Biotecnología Vegetal Transformación génica en

plantas

Biotecnología Vegetal

• La biotecnología consiste en la utilización de organismos vivos con fines industriales

• Conjunto de técnicas que utilizan organismos vivos o parte de ellos para obtener productos o modificarlos, para mejorar plantas o animales, o para desarrollar microorganismos con fines determinados

• Se utilizan las técnicas de ingeniería genética y cultivo de tejidos vegetales in vitro

• Sistemas de transferencia de ADN basados en vectores biológicos

- Sistemas basados en Agrobacterium tumefaciens y Agrobacterium rhizogenes.

- Sistemas basados en virus vegetales.

• Sistemas de transferencia directa de ADN

- Transferencia por biobalística (micropartículas de oro o tungsteno que tiene aglomerado el DNA foráneo).

- Transferencia mediada por cationes divalentes y/o electroporación

- Transferencia por microinyección.

Sistemas de transformacióngenéticaen plantas

Planta transgénica

Se introduce un DNA foráneo en el genoma de sus células, este DNA se expresa y confiere a la planta un carácter o unos caracteres nuevos

¿Para qué plantas transgénicas?

• Rendimiento y calidad nutricional

• Biorreactores

• Estudio de procesos biológicos

Rasgos introducidos

• Resistencia a:– insectos– herbicidas– virus, hongos, bacterias

• Retraso de senescencia, tolerancia a estrés

• Mejora del valor biológico (proteínas, lípidos)

• Producción de polipéptidos de uso farmacológico.

Biotecnologías de apoyo al Biotecnologías de apoyo al mejoramiento de plantasmejoramiento de plantas

•Cultivo de tejidos•Rescate de embriones•Embriogénesis somática•Organogénesis somática•Producción de haploides •Fusión de protoplastos

•Trasformación genética•Agrobacterium tumefaciens•Agrobacterium rhizogenes•Métodos directos •Métodos Indirectos

Cultivo de tejidos Factores comunes

Composición general de medios de cultivo:• Fuente de Carbono (azúcares)• Macronutrientes (N, K, etc)• Micronutrientes (Fe, Cl, etc)• Vitaminas• Agente gelificante (para medios sólidos)• Reguladores de crecimiento (hormonas vegetales)• Otros compuestos (ej: agentes quelantes)

asepciaasepcia

cultivocultivo

aambientacimbientaciónón

Cultivo de tejidos: Rescate de embriones

Cultivo de tejidos: Embriogénesis somática

Cultivo de tejidos: Organogénesis somática

Propagación masiva •Flores•Frutales•Árboles forestales

Cultivo de meristemas•Saneamiento de virus•Rejuvenecimiento

Cultivo de tejidos: Producción de haploides

Cultivo de tejidos: Fusión de protoplastos

Transformación genética Técnicas básicas

• Enzimas de restricción• Clonación de genes• Secuenciación• Electroforesis de Proteínas, ARN y ADN• Hibridación con anticuerpos (western blot)• Hibridación de ácidos nucleicos (southern, northern)

• Reacción de la polimerasa en cadena (pcr)

Transformación genética Técnicas básicas

Enzimas de restricción

Clonación en plásmidos (vectores)

Transformación genética Técnicas básicas

Clonación en plásmidos (vectores)

Transformación genética Técnicas básicas

Secuenciación

A C G T

Transformación genética Técnicas básicas: Secuenciación

Transformación genética Técnicas básicas

Electroforesis (DNA, RNA,proteinas)

southern

northern

western

Transformación genética Técnicas básicas

Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

Métodos indirectos

• Agrobacterium tumefaciens

• Agrobacterium rhizogenes

Transformación genética:A. tumefaciens

Agrobacterium tumefaciens

Tumor de tallo provocadopor Agrobacterium tumefaciens

Agrobacterium tumefaciens

Bacteria del suelo Gram (-)

Agallas en corona

Agrobacterium tumefaciens

Bacteria Gram negativa que infecta a las plantas en lugares donde hay heridas y produce la enfermedad de las agallas en

corona, fundamentalmente en Dicoteledóneas.

Las agallas son protuberancias formadas por conglomerados de células indeferenciadas

El plásmido Ti (tumor-inducing) es el responsable de la inducción de tumores, durante la infección se transfiere una porción definida de este plásmido: T-DNA (DNA de

transferencia)

La integración y expresión de ciertos genes del T-DNA (oncogenes) hace que las células transformadas se dividan sin control. Codifican para la síntesis de fitohormonas (auxinas y

citoquininas) y de opinas (fuente de C y N para la bacteria).

¿Qué son los genes vir?

• Codifican factores esenciales para la transferencia e integración del T-DNA dentro del genoma de la planta.

• Están ubicados en una regíón de 35 kb del plásmido Ti fuera de la región del T-DNA.

• Hay 25 genes vir distribuídos en 7 operones.

• Responden a un metabolito secundario exudado por las plantas cuando se les provoca una herida (acetosiringona)

Transformación genética:A. tumefaciens

Vectores derivados del plásmido Ti

• Componentes necesarios:– Marcador de selección (resistencia a kanamicina)– Origen de replicación (para que se replique en E.coli)– Borde derecho de la secuencia T-DNA– Polylinker (región de multiple clonaje)

• Tipos:– binarios– cointegrados

Transformación genética:A. tumefaciens

Se inocula con Agrobacterium desarmada que contenga un vector de transformación. El T-DNA contiene un módulo de expresión y el gen de resistencia a la kanamicina

El medio además de hormonas debe contener el antibiótico cefotaxima (para controlar el crecimiento de Agrobacterium) y kanamicina (antibiótico de selección)

Cultivo de raíces de tabaco transformadaspor Agrobacterium rhizogenes

Fenotipo Ri en plantas de Brassica napus

Gentileza del Dr. Mark Tepfer

Agrobacterium rhizogenes

En este caso se utiliza como vector de transformación la bacteria con su plásmido Ri intacto y además se introduce otro plásmido que contiene los genes quiméricos dentro del T-DNA. Puede dar fenotipos aberrantes en la parte aérea de la planta

Métodos directos

• Bombardeo de partículas (biobalistica)

• Electroformación de Protoplasto

• Fibras de carburo de silicio “Whiskers”

• Transformación mediada por Glicol de polietileno (PEG)

Transformación genética:Biobalística

Manipulación de la expresión génica

• Promotores:– constitutivos (35S del virus del mosaico del

coliflor)

– tejido específicos (FBPasa - Rubiscom)

– inducibles

• Secuencias “enhancer”• Intrones que estabilizan el mRNA producido• Secuencia terminadora (nopalina sintasa)

Manipulación posttranscripcional

• Antisentido– Se transfiere un gen que codifica para un RNA

complementario (asRNA) al mRNA de interés.– Al transcribirse ambos genes se forma un

híbrido asRNA-mRNA que impide la traducción del último.

GENES UTILIZADOS Y CARACTER CONFERIDO EN

PLANTAS TRANSGÉNICASTipo de gen utilizado en

transgénesisCaracter que confiere a la

planta

Toxina de Bacillus thuringensis

Proteína de la cubierta viral

Quitinasas, glucanasas de plantas y de otros organismos

Lisozima humana y de cerdo. Otros péptidos bactericidas

Genes cuyos productos afectan la biosíntesis de aminoácidos, o la fotosíntesis

Genes cuyos productos afectan la biosíntesis del etileno, o la formación de pared celular

Resistencia a Insectos

Resistencia a Virus

Resistencia a Hongos

Resistencia a Bacterias

Resistencia a Herbicidas

Retraso maduración de frutos

ALGUNAS LIBERACIONES COMERCIALES DE PLANTAS TRANSGÉNICAS (Birch, 1997)

Cultivo (Fecha liberación)

Nombre Compañía Caraterísticas

Tomate (1994) Flavr Savr Calgene Savor de madurez en rama, largavida

Tomate (1995) Zeneca Consistencia de pasta de tomate

AlgodónPapasMaiz (1996-97)

BollgardNewLeafYieldGuard

MonsantoToxina deBacillus thuringiensis para resistencia insectos

SoyaRapsAlgodón (95-96)

Roundup Ready

MonsantoResistencia a Glifosato (herbicida)

OTRAS PLANTAS QUE HAN SIDO GENÉTICAMENTE MODIFICADAS

AbetoAcelgaAlfalfaAlgodónAlamoArabidopsisArrozArvejaCamoteCaña de azucarCebadaCentenoClavelCrisantemoEspárrago

EucalyptusFrambuesaFrutillaKiwiLechugaLirioMaízManíManzanaMaravillaOrquideaPapaPapayaPetuniaPera

PinoPlátanoPorotoPoroto de soyaRemolachaRepolloRosaSorgoTabacoTomateTulipánTrigoVidesZanahoriaZapallo

Transformación de Plantas

Biobalística o

Agrobacterium

Mejoramiento Genético

Color Postcosecha

Resistencia a Patógenos

MEJORAMIENTO GENÉTICO DE PLANTAS CON TRANSFORMACIÓN GENÉTICA

Insectos

Resistencia a Herbicidas

Esterilidad Sexual

Calidad del Producto

Hongos BacteriasMaterna

Paterna

Roundup

Listo

Glifosato

Bromoxinil

Glifosato

Asignacion

• Definicion• Rescate de embriones• Embriogénesis somática• Organogénesis somática• Producción de haploides • Fusión de protoplastos• Plasticidad• Totipotencia• Monocotiledodeas• Dicotiledoneas