Biotecnología Industrial como

herramienta productiva

BiolatinaBiotecnología en América Latina

Setiembre-Octubre- 2008

Dra. Mary Lopretti

Departamento de Bioprocesos y Biotecnología - LATU

Desarrollo de I+D en Biotecnología

Áreas de desarrollo en

Biotecnología Industrial

Producción de enzimas

de uso industrial

Implementación

Diagnóstico por

Biología Molecular

•Nuevos agentes

extremofilos

•Bioinformática

•Biología Molecular

•Bioprocesos y

Producción a escala:

•Banco

•Laboratorio

•Piloto

•Microencapsulación

TRANSFERENCIA A LA

INDUSTRIA

•Textil

•Papel

•Cuero

•Alimentos

•Bioetanol

•etc.

•Servicios BIOTEC

•Valorización de Cadena Productiva

Áreas de desarrollo de Biotecnología

Biología

Molecular

Microorganismos Recombinantes

Generación de plásmidos de expresión

Análisis de secuencias genómicas y

proteicas

Bioprocesos Avances en Bioetanol

Enzimas de uso industrial

Microencapsulación de agentes

bioquímicos

Extremozimas

Estrategia de trabajo

Plataforma INIA-LATU-I.Pasteur Montevideo (y otros)

Microorganismos extremófilos y

bioinformática

PROYECTOS DE I+D

Áreas básicas de

desarrollo:

Extremozimas

Microencapsulación

Extremófilos

Bioprocesos

Biocombustibles

PROYECTOS DE

TRANSFERENCIA

Eje. Desarrollo de Probióticos

Producción de Bioetanol

Desarrollo de productos

dextranos

Proyectos

Proyectos de Innovación LATU - INIA

Microorganismos extremófilos y bioinformática

Valorización de la cadena productiva

Sevicios Biotec

Desarrollo de organismos extremófilos para detoxificación de efluentes de la industria papelera.

Proyectos de Desarrollo para la Industria

Enzimas de uso industrial

Extremozimas

Biotecnología en textiles (Producción de Microesferas)

Enzimas celulasas para la industria textil

Avances en Bioetanol

Proyecto CIU – LATU

Reactores Escala Piloto – 50 y 200 litros

Reactor Escala Banco

Proyectos Transferencia e

Innovación

Producción de Biogás

Desarrollo de Probióticos

Producción de Bioetanol -

Paysandú

Servicios a la Industria

Escalado

Desarrollo de líneas

productivas

Asesoramientos y

Consultorías

Implementación de una Unidad Genómica

Integrativa que trabaje dentro de la

Plataforma regional INIA-LATU-PASTEUR.

OBJETIVOS

• Integración de genómica y bioinformática.

•Determinación de enzimas de interés industrial de

microorganismos de condiciones extremas para la

producción de glucosidasas, xilanasas, celobiohidrolasas.

• Estudio de la producción de enzimas y su aplicación.

Formación de consorcios recombinantes y recombinantes

microencapsulados

• Aplicación; enzimas para la valorización de biomasa como

fuente de productos químicos y energía

Proyecto: “Desarrollo de una plataforma INIA-LATU-

PASTEUR para la producción de enzimas

recombinantes de interés industrial”

Área: Genómica Integrativa

Plataforma INIA-LATU-PASTEUR

Etapa 1: Extremófilos y Bioinformática

Etapa 2: Extremozimas

Etapa 3: Microcápsulas

Etapa 4: Reingeniería Bioetanol; PS+S+F

Etapa 1: Extremófilos y Bioinformática

Desarrollo de un prototipo para identificación de

extremozimas con aplicaciones en procesos industriales

basados en materiales ligno-celulósicos, integrando

información ambiental, bioquímica y genómica.

• FILOGENIA MOLECULAR Y ANÁLISIS

BIOINFORMÁTICO

• CARACTERIZACIÓN BIOQUÍMICA Y CINÉTICA DE

GENES Y ENZIMAS

• EVALUACIÓN Y OPTIMIZACIÓN DE LA

PRODUCCIÓN ENZIMÁTICA

• PROMOCIÓN DE FORMACIÓN DE RECURSOS

HUMANOS

• TRANSFERENCIA DE RESULTADOS Y

PROCESOS AL SECTOR INDUSTRIAL

Caracterización de extremófilos

Figura 1. A. Morfologia de las

colonias de Penicillium variabile. B.

Microscopio óptico 400x. Preparados con

10% de KOH. Figura 2. A. Morfología de

las colonias de Penicillium citrinum .

Microscopia óptica 400%, preparadas con

KOH al 10%. Figura 3. A. Crecimiento

macroscópico de Penicillium citrinum. B.

Microscopia óptica 400%, preparadas con

KOH al 10%. Figura 4. A. Crecimiento

macroscópico de Penicillium chrysogenum.

B. Microscopio óptico 400x. Preparados

con 10% de KOH. Figura 5. A.

Crecimiento macroscópico de Penicillium

chrysogenum. B. Microscopio óptico 400x.

Preparados con 10% de KOH. Figura 6. A.

Visualización macroscópica de colonias de

Aspergillus ochraceus. B. Conidioforo de

Aspergillus ochraceus. Figura 7. A. y B.

macro y micro de la cepa TU1 aun sin

caracterizar. Figura 8. Visualización

macroscópica de colonias de Trichoderma

longibrachiatum

A.

B.

B.

A.

A. B.

A. B.

Figura 1.

Figura 2.

Figura 3.

Figura 4.

B.A.

A.

B.

A. B.

Figura 5.

Figura 6.

A. B.

Figura 7.

A.

Figura 8.

Laboratorio Tecnológico del Uruguay (LATU) - Laboratorio de Micología. Facultad de Ingeniería (UdelaR)

Muestra Nombre Tiemp

(días)

Temp.

(ºC)

Origen Morfo. Macro Género Especie

1 CR1 1 5 25 Costa Rica1 Colonia verdes Penicillium variabile (Sopp)

2 Lig U1 col

1

5 25 Col. de lignina Colonias verdes y

amarillentas

Penicillium citrinum (Thom)

3 CR1 3 5 25 Costa Rica1 Colonia verdes Penicillium citrinum (Thom)

4 CR1 4 5 25 Costa Rica Colonia verdes Penicillium chrysogenum

(Thom)

5 TU1 7 50 Termas Colonia blancas Aspergillus fumigatus (Fresen)

6 Lig U1

Rosado

5 25 Col. de lignina Colonias

esponjosas

rosadas

Fusarium verticillioides

(Saccardo)

(Nirenberg

7 Lig U1 col

2

5 25 Col. de lignina Colonias verdes

azuladas

Penicillium chrysogenum

(Thom)

8 CR 2 4 25 Costa Rica2 Colonias verdes

amarillentas

Trichoderma longibrachiatum

(reesei) (Rifai)

9 QU 1 5 25 Sustratos

calcáreos y

polisacáridos

Colonias

amarillentas

Aspergillus ochraceus (K.Wilh.)

Bioinformática

Análisis de la diversidad funcional para clones de interés

biotecnológico e industrial a través del tamizado de librerías

metagenómicas establecidas por CIBCM (en coordinación entre esta

Institución y los laboratorios participantes del proyecto).

- http://www.jgi.doe.gov/

-http://www.pasteur.fr/recherche/unites/tcruzi/minoprio/genomics/fungi.htm

- http://www.broad.mit.edu/annotation/genome/aspergillus_group/MultiHome.html

- http://www.broad.mit.edu/annotation/genome/aspergillus_group/Links.html

Etapa 2: Extremozimas

Desarrollar un microorganismo recombinantesúperproductor de enzimas o complejos enzimáticos conactividad xilanasa, celulasa y/o ligninolítica, para eltratamiento biológico de procesos realizados porindustrias papeleras nacionales.

Screening de distintos microorganismos productores deenzimas de interés

Inducción y aislamiento del ARNm – Clonación

Transformación del huésped

Purificación y evaluación funcional enzimática

Escalado de la producción

Clonación y expresión de la celobihidrolasa II (cbhII) de Trichoderma reesei en Kluyveromyces lactis

Enzimas Recombinantes de uso industrial

Clonación de la enzima celobiohidrolasa II (cbhII) de

Trichoderma reesei

Expresión en Kluyveromyces lactis

Producción enzimática en escala laboratorio

Caracterización molecular y biológica

Evaluación enzimática

Escalado y uso industrial

Esquema de la enzima celobiohidrolasa II

interactuando con las fibras de celulosa.

El dominio mas grande de la enzima contiene

el sitio catalítico de la misma (derecha),

mientras que el dominio pequeño es el dominio

de unión a las fibras de celulosa (izquierda).

Clonación de la enzima celobiohidrolasa II

(cbhII) de Trichoderma reesei

Se amplificó la secuencia del gen cbhII de Trichoderma reesei a

partir del vector de clonación pTTc9

El producto de la PCR se secuenció y se comprobó que el mismo

corresponde a el gen cbhII de T.reesei. El análisis se llevó a cabo

sobre la base de datos del NCBI (EEUU)

El gen amplificado, se clona en el vector de expresión para

levaduras pKLAC1, el cual contiene un promotor inducible por

galactosa, y le confiere resistencia a la acetamidasa (marcador de

selección positiva)

Evaluación de los clones positivos y posterior expresión y análisis

del producto proteico.

Clonación de la enzima celobiohidrolasa II

(cbhII) de Trichoderma reesei

Sequence 1: 080522-02_F20_MIX3B2-F-

cbhll_F.ab1 844 0 844 ABI

Length = 844 (1 .. 844)

Sequence 2: lcl|65536 T.reesei

cellobiohydrolase gene (CBH II), complete cds

Accesion Number M16190

Length = 2193 (1 .. 2193)

Etapa 3: Microcápsulas

Desarrollo de un sistema de microencapsulación para laintroducción de sustancias de interés en diversossectores Industriales.

Producción de microesferas utilizando diferentespolímeros (poliuretanos, alcohol polivinílico)

Evaluación mediante Microscopía Optica (MO);Microscopía Electrónica de Barrido (MEB)

Estandarización de metodologías de producción

Evaluación de permanencia y estabilidad de la sustanciamicroencapuslada

Resultados

Microscopía óptica - Microesferas de alcohol polivinílico (PVA)

Microscopía óptica

A: 400x B: 200x

A B

Microscopía de barrido - Microesferas de alcohol polivinílico (PVA)

A B C

F

IHG

D E

Microscopía de barrido

(MEB)

A, B y C: x430; x2700;

x7000. Microesferas de

PVA-deshidratadas con N2.,

Tamaño: 2-30μm.

D, E y F: x430; x2700;

x7000. Microesferas PVA;

inclusión de limoneno luego

de producirlas. Tamaño: 2-

25 μm.

G, H y I: x65; x430; x900.

Microesferas de PVA con

limoneno introducido en el

proceso de elaboración de

las mismas. Tamaño: 50-

200μm.

Etapa 4: Reingeniería Bioetanol; PS+S+F

Producción de bioetanol a partir de diferentes sustratos

residuales mediante el desarrollo de actividades en el

área de Biomasa; presacarificaciones por fermentación

semisólida de lignocelulósicos y sacarificaciones

enzimáticas

Optimización de los Procesos de

Sacarificación y Fermentación

utilizando Kluyveromyces marxianus

para la producción de bioetanol.

Deslignificación y presacarificación biológica de los materialesmediante la inoculación selectiva de diversos tipos de hongos depudrición blanca (HPB)

Sacarificación: enzimas microbianas que faciliten ladepolimerización de los polisacáridos estructurales como lacelulosa y las hemicelulosas a azúcares simples.

Fermentación; utilización de Kluyveromyces marxianus para laproducción de bioetanol

Departamento de Bioprocesos y Biotecnología

Integrantes:

Dra. Mary Lopretti

Lic. Bioq. Ana López

Lic. Bioq. Fabiana Rey

Lic. Bioq. Sylvia Vázquez

Lic. Bioq. Agustín Damboriarena

Bach. Carolina Ottati

Bach. Mauricio Tomasso

Msc. Laura Harispe