentos fenlicos amarillos; qumicamente son diferentes a los flavonoides, pero son muy similares en sus reacciones de coloracin y en su movilidad cromatogrficas. Se presentan especialmente en ciertas familias: Gutiferae Gentianaceae Moraceae PoligonaceaeLa gentisena es probablemente formada a partir del cido 4-hidroxibenzoico y de tres unidades de malonil CoA. Para otras Xantonas se propone que se originan a partir de las antraquinonas; por ruptura oxidativa en el anillo B se forma derivados de benzofenona que luego son transformados en Xantonas.

5.2.- TCNICAS GENERALES Las Xantonas pueden ser extradas del material que las contiene con solventes como C o metanol, y ser separadas con CCD sobre gel de slice utilizando sistemas como: Benceno: C (3:7) C: metanol (7:3)Para glicsidos puede utilizarse acetato de etilo: metanol: (100: 16,5: 7). Para algunas xantonas solubles en agua como la mangiferina, puede utilizarse la CP.Otras tcnicas cromatogrficas son tambin muy usuales como la filtracin en Sephadex LH-20 con metanol o C: metanol (1:1).Pueden ser detectadas en una cromatografa por su coloracin al UV con y sin amoniaco; con solucin de KOH al 5% en metanol, o en general usando reveladores para grupos fenlicos. Entre las propiedades espectrales sealaremos que en le UV presentan mximos de absorcin a 230-245, 250-265, 305-330 y 340-400 nm.

6.- QUINONAS6.1.- DEFINICIN Las quinonas naturales son un grupo de compuestos cuya coloracin puede ser desde amarillo plido hasta casi negro. Se encuentran frecuentemente en la corteza, en el corazn de la madera o de la raz, y en algunos casos en las hojas, donde su color esta enmascarado por otros pigmentos. Para confirmar su presencia puede ser til una simple reaccin de color basado en las propiedades redox de las quinonas; as, la reduccin a un producto incoloro y la fcil regeneracin de su color por oxidacin es caracterstico y distintivo de ellas (en comparacin a otros compuestos naturales coloreados). La reduccin puede efectuarse con solucin neutra o alcalina de ditionito de sodio u otros agentes reductores, y la oxidacin con perxido de hidrogeno o la simple agitacin al aire de la solucin. Las quinonas se sub-dividen en: Benzoquinonas - Naftoquinonas Antraquinonas - Quinonas isoprenoidesLas quinonas son conocidas por sus propiedades tintreas. Algunas presentan otras propiedades como la emodina que es catrtica; shikonina, antimictica; rhein, bajo la forma de diacetato, antirreumtico; etc.

6.2.- TCNICAS RECOMENDADAS6.2.1.- DE EXTRACCINDe acuerdo a su solubilidad y polaridad pueden ser extradas en solventes de diferente polaridad, por lo que generalmente se utiliza la extraccin secuencial con solventes de polaridad creciente y luego los extractos se fraccionan y purifican por las diversas tcnicas cromatogrficas.Otro mtodo es la extraccin en medio alcalino aprovechando la presencia de grupos hidroxilos fenlicos; as las naftoquinonas y antraquinonas -hidroxiladas en el anillo bencnico son solubles en solucin de bicarbonato de sodio.

6.2.2.- DE SEPARACIN CROMATOGRFICA Y DE DETECCINLa CCD en gel de Silice es un procedimiento general para la separacin de quinonas, aunque dada la variedad de estructuras no hay un sistema de solvente nico; por lo general las benzo- y naftoquinonas son liposolubles y para ellas pueden utilizarse solventes puros como: benceno, cloroformo, ter de petrleo o mezclas de ellos; en el caso de antraquinonas o quinonas ms hidroxiladas son usuales sistemas como:- Acetato de etilo: metanol: (100:16,5:13,5): ter de petrleo: formiato de etilo: cido frmico (90:40:1).Desde que las quinonas son coloreadas, ellas son detectadas a la luz visible; pero tambin pueden ser examinadas a la luz UV o utilizar reactivos cromogenicos como el azul de leucometileno que produce en la benzo y naftoquinonas manchas azules sobre un fondo blanco, o KOH metanlico al 10% que producen cambios de color de las manchas originales, de amarillo a rojo, violeta, verde o prpura.

6.2.3.- TCNICAS ESPECTROMTRICAS Las mediciones espectrales son esenciales para la identificacin de las quinonas. El espectro UV-Vis indica la clase de quinona presente, desde que el nmero y posicin de las bandas de absorcin aumenta con la complejidad de la estructura.

6.3.- EJEMPLO DE APLICACIN Lapachol de especies de Tabebuia 50 g de madera seca y molida de lapacho fue macerado durante 24 h con 300 ml de NaOH al 1%; al cabo de ese tiempo se le agreg HCl 6N hasta la formacin de un precipitado (pH 7) el que fue separado por filtracin, lavado con etanol varias veces, luego disuelto en C y dejado recristalizar. El proceso se repite varias veces hasta obtener cristales amarillos de lapachol (400 g) de punto de fusin 137-139 C. Quinonas de Pseudocalymma alliaceum 130 g de corteza y tallo de ajo sacha se extrajo con 700 ml de metanol; el extracto se concentro a sequedad (9,0 g) y fue sometido a una particin con acetato de etilo: (1:1). El extracto acetato de etilo (0,41 g) se someti a una CC de silicagel 60 eluyendo con cloroformo con cantidades crecientes de metanol, obtenindose luego de la purificacin de las diversas fracciones, cuatro compuestos quinnicos de color amarillo, para los que se propone las siguientes estructuras en base a sus datos espectroscpicos. 6-hidroxi- -lapachona (1,7 mg. Fusin 118,5-119,5 C) 4,6-dihidroxi- - lapachona (1,44 mg p. fusin 123-127,5 C) 6-hidroxi-9-metoxi- -lapachona (1,1mg) 4,6-dihidroxi-9-metoxi- -lapachona (1mg p. fusin 152-156 C)

III.- ALCALOIDES

1.- DEFINICIONES Substancias bsicas que contienen uno o ms tomos de nitrgeno como parte de un sistema cclico, que manifiestan actividad farmacolgica.Los alcaloides constituyen el grupo ms grande de metabolitos secundario de plantas. Se encuentran en las semillas, races, cortezas y hojas; al estado libre o como glicsidos, o formando sales con cidos orgnicos.Los alcaloides derivan principalmente de los aminocidos ornitina, lisina, fenilalanina, triptfano y del cido antranlico, a travs de una serie de reacciones.PRINCIPALES ALCALOIDES EN EL COMERCIO. SU ACCIN FISIOLGICA

PLANTAALCALOIDESACCIN FISIOLGICA

Belladona (Atropa belladonna)AtropinaAntiespasmdico, estimulante, analgsico

Coca(Erythroxylum coca)CocanaEstimulante, analgsico local, sedante

EmetinaEmtico, expectorante, antipirtico, amebicida

Mandragora (Mandragora autumnalis)EscopolaminaHipntico, sedante

Hesperolaburnum

EspartenaEstimulante cardiaco, diurtico

Hierba loca(Hyoscyamus niger)HiosciaminaHipntico, sedante cerebral, midritico

Adormidera(Papaver somniferum)MorfinaNarctico, sedante hipntico, analgsico

ChinchonaQuininaTnico, emenagogo, antisptico, antipirtico

Efedra (Ephedra distachya)EfedrinaAsma, insuficiencia circulatoria

Adormidera (Papaver somniferum)CodenaAnalgsico, sedante, hipntico

Adormidera(Papaver somniferum)PapaverinaRelajante muscular

2.- TCNICAS RECOMENDADAS Debido a la gran diversidad de estructuras que pueden presentar los alcaloides, el tener como referencia la planta (familia y gnero) del cual ha sido aislado reduce el problema de identificacin y clasifica al alcaloide dentro de un determinado tipo; la posterior aplicacin de pruebas de cromatografa de capa delgada en combinacin con reacciones especificas de coloracin hace posible en muchos casos la identificacin de un alcaloide conocido. La cual puede ser comprobada con un registro UV e IR. En el caso de alcaloides desconocidos, son indispensables mtodos espectrales como ESPECTROMETRA DE MASAS. 2.1.- DE EXTRACCINDada la importancia de los alcaloides se ha desarrollado diversos mtodos para obtenerlos los cuales se sealan a continuacin. Usando una solucin acuosa o alcohlica dbilmente acida (HCl 1N o 1N, o de cido actico o tartrico 10%), el extracto es luego alcalinizado con amoniaco, hidrxido de calcio o carbonato de sodio y los alcaloides as liberados, son extrados finalmente con solventes orgnicos como cloroformo, diclorometano, ter etlico; obtenindose extracto crudo de alcaloides. Liberando antes los alcaloides: humedeciendo el material con soluciones diluidas de amoniaco o carbonato de sodio, secado al aire, y extrado con solventes orgnicos como cloroformo, diclorometano, ter etlico. El extracto orgnico se concentra y se trata con cido diluido formando las sales de los alcaloides; se alcaliniza este extracto cido y los alcaloides liberados se extrae con uno de los solventes inmiscibles sealados antes, teniendo el extracto crudo de alcaloides. Es preferible desengrasar el material antes de iniciar el proceso.

2.2.- REACCIONES DE COLORACIN Y DE PRECIPITACINPara determinar la presencia de alcaloides se ha desarrollado un gran nmero de reactivos de coloracin y de precipitacin; algunos de ellos son considerados de aplicacin general mientras que otros de usos especifico y sirven para clasificaciones parciales de estas substancias; se considera que hay presencia de alcaloides si dan reaccin positiva a por lo menos a cuatro reactivos: DRAGENDORFF, MAYER, WAGNER, SONNESCHEIN.

2.3.- TCNICAS CROMATOGRFICASLa cromatografa de capa delgada es la mas usual utilizando principalmente silicagel G; otros absorbentes usuales son: poliamida, celulosa o la silicagel G hecha alcalina por preparacin de la placa con una solucin de KOH 0.5 N o NaOH 0.1 N en vez de agua. Los sistemas de solventes son tambin muy variados, al igual que las reacciones de coloracin y de precipitacin.La CCDP y LA CC siguen constituyendo las tcnicas ms comunes para la separacin de los alcaloides de los extractos crudos.

2.4.- TCNICAS ESPECTROMTRICASEl UV, siendo uno de los mtodos espectromtricos ms antiguos, es an una herramienta til en la identificacin y elucidacin estructural de los alcaloides. Hay grupos de alcaloides que no absorben esta regin como los alcaloides de pirrolidina, de piperidina y los esteroalcaloides.En el IR los alcaloides carecen de absorciones que permiten identificarlos, pero proporciona informacin sobre la presencia o ausencia de ciertos grupos sustituyentes, las absorciones usualmente tiles son de 3700 3200 para determinar presencia de grupos hidroxilo o amino; 3060 2800 grupos metilo, metileno o vinlico; 1780 1620 grupos carbonilo; 1600, 1550, 1500 sistemas aromticos.

VALORES DE ABSORCIN EN EL UV

ALCALOIDE mx. nm (en )

Berberina Quinina Estricnina Atropina Coniina Mezcalina Cocana Morfina Codena228250254258268268275284284

2.5. EJEMPLO DE APLICACIN Determinacin de alcaloides en las hojas de coca Se pesa 10 g de muestra seca y pulverizada, se humedece con una solucin saturada de NC y se extrae en un Soxlhet con una mezcla de ter de petrleo: ter etlico (1:1), durante 8horas.El extracto ter de petrleo: ter etlico, se extrae con S 2N (140 ml, 130 ml,120 ml). Los extractos cidos reunidos se alcalinizan con una solucin saturada de NCy se extraen con hexano (140ml, 130ml, 125ml). Los extractos hexnicos, que contienen los alcaloides, se renen, se secan con S anhidro y se concentran a sequedad.La mezcla slida de alcaloides se disuelve en 30 ml de S 0,1 N se agrega indicador rojo de metilo y se titula con NaOH 0,1 N.El resultado se expresa como porcentaje de cocana.

Alcaloide oxindlico pentacclico de Uncaria guianensis, ua de gato o garabato colorado Las hojas secas y molidas de U. guianensis fueron desengrasadas con benceno, luego humedecidas con N al 10% (72 horas), y finalmente maceradas con acetato de etilo (72 horas).El extracto acetato de etilo se concentr, se extrajo con S al 2% y se alcalinizo con N hasta pH 11. El precipitado formado se separ y se trato con cloroformo; el extracto clorofrmico obtenido, de color amarrillo verdoso, fue concentrado y el residuo recristalizado por varias veces por una mezcla de CHC: metanol, obtenindose agujas cristalinas de punto de fusin 262-263 C identificadas como: mitrafilina, alcaloide oxindlico pentacclico.

CAPITULO IV

4.- METODOS PARA EL DESASRROLO DE LA INVESTIGACION

Los mtodos empleados durante esta investigacin fueron los siguientes: Mtodo analtico. Mtodo experimental. Mtodo deductivo.

CAPITULO V

5.- CRONOGRAMAS DE ACTIVIDADES

ACTIVIDADESMESES

AMJJ

Revisin bibliogrficaxx

Recoleccin de datosxX

Redaccin e impresin del proyectoXx

Levantamiento de observaciones finalesx

Sustentacin del proyectox

CAPITULO VI

6.- PRESUPUESTO Y FINANCIAMIENTO

DESCRIPCIONUNIDADCANTIDADVALORUNITARIO (S/.)TOTAL (S/.)

A. Costos directos

MATERIAL DE OFICINA

Papel bond A-4Unidad600.053.00

LapiceroUnidad31.003.00

LapizUnidad21.002.00

CorrectorUnidad13.003.00

BorradorUnidad21.002.00

Libreta de apuntesUnidad13.003.00

MANO DE OBRA

Mano de obra20.00

SERVICIOS

FotocopiasHojas400.104.00

ImpresinHojas500.2010.00

MovilidadPasajes15.00

CdUnidad11.001.00

B. Costo indirecto

Imprevistos15.00

TOTALS/. 81.00

CAPITULO VII

7.-BIBLIOGRAFIA

Dominguez, X. A. Mtodos de investigacin Fitoqumica. Limusa. Mxico.

Lock de Ugaz, Olga. (1994). INVESTIGACION FITOQUMICA. Mtodos en el estudio de productos naturales. Pontificia Universidad Catlica del Per. Seg. Edic. Fondo Editorial. Per. (1973).

Pomilicia, Eduardo. Introduccin al estudia de los Productos Naturales. Universidad de Buenos Aires. Argentina.

Valencia Ortiz, Ciria. Fundamentos de Fitoqumica. Mxico. Trillas 1995.

CAPITULO VIII8.-ANEXOS

ANEXOS 01. DETERMINACION DE BIOMOLECULAS DE EUCAPILTO

ANEXOS II: REACCIONES DE COLORACIN O PRECIPITACIN PARA ALGUNOS PRODUCTOS NATURALES

MTODOPROCEDIMIENTOCOLORAPLICACIN Y COMENTARIO

TRITERPENOIDE

Ac. tricloroacticoMs. + cristales de c. TricloroacticoNaranja, rojo, rojo oscuro.Triterpenos tetracclicos y esteroides desarrollan color a 60 C, triterpenos pentacclicos 110 C.

Carr Price1 mg Ms/CH + 2 ml Sb al 30% en CHAzul Originalmente para vitamina A; positivo: derivados de colestano con dieno o trieno potencial en anillos A y B.

KeddeA: c. 3,5 dinitrobenzoico 2% en Metanol.B: KOH 5,7% en R: mezclar A+B, volmenes iguales 1mg Ms+2 gotas R.Prpura o violceoPositivo: glicsidos cardiacos, para anillos -lactona-,-insaturado.

Liebermann-Burchard1mg Ms/pocas gotas cido actico + 3ml anhidro actico/ (50:1)Verde, azul verdoso (va rojo o azul)Positivo: esteroides conteniendo 2 C=C conj. O formados por deshidratacin con

NollerR: anh. 0,1 % /SO.Ms+0.2 ml RCambios de coloracin/60 CTriterpenoide

RosenthalerMs/sol. Etanlica de vainillina al 1%+1gt HCL conc.variosPara sopogeninas esteroidales y triterpenoidales

Salkowski1-2 mg Ms (seco o 1ml CH) + 1ml + anhidro acticoAmarillo-rojo sangreAplicacin como paraLiebermann-Burchard

Tortelli-Jaff0.5 mg Ms/0.2 ml anhidro actico (+gotas de CH para disolver). Agregar cuidadosamente 0.1 ml 2% / CHVerde en la interfasePara esteriodes, dobles enlaces terciarios o potenciales.

FLAVONOIDES Y OTROS COMPUESTOS FENLICOS

BorntragerMs/benceno+NaOH 5% acuosoRojo en fase acuosoPositivo: antraquinonas y naftoquinonas

Cloruro frricoR: 1 gt 100 ml de .Ms+1 gt RAzul, verde negroPositivo: comp. Fenlicos, taninos

Dimroth (c. Brico)Ms/acetona+c. Brico y c. Ctrico.Amarillo o amarillo verdePositivo: 5-hidroxiflavona

Gelatina-cloruro de sodioR: 1 g gelatina/100 ml +10 g NaCl.Ms+1gt RPpdo.Positivo: taninos

Marini-Bettolo5 mg Ms/5ml + 1 ml Sb 2%/ CPpdo. Amarillo

Ppdo. Rojo a violetaPositivo: flavonas, flavonoles, flavanonas.Positivo: chalconas

ShinodaMs+limadura de Mg+HCl con.Tonos rojosPositivo: ncleo de -benzopirona

Rosenheim Ms+HCl 2N/1-propanol. Hervir 15-30 min.RojoPositivo: catequinas

ALCALOIDES (reacciones de coloracin)

DMBR: 4-dimetil-amino-benzaldehido al 5% en c.Ortofosfrico/metanol.Ms+1 gt R.VioletaAcido lisrgico y sus amidas.

Ehrlich0.5 mg Ms/1 ml etanol +1ml 4-dimetil-amino-benzaldehido 5%/HCLvioleta

ErdmannA: 6 gotas HN/100 ml .R: 10 gtas. A+20gtas .1-2mg Ms+8-10 gtas RRojo, otros coloresBrucina, tebana, veratrina, morfina, codena, colchicina, atropina.

FrohdeR: 5 mg c. Molibdico o molibdato de sodio/1ml . Fresco Ms+2-3 gotas RRojo,verde, azulBrucina, tebana, veratrina; morfina, codena, papaucrina; apomorfina, berberina emetina.

KellerMs/cido actico+trazas de anh/Azul intenso en interfaseAlcaloide ergot

MandelinMs +10 mg vanadato de amonio en 2 ml Violeta, azul rojoSolanina, estrictina

MarquisA: 8-10 gtas de aldehdo frmico al 40% en 10 ml de cido actico glacial.B: Ms+1 gt A+3gtas BNaranja,violeta, prpuraMezcalina y anfetamina; alcaloide del opio; herona, morfina.

MeckeA: 0,25 g de c. Selenioso en 25 ml de cido actico glacial.B: Ms+1 gt A+3gtas BAzul-verdosoMorfina y herona

OttoMs/80% + 1gt diluido.Rojo-violeta a azul prpuraEstricnina; alcaloides indolicos.

ShaerR: 1ml 30% +10 ml .0,1 mg + 2-3 gotas RverdeAlcaloide del tropano

Tiocinato de cobaltoR: 0,8 g tiocianato de cobalto+1ml c. Ortofosforico/100 ml metanol: (2:3).Ms+1gt RAzul-turquesaCocana. Otros anastsicos.

REACCIONES DE PRECIPITACIN

Dragendorff (yoduro de bismuto y potasio)A: 8 g Bi.5/20 ml HN.B: 27,2 g KI/50 ml .Mezclar, reposar, decantar super- nadante. Diluir a 100 ml.Rojo a naranjaAgregar a solucin cida de alcaloide.

Mayer (yoduro de mercurio y potasio)A: 1,36 g Hg / 60 ml B: 5 g KI/ 10 ml de Mezclar. Diluir a 100 ml.

Blanco a cremaAgregar a la solucin acidulada, precipita solo en exceso de reactivo.

Sonneschein (c. fosfomolbdico)Sl. cida de molibdato de amonio, agregar sl. c. Saturada de , hasta formacin de pptdo. Filtrar, lavar ppto. y disolver en sol. Saturada de . Evaporar a sequedad. Disolver 10 g de residuo en 100 ml de HN

Naranja

General

Wagner (yodo-yoduro de potasio)1,27 g + 2 g KI/5 ml . Diluir a 100 ml.Marrn

General

DETERMINACIN DE BIO-MOLCULAS EN PLANTAS MEDICINALESPgina 12