Introducción

Los ENSAYOS MICROBIOLOGICOS de alimentos:

Poseen particularidades que los diferencian de los físico-químicos.

Incluyen: Ensayos de esterilidad, detección, aislamiento, recuento e identificación de microorganismos y sus metabolitos.

Operaciones críticas Las operaciones importantes a considerar en

microbiología son: a) La preparación de los medios de cultivo y su

esterilización b) El procedimiento de siembra e incubación (incluye aquí

la temperatura como parámetro crítico)c) Control de la calidad de los medios de cultivo.d) Personal capacitado para la realización de cada

actividad. e) Lectura de placasf) Validación de los métodos de ensayo.g) Aseguramiento de la calidad de los resultados de ensayo.h) Monitoreo ambiental.

Factores que determinan la exactitud y confiabilidad de los ensayos

Los factores que determinan la exactitud y confiabilidad de los ensayos realizados en el laboratorio se detallan a continuación: Factores humanos. Relativo a las instalaciones y condiciones ambientales. De los métodos de ensayo y validación de los métodos. De los equipos. De la trazabilidad de las mediciones. Del muestreo. Del manipulación de las muestras. Estos factores contribuirán en diferente grado a la incertidumbre total

de la medición. El laboratorio debe tener en cuenta estos factores al desarrollar los

métodos y procedimientos del ensayo, en la capacitación y calificación del personal, así como en la selección y calibración de equipos utilizados.

Personal

Calificación básica

Descripción de actividades y responsabilidades

CAPACITACION:•Identificación de las necesidades de formación•Planificación de la formación.•Realización de la formación•Documentación.

PERSONAL DE CONDUCCIÓN

PERSONAL TÉCNICO

PERSONAL

TÉCNICO DE APOYO Supervisión adecuada

Relación de dependencia

LABORATORIO

COMPETENCIA TECNICA

Instalaciones y condiciones ambientales

LABORATORIO

Limpieza y orden

Separación de áreas donde se realizan

ensayos incompatibles

Plan de higiene

Monitoreo ambiental

Equipamiento necesario

Reglas de acceso y utilización de las áreas

Ejemplo de la planta de laboratorio

1) Balanza2) Campana de flujo laminar o cabina de seguridad3) Microscopio4) Estufa de cultivo5) Heladera con congelador6) Congelador para mantenimiento de cepas de referencia a -70º

Celsius.7) Estufa de esterilización8) Autoclave de descontaminación9) Autoclave de esterilización10) Estufa de secado

Sala de lavado

Droguero Oficina

2 Sala de preparación de muestras

Sala de preparación de material

3 4

5 7

10.2

1

9

Sala de siembra

Area de acceso restringido

8

6

10

MONITOREO AMBIENTAL En el laboratorio de microbiología se debe

evaluar:

La calidad microbiológica del aire.

La calidad microbiológica de las superficies.

Métodos de ensayo microbiológicos

Existencia y selección de

métodos y procedimientos de ensayo apropiados

Actualización

Instrucciones de uso disponible para elpersonal técnico

que realiza el ensayo

Acuerdo con el cliente

LABORATORIO

Medios de cultivo y reactivos

El laboratorio debe asegurarse que la calidad de los medios de cultivo y reactivos sea

apropiada para los ensayos realizados.

Medios de cultivoLos medios de cultivo, soluciones y

reactivos deben prepararse, almacenarse y utilizarse de acuerdo con un procedimiento documentado.

Los medios de cultivo se preparan en el laboratorio a partir de sus diferentes componentes o a partir de productos en polvo deshidratados comerciales, pero también pueden adquirirse medios listos para su uso.

Medios de cultivo

El laboratorio debe contar con:

Especificaciones de calidad provistas por el fabricante en el momento de la entrega del producto.

Procedimientos documentados para la preparación, esterilización y almacenamiento de los medios de cultivo así como su adecuada implementación.

Procedimientos documentados para la evaluación de la calidad de los medios de cultivo y su adecuada implementación.

Procedimientos documentados para el lavado de material y su adecuada implementación.

Evaluación de calidad de los medios de cultivo Se debe evaluar:

Productividad: rendimiento, recuperación, crecimiento de un microorganismo que se espera que desarrolle en el medio de cultivo.

Selectividad: la supresión del crecimiento de un microorganismo que se espera sea inhibido en el medio de cultivo.

Validación de los Métodos microbiológicos Definición:

la validación es la confirmación, a través del examen y el aporte de evidencias objetivas,

de que se cumplen los requisitos particulares para un uso específico

previsto.

¿Qué se valida?Los métodos no normalizadosLos métodos que diseña o desarrolla. Los métodos normalizados empleados fuera del

alcance previsto En el caso en que utilice métodos oficiales,

métodos normalizados o métodos de organismos nacionales o internacionales reconocidos, o basados en ellos, antes de analizar cualquier muestra, los laboratorios deberán verificar su capacidad para cumplir de forma satisfactoria todos los requisitos establecidos en dichos métodos.

Extensión de la validaciónLa extensión de la validación necesaria

dependerá del método y su aplicación.“La validación es siempre un equilibrio

entre costos, riesgos y posibilidades técnicas.”

Cada laboratorio establecerá los requisitos que debe cumplir el método, con objeto de demostrar que son adecuados para la finalidad establecida.

Métodos de ensayo

microbiológicos cualitativos Primero: Descripción del método de ensayo.

Deben ser validados estimando, cuando sea apropiado:

EspecificidadExactitud relativaDesviación positiva y Desviación negativaLímite de detecciónEfecto matricialRepetibilidad y reproducibilidad

Métodos de ensayo microbiológicos cuantitativos

Primero: Descripción del método de ensayo.

Deben ser validados estimando, cuando sea apropiado:

EspecificidadSensibilidadExactitud relativaDesviación positiva y Desviación negativaLímite de cuantificaciónRepetibilidad y reproducibilidad

Estimación de la Incertidumbre

de medición en microbiología

Definición: la incertidumbre de medición es un parámetro

asociado al resultado de la medición, que caracteriza la

dispersión de los valores que podrían ser razonablemente asignados al mesurando.

Control de datos Adecuada revisión de los

cálculos y de la transmisión de datos.

Trazabilidad

Procedimientos para proteger los datos

Validación de los datos informatizados.

Almacenamiento de los datos informatizados.

Equipos

LABORATORIO

Existencia de los equipos necesarios para la correcta ejecución del ensayo

Instrucciones de uso disponible

Programa de calibración, verificación y mantenimiento

Procedimiento:Identificación de equipos

Procedimiento: Manejo de equipos no conformes

Una Carpeta para cada equipo con los certificados de calibración

e historial del equipo

registros

Equipos en Microbiología Material de uso general: Material de vidrio o

plástico (Ejemplo: tubos de ensayo, placas de Petri, etc.), instrumentos de muestreo, ansas de siembra, etc.

Estufas, autoclaves, baños termostáticos, heladeras, congeladores, campanas de flujo laminar, equipos de filtración, etc.

Equipos volumétricos como pipetas, distribuidores automáticos, sembradores en espiral, etc.

Instrumentos de medida: termómetros, cronómetros, balanzas, medidor de pH, contadores de colonias, etc.

EquiposDeben estar: Mantenidos correctamente Inequívocamente identificados Calibrados Rotulados en cuanto a su estado de

calibración.

TrazabilidadEn microbiología es necesario demostrar trazabilidad en las

calibraciones de equipos y para los cultivos de referencia

TrazabilidadLos materiales de referencia y los materiales

de referencia certificados proporcionan la trazabilidad esencial en las mediciones y son utilizados para: demostrar la exactitud de los resultados calibrar equipos. controlar la calidad del laboratorio validar métodos. permitir la comparación de métodos.

Cultivos de referencia Las cepas de referencia son

necesarias para :

La evaluación de la calidad de los medios de cultivo.

Validar métodos Realizar controles de

calidad interno durante la ejecución de los ensayos

Esquema de cultivos de referencia:

CEPA DE REFERENCIA

CONSERVACIÓN MEDIANTE DISTINTOS MÉTODOS

(Liofilización, nitrógeno líquido, ultracongelación rápida, etc.)

Especificar tiempo y condiciones de almacenamiento

OBTENCIÓN DE LAS CEPAS DE RESERVA

CEPAS DE TRABAJO(Especificar tiempo y condiciones de almacenamiento)

UTILIZACIÓN EN EL CONTROL DE CALIDAD DE LOS MEDIOS, VALIDACIÓN DE MÉTODOS Y

CONTROLES INTERNOS DE CALIDAD

*

Reconstitución(Sólo se acepta un único repique)

*

Descongelación / reconstitución

*

Se subcultiva

una sola vez.

( * ) Deben realizarse los controles de pureza y pruebas bioquímicas de la cepa.

Muestreo

Personal capacitado para realizar el muestreo

Elección del Plan de muestreo

Procedimiento de muestreo

Documentación:Plan de muestreo usado.•Procedimiento empleado

•Identificación de la muestra•Condiciones ambientales

•Descripción del lugar de muestreo

Diagrama de flujo de manipulación de las muestras

Muestreo

Transporte

Conformidad de las condiciones de recepción de

las muestras

Apertura de PE

Si

No

Recepción e identificación de las muestras

Acuerdo de procesamiento de

las muestras

Si

No

Comunicarse con el cliente

Rechazo de la muestra

Almacenamiento

Realización del ensayo

Emisión del informe de ensayo

Disposición final de las muestras

Aseguramiento de la calidad de los resultados El laboratorio debe tener procedimientos de control de

calidad para monitorear la validez de los ensayos llevados a cabo.

Control de calidad interno: El control de calidad interno consiste en todos los procedimientos realizados por un laboratorio para la evaluación continua de su trabajo.

Control de calidad externo: Comprende la participación en Ensayos de Aptitud

Interlaboratorio (“Proficiency Testing”) y constituyen un medio independiente por el cual un laboratorio se puede evaluar objetivamente y demostrar la veracidad y precisión de los resultados obtenidos por sus métodos analíticos.

Informe de los resultados de ensayoDeben ser claros, precisos, unívocos, objetivos

Pueden transmitirse en

forma electrónica, luego de acordar con

el cliente y cumplir con la norma

Contienen las indicaciones mínimas definidas en la norma

Contiene la información que solicitó el cliente

Pueden contener opiniones e interpretaciones

Contienen la descripción o referencia a la metodología utilizadaContienen los resultados

de los ensayos

Muchas gracias