INSTITUTO TECNOLGICO DE COSTA RICA ESCUELA DE BIOLOGA CARRERA DE INGENIERA EN BIOTECNOLOGA INFORME DE PRCTICA DE ESPECIALIDAD OPTMIZACIN DEL PROCESO DE BIOSEPARACIN DE COMPUESTOS FENLICOS A PARTIR DE DOS VARIEDADES DE FRIJOL NEGRO (Phaseolus vulgaris L.), MAZ AZUL (Zea mays L.) Y JAMAICA (Hibiscus sabdariffa L.) MA. CATALINA ROSALES LPEZ 9917718 catyros@hotmail.com II semestre-2003 OPTIMIZACIN DEL PROCESO DE BIOSEPARACIN DE COMPUESTOS FENLICOS A PARTIR DE DOS VARIEDADES DE FRIJOL NEGRO (MX 332 Y PERLA), MAZ AZUL Y JAMAICA Realizado en: INSTITUTO TECNOLOGICO DE ESTUDIOS SUPERIORES DE MONTERREY (ITESM) LABORATORIO DE BIOTECNOLOGA MONTERREY, MXICO

2003 iOPTIMIZACIN DEL PROCESO DE BIOSEPARACIN DE COMPUESTOS FENLICOS A PARTIR DE DOS VARIEDADES DE FRIJOL NEGRO (Phaseolus vulgaris L.), DE JAMAICA (Hibiscus sabdariffa L.) Y MAIZ AZUL (Zea mays L.) Informe presentado a la Escuela de Biologa del Instituto Tecnolgico de Costa Rica por Ma. Catalina Rosales Lpez, como requisito parcial para optar al ttulo de bachiller en Ingeniera en Biotecnologa MIEMBROS DEL TRIBUNAL ASESOR EN ITCRPROFESOR _______________________________ Dr. MIGUEL ROJAS CHAVES ASESORA EN ITESMPROFESORA ________________________________ Dra. CARMEN HERNNDEZ B. LECTORES (ITCR) ___________________________________________________________ Licda. ELIZABEHT ARNEZ S.MSc. SILVANA ALVARENGA V. ESTUDIANTE ____________________________ MA. CATALINA ROSALES LPEZ Cartago, 26 enero de 2004 iiDEDICATORIA Este proyecto como parte importante de mi vida profesional, es dedicado a todos aquellos que junto conmigo lo hemos hecho posible: PrimeroamisprofesoresycompaerosdelITCR,quienesmehan enseado todo lo que en este proyecto he puesto en prctica.AlosdoctoresdelITESMporaceptarmecomoparteimportanteenuno desusproyectosdeinvestigacinyaloscompaerosdetrabajodel Centro de Biotecnologa que me ensearon lo el trabajo en el laboratorio.A mi familia en Costa Rica, mi novio y mi familia en Mxico quienes con su cario me demostraron su apoyo. Ytodosaquellosqueseacordarondem,ymeapoyaronduranteel tiempo de la realizacin de mi proyecto. iii AGRADECIMIENTOS Es muy importante el crecimiento y desarrollo profesional hoy en da, hay mucha competencia Gracias a Dios por nunca dejarme sola. Gracias por permitir que en todo momento las cosas salieran bien. Y especialmente gracias por que haya sido tu voluntad el que yo realizara este trabajo. Lesagradezcoamispadresyhermanosporensearmequelavidaes una lucha constante y que el bienestar del mundo depende de nosotros, nuevas generaciones. Graciasaminovioqueconsuspreocupacionesynimos,encada llamada, me demostraba su apoyo. Gracias por el simple hecho de estar. Graciasatodosquecomol,medijeronpalabrasdealiento,me apoyaron y me dieron nimos para seguir adelante. GraciasalafamiliaLpezRamrezporabrirmelaspuertasdesus hogares y de sus corazones, los quiero mucho. Y muchsimas gracias a cada uno de los compaeros del laboratorio del ITESM, quienes me ayudaron a sentirme bien. Gracias por su amistad y ayuda. ivEPGRAFE El minuto que se vive es el ms importante en la vida, dondequiera que te encuentres. Pon atencin en lo que ests haciendo. El ayer ya se te fue de las manos. El maana no ha llegado an. Vive el momento presente, porque tu futuro depende de l. No desaproveches las oportunidades del momento, scale toda la utilidad que puedas, para tu perfeccin. Cada uno de nosotros es responsable de su destino. Supera las dificultades, vence los obstculos y edifica tu vida. Aprende a vivir eternamente: tratando de estudiar y aprender cosas tiles y provechosas, para ti y para el prjimo. S fiel al cumplimiento de los deberes, trabaja con esmero y amor cada proyecto, aunque parezca insignificante. Cualquier cosa que se haga, por pequea que sea, es un paso adelante en el progreso. T eres el nico que decide hasta donde quiere llegar. C. Torres Pastorino vRESUMEN Existeungranintersporloscompuestosfenlicosdebidoasuspropiedades antioxidantesysusposiblesimplicacionesenenfermedadescardiovasculares, inhibicindeclulascancergenasycolesterol.Lagranmayoradelos compuestos fenlicos son considerados fitoqumicos y metabolitos secundarios. Hoyendaserealizanestudiosparadeterminarsuefectoteraputico; determinando sus principios activos para curar enfermedades. Laideaprincipaldeesteproyectofueseparar,estoscompuestos,dealgunas plantasqueloscontienen,optimizandosuprocesodebioseparacin.Se extrajeron los compuestos fenlicos de dos variedades de frijol negro (Phaseolus vulgaris L.) previamente seleccionados, as como del maz azul (Zea mays L.) y de la flor de jamaica (Hibiscus sabdariffa L.). Este trabajo se realiz en el Laboratorio del Centro de Biotecnologa, del Instituto TecnolgicodeEstudiosSuperioresdeMonterrey,Mxico,bajolasupervisin delaDra.CarmenHernndezBrenes.Enunperododejunioadiciembredel 2003. Para la bioseparacin se utiliz el mtodo de fraccionamiento por solubilidad, el cualesunatcnicasencillayrpidaparalaseparacindelosgruposms comunes de compuestos fenlicos por solubilidad a diferentes reactivos. Laprimerafraccindeacetona,permitilaseparacindeloscompuestos fenlicos,loscarbohidratos,protenasylpidosquecontienenlascscarasdel frijolnegro,elmazazulmolidoylaflordelajamaica.Posteriormente,enla extraccin con ter, se retiraron los lpidos, carotenos y las protenas separados en la fraccin anterior. Se dio la extraccin gracias a que los componentes de las muestrassoninsolubles en ter, permitiendo su separacin de los compuestos vifenlicostotalesloscualessonsolublesaestereactivo(Jaworski,andLee, 1987). Posteriormentesedeterminlaconcentracindefenlicostotalessolubles presentesenlasdiferentesfracciones,obtenidoporlapruebadeFolin. IgualmentelaconcentracindeantocianinastotalesporlapruebadepH diferencial,elcualconsisteenhacerlecturasespectrofotometrcasconbuffers de diferente pH. Como resultado se obtuvo que la jamaica es la muestra de las analizadas, con mayorcontenidodecompuestosfenlicos,principalmenteantocianinas.Del mismomodoseobservarondiferenciasentrelasdosvariedadesdefrijol,en cuantoelcontenidodeantocianinaseisoflavonas.Elmazazulcontienegran cantidad de antocianinas responsable de su color caracterstico. Sepuedeconcluirquelatcnicadefraccionamientoporsolubilidad,permitela separacindeloscompuestosfenlicos.Yconformesevarealizandoel fraccionamientolasconcentracionesdeloscompuestosvandisminuyendoen cadafraccin.Ademssecomprobqueexistendiferentestiposde compuestos, antocianinas e isoflavonas en cada especie, adems se determin la cantidad presente por muestra. viiNDICE GENERAL SECCIN PGINA Constancia de la defensa pblica del proyecto de graduacini Dedicatoriaii Agradecimientoiii Epgrafeiv CONTENIDO Resumenv ndice Generalvii ndice de Cuadrosxi ndice de Figurasxii I. INTRODUCCIN1 A. Centro de Biotecnologa del ITESM3 B. Justificacin5 C. Objetivos del Proyecto6 C.1 Objetivo General6 C.2 Objetivos Especficos6 II. REVISIN DE LITERATURA7 1.Fitoqumicos 7 1.1 Polifenoles8 2.Compuestos Fenlicos8 2.1 Flavonoides13 viii2.2 Antocianinas 16 2.3 Isoflavonas18 3.Antioxidantes21 3.1 Nutrientes y sustancias no nutritivas que actan como antioxidantes 22 3.1.1. Vitaminas22 3.1.2. Minerales23 3.1.3. Aminocidos24 3.1.4. Colorantes Vegetales24 3.1.5 Enzimas Antioxidantes25 4.Frijol (Phaseolus vulgaris)25 5.Maz (Zea mays)27 6.Jamaica (Hibiscus sabdariffa)29 7.Cromatografa de micro extraccin en fase reversa31 III. MATERIALES Y MTODOS32 1.Caracterizacin fsica de doce variedades de frijol negro (Phaseolus vulgaris L.)33 2.Evaluacin de eficiencia de diferentes solventes para la extraccin de compuestos fenlicos34 3.Extraccin de compuestos fenlicos por fraccionamiento35 3.1 Extraccin con solucin de acetona:agua35 3.2 Extraccin con ter etlico36 3.3 Fraccionamiento36 3.4 Extraccin y concentracin en metanol37 4.Determinacin de compuestos fenlicos totales38 5.Determinacin de antocianinas totales38 ixIV. RESULTADOS Y DISCUSIN40 1.Seleccin de las variedades de frijol negro a analizar40 2.Evaluacin de la extraccin con diferentes solventes41 3.Fraccionamiento 43 3.1 Cuantificacin de fenlicos totales 43 3.2 Cuantificacin de antocianinas totales47 V. CONCLUSIONES52 VI. RECOMENDACIONES 54 VII. BIBLIOGRAFA 55 VIII. ANEXOS60 1.Clasificacin de compuestos fenlicos61 2.Columna de fase reversa (Sep Pak)62 3.Lavados de la extraccin de compuestos condiferentes solventes 63 4.Resultado de la extraccin de compuestos fenlicos,despus de los lavados con diferentes solventes 64 5.Secuencia de los reactivos utilizados en el Sep Pak,en la tcnica del fraccionamiento65 6.Esquema del fraccionamiento 66 7.Resultados de la coloracin de cada fraccin68 8.Frmulas para la determinacin de fenlicos totales69 9.Frmulas utilizadas para la cuantificacin de antocianinas 70 x10. Buffers utilizados para la tcnica de pH diferencial 71 11. Frijoles en remojo72 12. Tcnica del fraccionamiento, tcnica de prueba y error73 13. Espectrofotmetro y el rotavapor74 14. Contenido de fenlicos totales en cada una de las muestras75 15. Contenido de antocianinas en cada una de las muestras77

xiNDICE DE CUADROS NMERODESCRIPCIONPGINA 2.1Fitoqumicos presentes en algunos alimentos9 2.2Tipos de compuestos fenlicos sus tomos y estructura12 2.3Tipos de antocianinas y la diferencia entre los grupos RIy RII 18 2.4 Compuestos fenlicos ms comunes presentes en las muestras a analizar 30 3.1Variedades de frijol negro analizadas34 4.2Contenido de fenlicos totales en cada fraccin (mg)50 4.3Contenido de antocianinas en cada fraccin (mg)51 xiiNDICE DE FIGURAS NMERODESCRIPCIONPGINA 2.1Estructura qumica general de los compuestos fenlicos10 2.2Estructura qumica de los cidos fenlicos11 2.3Estructura qumica general de los flavonoides15 2.4Estructura qumica de las antocianinas17 2.5Estructura qumica de la Genistena 19 2.6Estructura qumica de la Glicitena y Daidzena 20 2.7Estructura qumica del estradiol20 2.8Frijol negro27 2.9Maz azul28 2.10Jamaica30 4.11Contenido de antocianinas en cada una de lasvariedades analizadas41 xiii4.12Evaluacin del contenido de fenlicos totales extrados con diferentes solventes42 4.13Contenido de fenlicos totales (mg/l), expresados en c. glico, en las distintas fracciones 45 4.14Comparacin entre las concentraciones de fenlicos totales de las dos variedades de frijol negro expresados en cido Glico46 4.15Comparacin entre las concentraciones de antocianinasde las dos variedades de frijol negro47 4.16Comparacin entre las concentraciones de antocianinasde las distintas variedades analizadas48 4.17Esquema representativo de la presencia de antocianinas a diferentes valores de pH, ledos a 518nm49 1 I.INTRODUCCIN Los alimentos independientemente de cual sea su origen, estn compuestos por muchaagua,carbohidratos,protenas,lpidosyminerales;estoscomponentes sonnecesarioscomofuentedeenerga,asmismoelementosindispensables para el metabolismo (Hoff and Janick, 1975). Estudios sobre la composicin de los alimentos han revelado que estos a la vez contienen otros componentes en pequeas cantidades como son las vitaminas, colorantes,compuestosfenlicos,entreotros.Muchosdeestoscomponentes pueden ser utilizados para ayudar a mejorar las actividades normales que realiza nuestro cuerpo (Sikorsk, 1997). Lasplantashanestadodesdelaantigedadalalcancedelserhumanotanto para su alimentacin, como para curar enfermedades; por esta ltima propiedad, sontodavaveneradasysetransmiteelconocimientodesusvirtudesde generacin en generacin. An en la actualidad cientos de plantas son utilizadas en la medicina tradicional. Losinvestigadoresestnanalizandoyestudiandolosefectosteraputicos vegetales,queriendoprecisar,compararyclasificarlosprincipiosactivos responsablesdealiviarocurarenfermedades.Seconsiderandemanera arbitrariadosgrandesgrupos:losmetabolitosprimariosylossecundarios, dentrodelosprimariosseincluyenasustanciasdelasrutasbioqumicas bsicaspresentesentodaclula,lossecundariossonungrupoampliode substanciascuyafuncinseubicacomoevolutivaydeadaptacinalmedio (Senz, 2000). Los metabolitos secundarios tienen propiedades beneficiosas desde el punto de vistafisiolgicoyfarmacolgico.Enestesentido,sedestacanlassustancias 2fenlicas(flavonoides,flavanos,resveratrol,tirosol,entreotros.)como compuestosquemsintershandespertadoennumerososgruposde investigacindedicadosalestudiodediversosaspectos,deestassustancias, qumico, bioqumico, fisiolgico, farmacolgico, entre otros (IPN CIENCIA, 1998). Lospolifenoles,delasplantas,hanllamadolaatencindelosepidemilogos, biotecnlogos,qumicos,bioqumicosyfarmaclogos;debidoasupotenciale importanciaenlasaludyenmecanismosantioxidantesdedefensa(Rickard, 1997) Varios estudios han identificado a los compuestos fenlicos como responsables depropiedadesbeneficiosasenlasalud.Ungrupodeprofesionalesy estudiantesdelInstitutoTecnolgicodeEstudiosSuperioresdeMonterrey (ITESM), Mxico, estn probando la capacidad antioxidante y el efecto inhibitorio decompuestosfenlicossobreelcrecimientodeclulascancergenas, extrados de diferentes muestras como el maz, el frijol y la jamaica (Hernndez, 2003). Los flavonoides, las isoflavonas son tipos de compuestos fenlicos, encontrados enfrutas,vegetales,nuecesygranos,poseenpropiedadesbiolgicasque ayudanareducirelriesgodecontraerenfermedades(Lock,1994),(Barret-Connor,1998).LosinvestigadoresdelITESMreconfirmanestasafirmaciones (Hernndez,2003).Otrasustanciautilizadacomoantioxidantecontralas enfermedadescardacasycancerosassonlasantocianinas,pigmentos responsablesdelcolordelosalimentosyqueprotegenalasfrutascontrael ataque de los hongos. La mayora de stas sustancias beneficiosas se acumulan en las cscaras de las frutas (Senz, 2000). Loscompuestosfenlicosestnpresentesenlasfrutas,flores,granosy verduras. Se pueden encontrar varios tipos de ellos en un solo alimento. Por lo que fue necesario optimizar la extraccin para luego realizar su anlisis y probar 3sus efectos por separado; esto a partir de las concentraciones de fenlicos totales, donde se incluyen las isoflavonas, antocianinas y flavonoides. A.CENTRO DE BIOTECNOLOGA DEL ITESM ElCentrodeBiotecnologa(CB),delInstitutoTecnolgicodeEstudios SuperioresdeMonterrey,Mxico,fuefundadoen1994.ElCentrorealiza investigacionesenfocadasenlasreasalimentarias,agrcolas,ambientalesy farmacuticas, haciendo uso de microorganismos, enzimas y plantas o animales. EllaboratoriodeinvestigacindelCentrodeBiotecnologaseencuentraenla ciudad de Monterrey, Nuevo Len, Mxico. Actualmente en el Centro de Biotecnologa del ITESM, se desarrollan procesos biotecnolgicos alternativos para la produccin de aditivos funcionales, su labor de investigacin se enfoca a la identificacin de compuestos con potencial para serutilizadosenlaprevencinytratamientodelasprincipalesenfermedades quebajanlaexpectativaylacalidaddevidatalescomodiabetes, ateroesclerosis,hipercolesterolemia,hipertensin,sndromeposmenopusicoy cncereshormona-dependienteseindependientes.Losproyectosde investigacinsebasanenelaislamientoypurificacindeestoscompuestos mediantetcnicasbiotecnolgicassofisticadasparasuposteriorusoporlas industrias de alimentos y farmacuticas. AlgunasreasdeinvestigacinenelCentrodeBiotecnologa,combinan bioingeniera y biomedicina, ingeniera de bioreaccin, modelos matemticos de bioprocesos.AscomolaBiotecnologadeloscereales,tecnologadelas enzimas, prebiticos y alimentos fermentados, entre otros. 4 Eneldesarrollodelproyectoelequipodetrabajoestintegradopor profesionales y estudiantes de maestra, entre los cuales estn: Carmen Hernndez, Ph.D. Janethe Gutirrez, M.Sc Mayra Cisneros, M.Sc Armando Delfollo, M.Sc Ing. BQ Gabriela ngel Q. Isabel Garca (Encargada del laboratorio) 55B.JUSTIFICACIN DEL PROYECTO Enlosltimosaos,labiotecnologajuntoconlatecnologadealimentoshan tratadodeobtenerlatransformacin,conservacinyaseguramientodela calidaddelosalimentos.Adems,seencuentranorientadasalabsquedade alimentos similares a productos frescos, libres de aditivos qumicos, disponibles todo el ao y con caractersticas demandadas por los consumidores. Conlaelaboracindelpresenteproyectosepretendioptimizarlatcnicade fraccionamientoporsolubilidad,ybiosepararloscompuestosfenlicospara posterioresinvestigaciones,conlascualessequisoprobarlaactividad antioxidante de cada uno de ellos, sobre clulas cancergenas. Y as llegar a la obtencindeproductosfarmacuticosapartirdecompuestosqumicosque contienen algunos alimentos. Ademssequisocuantificarloscompuestosfenlicosencadafraccin,para determinarcualdestaseralamsadecuadaenlasinvestigaciones posteriores. Elestudioserealizapartirdealimentosquesonunafuenteconpotencial nutracetico,alimentoscomunmenteconsumidosporlamayorade latinoamericanosyaloscualespuedenteneraccesolasdiferentesclases sociales, como lo son el frijol, el maz y la jamaica. 6C.OBJETIVOS DEL PROYECTO C.1 OBJETIVO GENERAL Optimizar el protocolo de fraccionamiento con solventes orgnicos que permitan laextraccindeloscompuestosfenlicos,apartirdedosvariedadesdefrijol negro (Phaseolus vulgaris L.), de la flor de jamaica (Hibiscus sabdariffa L.) y del mazazul(ZeamaysL.)yparallevaracabolacuantificacindelosfenlicos totales y de las antocianinas presentes en los extractos. C.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS Seleccionar las variedades de frijol negro que se utilizarn en el proceso de fraccionamiento por solubilidad. Evaluarelrendimientodeextraccindecompuestosfenlicosutilizando diferentes solventes orgnicos. Extraeryseparardecompuestosfenlicosporlatcnicade fraccionamiento a partir dos variedades de frijol negro (Phaseolus vulgaris L.),granosdemazazul(ZeamaysL.)ylaflordejamaica(Hibiscus sabdariffa L.). Caracterizarycuantificardedichoscompuestosportcnicas espectrofotomtricas. Comparar de forma cuantitativa los compuestos fenlicos extrados de las diferentes muestras (frijol, maz y jamaica). 7II. REVISIN DE LITERATURA 1. LOS FITOQUMICOS Lasfrutasyverdurassonbuenasparalasaludyaquecontienendiversas vitaminas, minerales y fibra. Desde hace algunos aos, se sabe que adems de estosnutrimentos,aportanalorganismootrassustanciasalasqueselesha denominado,fitoqumicosofitonutrientes,lascualeshandemostradotener efectospositivossobrelasaludporloquesonestudiadosporungrannmero de cientficos (Avils, 2002). Losfitoqumicossonmetabolitossecundariosporquenoejercenunafuncin directaenlasactividadesfundamentalesdelorganismovegetalcomoel crecimientoolareproduccin.Constituyennumerososcomponentesqumicos, como los carotenoides, que incluyen a los betacarotenos, licopeno o lutena y los polifenoles,dondeestnloslignanos,cidosfenlicos,taninos,flavonoides, entre otros (Anexo 1) (Avils, 2002). Actualmentesesabequealgunasdeestassustanciasactanmodulandola accindeciertasenzimas.Otrasactancomoantioxidantesneutralizandolos radicales libres, causantes de enfermedades cardiovasculares, arteriosclerosis y envejecimiento (Avils, 2002). Noslolosfitoqumicossonantioxidantessinotambin lo son las vitaminas C, E, A y algunos oligoelementos (selenio y manganeso). Algunos polifenoles como las isoflavonas y los lignanos tendran propiedades estrognicas que limitaran el desarrollodecncereshormonodependientes.Existeevidenciacientficaque relaciona un alto consumo de frutas y verduras con un menor riesgo de padecer ciertostiposdecncer;responsablesdeestaaccinprotectoraseranlos fitoqumicos (Avils, 2002) (Cuadro 1). 81.1 LOS POLIFENOLES Estos pigmentos son muy abundantes en los vegetales a los que dan aromas y colores. Los polifenoles constituyen una de las principales clases de metabolitos secundarios,sondedifcilclasificacinperosepuedensubdividirencuatro grandesgrupos,primeroloscidosfenlicos,segundolosligninas,tercerolos taninos y por ltimo los flavonoides, que a su vez se dividen en varios subgrupos como flavonas, isoflavonas, antocianinas, entre otros (Martnez et al, 2000). Elenvejecimientoascomolaaparicindealgunasenfermedades,sedebeal efectodelos"radicaleslibres".Losradicaleslibressonmolculasaltamente reactivasqueatacanlosenlacesdeprotenasdelostejidos.Unavezque comienzanaactuar,seactivaunareaccinencadenaqueacabapordestruir totalmente la clula (Sauza y Senz, 2000) (Rickard, 1997). Sepuede combatir a los radicales libres consumiendo antioxidantes artificiales, pastillasdevitaminaC,vitaminaEybetacarotenos;orecurriendoauna alimentacin sana (antioxidantes naturales) con altas dosis de verduras, granos y frutas frescas, aceite de oliva y vino tinto (Sauza y Senz, 2000). 2. COMPUESTOS FENLICOS Estoscompuestosposeenencomnunanilloaromtico,conunooms sustituyentes hidroxilos, y que se encuentran como glicsidos, combinados con unidadesdeazcar(Figura1).Sonrelativamentepolaresytiendenaser solublesenagua;puedenserdetectadosporelintensocolorverde,prpura, azulonegro,queproducencuandoselesagregaunasolucinacuosao alcohlica al 1% de cloruro frrico. Dada su naturaleza aromtica muestran, una intensaabsorcinenlareginUVdelespectro,siendoestemtodoespectral especialmenteimportanteparasuidentificacinyanlisiscuantitativo(Lock, 1994). 9Cuadro 1: Fitoqumicos presentes en algunos alimentos AlimentoFitoqumicosAccinTomateLicopenoAfecciones cardiacas Cncer de prstata Ajo, cebolla, poroSaponina Alicina Infecciones El aumento del colesterol Tumores Zanahorias, verduras verdes oscuras, mango, melocotn, meln BetacarotenosAlteraciones pulmonares malignas Brcoli, coles, col de Bruselas, ajo, cebollas IsotiocianatosCncer del pulmn Manzanas, uvas, cebollasQuercetinaAfecciones cardiacas Evolucin celular cancerosa Fresas, uvascido elgicoIntoxicacin por humo del tabaco Naranjas, duraznosTerpenolceras Cncer Brcoli, colesIndolesCiertos tipos de cncer Frutas, verduras, soja, ctricos, t verde, vino, cacao FlavonoidesAfecciones cardiacas Ciertos tipos de cncer Frutas, verduras, bayas, nueces, soja, azafrn, aceitunas PolifenolesAfecciones cardiacas Ciertos tipos de cncer FUENTE: Avils, R. 2002. 10La estructura qumica de los polifenoles es especialmente adecuada para ejercer unaaccinantioxidante(donadordehidrgenooelectrones,oatrapadorde radicales libres). Adems, su capacidad de quelar metales, especialmente cobre yhierro,loshaceactuarindirectamentecomoantioxidantesyaqueinhibenla accindelosmetalescomocatalizadoresenlaformacinderadicaleslibres (Evans and Miller, 1997) (Cuadro 2). Dentro de ellos existen dos grandes grupos de compuestos fenlicos: los cidos fenlicos(benzoicosycinmicos)ylosflavonoides(flavonoles,antocianinasy taninos). La diferencia de estructura entre ambos grupos consisten principalmente en que los cidos fenlicos tienen un nico anillo fenlico, mientras que los flavonoides estn formados por dos anillos fenlicos unidos por una cadena de tres tomos de carbono (Martnez, sf) (Figuras 1y 2) O+R1R2RR4R3R5 Figura 1. Estructura qumica general de los compuestos fenlicos Apesardequetodospresentanunaestructurafenlica,ncleoaromticoque contieneungrupohidroxlicolibreosustituido,sediferenciandeotros 11compuestos que tambin poseen esta estructura fenlica (monoterpenos), en su origen biosinttico. R1R2R3R4COR5 Figura 2. Estructura qumica de los cidos fenlicos Los flavonoides y los cidos fenlicos junto con sus steres, son genricamente denominadoscompuestosfenlicos(Bankovaetal,2000).Estoscompuestos absorbenradiacinenlareginultravioletadelespectroelectromagnticoy protegen de la radiacin solar a los tejidos vegetales ms sensibles (Maldonado, 2002). Entrelasplantasmedicinalesqueposeencidosfenlicos se pueden destacar la alcachofa con actividad contra el colesterol, el ortosifn con actividad diurtica ylaequinceaempleadaporsuspropiedadesinmuno-estimulantes(Tyler, 1994). Lamayoradecompuestosfenlicoscumplendoscondiciones.Laprimeraes quenosonintermediarios,niproductosfinalesdelosciclosmetablicos aceptados como esenciales para los procesos vitales de los organismos que los sintetizan.Ylasegundaesqueraramentesupresenciaesuniversal; normalmenteunasustanciaselocaliza en una o varias especies ms o menos relacionadas filogenticamente. 12 Por estas razones, estas sustancias no se consideran esenciales desde el punto devistametablicoparalosseresquelasproducenyselesagrupabajola denominacincomndeproductosmetabolitossecundarios,conceptomuy amplioqueenglobasubstanciasdenaturalezayfuncintandiversacomo pigmentos, esencias y substancias con accin fungicida y bactericida. 13Cuadro 2. Tipos de compuestos fenlicos sus tomos y estructura tomos de Carbono EstructuraTipo 6C6 Fenoles simples Benzoquinonas 7C6 C1 cidos Fenlicos 8C6 C2 Derivados de Tirosina cidos Fenilacticos 9C6 C3 cidos Cinmicos Fenilpropenos Cumarinas 10C6 C4 Naftoquinonas 13C6 C1 C6 Xantonas 14C6 C2 C6 Estilbenos Antraquinones 15C6 C3 C6 Flavonoides Isoflavonoides 18(C6 C3)2Lignanos Neolignanos 30(C6 C3 C6)2 Bioflavonoides n9 (C6 C3)n Ligninas n6 (C6)n Melaninas Catecolicas n15 (C6 C3 C6)n Taninos condensados FUENTE: Lock de Ugaz, O. 1994. 142.1 FLAVONOIDES Losflavonoidessonungrangrupodesustanciasvegetalesquefueron descubiertas por el Dr. Albert Szent-Gyorgi, premio Nobel en Bioqumica, quien lesdenomincomo"vitaminaP".ElDr.Szent-Gyorgidescubriquelos flavonoidesfavorecenlafuncindelavitaminaC,mejorandosuabsorciny protegindoladelaoxidacin.Comprendenvariasclasesdesustancias naturales,entrelascualesestnmuchasdelasquelesconfierenencolores amarillo,naranja,rojo,violetayazul,amuchasflores,hojasyfrutos, especialmente (Martnez et al 2000). Los flavonoides comprenden un grupo de compuestos polifenlicos ampliamente distribuidos en las frutas y en los vegetales, as como en el t negro, el caf, la cocoa,lacervezayelvinorojo.Puedenaparecerdesdesimplesmolculas fenlicashastacompuestosmuypolimerizadosconpesosmoleculares superiores a los 30 000 Da (Prez, 2003). Sehanpublicadoestudiosepidemiolgicosqueasocianelconsumode flavonoidesconunamenormortalidadgeneralymenormortalidadpor enfermedadcoronaria.Enlapoblacinestudiada,laprincipalfuentede flavonoideserancebollasymanzanas,yquercetinaelflavonoidems abundante (Hertog, 1995). Losflavonoidesejercennumerososefectosbioqumicos,aparentemente beneficiosos,ademsdesuaccincomoantioxidantes.Invitroposeen actividadesanti-inflamatoria,antialrgica,antitrombtica,antimicrobianay antineoplsica.Sinembargo,laextrapolacinderesultadosinvitroaloque ocurreenunorganismoinvivo,sloesposiblecuandoseconocela biodisponibilidad del compuesto activo. 15Las propiedades biolgicas de mayor inters han sido sus efectos antioxidantes, loscualeshansidoblancosdeunsinnmerode estudios, teniendo en cuenta queamenudodosisfarmacolgicasdeantioxidantesdietticoscomnmente recomendadosentodoelmundo,comoeselcasodelascombinaciones vitamnicas(vitaminaEmsvitaminaCy!-caroteno),quenoproducenlos efectosesperadosoestosresultandainos,porloqueparalograrunamejor accinantioxidanteseprefiereincluirenladietaunamezcladeflavonoidesy taninos (Prez, 2003). Porsusposiblesbeneficiosdesalud,losflavonoidessonelgrupomsgrande de qumicos de las plantas, que la comunidad cientfica han estado estudiando, otrosflavonoidestienenefectosantimicrobianosyposiblemente anticarcinognicos y cardioprotectores (Rodrguez, 2003) (Cuadro 1). Este tipo de compuestos fenlicos, adems de poseer actividad antioxidante, se aplicancomocolorantesnaturalesyposeenpropiedadesantibacterianasy antifngicas.Enlosvegetalesintervienenenlosfenmenosdeoxidacin-reduccin,protegenaotrospigmentosdelaluzylaradiacinUV,presentan actividadfunguicidaycontraparsitosagresores,ayudanalapolinizacin,ya queporsuscoloresatraenalosinsectosjuntoconlosaceitesesenciales (Marcano y otros, 1991). Losflavonoides(C6 -C3 -C6)sepuedenclasificarenvariasfamiliassegn cambios estructurales en su estructura bsica, (Figura 3). Poseen varios grupos hidroxilo(-OH)unidosasuestructuradeanilloyseencuentrannormalmente comoglicsidos.Lasposicionesdeglicosilacinson7-hidroxiloenflavonas, isoflavonas y dihidroflavonas; 3- y 7- hidroxilo en flavonoles y dihidroflavonoles, y 3- y 5- hidroxilo en antocianidinas. La glucosa es el residuo de glicosilacin mas frecuente.Losglicsidossonmshidrosolublesymenosreactivosfrentea radicales libres, que su aglicona o flavonoide respectivo (Rice-Evans, 1997). 16Su secuencia carbonada: C6 -C3 -C6 en la que la posicin del C3 determina que seadediferentestipos:flavonas,isoflavonas,antocianinas,catequinas,entre otros (Marcano, et al, 1991). O+RRRRRR Figura 3.Estructura qumica general de los flavonoides Para obtener flavonoides de la dieta se deben comer, sobre todo, muchas frutas yverduras.Otrosalimentosqueloscontienensonelt,elcaf,elcoco,la cerveza,elvinotinto,elmostodeuvasnegrasylasoyaysusderivados(tofu, miso, leche de soya, entre otros) (Rodrguez, 2003). Laindustriacosmticadesarrollderivadosdelosflavonoidesparalapiel. Fueron biotecnolgicamente modificados para ser activos en la piel. A modo de ejemplo:elflavonoideprotege10vecesmsquelavitaminaE,porqueesun antioxidantemuchomspoderoso.Esdecir,previeneconmayoreficaciala accin de los radicales libres, considerados la causa principal del envejecimiento prematurodelapiel(Rojas,2000).Adems, protege las clulas epidrmicas al ayudarefectivamentealosmecanismosdedefensadelapiel,protegedelas alergiassolaresylapolucinambiental,yprevienelaformacindearrugas (Rojas, 2000) 172.2 ANTOCIANINAS Las antocianinas tienen un carcter antioxidante, por lo que su consumo puede suponerunbeneficioparalasalud.Porcuantodisminuyenlosnivelesde colesterol(inhibiendosusntesis),proveenproteccincontralasenfermedades cardacas y previenen ciertos tipos de cncer. Qumicamente son miembros del grupodelospolifenoles,tambinllamadosvitaminaselsigloXXIporsus efectos beneficiosos. Lospigmentosvegetalessepuedenclasificarencuatrograndesgrupos,dos liposolubles:clorofilaycarotenoides,ydoshidrosolubles:lasbetalanasylos flavoniodes,loscuales,comoyasehamencionado,seencuentran principalmenteenfloresyfrutos.Lascoloracionesdelasantocianinasvaran con el cambio de pH, de rojo en medio cido, pasando por amarillo, a violeta y azul en medio alcalino (Lock, 1994) Loscoloresrosa,rojo,azul,malvayvioletadelasflores,frutasyverduras,se debenalapresenciadeantocianinas.Lasantocianinas,aligualqueotras sustancias polifenlicas, se encuentran en la naturaleza en forma de glicsidos, siendo conocidas sus agliconas como antocianidinas. Se trata de flavonoides, es decir, sustancias derivadas del ncleo flavano (Daz de Villegas, 1986) ElpHylapresenciadeotrassustanciastienenmuchamasinfluenciasobreel color que la naturaleza de las sustancias del anillo. En la Figura 4 se representa laestructurabsicadelasantocianinas,enformadecatinflavilio,queesla predominanteenvaloresdebajopH.ConformeaumentaelpHsepierdeun protn,seganaunamolculade agua y se forma una pseudobase carbiol, las cualessonincoloras,porloqueexisteunadegradacindecolorconforme aumenta el pH (Daz Villegas, 1986). 18Se conocen cerca de 4.000 pigmentos vegetales en alimentos, incluyendo miles de flavonoides y antocianinas. Al igual que el resto de los colorantes naturales, las antocianinas presentan una inestabilidad inherente propia dentro de matrices alimentarios; aunque son ms establesbajocondicionesdeacidez.Puedenserdegradadasporunagran variedaddefactoresomecanismosquelasconviertenenproductosincoloros solublesy/oproductoscontonalidadcafeinsoluble.Estadegradacinpuede ocurrir durante el proceso de extraccin y purificacin del pigmento o durante el proceso y almacenamiento de los alimentos. Los factores que tienen una mayor influenciaenlaestabilidadenlasantocianinassonelpH,temperatura,la presencia de oxgeno y la exposicin a la luz. Elcolordeestospigmentosestdeterminadoporelnmerodegrupos hidroxilos.Ascomoporlanaturalezaynmerodelosgruposalifticoso aromticos que estn unidos al azcar y el ambiente fisicoqumico en el cual se encuentra el compuesto (Mazza y Brouillard, 1990). En el Cuadro 3 se muestran las caractersticas estructurales de las diferentes antocianinas, dependiendo del tipo de sustitucin que presentan. O+RIOHRIIOHHOOH Figura 4. Estructura qumica de las antocianinas 19Sehanencontradoseisantocianinasdiferentesenlanaturaleza,perolos diversospatronesdeglicosilacindanlugarainnumerablesantocianinas diferentes.Unasolaespecievegetalcontieneunconsiderablenmerode antocianinas diferentes. Cuadro 3. Tipos de antocianinas y la naturaleza qumica de los grupos R I y R II. ANTOCIANINASR IR II Pelargonidina- H- H Cianidina- OH- H Peonidina- OCH3- H delfinidina- OH- OH Petunidina- OCH3- OH malvanidina- OCH3- OCH3 FUENTE:ITESM, 2003 2.3 ISOFLAVONAS Son compuestos qumicos que se encuentran de manera natural en las plantas. Estndistribuidosenpocasfamilias,principalmenteenlasleguminosasy pertenecenalaclasedelosfitoestrgenos.Seutilizancomounaterapia alternativadediferentescondicionesdependientesdehormonas,talescomo cncer,sntomasdemenopausia(descalcificacinseaylaintoleranciaa calores), enfermedades cardiovasculares y osteoporosis (Setchell, 1984). Otro aspecto teraputico importante de las isoflavonas, es su efecto antioxidante, dondeprevienelaoxidacindelasLDL (lipoprotenas de baja densidad) por lo que se limita la formacin de asterosclerosis (placas de grasa que se forman en 20las paredes de las arterias que dan lugar a trombosis e infartos) (Goldwyn, et al, 2000). Lasisoflavonastienenunaestructuraqumicamuyparecidaaladelos estrgenosqueposeenigualmenteunanillofenlico(Figura5y7),debidoa estaestructurafenlica,lasisoflavonaspuedenserreconocidasporlos receptoresdelosestrgenosyunirseastos,poresoselesdenomina fitoestrgenos, (Gerber, 2001). Setratadeunoscompuestosquecontienenunoovariosgruposhidroxilos unidosaunanilloaromtico.Existendiferentestiposdeisoflavonasdentrodel cereal, los ms importantes son; la genisteina, la daidzeina y la gliciteina. A partir destosseconstruyenlasformasmaloniles,acetilesyglucsidos.Poreste motivo se cuentan con doce formas distintas (Potter et al., 1998) En las Figuras 5 y 6 se observan la genistena es el tipo de isoflavonas ms comn y el que se encuentra en mayor cantidad en el frijol. Y luego la glicitena y la daizena, otras isoflavonas comunes. O+OHOH OHHO Figura 5. Estructura qumica de la Genistena 21O+OHOHOHO Glicitena O+OHOHO Daidzena Figura 6. Estructura qumica de dos tipos de isoflavonas (Wei, et al, 1995) Las isoflavonas al igual que otros fitoestrgenos como los lignanos y estilbenos, tienen ciertos aspectos en comn con el estradiol, tales como un par de grupos hidroxiloseparadosporunadistanciasimilaryunanillofenlico(Figura7)que es prerrequisito para la unin al receptor de estrgeno (Cassidy, 2000) HOOH Figura 7. Estructura qumica del estradiol 223. ANTIOXIDANTES Un nutriente tiene propiedades antioxidantes cuando es capaz de neutralizar la accinoxidantedeunamolculainestable,esdecir,deunradicallibre,sin perdersupropiaestabilidadelectroqumica(StarkeyReed,2003).Setratade ungrupodevitaminas,minerales,colorantesnaturalesyotroscompuestosvegetalesyenzimas.Lamayoradelosantioxidantesseencuentranen alimentosvegetales,porloqueserecomiendaincluirfrutas,legumbres, verduras y hortalizas o cereales integrales en nuestra dieta sea tan beneficioso. Millones de radicales libres bombardean diariamente nuestras clulas. El hecho de que necesiten tantos aos para causar daos mayores es por la eficacia de las enzimas que produce nuestro propio organismo para neutralizarlos. Nuestro sistema est luchando contra radicales libres a cada momento del da. Elproblemaparaelorganismoseproducecuandotienequetolerardeforma continuaunexcesoderadicaleslibres,elcualesproducidomayormentepor contaminantesexternosquepenetranennuestrocuerpo.Lacontaminacin atmosfrica, el humo del tabaco, los herbicidas, pesticidas o ciertas grasas son algunosejemplosdeelementosquegeneranradicaleslibresqueingerimoso inhalamos. Este exceso no puede ya ser eliminado por el cuerpo (Flores, 2000). Los radicales libres daan las membranas de las clulas, llegando finalmente a destruirymutarsuinformacingentica,facilitandoaselcaminoparaquese desarrollendiversostiposdeenfermedades.Laaccindelosradicaleslibres est ligada al cncer, as como al dao causado en las arterias por el colesterol "oxidado", lo que relaciona directamente estas molculas con las enfermedades cardiovasculares. Existencadavezmspruebasdelaintervencindelosradicaleslibresyde otrasmolculasreactivasenlosprocesospatolgicos.Laprincipalevidencia provienedeestudiosepidemiolgicosquemuestrancorrelacionesestadsticas 23entrelaincidenciadepatologaylapresenciadeconcentracionesbajasde nutrientes antioxidantes en la sangre o alimentos (Murray et al, 1997) NutrientesantioxidantescomolavitaminaCcedenalosradicaleslibressus propioselectronessalvandoasnuestrasclulasdesufrirdao.Losnutrientes antioxidantes por excelencia son el beta caroteno, la vitamina C, la vitamina E, y el selenio (Starke y Reed, 2003) LavitaminaEeselantioxidantemsimportantedelcuerpoyactaenlafase lipdica de las membranas en toda la clula. Alafechanosetienenestudiossobrelautilizacingenticadelosgenes responsables de esta actividad antioxidante, tampoco complementos de ninguno delosantioxidantesmencionados.Sinembargo,serecomiendaaumentarel consumodecereales,nueces,frutasyvegetales,todosellossonricosen antioxidantes naturales, como los compuestos fenlicos. 3.1NUTRIENTESYSUSTANCIASNONUTRITIVASQUEACTANCOMO ANTIOXIDANTES 3.1.1 VITAMINAS Lasvitaminassonpequeasmolculasorgnicaspresentesenladieta ya que nopuedensersintetizadasporelhombre,obiensonsintetizadasenuna porcininferioralanecesariaparaunabuenasalud.Lasvitaminassuelen dividirse en dos clases: las liposolubles como lo son la vitamina A y la vitamina D; y las hidrosolubles como la vitamina B y la C (Montgomery et al, 1998). VitaminaC:presenteenfrutasyverduras,frescasycrudas,comoguayaba, kiwi,mango,pia,caqui,ctricos,meln,fresas,bayas,pimientos,tomate, brasicceas (verduras de la familia de la col), frutas y hortalizas en general. 24VitaminaE(tocoferol):seencuentraenelgermendeltrigo,aceitedesoja, germendecerealesocerealesdegranoentero,aceitedeoliva,vegetalesde hoja verde y frutos secos.Betacaroteno o "provitamina A": Pertenece a la familia de los carotenoides de losvegetales.ElorganismoescapazdetransformarloenvitaminaA.Posee conjuntamentelaspropiedadesdelavitaminaAydelosantioxidantesque actan sobre los radicales libres. Recientemente se ha demostrado su papel en la prevencin de las cataratas y su efecto beneficioso en procesos inflamatorios yenlosrelacionadosconelenvejecimiento.Algunosalimentosricosen betacarotenosonlasverdurasdecolorverdeocoloracinrojo-anaranjado-amarillentocomolazanahoria,lasespinacas,lacalabazayotros;adems, ciertasfrutastalescomoalbaricoques,cerezas,melnymelocotn(Lpez, 2001). 3.1.2 MINERALES Los elementos inorgnicos forman parte esencial de la dieta. Selenio: Relacionado con un menor riesgo de tumores de piel, hgado, colon y mama. Asimismo vinculado al funcionamiento de la glutation peroxidasa (enzima antioxidantedenuestroorganismo).Encarnes,pescados,marisco,cereales, huevos, frutas y verduras.Zinc: Favorece la formacin de nuevas protenas (renovacin celular), participa en la lucha contra los radicales libres y en la sntesis de enzimas, interviene en elsistemainmuneodedefensasyfavoreceel buen estado de piel y mucosas (tonicidad y elasticidad de la piel). Constituyen buena fuente de zinc las carnes y vsceras, los pescados, los huevos, los cereales completos y las legumbres.Cobre:Potenciaelsistemainmune,participaenlaformacindeenzimas, protenas y neuro-transmisores cerebrales (renovacin celular y estimulante del sistemanervioso)yesunagenteantiinflamatorioyantiinfeccioso.Yfacilitala sntesisdecolgenoyelastina(necesariosparaelbuenestadodelosvasos sanguneos, del cartlago, de los pulmones y de la piel), acta como antioxidante 25protegiendo las clulas de los efectos txicos de los radicales libres y facilita la fijacindelcalcioydelfsforo.Alimentosricosencobre:hgado,pescado, marisco, cereales completos y vegetales verdes (Lpez, 2001). 3.1.3 AMINOCIDOSLos aminocidos procedentes de las protenas de la dieta son utilizadas para la biosntesisdelasprotenastitulares.Loasaminocidosactantambincomo fuente de nitrgeno para la biosntesis de otros compuestos (Montgomery et al, 1998). Cistena:aminocidonoesencial,nuestrocuerpopuedefabricarlosin problemas.Esimportanteparalaproduccindeenzimascontralosradicales libres,comolaglutationperoxidasa.Elhgadoynuestrasdefensasloutilizan paradesintoxicarelcuerpodesustanciasqumicasyotroselementosnocivos. Lacistena,queseencuentraencarnes,pescados,huevosylcteos,esun detoxificante potente contra los agentes que deprimen el sistema inmune, como el alcohol, el tabaco y la polucin ambiental (Lpez, 2001). 3.1.4COLORANTESNATURALESUOTROSCOMPUESTOSDE VEGETALES SeencuentrandentrodeestegrupodeantioxidantesalosFlavonoides: Comprendenalosflavonoles,losantocianidolesyalasflavonas,colorantes naturales con accin antioxidante que constituyen el grupo ms importante de la familiadelospolifenoles,muypresentesenelmundovegetal.Protegenel sistemacardiovascularyactivanlasenzimasglutationperoxidasaycatalasa, antioxidantespresentesdeformanaturalennuestroorganismo.Estnenla familia de las coles, las verduras de hoja verde, las frutas rojas y moradas y los ctricos. Segn la American Cancer Society, reducen el riesgo de cncer colo-rectal. Tambin antes mencionadas las Isoflavonas (Lpez, 2001). 26cido alfa-lipoico: Es un carotenoide de algunas verduras y frutas, que ayuda a neutralizarlosefectosdelosradicaleslibrespotenciandolasfunciones antioxidantes de las vitaminas C, E y de la enzima glutation peroxidasa. Abunda en el tomate. 3.1.5ENZIMAS ANTIOXIDANTES Adems de las enzimas glutation peroxidasa, catalasa y superxido dismutasa, hay otras sustancias antioxidantes como la coenzima Q-10. Coenzima Q-10: Ayuda a las enzimas a realizar su funcin. Se ha comprobado una gran similitud entre las propiedades antioxidantes de la vitamina E y las de lacoenzimaQ-10,quejuegaunimportantepapelenlageneracindeenerga celular,yasuvezesunestimulanteinmune,mejoralacirculacinyayudaa proteger el sistema cardiovascular (Lpez, 2001). 4. EL FRIJOL NEGRO (Phaseolus vulgaris) Phaseolus vulgaris, es una planta con una altura promedio de 50 a 70 cm; con races bien desarrolladas, presenta una raz principal pivotante y muchas races secundarias cercanas a la superficie; tallos delgados y dbiles, cuadrangulares, hojastrifoliadas.Producede2a5semillasreniformesoblongasaovaleso redondeadas, poco comprimidas, de color rojo, amarillo, caf o negro (Figura 8). Seutilizanparalaalimentacinhumanaseconsumenlosgranossecoso tiernos;lasvainasenterasyverdesseconsumencomoverdura.Pueden utilizarsecomoabonoverdeenrotacin,intercaladocomocoberturaconotros cultivosycomoforrajedecorteparaanimales(CentroInternacionalde Informacin sobre Cultivos de Cobertura, 2002). 27Elfrijolesconsideradopartedelaalimentacinbsicaenmuchospasesde Latinoamrica.Lasleguminosassonunaimportantefuentedeprotenaexplica elbioqumicoJavierButrn.Ventajasporsualtocontenidoenglcidos,(su importancia energtica), y de otros componentes como lpidos, fibra, vitaminas y minerales.Sucontenidodefibrasolublelohaceespecialmenteinteresanteen relacin con el control de la colesterolemia (Castellanos et al, 1997) (Cardador et al, 2002). Estas actividades han sido comprobadas por diversos estudios epidemiolgicos quieneshandemostradoqueloscomponentesdelosfrijolesestnasociados con la disminucin del riesgo de las enfermedades crnicas (Kafui and Rui, sf) Granpartedelrecienteinters,esdebidoalapresenciadeisoflavonasenel frijol,yenparticulardelagenistena,unadelasdosisoflavonasprimariasdel frijolsoya.Lagenistenaatrajomucholaatencindelacomunidadde investigacin,noslodebidoasupotencialefectoestrognico,sinotambin porqueinhibevariasenzimasclavessupuestamenteinvolucradasenla carcinognesis. (Reyes, 1993). Tambinexistenvarioscomponentesno-isoflavnicosenelfrijol,comolas saponinas. El frijol es una de las fuentes dietarios ms importantes de este tipo de compuestos no-isoflavnicos (Reyes, 1993) (Cuadro 4). Otroscomponentesimportantesenelfrijolyqueestnenestudiosporsu capacidadantioxidante,sonlasantocianinas,conocidoscomocolorantes naturales.Qumicamentesonmiembrosdelgrupodelospolifenoles,tambin llamadosvitaminaselsigloXXIporsusefectosbeneficiosos.Dentrodefrijol, segn Takeoka, (1997), las antocianinas mas comunes y que se encuentran en mayorcantidadsonmalvidina3-5di-glucsidoyladelfinidina3-glucsido (Cuadro 4). 28 Figura 8. Frijol negro, Phaseolus vulgaris , de la variedad Perla 5.MAZ AZUL (Zea mays L.) Zeamaysesunagramneaanual,decrecimientorpido,hastade2,5mde altura, con hojas largas y anchas en forma de tira (Quesada, sf.). Elmazconstituyeunabuenafuentedecarbohidratos,protenasdeorigen vegetalyfibradiettica(almidonesresistentes).Estoscomponentestienen efectosfisiolgicospositivos,relacionadosconlamenorprevalenciade enfermedadesintestinales(Guisell,2000).Actualmentesehacomprobadoque laspropiedadesdeloscompuestosqumicasqueloscaracterizanestn asociadasconlavariedad.Estosefectosresultantilestantoenlaprevencin comoeneltratamientodelaDiabetesMellitus,trastornoscardiovasculares, constipacin, dieverticulitis y cncer de colon (Gisell, 2000). Elgranodealgunasleguminosasjuntoconelmaz,sonlabasedela alimentacindeMxicoyenotrospases,principalmenteporsusraces culturalesehistricas.Elmazseconsumeenunagranvariedaddeformas, 29ademsdeserdemandadoporvariasclasescomercialesdediferentecolor, forma y tamao (Castellanos et al, 1997) (Figura 9). Enelmundohayvariostiposdemazydeelloshayvarioscoloresdesdeel blanco,amarillo,rojos,morados,caf,verdes,azulesymorados.Elmazazul generalmenteescultivadoenAmricaLatina,principalmenteenPerylos peruanos tienen una bebida tpica hecha con el maz morado o azul (Castellanos et al, 1997). Los mexicanos llaman "maz azul" a una especie que se da al Norte delpasyenEstadosUnidosporlapartedeNuevoMxico.Tienegranos salteadosdecolores,algunosdeellosazules.Sediceasencontrasteconel maz amarillo, el normal (Castellanos et al, 1997). Elcolorazul,morado,yrojopresentesenelmazdebidoalapresenciade antocianinas.Elmazconantocianinasesutilizadocomocoloranteparalos jarabes,galletasyotrosalimentosenJapn (Aoki y otros, sf). Y segn Fossen Torgils(2001),lasantocianinasmscomunespresentesenelmazson Cianidina 3 glucsido y Delfinidina (Cuadro 4). Figura 9. Maz azul 306. JAMAICA (Hibiscus sabdariffa L.) HibiscussabdariffaL.esunaplantatpicadelostrpicosprincipalmentese puedeencontrarenregionesconmanglares(Melecchiyotros,2002).Dela familia de las Malvaceae, el Hibisco aporta entre 250 y 300 especies (Figura 10) SufloresutilizadacomoplantamedicinalenAsia,fricayotroslugares. Tambinescomnmenteusadaparajaleas,mermeladasyremedios.Su brillantecolorrojoysusabornico,escaractersticoenalgunosproductos alimenticios. Se convirtieron en remedios naturales para bajar de peso, calmar la tosoprevenirlacadadelcabello.Perorecientemente,sehadetectadoque estascontienenexcelentesreservasdeflavonoidesyantociansidos(Rojas, 1999 y Rojas, 2000). El Hibiscus ayuda a reducir las grasas y el colesterol, porque estimula la funcin hepatorrenal. As, hoy, todos los especialistas en el mundo recomiendan sumar la infusin de Hibisco a la dieta para defender al organismo de los daos de los radicaleslibresytambinalcorazndelahipertensin.Peronotodoslos compuestosfenlicospresentesenestegnerosoniguales.Hastaahora,el msreconocidoeselHibiscussabdariffa,especiemuyusadaenformade fitomedicamentos y en el que se ha definido la accin antioxidante e hipotensora (Rojas, 1999 y Rojas, 2000). Una de las ventajas de esta especie es la alta reproductividad, adems de que su extraccin es un proceso simple y de bajo costo (Melecchi el al, 2002) Elcolorrojodesuflorestdadoporpigmentosconocidoscomoantocianinas, que son las responsables de la coloracin de varios alimentos (Tsai & Ou, 1996) (Tsaia et al, 2002). 31Enlajamaicalasantocianinasqueseencuentranenmayorcantidadsegn Chau-Jong Wang, 2000, son la Cianidina 3 glucsido y la Delfinidina 3 glucsido, perootrosinvestigadoreshandescubiertolapresenciadeCianidina3-o-soforosido como lo hizo Hideo Yamasaki, 1996 (Cuadro 4) Figura 10.Flor de jamaica Cuadro 4. Compuestos fenlicos ms comunes presentes en las muestras a analizar Fuente NaturalCompuestos fenlicosReferencias Jamaica(Hibiscus sabdariffa ) Cianidina 3 glucsido Delfinidina 3 glucsidoCianidina 3-o-soforosido Chau-Jong Wang, 2000Hideo Yamasaki, 1996. Frijol Negro (Phaseolus vulgaris) malvidina 3-5 di glucsidodelfinidina 3-glucsido Takeoka, 1997 Maz Azul (Zea Mays) Cianidina 3 glucsidoDelfinidinaTorgils, 2001 FUENTE: ITESM, 2003 327.CROMATOGRAFADEMICROEXTRACCINCONCOLUMNA DE FASE REVERSA Lacromatografaesunatcnicaquepermitelaseparacindeunlquidoy disolventedelasmolculasbasadoensupesomolecular,lapolaridad (hidrofbica contra hidroflico). Y la carga o la elasticidad (Alamo, et al, 2000). Lacromatografaenfasereversapermitesepararmolculasenbaseasu polaridad.Hayunafaseestacionariaenlamatrizlacualesapolar.Lasfases mviles son las polares, as las sustancias ms polares eluyen primero. Lasmolculasseretienenenlacolumnaenvirtuddelasinteracciones hidrofbicasqueestablecenconlaslicamodificada. Aunque, las interacciones hidrofbicassonengeneralbastantedbiles,sontambinamenudomuy numerosasyparaelurlasmolculasescasisiemprenecesariodisminuirla polaridad del disolvente; para ello se puede sustituir el agua de la fase mvil con un solvente orgnico cuya concentracin se va aumentando gradualmente. En la separacin de compuestos fenlicos mediante fase reversa la resina ms comnmente empleada posee una cadena lineal de 18 carbonos y se denomina como C18 (Anexo 2). LoscartuchosSepPak,sondiseadosyhechosespecialmenteparala extraccin o fraccionamiento de la muestra. Debe ser reproductivo en actividad y capacidad, con distribuciones de tamao ptimas del poro y de partcula del rea superficial (Alamo, et al, 2002) Lasuperficiedelacolumnadebedecumplirtresactividadesanteelsolvente disponible. Primero, cada porcin se prueba bajo especificaciones rgidas para la actividad, segundo, la retencin y tercera, la selectividad cromatogrficas. 33 III. MATERIALES Y MTODOS El proyecto se desarrolla en el Centro de Biotecnologa del Instituto Tecnolgico de Estudios Superiores de Monterrey. Para la extraccin de compuestos fenlicos del frijol negro (Phaseolus vulgaris), seutilizaronlastestasdelosgranosdonadosporelCentroINIFAP(Instituto NacionaldeInvestigacionesForestales,AgrcolasyPecuarias).Elextracto fenlico del maz (Zea mays L.) se obtuvo del maz molido, proveniente de lneas experimentales de la Escuela de Zootecnia del ITESM (Monterrey, Mxico). Los compuestosextradosdelajamaica(Hibiscus sabdariffa L.) se extrajeron de la flordelaplanta,delalocalidad(Monterrey,N.L.,Mxico).Losreactivosy solventesutilizadosenlosprotocolosseobtuvierondeFermont-Productos QumicosMonterreyS.A.deC.V.(Monterrey,N.L.,Mxico),Sigma-AldrichCo. (St.Louis,MO.,EUA.),FisherScientificInt(Winnipeg,MB.,Canad)yMerck Co. (Darmstadt, Alemania). Los cartuchos cromatogrficos de fase reversa (Sep Paks) C-18, 5g absorbente, se obtuvieron de Waters Co. (Milford, MA., EUA). Lossolventesorgnicosutilizados(metanol,acetona,aguayetanol),fueron preparadosenellaboratorioantesdeusar.Losreactivosysolventesse obtuvieron de Fermont-Productos Qumicos Monterrey S.A. de C.V. (Monterrey, N.L.,Mxico),Desarrollodeespecialidadesqumicas,S.A.deC.V.(Nogalar, San Nicolas de los Garza, N.L. Mxico). Paracadamuestrasetrabajcontrestratamientosycadaunacontres repeticiones, por triplicado denominados R1, R2 y R3 341.CARACTERISTICASFSICASDEDOCEVARIEDADESDE FRIJOL NEGRO (Phaseolus vulgaris L.) Seseleccionaron12variedadesmexicanasdefrijolnegro,lascuales,fueron donadasenenerodel2002,porelDr.JorgeAcostaGallegos,CIR,CENTRO INIFAP, Campo Experimental Valle de Mxico, Chapingo, Mxico (Cuadro 5). Paralacaracterizacinfsicadecadavariedadfueronidentificadasconun nmero especfico. Se contabilizaron 100 frijoles de cada variedad. Se pesaron, selesmidielcolor,conunColormetroMinoltaCR-300(MinoltaCo.,Ltd., Osaka, Japn), se les calcul el valor de E (grado de color para cada especie). Se dejaron remojando 12 horas en 30 ml de agua destilada. Despus del tiempo deremojoselesquitlatesta,sesepardeloscotiledonesysepesaronpor aparte(loscotiledonesdelastestas).Estosehizoparacadavariedad,sise dificultaba la extraccin de la testa se le agregaba ms agua a esa variedad. Se dejaron en la estufa por 12 horas (35C) para luego determinarles por separado, el porcentaje de humedad a las testas y a los cotiledones. Elobjetivodeestafaseeradeterminarsiexistandiferenciasentrelas concentracionesdeisoflavonasentrelasvariedadesrecibidasporINIFAPy seleccionar aquella que tuviera mayor contenido de isoflavonas para su uso en el estudio de fraccionamiento. Seconsideronecesarioconocerelcontenidodefenlicostotalesdecada variedad,yaqueademsdeisoflavonasesposiblequeexistanotros compuestosquepuedenejerceralgunaactividadbiolgicaimportante.Porlo tanto se llevo a cabo la prueba Folin a los extractos crudos (80% metanol) de las 12 variedades de frijol. 35Cuadro 5. Variedades de frijol negro analizadas Nmero de la variedad Variedades de Phaseolus vulgaris L. 1Mx 332 2NG Cotaxtla 3NG 8025 4NG Sn. Luis 5NG Altiplano 6NG 150 7NG Sahuatoba 8NG Tacana 9NG Vizcaya 10NG Otom 11NG Perla 12NG Inifap FUENTE: ITESM, 2003 2.EVALUACINDEDIFERENTESSOLVENTESPARALA EXTRACCIN DE COMPUESTOS FENLICOS Sepesarontestasdefrijolnegro(5g)yselesrealizlaseparacinconun homogenizador Ultra-Turrax T25 Basic IKA-Werke (San Nicols, N.L, Mxico) a 16000rpmpor5minutosconcadaunodelossolventesdeprueba(metanol 80%, acetona 70%, etanol 96% y agua 100%). Secentrifugparasepararloscompuestos,setomunamuestradel sobrenadante para realizarle cuantificacin de fenlicos totales. Al precipitado se 36le realiz otro lavado con cada solvente orgnico. Se dej reposar todo un da a 4 grados Celsius.Alfinal,todosloslavadossejuntaronyseevaporaronenelrotavapor(Buchi, Suiza).Serealizlacuantificacindefenlicostotales,seagreg500lde reactivo Folin y 50 l de la muestra analizar, antes y despus de evaporar. PreparacindemuestrasparaelanlisisenHPLC,CromatografaLquidaDe AltoRendimiento.SeutilizaengeneralunafasedereversaODSC-18 (OctaDodecilsilano). La idea de esta fase es determinar los tipos y la cantidad de isoflavonasyflavonoidespresentesenlasmuestrasdeextraccinconcada solvente. Setom10mldemuestraconcentradao50mldemuestradiluida(10mlde muestray40deagua);yselesajustelpHa3.5.Sepaslamuestraporla columna. Posteriormente se lav con agua pH 3.5. Se eluy con 2ml de Metanol 30% (F1), y se volvi a agregar 2ml de metanol 100% (F2) (Cisneros, M., 2003). 3.EXTRACCINDECOMPUESTOSFENLICOSPOR FRACCIONAMIENTO Labioseparacindeloscompuestosfenlicosdelosdiferentesalimentosse realiz con modificaciones al protocolo descrito por Oszmianski et al, 1998. 3.1 EXTRACCIN CON SOLUCIN DE ACETONA:AGUA ( 70 : 30 ) Elpropsitodeestaextraccin,fuelaseparacindeloscomponentesque poseeelfrijol,lajamaicayelmazazul,comolosazcares,protena,lpidos, carotenoides, compuestos fenlicos, entre otros. 37Lastestasdefrijol(10g)secolocaronen150mldesolucinacetona:agua 70:30, en el caso de la jamaica y el maz se utiliz una solucin de acetona:agua de80:20.Sehomogenizaron(10min).Seleagreg50mladicionalesde solucin,paradesprenderlascscarasdelosbordes.Fuecentrifugadopor10 minutosa3500rpmyseobtuvierondoscapasdondeseseparlaparte slida de la lquida. En total se realizaron cuatro lavados con la solucin acetona: agua, cada 12 horas. Alterminarconloslavados,lamuestrasefiltralvaco,parasepararlos pequeosresiduosslidos.Enelrotavapor-R,(Buchi,Suiza),elcualse encuentraunidoaunextremoconunbaoaguafra(modelo1140VWR, Scientific Company) y al otro con un bao de agua caliente (Boekel Grant) y todo conectado a una bomba de vaco, (modelo GP110, Savanr, Gel Pump). (Anexo 13) Este elimina la acetona por evaporacin y a la vez se concentra la muestra. 3.2EXTRACCIN CON ETER ETILICO El objetivo de esta fase fue la extraccin de los lpidos, carbohidratos, carotenos y las protenas que quedaron en la extraccin anterior.En esta etapa se debi trabajar dentro del extractor de aire, dadas las caractersticas del reactivo. Serealizaronentotaldosextraccionesconter.Laprimera,serealizapartir delafaseacuosa(50ml)conteretlico(50ml)(1:1).Seagit(10min)yse centrifugaron para separar la fase acuosa de la etrea. Se extrajo la fase etrea (sobrenadante). La segunda extraccin consisti del precipitado de la extraccin anterior ms 50ml de ter. 3.3FRACCIONAMIENTO A pH 3.5 Con forme se fue realizando el fraccionamiento a cada fraccin obtenida se les iba denominando con una letra del abecedario. A la muestra sin ter se le llam 38fraccinA,lacualseafora50ml,destos,setomaron20mlparael fraccionamientodelfrijol,paralajamaica15mlfueronsuficientes,yparael fraccionamiento del maz, fueron necesarios 50 ml de extracto. Se les ajust el pH a 3.5 con HCl o NaOH, segn se requieran. ParaelpreacondicionamientodelSepPak,seutilizmetanol(20ml)yagua (20ml). Se carg la columna con la muestra. El lquido que pas se le denomin B.PosteriormentefuelavadoelSepPakconaguabidestilada(20ml)esla solucinC,yluegoconHCl0,01M(20ml),esD.Loscompuestosdeinters quedaron atrapados en el SepPak.Se le agreg acetato de etlo (30ml) solucin E, seguido de metanol (30ml) es F (Anexo 5). Para la segunda parte del fraccionamiento se necesit un nuevo Sep Pak, esta faseesdereconfirmacindelaefectividaddelfraccionamiento,dondelos compuestosfenlicosyaestnenlasfraccionesanteriores.SeajustelpHa 2.5, tanto de la fraccin B como a G, (C+ ++ + D). SepaslasolucinB,ellquidoquepasaselellamH.Selavaconmetanol (30ml),ellquidoesI.SevolviapreacondicionarelSepPak,conmetanol (20ml), posteriormente con 20ml de HCl 0.01M. Se aliment el Sep Pak con G, el lquido que pasa es J.Y se lav el Sep Pak con metanol (30ml), el lquido es K (Anexo 4). 3.4EVAPORACIN Y CONCENTRACIN EN METANOL SeevaporaronenelrotavaporlasfraccionesE,F,IyKasequedadyse resuspendieronen20mldemetanol100%,lasmuestrasdefrijolyen15mlde metanol la jamaica y el maz. 39Aestasfraccionesresuspendidasenmetanolseleshizlaspruebasde cuantificacindecompuestosfenlicosparacomprobarlaefectividaddel fraccionamiento. 4. DETERMINACION DE FENOLICOS TOTALES Laconcentracindefenlicostotalessolublespresentesenlasdiferentes fracciones, se determin con base en el mtodo de Folin-Ciocalteau descrito por Aberson y Simon, 2001. El mtodo consiste en adicionar a la muestra (50 l) 500l del reactivo de Folin-Ciocalteau,posteriormentesedejreaccionar.Unavezterminadalareaccin, las muestras se dejaron reposar (20 min) a temperatura ambiente y se realizaron laslecturasespectrofotomtricasa750nmenunespectrofotmetroBeckman modelo DU 650 (Fullerton, CA., EUA.) (Anexo 13). Al obtener la absorbancia se calcul la concentracin (ppm) de los compuestos fenlicos totales presentes en cada una de las fracciones. La concentracin de fenlicos totales (mg/l) se expres en equivalentes de cido glico (Anexo 8). Se compararon los resultados entre tratamientos denominados R1, R2 y R3. 5.DETERMINACINDEANTOCIANINASMONOMERICAS TOTALES El mtodo pH diferencial descrito por Wrolstad (2000) se basa en la reaccin de la muestra (100l) en buffer de cloruro de potasio pH 1,0 y en buffer de acetato desodiopH4,5;conuntiempodeequilibriodereaccinde15min.a temperaturaambiente(Anexo10).Posteriormentesehicieronunaseriede 40barridosespectralesenunespectrofotmetroconelfindeobtenerla absorbancia mxima en el rango visible (400-800 nm). La "max promedio utilizada para la cuantificacin fue de 515 a 520 nm. As mismo se midi la absorbancia a 700nmparalacorreccinporturbidezdeambasmuestras.Elcontenidode antocianinassecalculutilizandoelcoeficientedeextincinmolaryelpeso moleculardelaantocianinapresenteenlamuestraconmayorproporcin (Anexo 9). Laslongitudesdeondaalascualesestnpresenteslasantocianinas,varan paralasdiferentesmuestrasya que cada alimento contiene tipos diferentes de antocianinas. Aunque todas las antocianinas se encuentran dentro de un mismo rango entre 515 a 520nm. 41IV. RESULTADOS Y DISCUSIN 1.SELECCINDELASVARIEDADESDEFRIJOLNEGROA ANALIZAR Se seleccion frijol por ser la leguminosa de mayor consumo en Mxico y por ser una fuente con potencial nutracutico, ricos en protenas, carbohidratos, hierro y otrosnutrientes.Seutilizaronlastestasdelfrijolnegropuesenlaliteraturase reportaquelamayorcantidaddecompuestosfenlicosseencuentraenlas cscaras, donde ellos mismos le brindan color al grano (Gmez, et al, 2000). Lasdocevariedadesdefrijolnegro,presentaroncantidadessuperioresde compuestos en las testas, a lo encontrado en los cotiledones molidos, donde el total de fenlicos fue 3.20,15 moles/g en equivalentes a catequina. Comparandoelcontenidodefenlicostotalesdelas12variedadesdefrijol negroanalizadasporelmtododeFolincido,lavariedadMx332fuelaque obtuvomayorconcentracin.AunquelavariedadSahuatobayOtomi,tambin presentaron valores elevados en cuanto al contenido de fenlicos totales, pero la variedad Mx 332 fue la que present la mayor cantidad de antocianinas por eso fuelaseleccionadaparaposterioresanlisis(Figura11).EnlapruebadepH diferencial, la variedad Perla obtuvo muy bajas concentraciones de antocianinas, peroenlacuantificacindeisoflavonasenlasvariedadesanalizadas,elfrijol Perla fue el que present mayor contenido, por lo cual tambin fue seleccionada. ApartirdeestafasesedenominalfrijolnegroMx332comofrijol1yala variedad Perla como frijol 2. 42010203040506070801 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12VARIEDADESmg/l de antocininasFrijol negro Figura 11.Contenido de antocianinas en cada una de las doce variedades de frijol negro analizadas (1-Mx332, 2-Cotaxtla,3-8025,4-San Luis, 5-Altiplano,6-150,7-Sahuatoba, 8-Tacana, 9-Viscaya, 10-Otomi, 11-Perla y 12-Inifap) FUENTE: CB, ITESM, 2003 2.EVALUACINDELAEXTRACCINDECOMPUESTOS FENLICOS CON DIFERENTES SOLVENTES Laideaprincipaldeestaetapafueprobarcualeraelmejorsolventeparala extraccindeloscompuestosfenlicosdeinters(antocianinas,isoflavonasy flavonoides), tomando en cuenta que los solventes polares extraen compuestos polaresylossolventesnopolaresextraencompuestosnopolares,consus pocas excepciones (Mata, 2003). Enelanexo4sepuedeobservarcomodesdelosprimeroslavadosseobtuvo una buena efectividad con cada uno de los solventes. Despus de los anlisis de la tcnica de Folin, se comprob que el solvente que mejor extrajo compuestos fenlicos fue la acetona (Figura 12.) 43Laacetonafueelsolventenopolarquepermitilaseparacindevarios compuestos no polares como lo son las protenas, lpidos, fibras, carbohidratos, entre otros. Separando as, los compuestos polares de los no polares. Porelcontrarioeletanol(96%)fuesolventemsdeficienteenlaextraccin, segn los resultados de la cuantificacin de fenlicos totales se puede suponer que es debido a que el etanol es un lquido muy polar que impidi la extraccin de varios compuestos no polares. De la misma manera se comporta el metanol y el agua al ser compuestos polares. Durantelosprimeroslavadosseconsiderabaalaguacomoelmejorsolvente para la extraccin de compuestos fenlicos, pero al final de la extraccin, no fue el ms efectivo (Anexo 3). 0100200300400500600Metanol Etanol Acetona AguaSolventesmg/l de fenlicos totalesSolventes Figura 12. Contenido de fenlicos totales, de las muestras extradas a partir de los diferentes solventes (metanol 80%, etanol 96%, acetona 70% y agua) FUENTE: CB, ITESM, 2003 44 Apartirdeestosresultados,seutilizlaacetonaenelmtodode fraccionamiento para la extraccin de los compuestos fenlicos de los alimentos a analizar en este proyecto. 3. FRACCIONAMIENTO 3.1Cuantificacin de fenlicos totales En esta etapa fue muy importante considerar las propiedades cidas (pH 3,5) de la muestra y la polaridad de los compuestos y solventes utilizados en el mtodo de bioseparacin de los compuestos fenlicos. El extracto crudo, es el resultado de la extraccin con acetona. En esta fraccin seencuentrantodosloscompuestosdelosalimentosanalizados,laacetona comosolventeutilizadoparalaextraccin,permitelaseparacindelos compuestos polares y no polares. Al realizar la cuantificacin de compuestos fenlicos totales, a esta fraccin, los resultadosfueronmuyelevados,puesseencuentrantodosloscompuestos fenlicos mezclados, pero conforme se va realizando el fraccionamiento, en las siguientesfracciones hay separacin de ellos, las concentraciones de fenlicos van disminuyendo (Figura 13). En los resultados se observ como en las ltimas fracciones (I y la K), la cantidad de compuestos fenlicos es insignificante. El resultado del fraccionamiento con ter etlico fue la extraccin de los lpidos, protenas, carbohidratos y carotenoides, que son insolubles al ter, y los cuales fueronseparadosenlaextraccinanterior.EslafraccinAdondelos compuestosfenlicosanestntodosjuntos.Susconcentracionesdebenser muy parecidas a las concentraciones del extracto crudo. Pero en algunos casos seobtuvierongrandesdiferenciasentreellos,causadasporprdidasenla 45segunda extraccin; se cree que a la hora de extraer los lpidos, carbohidratos, protenasyotros;seperdieronalgunoscompuestosdeinters(antocianinas, isoflavonas y flavonoides) con ellos (Figura 13). Lasprimerasfraccionesdelfraccionamiento(B,CyD),sonconsiderados lavados despus del paso de la muestra por la columna. En ellas no debe de habercompuestosfenlicosysiasfueraelfraccionamientonoseralo adecuado desde el inicio. En la fraccin con acetato de etilo, E, se separaron y extrajeron los flavonoides e isoflavonas del resto de los compuestos fenlicos. Es en esta fraccin en la que seinicialaseparacindelosfenlicostotales.Alestarlamuestraconlos compuestos fenlicos totales a un pH de 3,5 (cida), los hace solubles a bases comoelacetatodeetiloyalter,enlaextraccinanterior(Marcanoy Hosegawa,1991).EnA,laconcentracindefenlicostotalesdisminuyecon respecto a lasfracciones anteriores, pues en esta fraccin, ya estn separados dostiposdecompuestosyyanoestnpresentestodosenlamismafraccin (Figura 13). Debidoasupolaridadloscompuestosfenlicospermitensuseparacinpor solubilidad a solventes polares, como sucede con el metanol en la fraccin F. El metanolpermitelaextraccinespecficamentedelasantocianinas,pigmentos responsables del color azul del maz, el rojo de las flores de jamaica y el negro delastestasdelfrijol.Elmetanolpermiteladiferenciacindeotrospigmentos liposolubles igualmente coloreados como los carotenos. En esta fraccin (F) en quelaconcentracindefenlicostotalesesmsaltaqueelcontenidode fenlicos,presentesenlafraccinE,loquequieredecirqueenlosalimentos analizados hay ms antocianinas que flavonoides e isoflavonas. En las fracciones acuosas H y J nunca se encontraron compuestos fenlicos ya que estas fracciones son lavados de reconfirmacin, donde se espera que los 46compuestosfenlicosyaseencuentrenenlasfraccionesanterioresynoen stas; por lo que no se les hizo la cuantificacin de antocianinas (Anexo 7). Porsuparteenlasfracciones I y K, diluidas en metanol, se pretenda rescatar lasantocianinasuotroscompuestoscomoloscidosfenlicos(pH2,5);que quedaroneliminadosenlasfraccionesanteriores.Enestasdosltimas fracciones,lasconcentracionesdefenlicostotalesfueronmuybajas, demostrando la efectividad de la tcnica (Figura 13). La jamaica fue la muestra de las analizadas, que tiene mayor concentracin de fenlicos totales (Figura 13), por su gran cantidad de antocianinas (Figura 16). El mazazul,fuelamuestraconconcentracionesmsbajasdefenlicostotales. Lasdosvariedadesdefrijolnegro,semantuvieronsemejantesentodaslas fracciones,peromsadelantesevernlasdiferenciasencuantoeltipode fenlicos, presentes en cada variedad. 05001000150020002500CRUDO A E F I Kfraccionesmg/l de fenlicos totalesFrijol 1Frijol 2JamaicaMaz Figura 13. Concentraciones de compuestos fenlicos, equivalentes cido glico, de las fracciones.CRUDO- extraccin con acetona, fraccin A-extraccin con ter, fraccin E- extraccin con acetato de etilo, Fraccin F-extraccin con metanol, fraccin I y fraccin K, lavados con metanol. FUENTE: CB, ITESM, 2003 47Lostiposylasconcentracionesdelospolifenolespresentesenunmismo alimento dependen principalmente de la variedad, de las condiciones climticas, delamaduracindelalimentoydelastcnicasempleadasparasuextraccin (Alamo, et al, 2000). stas son algunas de las causas que explican la diferencia encuantoalcontenidodefenlicosentrelasdosvariedadesdefrijolnegro seleccionadas para ser analizadas. EnlasFiguras14y15sepuedenobservar,lasdiferenciasenlas concentraciones de compuestos fenlicos y antocianinas en las dos variedades de frijol negro. El frijol 1 (Mx 332) contiene mayor cantidad de antocianinas, en comparacin con el frijol 2 (Perla). Es grande la diferencia en cuanto al contenido de antocianinas entre ambas variedades (Figura 15), pero no existe mucha diferencia en el contenido de fenlicostotales,locualdemuestraqueelfrijol2contienegrancantidadde flavonoides e isoflavonas (Figura 14). 01002003004005006007008009001000CRUDO A E F I KFRACCIONESmg/l de compuestos fenlicosFrjol 2Frjol 1 Figura14.Comparacinentrelasconcentracionesdefenlicostotalesenlasdos variedades de frijol negro; mg/l expresados en cido Glico. (CRUDO- extraccin con acetona, fraccin A-extraccin con ter, fraccin E- extraccin con acetato de etilo, Fraccin F-extraccin con metanol, fraccin I y fraccin K, lavados con metanol. 48FUENTE: CB, ITESM, 2003 0102030405060708090CRUDO A FFRACCIONESmg /L de antocianinas monemricasFrijol 1Frijol 2 Figura 15. Comparacin entre las concentraciones de antocianinas monomricas de las dos variedades de frijol negro.(CRUDO- extraccin con acetona, fraccin A-extraccin con ter, fraccin E-extraccin con acetato de etilo, Fraccin F-extraccin con metanol, fraccin I y fraccin K, lavados con metanol. FUENTE: CB, ITESM, 2003 3 . 2Cuantificacin de antocianinas totales EnlacuantificacindeantocianinasporlatcnicadepHdiferencial,se analizaron solo las fracciones crudo, A (extraccin con ter) y F (extraccin con metanol); ya que fueron las fracciones en las que se asegura el contenido de las antocianinas.CrudoyA,porqueenellasseencuentrantodosloscompuestos fenlicosjuntos,yenF,pueseslafraccinenqueseesperaextraerlas. Mientras que en la fraccin E (extraccin con acetato de etilo) no se presentaron este tipo de fenlicos en su lugar estn las isoflavonas y flavonoides. Los resultados de esta tcnica no fueron los esperados, se esperaba que al igual queenlasconcentracionesdefenlicostotales,lasfraccionescrudayA, debieron de ser las que contienen mayores concentraciones de antocianinas, y con valores parecidos entre ellos, pero en este caso no fue as. 49Sepuedoobservarenlajamaicaunbajocontenidodeantocianinasenla primera fraccin y la siguiente fraccin aumenta (Figura 16) cuando se esperara lo contrario en la primera mayor concentracin que en las siguientes. En las tres fraccionesdebidehaberlamismacantidaddeantocianinas,huboprdidas conforme se fue realizando el fraccionamiento, pero no antes. Otra causa de esta diferencia en las concentraciones podra ser que no todas las fraccionesseencontrabanenlamismabasemsica,esdecir,notodaslas fraccionestienenelmismocontenidomsicoinicial,detestas,demazode jamaica. Lo que explicara la diferencia entre el contenido de antocianinas en las tres muestras (Anexo 12). Laconcentracindeantocianinastotalesobtenidaparaestetipodefenlico debe encontrarse preferiblemente dentro del rango de absorbancia 0.4-0.8. 050100150200250300350CRUDO A FFraccionesmg/l de antocianinas monomricasFrijol 1Frijol 2JamaicaMaz Figura16.Comparacinentrelasconcentracionesdeantocianinastotales,presentes en las tres fracciones analizadas(CRUDO-extraccinconacetona,fraccinA-extraccinconteryF-extraccincon metanol) FUENTE: CB, ITESM, 2003 50 Elmazazul,porsucolor,seesperabaquetuvieragrancantidadde antocianinas,comoloinformalaliteratura(Ruz,1997).Secomprobqueel mazazulesunalimentoricoenantocianinas,perosinisoflavonas,segn anlisis previos en HPLC. Lajamaicaeselalimentoconmayorcontenidodeantocianinasenlastres fracciones. El frijol 1, tambin es rico en estos pigmentos, en comparacin con la variedad Perla, quien es deficiente en cuanto a contenido de antocianinas, pero las pocas que tiene son las que le dan el color negro al frijol. Enlatcnicadecuantificacindeantocianinasseutilizaronbufferscon diferentes pH, donde se observaron mayor cantidad de antocianinas a un pH de 1,0(Figura17);debidoaquelasantocianinaspresentantransformaciones estructurales reversibles. A pH 1,0 predomina su forma oxonium coloreada y a pH 4,5 la forma hemicetal incolora. Conforme aumenta el pH se pierde un protn, se gana una molcula de agua y se forma una pseudobase carbiol (las cuales son incoloras, por lo que existe una degradacin de color conforme aumenta el pH) (Diaz Villegas, 1986) 00,10,20,30,40,50,60,70,8CRUDO A FfraccionesAbs (518nm)pH 1pH 4.5 Figura 17. Valores de la presencia de antocianinas coloreadas a diferentes pH. Abs 518nm. Ejemplo tomado de los resultados de pH diferencial de la Jamaica. 51 Apartirdelasconcentracionesdecompuestosfenlicosydeantocianinas,en cada una de las muestras se pudo determinar la masa de compuestos fenlicos, en cada fraccin de las diferentes muestras analizadas. En los cuadros 6 y 7 se puedenobservarlasdiferenciasentrelacantidadenmg,encadaunadelas fracciones de compuestos fenlicos totales y antocianinas respectivamente. Esimportanteconsiderarquelacantidaddemasapormuestrautilizada inicialmente,noeslamismacantidadqueentraenlacolumnaalahoradel fraccionamiento. El peso de las testas utilizadas fue de 10g, donde en la fraccin conmayorcontenidodecompuestosfenlicos(mg/g)fueelfrijol2,conuna aproximacinde4,6mg/g,enlafraccinmsconcentrada.Para100gdemaz molidoutilizadosalinicioseobtuvoenlafraccincrudaunacantidadde 0,1952mg/gdefenlicostotalesyenlajamaicaelcontenidodefenlicosen 30gramos iniciales fue de 7,06mg/g. Cuadro 6. Contenido en mg de los fenlicos totales en cada fraccin del frijol, maz y la jamaica. FUENTE: CB, ITESM, 2003 MuestraCRUDO(mg) A (mg) E (mg) F (mg) I (mg) K (mg) Frijol 136.5514.580.590.870.21 0.21 Frijol 246.1813.090.64 8.280.28 0.07 Jamaica212.0329.953.0511.240.130.24 Maz19.525.840.722.690.110.03 52 Se debe considerar para la tabla siguiente que el volumen en la fraccin cruda es el doble al de las otras fracciones, por lo tanto los resultados de la fraccin cruda son el doble de la fraccin A (Cuadro 7). Cuadro 7. Contenido de antocianinas monomricas en cada una de las fracciones (mg) de las muestras analizadas MuestraCRUDOAF FRJOL 13,371,680,94 FRIJOL 21,780,550,36 JAMAICA10,336,163,32 MAZ6,733,292,27 FUENTE: CB, ITESM, 2003 Duranteesteproyectoserealizaronvariosfraccionamientosyseobservque los primeros resultados del fraccionamiento del frijol fueron muy bajos debido al excesodeaguayaltiempoderemojo,paraeldesprendimientodelastestas. Por lo que los experimentos posteriores se hicieron disminuyendo la cantidad de agua de remojo (Anexo 11). Por lo tanto, en cuanto ms agua se utiliz en relacin a la masa de frijol, mayor ser el efecto de lixiviacin, prdida del contenido. Lo anterior comprueba que la cantidad de agua empleada en el remojo del frijol tieneefectosobrelacantidaddecompuestosfenlicos,quesepueden encontrar despus de dicho proceso 53V. CONCLUSIONES 1.De los solventes utilizados la acetona fue el ms adecuado para la extraccin de compuestos fenlicos. 1.Latcnicadefraccionamientoporsolubilidadesunmtodosimpley rpido utilizado para la bioseparacin de los compuestos fenlicos. 2.Lasantocianinassonpigmentosquedancoloralasfrutas,floresy algunas verduras, como el azul a los granos del maz azul y el negro a las testasdelfrijol.Sedemostrconesteproyectoquelaflordejamaica contienegrancantidaddeantocianinas,quelepermitenobtenerla coloracin roja que ella presenta. 3.Existendiferenciasenelcontenidodecompuestosfenlicos,entre variedades, de un mismo alimento. Ese es el caso de las dos variedades de frijol negro analizadas, el frijol 1 contiene una cantidad de cierto tipo de compuestos fenlicos mayor, que la que contiene el frijol 2. 4.Enelaguaderemojosepierdencompuestosfenlicos.Encuantoms aguaseutiliceenrelacinalamasadefrijol,mayorserelefectode lixiviacin. 5.Lajamaicaeslamuestradelasanalizadasconmayorcantidadde compuestos fenlicos, principalmente de antocianinas monomricas. 6.La jamaica y al maz azul no contienen isoflavonas. 7.El frijol 1 (Mx 332), contiene mayor concentracin de antocianinas que el frijol 2 (Perla). 548.Elfrijol2(Perla)presentgrancantidaddeisoflavonasencomparacin con las otras doce variedades analizadas. 9.ElpHinfluyeenlacuantificacindeantocianinasyaqueenlalectura espectrofotomtrica altera la estructura y coloracin de estos compuestos. 55VI. RECOMENDACIONES 1.En la tcnica del fraccionamiento es recomendable analizar con la prueba de Folin (cuantificacin de compuestos fenlicos totales) las muestras B, C y D; como una reconfirmacin de que no hay fenlicos totales en esas fracciones, pues se supone que quedaron atrapados en la columna. 2.Realizarbiosntesisinvitrodecompuestosfenlicossencillos, comenzando a travs de un precursor comn, el cido Shikmico (Trease y Evans 1989) 3.Recomendarlainclusindecompuestosfenlicosenladieta,parala proteccin de las LDL (lipoprotenas de baja densidad) de la oxidacin, y por lo tanto de la iniciacin del proceso dearteriosclerosis. 4.Realizar bioensayos en clulas cancergenas para comprobar la actividad antioxidante de los compuestos fenlicos. 5.Hacer el mismo estudio y anlisis en productos de mayor consumo a nivel mundial.Porejemplo,enlasvariedadesdefrijolmsconsumidasen Costa Rica. 6.Determinarsienelprocesodecoccindeestosalimentos,las concentraciones de fenlicos totales se ven alteradas. 7.DeterminarmediantelatcnicadeHPLC,eltipoylacantidadde compuestos fenlicos ms comunes en las muestras. 8.Desarrollarunproductofarmacuticoutilizandocomobasealos compuestos fenlicos extrados. 56VII. 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CLASIFICACIN DE LOS COMPUESTOS FENLICOSCOMPUESTOS FENLICOS TIPOS 1.Compuestos Fenlicos Simples C6C1,C6C2,C6C3 2.FlavonoidesChalconas y flavonas Flavonoles y flavonas Antocianinas Flavononas y flavononoles Flavonoles 3.Chalconas y flavonas Flavonoles y flavonas Antocianinas Flavononas y flavononoles Flavonoles 4.Isoflavonoidesisoflavonas Isoflavononas Rotenoides Isoflavanos e isoflavenos 5.QuinonasBenzoquinonas Naftoquinonas Antraquinona Bis- antraquinona 6.-Pironascumarinas Isocumarinas Aflatoxinas 7. - Pironascromanos y cromonas Canabinoides 8.Xantonas 9.Lignoides 10. Dpsidos 11. Otros polictidos aromticos **Rodrguez, A., Marion, R.,2003. 63Anexo 2. Figura 1. Diferentes tipos de Sep Pak como columna de fase reversa. Figura 2. Forma de cmo utilizar el Sep Pak, en la tcnica del fraccionamiento 64Anexo 3. Figura 3. Primeros lavados de la extraccin de compuestos con diferentes solventes Figura 4. Segundo lavado en la extraccin de compuestos con diferentes solventes 65Anexo 4. Figura5.Resultadofinaldelaextraccindecompuestosfenlicos,despusdelos cuatro lavados con diferentes solventes 66Anexo 5Cuadro 2. Secuencia de los reactivos utilizados en el Sep Pak, en la tcnica del fraccionamiento REACTIVOFRACCINUSO AcetonaCrudoSeparacindecomponentesdela muestra terAExtraccindeloscompuestosno polares Muestra (sin ter)BRetencindeloscompuestosfenlicos en la columna Agua pH 3.5CPrimer lavado HCl 0.01MDSegundo lavado Acetato de etiloEEluyente de flavonoides MetanolFRecuperacin de antocianinas (resto de compuestos fenlicos) C+DGUnindeloslavadosparainiciaruna reconfirmacin BHPrimera reconfirmacin MetanolIExtraccindeposiblesfenlicos, retenidos en el primer lavado GJSegunda reconfirmacin MetanolKExtraccindeposiblesfenlicos, retenidos en el segundo lavado FUENTE: CB,ITESM, 2003 67Anexo 6. Esquema del fraccionamiento, para la obtencin de los compuestos fenlicos EXTRACTO DE FIJOL PREACONDICIONAMIENTOFRACCIN A Metanol Agua pH 3.5Agua pH 3.5HCl 0.01M BCD Acetato de etiloMetanol FRACCIN EFRACCIN F Waters C-18 Sep-PakWaters C-18 Sep-PakWaters C-18 Sep-PakWaters C-18 Sep-Pak 68 BMetanol HI G(C+D)Metanol JK Waters C-18 Sep-PakWaters C-18 Sep-PakWaters C-18 Sep-PakWaters C-18 Sep-Pak 69Anexo 7. Resultados de la coloracin de las diferentes fracciones B CD EFGH IJK Figura 6. Coloracin de las diferentes fracciones Figura 7. Coloracin obtenida del fraccionamiento del frijol negro 70Anexo 8.Frmulas para la determinacin de fenlicos totales Estatcnicaseutilizaparalacuantificacindelosfenlicostotalesencada fraccin,esteprocedimientofuedescritoporAberson,J.;Simon,M.,2001. ExtradadellibroMethodsinEnzymology,vol335.(Verlareferenciaen bibliografa).Antesdeaveriguarlaconcentracindecadamuestraserealiz una curva de calibracin con cido Glico. La frmula que se utiliz para averiguar la concentracin de fenlicos totales se determino por la curva de calibracin. 009 . 1 52 . 321 + = x yEsta formula para las muestras estn disueltas en agua.Y paralas muestras disueltas en metanol:404 , 2 82 . 334 = x y Folin-Fenlicos Totales (Ac. Glico)y = 334,82x - 2,4049R2 = 0,99960204060801001201401600,0000 0,1000 0,2000 0,3000 0,4000 0,5000Absorbancia 750 nmConcentracin (ppm) FUENTE: CB, ITESM, 2003 71Anexo 9 CUANTIFICACIN DE ANTOCIANINAS MONOMRICAS Frmula 1. Se utiliz para calcular la absorbancia de la dilucin preparada con el Buffer pH 1,0 (Wrolstand, R., 2000) 5 . 4 ) 700 max ( 0 . 1 ) 700 max ( pH A vis A pH A vis A A = Donde: A: Absorbancia total de antocianinas : max vis AAbsorbancia a la Longitud de onda mxima visible. Varia para a cada especie : 5 . 4 0 . 1 700 pH pH A Es la longitud de onda de 700nm a la cual tambin se lee la muestra a los diferentes pH Frmula2.Seutilizparacalcularlaconcentracindeantocianinas monomricas de la muestra(Wrolstand, R., 2000) Antocianinas monomricas en mg / l = (/ ) 1000 DF MW A( ) 1 Donde: A: absorbancia total de antocianinas MW: Peso molecular de la antocianina ms predominante en la muestra DF: Factor de dilucin (Wrolstand, R., 2000) 72 Anexo 10 Buffers utilizados en la tcnica de pH diferencial Buffer de Cloruro de Potasio(0.049M, pH1.01) KCl =3.72g Volumen =1 000 ml(aforar con agua destilada y despus ajustar el pH con HCl concentrado) Buffer de Acetato de Sodio (0.4M, pH4.5)Acetato de Sodio = 54.43g Volumen: 1000ml(aforar con agua destilada despus de ajustar el pH a 4.5, con HCl concentrado) Buffer de Citrato (0.02 M, pH 3.5) Acido ctrico monohidratado = 1.924g Volumen : 500mlNaOH : 1Normal 73Anexo 11. Frijoles en remojo Figura 8. Frijol negro de la variedad Perla, despus de 1 da de remojo 74Anexo 12. Tcnica del fraccionamiento, tcnica de prueba y error Figura 9. Repeticiones a la tcnica del fraccionamiento 75Anexo 13.Equipo utilizado para la cuantificacin de los fenlicos totales Figura 10. Espectrofotmetro Figura 11. Rotavapor 76Anexo 14.Contenido de fenlicos totales en cada una de las muestras Contenido de fenlicos totales en el frijol 1010203040CRUDO A E F I Kfraccionesmg de fenlicos totalesSeries1 Figura 12. Contenido de fenlicos totales en el frijol 1 (Mx332) Contenido de compuestos fenlicos totales en el frijo 201020304050CRUDO A E F I Kfraccionesmg de fenlicos totalesSeries1 Figura 13. Contenido de fenlicos totales en el frijol 2 (Perla) 77 Contenido de Compuestos fenlicos totales en la Jamaica050100150200250CRUDO A E F I Kfraccionesmg de fenlicos totalesSeries1 Figura 14. Contenido de compuesto fenlicos totales en la Jamaica Compuestos fenlicos totales en Maz0510152025CRUDO A E F I KFraccionesmg de fenlicos totalesSeries1 Figura 15. Contenido de fenlicos totales en el maz 78Anexo 15. Contenido de antocianinas en cada una de los alimentos a los que les extrajo Cont eni dodeant oci ani nas monomri casenFri j ol 100,511,522,533,54CRUDO A FFr acci onesSer i es1 Figura 16. Contenido de antocianinas en el frijol 1 (Mx 332) Contenido de antocianinas monomricas en Frjol 00,5