biotecnología vegetal

Biotecnología Vegetal• Cultivo in vitro de células, tejidos y órganos

micropropagación mejoramiento de plantas producción de compuestos de interés comercial

producción de metabolitos secundarios

producción de proteínasproducción de polímeros

biodegradables establecimiento de plantas transgénicas

plantas resistentes a virusplantas con rutas metabólicas

modificadasplantas mejoradas en cuanto a

composición de proteínas, aceites, etc.

fitorremediaciónremoción de xenobióticosremoción de metales pesados

Agrobiotecnología

Cultivo de tejidosvegetales

SumarioTécnicas del cultivo de células y tejidos vegetales

Micropropagación vegetal

Consideraciones técnicas de la propagaciónclonal masiva de plantas

Etapas del cultivo in vitro de plantas superiores

Vías morfogenéticas: organogénesis y embriogénesis

Sistemas de micropropagación vegetal

Referencias

Alcances de la propagación clonal masiva de plantas

Técnicas del cultivo de célulasy tejidos vegetales

Agrobiotecnología


• Existen tres conceptos básicos que fundamentan el cultivo in vitro de células y tejidos vegetales:

- Totipotencialidad celular

- Desdiferenciación / Rediferenciación

- Balance de reguladores del crecimiento vegetal

Principales conceptos fisiológicos aplicables a los cultivos in vitro

Agrobiotecnología


• La teoría de la totipotencialidad celular, enunciadapor Haberlandt a principios del siglo veinte, postula que toda célula vegetal individual es capaz de regenerar una planta entera a partir de un cultivo in vitro sin importar el grado de diferenciación alcanzado. Para ello se requieren condiciones específicas referidas al medio del cultivo, relaciones hormonales, temperatura, fotoperíodo, etc.

• La desdiferenciación consiste en la transformación y pérdida de las características de especialización de un tipo celular para dar lugar a células de tipo meristemático. El siguiente paso involucrado en la regeneración de una planta es la rediferenciación de las células previamente desdiferenciadas.

• Todo proceso de diferenciación está regulado por el balance entre diferentes tipos de reguladores del crecimiento, fundamentalmente de auxinas y citocininas.

Fundamentos teóricos y prácticos del cultivo de tejidos vegetales

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• Micropropagación vegetal

• Regeneración de plantas (embriogénesis y organogénesis)

• Cultivo de meristemos

• Cultivo de suspensiones de células vegetales

• Cultivo de protoplastos

• Cultivo de anteras

• Cultivo de óvulos y embriones

Técnicasdel cultivo de células y tejidos vegetales

Agrobiotecnología


Micropropagación vegetal

Agrobiotecnología


• La micropropagación vegetal, o propagación clonal masiva de plantas superiores, posibilita la obtencióny cultivo de plantas a gran escala.

• Se realiza bajo estrictas condiciones de esterilidad en un medio sintético nutritivo y con control de temperatura, luz y fotoperíodo.

La micropropagación constituye la principal aplicación comercial del cultivo de tejidos vegetales

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Consideraciones técnicas de la propagaciónclonal masiva de plantas

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• Laboratorio

- Area de preparación de medios.- Area de lavado y esterilización.- Cuarto estéril.- Cámara de cultivo.- Area de rusticación.

• Material vegetal

- Plantas madres seleccionadas (pre-acondicionamiento).- Explantes (elección, disección, esterilización, etc.).

• Condiciones de cultivo

- Asepsia.- Recipientes.- Temperatura.- Luz y fotoperíodo.

La micropropagación vegetal requiere disponer de una infraestructura mínima especializaday de condiciones controladas de cultivo

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Compuestos inorgánicosMacronutrientes: NO3

- , PO4

3- , K+, Ca2+, Mg2+, SO4

2-

Micronutrientes: Fe2+, Cu2+, Zn+, Mn2+, Mo2+, Co2+, I-

CarbohidratosSacarosa, glucosa, mio-inositol

VitaminasTiamina (B1)PiridoxinaAcido nicotínico (C)Biotina

AminoácidosGlicina

Reguladores del crecimientoAuxinasCitocininasGiberelinas

Soporte inerte (medios semisólidos)Agar (0,7 a 1%)Gelrite®

pH5,6 – 5,8

Esterilización1 atmósfera, 15 a 20 minutos en autoclave

Medios de cultivo: composición general

• Soluciones concentradas de macroelementos (100x)

• Soluciones concentradas de microelementos (100x)

• Vitaminas grupo B (500 ó 1000x)

• Mio-inositol (100 mg/L)

• Azúcares: Generalmente sacarosa o glucosa en concentraciones de aproximadamente 30 g/L.

• Agar-agar: hidrato de carbono de alto peso molecular extraído a partir de algas. Se usa entre 5 y 10 g/L

Formulaciónbásicade un mediode cultivopara tejidos vegetales

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• El metabolismo de los tejidos puede modificarse dependiendo de las características del medio de cultivo (líquido o semi-sólido).

• En el caso de un medio sólido, la concentración y calidad del agar pueden tener importantes efectos en el desarrollo del cultivo (hiperhidricidad, crecimiento lento, etc.).

• El cultivo en medio líquido resulta imprescindible cuando la propagación in vitro es desarrollada a través de las siguientes vías:

- Inducción de embriogénesis*.- Cultivo de protoplastos.- Cultivo de suspensiones celulares.

*también en medio semisólido

Consistencia del medio

Semisólido

Líquido

Propiedades físicasde los mediosde cultivo

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• Intercambio gaseoso:

Los recipientes de cultivo se tapan con una película de polietieleno (Resinite) para posibilitar el intercambio de gases. La organogénesis puede verse modificada si el intercambio de gases se ve dificultado.

- La inducción de yemas a partir de callos de tabaco se reduce si no hay suficiente oxígeno.

- La acumulación de etileno puede inhibir la regeneración de brotes.

• pH:

- Constituye un factor crítico.- Se ajusta en el rango 5,5 – 5,8.- Se modifica durante el crecimiento de los cultivos.

Propiedades físicasde los mediosde cultivo

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Composición de medios de cultivo comúnmente usados

Reguladores del crecimiento comúnmente usadosen los medios de cultivos vegetales

• Grupos básicos de reguladores del crecimiento:

- Auxinas- Citocininas- Giberelinas- Acido abscísico- Etileno

• Generalidades:

- Actúan a bajas concentraciones

- Interactúan unos con otros (los resultados están determinados por las concentraciones relativas entre las diferentes fitohormonas).

- Los reguladores endógenos del crecimiento están presentes en la planta durante todo su ciclo de vida pero su concentración fluctúa. Su concentración relativa varía en función del estado fisiológico de la planta y en cada uno de los órganos de ésta.

- Están involucrados en numerosos procesos fisiológicos.

Reguladoresdel crecimiento

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• Las auxinas fueron descubiertas entre 1933 y 1935 a partir de bioensayos realizados para caracterizar el mensajero químico responsable de la elongación y de la respuesta fototrópica del coleóptilo de gramíneas.

- Alargamiento y división celular- Crecimiento de secciones de hojas, tallos y frutos - Formación de raíces adventicias- Dominancia apical- Acción herbicida- Estimulación de la producción de etileno

• Se sintetizan en las yemas, las hojas jóvenes, los frutos y en el embrión. La concentración endógena en la planta varía entre 0,001 y 0,1 mg·Kg-1.

• Su transporte es polar

• Auxinas sintéticas:

- Acido indol butírico (IBA) - Acido naftalen acético (ANA) - 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D)

N

OH

O

Acido indol acético (AIA)(auxina endógena)

Auxinas: estos compuestos se emplean básicamente como promotores de la proliferación celular y la inducción de la

morfogénesis

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• Fueron descubiertas en 1955 estudiando sustancias promotoras de la división celular in vitro.

• Están involucradas en variadas respuestas fisiológicas:

- Promoción de la división celular- Promoción de la organogénesis (relación auxinas/citocininas) - Retardo de la senescencia- Síntesis de clorofila y desarrollo de cloroplastos

• Citocininas endógenas:

- Zeatina (Zea)- Isopenteniladenina (2iP)

• Citocininas sintéticas:

- Cinetina (Kin)- Benziladenina (BAP)

• Se sintetizan en el embrión y las raíces; se encuentranen todos los tejidos. La concentración endógena en plantas varía entre 0,1 y 500 g·Kg-1.

• Su transporte es no polar.

Citocininas: en combinación con las auxinas, determinan diferentes respuestas morfogenéticas

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Estructura química de las principales citocininas

• Aisladas del hongo Gibberella fujikuroi, a partir de plantas de arroz infectadas. Estas plantas presentaban marcada clorosis y largos entrenudos. Los primeros ensayos se llevaron a cabo usando extractos solubles del hongo.

• El ácido giberélico (GA3) fue la primera giberelina identificada. En la actualidad se conocen alrededor de 50 diferentes giberelinas.

• Algunos efectos mediados por las giberelinas son:

- Promoción del crecimiento en plantas de genotipos enanos o plantas bianuales- Crecimiento de yemas latentes- Germinación de semillas en dormancia- Floración- Movilización de reservas en la semilla.

• Se sintetizan en hojas jóvenes, yemas y en el embrión.

• Su transporte no es polar.

Acido giberélico (GA3)Las giberelinas se utilizan para favorecer el crecimiento y el alargamiento de los entrenudos de los brotes de novo

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Etapas del cultivo in vitrode plantas superiores

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• Iniciación

- Elección y fitoacondicionamiento de la planta madre- Elección del explante inicial y de la formulación

del medio de cultivo- Desinfección superficial de los explantes- Establecimiento del cultivo in vitro

• Multiplicación

- Multiplicación del material stock

• Enraizamiento

- Enraizamiento de los brotes obtenidos in vitro

• Rusticación

- Pasaje de las plantas crecidas in vitro a las condiciones de maceta o a campo

Etapas de la micropropagación vegetal

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• Posibles vías morfogenéticas:

- Organogénesis

- Embriogénesis

• Diferencias entre las dos posibles vías:

- La organogénesis es de origen pluricelular. Un grupo o cluster de células del explante inicial se desdiferencía inicialmente para luego rediferenciarse dando lugar a un órgano vegetal. No se obtienen por esta vía plantas completas directamente.

- La embriogénesis se presupone de origen unicelular.Una célula del explante se aísla y constituye el puntode partida para la obtención de un embrión somático.Se diferencian embriones o estructuras bipolaresque completan cada una de las etapas implicadasen la ontogenia de un embrión cigótico. El resultado es una planta completa.

Existen dos posibles vías morfogenéticas implicadas en la diferenciación de novode brotes y/o plantas completas

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Elección de una planta madre selecta

Explantes

Desinfección superficial

Establecimiento en medio de cultivo apropiado

Transferencia a un medio de

multiplicación

Formación de brotes o embrioides

Transferencia a un medio para el enraizamiento de

los brotes

Pasaje a maceta en un invernadero

ETAPA 1

ETAPA 2

ETAPA 3

ETAPA 4

Etapas implicadasen el protocolo de micropropagación de una especie vegetal

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Elección del explante inicial

Protocolo tipo de esterilización superficial de material vegetal:

- Etanol 70%, entre 5 y 10 segundos.

- Solución de hipoclorito de sodio (NaCIO) al 5 a 20%, entre 5 y 30 min Este paso puede ser reemplazado por el uso de soluciones diluídas de bicloruro de mercurio (HgCl2), entre el 0,01 y 0,05%.

- Enjuagues con abundante agua estéril (4 ó 5 veces).

- En el caso del HgCl2, el material se debe enjuagar sucesivas veces pues es difícil de eliminar.

Los explantes deben ser esterilizados antes de ser establecidos en condiciones de cultivo

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Posibles respuestas de los cultivos vegetales in vitro

Vías morfogenéticas:organogénesis y embriogénesis

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Propagación vegetativa por embriogénesis somática

Semillas sintéticas de orquídea obtenidas por

encapsulación en alginato

Embriogénesis: Obtención de semillas artificiales

Sistemas de micropropagación vegetal

Sistemas de micropropagación vegetalProliferación de yemas axilares o apicales

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• Proliferación de yemas apicales o axilares

- Consiste en la multiplicación de plantas a partir de las yemas axilares preexistentes. Representa la aceleración in vitro del crecimiento natural de dichos meristemos.

- La tasa de multiplicación (t.m.) se calcula con base en el número de brotes o vástagos obtenidos

a partir de un explante inicial, entre una resiembra y otra sucesiva. Esta tasa puede variar entre 2 y 20 brotes por mes, dependiendo de la especie en cuestión, entre otras variables.

- Por ejemplo, con una t.m. de 5/mes podrían obtenerse 10.000.000 plantas en un solo año, a partir de una única yema inicial.

- El cultivo de meristemos es un caso especial del uso de esta técnica.

Propagación vegetativa a partir de yemas preexistentes

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Sistemas de micropropagación vegetalProliferación de tejidos desdiferenciados

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• Consideraciones generales:

- Callo: masa de células desdiferenciadas obtenidas a partir de un explante cultivado in vitro (disco de hoja, meristemo, células en suspensión, etc.)

- Es posible regenerar brotes o vástagos a partir de estos callos.

- Las plantas diferenciadas pueden no ser uniformes, debido al posible desarrollo de variantes somaclonales. Esto debe tenerse en cuenta, especialmente cuando se trabaja en propagación clonal a gran escala.

Resulta posible regenerar brotes o yemas a partir de tejidos vegetales desdiferenciados in vitro

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Sistemas de propagación vegetativa in vitro Regeneración directa e indirecta

Sistemas de propagación vegetativain vitro

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Sistemas de micropropagación vegetalCultivo de meristemos

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• Posibilitan la micropropagación de diferentes especies vegetales.

• Constituyen el explante ideal para liberar de patógenos in vitro a plantas infectadas por virus, hongos y/o bacterias.

• Son ampliamente utilizados como explantes para la criopreservación y conservación de germoplasma.

Los meristemos son grupos de células indiferenciadas que retienenla capacidad de dividirse durante todo el ciclo de vida de una planta

Los meristemos determinan el crecimiento de la planta y dan origen a sus diferentes órganos

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• Meristemos apicales

- Están localizados en la porción terminal o distal del vástago

y de la raíz.

- Sus divisiones dan lugar a las células de los tejidos pimarios del tallo y la raíz.

- Son organogénicos.

- Determinan el crecimiento en largo de tallos y raíces.

• Meristemos secundarios

- Determinan el crecimiento radial de los órganos vegetales.

- Dan lugar a los tejidos de conducción.

• Meristemos florales

- Derivan de la transformación de meristemos apicales.

- Se limitan a la producción de órganos florales.

• Meristemos intercalares

- En el curso del desarrollo de la planta, persisten restos de los meristemos apicales intercalados en los tejidos

maduros.

- Determinan el crecimiento en largo de tallos y raíces

En el cuerpode una plantase reconocen diferentes tipos de meristemas

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Cultivo de meristemasEl empleode los meristemos como explantesdel cultivo in vitro constituyeuna posible herramienta parael saneamiento de plantas infectadas

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- El domo meristemático no está vascularizado (muchos patógenos se translocan por los tejidos de conducción).

- El número de partículas virales es menor en los meristemos que en otros tejidos (White, 1934).

- La velocidad de división celular a nivel del meristema es mayor que la velocidad de replicación de un virus.

- Las primeras plantas saneadas a partir del cultivo de meristemos fueron obtenidas por Morel y Martin entre 1952 y 1957 a partir de cultivos de papa y Dahlia.

El cultivo de meristemos facilita la eliminación de patógenos

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Asp • Equipamiento

- Elementos generales para cultivo in vitro.- Lupa estereoscópica.- Instrumental de disección.

• Etapas del cultivo

- Elección del explante: escencialmente meristemos apicales de vástago. Domo meristemático desnudo o acompañado por 2 ó 3 pares de primordios foliares. Tamaño aproximado 0,5 mm.

- Esterilización de la yema o porción apical del vástago conteniendo al meristemo propiamente dicho.

- Disección del meristemo bajo lupa. Eliminación de las primeras hojas.

- Transferencia del explante al medio de cultivo semi-sólido.

- Regeneración de yemas axilares. Subcultivo a medio sin hormonas para la obtención de plantas completas.

- Propagación del material (a partir de estacas uninodales, etc.)

- Rusticación.

Aspectos técnicosdel cultivode meristemas

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• La eficiencia del cultivo de meristemos como procedimiento para la obtención de plantas sanas dependerá del tamaño del explante.

• Existe una situación de compromiso entre el tamaño mínimo posible del meristemo y su capacidad de desarrollar y prosperar durante el cultivo in vitro.

Ejemplos prácticos:

- Frutilla (Fragaria sp) / ¿patógeno?: Explantes de 0,22 mm; 100% de plantas sanas.

- Papa (Solanum tuberosum) / Potato virus X: Explantes de 0,1 mm (o menor); 10% de plantas sanas. Si el explante incluye 2 pares de primordios el % de plantas sanas es menor.

- Papa (Solanum tuberosum) / Potato virus Y o V: Se obtienen altas eficiencias de saneamiento cultivando explantes de no más de 2 pares de primordios foliares.

Consideraciones prácticas sobre el cultivo de meristemos

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• Propagación vegetativa rápida y a gran escala

• Uniformidad seleccionada del material clonado

• Multiplicación de plantas recalcitrantesa las técnicas convencionales

• Reducción en el tiempo de multiplicacióny en el espacio requerido para tal fin

• Mayor control sobre la sanidad del material propagado

• Introducción rápida de nuevos cultivares

• Conservación de germoplasma

• Facilidades para el intercambio internacionalde material vegetal

Alcances de la micropropagación vegetal

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