BASES MOLECULARES DE LAS DISTROFIAS MUSCULARESBQ29. Dra Cervera

Las distrofias musculares son una serie de enfermedades genéticas con unas características comunes:

1.- Elevación plasmática de las enzimas musculares (CPK, ...): en el caso de la Distrofia muscular de Duchenne el aumento de CPK es de 60 veces y en portadoras de 3-4 veces.

2.- Debilidad muscular progresiva con desaparición de tejido muscular y aumento de tejido conectivo. Casi siempre comienza con músculo esquelético aunque finalmente tb haya afecc. cardiaca.

Dentro de las distrofias musculares se incluyen las distrofinopatías (alteraciones en el gen de la distrofina ) y las sarcoglicanopatías (en las que se produce la alteración de otros mienbros del complejo distrofina – glicoproteína ). Antiguamente estas enfermedades se clasificaban más bien de una forma clínica:

1.- Distrofia muscular de Duchenne (DMD: Herencia LX. Muy grave. Inicio 4-5ª. Muerte por alt cardiacas)2.- Distrofia muscular de Becker (DMB: HLX. Más leve. Inicio adolescencia. Clínica muy variada)3.- Distrofia muscular de las cinturas escapulares y pelvianas: cuadro muy heterogéneo de herencia autosómica dominante o recesiva4.- Distrofia muscular congénita: Ambas HAR. Dos variantes con clínica similar:

- Clásica - Fukuyama (Japón): incluye alteración SNC

5.- Distrofia muscular de Emery – Dreyfuss (HLX)6.- Distrofia miotónica

Hoy se tiende a la clasificación según el DEFECTO MOLECULAR:1. Distrofinopatías- sarcoglicanopatías : incluiría a las 4 primeras clínicas.2. Calpainopatías : alterac. Del gen de la calpaína 3 (proteasa del musc.

Esquelético).3. Distrofias miotónicas : por alteral. del gen de la kinasa miotónica por expansión

de tripletes.

1.- DISTROFIA MUSCULAR DE DUCHENNE - Se trata de una distrofia muscular progresiva de la musculatura proximal por

degeneración de las fibras musculares y sustitución por infiltración grasa y tejido conectivo.

- En un 10 – 15 % de casos existe afectación añadida de músculo cardíaco y retraso mental.

- Suele debutar a los 3 años y a los 7 – 9 ya necesitan silla de ruedas, falleciendo a los 18 – 20 años.

- Este mismo patrón es el que se presenta en la distrofia de Becker, sólo que de forma más leve que la de Duchenne, alcanzando incluso supervivencias de unos 60 años.

CARACTERÍSTICAS MOLECULARES:- La distrofina es una proteína muscular que se encarga de dar estabilidad a la

célula durante la contracción – relajación, para que pueda soportar los cambios de longitud durante las mismas.

- La distrofina no trabaja sola, sino que existe todo un complejo de proteínas transmembrana que interactuan con ella, contribuyendo así también en la estabilización de la célula muscular.

- Estas proteínas se llaman sarcogliconoproteínas y su alteración dará lugar a las sarcogliconopatías.

- Este complejo se asocia por último a la merosina o laminina 2, que se une a su vez con las proteínas que forman la matriz extracelular. La falta de merosina también produce otras enfermedades (sobre todo la distrofia muscular congénita). El complejo distrofina-glicoproteina esta localizado en la membrana de la célula muscular.

HISTORIA DE IDENTIFICACIÓN DEL GEN DE LA DISTROFINA:Supuso un hito en la historia de la biología molecular, ya que fue el primer gen

que se logró identificar por clonación posicional (1987). Se encuentra en el cromosoma

X, en la región Xp21. En 5 años se logró clonar este gen que es enorme. Se consiguió por los siguientes motivos:

- una mejora en la metodología- inversiones de la Sociedad de Distrofia Muscular ( de los Amish americanos, ya que en ellos

es muy frecuente )- porque este gen poseía características que facilitaban su clonaje:

· por su forma de herencia ya se sabía que estaba ligado al X, por lo que sólo había que buscar en este cromosoma

· sus mutaciones son grandes delecciones, fáciles de encontrar.Las estrategias para el clonaje que se emplearon fueron tres:

1.- al analizar a las pocas niñAs afectadas de DMD todas tenían como mutación responsable una traslocación entre un cromosoma (variable) y el cr X, y esa traslocación siempre ocurría en p21 del cr X: así la mutación se localizó en Xp21

2.- los niñOs tienen en ese cr X delecciones tan grandes que era posible verlas en el cariotipo al microscopio!!! se veía que esas delecciones eliminaban toda la banda 21

3.- estrategia clásica: análisis de ligamiento para identificar marcadores

Lo más importante para localizar un gen cuando no se sabe cúal es fabricar sonadas específicas para buscarlo; aquí se usaron por primera vez las sondas específicas de delección ( fragmento de DNA sano que se utiliza como sonda; si no hibrida con el DNA del paciente tenemos el diagnóstico )

- se coge DNA de un enfermo y se corta con enzimas de restricción- se coge DNA de una persona sana y se corta con enzimas de restricciónEn el DNA sano aparecen fragmentos no presentes en el DNA enfermo, que los tiene

deleccionados (esto se ve al hacer la electroforesis de ambos): se coge el fragmento del sano que no tiene el enfermo y se usa como sonda: si se rastrea el DNA de una persona con esa sonda y la sonda no hibrida querrá decir que ese fragmento está deleccionado: diagnóstico.

Otra estrategia para la búsqueda de sondas específicas, aparte de las “ sondas específicas de delección “ fue el uso del DNA de las niñas con la traslocación t(Xp21), que se sabía que era rRNA. Y gracias a estas sondas se logró clonar el gen, que era:

- enorme: 1% del cromosoma X. Es el 2º gen más grande después del de la neurofibromatosis. 2,3 millones de nucleótidos.

- Tiene muchísimas secuencias intrónicas: el gen se organiza en 79 exones, que sólo constituyen 14 Kb de mRNA: gran diferencia entre el tamaño del gen y del mRNA, sólo 1/200 nucleótidos están en los exones. No se sabe por qué esto es así.

Una vez que tuvieron el gen sacaron de él la proteína que codifica, y se hicieron Ac monoclonales marcados contra ella, que se utilizaron para buscar su ubicación en los tejidos: se localizó en el sarcolema de las células musculares (en su membrana plasmática).

Evidentemente en los enfermos de Duchenne no se detectaba y en los de Becker existía de forma discontínua (hay distrofina pero más pequeña y los anticuerpos hibridan peor con ella). Así pues la cantidad de distrofina se relacionaba con la gravedad del cuadro.

Morfología de músculos DMD. Tinción con anti-distrofina: Ver diferencias entre 1(IF+) y 2a (IF-) para Ac frente a Antidistrofina; b son los controless.

Morfología de un músculo BMD: hay patrón IF pero no es continuo ni intenso.

Inmunotinción de un músculo de paciente con una sarcoglicanopatía: A es enfermo de 13 a sin tinción específica y ↑tej conectivo; B es control.

Inmunotinción de un músculo de un paciente con una Distrofia muscular congénita (CMD): ↑Tej conectivo con IF específica -.

DISTROFINA: es una proteína de 427.000 D (muy grande) fundamental para la contracción en registro –al unísono- de todas las fibras musculares; está formada por cuatro dominios:

1.- Dominio amino terminal: Es el dominio de unión a la actina.2.- Parte central: 24 dominios formados por la repetición

sistemática de 109 aminoácidos. Estas unidades son parecidas a las de la espectrina (que se encuentra en la parte interna de los glóbulos rojos y les da cierta flexibilidad ).

3.- Tercer dominio: dominio rico en cisteína: es similar al de la alfa actinina, con dos regiones de unión al calcio: implicado en la homeostasis del calcio.

4.- Dominio carboxi terminal: unida al complejo de glicoproteínas (complejo de distroglicanos y sarcoglicanos), interacciona mediante la Laminina α (merosina) con la matriz EC. El tercer y el cuarto dominio son las dos regiones más importantes

en la función de la distrofina.

Las isoformas de la distrofina: este gen tiene una regulación a nivel transcripcional muy compleja y esto hace que existan muchas isoformas de la distrofina. El gen está regualdo por 5 promotores distintos que darán lugar a 5 isoformas, que son las de músculo esquelético, músculo liso y cardíaco y cerebro. Existen tres promotores para el gen de músculo (sobre todo) y cerebro ( P1, P2 y P3 ). Cada una tiene un exón distinto. De P4 y P5 no se conoce su funcionalidad.

En la clase del año pasado varía un poco la información a este respecto; os lo pongo también por si lo preguntaran de otra forma:

C M P S G5’ 3’

C, M y P: estos promotores generan una distrofina de pm 427.000 D, es decir, la normal.S y G: promotores “internos” del gen que dan isoformas mucho más pequeñas (S distrofina y G clutrofina ). La ausencia de estas isoformas explican el retraso mental, ya que son las del cerebro.- La distrofina es un dímero dispuesto de forma antiparalela- Este dímero interacciona directamente con un complejo glicoproteico que se encuentra en la

membrana celular muscular (sarcolema); está formado por una serie de subunidades: distroglicanos y sarcoglicanos. En los apuntes del CD lo llamaban “complejo DAP o DAG”; este año no dijo nombre concreto. Este complejo a su vez interacciona con laminina 2 o merosina, que sirve de unión con las proteínas de la lámina basal.

- Esta disposición de la distrofina y el complejo hace que se conecte el interior con el exterior de la fibra muscular, realizando una función estabilizadora de la célula muscular, contribuyendo a su correcta contracción y relajación; cuando desaparece la distrofina se altera esta función de anclaje y la contracción es defectuosa: en principio la fibra muscular intenta compensar este defecto hipertrofiándose, pero acaba fracasando y la fibra muscular degenera y es sustituida por tejido conectivo y grasa.

El conocimiento definitivo de todas las proteínas implicadas en este mecanismo ha permitido identificar la alteración molecular responsable de otras distrofias asociadas.

- Distrofina: Duchenne y Becker- Sarcoglicanos: Distrofia muscular de cintura escapular y pelviana

- Laminina 2 o merosina: distrofia muscular congénita clásica (la de la Fukuyama se llama fukutina y no se conoce su función, aunque se sabe que su déficit produce disminución de laminina 2 ).

- Caveolina: cinturas. Gen 1C (1 por HAD y C por el gen afecto: caveolina).

RELACIÓN GENOTIPO – FENOTIPO

Se realizó un análisis de mutación en 130 pacientes con DMD, para estudiar las alteraciones producidas en el gen de la distrofina. Se sacaron las siguientes conclusiones:

1.- Naturaleza de la mutación- delecciones: el 60% de los casos de DMD y DMB están producidos por una

mutación, que además es grande. Existen “hot spots” o puntos calientes que son las zonas donde más frecuentemente se produce la delección (normalmente alrededor del exón 45 al 50).

- Traslocaciones: niñas. 25%- Mutaciones puntuales ( raro )- Duplicaciones

2.- Relación entre el tamaño de la delección y la severidad del cuadro: que la delección sea de mayor tamaño no conlleva que la clínica sea más grave. Existen enfermos de Becker que tienen grandes delecciones y sin embargo tienen poca patología y enfermos de Duchenne con pequeñas delecciones y un cuadro muy florido.

3.-Relación entre la gravedad del cuadro y que se produzca una rotura en la fase de lectura del gen por la delección: sí que existe relación entre estas dos variables

- si se rompe la fase de lectura: NO hay proteína: DMD- si no se rompe: SI hay distrofina, pero más pequeña: DMB

Por tanto lo que es importante es DÓNDE se produzca la delección, no el tamaño de la misma. Esto implica que una distrofina pequeña es suficiente para mantener una función aceptable y esto tiene importancia en futuros tratamientos de terapia génica: es más fácil introducir minigenes que genes grandes. Recordad que las regiones carboxi terminal y rica en cisteina son las más importantes para la función de la distrofina.

Después de todos estos estudios se decidió reclasificar las distrofias musculares en función de la causa molecular que la produzca:

- DMD y DMB: distrofinopatias- Distrofia muscular de cinturas: grupo heterogéneo asociado a la alteración de

sarcoglicanos- Distrofia muscular congénita: alteración de merosina- Cardiomiopatía dilatada ligada al cromosoma X: producida por la falta

específica de la distrofina del corazón.

Existen 12 tipos distrofias del tipo de cinturas: 1 (de la A a la C) y 2 (de la A a la H) por alteración de las proteínas siguientes: caveolina, calpaína, sarcoglicanos y dysferlina. 1 es HAD y 2 es HAR.

PROTOCOLO DE IDENTIFICACIÓN

FENOTIPO

BIOPSIA MUSCULAR

TINCIÓN DISTROFINA

DISMINUIDA NORMAL

= DMC

WESTERN BLOT TINCIÓN SG (para medir proteínas)

Normal

NO Disminuida o truncada TINCIÓN LAMININA

Y MEROSINA 2 DMD DMB

Deficiente N- DMC: de cinturas- DMCo: congénita

DMCo Otras

2.- DISTROFIA MIOTÓNICA (DM)

- Enfermedad neuromuscular en adultos- Incidencia : 1/8.500. Es la enfermedad neuromuscular más frecuente en adultos- Enfermedad multisistémica con miotonía, debilidad progresiva con miotonía y pérdida de masa muscula y aumento del tejido conectivo.- El fenotipo es muy variable, existiendo 3 formas: leve, clásica y grave:

- leve: 50 – 60 años: cataratas y debilidad leve; muchas veces pasa desapercibido

- clásica: adultos jóvenes. Forma típica- grave o congénita : infancia: mortal muchas veces.

- Herencia AD- El gen alterado recibe el nombre de DM y se encuentra en el cromosoma

19q13.3

- La mutación consiste en la expansión de un trinucleótido repetido (CTG ) presente en la región 3’ no traducida ( zona que no da proteína ) del gen DM, que codifica para una proteinkinasa. Es una mutación dinámica.

IDENTIFICACIÓN DEL GEN DE DM: CLONAJE POSICIONALTardó mucho tiempo en conseguirse porque aquí hubo que identificar primero en

qué cromosoma estaba (fue por tanto difícil encontrar la sonda ); pero cuando se conoció por análisis de ligamiento, la identificación del gen fue mucho más rápida. La identificación de los marcadores D19S63 y D19S95 que presentan con DM un fuerte desequilibrio de ligamiento fue fundamental para la clonación de este gen.

Cuando se cortaba el DNA con enzimas de restricción ( y se hacía Southern ) se veía que en todos los individuos enfermos aparecía una banda de DNA de mayor tamaño de la que aparecía en individuos sanos de 9Kb, y la de 9Kb aparecía muy disminuida: esto refleja la amplificación del triplete en cada enfermo en mayor o menor medida. La aparición de una nueva banda corresponde a la región del gen no traducida y que aquí sí aparece al existir una expansión de CTGs.

Una vez conocido el gen se sintetizó la proteína, que resultó ser una serín – treonín – kinasa; todavía no se conoce el sustrato de esta enzima, pero sí se sabe que en la zona no traducida su gen (zona 3’UTR) tiene un triplete que es el responsable de la enfermedad.Población normal: 5 – 37 tripletesPoblación enferma: 40 – 180 : clínica leve

200 – 1000 : clínica clásica 1000 – 5000 : congénita

FENÓMENO DE ANTICIPACIÓNAdemás esta enfermedad presenta el fenómeno de anticipación: en estudios con

familias encontramos una relación entre el número de tripletes y la gravedad de la enfermedad, así como con la precocidad de la aparición del cuadro.Con PCR se vio que la gravedad era mayor en generaciones sucesivas (iban apareciendo más tripletes) y la enfermedad debutaba antes; el fenómeno de anticipación aparece sólo cuando quien transmite la enfermedad es la MADRE.

Hipótesis de por qué aparece la enfermedad por una alteración en una zona que no se traduce del gen:Se ha visto que:

- esta alteración permite que se exprese la proteína del gen- no tiene nada que ver con que esta alteración provoque que se sintetice

menos mRNAHipótesis:1.- Este gen, el anterior y el siguiente están muy juntos en el cromosoma; una expansión en los tripletes de esta zona del gen DM puede alterar la estructura de la cromatina, en concreto su activación (para activarse requiere una correcta expansión desde su nucleosoma).

En los genes existe una región de hipersensibilidad a la DNAsa 1, que aparece cuando la cromatina está menos compactada (el genoma está así más “activo”, sintetiza proteínas); justo en 3’ al lugar donde se produce la expansión de tripletes del gen DM se encuentra un gen de estos hipersensible a DNAsa 1. Este gen es un factor de transcripción: por lo que se producirá una alteración en la síntesis de proteínas de muchos tipos a nivel sistémico: explica la clínica sistémica. Es decir, si se altera la

expresión de los genes vecinos, habrá un fenotipo asociado al déficit de esas proteínas “vecinas”.2.- hay proteínas que se asocian el DNA en secuencias repetidas CUG, las cuales regulan el DNA (por tanto son muy importantes): si existe un mRNA alterado con repeticiones muy grandes de CUG se tendrán que secuestrar muchas de estas proteínas (CUGBP ) y ya no pueden usarse para regular el resto del DNA, por lo que se producirán alteraciones en la síntesis de distintas proteínas y por tanto la clínica sistémica ( se alteran proteínas que se requieren en órganos distintos ).