La necesidad de análisis de diferentes com-ponentes a tiempo real en áreas cada vezmás diversas ha promovido en estos últimosaños que los esfuerzos realizados en el desa-rrollo de instrumentación analítica se dirijanhacia la construcción de dispositivos cuyautilización no requiera la supervisión profe-sional, cuyo manejo sea sencillo y cuyo costesea menor. Como resultado de estademanda de información relacionada con elanálisis de forma rápida, fiable y descentra-lizada se ha favorecido el desarrollo de sen-sores químicos y biosensores como alterna-tiva de análisis a la instrumentación analíticaconvencional Los sensores químicos existen desde hacemucho tiempo. Se han estudiado en profun-

didad y han encontrado durante todo estetiempo un gran campo de aplicación. Seconocen muy bien por su uso cotidiano en

el laboratorio los electrodos redox, los elec-trodos selectivos a iones, especialmente elde pH, entre otros muchos. Simultánea-mente al avance de los sensores, y debido algran impulso de la informática, se viene des-arrollando del mismo modo instrumentacióncapaz de realizar el seguimiento continuo deprocesos complejos mediante ordenador delos parámetros físicos y/o químicos basadosen sensores químicos. Mediante este tipo deinstrumentación es posible intervenir en elcontrol de procesos de forma rápida ysegura. Los biosensores, de aparición más reciente,constituyen un campo multidisciplinario deI+D y un mercado muy atractivo. Originaria-mente la investigación en este campo pro-

Los biosensores en la industria alimentaria,el control medioambiental y la salud humana

María Isabel Pividori*, Emanuela Zacco, AnabelLermo y Salvador Alegret. Grup de Sensors iBiosensors (GSB), Departament de Química,

Universitat Autònoma de BarcelonaMaría Pilar Marco, Francisco Sánchez Baeza.Grupo de Receptores Moleculares Aplicados(AMRg), Departamento de Química Orgánica

Biológica, IIQAB-CSIC Barcelona

El Grupo de Sensores y Biosensores de la Universitat Autònoma deBarcelona (GSB) y el Grupo de Receptores Moleculares Aplicados delCSIC (AMRg) vienen dirigiendo alguna de sus líneas de investigación haciael desarrollo de biosensores electroquímicos robustos, económicos, deuso simple, y dirigidos a su aplicación principalmente en la industriaalimentaria y el control medioambiental y la salud humana. Las agenciasreguladoras y los laboratorios de control de calidad podrán,enun futuro, disponer de biosensores portátiles capaces derealizar análisis de manera más rápida y económica.

68 NOVIEMBRE/DICIEMBRE06 FARMESPAÑA INDUSTRIAL

Biotecnología

LOS SENSORES QUÍMICOS

EXISTEN DESDE HACE

MUCHO TIEMPO. SE HAN

ESTUDIADO EN

PROFUNDIDAD Y HAN

ENCONTRADO DURANTE

TODO ESTE TIEMPO UN

GRAN CAMPO DE

APLICACIÓN

venía principalmente del sector clínico y bio-médico. Las inversiones realizadas en eldesarrollo de biosensores para la aplicaciónen el campo clínico fueron compensadas enun corto plazo con la aparición de los bio-sensores para la determinación y control deglucosa en pacientes diabéticos. Los bio-sensores demostraron así su capacidad derealizar análisis fuera del ámbito del labora-torio y por personas no entrenadas, porejemplo, en la consulta médica por elmismo paciente. Actualmente los biosensores no son patri-monio exclusivo de la investigación biomé-dica. La industria alimentaría demandamétodos rápidos para estimar la identidad,la caducidad, el deterioro o la contamina-ción de los alimentos. A la industria engeneral, y a la alimentaria en particular, le esnecesario controlar de manera confiable losproductos en matrices muy complejas. Conla consolidación de la Unión Europea, lasmedidas dirigidas hacia el control de ali-mentos cada vez son más estrictas y gene-ran necesidades analíticas muy variadas.

La problemática de los contaminantesen la salud humana. La seguridadalimentaria y medioambiental El concepto de seguridad alimentariaimplica garantizar la producción y comercia-lización de alimentos que no supongan unriesgo potencial para la salud del consumi-dor.La innovación y el desarrollo de la industriaagroalimentaria pasan de forma general por

dos ejes fundamentales: la seguridad y lacalidad de los alimentos. La cada vez mayorcomplejidad de la cadena alimentaria exige,por otra parte, el desarrollo de eficaces sis-temas de trazabilidad que aseguren la soli-dez de todos los eslabones. Tanto el VI Programa Marco de la Unión

Europea a través de su Prioridad temáticade Calidad y Seguridad de los alimentos,como el Plan Nacional de Ciencia y Tecno-logía 2004-2007 a través de sus programasnacionales de Biotecnología y Recursos yTecnologías Agroalimentarias, recogen lanecesidad de desarrollar e implantar siste-

mas de control encaminados a aumentar laseguridad y la calidad de los alimentos y amejorar los sistemas de trazabilidad, que sedefine como la capacidad de rastrear un ali-mento, desde sus orígenes hasta al consu-midor, dando lugar a una identificación fia-ble de sus componentes, un control sanitarioy un seguimiento del alimento en toda lacadena de producción.Para poder cumplir con estos programaspreventivos, se establece como prioridad eldesarrollo de métodos de detección, deanálisis y diagnóstico que sean rápidos, dealta sensibilidad y que permitan el análisisautomatizado de un amplio espectro deagentes que amenazan la salud humana. Los contaminantes alimentarios –ymedioambientales– pueden agruparse deacuerdo a su origen y naturaleza. Esencial-mente, se pueden clasificar en contaminan-tes microbiológicos (bacterias, virus y pará-sitos), material exógeno, toxinas naturales, yotros compuestos químicos tales como pes-ticidas, metales tóxicos, dogas y residuosveterinarios, entre otros muchos. Algunoscontaminantes alimentarios provienen defuentes naturales del medioambiente, mien-tras que otros son aditivos agregados deli-beradamente. De la misma forma que ladetección y el control de aditivos tuvieron suimportancia con anterioridad, en la actuali-dad la mayor problemática en salud alimen-taria lo constituyen las contaminacionesmicrobiológicas, seguidos de los pesticidasy los residuos de medicamentos en produc-tos animales, así como resistencia a antimi-crobianos. No son pocos los consumidorespreocupados por el impacto a largo plazodel consumo crónico de aditivos químicos(tales como pesticidas, metales tóxicos, resi-duos de drogas veterinarias, saborizantes,colorantes y conservantes), así como losefectos agudos en grupos vulnerables. Las metodologías de análisis de contami-nantes en alimentos deben ser capaces dellegar a detectar concentraciones en elorden de µg/kg o inferiores. Los métodosanalíticos instrumentales convencionalesconsisten en HPLC, cromatografía de gasesy electroforesis capilar y se basan en lassiguientes etapas: I) toma de muestra; II) tra-tamiento; III) extracción; IV) purificación; V)análisis cromatográfico y, VI) obtención deresultados. Además de métodos instrumen-tales de análisis, en el caso de antibióticosen leche o carne se pueden llevar a caboensayo microbiológicos que se basan en lade inhibición del crecimiento bacterianodebida a la presencia del antibiótico.

69NOVIEMBRE/DICIEMBRE06FARMESPAÑA INDUSTRIAL

FIGURA 2. Diagrama esquemático del funcionamiento de un sensor. El “elemento de reconocimiento” o“receptor” sólo reconoce un componente de la muestra. La señal proveniente del proceso dereconocimiento se convierte en una señal eléctrica mediante el transductor. Esta señal es amplificada yposteriormente procesada y presentada en forma digital. El receptor puede interactuar con el analitomediante mecanismos físicos, químicos o biológicos.

ACTUALMENTE LOS

BIOSENSORES NO SON

PATRIMONIO EXCLUSIVO

DE LA INVESTIGACIÓN

BIOMÉDICA. LA

INDUSTRIA ALIMENTARÍA

DEMANDA MÉTODOS

RÁPIDOS PARA ESTIMAR

LA IDENTIDAD, LA

CADUCIDAD, EL

DETERIORO O LA

CONTAMINACIÓN DE LOS

ALIMENTOS

Los ensayos inmunológicos representan unaalternativa de screening rápida y fiable. Enlas últimas décadas, la detección inmunoló-gica de bacterias, células y esporas, virus ytoxinas, y pequeñas moléculas orgánicas hacomenzado a ser cada vez más sensible,específica, y reproducible. Así, cada vez seencuentran en el mercado más kits basadosen la detección inmunológica.La detección de ácido nucleicos de microor-ganismos patógenos es cada vez más espe-cífica y sensible que los métodos inmunoló-gicos. El desarrollo de técnicas deamplificación in vitro del DNA -tal como es laPCR- ha contribuido de manera decisiva aaumentar la sensibilidad y selectividad de losensayos basados en ácidos nucleicos. Estosmétodos tienen ventajas distintivas sobre losmétodos de cultivo e inmunológicos talescomo una mayor especificidad, la sensibili-dad, la rapidez y la capacidad de detectarpequeñas cantidades de ácido nucleico enuna muestra. Además son capaces de detec-tar varios patógenos simultáneamente en unúnico ensayo. Un problemas asociado es queel DNA puede permanecer intacto en ali-mentos procesados, en forma libre o pre-sente en bacterias muertas pudiendo dar suamplificación y posterior detección resul-tando falsos positivos. Este método requiere,por tanto, un período de enriquecimientoque retrasa los resultados pero que asegurala sensibilidad al orden de 3 UFC por 25 gde alimento. Para certificar la seguridad alimentaria, loslaboratorios de control oficiales deberían sercapaces de procesar un gran número demuestras en un período corto de tiempo. Deacuerdo con estos requerimientos, es deimportancia el desarrollo de nuevas técnicasrápidas, económicas, sensibles y capaces derealizar medidas de campo, cuyo resultadopueda ser usado como alarma para la detec-ción rápida del ‘riesgo’ de contaminación.Debido a sus características, los biosensoresse constituyen en los principales candidatosy herramientas de análisis con numerosasaplicaciones en la industria agroalimentaria,control medioambiental y salud humana. Lascaracterísticas más destacables de estos dis-positivos que los convierten en opcionesaltamente atractivas son: I) su especificidad,II) alta sensibilidad, III) corto tiempo de análi-sis, IV) capacidad de inclusión en sistemasintegrados, V) facilidad de automatización, vi)capacidad de trabajar en tiempo real, VI) ver-satilidad, que permite el diseño de dispositi-vos a la carta, y su bajo coste: VII) no des-tructivos, lo que permite el control de

procesos in situ, VIII) no contaminantes, ami-gables con el medioambiente.

Sensores químicos y biosensoresSi queremos imaginar como funciona unsensor, debemos tener en cuenta que estáformado por dos partes. Una de dichas par-tes es el denominado “elemento de recono-cimiento molecular” o “receptor” que inter-acciona con un determinado componentede la muestra, el que se quiere determinar,de manera “específica”, es decir, sin que elresto de la muestra interfiera en la medida.El otro componente, se conoce como“transductor” (Figura 2). Cuando el compo-nente que se busca determinar en la mues-tra compleja interacciona con el “receptor”

del sensor, se produce un cambio que esdetectado por el “transductor” y transfor-mado en una señal eléctrica que es medidapor un instrumento.Esta configuración tan simple de reconoci-miento y transducción es la que ha permitidoel diseño de una instrumentación con carac-terísticas prácticas e innovadoras en elcampo del análisis. Mediante este esquemaanalítico tan sencillo fue posible eliminarnumerosas etapas necesarias en un procesoanalítico convencional tales como el trata-miento de la muestra o la separación delcomponente que se quiere determinar delresto de la muestra, que complican un pro-cedimiento clásico de análisis basado enequipamiento analítico tradicional. Un aspecto fundamental de este diseño es lageneración de una señal suficientementeintensa entre el componente que se deseaanalizar (el analito) y el “receptor” selectivode éste o “elemento de reconocimiento”.Mientras más simple y confiable sea el pro-

ceso de reconocimiento, más lo será el dis-positivo resultante. Los demás aspectos aso-ciados al proceso y al sensor, como la con-versión (transducción) de las señales, suprocesamiento y transmisión son igualmenteimportantes pero ya poseen un tratamientomucho más desarrollado y efectivo gracias alos adelantos constantes y continuos de lamicro y optoelectrónica.La investigación y el desarrollo de los senso-res químicos están dirigidos principalmentea la obtención de receptores cada vez másselectivos de moléculas. También es necesario inmovilizar los recep-tores sobre los transductores más adecua-dos, sin que unos ni otros pierdan sus carac-terísticas funcionales. Hay todo un espectrode posibilidades de inmovilización de recep-tores sobre los transductores, desde inmovi-lizaciones simples por adsorción, retencióndel receptor en geles o membranas polimé-ricas, o por entrecruzamiento de los recepto-res entre sí mediante agentes bifuncionales,hasta inmovilizaciones más complejas porunión química entre el receptor y el trans-ductor. Por otro lado, existe un abanico deposibilidades en el desarrollo de nuevostransductores mediante nuevos materialesde complejidad creciente. De todas formas,los esfuerzos se dirigen hacia el diseño denuevos materiales de reconocimiento sufi-cientemente selectivos. Los elementos de reconocimiento o recep-tores de naturaleza sintética presentan ungrado de reconocimiento limitado. A pesarde esto se consiguen cada vez más materia-les adecuados para el desarrollo de sensoresen aplicaciones muy concretas. Esta limita-ción hizo que se consideraran como “ele-mentos de reconocimiento” los receptoresde naturaleza biológica o biorreceptores,para la construcción de transductores conmateriales biológicos de reconocimientomolecular, mucho más selectivos que los denaturaleza sintética. Estos sensores químicosque incorporan materiales biológicos en suconstrucción se conocen como biosensores.Un biosensor es un sensor químico cuyaparte receptora está constituída por materialbiológico para el reconocimiento molecularde la muestra.

Receptores y transductoresEl componente receptor de un sensor quí-mico transforma selectivamente determinadainformación química contenida en una mues-tra en una forma de energía susceptible deser medida por el transductor. El compo-nente transductor es un elemento capaz de

70 NOVIEMBRE/DICIEMBRE06 FARMESPAÑA INDUSTRIAL

Biotecnología

LA INVESTIGACIÓN Y EL

DESARROLLO DE LOS

SENSORES QUÍMICOS

ESTÁN DIRIGIDOS

PRINCIPALMENTE A LA

OBTENCIÓN DE

RECEPTORES CADA VEZ

MÁS SELECTIVOS DE

MOLÉCULAS

72 NOVIEMBRE/DICIEMBRE06 FARMESPAÑA INDUSTRIAL

Biotecnologíatransformar la energía que codifica la infor-mación química procedente de la muestra enuna señal analítica útil. El componente receptor puede interaccionarcon el analito mediante un mecanismo físicosin que haya una reacción. Es el caso en elque se detecta la interacción mediante uncambio de absorbancia, en el índice derefracción, en la conductividad, en la tempe-ratura o en la masa. Más común es que elreceptor reconozca al analito mediante unareacción química o bioquímica. Se conoce la selectividad limitada de lamayoría de las reacciones utilizadas en elanálisis químico, que obliga a tratar previa-mente la muestra a fin de eliminar las interfe-

rencias. Este hecho ha ocasionado que sóloun número reducido de reacciones químicassean aprovechadas como sistemas recepto-res en los sensores químicos, ya que éstos sediseñan para funcionar en determinacionesdirectas sin tratamiento de la muestra.En la actualidad se están utilizando elegantesprocedimientos sintéticos de arquitecturamolecular para la obtención de reactivosmuy innovadores, formadores selectivos decomplejos receptor-analito (host-guest),cuando las especies implicadas se comple-mentan en forma y dimensiones (geometría)y en grupos enlazantes (energía). Por otrolado, se sabe que el reconocimiento mole-cular es la base de la vida celular, de su orga-nización y mantenimiento. La comunicaciónquímica entre células mediante sistemasmoleculares complementarios es un procesode vital importancia, responsable de la orga-nización y la protección de organismos y dela regulación de su metabolismo. Este tipode reconocimiento, optimizado por la evolu-ción biológica, es el que se ha estado utili-zando para el desarrollo de los biosensores.

FIGURA 3. La interacción de dos hebras de ADN (constituyente principal del genoma de organismos vivos),o de un anticuerpo con su antígeno específico (constituyente principal del sistema inmune), o de una enzimacon su correspondiente sustrato (efectoras biológicas más importantes mediante la catálisis de reaccionesbioquímicas a nivel celular) son algunos modelos de interacciones biológicas en las que se inspiran losbiosensores.

FIGURA 4: Estrategia seguida por el grupo de de Receptores Moleculares Aplicados para la producción deanticuerpos anti sulfonamida usados como biorreceptor en los biosensores electroquímico.

FIGURA 7. Representación esquemática de la estrategia de detección electroquímica de sulfonamidas basadaen un magneto sensor. (A) Luego de la reacción inmunológica, las partículas magnéticas modificadas con elanticuerpo específico son captadas por el sensor magnético (I). El sensor se polariza a _0.150 V (II) y sedetecta electroquímicamente la señal luego de la adición de los reactivos necesarios (III).Aspectomacroscópico del sensor con las partículas magnéticas en la superficie (IV). (B) Aspecto microscópico de lasuperficie del sensor con las esferas magnéticas, obtenidas mediante microscopía electrónica de barridotomada a una resolución de 0.5 (mm) (I) y 100 _m (II a IV). (C) Imagen del prototipo desarrollado paramedidas en el laboratorio.

EN LA ACTUALIDAD SE

ESTÁN UTILIZANDO

ELEGANTES

PROCEDIMIENTOS

SINTÉTICOS DE

ARQUITECTURA

MOLECULAR PARA LA

OBTENCIÓN DE

REACTIVOS MUY

INNOVADORES

73NOVIEMBRE/DICIEMBRE06FARMESPAÑA INDUSTRIAL

Efectivamente, las interacciones entre enzi-mas y sustratos o inhibidores, entre anticuer-pos y antígenos o haptenos, entre diversosreceptores y hormonas, fármacos y neuro-transmisores y entre fragmentos de ADN hanservido de modelo a variados sistemas bio-sensores, algunos ya comercializados (Figura3).El Grupo de Receptores Moleculares Aplica-dos ha producido anticuerpos policlonalesanti sulfonamidas de clase, así como antiatrazina, luego del diseño y síntesis de loshaptenos inmunógenos, preservando la geo-metría, la conformación, y la distribuciónelectrónica del analito (Figura 4). Estas molé-culas son receptores específicos ideales parabiosensores.

Metodologías y tecnologíasLa determinación de componentes enmedios complejos mediante sensores y bio-sensores se ha promovido extensamentedebido a su simplicidad. En algunos casosson los mismos laboratorios quienes constru-yen sus propios sensores para aplicacionesmuy particulares. Los sensores y biosensores son ideales paraser utilizados en mediciones directas, esdecir, sin un tratamiento preliminar de lamuestra. Son particularmente adecuados enlos procesos industriales, sin necesidad detomar muestras, in situ. Por ser portátiles yrobustos, los sensores químicos también sonapropiados en mediciones de procesos,junto a reactores industriales o en circunstan-cias especiales. Los sensores pueden conec-tarse de algún modo con el proceso a seguiro controlar muestras en forma continua. Es

decir, el sensor está acompañado de un sis-tema de toma de muestra automatizado.Los sensores y biosensores pretenden serdispositivos cuya fabricación se realice deforma masiva a muy bajo coste. Así, con unafabricación económica, estos dispositivospodrían ser de “uso personal” y desecha-

bles, es decir, de usar y tirar. Por lo tanto, la investigación y desarrollo delos sensores químicos y biosensores va tam-bién dirigida hacia diseños compatibles contecnologías que posibiliten una gran produc-ción de dispositivos a bajo coste. En estesentido tiene una gran importancia el hechode que los sensores se puedan desarrollancon tecnologías planas, de capas delgadasmicrolitográficas, como las que se utilizan enla fabricación de dispositivos microelectróni-cas y en circuitos impresos. Eventualmentepueden construirse sensores de capas grue-sas que no requieren inversiones muy eleva-das, como los producidos con técnicas seri-gráficas

Biosensores electroquímicos para elanálisis rápido de residuos deantibióticos, pesticidas y bacteriaspatógenas en muestrasagroalimentarias y medioambientalesEl Grupo de Sensores y Biosensores, en cola-boración con el Grupo de de ReceptoresMoleculares Aplicados, ha diseñado un sis-tema electroquímico para la detección desulfonamidas en leche, basados en una reac-ción inmunológica competitiva. Para tal fin,los anticuerpos específicos de clase anti-sul-fonamidas se inmovilizaron covalentementeen partículas magnéticas modificadas congrupos tosil. El ensayo inmunológico com-petitivo se basó en la competencia entre elantibiótico en la muestra y un conjugadoenzimático, diseñado y sintetizado por elGrupo de Receptores Moleculares Aplica-dos. Finalmente, la cantidad de antibióticose detecta mediante una estrategia electro-química de manera muy sensible, en unesquema que se muestra en la Figura 7. El uso de las partículas, sumado a las propie-dades electroquímicas mejoradas del bio-sensor y al diseño apropiado del receptormolecular, hacen posible la detección delantibiótico en concentraciones 100 veces pordebajo de los límites requeridos por UE (100ppbs), en leche entera.Por otro lado, el hecho de utilizar partículasmagnéticas permite eliminar el efecto matrizmediante la simple dilución de la leche 4veces en una solución amortiguada de fos-fato, tratamiento muy fácil de realizar.Los primeros prototipos han demostradotener una excelente sensibilidad (1 ppbs), yunas excelentes características para la deter-minación de antibióticos fuera del ámbito dellaboratorio, por ser de uso simple, capacesde ser operados por personal no entrenado,y de bajo coste.

Un ensayo similar se realizó para la detecciónde atrazina en zumo de naranja y aguassuperficiales y embotelladas, que demostra-

ron excelentes límites de detección, 6•ng L-1, en zumo de naranja, muy por debajo dellímite establecido por la Uniòn Esuropea (0.1µg L-1) con un sistema electroquímico basa-dos en una reacción inmunológica competi-tiva. Para tal fin, los anticuerpos específicosde clase anti-atrazina se inmovilizaron cova-lentemente en partículas magnéticas modifi-cadas con grupos tosil. El ensayo inmunoló-gico competitivo se basó en la competenciaentre el pesticida en la muestra y el conju-gado enzimático, diseñado y sintetizado porel Grupo de Receptores Moleculares Aplica-dos. Finalmente, la cantidad de pesticida sedetecta mediante una estrategia similar a laque se muestra en la Figura 7. En el caso delzumo de naranja el tratamiento también esmuy sencillo y consiste en la filtración y en ladilución. Asimismo, se han diseñado estrategias dedetección rápida de bacterias patógenas,tales como Salmonella y E coli, basado en sumaterial genético y con detección electro-química. Se han diseñado unos metodolo-gías de amplificación del material genéticousando primers magnéticos, que podrían serintegrados a termocicladores para la detec-ción electroquímica de la amplificación atiempo real. Las perspectivas futuras se dirigen al diseñode estrategias basados en biosensores elec-troquímicos enfocados al diagnóstico depatologías en humanos y diagnóstico gené-tico, investigación que se realizará en el GSBcon el apoyo de la empresa ADF Tecno-gen/Circagen.

LOS SENSORES Y

BIOSENSORES

PRETENDEN SER

DISPOSITIVOS CUYA

FABRICACIÓN SE REALICE

DE FORMA MASIVA A MUY

BAJO COSTE

LAS PERSPECTIVAS

FUTURAS SE DIRIGEN AL

DISEÑO DE ESTRATEGIAS

BASADOS EN

BIOSENSORES

ELECTROQUÍMICOS

ENFOCADOS AL

DIAGNÓSTICO DE

PATOLOGÍAS EN

HUMANOS Y

DIAGNÓSTICO GENÉTICO