7/26/2019 Biorremediacin de Metales Pesados Mediante El Uso de Mezclas Bacterianas

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BIORREMEDIACIN DE METALES PESADOS MEDIANTE EL USO DEMEZCLAS BACTERIANAS.

Fabian Gomez Galvi !o"# $%$&''$

(en")***********..La contaminacin ambiental por metales pesados y txicos debido a la minera, procesos

metalrgicos, y otras industrias qumicas es un problema mundial que afecta tanto a la salud

humana y el medio ambiente. El objetivo de este estudio fue investigar el efecto sinrgico de

las me!clas bacterianas en la biorremediacin de una me!cla de "b, #d, #u presentes en

suelos contaminados. En comparacin con el mtodo de cultivo solo, las me!clas bacterianas

mostraron una mayor tasa de crecimiento, la actividad de ureasa, y la resistencia a metales

pesados. #uatro cepas bacterianas fueron aisladas e identificadas Viridibacillus arenosi$%&,

Sporosarcina soli$'%%,Enterobacter cloacae()'*+, yE. cloacae()'*, que obtuvieron de

una mina abandonada en #orea y mostr efectividad en la precipitacin de la calcita inducidapor microorganismos -/#"0. Los siguientes par1metros se controlaron durante el transcurso

del experimento2 densidad ptica, p3, actividad de la ureasa, la produccin de la calcita, la

tolerancia a los metales pesados, y la prueba de impermeabilidad. 4e observaron efectos

sinrgicos sobre la remediacin de diferentes metales pesados a travs de la modificacin de

las me!clas bacterianas y, despus de *5 h, se registr la biorremediacin de 65,78 para "b,

59,*8 para #d, y 9,+8 para #u. En comparacin con los cultivos de cepas individuales, las

me!clas bacterianas demostraron una mayor resistencia y la eficiencia para la remediacin de

los metales pesados. "or lo tanto, nuestros resultados muestran que el uso de me!clas

bacterianas es til en la biorremediacin de metales pesados del medio ambientecontaminado.

INTRODUCCION

La acumulacin de metales pesados en el agua, sedimentos y suelos ha dado lugar a graves

problemas ambientales. En los ltimos a:os, varios procesos han sido desarrollados con el

objetivo de reducir o recuperacin de metales pesados de ambientes contaminados -;&&0. ;proximaciones fsicas y qumicas son capaces de eliminar un amplio

espectro de contaminantes, pero las principales desventajas de estos mtodos se encuentran en

el aumento de consumo de energa y la necesidad de productos qumicos adicionales - /lhan et

al., %>>*0. En los ltimos a:os, los procesos tales como la biolixiviacin, biosorcin, y

bioprecipitacin todos se basan en el uso de microorganismos que tienen la capacidad de

solubili!ar, adsorber, o precipitar los metales pesados -$allester Et al, &66%?.. @ouboulis et al,

&660. 3asta la fecha, la mayor parte de las investigaciones sobre la precipitacion de la calcita

inducida por microorganismos -/#"0 se ha limitado a las bacterias ureolticas, con especial

nfasis en la cat1lisis de la hidrlisis de la urea -Aerris et al., %>>70, la eficiencia de la

produccin de calcita -uync< et al, %>&>?. Ban "aassen et al., %>&>0, y la modificacin de las

propiedades fsicas del suelo por bacterias modelo -$urban< et al, %>&&?. Ce )ong et al.,%>&>0. La /#" ha demostrado que aumenta la resistencia al corte de materiales porosos -Ce

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)ong et al, %>>+?. 3ar&>0. /#" surge de la siguiente reaccin catali!ada por la

ureasa2 -D3%0%# F %3% G %D3*FF #7%H

se produce en presencia de iones calcio

disueltos, lo que lleva a la precipitacin de cristales de carbonato de calcio2 #a%FF #7%HG

#a#7-s0.

Los cristales formados por este proceso crean puentes entre partculas, mejorando as la

resistencia y la rigide! del material -3ar&>0. #a#7 ureasa inducida puede

llenar los espacios de poros dentro de las diversas matrices de suelo y granos de suelo de

cemento para formar piedra arenisca -$urban< et al, %>&&?.. Ceepa< et al, %>>6?. Ce )ong et

al, %>>+0. La precipitacin de #a#7 inducida por la hidrlisis catali!ada por la ureasa de

urea se ha demostrado que cambiar las propiedades de ingeniera de geomateriales -$urban&&?. Ihiffin et al., %>>0. 4istemas de me!clas bacterianos han sido utili!ados para

estudiar las interacciones entre las poblaciones de clulas e interacciones fundamentales

clula'clula. Jecientemente, estos sistemas han sido de particular inters para los bilogos

sintticos y para el estudio y la ingeniera de sistemas sintticos multicelulares complejos. Enel nivel b1sico, un cocultivo isa cultivo de clulas de configuracin, en la que dos o m1s

poblaciones de clulas se cultivan con cierto grado de contacto entre ellos -=ore et al., %>&*0.

El objetivo fundamental del sistema me!clas bacterianas es entregar beneficios sociales a

travs de sus aplicaciones industriales, mdicas y ambientales -#hen, %>&%? (itney y

Areemont, %>&%0.

"or lo tanto, muchos sistemas de me!clas bacterianas se desarrollan para futuras aplicaciones

industriales, mdicas o ambientales. ;unque las interacciones sinrgicas entre los metales y

bacterias ureolticas han atrado una parte justa de la atencin, los efectos de ambientes

contaminados por metal sobre el crecimiento de me!clas bacterianas son todavadesconocidos.

La utili!acin de microorganismos con probo el potencial de biorremediacin y la

supervivencia en el ambiente contaminado es crucial para una biorremediacin con xito. En

vista de ello, el presente trabajo tiene como objetivo estudiar la capacidad de remediacin de

metales pesados mediante cultivos bacterianos puros y mixtos, para aplicaciones de proceso

de biorremediacin.

+. Ma,e-iale ) m,o"o

+.$. Mi!-oo-/animo ) !on"i!ione "e !0l,ivo

#uatro cepas bacterianas fueron aisladas del suelo de una mina abandonada en nuestros

trabajos anteriores -(ang et al., %>&90. Estas cepas incluyen Viridibacilo arenosi$'%& -$'%&0,

Sporosarcinasoli$'%% -$'%%0,Enterobacter cloacae()'*+ -()'*+0, yE. cloacae()'* -()'

*0. Kres conjuntos de experimentos se llevaron a cabo en condiciones aerbicas utili!ando

co'cultivo definido ;&, cultivos bacterianos me!clados de $'%& y $%%? ;%, cultivos

bacterianos me!clados de ()'*+ y ()'*? ;7, cultivos bacterianos me!clados de $'%&, $'%%,

()'*+, y ()'*. Estas cepas fueron pre'seleccionadas en base a sus altos niveles de actividad

de ureasa y produccin de calcita. ;dem1s, estas cepas tienen la m1s alta tolerancia a metalespesados. 4us secuencias han sido depositados en =en$an< con los nmeros de acceso

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()+&*+ -$'%&0, ()*59>& -$'%%0, (A965597 -()'*+0, y (A96559* -()'*0. Las me!clas

bacterianas se cultivaron de forma rutinaria en 7># en caldo M; -extracto de levadura a una

concentracin %> g N L y sulfato de amonio a una concentracin de &> g N L a p3 0. El p3

final del medio fue ajustado a ,>.

1.&.+.+. P-e2a-a!i3n "e me,ale 2ea"o ol0!i3n ma"-e.

"ara la preparacin de una concentracin de & de las me!clas de soluciones madre de

metales pesados las cantidades necesarias de2 #d#l% O 93% -(anto #hemical #o., Ltd.,

Ko Rl0 a %9> Rl de tampn

de fosfato de sodio >,& que contiene 9>>Rl de solucin de urea a 7 . La me!cla se incub

a 7# con intervalos de tiempo regulares. "osteriormente, % ml de solucin de fenol

nitroprusiato se a:adio a una solucin de hipoclorito alcalino, luego, se incubaron a 9>#

durante *> min. Cespus de la incubacin, se midi la ;bsorbancia a +%+ nm con cloruro de

amonio ->'&>S0 como un est1ndar. Qna unidad de actividad de la ureasa se defini como la

cantidad de en!ima que catali!a la hidrlisis de & R de urea por min.

"ara producir calcita, los aislados se cultivaron en caldo de M; para %* h y se subcultivaron en

caldo de $"Q -7 g de extracto N L de ternera, 9 g N L de peptona, y %> g N L de urea a p3 0 a

7># durante % h con agitacin continua a %>> rpm. 4e a:adi la suspensin bacteriana -9>>T

L0 a 9>>T L de una solucin de dihidrato de cloruro de calcio a 79> m y la me!cla se

centrifug a &+.&6 U g durante 9 min a %9# para recoger el precipitado. Ainalmente, el

precipitado se sec a 9> # durante *5 h antes de ser pesado.

+.5. De,e-mina!i3n "e la !on!en,-a!i3n m6nima in7ibi,o-ia.

Los experimentos de tolerancia se llevaron a cabo en Erlenmeyers de %9> ml, que contienen

cada uno *9 ml de caldo de M;. ;proximadamente el nmero igual de clulas de las cuatro

cepas aisladas fueron utili!adas y las me!clas bacterianas con una densidad celular inicial de

&x&>5 cellNml para cada una de las cepas aisladas. Kodos los cultivos fueron incubados en 7>

V# y agitacin a %>> rpm. "ara estudiar la influencia de los metales pesados en el crecimiento

bacteriano, las me!clas bacterianas fueron expuestos a una me!cla de metales pesados con

concentraciones individuales que van desde > a &> m.

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+.'. P-0eba "e im2e-meabili"a"

Los cultivos individuales y las me!clas bacterianas cultivadas en caldo durante la noche se

recogieron por centrifugacin a +>>> rpm durante 9 min, se lavaron dos veces y se

resuspendieron en una solucin de cloruro sdico al >,68 a una C final +>> nm de &,>

-equivalente a & U &>5 clulas N ml0. 4e me!clo arena estril -%>> g, desde >,*9 hasta >, mm,

)oomoonjin 4and #o. Ltd., #orea0 con &> ml de urea -*> g N L0 y una solucin de cloruro de

calcio dihidrato -%9 g N L0. La suspensin de arena -*> g0 se empaquet en una columna de

pl1stico de %9 ml -#orning #o. Ltd., #orning, DM, EE.QQ.0. Cespus de ser secadas durante

*5 horas a 9>#, las columnas se recogieron una ve! por gravedad con &> ml de suspensin

celular. Las columnas se almacenaron durante *5 para permitir el crecimiento de cristales de

calcita. ; continuacin, % ml de cristal violeta -#B0 se pipetearon en la columna de arena de

relleno. El grado de permeabilidad se determin mediante la medicin de la distancia de

migracin de #B.

+.%. Bio--eme"ia!i3n "e me,ale 2ea"o

#inco mililitros del pre'cultivo de una noche se inocularon en *9 ml de caldo M; contenidos

en erlenmeyers de %9> ml. El caldo M; contiene urea 9 m y #a#l% %9 m, que fueron

filtrados usando filtros estriles de >,%% Rm, y fueron suplementado con % m de me!cla de

metales pesados. Los erlenmeyers fueron incubados en incubadora con agitacin constante a

%>> rpm a una temperatura de 7> V# por *5 horas. Los tratamientos de control o blancos sin

ningn tipo de clulas bacterianas fueron agregados tambin en todos los experimentos.

Cespus de la incubacin, los cultivos se centrifugaron a 5>>> x g durante &9 min. La

biorremediacin de metales pesados por cultivos individuales y me!clas bacterianas -;70 secalculo como la diferencia porcentual entre las concentraciones inciales y finales de los

metales pesados presentes en los sobrenadantes. Las concentraciones de metales pesados se

midieron usando un espectrmetro "er> CB ptico de plasma

acoplado inductivamente -/#"'E4, "er

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recogieron de la parte inferior de la columna con &>> ml de agua destilada. Las

concentraciones de metales pesados en las muestras de los efluentes se determinaron mediante

/#"'E4.

+.8. An9lii e,a"6,i!o.

Los resultados se expresaron como la media W 4.C. de los tres experimentos. El an1lisis

estadstico se reali! mediante la prueba t de 4tudent, y se consider un valor de p X>,>9 para

indicar una diferencia significativa.

4. Re0l,a"o ) "i!0i3n

4.$. La a!,ivi"a" 0-eaa ) la 2-o"0!!i3n "e !al!i,a

La ureasa es una en!ima clave que conduce a la precipitacin de calcita y se produce en

cantidades significativas en medios que contienen fuentes de urea y de calcio -4toc mg N ml0, y $'

%& -&%,9 mg N ml0.

En comparacin con un sola cultivo, las me!clas bacterianas tienen muchas

ventajas porque las tasas de hidrlisis de la urea eran m1s altas en ella y los valores de p3 de

las me!clas bacterianas aumentan m1s r1pidamente que los de los diferentes cultivos

individuales -datos no mostrados0. $acterias productoras de ureasa pueden promover la

precipitacin de carbonato de calcio mediante la hidrlisis de la urea, y la produccin de ionesde amonio y bicarbonato, por lo tanto, aumenta el p3 y la acelera las reacciones qumicas

-achal y "an, %>&&0.

Fi/0-a $.;ctividad de la ureasa y produccin de calcita de la cepa sola y la me!clas

bacteriana

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4.+. E,0"io "e ,ole-an!ia "e me,ale 2ea"o

Las me!clas bacterianas que contienen todas las cepas toleran la mayor concentracin mnima

inhibitoria -/#0 de los metales pesados, 6 m -Aig %0. Entre las cepas bacterianas y me!classometidas a ensayo, tres de ellas -;7, ()'*+, y ()'*0 toler una #/ de metales pesados de

+ mm. La investigacin anterior dio a entender que debido a que los miembros de las me!clas

de bacterias se comunican y se diferencian uno de otros, las me!clas bacterianas pueden

reali!ar tareas m1s complejas y sobrevivir en entornos cambiantes m1s que una sola cepa

-$renner et al., %>>50. La resistencia bacteriana a los metales pesados es un factor importante

a considerar en el estudio de remediacin, ya que est1 directamente relacionado con la

supervivencia y el crecimiento de las bacterias que se utili!a para recuperar los sitios

contaminados -Li y Jama&&0. 4e sabe que los sistemas de resistencia de metal en

las bacterias son abundantes y generali!ados, y sus frecuencias de aparicin van desde un

peque:o porcentaje de los aislamientos en ambientes limpios a casi todos los aislados en

ambientes fuertemente contaminadas -$ar>&? @ouboulis et al, %>>*.0.

Fi/ +. #oncentracin inhibitoria mnima de una me!cla de metales pesados en cepasindividuales y me!clas bacterianas.

4.4. P-0eba "e im2e-meabili"a"

En este estudio, las me!clas bacterianas que contienen todas las cepas mostraron una longitud

de migracin reducida cristal violeta en comparacin con la de los cultivos individuales -Aig.

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70. Las ventajas que tiene la prueba de permeabilidad es su simplicidad en la operacin,

menor coste en comparacin con otros procesos, y la ausencia de formacin de calcita -(ang

et al., %>&*0. La reduccin en el tiempo de retencin se puede atribuir a los cristales de

carbonato de calcio que se depositaron entre las partculas de arena, lo que result en el

taponamiento. ejora en la resistencia de las columnas de arena debido a la formacin de

carbonato de calcio inducida por bacterias tambin se ha informado anteriormente -Ce )ong et

al, %>&>?. Ihiffin et al., %>>0. Las iniciativas de investigacin recientes han demostrado que

los cristales de calcita forman YpuentesY de cohesin entre los granos de arena existentes, el

aumento de la rigide! de la arena mientras que que causa solamente una disminucin limitada

de la permeabilidad -Ce)ong et al, %>&>?. van "aassen et al., %>&>0.

Fi/ 4.Longitud de migracin de cristal violeta bajo cepas individuales y diferentes me!clas bacterianas. --Los valores sonmedias W 4C0

4.5. Lo 2a,-one "e !-e!imien,o "e !0l,ivo ) -eme"ia!i3n "e mez!la ba!,e-iana

Los perfiles de crecimiento microbiano durante los experimentos a escala de matra! usando

los diferentes dise:os de me!clas bacterianas se muestran en la Aig. *. 4e observaron

diferentes patrones de crecimiento para diferentes dise:os de me!clas bacterianas -;& y ;%0.

Los cambios de p3 en el transcurso del tiempo se muestran en la Aig. *;. 4e espera que la

hidrlisis de urea para dar lugar a un aumento del p3 en el medio es debido a la produccin

de amonio. Los de valores de p3 inciales para todos los tratamientos fueron de

aproximadamente +,9, probablemente debido al caldo de p3 M;. En el experimento con

diferentes me!clas bacterianas, los valores de p3 se increment r1pidamente durante % h

-aproximadamente p3 %,90 hasta que llegaron a un p3 promedio aproximado de 5,+. Qn

fenmeno similar tambin fue descrito por Kobler et al. -%>&&0 durante la induccin de la

hidrlisis de la urea en me!clas bacterianas de las bacterias nativas del suelo. Curante las

mediciones de absorbancia, la fase de crecimiento estacionario comen! % h despus delinicio del experimento -Aig. *$0, mientras que durante las mediciones de #AQ, la fase de

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muerte comen! *5 h despus del inicio del experimento -Aig. *#0. En nuestro experimento,

los valores de p3 aumentaron r1pidamente de las *5 horas hasta llegar a un valor de p3

aproximado de 5,%% -Aig. 9;0, porque las tasas de hidrlisis de urea son m1s altos en las

me!clas bacterianas. 4in embargo, durante la medicin de las #AQ, la fase de muerte

comen! *5 h despus del inicio del experimento -Aig. 9;0. La eliminacin de metales

pesados por las me!clas bacterianas se evalu mediante una me!cla de % m de metales

pesados, y se observaron los potenciales de remediacin de las me!clas bacterianas que varan

entre 9,9+8 y 65,%98 -Aig. 9$0. "b, #d, #u y concentraciones se redujeron a >.>+, &6.7* y

&7.9> mg N L en aproximadamente *5 h, respectivamente. Esto equivale a alrededor de

65,%98, 59,768 y 9,9+8 de eliminacin de "b, #d, y #u por biorremediacin,

respectivamente. En estudios anteriores han mostrado que precipit el #a#7 encapsulado

por clulas bacterianas -itchell y Aerris, %>>+?. #uthbert et al, %>&%0, es de suponerse que la

electronegatividad de la pared celular bacteriana favorece la adsorcin de cationes tales como

iones de calcio, por lo tanto, facilitando el proceso de precipitacin de #a#7 en la pared

celular -4chult!e'Lam et al., &66+0. Barios estudios tambin han informado de que el #a#7

puede ser el sorbente dominante para una variedad de metales en acuferos carbonatados

-@achara et al., &66&0. ;dem1s, se inform que los metales pesados para ser absorbidos en la

superficie de la calcita -Lorens, &65&0, con la sorcin es definido como un proceso de

superficie independiente de mecanismos como la adsorcin o la precipitacin -4posito, &65*0.

Fi/ 5. #ambios en el tiempo en el p3 -;0, C a +>> nm -$0, y la colonia unidad -#0 para lostratamientos utili!ando diferentes dise:os de me!clas bacterianas formando.

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Fi/ '.Cependencia de tiempo del patrn de crecimiento y la capacidad de eliminacin demetales pesados de las me!clas bacterianas.

4.' 2-0eba "e !ol0mna.

Las tasas de biorremediacin pueden estimarse en base a los resultados de la Aig. +. Losresultados mostraron que las tasas de biorremediacin aumentaron en el siguiente orden2 #d

-*%,*80 X#u -+,%80 X"b -65,980.

Fi/ %.La eliminacin de metales pesados de las me!clas bacterianas -Los valores son medias

W 4C0.

La adsorcin de afinidad de metales pesados en las bacterias puede ser relacionadas con la

electronegatividad de iones met1licos como se ha descrito en otros estudios -erdy et al,

%>>6?.. 4eco et al, &660, que inform de que la atraccin entre los metales y las bacterias es

mayor con mayor electronegatividad. La selectividad tanto en soluciones individuales y de

mltiples componentes es mayor para "b% F que para #u% F. ;dem1s, el radio inico de alta

de "b% F -&.&%Z[;0 debe inducir una r1pida saturacin de los sitios de adsorcin debido al

impedimento estrico en comparacin con #u% F ->.>Z[;0. Estos hechos podran explicar la

reactividad de #u y "b con sitios de la superficie bacterias. "b% F se adsorbe sobre la calcita

y, por lo tanto, los iones de "b% se mueven en los sitios de #a% F, a pesar del radio inicogrande de "b% F con relacin a #a% F -4turchio et al., &660.

"ara confirmar an m1s el papel de /#" en la biorremediacin de metales pesados, las

muestras de arena remediadas se anali!aron por difraccin de rayos \ -CJ\0. Los espectros

de CJ\ indic la presencia de cerusita -carbonato de plomo, "b#70, otavita -carbonato de

cadmio, #d#70, y carbonato de cobre -#u#70 como cristales minerales predominantes,

como se evidencia por la deteccin de agudos picos en el an1lisis de muestras bioremediadas,

en contraste con el control, donde los picos correspondientes al cuar!o -4i%0 representaban

los picos m1s agudos -Aig. 0.

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3igo. . espectros \JC, lo que confirma la biorremediacin de metales pesados por las

me!clas bacterianas cultivadas en una columna de arena? patrn de \JC de la columna de

arena de control -;0 y la columna de arena bioremediated -$0. picos identificados2 #, #u#7?

, otavita -#d#70? ", cerussite -"b#70? P, cuar!o -4i%0.

Los picos de cuar!o en las muestras de control podran atribuirse a la muestra de arena. 4e

encontr una me!cla de metales pesados a coprecipitar con #a#7 como cerusita -carbonato

de plomo, "b#70 en los experimentos de biorremediacin, mientras que tambin se

detectaron otavita -carbonato de cadmio, #d#70 y picos carbonato de cobre -#u#70. Las

reacciones generales implicadas en el proceso de biorremediacin incluyeron2 produccin de

D3* F y 3#7 por la ureasa, la desorcin de #a% F y N o iones de metales pesados a partir

de superficies slidas por el D3* F y 3#7 promovido por precipitacin de #a#7, y la co'

precipitacin de los metales pesados.

5. Con!l0ione

En este estudio, las cepas aisladas se utili!aron para evaluar los efectos sinrgicos de las

me!clas de bacterias en la eficiencia de la biorremediacin. ;l final del periodo experimental,

se encontr que las me!clas bacterianas resulto ser el mtodo m1s efica! de bacterias, en

comparacin con los mtodos de cultivo en individuales. En comparacin con los cultivos decepas individuales, las me!clas bacterianas mostraron una mayor tasa de crecimiento, la

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actividad de ureasa, y la resistencia a metales pesados. ;dem1s, hemos demostrado que las

me!clas bacterianas exhibieron una capacidad de biorremediacin de metales pesados

considerablemente mayores que los cultivos individuales, lo que podra ser debido a la

densidad celular bacteriana superior a altos niveles de metales pesados. Ce acuerdo con los

resultados de la prueba de columna, las mayores eficiencias de biorremediacin se observaron

para "b, mientras que se detectaron eficiencias muy bajas de eliminacin para #d. La

biorremediacin con las cepas aisladas de me!clas bacterianas es un mtodo efica! para la

eliminacin de metales pesados de los ambientes contaminados. Esto puede llegar a ser una

buena estrategia para el desarrollo de un mtodo efica!, eficiente y econmico de la

biorremediacin de metales pesados, y la introduccin de estas bacterias indgenas podra ser

utili!ada para la biorremediacin de suelos contaminados sin perturbar el entorno de destino.