Bloque 4. Genética y Biología Molecular

Mapas conceptuales y tablassintéticas

Maestro en Ciencias BioquímicasGenaro Matus Ortega

Autor: Maestro en Ciencias Bioquímicas Genaro Matus Ortega. Asesor del grupo GUTE: www.gute.com.mxvisíta

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HISTORIA Y DESARROLLO DELA BIOLOGÍA MOLECULAR

Primera parte


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HISTORIA

Genes ligados,Genes auto y gonosómicos,Herencia citoplásmica,


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ESTRUCTURA DE ADN Y ARN:PROPIEDADES DERIVADAS

Segunda parte


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Estructura de la doble hélice


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Purinas

GuaninaAdenina


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Purinas Pirimidinas

Timina Citosina UraciloGuaninaAdenina

Timina = uracilo metiladoCitosina = uracilo aminado

Timina – uracilo –citosina


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Purinas Pirimidinas

Ribosa 2’-Desoxi-ribosa

Pentosa

RNA DNA

Timina Citosina UraciloGuaninaAdenina

Aldopentosa


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Estructura del ADN

Características del modelo de Watson y Crick (1953)

1.- El DNA está formado por 2cadenas de polinucleotidos

4.- Cada cadena se encuentrade forma perpendicular al eje.

5.- la doble hélice tiene undiámetro de 20 A (2nm)

6.- la doble hélice gira hacia laderecha del eje siguiendo laorientaión de los azucares.

7.- por cada 10 pares de bases, ladoble hélice da una vuelta

completa con una dimensiónlineal de 34 A.

8.- las bases nitrogenadas seorientan hacia el interior y laspentosas y fosfatos al exterior

9.- la complementaridad de lasbases cumple las leyes de

Chargaff (pares purina-pirimidina)

10.- las cadenas de polinucleo-tidos se unen por puentes de H.

11. Los enlaces fosfato-desoxirribosa están polarizados en

sentido opuesto 5’-3’ y 3’-5’

ESTRUCTURA

3.- las cadenas forman unadoble hélice antiparalela

2.- cada cadena consiste de ungrupo fosfato unido a un residuo

de -D-desoxirribosa y unabase nitrogenada


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Estructura del ARN

Contenido de RNAen la célula

BACTERIAS: 0.5-0.10 pg deRNA, 6% de su peso total

EUCARIOTAS: 20-30 pg deRNA, 1% de su peso total

3 tipos de RNAparticipan en la síntesis

de proteínas.

mRNA.

Contiene al mansajegenético que determina la

secuencia de amino ácidosen la síntesis de proteínas.

rRNA

Presenta cerca del 70% delRNA total.

tRNA

Existen diversas copiaspara cada gen de tRNA(redundancia de genes).

Existen 4 tipos eneucariontes: 18SrRNA,

28SrRNA, 5.8S y 5SrRNA

Existen 32 tipos de tRNA en célulaseucariontes, son pequeños (-4S)

Cada tipo de tRNAtransporta (en su

extremo 3´) uno delos 20 aminoácidos

Procesamiento de lospreRNA---- RNAm.

Splicing:remoción de

intrones.

Eventos de corte:procesamiento de

rRNA y tRNA

Modificacionesquímicas: adición

de gruposquímicos.

Edición del RNA:

Modificacionesquimicas *citidin

desaminasa-convierte una C a U

2 fuentes principales de RNA antisentido

Small interfering RNAs (siRNAs)

Micro RNAs (miRNAs)

ESTRUCTURA


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Desnaturalización del ADN


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Tasas de reasociación del DNA

Según su grado de asociación existendiferentes fracciones genómicas:

A) Componente rápido. Primera fracciónde reasociación. Que representa el 25% del genoma.

B) Componente intermedio. Segundafracción que corresponde al 30 % delgenoma total.

C) Componente lento. La última fracciónen renaturalizarse y supone el 45 %restante del genoma total.

¿Esto significará algo?


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Secuencias repetidas y no repetidas

Las secuencias de renaturalización lenta generalmente son regiones de DNAno repetitivas y casi todas las veces codificantes.

Según el grado de repetición las secuencias de DNA se clasifican en:

A) DNA repetitivo: si están presentes en más de una copia.

B) DNA moderadamente repetitivo: si tienen un rango de reasociación moderado

C) DNA altamente repetitivo: Representa la fracción de reasociación rápida y sonproducto de la reasociación de secuencias cortas localizadas en tandem enfrecuencias de repetición múltiple.

En este grupo también se encuentra el DNA satélite que consiste de regiones cromosómicascentroméricas inertes (no se transcriben).

El DNA microsatelite corresponde a fragmentos más cortos de DNA de alta asociación.

El DNA minisatélite o VTNR y las secuencias cortas forman parte de este DNA.


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Genes y genomasConcepto fundamental: Definición: Complementario:

Gen Secuencia de DNA que codificapara un RNA funcional.

Contiene informaciónextrínseca e intrínseca.

Genoma Conjunto de genes codificadosen el DNA.

Secuencias no codificantes Secuencias regulatorias de laduplicación, transcripción ocontrol epigenético.

OriC, ARS, ACS, Intron,Promotor, Terminador,DNA espaciador

Densidad génica y genómica

Cistron Unidad monogénica. Cis-trans (un promotor controlala expresión de un gen).

Policistron Unidad poligénica dependientede un promotor.

Valor C Cantidad total de DNA en elgenoma

Paradoja del valor C No correspondencia entre eltamaño del genoma y el númerode genes.


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Lynch et al. (2001) Genetics

Nonfunctionalization Neofunctionalization Subfunctionalization

On the fate of duplicated genes……

deletereous mutagenesis

conservation

90% loose function

9% subfunctionalizatión

1% neofunctionalization


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Familias génicas


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CONTROL DE LA CROMATINA

Tercera parte


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Organización del DNAen células eucariontes

El DNA se asocia aproteínas llamadas

HISTONAS

Histonas H1

Histonasnucleosomicas:

H2A, H2B, H3, H4

El bloque de construcción de lacromatina es el nucleosoma

Es la unidad mínima deconstrucción de cromatina,involucra todas las histonas

excepto la H1.

dimeros

Octameros(nucleosoma)

Cubre 200 pares de bases.

Collar de cuentas

solenoide

Asas de cromatinaRegiones de cromatina en metafaseCROMOSOMA

Modelos deinteracción

nucleosoma - DNA

*ricos en hélices

*formación deheterodímeros:

H3-H4. H2A-H2B.

*residuos de fosfatointeraccionan con las

histonas.

*interaccioneselectrostaticas ypuentes de H.

Los extremos amino delas histonas pueden ser

modificadas por enzimas:Acetilación, Metilación, Fosforilación.

Estructurade la

cromatina

Eucromatina (A) Heterocromatina


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La subunidad que se repite en la estructurade la cromatina es el nucleosoma

165pbDNAespaciador

Los trabajos de A. Klug y colaboradores (1980) sobre la disposición delas histonas en el nucleosoma le valieron el Premio Nobel de Química(1982).


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Las fibras de 30 nm se unen aun armazón proteíco enregiones especificas llamadasSAR [regiones asociadas con elarmazón o regiones de unión ala matriz (MAR)].

DNA

Nucleosoma

Fibra de 30 nm (300 Å) o

solenoide

Asas o Bucles radiales deDNA


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CONCEPTO CONCEPTO NECESARIO CONCEPTO COMPLEMENTARIO

CROMATINA

(solo presente en Eucariotas)

Conjunto de ADN, histonas y

proteínas.

Se encuentran en el núcleo de

células eucariontes y constituyen el

cromosoma eucarionta.

HISTONAS Principal proteína presente en las

cromatinas.

Tienen carga positiva.

Ricas en lisina y Argina

Consecuencia de genomas grandes

Proteínas mas conservadas en

eucariontes

NUCLEOSOMA Conjunto de octamero de histonas

que involucran todas menos la H1

Cubre 200 pares de base

EUCROMATINA Representa la forma activa de la

cromatina.

Esta diseminada por el resto del

núcleo y aquí se encuentran la

mayoría de genes activos.

HETEROCROMATINA Representa la forma inactiva de la

cromatina.

Se localiza en la periferia del núcleo

y puede ser de dos tipos:

constitutiva y facultativa.

REGIONES Y TERRITORIOS NUCLEARES Nucleólos,

Dominios OPT,

Cuerpo PcG

Cuerpo PML,

Cuerpos de Cajal,


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Estructura del nucleonema

NucleoloNucleolo

No tiene membranasdelimitantes.

Es la estructura subnuclearmás prominente.

Producción y ensamblaje de lassubunidades ribosomales.

Precursor de 45S

Usa proteínas importadas delcitosol = RNP

FC: Centro Fibrilar

DFC: Componente denso fibrilar

GC: Componente granular


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Cuerpos nucleares

Cuerpos de Cajal:

Orgánulos esféricos nucleares presentes en células en alta proliferación(tumorales), o metabólicamente activas con alta tasa transcripcional(neuronas).

Ramón y Cajal las denominó “cuerpos accesorios nucleolares”, debido a suasociación con el nucléolo en las neuronas.

Su tamaño se sitúa entre 0.1 - 2.0 micrometros y su número es de entreuno a cinco por cada núcleo, variando a lo largo del ciclo celular y entre losdiferentes tipos celulares.

Los cuerpos celulares “son posibles lugares de ensamblaje o modificaciónde la maquinaria de transcripción del núcleo”.

Se encuentran únicamente en los núcleos de plantas, animales ylevaduras.


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Cuerpos nucleares

Los dominios OPT se relacionan con nuevas síntesis de RNA polimerasaII y dominios que contienen proteínas relacionadas con la transcripción yfactores de transcripción TFIIH, Oct1, BRG1, E2F-1, estos puedenrepresentar complejos de iniciación de transcripción incompletos, complejosinhibitorios, o sitios del almacenamiento.

El complejo grupo Polycomb (PcG, o cuerpo PcG) es una asociacióncromatina multiproteica relacionada con la represión estable de mutacioneshomeóticas, además de ser un complejo de represión transcripcional.


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Cuerpos nucleares

Las manchas -nuclear speckles- son estructuras intranuclearescaracterizadas por concentraciones altas de pre-mRNA, aunque su funciónes polémica, existe evidencia fuerte de que son sitios que unen piezas dealmacenaje o ensamblaje.

Cuerpos PML. Cuerpos nucleares promielocíticos, donde se sintetiza laproteína PML (882 residuos de aa, 97,5 kDa), cuya su función principales lasupresión del crecimiento celular.

Posee otras funciones relacionadas con la regulación de genes eimplicación en las vías de supresión tumoral y, por tanto, de la inhibición delcrecimiento celular.


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MEMORIA CELULAR: modificación química de lacromatina

Mediante acetilación, fosforilación, que permitenencender y apagar diferentes genes para formar untejido específico

DIFERENCIACIDIFERENCIACIÓÓN Y ESPECIALIZACIN Y ESPECIALIZACIÓÓNN CELULAR:proceso de remodelación de la cromatina

Determina características estructurales y funcionalesdistintas

ENVEJECIMIENTO CELULAR: mediado por genes Lleva a 2 tipos de muerte: apoptosis y necrosis

CELULAS TOTIPOTENCIALES

CELULAS MULTIPOTENCIALES

CELULAS OLIGOPOTENCIALES

CELULAS DIFERENCIADAS

CELULAS ESPECIALIZADAS

INSULATOR

ENHANCER

SILENCER

LCR

Control de la expresión génica

Cuerpos nucleares


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DUPLICACIÓN Y REPARACIÓNDEL DNA

Cuarta parte


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¿Cómo es la replicación del DNA?


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El oriC

El origen de replicación bacteriano se denomina OriC y corresponde a 245pb.

Tiene las siguientes características:

Es una secuencia rica en A y T.

Presenta 4 cajas de reconocimiento a DnaA (R1-R4 nonámeros repetidos).

Tiene 3 repeticiones de treceámeros que permiten la disociación del DNA.

Posee secuencias palindrómicas GATC de reconocimiento para lasmetilasas de Adenina (DAM)


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Proteina DnaA

- multicomplejo (10-20)

- ATP

- se une a los repetidos de 9 pb del

OriC

- provoca la separación de las

cadenas de los repetidos de 13 pb

Proteina DnaC

- “escolta” la DnaB a las DnaA

Proteina DnaB (Helicasa)

- hexamero

- ATP

- “abrazadora” alrededor de cad.

sencillas

- se desplaza a lo largo del DNA para

separar las cadenas en el sentido 5´-3´

5´ 3´


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Inicio de la replicación

Proteína: Funciones:

DnaA: 1.- Reconocimiento de OriC,2.- Curvatura, desestabilización y apertura del DNA,3.- Reclutamiento de DnaB y DnaC.

DnaB, DnaC 1.- Helicasas que impiden la reasociación del DNA,2.- Permiten el reclutamiento de SSB y de la DnaG(primasa).

SSB 1.- Impide la reasociación de las hebras de DNA,2.- Permite la liberación de DnaA (pre-primosoma)

DnaG 1.- Sólo se integra si DnaC ha sido retirado.2.- Coloca el cebador de RNA. Define la formacióndel primosomaprimosoma.


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Crecimiento de DNA y RNA 55’’⇨⇨33’’

Se requiere un extremo 3’-OHlibre para que ocurra el ataqueelectrofílico sobre el alcohol.

El crecimiento de cada cadenaes unidireccional.

La doble hélice crece demanera bidireccional


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Elongación de la replicación

Proteína: Funciones:

Hda/Ida: Permiten que se retire las DnaA

DnaG Coloca el primer (iniciador, cebador, prímero) de 10-12nucleótidos de RNA sobre el molde de DNA.

Se requiere para dejar un extremo 3’-OH.

Dnapol III Toma el extremo 3’-OH dejado por la primasa ypolimeriza DNA en ambas cadenas (líder continua,retrasada discontinua F. OkazakiF. Okazaki).F y x permiten la retirada de SSB.

Dnapol I (Rnasa) Retira los fragmentos de RNA.

Dnapol I (polimerasa) Rellena los huecos dejados por la actividad de RNAsa.

Dna Ligasa Sella los fragmentos de Okazaki.


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FIDELIDAD:FIDELIDAD:

El seguimiento exacto de la secuenciaque sirve como molde.

La actividad de exonucleasa 3’ 5’ dela DNA polimerasa contribuye a lafidelidad pues tiene actividad correctora(proofreading).

Hay dos propiedades importantes de las DNA POLIMERASAS:

FIDELIDAD Y PROCESIVIDAD

PROCESIVIDAD:PROCESIVIDAD:

La capacidad de una DNA polimerasa de elongar una cadena de DNA pormuchos nucleótidos antes de disociarse del complejo que forma con el sustrato.

La DNA polimerasa I tiene una procesividad baja. Es distributiva.

La DNA polimerasa III tiene una procesividad alta.


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La DNA polimerasa III está compuesta por varias subunidades

Subunidad : 129 kDa, tiene actividad de DNA polimerasa

Subunidad : 27.5 kDa, tiene actividad de exonucleasa 3’ 5’

Subunidad : 41 kDa, se une al DNA. Es el factor de procesividad

Subunidad : Factor de dimerización

Subnidad : cargado de la hebra de DNA.

En ausencia de la subunidad , la DNA Pol III tiene muy baja procesividad, pues sedisocia del molde

Permiten quese retire SSB


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Termino de la replicación

El fin de la replicación es mediada por secuencias TerCTerCricas en A y T que pueden retrasar el avance losreplisomas debido a la unión de proteínas Ter y TTer y Tus quemuestran una unión cooperativa al DNA.

La metilacimetilacióónn--desmetilacidesmetilacióónn del OriC permite controlarlos ciclos de inicio de cada replicación del DNAprocarionte.

La disponibilidad de las DnaA y los demás factores queforman el pre-primosoma constituyen un mecanismo deregulación.


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Eucariotas = más genoma (DNA + proteína)

oriC

Ter


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Tres características comunes de los orígenes dereplicación de procariontes y eucariontes

1) Son segmentos de DNA singulares que contienen múltiples secuencias

repetidas cortas

2) Estas unidades repetitivas cortas son reconocidas por proteínas

multiméricas ORCORC (origin recognition complex) que reconocen regiones ARSARS

(Autonomously Replicating Sequence) que se unen al origen para iniciar la

replicación

3) Las orígenes de replicación suelen ser regiones ricas en AT, lo que facilita

la desnaturalización del duplex de DNA (menos energía).


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- cada 40 kb

- aprox. 400 orígenes de replicación en los 17 cromosomas de S. cerevisiae

- activación sucesiva de las diferentes ARS: regulación

Eucariontes Inferiores - Secuencia de replicación autónoma

de S. cerevisiae: ARS (Autonomously Replicating Sequence)

- mutaciones puntuales inhiben el inicio de la replicación

- Sitio de unión del ORC (Origin Recognition Complex), 6

proteínas que forman la maquinaria de iniciación de la replicación)

B1 B2 B3A

5´- (A/T)TTTAT(A/G)TTT(A/T) -3´

ARS consensus sequence (ACS)


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G1

SM/G2Ciclina E/Cdk2 >> Inhibe unión de

Mcm2-7 (Cdc6)

Germinina >> secuestra Cdt1

P

P

Cdc6 + Cdt1

ORC (6 proteínas)

origen

Helicasas Mcm2-7

síntesisciclinas yactivaciónCdkDegradación

ciclinas

Xenopus

Cdc45PP

P

- Fosforilación Cdc6y liberación- Fosforilación ORC yMcm2-7-Associación Cdc45

P

P


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Control positivoControl positivo de la replicación en eucariontes

1.1.-- AcumulaciAcumulacióón de proten de proteíínasnas

““permisivaspermisivas”” en el nen el núúcleo en G1:cleo en G1:

- CDC-6 y CDT-1, las cuales se unen al

ORC y reclutan las helicasas MCM

- helicasas MCM se unen al DNA y

catalizan su desenrollamiento

2.- Una vez que empieza la replicación

en la fase S:

- CDC-6 y CDT-1 se despegan del ORC

(por fosforilación)

- MCM progresan con el avance de la

horquilla de replicación


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Control negativoControl negativo de la replicación en eucariontes

• En la célula en fase M/G2 se impide la activacion del ORC, a través de ctd1 y el

reclutamiento de las helicasas MCM a las nuevas cadenas de DNA.

•Por tanto no se puede iniciar la replicación.

• En G1, la germinina es degradada, de tal manera que el DNA de la célula

pueda responder al control positivo por las proteínas permisivas y iniciar su

replicación

Helicasa Mcm2-7

Complejopre-replicativo

- Ciclina Cdc6, reguladorpositivo no fosforilado(Expresión alta en G1)- Ctd1


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TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTG-3’AACCCC-5’

cadena en extensión, incompleta

cadena molde

TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTG-3’AACCCC-5’

Telomerasa contemplado

de RNAACCCCAAC3’ 5’

TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTG-3’AACCCC-5’ ACCCCAAC

3’ 5’

TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTG-3’AACCCC-5’

TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTG-3’AACCCC-5’ CCCAACCCCAACCCCCAAC-5’

DNA polimerasa

Elongaciónextremo 3’por latelomerasa

Adición primer RNA

Extensióncadenaretrasada porla polimerasa

CCAACPrimer RNA

Cromosoma telomero

TELOMERASA


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DAÑO EN EL DNA


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AGENTES INDUCTORES DE DAÑO

Físicos:

•Radiación ultravioleta

•Radiación ionizante

•Radiación nuclear

Químicos:

•Agentes químicos

•Hidrocarburos

•Quimioterapéuticos

•Radicales libres


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Entrecruzamiento covalente depirimidinas adyacentes en lamisma cadena de DNA.Generalmente son timinas.

También se puede generar el“fotoproducto 6-4”

Radiación ultravioleta (200-300nm) 11


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Radiaciones ionizantes: Rayos X y rayos gamma.

Ionizan moléculas que rodean al DNA radicaleslibres

algunos contienen oxígeno que tienen un electrón desapareado. Son especiesaltamente reactivas y pueden atacar la molécula del DNA causando rupturas enuna o en las dos cadenas.

También pueden modificarquímicamente una base, como laguanina.

Generación de 8-oxo-guanina.

Causa transversiones: GC -> TA

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Radiación nuclear

Enlaces covalentes O-P

Extremos romos Translocaciones Cáncer

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Modificación de bases en el DNA

Las desaminaciones pueden ser espontáneas o inducidas.

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Modificación de bases en el DNA: Desaminación por ácido nitroso.

Desaminación de citosinagenera uracilo

Desaminación de 5-metilcitosina genera timina

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Tipos de Daño alDNA. Alquilación.

Tipos de Daño alDNA. Alquilación.

Metilación o acetilación de las bases en los átomos (O/N) queparticipan en la formación de puentes de H, desestabiliza la doblehélice de DNA y hace esa zona susceptible a mutación.

La presencia de estas regiones dañadas puede causar detenciónde la replicación, o si ésta continúa, está sujeta a errores.

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Efectos del daño al DNA

Veamos la contraparte al dañoVeamos la contraparte al daño


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CONCEPTO CONCEPTO NECESARIO CONCEPTO COMPLEMENTARIO

Mutación Alteración o cambio en la información

genética (genotipo) de un ser vivo. Alteración Espontánea: se producen de forma

natural o normal en las poblaciones

Alteración Inducida: surgen como consecuencia

de la exposición a mutágenos químicos o fisicos

Alteraciones Espontáneas

Causados por:

• Errores durante los procesos de

replicación, recombinación o

reparación del DNA.

• Cambios químicos espontáneos

Cambios tautoméricos - Formas alternativas

isoméricas de las bases nitrogenadas que

cambian el patrón de apareamiento normal.

depurinación, desaminación y oxidación de

Bases.

Alteraciones Inducidas Causados por:

• Agentes químicos

• Agentes físicos

Modificación de Bases en DNA

(desaminantes, alquilantes)

Rayos UV (dimeros de T), Ionizante (radicales

libres), Nuclear (extremos romos)

Reparación del DNA Es un proceso constante en la

célula, esencial para su

supervivencia ya que protege al

genoma de daños y mutaciones

dañinas.

Mecanismos de Reparación:

Directa

Apareamiento

NER - Reparación por Escisión de Nucleótido

Recombinación

VER Reparación por Escisión de Base

Daño en el DNA


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REPARACIÓN DEL DNA


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Mecanismos de Reparación

Glucosilasas

RnasaH, Dnapol I,Dnapol ligasa

u.v.rABC

RecA, RAD51

Glucosilasas


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1. Reparación directa: Fotorreactivación

Fotoliasas


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2. Actividad de las Glucosilasas (BER)

¿Cuál OH es?¿1’, 2’, 3, 5’?

Esto lo respondenhasta los que noson “masters”.


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3. Reparación de apareamientos erróneos (MMR)

1. Reconocimiento de la lesiónMutSalfa: AE, ins/del (2-8)MutSbeta: ins/del (1-16)

2. Act. ATPasa MutSalfa libera el AE

3. Discriminación de la hebra (Okazaki)

4. Excisión y síntesis de reparación

1

PCNA

RPA- SSDNA


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4. Reparación de excisión de nucleótidos

NERGenómica Global

NER-TCRAcoplada atranscripción

1.Reconocimiento XPC/HR23B2. Entrada del factor TFIIH a laLesión3. Ensamblaje del complejo NER4. Helicasas actúan y XPA-RPAInteractúan con la lesión5. Endonucleasas:XPG y F6. Remoción 25-32 n7. Liberación complejo8. Síntesis y ligación


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5. uvrABCMecanismo resumido:

1.- UvrA se une al DNA en la regióndañada.

2.- UvrB/UvrC tienen actividad deendonucleasa y corta en los ladosadyacentes de la cadena liberando unoligonucleótido de unos 12-13 nts delargo.

3.- La región “vacía” es rellenada poruna DNA polimerasa I y

4.- Sellada por una DNA ligasa.


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6. Recombinación Homóloga

•Eucariontes•Libre de error•Fase S y G2


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Intercambio de cadenas mediadopor REC A O RAD51 (sistema SOS)


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Ruptura


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•Mamíferos•Predispone al error•Fase GO/G1

7. Reunión de extremos no homólogos

Exonucleasa ssDNA


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Rescata lo más importante:


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Reparación del DNAAgente causal Daño producido Mecanismo de reparación:

U. V. Dímeros de pirimidina (timina- timina,

citosina-timina, citosina-cistosina).Fotoproducto 6-4.Bultos y aductos.

Fotoreactivation (UvrABC)NERRecombination Repair.

Radiación ionizante(rayos X y )

8-oxo-guannina.Transversión GC-TA.Ruptura de cadenas (1 y 2),Intercruzamiento.

BERNERRecombinación

Radiación nuclear Ruptura de cadenas de DNA.Extremos romos y adhesivos.Traslocaciones.

Missmatch repair (MSH,MLH, PMS).Recombination repair (DSB,RPA,RAD52, RAD51).

Alquilaciones,metilaciones,

O6-EtilguaninaCambio en la información(apareamientos erróneos).Timina -Uracilo

Direct Reversal.

DesaminacionesDespurinacionesDespirimidaciones

Citosina – UraciloCambio en la información(apareamientos erróneos).

BER (glicosilasas)


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Tipos de mutaciones de pares de bases

CATTCACCTGTACCAGTAAGTGGACATGGT

CATCCACCTGTACCAGTAGGTGGACATGGT

Sustitución/ Transición o Transversión

CATCACCTGTACCAGTAGTGGACATGGT

Deleción o eliminación

CATATCACCTGTACCAGTATAGTGGACATGGT

Inserción

Secuencia silvestre


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EFECTO DE SUSTITUCIONES EN UN GEN

PROTEÍNADIFERENTE

PROTEÍNAINCOMPLETA

PROTEÍNANORMAL

PROTEÍNANORMAL

PROTEÍNANORMAL

AAC

Codón deasparagina

UAG

Codón determinación

UAU

Codón detirosina

UAC

Codón detirosina

AAC

TTG

TAG

ATC

TAT

ATA

TAC

ATG

DNA molde : 5’----T A C---3’RNAm 3’----A T G ---5’

Replicaciónnormal

Replicaciónnormal

Mutaciónsilenciosa

Mutaciónsilenciosa

Mutación consentido erróneo

Mutación consentido erróneo

Mutaciónsin sentido

Mutaciónsin sentido

Carácter conservativo vs no conservativoCarácter conservativo vs no conservativo


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LA TRANSCRIPCIÓN


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Proceso celular por el cuallos RNAm (y los demástipos de RNA) sonsintetizados a partir deuna secuencia de DNAque sirve como molde.

¿Es el primer paso de laexpresión génica? R =NO.

Es el punto principal deEs el punto principal decontrol celular de lacontrol celular de laexpresiexpresióón gn géénica.nica.

La Transcripción


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•La enzima RNA polimerasa (mensajero II).

•DNA

•Ribonucleótidos (trifosfatados) ATP, GTP, CTP, UTP.

•Proteínas nucleares o factores de transcripción.•-factores generales o basales de transcripción•-proteínas activadoras o represoras

interaccionan con secuencias específicas de DNA (secuencias consenso)

Hebra molde 3’-5’

Señales de iniciación (promotor) y de terminación

Secuencias regulatorias.

Se requiere:

La Transcripción


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Características de la transcripción

Se copia sólo una de las hebras del DNA.

La discriminación o selección de la hebra a copiar está dada por lospromotores.

El super-enrollamiento negativo incrementa la potencia de los promotores.

La actividad de la Rna pol de Procariontes y Eucariontes NO requiere de uncebador.

El transcrito resultante es idéntico a la cadena complementaria a la moldeexcepto en T-U.

Se requieren nucleótidos trifosfatados para catalizar la reacción depolimerización en sentido 5’-3’.

La transcripción es selectiva. Sólo ocurre bajo control temporal en genesespecíficos.

Nomenclatura:Nomenclatura: nucleótido de inicio (n+1), curso abajo (+), curso arriba (-).


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LA TRANSCRIPCIÓN


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Elementos de control transcripcional en procariotes:

Elementos CisCis (Cis-acting regulatory sequences):

Secuencias de DNA con un determinado arreglo de bases. Tienenfunción reguladora positiva o negativa.

Promotor Mínimo*Promotor proximal*

- Genes constitutivos (Housekeepinkg)

- Genes inducibles

Proteínas Reguladoras TransTransactivadoras o Factores de Transcripción(Trans-acting regulatory proteins)

Proteinas activadores o represores


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Elementos de control transcripcional en eucariotes:

Elementos CisCis (Cis-acting regulatory sequences):

Secuencias de DNA con un determinado arreglo de bases. Tienenfunción reguladora positiva o negativa.

Promotor Mínimo*Promotor proximal*Potenciadores (Enhancers)*Silenciadores*Elementos de Respuesta*

Proteínas Reguladoras TransTransactivadoras o Factores de Transcripción(Trans-acting regulatory proteins)

Factores Generales de transcripción*Proteinas activadores o represores

* Sólo presentes en eucariotas.


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La enzima que sintetiza RNA es la RNA POLIMERASA(Samuel Weiss y Jerard Huwitz, 1960)

La enzima de E. coli tiene 4 tipos de subunidades

Es susceptible a inhibición por: RIFAMPICINA y ACTINOMICINA DEs susceptible a inhibición por: RIFAMPICINA y ACTINOMICINA D

Holoenzima formado por:

: Reconocimiento del promotorespecífico

: ensamblaje de las unidades y unión alpromotor

’: Se une al DNA

: Sintetiza el RNA

: estabiliza la unión de ’ con 2-


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Inhibidores de las RNA polimerasas

Precursor de amatoxinas

Derivado de la rifamicinaB

ojo

Anticancerígeno-Quimioterapia


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Inicio de la transcripción

La subunidad sigma reconoce la caja de Pribnow en el promotorprocarionte.

Alfa permite el ensamblaje de las otras subunidades de la Rna pol.

Se une la subunidad b’ al DNA y b añade 9-10 nt.

Elementos de la región promotorapromotora:

Región -10 TAT AAT (caja de Pribnow)

Región -35 TCT TGA CAT

Separación de ambas cajas (16-19 pb).

Velocidad 20-50 nt

Error 10-4 a 37°.

RNApol


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ATPGTPUTPCTP

Sustratos

+ DNA(como molde)

Polimerasa del RNAdirigida por DNA

(Mg++)

nPPi

5’ 3’pppApUpCpCpCpGpU…

RNA

(tipo, longitud ysecuencia de este RNAdependen del gen deDNA que se estátranscribiendo)

Elongación:

1.- Se disocia la subunidad de la RNA polimerasa.2.- Comienza la adición de ppp G o ppp A, en el extremo 5’del RNA naciente.

3.- Se añaden ribonucleótidos polimerizándose la cadena através de enlaces fosfodiéster (la cadena va creciendo en ladirección 5’ – 3’)

El RNA que se va copiando del DNA se llama transcrito


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4.- La “burbuja de transcripción” va avanzando, por un ladose abre el DNA duplex y por el otro se re-bobina.5.- El RNA sintetizado va formando un híbrido (transitorio),con la cadena 3’ – 5’ del DNA

3

5

5

3

5’ ppp RNAnaciente Desplazamiento de

la polimerasa

RNA polimerasa

Hélice híbridaRNA - DNA

3

Punto deelongación

RebobinadoDesenrollado

Hebra molde

Hebra codificadora

BURBUJA DE TRANSCRIPCIÓN


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Termino de la transcripción:

La Rna pol deja de añadir RNA

La Rna pol se disocia del DNA

Secuencias de terminación en 5´ respecto al sitio determinación.

Dos tipos de terminadores respecto al DNA:

Intrínsecos:

Extrínsecos:


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Terminación en procariontes

Terminadores intrínsecos:

Serie de 4-10 nt AT consecutivos en 5´.

Estructura secundaria en forma de horquilla (harpin)

Sucesión de 6 U al final de la horquilla.

Generalmente región rica en GC (palindrómica) en la base del tallo.

Terminadores dependientes de Rho:

Rho actúa como hexámero y tiene actividad de helicasa dependiente deATP.

Se une a regiones de 50-90 pb en posición 5´ respecto al terminador ricasen C y pobres en G.

Rho avanza en dirección 3´ y desestabiliza la unión de la RNApol cuandollega a la región terminadora.

La desestabilización se debe a la disociación del híbrido DNA:RNA

Es apoyada por NusA que reconoce a box A.


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Tramo de uridinascontiguas

Independiente de Rho


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Terminación dependiente de Rho:

1.- La RNA polimerasa encuentra señales de terminación en el DNA(región Palindrómica rica en GC y luego en AT).2.- El RNA se disocia del molde.3.- La RNA polimerasa se disocia del DNA.4.- La proteína rho, hidroliza ATP en presencia de RNA o DNA de unasola hebra, rompiendo el DNA del RNA


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Independiente de Rho

Palíndromerico en GC:horquilla

Informaciónestructural-desestabilización.

Secuencia ricaen (T): lineal

Informaciónposicional

El ITP (análogodel GTP) ¡impidela terminación!Generando uncambioconformacional.

¡Pregúntame!


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Antiterminación

La RNA pol lee más allá de los sitios de terminación.

Es utilizada por los fagos para regular la transición de unaetapa de expresión génica a otra.

Proteína antiterminadora (pN, pQ) que reconoce la secuenciaantiterminadora en DNA (Box B),

La proteína antiterminadora interacciona con la Rna pol através de proteínas intermediarias.

El complejo estabiliza a la Rna pol unida Nus A y evita laterminación de la transcripción.


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En procariotes casi todos los RNAm que se van sintetizando se vancopiando en proteínas (traducción). Pero los RNA, los RNAt y todos losRNAm de eucariontes sufren modificaciones antes de ser usados o leídos.

TRANSCRIPCIÓN EN EUCARIOTES


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TIPO DEPOLIMERASA

GENES QUE TRANSCRIBE

RNA polimerasa I Genes de rRNA 5.8S, 18S y 28S

RNA polimerasa II Todos los genes que codifican proteínas, los UsnRNA (1-5), los genes plus snoRNA y algunosgenes snRNA

RNA polimerasa III Genes de tRNA, 5S-rRNA, algunos genes snRNAy genes para otros RNAs pequeños (UsnRNA).

Anota en tu cuaderno esto:

En Eucariontes hay tres tipos de RNA polimerasas


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En Eucariontes hay tres tipos de RNA polimerasas


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Cada tipo de RNA lleva una forma diferente de PROCESAMIENTOPOST-TRANSCRIPCIONAL o MADURACIÓN

RNAt

RNAmEuc.

RNAr

PROCESAMIENTOPROCESAMIENTOo MADURACIo MADURACIÓÓNNDIFERENCIALDIFERENCIAL

Remoción de los extremosModificación de la ribosaModificación de las bases

Empalme o splicingAdición del CAP en el extremo 5’Adición del poliA en el extremo 3’

Metilación de la ribosaRemoción de partes intermedias de un pre-RNAr largo que originavarios RNAr más cortos


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Rna pol I Rna pol II Rna pol III

RNA sintetizado RNAr (5.8, 18 y 28S) RNAmUsnRNA (1-5)

RNAtRNArUsnRNA (6)

Localización Nucleolo Nucleoplasma Nucleoplasma

Sensibilidad a -amanitina

No sensible Muy sensible Sensible

Subunidadescomunes

2 subunidades grandes similares a y ´de E. coli2 subunidades similares a de E. coli5 subunidades comunes pero sin homólogos con E. coli

Subunidades totales 14 subunidades 12 subunidadesSubunidad grandecon repeticiones enCOO- terminal.Secuencias CTD(carboxi teminaldomain): TSTSP26 repeticiones enlevaduras,56 repeticiones enmamíferos.

17 subunidades


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Promotor Dos regiones decontrol:Core element: -40 a+20Rico en GCElemento alrededordel sitio de unión(especie específico).Upstream controlelement (UCE):-180 a -107.

Tiene variedad deelementos cortos encis:

Promotor mínimo.TATA-like (-30) cajade Golberg-Hogness.

Promotor proximal:CAAT (-80)GGGCGG (-90) cajaGC de genesgenesconstitutivosconstitutivos

Enhancers.(incrementadores,potenciadores,intensificadores…)

Promotor de tRNAs:Dentro de lasecuencia transcrita(interna):Caja ACaja BPromotor de 5srRNAs:Caja ACaja CPromotor deUsnRNA6Caja TATAPSEOCT-1

Factores detranscripción:

UBF1, SL1, TBP TBP, TFIIB, TFIIF,TFIIE, TFIIH, TFIIA

Pregunta:¿Si se quita el

promotor mínimohabrá transcripción?

Promotor de tRNAs:TFIIBn (incluye TBP)TFIICPromotor de 5s-rRNAs:TFIIA, TFIIB, TFIIIC.


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Inicio de latranscripción:

No requiere hidrólisis deATP.1. Unión de UBF1 aUCE y en el core.2. SL1 (TBP-TAFcomplex) se une aUBF1 de formacooperativa paraextender la región deADN que es cubierta.3. Se disoscia hRRN3.4. Se une la Rna pol I.5. Se requiere la TIFpara iniciar la adicióndel primer nt.

1. Unión de TBP a lacaja de Goldberg-Hogneess.TBP interactúa con elsurco menor del Dna enlas TATA y curba ladoble hélice.2. Unión de TFIIB.El C-terminalinteracciona con TBP yDNA. El N-terminal seextiende hacia el sitiode inicio de latranscripción.3. Unión de TFIIF.Provoca elreclutamiento de laRNApol II.4. Unión de TFIIE:Permite reclutar TFIIH.5. Unión de TFIIH:TFIIH tiene actividad dehelicasa y ATPasa,comienza la síntesis deRNA.6. La RNA pol se liberade casi todos los TFs.

No requiere hidrólisis deATP.tRNAs:1. TFIIC reconoce loselementos control.2. TFIIB se une a TFIICy dirige a la Rna pol IIIal sitio correcto.•TFIIB contiene a TBPque se une al DNA pesea no existir cajas TATA.

5s-rRNAs:TFIIA se une a la cajaC,TFIIC se une a TFIIATFIIIB se une y coloca ala RNA pol en el sitiocorrecto.


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Elongación Requiere factores deelongación DSIF,ELONGATOR,FACT, Spt6, ELL…etc.

-

Termino de latranscripción

Región reconocidapro la polimerasa(10-12 pb ricos enT).Región reconocidopor elementosterminadores Reb1p(10 pb) en S.cerevisiaeTTF-1(18 pb) enratón.

No clara -


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MODIFICACIONESPOSTRANSCRIPCIONALES


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RNAm Eucarionte:Adición del CAPo “capuchón”

7-metil guanosina7-metil guanosina


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RNAm Eucarionte:Metilación del CAP

• Ocurre antes que la cadena tenga 20nucleotidos de largo.

Se añade un residuo 7-metil guanosina,por una guanililtransferasa en forma reversa.

Se forma un puente 5´-5´ trifosfato

El “capuchón” o “capping” puede estarmetilada en O(2´) (1 o dos nucleosidosterminales) o no (cap-0).


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RNAm eucarionte: Adición de la cola de poliA

Secuencias consenso

PABP


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RNAm eucarionte:Sólo después de la modificación en 5’ y 3’ocurre el corte y empalme/ “splicing” de exones

Este proceso de remoción de exones es llevado a cabo por un cuerpo desplicing con snRNA catalíticos (Joan Steitz, 1960).


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RNAm eucarionte: Corte y empalme o splicing


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Esta conducción (transporte yarrastre de RNA) es llevado acabo por apareamiento debases formando heteroduplexRNAm-snRNA


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Ex1

Ex2


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Functional roles for each snRNP

U1 Initially bound to 5'-splice site. Determines which 5'-splice site is usedReleased on recruitment of U4/U5/U6 ?

U2 Initially binds branchpoint sequence.Brings intron 5'-splice site close to the branchpoint

U4 Initially complexed with U5 and U6 Keeps U6 in an unfolded conformationReleased after delivering U6 to the 5'-splice site

U5 Initially complexed with U4 and U6 Binds exon sequences LocationUpstream of 5'-splice site Downstream of 3'-splice site ?

U6 Initially complexed with U4 and U5 Displaces U1 from 5'-splice site Formsduplex with intron sequences Complexes with U2. Brings intron 5'-splice siteclose to branchpoint


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Cromatina y Regulación Transcripcional


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PROMOTOR exón 1 exón 2intrón

5’ 3’

transcripción

La mayoría de los cambios en los niveles de mRNA ocurrenpor variaciones en la transcripción.

m7GpppN

AAAAAA5’ 3’

mRNA

Región CodificanteRegión Reguladora

Controla la tasa a la cual la RNApolTranscribe la región codificantedel gen.

Los genes tienen dos regiones distintas funcionalmente:


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Componentes de la Región Reguladora de un gen


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Promotores y la Maquinaria basal de transcripción

Funciones del “Promotorromotor MMíínimonimo””:

•Sitio de unión de la RNApolII, factores generales de transcripción y coactivadores.

Controla el sitio de inicio de la transcripción y la direccionalidad.

•Responde a elementos activadores o silenciadores.

•Necesarios para la transcripción basal


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Promotores y Potenciadores

Promotor Proximal: Se encuentran muy cercanos al sitio de inicio de la transcripciónaprox. de 50 a 200 pb. A estas regiones se unen proteínas activadoras.

Potenciador: Potenciadores (“Enhancers”) son secuencias capaces de inducir unincremento en la transcripción de un gen. Se encuentran localizados río arriba o abajoa distancia del sitio de inicio de la transcripción o en Intrones.

Activadores/ RepresoresEnhancers / Silencenciadores


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Organización y Función de unPotenciador:

• Diferentes combinaciones de proteínasactivadoras los reconocen.

Pueden funcionar de manera tejido-especifica

Funcionan a distancia eindependientemente de la orientación.

• Pueden estar compuestos por móduloscon diferentes secuenciasconsenso (cooperatividad).

• A los enhancers se unen activadores yotras proteínas con actividadremodeladora

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Formación del complejo de inicio de transcripción

Ensamblaje

Inicio de latranscripción


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RNA polimerasa

DNA de doble héliceDNA desenrollado

(17 pb abiertos)

Formación del complejo de inicio de transcripciónSe abre la doble hélice del DNA (17pb) y se forma la “burbuja de

transcripción”


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Transcripción en Eucariotas.


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REGULACIÓNPOSTRANSCRIPCIONAL


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Policistronic transcription

DNA

mRNAtranslation

degradation

protein

Celularfunctions

Levels of gene expression regulationin bacteria

mRNA stability(half life)

Degradationof RNA

Postranscriptionalcontrol

Transcriptionalcontrol

Translationalcontrol


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mRNA

Postranscriptional regulation

mRNA stability(half life)

Degradationof RNA

mRNAsteady-state levels


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mRNAstability &degradationcontrol

pre-mRNAprocessing

proteinstability &degradationcontrol

Eucariotes


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Significado biológico dela estabilidad del mRNA

Significado biológico dela estabilidad del mRNA

La expresión genética es modulada por los niveles

estacionarios del mRNA disponibles para la producción

de proteínas, los cuales son producto del equilibrio

entre la síntesis (transcripción) y la degradación

(estabilidad) de los transcritos.

Mayor estabilidad mRNA = Mayor expresión genética


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Características importantes de la abundancia del mRNAen bacterias:

¿Qué determina laestabilidad de un mRNA enla célula?

1. ¡ La estructura del RNA !

2. ¡ La tasa de degradación del RNA !Actividad de proteínas que degradan el mRNA(Degradosoma y otras ribonucleasas)


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Toma nota:

La estabilidad y la tasa de degradación del mRNA regulan laexpresión genética de dos maneras:

1. La estabilidad determina el tiempo en el cual un mRNApuede estar presente para ser traducido

2. La estabilidad del mRNA regulada así misma porestímulos del ambiente celular, provee un medio derespuesta mediante el control de la capacidadtraduccional


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AUUUA

mRNA Elemento estructural

3´ UTR

Elementos ricos en AU y tractos de PyAn

Tallo-burbuja del 3´ terminal

Histonas

An

c-myc, c-fos

Elementos en la región codificante

Jeff Ross 1995

PyBP

p70

AAAAAAAAn

PABP

Tracto de poli (A)

Todos

AUBP

Py

Algunos

Elementos estructurales del 3´ UTR que regulan laestabilidad del mRNA en eucariontes


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Jeff Ross 1995

AUG UAA

AUG UAA

AUG UAA

Desadenilación

Decapping

AAAAAAAAA250

A-10

7mGpppG

7mGpppG

pG

3´ UTR

Degradación3´ – 5´

En eucariontes la degradación del tracto de poli (A)inicia el decaimiento del mRNA

AAAAAAAAA250


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RNases involved in mRNA degradationin bacteria

• RNase E Poly(A) ribonucleaseEndonuclease

• PNPase Poly(A) ribonucleasePoly(A) polymeraseExonuclease 3´to 5´

• RNase II, III

DEGRADOSOME


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Degradación 3’-5’

Ojo:

Siempre ocurre unahidrólisis espontáneade los enlaces 5’-5’ y5’-5’ en ambosextremos.

La disminución de lapoliA y del CAP


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Differences in mRNA degradation mechanismsbacteria eukayotes

mRNAs are unstable with halflives of minutes to 1 hr

Endonucleolytic cleavage is thefirst step in degradation

Major via: 3´to 5´. Has not beendetected 5´to 3éxoRNases

mRNA decay is not linked to3énd formation

Poly(A) tract destabilize RNAs

Poly(A) tail length control inimportance in mRNA stability ?

mRNAs are more stable hours todaysEndocleavage is less importantDeadenylation 3´- 5´ is the firststepMajor via: 5´to 3´degradationDegradation mechanisms are linkedto 3énd formation andtranscription of mRNA

Poly(A) tract, PABs stabilizesmRNAsPoly(A) tail length control isimportant in mRNA stability

CAP-dependent decay mechanisms(decapping enzymes)


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1.- Polinucleótido fosforilasa (PNPasa): Actividad 3’ a 5’ procesativa

2.- RNasa II: No son específicas y son procesativas 3’ a 5’ exoribonucleasa

3.- RNasa D: 3’ a 5’ exoribonucleasa, participa en la maduración de pequeñosRNAs estables.

4.- RNasa BN: Esencial en la maduración del extremo 3’ de ciertos tRNAs de fagos.

5.- RNasa T: Maduración del 3’ de pequeños RNAs estables,tRNA y rRNA, reciclamientode tRNAs

6.- RNasa PH: 3’ a 5’ distributiva

7.- RNasa R: 3’ a 5’ procesativa

8.- Oligoribonucleasa: Actividad 3’ a 5’ exonucleasa específica para pequeñosoligonucleótidos .

Funciones asociadas a cada componente del degradosoma


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LA TRADUCCIÓN


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La traducción

La traducción corresponde a lasíntesis proteica que se lleva acabo en los ribosomas.

Una vez traducida la informacióncontenida en los RNAm paragenerar las cadenas deaminoácidos, no hay “vueltaatrás” en el flujo informativo.

El flujo de información hacia lospolipéptidos constituye unproceso irreversible.

mRNA

proteína


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Estructura de Ribosomas

23S(2900 bases)

rRNA

5S(120 bases)

Proteínas(31)

Proteínas(21)

16S(1500 bases)

28S:5.8S(4800+160 bases)

5S(120 bases)

28S

5.8S

18S(1900 bases)

Eucario

nte

sP

rocario

nte

s

Proteínas(50)

Proteínas(33)

50S

30S

60S

40S

70S

80S


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Anatomía de los ribosomas


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EPA E P A

Traten de no verlo en 2D


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Ribosomas (RNAr +proteína)

Aminoacil-RNAt

RNAm

proteínas

cationes

GTP

El ensamblado de unaproteína requiere los 3 tiposprincipales de RNA yelementos accesorios:

TRADUCCIÓN


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Inicio de lacadena

Elongación

Terminación

LA SÍNTESIS DE UNA CADENA POLIPEPTÍDICA PUEDEDIVIDIRSE EN TRES ETAPAS DISTINTAS

TRADUCCIÓN

30S

50S

Met


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Iniciación:Formación del complejo de iniciaciónColocación del ribosoma en el codón AUGPosicionamiento de la primera metionina

Alargamiento:Adición de todos los aminoácidoscon enlace peptídico entre ellos

Terminación:Reconocimiento de codón determinación y liberación del peptido y delribosoma

PASOS GENERALES DE LATRADUCCIÓN


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INICIO

Paso 0. Reconocimiento de lasecuencia señal Shine-Dalgarnopor la subunidad menor delribosoma.

PASO 1. Traslado de lasubunidad pequeña alcodón de inicio

PASO 2. Traslado delprimer aa-tRNA (f-met)al ribosoma

PASO 3. ensamblado delcomplejo de iniciocompleto.

30S

AUG

1

2

3


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unión de los factores deiniciación IF-3 e IF-1

unión del RNAm – SecuenciaShine Dalgarno.

unión de la subunidad 30S conel RNAm en el codón de inicioAUG, se requiere de IF1 e IF3

30S

AUG

El ribosoma seune al DNA enun sitio preciso

La unión a este codón pone alribosoma en el marco de lectura=lectura correcta del mensaje

La interacción entre estas secuenciasComplementarias en el mRNA y elrRNA lleva a unión de la subunidad30S al codón de inicio

5-10nucleótidos

INICIO


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ELONGACIÓN

PASO 1. Selección delaminoacil tRNA

PASO 2. FORMACIÓN DELENLACE PEPTÍDICO(liberación de EF-Tu GDP)

PASO 3. TRASLOCACIÓN(dependiente de EF-G ehidrólisis de GTP)

PASO 4. LIBERACIÓN DELtRNA DESACILADO


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TERMINACIÓN

La terminación requiere factoresde liberación (RF) que reconocenlos codones de terminación.

Codones de terminación.

UAA, UAG, UGA

RF1=> UAA y UAG /

RF2 => UAA y UGA

Ruptura del enlace ester entre el aa ysu RNAt del último aminoacil-RNAt.


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Antibiótico Acción:

Estreptomicina Provoca una mala lectura del código genético en las bacterias a concentracionesrelativamente bajas e inhibe la iniciación a concentraciones mayores, enlazándose ala subunidad ribosómica 30s.

Tetraciclina Se une a la subunidad 30S del ribosoma e inhibe la elongación impidiendo la unióndel aminoacil-RNAt (Procariontes) que bloquea el sitio A.

Cloramfenicol Inhibe a la peptidil transferasa (Procariontes). Bloquea la fase de la transferenciapeptídica de la elongación en la subunidad ribosómica 50s, tanto en las bacteriascomo en las mitocondrias.

Cicloheximida Impide la elongación bloqueando a la peptidil transferasa de Eucariontes (tóxico,espermicida y mutagénico).

Eritromicina,macrólidos ylincosamidas

Se enlazan a las subunidades ribosómicas 50s, inhibiendo la reacción de lapeptidiltransferasa o la traslación, o ambas cosas.

Puromicina Causa terminación prematura de la traducción. Actúa como análogo estructural delaminoacil-RNAt. Se enlaza al sitio A del ribosoma y participa en la formación deenlaces peptídicos, produciendo peptidil-puromicina.

Toxina diftérica Inhibe a la translocasa eEF-2 (eucariote). Es un péptido de 535 residuos de a.a.unidos por S-S.

Aminoglucósidos La tobramicina y la kanamicina evitan la asociación ribosómica al final de la fase deiniciación y provocan una mala lectura del código genético.

Inhibidores de la traducción (anótalos)


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60 S

40 S

eIF 6

eIF 3

Complejo de iniciación

¿Espontáneo?

eIF-4C

eIF 4B


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eIF 3

Interacción del complejo ternario con la subunidad40 S para formar el complejo de preiniciación

43-45Scomplejo de preiniciación

complejo ternario

eIF4C


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AUGCap

4G

4A

4E

4B

eIF 3eIF4C

5’


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Cap5’

4G

4A

4E

4B

eIF4CeIF 3

AUG

eIF5


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Alargamiento

Factores de reconocimiento al Cap

eIF 4FeIF 4F Ayuda a la union del ribosoma

4G

helicasa4A

AUG

40 S

4E

Reconocimientoy unión al Cap

eIF-4BEstimula a la helicasaSe una al eIF-3

5’ Cap

Factores de laFactores de la iniciaciiniciacióón de la traduccin de la traduccióón (eIFs)n (eIFs)

AUG40 S

60 S


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3’Cap AU

G

5’ NNN

EF-1 .GTP. aatRNAP

E

A


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3’Cap AU

G

5’ NNN

EF-1 .GDP. aatRNAP

E

A.GTP.


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3’Cap AU

G

5’ NNN

P

Translocación

NNN

E

A


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3’Cap AU

G

5’ NNN

P

Translocación

NNN

EEF-1a.GTP.aatRNA

A


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3’Cap AUG5’ NNN NN

N

P

NNN

UAG

Terminación

Cuando los RFs reconocen a los codones de terminación, activan al ribosomapara que se hidrolice el peptidil tRNA mediante una reacción semejante a la detransferencia del peptidil, solo que el aceptor es H2O en vez del aa-tRNA.

eRF 3

eRF1.GTP

A


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3’Cap AU

G

5’ NNN

UAG

RF.GTP

Proteína

RF 3


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Terminación

UAA (codón de término)

“STOP”

Factor de liberación o determinación (RF)

Los codones UAA, UAG y UGAno son reconocidos por ningúnRNAt

RF1=> UAA y UAG / RF2 => UAA y UGA

Ruptura del enlace

éster


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IRES: región de unión interna del ribosoma

pNp AUG

AU

G

AU

G

AU

G

Poli AALTORNT 3’

ITAFs

IRES

AUG

RNT 5’ UAAUAGUGA

eIF 3

eIF2Met GTP

Complejo ternario

Traducción


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3’ AAAAA1 743 7441

ORF

RNT 5`

I IIIII

IV

V

VI

RNT 3’

PoliproteínaCap 5’X

Historia: Traducción de Poliovirus

AUG

AUG AUG AUG

PTBPTB

PCBP2

La

Proteínas celulares eIFs

IRES


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RNA ribosomal 28 SRNA ribosomal 28 SPeptidil-transferasa

La resolución atómica de cristales de estructuras de la subunidad ribosomal 60Sprueban que la peptidil transferasa, localizada en el centro del ribosoma, esta compuestaen su totalidad por RNA; el ribosoma es una ribozima.


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Se doblan en formas tridimensionales y forman las plataformas en las quese ensamblan las proteinas ribosomales.

RNA ribosomales pequeRNA ribosomales pequeñños 5 y 5.8 Sos 5 y 5.8 SPapel estructural


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RNA de transferenciaRNA de transferencia

D

ABrazo aceptor

C

C

Brazo T C

Brazo extra

ANTICODON

NNN

Brazo D

CODON

Añadido despuésde la síntesis yprocesamiento deltRNA

La ribosa se uneal carbón 5 en vezde al N 1 deluracilo.

mG

El uridilato metilado estimidilatoPseudo uridina

7pb no Watson

5’

dihidrouridina


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The Aminoacyl Synthetase binds both the anticodon (top) and the amino acid acceptor(bottom) and attaches the appropriate amino acid according to the Genetic Code.

The exact mechanism by which this recognition takes place is uncertain, and hassometimes been described as a "second genetic code".

Aminoacil tRNA sintetasaAminoacil tRNA sintetasa


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ORFORF

Cap AAAAAAA

AUG

UAG- ÁmbarUGA- ópaloUAA- ocre

RNT 5RNT 5’’ RNT 3RNT 3’’

5’ 3’

RNA mensajero (mRNA)RNA mensajero (mRNA)


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EL CÓDIGO GENÉTICO


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UUU UUUUUU Phe PhePhe

AAA AAAAAA Lys LysLys

CCC CCCCCC Pro ProPro

+

+

+

RNAm sintético Polipeptido

Extrácto Bacteriano

ACA ACACAC CAC

HisThr HisThr

ACA ACAACA ACA CAC CACCAC CAC

Thr ThrThr Thr His HisHis His

(mezcla de aa y uno radiactivo cada vez)


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1. Es una regla de correspondencia entre los codones (F. Crick y Sidney Brenner,1961) y anticodones que permite el acoplamiento o ensamble de los residuosde aminoácidos cargados por la aminoacil-t-RNA sintetasa.

2. El codón es un triplete de nucleótidos,

3. El codón constituye una “palabra” en el lenguaje de los ácidos nucléicos que estraducida para codificar un aminoácido.

4. El código es universal, desde las bacterias hasta el hombre *.

5. La interpretación de los codones por aminoácidos es igual en todas las células,todas "leen" de la misma manera los genes.

El Código Genético Estándar


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5. El código esta basado en tripletes, sin puntuaciones ni sobrelapamientos.

6. Posee un codón de inicio* y tres codones de término (UAA, UAG, UGA).

7. Todos los tripletes tienen un sentido y marco de lectura.

8. Es un código degenerado (sinonímica o redundancia no uniforme).

9. No es ambiguo (es inequívoco)*.

10. Tiene un carácter altamente conservativo (atenuador) de mutaciones..

11. Requiere un “adaptador” para traducir la información genética en proteína(tRNA).

12. La disponibilidad de los tRNA redundantes (sinonímias) genera laaparición de “dialectos” o índices de uso preferencial de codones (IchiIkemura). CAI (codon adaptation index).



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Aminoácidos hidrofóbicos ---hidrofílicos

Máxima amortiguación en cambios puntuales



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La hipótesis del balanceo de Crick

La “wobble hypothesis” de Crickproponía que las dos primeras basesdel codón deben poseer paresgeométricos Watson-Crick normales,mientras la tercera podía ser“solapada”.

Sólo existen limitaciones estructuralesen los dos primeros apareamientos y latercera base permite flexibilidad yajustes conformacionales.

De esta forma se necesitarían almenos 31 tRNA aminoacil cargadospara leer los 61 codones posibles.

S. cerevisiae sólo tiene 25 aminoacil-tRNA para leer el código del mensajerosegún su ICA.


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Selenocysteine Selenocysteine is an aminoacid

that is present in several enzymes(for example gluthatione,peroxidases, tetraiodothyronine 5'deiodinases, thioredoxinreductases,formatedehydrogenases,glycinereductases and somehydrogenases).

Selenocysteine has a structure similarto cysteine, but with an atom ofselenium taking the place of the usualsulfur.

Proteins that include a selenocysteineresidue are called selenoproteins.


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Selenocysteine

Selenocysteine is encoded in aspecial way by a UGA codon,which is normally a stop codon.

The UGA codon is made toencode selenocysteine by thepresence of a SECIS (SElenoCysteine Insertion Sequence)in the mRNA.

The SECIS element is definedby characteristic nucleotidesequences and secondarystructure base-pairing patterns.


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Selenocysteine tRNA

The primary and secondary structureof selenocysteine tRNA, tRNA(Sec),differ from those of standard tRNAs inseveral respects, most notably in:

An 8-base (bacteria) or 9-base(eukaryotes) pair acceptor stem.

A long variable region arm,

Substitutions at several well-conservedbase positions.


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MODIFICACIONESPOSTRADUCCIONALES


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¿Porqué las proteínas son modificadaspostraduccionalmente?

Regulación de la actividad Activar función Apagar función Generar una función diferente

Propiciar interacciones proteína-proteína El sitio modificado puede ser una interface de unión.

Localización subcelular El sitio modificado puede ser una señal de localización. El sitio modificado puede ser un anclador a la membrana.

Envejecimiento La modificación puede identificar a la proteína para ser degradada. La modificación puede marcar a una proteína para ser procesada.


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Ejemplos

•Apropiado plegamiento y propiedades mecánicas mejoradas (ej. Triple hélice delColágeno)

•Solubilidad de las proteínas (carbohidratos)

•Estabilidad o inestabilidad de las proteínas (carbohidratos, ubiquitinación,fosforilación)

•Procesamiento proteolítico (remoción de secuencia líder)

•Localización de proteínas ( anclaje a lípidos de membrana, destino a lisosomaspor la presencia de Manosa-6P)

•Regulación de interacciones moleculares (fosforilación, acetilación, acilación,glicosilación).


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Modificaciones postraduccionales

Mann and Jensen, Nature Biotech. 21, 255 (2003)


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EL SISTEMA DE OPERONES


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PIPOZYA


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Sistemas de operón


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Bloque 4. Genética y Biología Molecular

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