Biorremediacion de Humedales Con Bacteria Pseudomona

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Contenido INTRODUCCIÓN ................................................................................................................................. 1 OBJETIVO ............................................................................................................................................ 2 BIODIVERSIDAD E IMPORTANCIA ECOLOGICA DE LOS MANGLARES ............................................... 3 México un país megadiverso ........................................................................................................... 3 México y sus manglares .................................................................................................................. 3 Mangle rojo (Rhizophora mangle) .............................................................................................. 4 Mangle blanco (Laguncularia racemosa).................................................................................... 4 Mangle botoncillo (Conocarpus erectus) ................................................................................... 5 Mangle negro (Avicennia germinans)......................................................................................... 5 Importancia ecológica de los manglares ......................................................................................... 5 Presiones y amenazas a los manglares ........................................................................................... 8 HIDROCARBUROS ............................................................................................................................... 9 Reacción con el medio ambiente .................................................................................................... 9 Efectos fóticos ............................................................................................................................... 10 Efectos tóxicos............................................................................................................................... 11 Causas a la salud............................................................................................................................ 12 BIORREMEDIACIÓN .......................................................................................................................... 13 Tipos de biorremediación ............................................................................................................. 14 Remediación microbiana............................................................................................................... 15 Fitorremediacion ........................................................................................................................... 17 Tipos de fitorremediación ........................................................................................................ 20 Uso de organismos modificados genéticamente en biorremediación ......................................... 21 Nuevos desarrollos biotecnológicos en plantas y bacterias ......................................................... 23 ANALISIS DE CASO ............................................................................................................................ 25 Generalidades del lugar ................................................................................................................ 25 Planteamiento del problema ........................................................................................................ 26 BACTERIAS PSEUDOMONAS EN LA BIORREMEDIACIÓN DE SUELOS CONTAMINADOS CON HIDROCARBUROS ............................................................................................................................. 28

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biorremediacion de humedales con bacterias pseudomonas, contiene la ruta metabolica de diferentes contaminantes presentes en suelo.

Transcript of Biorremediacion de Humedales Con Bacteria Pseudomona

  • Contenido

    INTRODUCCIN ................................................................................................................................. 1

    OBJETIVO ............................................................................................................................................ 2

    BIODIVERSIDAD E IMPORTANCIA ECOLOGICA DE LOS MANGLARES ............................................... 3

    Mxico un pas megadiverso ........................................................................................................... 3

    Mxico y sus manglares .................................................................................................................. 3

    Mangle rojo (Rhizophora mangle) .............................................................................................. 4

    Mangle blanco (Laguncularia racemosa) .................................................................................... 4

    Mangle botoncillo (Conocarpus erectus) ................................................................................... 5

    Mangle negro (Avicennia germinans) ......................................................................................... 5

    Importancia ecolgica de los manglares ......................................................................................... 5

    Presiones y amenazas a los manglares ........................................................................................... 8

    HIDROCARBUROS ............................................................................................................................... 9

    Reaccin con el medio ambiente .................................................................................................... 9

    Efectos fticos ............................................................................................................................... 10

    Efectos txicos............................................................................................................................... 11

    Causas a la salud............................................................................................................................ 12

    BIORREMEDIACIN .......................................................................................................................... 13

    Tipos de biorremediacin ............................................................................................................. 14

    Remediacin microbiana ............................................................................................................... 15

    Fitorremediacion ........................................................................................................................... 17

    Tipos de fitorremediacin ........................................................................................................ 20

    Uso de organismos modificados genticamente en biorremediacin ......................................... 21

    Nuevos desarrollos biotecnolgicos en plantas y bacterias ......................................................... 23

    ANALISIS DE CASO ............................................................................................................................ 25

    Generalidades del lugar ................................................................................................................ 25

    Planteamiento del problema ........................................................................................................ 26

    BACTERIAS PSEUDOMONAS EN LA BIORREMEDIACIN DE SUELOS CONTAMINADOS CON

    HIDROCARBUROS ............................................................................................................................. 28

  • Factores abiticos ........................................................................................................................|28

    Factores biticos ........................................................................................................................... 29

    Rutas metablicas de bacterias Pseudomonas en medios carbonatos ......................................... 31

    Ruta metablica de oxidacin terminal de n-alcanos por Pseudomonas ............................. 33

    Ruta metablica de oxidacin subterminal de n-alcanos ....................................................... 34

    Ruta metablica de degradacin de n-alcanos alquil hidroperoxidasa ................................. 34

    Ruta metablica de degradacin de ciclohexano ................................................................... 34

    Ruta metablica de degradacin de tolueno por P. putida TOL, P. putida, P. mendocina KR1

    y P. pickettii PKO ..................................................................................................................... 35

    Crecimiento Microbiano en la Biorremediacin de Suelo Contaminado con Hidrocarburos ....... 36

    Determinacin de bacterias hidrocarbonoclastas por dilucin en placas .................................... 38

    Medio mineral basal. ............................................................................................................... 39

    Solucin mineral ....................................................................................................................... 39

    Mtodo y equipos .................................................................................................................... 40

    Soluciones y reactivos .............................................................................................................. 40

    Procedimiento .......................................................................................................................... 41

    Preparacin de la muestra ....................................................................................................... 41

    Clculos ..................................................................................................................................... 43

    Fases del crecimiento microbiano durante la Biorremediacin de Suelo Contaminado con

    Hidrocarburos ............................................................................................................................... 43

    Control de los factores cinticos durante la Biorremediacin ...................................................... 45

    CONCLUSIN .................................................................................................................................... 46

    BIBLIOGRAFIA ................................................................................................................................... 47

    ANEXOS ............................................................................................................................................. 49

    Anexo I. Determinacin de la concentracin de hidrocarburos totales del petrleo (HTP) en el

    suelo. ............................................................................................................................................. 49

    Anexo II. Determinacin de pH por el mtodo de potencimetro. (Bates, 1983). ....................... 55

    Anexo III. Determinacin de porcentaje de humedad en suelos. ................................................. 57

    Anexo IV. Cuantificacin de Carbono orgnico total. ................................................................... 59

    Anexo V. Determinacin de Nitrgeno total con el mtodo Micro- Kjeldahl. (Modificado por

    Bremner, 1965). ............................................................................................................................ 62

  • 1

    INTRODUCCIN

    El medio ambiente es el conjunto de todas las cosas vivas que nos rodean. De ste

    obtenemos agua, comida, combustibles y materias primas que sirven para fabricar

    las cosas que utilizamos diariamente. Desde sus orgenes, la accin humana ha

    introducido cambios en los procesos ecolgicos, y lo que empez como un conjunto

    de pequeas alteraciones puntuales adquiri en los ltimos tiempos una dimensin

    altamente preocupante.

    El petrleo es la fuente principal de energa de la sociedad actual, este compuesto

    y sus productos de refinacin no son sustancias especficas y nicas, puesto que

    son mezclas de varios hidrocarburos y otros compuestos cuyas propiedades fsicas

    y qumicas son muy variadas, las cuales determinan su comportamiento e impacto

    en los elementos ambientales, cuando ocurre una descarga al ambiente. Al suceder

    esto es necesario hacer una investigacin y caracterizacin de la contaminacin

    para evaluar los daos e implementar una correccin ambiental efectiva (Echarri,

    1998).

    Segn las estadsticas de la Procuradura Federal de Proteccin al Ambiente

    (PROFEPA, 1999), entre los aos de 1997 y 2001, de 2,592 emergencias

    ambientales con materiales peligrosos a nivel nacional, Petrleos Mexicanos

    provoc 57 % de ellas, la mayora de las emergencias se presentan en ductos,

    provocando derrames con sustancias como petrleo crudo, combustleo, diesel,

    gasolina, turbosina, gas natural y amoniaco. Los derrames en ductos en el rea de

    PEMEX Refinacin se deben en orden de importancia a: toma clandestina, daos o

    averas provocadas por terceros, corrosin y fallas del material. En el 60 % de estos

    eventos existe afectacin al suelo, en 30 % al agua y en 10 % al aire (CEMDA,

    2006). De los 50 mil kilmetros de ductos que existen en el pas, por lo menos 20

    mil necesitan de urgente atencin, datos que son confirmados por el Instituto

  • 2

    Mexicano del Petrleo (IMP), pues cerca de la mitad de los ductos tienen ms de

    30 aos de operacin.

    El problema de los suelos contaminados con hidrocarburos radicaba en que no

    exista conciencia de las tcnicas y costos de la biorremediacin pero gracias al

    desarrollo tecnolgico ahora se cuenta con diversos estudios que han definido estas

    metodologas y sus diferentes aplicaciones. En Mxico, se han iniciado algunos

    trabajos de caracterizacin de sitios afectados por hidrocarburos, 3 especficamente

    en zonas petroleras como Tabasco y Veracruz ((Gutirrez y Zavala, 2002), donde

    el suelo es el factor que ms se estudia. Estas prcticas remediativas consisten en

    el uso de organismos como plantas, hongos, bacterias naturales o modificadas

    genticamente para neutralizar sustancias toxicas, transformndolas en sustancias

    menos dainas o bien inocuas para el ambiente y la salud humana.

    Este trabajo presenta hablaremos sobre los tipos manglares existentes en el

    municipio de Paraso Tabasco, Los tipos de hidrocarburos existentes y las tcnica

    de biorremediacin ms eficientes en manglares contaminados con hidrocarburos

    y las bacterias Pseudomonas en la biorremediacin de suelos contaminados con

    hidrocarburos.

    OBJETIVO

    Conocer mediante una investigacin las diferentes tcnicas de biorremediacion, as

    como las rutas metablicas de las Bacterias Pseudomonas empleadas en sitios

    contaminados por hidrocarburos, tomando como caso de estudio la zona costera de

    manglares y cocotales de Paraso Tabasco, para proporcionar el conocimiento

    necesario en la medicin de la cintica de crecimiento.

  • 3

    BIODIVERSIDAD E IMPORTANCIA ECOLOGICA DE LOS MANGLARES

    Mxico un pas megadiverso

    Mxico es un pas privilegiado por su biodiversidad y se le ubica en el cuarto lugar

    entre los pases megadiversos; junto con Brasil, Colombia e Indonesia ocupa los

    primeros lugares en todas las listas de diversidad biolgica que se han elaborado

    en el mundo. El concepto de megadiversidad slo se aplica a un nmero muy

    pequeo de pases: aquellos que contienen un porcentaje extraordinario de la

    biodiversidad del planeta. De todos los pases en el mundo, slo 111 se encuentran

    situados, parcial o totalmente, en los trpicos; aproximadamente una docena de

    estos pases cuentan con una gran parte entre 60 y 70% de la diversidad biolgica

    del planeta y de ellos, Mxico es uno de los ms importantes (Mittermeier y Goettsch

    de Mittermeier, 1992). Las caractersticas de Mxico como pas megadiverso

    derivan de la ubicacin geogrfica y de la distribucin orogrfica del territorio

    nacional, que se extiende dentro de dos de las regiones biogeogrficas reconocidas

    en el mundo, la nertica y la neotropical, las cuales se entrelazan en el sur de

    Mxico, abrindose una importante zona para la biodiversidad del planeta.

    Mxico y sus manglares

    Los humedales constituyen uno de los ecosistemas existentes dentro del territorio

    nacional y entre ellos los manglares, que son humedales costeros, ocupan un lugar

    privilegiado por la riqueza natural que encierran y los servicios ambientales que

    prestan; su importante papel ecolgico ha sido reconocido internacionalmente. Los

    manglares son formaciones vegetales en las que predominan distintas especies

    conocidas como mangle, un rbol o arbusto con ramas descendentes que llegan al

    suelo y arraigan en l, y tienen la particularidad de ser plantas resistentes a la

    salinidad del agua.

  • 4

    Los manglares se desarrollan en las planicies costeras de los trpicos hmedos

    cerca de las desembocaduras de ros y arroyos o alrededor de esteros y lagunas

    costeras. Estos ecosistemas sirven de transicin entre los ecosistemas terrestres y

    los ecosistemas marinos. A los manglares se les reconoce como uno de los

    ecosistemas ms ricos del planeta por su productividad; tienen una gran importancia

    econmica y ambiental por el uso que las comunidades rurales les han dado y por

    los servicios ambientales que brindan. En Mxico predominan cuatro especies de

    mangle: Rhizophora mangle (mangle rojo), Laguncularia racemosa (mangle blanco),

    Avicennia germinans (mangle negro, madre de sal) y Conocarpus erectus (mangle

    botoncillo). Es comn encontrarlas asociadas, en un proceso sucesorio

    dependiendo del nivel de las mareas que las inundan o los baan, pero

    estableciendo dominancia de una especie o de una asociacin predominante de dos

    o tres especies dependiendo del lugar en donde se hayan asentado.

    Mangle rojo (Rhizophora mangle)

    El mangle rojo es la especie que generalmente se encuentra en la parte exterior de

    las lagunas y en los bordes de los canales. Es un rbol o arbusto de entre 2 a 25

    metros de altura, que en algunos casos alcanza los 35 metros. Se caracteriza por

    sus races en forma de zancos, races areas, hojas simples y opuestas. Sus flores

    son pequeas de color blanco amarillento, y su fruto comienza su desarrollo an

    prendido del rbol.

    Mangle blanco (Laguncularia racemosa)

    El mangle blanco es un rbol de hasta 20metros de alto con corteza fisurada. Sus

    hojas son de 4 a 10 cm de largo, con tallos rojizos y dos glndulas colocadas en

    ambos lados del tallo. Sus flores son pequeas y numerosas, de color gris

    blanquecino. El fruto es pequeo y un poco aplastado. Su sistema de races es poco

    profundo, algunas veces sobresalen del suelo y se ubican cerca del tronco.

  • 5

    Mangle botoncillo (Conocarpus erectus)

    El mangle botoncillo es un rbol o arbusto con altura entre 5 a 7 metros, de corteza

    fisurada. Tiene inflorescencias que se convierten en fruta agregada, redonda y de

    color castao. Los frutos tienen forma de glbulo y contienen una gran cantidad de

    semillas.

    Mangle negro (Avicennia germinans)

    El mangle negro se distingue por el desarrollo pronunciado de sus races que

    sobresalen del suelo y llegan a alcanzar alturas de 20 cm o ms (pneumatoforos).

    Estos rboles alcanzan hasta 20 metros de altura y tienen corteza exterior gris

    oscura o negra. Sus hojas son verde amarillento, a menudo con vellos y cristales de

    sal en la parte posterior. Las flores son pequeas y blancas, mientras que el fruto

    es ovalado, achatado y velloso.

    Importancia ecolgica de los manglares

    Muchos manglares se desarrollan alrededor de las lagunas costeras, esteros y

    desembocadura de ros y arroyos. En estas reas, a nivel mundial, se llevan a cabo

    importantes actividades pesqueras artesanales que aportan alimento y desarrollo

    econmico a comunidades asentadas en la costa. Asimismo, parte de la actividad

    pesquera de las zonas costeras existe en virtud de que distintas especies que se

    aprovechan comercialmente tuvieron al manglar como zona de crianza y

    crecimiento desde las primeras fases de su ciclo de vida: entre las races de los

    manglares se protegen y alimentan larvas, postlarvas y alevines de peces y

    crustceos. Algunos moluscos, como el ostin de mangle, utilizan las races de los

    manglares para fijarse y desarrollarse hasta alcanzar una talla apta para su

    consumo. Los ecosistemas de manglar son altamente productivos y generan una

    gran cantidad de nutrientes, los cuales son exportados por las mareas a las aguas

    marinas de la franja litoral ms cercana a la costa, donde son aprovechados por

    pastos marinos y una variedad de peces que tienen importancia comercial. De

  • 6

    acuerdo con la FAO cerca del 80% de la captura mundial de peces marinos se

    realiza en la franja costera. Adems, muchas poblaciones de aves acuticas utilizan

    los manglares como zonas de reposo o reproduccin. La pesquera del camarn,

    una de las ms importantes de Mxico, existe gracias a la gran cantidad de lagunas

    costeras que albergan importantes humedales, como reas de manglar y marismas,

    en donde se refugian las postlarvas de camarn y se desarrollan durante varios

    meses hasta alcanzar sus fases juveniles, momento en el cual migran al mar para

    completar su ciclo de vida. Por otra parte, la existencia de los manglares permite

    amortiguar los impactos que el acarreo de tierra por las corrientes de agua de ros

    y arroyos tiene sobre los arrecifes de coral. Junto con las descargas de aguas

    continentales se trasladan tambin diversos tipos de contaminantes generados por

    la actividad humana que son recibidos en las zonas de manglar.

    Los manglares sirven de filtro biolgico y retienen o procesan algunos

    contaminantes: procesan nutrientes en exceso, degradan materia orgnica y

    almacenan algunos residuos utilizados en la agricultura. El exceso de estos

    contaminantes generados por el hombre tambin acabar destruyendo a los

    manglares. El manglar, como recurso forestal, se ha aprovechado alrededor del

    mundo por las comunidades rurales asentadas alrededor de estos ecosistemas para

    producir lea y carbn, como material de construccin en viviendas rurales y en la

    fabricacin de cercos para la delimitacin de los terrenos o el confinamiento de

    animales para el consumo domstico, en la industria de la construccin como

    puntales para las cimbras, en la fabricacin de artes de pesca como los tapos, en

    la elaboracin de espigas y puntales para la locomocin de pequeas

    embarcaciones en zonas someras de las lagunas costeras y los esteros, etc.

    Asimismo, alrededor de los manglares se desarrollan actividades cinegticas y una

    creciente industria asociada al ecoturismo: el avistamiento de aves migratorias, su

    paisaje y la variedad de vida silvestre que albergan, generan corrientes de turistas

  • 7

    que son atrados por la riqueza natural de estos singulares ecosistemas. Los

    manglares juegan un importante papel como barrera natural de proteccin que

    contiene la erosin de vientos y mareas. En aquellos sitios en donde el ecosistema

    de manglar se ha mantenido sano, el impacto de ciclones ha sido menor al de

    aquellos sitios en donde se destruyeron o no existen estas barreras naturales.

    Organismos internacionales como la FAO, el PNUMA y el PNUD reconocen que en

    aquellos sitios en donde el manglar mantena su estructura y funcin, el dao

    provocado por el tsunami que irrumpi en diciembre de 2005 en costas del Ocano

    ndico, fue significativamente menor. Los manglares tambin prestan servicios

    ambientales diversos. En condiciones naturales filtran el agua y permiten el

    abastecimiento de mantos freticos. Son ecosistemas que capturan gases de efecto

    invernadero y actan como sumideros de bixido de carbono. Contribuyen al

    mantenimiento de la lnea de costa y al sostenimiento de las arenas sobre las

    playas. Se debe reconocer entonces que los manglares son ecosistemas que

    aportan importantes servicios ambientales a la diversidad biolgica del planeta. Las

    actividades productivas que desarrolla el hombre tienen que ser compatibles con la

    proteccin y conservacin de los manglares, y deben establecerse estrategias que

    permitan que estos ecosistemas mantengan su estructura y funcin, para brindar

    los servicios ambientales que prestan y que son insustituibles.

  • 8

    Presiones y amenazas a los manglares

    Las actividades humanas, que difieren de pas a pas, constituyen la principal

    amenaza para los manglares. Entre ellas estn las relacionadas con el desarrollo

    urbano, industrial y turstico, as como el desarrollo agrcola, ganadero y acucola,

    que compiten por el suelo en donde se asientan los manglares. As mismo, los

    manglares han recibido presiones por efecto de la contaminacin: desechos slidos

    urbanos, contaminantes industriales, pesticidas y fertilizantes agrcolas, derrames

    de petrleo, etc., as como modificaciones a las condiciones hidrolgicas. Distintos

    estudios a nivel internacional sealan que recuperar un manglar que ha sido

    severamente daado puede tomar muchos aos cuando ello es posible; en muchas

    ocasiones la prdida es total e irreversible. La prdida de los manglares influye

    significativamente en todas las especies que los utilizan para su desarrollo biolgico.

    En particular, se estima que los manglares son determinantes para el desarrollo de

    distintas especies de peces que se capturan comercialmente. De acuerdo con una

    estimacin de la FAO, en 1980 los manglares abarcaban una superficie cercana a

    los 19.8 millones de hectreas de las zonas costeras del mundo, con Indonesia,

    Brasil, Nigeria y Australia como los pases con mayor superficie de manglar. Algunas

    estimaciones sealan que a principios del ao 2000 la superficie global de manglar

    se haba reducido a poco menos de 15 millones de hectreas. Si esta estimacin es

    correcta y la comparamos con las cifras oficiales de FAO, en los ltimos 20 aos se

    habra perdido entonces cerca del 25% de la superficie. Con las presiones

    existentes y si la tendencia contina, estaramos destruyendo uno de los

    ecosistemas representativos de la biodiversidad del planeta.

  • 9

    HIDROCARBUROS

    El trmino hidrocarburos totales de petrleo (TPH) se usa para describir a un grupo

    extenso de varios cientos de sustancias qumicas derivadas originalmente del

    petrleo crudo. En este sentido, los TPH son realmente una mezcla de sustancias

    qumicas. Se les llama hidrocarburos porque casi todos los componentes estn

    formados enteramente de hidrgeno y carbono. Los crudos de petrleo pueden

    tener diferentes cantidades de sustancias qumicas; asimismo, los productos de

    petrleo tambin varan dependiendo del crudo de petrleo del que se produjeron.

    La mayora de los productos que contienen TPH se incendian. Algunos TPH son

    lquidos incoloros o de color claro que se evaporan fcilmente, mientras que otros

    son lquidos espesos de color oscuro o semislidos que no se evaporan. Muchos

    de estos productos tienen un olor caracterstico a gasolina, kerosn o aceite. Debido

    a que en la sociedad moderna se usan tantos productos derivados del petrleo (por

    ejemplo, gasolina, kerosn, aceite combustible, aceite mineral y asfalto), la

    posibilidad de contaminacin ambiental es alta. La contaminacin con productos de

    petrleo estar constituida por una variedad de estos hidrocarburos. Son

    contaminantes frecuentes como la actividad volcnica y porque se emplean en la

    fabricacin de un sinnmero de productos, esto causa que estn presentes con

    regularidad en el agua, suelo, vegetales y hasta en tejidos animales y humanos.

    Reaccin con el medio ambiente

    Los TPH son liberados al ambiente a raz de accidentes, desde industrias o como

    productos secundarios a raz de su uso comercial o privado. Cuando hay escapes

    o derrames de TPH directamente al agua, algunas fracciones de los TPH flotarn

    en el agua y formarn una capa delgada en la superficie. Otras fracciones ms

    pesadas se acumularn en el sedimento del fondo, lo que puede afectar a peces y

    a otros organismos que se alimentan en el fondo. Algunos organismos en el agua

    (principalmente bacterias y hongos) pueden degradar algunas de las fracciones de

    los TPH. Los TPH que son liberados al suelo pueden movilizarse hacia el agua

    subterrnea a travs del suelo. All, los componentes individuales pueden separarse

  • 10

    de la mezcla original dependiendo de las propiedades qumicas de cada

    componente. Algunos de estos componentes se evaporarn al aire y otros se

    disolvern en el agua subterrnea y se alejarn del rea donde fueron liberados.

    Otros compuestos se adherirn a partculas en el suelo y pueden permanecer en el

    suelo durante mucho tiempo, mientras que otros sern degradados por

    microorganismos en el suelo.

    Efectos fticos

    La falta o disminucin de la entrada de luz en el mar a causa de manchas de

    petrleo imposibilita o reduce el rea donde es posible la fotosntesis y por

    tanto, el desarrollo de plantas verdes.

    80% de la actividad fotosinttica y de la absorcin de energa solar se

    produce en los 10 primeros metros de la superficie marina. Ello indica la

    importancia de la entrada de la luz (ese 20% restante) para mantener las

    comunidades fotosintticas de los fondos marinos.

    La falta o disminucin de plantas fotosintticas reduce el aporte de oxgeno

    y alimento al ecosistema.

    La prdida de extensin en la distribucin de algas y otras plantas acuticas

    limita las zonas que proporcionan cobijo a miles de especies marinas. Estos

    lugares son utilizados para larvas de los peces como zonas de alimento

    mientras son sub-adultos.

    El fitoplancton es a su vez el alimento del zooplancton (que adems de

    microorganismos est formado por larvas de peces, moluscos, crustceos,

    etc.) sin fitoplancton, el zooplancton muere y con l se interrumpe el

    crecimiento de un importante nmero de especies, al tiempo que se deja sin

    alimento a un gran nmero de animales marinos.

  • 11

    Efectos txicos

    Las aves que quedan impregnadas de petrleo pierden o ven reducida su

    capacidad de aislarse del agua pudiendo morir por hipotermia. Al intentar

    limpiarse el plumaje con el pico ingieren grandes cantidades de hidrocarburos

    por lo que se envenenan.

    Muerte de los organismos por envenenamiento, sea por absorcin, o por

    contacto.

    Muerte por exposicin a los componentes txicos del petrleo solubles en

    agua.

    Tras desaparecer el petrleo de la superficie, el agua presenta una falsa

    apariencia limpia dado que queda cristalina por la muerte del fitoplancton y

    fauna marina que enturbia el agua.

    Los mamferos marinos pueden sufrir el taponamiento de sus vas

    respiratorias o daos en el tracto respiratorio y su mucosa por efecto de los

    contaminantes qumicos. Tambin ingieren grandes cantidades de

    hidrocarburos por alimentarse de animales contaminados.

    Los quimiorreceptores de muchas especies marinas detectan el petrleo en

    el agua y les hacen variar sus migraciones y movimientos con lo que

    determinadas especies desaparecen o no se acercan al lugar.

    El petrleo se deposita sobre fondos marinos matando o provocando efectos

    sub- letales sobre miles de animales y plantas vitales para el ecosistema.

    Las algas de los fondos y las orillas quedan cubiertas por una fina pelcula

    aceitosa que dificulta la fotosntesis y la reproduccin.

    Los efectos sub- letales de fertilidad, reduccin del nivel de eclosin de

    huevos, alteraciones en su comportamiento y gran cantidad de efectos

    derivados de la toxicidad del vertido.

    Los mejillones y otros moluscos que se adhieren a rocas u objetos, pierden

    su capacidad de adhesin y caen al fondo, perdiendo su capacidad de

    alimentarse.

  • 12

    Causas a la salud

    El petrleo crudo es una compleja mezcla de qumicos, compuesta principalmente

    de hidrocarburos parafenicos, cicloparafenicos, naftenicos, y aromticos, y

    partculas de otros elementos, incluyendo varios metales. Los hidrocarburos del

    petrleo de mayor inters toxicolgico son los compuestos voltiles orgnicos

    (principalmente benceno, tolueno y xileno) y los hidrocarburos aromticos

    polinucleares (HAP).

    Las personas que se encuentran en ambientes contaminados con bajas

    concentraciones de hidrocarburos pueden desarrollar irritacin de ojos, mucosa

    nasal, vas respiratorias altas, garganta y piel. Los pacientes asmticos agravan su

    condicin al tener contacto con este tipo de compuestos. En personas que no tienen

    asma, pueden observarse dificultad para respirar (disnea), tos, espasmo en el

    pecho o respiraciones entrecortadas.

    De particular preocupacin es la exposicin al benceno, tolueno y xileno. Altas

    concentraciones de benceno causan sntomas neurotxicos y una prolongada

    exposicin a niveles txicos puede causar lesin de la medula sea con

    pancitopenia persistente. El benceno es tambin una bien conocida causa de

    leucemia y probablemente de otros tumores hematolgicos.

    Sntomas

    Los sntomas que se presentan por exposicin a hidrocarburos en altas

    concentraciones pueden ser vrtigo, nauseas, vomito, irritacin estomacal,

    somnolencia, taquicardia, cefalea, angustia, confusin, depresin y en algunos

    casos hasta la prdida del conocimiento, convulsiones o muere. Algunos estudios

    recientes han postulado que la exposicin a concentraciones altas de hidrocarburos

    pueden incluso propiciar el impulso suicida en algunas personas.

  • 13

    BIORREMEDIACIN

    El crecimiento de la poblacin y el avance de las actividades industriales a partir del

    siglo XIX trajeron aparejados serios problemas de contaminacin ambiental. Desde

    entonces, los pases generan ms desperdicios, muchos de ellos no biodegradables

    o que se degradan muy lentamente en la naturaleza, lo que provoca su acumulacin

    en el ambiente sin tener un destino seguro o un tratamiento adecuado. De este

    modo, en lugares donde no existe control sobre la emisin y el tratamiento de los

    desechos, es factible encontrar una amplia gama de contaminantes. Habitualmente,

    los casos de contaminacin que reciben mayor atencin en la prensa son los

    derrames de petrleo. Pero, en el mundo constantemente estn sucediendo

    acontecimientos de impacto negativo sobre el medio ambiente, incluso en el entorno

    directo, generados por un gran abanico de agentes contaminantes que son

    liberados al ambiente. Un ejemplo lo constituyen algunas industrias qumicas que

    producen compuestos cuya estructura qumica difiere de los compuestos naturales,

    y que son utilizados como refrigerantes, disolventes, plaguicidas, plsticos y

    detergentes. El problema principal de estos compuestos es que son resistentes a la

    biodegradacin, por lo cual se acumulan y persisten en el ambiente y lo perjudica

    tanto como a los seres vivos, entre ellos el ser humano.

    En las ltimas dcadas, entre las tcnicas empleadas para contrarrestar los efectos

    de los contaminantes, se comenz a utilizar una prctica llamada biorremediacin.

    El trmino biorremediacin fue acuado a principios de la dcada de los 80, y

    proviene del concepto de remediacin, que hace referencia a la aplicacin de

    estrategias fsico-qumicas para evitar el dao y la contaminacin en suelos. Los

    cientficos se dieron cuenta que era posible aplicar estrategias de remediacin que

    fuesen biolgicas, basadas esencialmente en la observacin de la capacidad de los

    microorganismos de degradar en forma natural ciertos compuestos contaminantes.

    Entonces, la biorremediacin surge como una rama de la biotecnologa que busca

    resolver los problemas de contaminacin mediante el uso de seres vivos

  • 14

    (microorganismos y plantas) capaces de degradar compuestos que provocan

    desequilibrio en el medio ambiente, ya sea suelo, sedimento, fango o mar.

    Tipos de biorremediacin

    En los procesos de biorremediacin generalmente se emplean mezclas de ciertos

    microorganismos o plantas capaces de degradar o acumular sustancias

    contaminantes tales como metales pesados y compuestos orgnicos derivados de

    petrleo o sintticos. Bsicamente, los procesos de biorremediacin pueden ser de

    tres tipos:

    Figura 1. Diferentes modos de biorremediacin.

    Degradacin enzimtica

  • 15

    Este tipo de degradacin consiste en el empleo de enzimas en el sitio contaminado

    con el fin de degradar las sustancias nocivas. Estas enzimas se obtienen en

    cantidades industriales por bacterias que las producen naturalmente, o por bacterias

    modificadas genticamente que son comercializadas por las empresas

    biotecnolgicas. Por ejemplo, existe un amplio nmero de industrias de

    procesamiento de alimentos que producen residuos que necesariamente deben ser

    posteriormente tratados.

    En estos casos, se aplican grupos de enzimas que hidrolizar (rompen) polmeros

    complejos para luego terminar de degradarlos con el uso de microorganismos (ver

    en la prxima seccin). Un ejemplo lo constituyen las enzimas lipasas (que

    degradan lpidos) que se usan junto a cultivos bacterianos para eliminar los

    depsitos de grasa procedentes de las paredes de las tuberas que transportan los

    efluentes.

    Otras enzimas que rompen polmeros utilizados de forma similar son las celulosas,

    proteinasas y amilasas, que degradan celulosa, protenas y almidn,

    respectivamente. Adems de hidrolizar estos polmeros, existen enzimas capaces

    de degradar compuestos altamente txicos. Estas enzimas son utilizadas en

    tratamientos en donde los microorganismos no pueden desarrollarse debido a la alta

    toxicidad de los contaminantes. Por ejemplo, se emplea la enzima peroxidasa para

    iniciar la degradacin de fenoles y aminas aromticas presentes en aguas

    residuales de muchas industrias.

    Remediacin microbiana

    En este tipo de remediacin se usan microorganismos directamente en el foco de la

    contaminacin. Los microorganismos utilizados en biorremediacin pueden ser los

    ya existentes (autctonos) en el sitio contaminado o pueden provenir de otros

    ecosistemas, en cuyo caso deben ser agregados o inoculados.

  • 16

    La descontaminacin se produce debido a la capacidad natural que tienen ciertos

    organismos de transformar molculas orgnicas en sustancias ms pequeas, que

    resultan menos txicas. El hombre ha aprendido a aprovechar estos procesos

    metablicos de los microorganismos. De esta forma, los microorganismos que

    pueden degradar compuestos txicos para el ambiente y convertirlos en

    compuestos inocuos o menos txicos, se aprovechan en el proceso de

    biorremediacin. De esta forma, reducen la polucin de los sistemas acuticos y

    terrestres. La gran diversidad de microorganismos existente ofrece muchos

    recursos para limpiar el medio ambiente y, en la actualidad, esta rea est siendo

    objeto de intensa investigacin. Existen, por ejemplo, bacterias y hongos que

    pueden degradar con relativa facilidad petrleo y sus derivados, benceno, tolueno,

    acetona, pesticidas, herbicidas, teres, alcoholes simples, entre otros. Los metales

    pesados como uranio, cadmio y mercurio no son biodegradables, pero las bacterias

    pueden concentrarlos de tal manera de aislarlos para que sean eliminados ms

    fcilmente. Las actividades microbianas en el proceso de biorremediacin se

    pueden resumir en la siguiente figura:

  • 17

    Los microorganismos ingieren contaminantes como fuente de carbono y algunos

    nutrientes como fsforo y nitrgeno. La digestin de este compuesto en sustancias

    ms simples como parte del metabolismo del microorganismo, puede resultar en la

    degradacin del compuesto en forma parcial (transformacin) o total a dixido de

    carbono (CO2) y agua (H2O).

    Fitorremediacion

    La fitorremediacin es el uso de plantas para limpiar ambientes contaminados.

    Aunque se encuentra en desarrollo, constituye una estrategia muy interesante,

    debido a la capacidad que tienen algunas especies vegetales de absorber, acumular

    y/o tolerar altas concentraciones de contaminantes como metales pesados,

    compuestos orgnicos y radioactivos. La fitorremediacin ofrece algunas ventajas y

    desventajas frente a los otros tipos de biorremediacin:

    Ventajas:

    Figura 2 : Metabolismo microbiano

  • 18

    Las plantas pueden ser utilizadas como bombas extractoras de bajo costo

    para depurar suelos y aguas contaminadas.

    Algunos procesos degradantivos ocurren en forma ms rpida con plantas

    que con microorganismos.

    Es un mtodo apropiado para descontaminar superficies grandes o para

    finalizar la descontaminacin de reas restringidas en plazos largos.

    Limitaciones:

    El proceso se limita a la profundidad de penetracin de las races o aguas

    poco profundas.

    Los tiempos del proceso pueden ser muy prolongados.

    La biodisponibilidad de los compuestos o metales es un factor limitante de la

    captacin.

    Las plantas pueden incorporar las sustancias contaminantes mediante

    distintos procesos que se representan en la siguiente ilustracin y se explican

    en la tabla que contina:

  • 19

    Figura 3. Tipos de fitorremediacin, en donde se indica la zona de la planta en donde ocurre

    el proceso.

  • 20

    Tipos de fitorremediacin

    Tipo Proceso Involucrado Contaminacin Tratada

    Fitoextraccin

    Las plantas se usan para concentrar

    metales en las partes cosechables

    (hojas y races)

    Cadmio, cobalto, cromo, nquel,

    mercurio, plomo, plomo selenio,

    zinc

    Rizofiltracin

    Las races de las plantas se usan para

    absorber, precipitar y concentrar

    metales pesados a partir de efluentes

    lquidos contaminados y degradar

    compuestos orgnicos

    Cadmio, cobalto, cromo, nquel,

    mercurio, plomo, plomo selenio,

    zinc istopos radioactivos,

    compuestos fenlicos

    Fitoestabilizacin

    Las plantas tolerantes a metales se

    usan para reducir la movilidad de los

    mismos y evitar el pasaje a napas

    subterrneas o al aire.

    Lagunas de deshecho de

    yacimientos mineros. Propuesto

    para fenlicos y compuestos

    clorados.

    Fitoestimulacin

    Se usan los exudados radiculares

    para promover el desarrollo de

    microorganismos degradativos

    (bacterias y hongos)

    Hidrocarburos derivados del

    petrleo y poliaromticos,

    benceno, tolueno, atrazina, etc.

    Fitovolatilizacin

    Las plantas captan y modifican

    metales pesados o compuestos

    orgnicos y los liberan a la atmsfera

    con la transpiracin.

    Mercurio, selenio y solventes

    clorados (tetraclorometano y

    triclorometano)

    Fitodegradacin

    Las plantas acuticas y terrestres

    captan, almacenan y degradan

    compuestos orgnicos para dar

    subproductos menos txicos o no

    txicos.

    Municiones (TNT, DNT, RDX,

    nitrobenceno, nitrotolueno),

    atrazina, solventes clorados, DDT,

    pesticidas fosfatados, fenoles y

    nitrilos, etc.

    Cuadro 1. Tipos de fitorremediacin

  • 21

    Se conocen alrededor de 400 especies de plantas con capacidad para

    hiperacumular selectivamente alguna sustancia. En la mayora de los casos, no se

    trata de especies raras, sino de cultivos conocidos. As, el girasol (Heliantus anuus)

    es capaz de absorber en grandes cantidades el uranio depositado en el suelo. Los

    lamos (gnero Populus) absorben selectivamente nquel, cadmio y zinc. Tambin

    la pequea planta Arabidopsis thaliana de gran utilidad para los bilogos es capaz

    de hiperacumular cobre y zinc. Otras plantas comunes que se han ensayado con

    xitos como posibles especies fitorremediadoras en el futuro inmediato son el

    girasol, la alfalfa, la mostaza, el tomate, la calabaza, el esparto, el sauce y el bamb.

    Incluso existen especies vegetales capaces de eliminar la alta salinidad del suelo,

    gracias a su capacidad para acumular el cloruro de sodio.

    En general, hay plantas que convierten los productos que extraen del suelo a

    componentes inocuos, o voltiles. Pero cuando se plantea realizar un esquema de

    fitorremediacin de un cuerpo de agua o un rea de tierra contaminados, se siembra

    la planta con capacidad (natural o adquirida por ingeniera gentica) de extraer el

    contaminante particular, y luego del perodo de tiempo determinado, se cosecha la

    biomasa y se incinera o se le da otro curso dependiendo del contaminante. De esta

    forma, los contaminantes acumulados en las plantas no se transmiten a travs de

    las redes alimentarias a otros organismos.

    Uso de organismos modificados genticamente en biorremediacin

    En los ltimos aos, los avances en ingeniera gentica han permitido el desarrollo

    de organismos transgnicos. Y la biorremediacin hace uso de esta nueva

    tecnologa para resolver varios problemas de contaminacin. El futuro promete an

    ms.

  • 22

    Muchos grupos de investigacin estn desarrollando en el laboratorio, plantas y

    microorganismos genticamente modificados para ser mejores agentes de

    biorremediacin, es decir que degraden mejor o ms eficientemente a los agentes

    contaminantes. Por ejemplo, se puede utilizar material gentico de bacterias

    resistentes a metales para insertarlo en el genoma de una planta que, entonces,

    adquirira esta nueva caracterstica.

    Un grupo de investigacin utiliz un gen llamado mera, que codifica para la enzima

    reductasa del ion mercrico, altamente txico, que cataliza su reduccin hasta la

    forma voltil y poco txica de mercurio elemental, gaseoso en condiciones de

    temperatura no muy elevadas. Estos investigadores, consiguieron la transferencia

    del gen bacteriano mera a cultivos de Liriodendro tulipifera (lamo amarillo). El gen

    se expres adecuadamente en ese material vegetal, de modo que las plntulas

    regeneradas germinaron y crecieron vigorosamente en los medios de cultivo, que

    contenan niveles de iones mercurio que son normalmente txicos, siendo capaces

    de captarlo en su forma inica y de reducirlo en el interior de la planta, tras lo cual

    era liberado en la forma gaseosa no txica.

    Esta investigacin ha abierto el camino para que en el futuro sea posible realizar

    plantaciones arbreas transgnicas que, mediante este proceso de fitovolatilizacin

    u otros parecidos, sean capaces de descontaminar terrenos con altos niveles de

    contaminantes. Se estn perfeccionando nuevos mtodos de biotecnologa para el

    tratamiento del agua, que eliminarn los compuestos que contengan fsforo,

    nitrgeno y azufre. Este bioprocesamiento se est extendiendo a varios procesos

    industriales, entre ellos los de las industrias petroqumicas, qumicas y mineras, con

    el uso de bacterias oxidantes.

  • 23

    La biorremediacin mediante bacterias ofrece grandes posibilidades de limpiar y

    descontaminar sistemas complejos y gracias a sus ventajas econmicas y

    ambientales ser una de las tecnologas ms desarrolladas durante este siglo. Se

    estn utilizando cepas especializadas de microorganismos de alta actividad para

    tratar agentes contaminantes en diferentes sectores, como las industrias que utilizan

    catalizadores, las textiles, las curtiembres, el procesamiento de celulosa y almidn,

    la galvanoplastia, la minera, el desengrasado y recubrimiento de superficies y la

    impresin.

    Nuevos desarrollos biotecnolgicos en plantas y bacterias

    Entre los desarrollos biotecnolgicos que se estn llevando a cabo para procesos

    de fitorremediacin se encuentran los siguientes:

    Rizofiltracin para la extraccin de Uranio de aguas subterrneas en

    Asthabula, Ohio, EEUU.

    Rizofiltracin a nivel de cultivo en vitro para detoxificar compuestos fenlicos

    en aguas contaminadas (por ejemplo los derivados de los herbicidas

    tradicionales y contaminantes como el 2,4-D) en la Universidad Nacional de

    Ro Cuarto, Crdoba por el grupo de investigacin de la Dra. Elizabeth

    Agostini.

    Fitovolatilizacin de mercurio (Hg) por medio de plantas transgnicas

    (Arabidopsis thaliana) que fueron transformadas con dos genes provenientes

    de microorganismos que pueden transformar el mercurio inico en mercurio

    ms estable.

    Plantas transgnicas de tabaco con genes provenientes de bacterias que le

    permiten detoxificar TNT y GTN en suelos de campos minados.

    Plantas transgnicas de Arabidopsis thaliana que toleran la acumulacin de

    cadmio, arsnico y mercurio.

    Bacterias Pseudomonas transgnicas que son capaces de degradar

    compuestos txicos que contienen cloro en compuestos menos nocivos.

  • 24

    Microorganismos capaces de degradar TNT, un explosivo de gran potencia

    y muy agresivo para el entorno.

    Bacterias capaces de reducir las formas altamente txicas de mercurio en

    otras menos txicos y voltiles.

    Bacterias que transforman metales del suelo en formas menos txicas o

    insolubles. Por ejemplo: la reduccin de cromo (Cr+6 a Cr+3).

    La utilizacin de la bacteria Deinococcus radiodurans para eliminacin de

    elementos radiactivos presentes en el suelo y aguas subterrneas. Este

    microorganismo es un extremfilo que resiste condiciones extremas de

    radiacin, sequedad, agentes oxidantes y diversos compuestos

    mutagnicos.

    Cianobacterias a las que se le han introducido genes de bacterias

    Pseudomonas con capacidad de degradar diferentes hidrocarburos o

    pesticidas.

  • 25

    ANALISIS DE CASO

    Generalidades del lugar

    Paraso es un municipio del estado mexicano de Tabasco, localizado en la regin

    del ro Grijalva y en la subregin de la Chontalpa. Su extensin es de 577.55 km2,

    los cuales corresponden al 1.5% del total del estado; esto coloca al municipio en el

    decimosptimo lugar en extensin territorial, lo que lo hace el ms pequeo de los

    municipios de Tabasco. En la imagen 1 se muestra la localizacin satelital del lugar

    afectado.

    Foto 1. Vista satelital de la Laguna Mecoacn, laguna Contaminada por Terminal Martima de

    Dos Bocas, ubicada en el municipio de Paraso Tabasco.

    La Laguna Mecoacn est ubicada en el estado mexicano de Tabasco,

    aproximadamente a 85 kilmetros de la capital estatal Villahermosa, en el municipio

    de Paraso, en el golfo de Mxico, la Laguna Mecoacn es un cuerpo de agua salda

    con pequeas islas de exuberante vegetacin de manglar y palmeras, hbitat de

    infinidad de aves acuticas como garzas, gaviotas, y pelcanos, entre otros.

  • 26

    El clima caracterstico es clido hmedo (Tamayo, 1979; Garca, 1974). La

    precipitacin media anual a lo largo de la costa es del orden de 1,500 a 1,800 mm.

    La temperatura media anual es de 26C, con un mximo de 28C en julio, con

    temperatura extrema mxima de 42-43C, la mnima se presenta en enero con 22C

    y la mnima extrema de 10C en invierno. Los meses lluviosos son de junio a

    septiembre, con una precipitacin media de 240 mm, siendo septiembre el mes ms

    lluvioso con precipitacin de 350 mm. Los meses de enero a abril constituyen la

    temporada relativamente seca.

    La evaporacin media anual es de 1,600 mm con un escurrimiento medio anual de

    300 mm, siendo su mximo en octubre y el mnimo en abril (Servicio Meteorolgico

    Nacional, 1970). En los meses invernales, el desplazamiento hacia el S de masa de

    aire fro genera fuertes vientos denominados "nortes".

    Planteamiento del problema

    La situacin ambiental por la actividad petrolera en Tabasco est llegando a una

    situacin insostenible que provoca que los daos en el medio ambiente y el entorno

    natural de los humedales y manglares, sean ya irreversibles, segn lo han

    denunciado diversos organismos ambientalistas, quienes parecen luchar

    infructuosamente contra molinos de viento, para llamar la atencin sobre el

    problema sin que sean escuchados.

    En la Chontalpa, en la zona de Pantanos de Centla, y en la zona costera de

    manglares y cocotales, es recurrente el hecho que las lagunas, los sistemas

    lagunares y los afluentes de los ros estn contaminados por derrames de

    hidrocarburos debido al descuido, accidentes y la falta de mantenimiento en los

    ductos, vlvulas y equipo de perforacin de la paraestatal Petrleos Mexicanos

    (Pemex) imagen 2.

  • 27

    Imagen 2. Manglares de La laguna Mecoacn en el municipio de Paraiso, Tabasco,

    Contaminados por hidrocarburos de PEMEX.

    La explosin ocurrida en el ao 2007, en el quemador instalado en la Terminal

    Martima de Dos Bocas, frente al poblado de Torno largo, derram los

    hidrocarburos hacia la laguna de Mecoacn y el Ro Seco, afectando varias granjas

    de ostin de cra y engorda de peces, as tambin como varios kilmetros de

    manglares, que hasta la fecha no se han podido recuperar.

    Foto 3. Daos a manglares

    Debido a estas afectaciones 12 especies de flora y fauna costeras de la zona

    limtrofe de Comalcalco y Paraso han desaparecido por las afectaciones que tienen

    estos sistemas naturales.

  • 28

    BACTERIAS PSEUDOMONAS EN LA BIORREMEDIACIN DE SUELOS

    CONTAMINADOS CON HIDROCARBUROS

    El proceso de biorremediacin de hidrocarburos, contaminantes del suelo, llevado a

    cabo por Pseudomonas sp est condicionado por factores biticos y abiticos como

    los nutrientes, respiracin, pH, humedad y temperatura propios del microorganismo,

    los cuales al ser modificados limitan o favorecen la capacidad metablica de la

    bacteria y su adaptabilidad con el cambio de posicin de los cidos grasos de la

    membrana celular. La biorremediacin de suelos ha demostrado ser una tecnologa

    eficaz para el tratamiento de la contaminacin por petrleo, debido a que gran parte

    de los componentes del crudo y sus productos refinados son biodegradables. A

    continuacin se describen las condiciones biticas y abiticas que necesitan las

    Pseudomonas para llevar a cabo un adecuado proceso de biorremediacin,

    teniendo en cuenta las caractersticas y propiedades de la bacteria.

    Factores abiticos

    pH

    El pH es un factor qumico importante que influye en la recuperacin de suelos

    contaminados por hidrocarburos, ya que puede afectar principalmente a las

    poblaciones de Pseudomonas y la biodisponibilidad de las fuentes de carbono y

    energa. Este factor se constituye como uno de los indicadores del proceso de

    biorremediacin y aunque las Pseudomonas se pueden adaptar fcilmente a

    condiciones extremas, estas cepas microbianas tienen un determinado rango de

    tolerancia. El rango ptimo para la biodegradacin est entre 68 pH.

    Humedad y temperatura

    Las Pseudomonas spp son bacterias que requieren unas condiciones mnimas de

    humedad para su crecimiento; el agua es importante para su desarrollo porque

  • 29

    acta como medio de transporte de nutrientes y oxgeno a la clula ya que forma

    parte de su protoplasma bacteriano. Es conveniente mantener una humedad del

    orden del 25- 75 % de la capacidad de campo, la cual se define como la masa de

    agua que admite el suelo hasta la saturacin, que depende de cada tipo de suelo.

    En climas tropicales es mejor una temperatura aproximadamente de 30 a 35 C para

    la actividad de las Pseudomonas. Las Pseudomonas spp. responden a cambios

    ambientales modificando su composicin de cidos grasos de la membrana celular

    que le permite mantener la homeoviscosidad ante situaciones de estrs y su

    posterior adaptabilidad. Adems, los cambios de temperatura las Pseudomonas

    spp. presentan un incremento de la insaturacin de cidos grasos con la disminucin

    de esta con el fin de mantener la fluidez de la membrana, y ante el aumento de

    temperatura hay un incremento de cidos grasos saturados y una disminucin de

    los cidos grasos insaturados, demostrando de esta manera que las Pseudomonas

    spp. son microorganismos euritrmicos, es decir, microorganismos capaces de

    adaptarse a los cambios, lo cual hace que estas bacterias sean las mejores aliadas

    en la aplicacin de la biorremediacin de suelos contaminados con hidrocarburos

    en diferentes condiciones ambientales de temperatura.

    Factores biticos

    Suelo

    Los contaminantes del petrleo se alojan principalmente en el horizonte A, donde

    se encuentra el mayor contenido de materia orgnica que incluye a los

    microorganismos que pueden ser estimulados por la adicin de nutrientes, ya sean

    fertilizantes, o de Oxgeno por medio de la agitacin. Existen otros tipos de

    contaminantes como los hidrofbicos que se absorben y se depositan en los poros

    del suelo, dificultando la biodegradacin.

  • 30

    Los suelos expuestos a la contaminacin prolongada con hidrocarburos derivados

    del petrleo, constituye un microhbitat adecuado para la evolucin de especies

    bacterianas degradadoras. El contaminante ejerce una presin sobre la poblacin

    microbiana involucrada y de esta forma se seleccionan aquellos capaces de

    sobrevivir y adaptarse a estas condiciones.

    Nutrientes

    Los nutrientes son uno de los factores ms relevantes por ser sustancias qumicas

    necesarias para la actividad microbiana y metablica de la Pseudomonas spp, por

    lo que estos constituyentes se deben encontrar disponibles para su asimilacin y

    sntesis, y deben ser controlados para aumentar la eficiencia y el buen desarrollo de

    la biorremediacin. Se dividen en dos grandes grupos: macronutrientes y

    micronutrientes

    Respiracin y aireacin

    La biorremediacin es fundamentalmente un proceso metablico de transferencia

    de electrones. La energa necesaria para el crecimiento microbiano se obtiene

    durante el proceso de oxidacin de materiales reducidos, donde las enzimas

    microbianas catalizan la transferencia de los electrones. Este proceso se denomina

    respiracin microbiana, y se basa en que en la cadena respiratoria, o

    transportadora de electrones de las clulas, producen una serie de reacciones de

    xido-reduccin cuyo fin es la obtencin de energa.

    Capacidad metablica del microorganismo

    En el proceso de biorremediacin la degradacin efectuada por la Pseudomonas,

    se debe tener en cuenta que al ser parte de una poblacin nativa, est interactuando

    con otros microorganismos formando los llamados consorcios microbianos.

  • 31

    Rutas metablicas de bacterias Pseudomonas en medios carbonatos

    El gnero Pseudomonas representa un grupo grande e importante de bacterias

    Gram Negativas el cual incluye especies de gran versatilidad metablica as como

    de propensin patolgica, de ah su importancia tanto clnica como ambiental. El

    inters de estas bacterias se ha reflejado en el gran nmero de publicaciones de

    investigacin y libros sobre este tema.

    Existen dos lados opuestos sobre la reputacin de este gnero, uno afamado y otro

    desacreditado. La buena reputacin del genero Pseudomonas se ha reforzado

    debido al gran nmero de artculos publicados, en donde se enfatiza la notable

    capacidad de estos microorganismos para degradar una gran cantidad de

    compuestos orgnicos, Tales referencias sobre propiedades saprofitas han llegado

    a tomar un lugar preponderante en los publicaciones relacionadas con aspectos

    bioqumicos, ecolgicos, fisiolgicos, genticos y biotecnolgicos. La reputacin es

    bien merecida, no solo porque las Pseudomonas realmente usan gran cantidad de

    compuestos que pueden ser tanto sustratos como intermediarios de rutas

    metablicas conocidas, sino porque la lista frecuente incluye compuestos

    aromticos, derivados halogenados y una variedad de residuos orgnicos

    recalcitrantes que rara vez son degradados o pobremente degradados por otros

    grupos microbianos.

    El aspecto que desacredita a las Pseudomonas se representa porque algunas

    especies tienen importancia fitopatognica y otras son patgenos de humanos y

    animales. Muchos tienen capacidad intrnseca de tolerancia de agentes txicos,

    frecuentemente apoyados por genes contenido en plsmidos, conocidos como

    factores de resistencia, los cuales codifican para sistemas de resistencia a

    antibiticos, metales pesados y una variedad de agentes txicos tanto fsicos como

    qumicos. Estas propiedades se han intensificado por el uso excesivo de antibiticos

    en humanos y en medicina veterinaria.

  • 32

    Las especies de Pseudomonas contienen plsmidos que son principalmente

    catablicos, con genes que codifican para enzimas involucradas en la degradacin

    de una amplia variedad de compuestos que generalmente no son metabolizados

    por otro grupo de bacterias. Algunos plsmidos catablicos y de resistencia pueden

    ser trasferidos a otras bacterias Gram negativas por conjugacin, por tanto

    representan un depsito valioso de material gentico perteneciente a grupos

    fitogeneticamente distantes, por o cual es interesante resaltar que la resistencia a

    factores fuertemente selectivos tales como antibiticos, diversos agentes

    antibacterianos y sistemas de degradacin de compuestos txicos parecen estar

    codificados por genes localizados en elementos extracomosomales. Las especies

    Pseudomonas son una fuente extremadamente rica en plsmidos catablicos y de

    resistencia lo cual aumenta el inters sobre estos organismos desde el punto de

    vista de aplicaciones biotecnolgicas.

    Varias especies del gnero Pseudomonas participan activamente en el ciclo del

    carbono en la naturaleza, por lo que se les considera entre los organismos aerobios

    ms verstiles en la degradacin de muchos compuestos orgnicos.

    Las bacterias Pseudomonas tienen la capacidad de biodegradar hidrocarburos del

    petrleo, tales como hidrocarburos aromticos policclicos incluyendo naftaleno,

    hidrocarburos aromticos como el tolueno e hidrocarburos alifticos como n-alcanos

    y estos se encuentran relacionados con los plasmiodos catablicos OCT, NAH y

    TOL.

  • 33

    Ruta metablica de oxidacin terminal de n-alcanos por Pseudomonas

    Los n-alcanos son el grupo ms abundante de compuestos encontrados en el

    petrleo crudo, estos compuestos pueden ser biodegradados aerbicamente por

    diferentes rutas. La degradacin de n-alcanos de cadena media por Pseudomonas

    putida, la cual contiene al plsmido OCT, es iniciada por alcano hidroxilasas. La

    oxidacin del grupo metilo de n-alcanos por alcano hidroxilasa produce n-alcanoles

    que son posteriormente oxidado por alcohol deshidrogenasa unida a la membrana,

    a n-alcanales los cuales son subsecuentes transformados a cidos grasos y a acetil-

    CoA por aldehdo deshidrogenasa y acetil-CoA sintetasa respectivamente, se ha

    reportado tambin una ruta de degradacin de n-alcanos produciendo alcoholes

    secundarios en la cual los n-alcanos son oxidados por monoxigenasas a alcoholes

    secundarios, despus a cetonas y finalmente a cidos grasos, como se muestra en

    la siguiente figura.

  • 34

    Ruta metablica de oxidacin subterminal de n-alcanos

    Ruta metablica de degradacin de n-alcanos alquil hidroperoxidasa

    Ruta metablica de degradacin de ciclohexano

  • 35

    Ruta metablica de degradacin de tolueno por P. putida TOL, P. putida, P.

    mendocina KR1 y P. pickettii PKO

    La degradacin de compuestos aromticos, como el tolueno, puede seguir cinco

    rutas diferentes en las que se incluyen bacterias de las cuales cuatro incluyen

    Pseudomonas. En la ruta codificada por el plsmido TOL el tolueno es

    sucesivamente degradado a alcohol becilico, benzoato y cateo. La primera etapa

    de la degradacin del tolueno por Pseudomonas putida es la introduccin de dos

    grupos hidroxilo en la molcula formando cis-tolueno dihidrodiol, este intermediario

    es convertido a 3-metilcatecol. Pseudomonas mendocina KR1 convierte el tolueno

    a p-cresol por la accin de tolueno-4-monoxigenasa, seguido por la formacin de p-

    hidroxigenasa atreves de la oxidacin del metilo de la cadena lateral. Pseudomonas

    pickettii PKO1 oxida el tolueno por accin de tolueno-3-monoxigenanda a mecresol,

    el cual posteriormente oxidado a 5-metilcatecol por otro monoxigenasas.

  • 36

    Crecimiento Microbiano en la Biorremediacin de Suelo Contaminado con

    Hidrocarburos

    La biodegradacin es el proceso de la digestin, asimilacin, y metabolizacin de

    un compuesto orgnico, llevado a cabo por bacterias, hongos, protozoos y otros

    organismos. Este proceso de biodegradacin incluye las siguientes reacciones:

    oxido-reduccin, procesos de adsorcin e intercambio de iones, y reacciones de

    quelacin de formacin de complejos que dan lugar a la fijacin de metales. Para

    estos procesos se deben tener en cuenta algunos nutrientes para que se pueda

    completar la ruta metablica. Para el suelo contaminado con hidrocarburos se utiliza

    una biodegradacin aerobia que se describe de la siguiente forma:

    + + +

    Los hidrocarburos son compuestos orgnicos formados por carbn e hidrgeno, los

    cuales pueden existir en forma de cadenas lineales ramificadas o bien, formando

    anillos. Teniendo en cuenta esto, tambin tienen la posibilidad de ser degradados a

    una estructura molecular ms simple, dependiendo del proceso que se le aplique.

    As mismo se ha encontrado que una gran variedad de bacterias, hongos, levaduras,

    ciertas cianobacterias y algas verde azules son capaces de degradar hidrocarburos

    entre ellos las bacterias.

    La degradacin microbiana es una de las principales rutas, mediante la cual, los

    hidrocarburos son removidos de ambientes contaminados. Esta depende de la

    cintica del crecimiento, que est determinada por la curva de crecimiento

    microbiano. Esta tiene 4 fases establecidas. Las cuales son: fase de latencia, en la

    que se presenta una adaptacin al medio y se preparan las enzimas para degradar

    compuestos. Luego sigue la fase exponencial o de crecimiento, donde comienza la

    divisin celular y reproduccin de los microorganismos, esta fase depende de las

  • 37

    condiciones que tenga el medio para su crecimiento y del tiempo de duplicacin

    celular de cada especie. Despus se presenta la fase estacionaria, all la poblacin

    se mantiene constante. Ya que el tiempo de duplicacin es igual a la vida media. Y

    por ltimo esta la fase de muerte, all el nmero de muertes es mucho mayor al de

    divisiones la curva de crecimiento microbiano como se aprecia la siguiente figura.

    Figura 4. Fases de crecimiento microbiano

    Para la construccin de la curva de crecimiento se desarrollara por la cuenta de

    bacterias hidrocarbonoclastas. Con las repeticiones que se determinen ser posible

    conocer cul ser el desarrollo de las bacterias en la biorremediacin y el tiempo en

    que se demorar la biorremediacin, durante las primeras semanas se sugiere

    realizar la cuenta bacteriana cada 3 das ya que se encontrara la fase de latencia y

    es necesario identificar en qu momento o tiempo iniciar la fase exponencial es por

    ello la sugerencia de las primeras semanas realizar la cuenta cada 3 das, una vez

    identificado la fase exponencial se procede al conteo cada semana. A continuacin

  • 38

    se presenta el mtodo para la cuenta microbiana en la biorremediacin de suelo

    contaminado con hidrocarburos.

    Determinacin de bacterias hidrocarbonoclastas por dilucin en placas

    (Bossert I. D. y Kosson D. S. 1997).

    Las bacterias hidrocarbonoclastas son aquellas capaces de crecer en presencia de

    hidrocarburos como nica fuente de carbono y energa. En suelos contaminados, la

    biodegradacin es un proceso donde la actividad metablica de organismos vivos,

    principalmente microorganismos, degrada a los contaminantes orgnicos en

    compuestos ms simples y/o menos txicos, y en el mejor de los casos los

    mineraliza (transforma en CO2 y H2O). La cuenta microbiana provee evidencia de

    la presencia de grupos determinados de microorganismos cuando se utiliza un

    medio de cultivo especfico, y es usado como indicador del potencial de

    biodegradacin de un suelo en particular.

    El conteo de poblaciones microbianas por dilucin en placa es un mtodo simple y

    rpido para la cuenta viable de clulas microbianas en el suelo. Sin embargo, la

    cuenta obtenida es generalmente 10 a 100 veces menos que aquella determinada

    por cuenta directa por microscopia. Las razones para esta discrepancia incluyen la

    exclusin de la cuenta no viable directamente en el suelo y la inhabilidad para

    proveer apropiados nutrimentos en el medio de crecimiento, para obtener la cuenta

    total en placa.

    El mtodo para el aislamiento y cuenta de las bacterias hidrocarbonoclastas del

    suelo es por la tcnica de cuenta por dilucin en placa, utilizando un medio mineral

    basal. El sustrato utilizado para este mtodo debe ser ligero (voltil), ya que el

    acceso de esta fuente de carbono y energa esa travs de los vapores que se

    generan de ella.

  • 39

    Medio mineral basal.

    Componente Cantidad Agua destilada 1 L

    Fosfato de potasio monobsico KH2PO4 0.4 g

    Fosfato de potasio dibsico K2HPO4 1.6 g

    Cloruro de amonio NH4Cl 1.5 g

    Cloruro de magnesio sextahidratado MgCl2 6H2O 0.17 g

    Sulfato de sodio heptahidra tado NaSO4 7H2O 1.5 g

    Cloruro de calcio dihidratado CaCl2 2H2O 0.045 g Solucin mineral 1.0 ml

    Tabla 1. Componentes del medio mineral basal

    Nota: La solucin mineral se agrega despus de esterilizar.

    Solucin mineral

    Compontes Cantidad Agua destilada 1 L

    Cloruro de calcio dihidratado MgCl2H2O 5.1 g

    Cloruro de manganeso monohidratado MnCl2H2O 0.66 g Cloruro de sodio NaCl 1.0 g

    Cloruro frrico sextahidratado FeCl3 6H2O 1.0 g

    Cloruro de calcio dihidratado CaCl2 2H2O 0.1 g

    Cloruro de cobre CuCl2 0.01 g

    Cloruro de zinc ZnCl2 0.08 g

    Cloruro de aluminio AlCl3 0.05 g

    Acido brico H3BO3 0.01 g

    Molibdato de sodio dihidratado Na2MoO4 2H2O 0.04 g Tabla 2. Componentes de la solucin mineral

    El fundamento es el de dilucin en placa, basado en la capacidad de los

    microorganismos hidrocarbonoclastas de poder utilizar a los hidrocarburos como

    fuente de carbono y energa, cuando crecen en un medio con estas caractersticas

    de seleccin. El petrleo ligero que se impregna en un papel filtro permite que las

    bacterias hidrocarbonoclastas se alimenten de los hidrocarburos voltiles, o la

    adicin de un hidrocarburo en solucin asperjando la superficie de la caja ya

    inoculada.

  • 40

    Mtodo y equipos

    Tubos de vidrio de 15 ml para cultivo con 9 ml de solucin salina 0.85%

    estril.

    Matraz Erlenmeyer con tapa con 99 ml de solucin salina 0.85% estril.

    Pipetas de 1 ml y de 0.2 ml, estriles.

    Vrtex.

    Balanza.

    Esptulas.

    Campana de flujo laminar o rea estril.

    Cajas de Petri.

    Muestra de suelo.

    Incubadora.

    Papel aluminio estril.

    Matraces o botellas de cultivo 1 L.

    Agitador magntico.

    Varilla para expandir muestra.

    Papel filtro estril.

    Autoclave.

    Soluciones y reactivos

    1) Solucin salina 0.85% estril. Adicionar 8.5 g de cloruro de sodio (NaCl) en

    1 L de agua destilada.

    2) Cajas de Petri con medio de cultivo adecuado para el crecimiento.

    3) Etanol (CH3-CH2-OH).

    4) Agua destilada.

  • 41

    5) Agar noble (libre de impurezas).

    6) Medio mineral basal (Tabla 1).

    7) Solucin mineral (Tabla 2). Disolver en un litro de agua destilada cada uno

    de los componentes y esterilizar por filtracin.

    8) Petrleo crudo ligero estril. Esterilizar el petrleo crudo tres veces a 110C

    durante una hora, dejando entre cada esterilizacin un da a temperatura

    ambiente.

    Procedimiento

    1) Preparar el medio de cultivo con los componentes del medio mineral basal,

    disolvindolas en el orden sealado en un litro de agua destilada.

    2) Ajustar el pH a 7.0, despus adicionar 15 g de agar puro (agar noble).

    3) Esterilizar a 15 lb/15 min. Dejar enfriar, cuando el medio se encuentre a 50C

    aproximadamente, aadir la solucin mineral estril previamente preparada

    (1 ml por L de medio).

    4) Vaciar el medio en cajas de Petri en condiciones estriles, esperar a que

    gelifique.

    5) En un disco de papel filtro estril impregnar de petrleo que est en el

    sustrato y colocarlo en la parte interna de la tapa de la caja de Petri. El

    hidrocarburo que se volatiliza servir como fuente de carbono y energa.

    Preparacin de la muestra

    1) En condiciones estriles (trabajar en campana de flujo laminar), adicionar 1

    g del suelo a una botella de dilucin o matraz con tapa de rosca con 99 ml de

    solucin salina isotnica estril (dilucin 10-2). Dispersar el suelo y

    homogeneizar con agitacin vigorosa en vrtex.

    2) Tomar 1 ml y transferirlo a un tubo con 9 ml de solucin salina estril (dilucin

    10). De ah se hacen diluciones sucesivas hasta completar diluciones

    decimales hasta 10-10 las adecuadas, asegurndose de utilizar una punta o

  • 42

    pipeta estril diferente en cada paso. Agitar de forma constante con vrtex

    en cada paso.

    3) Tomar 0.1 ml de la dilucin seleccionada y colocarla en el centro de la

    superficie del medio de cultivo seleccionado para el crecimiento. Realizar

    esto por triplicado y con tres diluciones prximas (ej. 10-3, 10-4 y 10-5) para

    asegurar la cuenta.

    4) Extender la alcuota en la superficie de la placa con una varilla de vidrio

    previamente esterilizada (inmersa en alcohol y pasndola por la flama del

    mechero permitiendo su enfriamiento). Asegurar una distribucin homognea

    por toda la superficie del medio.

    5) Incubar las placas de forma invertida a 30C en ausencia de luz.

    6) Despus de cinco das de incubacin, proceder al conteo de colonias.

    7) Para el clculo final de unidades formadoras de colonias (UFC) se debe

    considerar la dilucin con que se inocul la caja, la cantidad de inculo (0.1

    ml) y la humedad de la muestra.

  • 43

    Clculos

    Contar slo aquellas cajas (diluciones) que contengan de 30 a 300 colonias. Con la

    siguiente ecuacin calcular las UFC/g s.s.

    UFC/g s.s. = (NC * 1/FD * 1/ V) / (P * FH)

    Donde:

    UFC/ g s. s. = unidades formadoras de colonias / g de suelo seco.

    NC = nmero de colonias en una caja.

    FD = factor de dilucin que corresponde a la dilucin de donde se tom la muestra

    con lo que se inocula la caja (10-2 a 10-10).

    V = volumen inoculado en la caja = 0.1 ml.

    P = peso de la muestra hmeda = 1 g.

    FH = factor de correccin de humedad (1-(%humedad/100)).

    Fases del crecimiento microbiano durante la Biorremediacin de Suelo

    Contaminado con Hidrocarburos

    Con este mtodo se podr conocer el crecimiento microbiano durante el proceso de

    biorremediacin, plasmando los resultados de cuenta de Unidades Formadoras de

    Colonias de bacterias hidrocarbonoclastas degradadoras de hidrocarburos. Se

    podr construir la curva de crecimiento microbiano en las 4 fases establecidas:

  • 44

    La fase de latencia ser la mayor monitoreada o con ms repeticiones; como se

    mencion se determinaran las cuentas de bacterias hidrocarbonoclastas cada 3

    das para cocer el tiempo en que pasara a la siguiente fase, ya que en esta fase es

    cuando las bacterias Pseudomonas sp estn en proceso de adaptacin.

    Luego sigue la fase exponencial o de crecimiento, donde comienza la divisin

    celular y reproduccin de los microorganismos, en cuanto ms aumente la cantidad

    de bacterias en el sistema menor ser el tiempo del proceso de biorremediacin, de

    igual forma se controlaran los factores para el crecimiento contine en alza. Cuando

    llegue el momento en que disminuye o se detiene el crecimiento es posible que se

    est pasando a la siguiente fase.

    La fase estacionaria, all la poblacin se mantiene constante. Es cuando mayor

    control de los factores se tendr para que esta fase perdure por el mayor tiempo

    posible y las bacterias hidrocarbonoclastas en especial las Pseudomonas sp.,

    puedan desempear su trabajo en las condiciones requeridas. Esta fase se

    desempea ya que el tiempo de duplicacin es igual a la vida media, en caso de

    que esta fase no se mantenga por mucho tiempo es posible de que se haya tenido

    un descuido en el control de los factores originando una baja del rendimiento de las

    bacterias. Pero si la concentracin HTP disminuye es posible que inicie una baja de

    las bacterias por carecer de fuente de energa y de paso a la siguiente fase.

    La fase de muerte, es cuando las bacterias mueren por no haber fuente de alimento

    el cual es el hidrocarburo, es decir que los que las bacterias desempearon un buen

    trabajo en transformar el contaminante en compuestos ms simples.

  • 45

    Control de los factores cinticos durante la Biorremediacin

    En la siguiente tabla se presentan los factores a controlar durante la

    biorremediacin, en caso de no controlarlos es posible de que el saneamiento del

    suelo no se desarrolle correctamente, teniendo en cuenta controlar los factores.

    Parmetro

    Criterio de

    Si se encuentra

    Si se encuentra

    Propsito

    por arriba del

    por debajo del

    que medir seleccin

    limite

    limite

    Determinar la Agregar mayor

    naturaleza y

    Cantidad de

    HTP

  • 46

    CONCLUSIN

    Podemos concluir que mediante el avance biotecnolgico en la biorremediacion con

    el uso de plantas, algas, hongos, y microorganismos modificados son tcnicas

    sumamente promisoria para el saneamiento y restauracin de lugares afectados por

    derrame de hidrocarburo. Los hbitats ultramaficos o serpenticolas donde se

    encuentran plantas acumuladores de metales pesados, se caracterizan por un alto

    nivel de diversidad y elevado ndice de endemismo El uso de estas tcnicas y los

    microorganismos rizosfricos puede ser una estrategia de saneamiento ambiental

    en cualquier lugar as como el uso de microorganismos modificados

  • 47

    BIBLIOGRAFIA

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  • 49

    ANEXOS

    Anexo I. Determinacin de la concentracin de hidrocarburos totales del

    petrleo (HTP) en el suelo.

    d) Preparacin de muestras de suelo para extraccin

    Aunque el anlisis de hidrocarburos puede hacerse con muestras hmedas, se

    recomienda secarlas y molerlas para obtener muestras ms homogneas. El

    secado de suelo para extraccin se lleva a cabo de la siguiente forma.

    Material

    Esptula.

    Mortero.

    Papel aluminio.

    Frascos de vidrio de 30 ml. Procedimiento

    1) Poner a secar la muestra (8-15 g de suelo) extendida en un papel aluminio a

    30C, durante 48 horas, en un cuarto de temperatura controlada o a la

    sombra.

    2) Moler la muestra en un mortero hasta obtener partculas finas.

    3) Colocar la muestra seca en un frasco seco y limpio.

    e) Extraccin de hidrocarburos por reflujo (Soxhlet)

    (D5369-93 de la ASTM, 2003 y 3540C y 3541 de la US EPA, 1996, 1994).

    Este mtodo consiste en extraer los hidrocarburos contenidos en el suelo, mediante

    la accin de un solvente orgnico voltil apropiado, que es reflujado a travs de la

    muestra varias veces durante un tiempo determinado. El solvente es evaporado y

    posteriormente condensado en un refrigerante, se le hace pasar por la muestra y se

  • 50

    le regresa al origen para ser nuevamente evaporado. La muestra slida es mezclada

    con sulfato de sodio anhidro para eliminar el agua residual, se le coloca en un dedal

    o cartucho de papel o fibra de vidrio y se usa un solvente orgnico apropiado para

    su extraccin en un equipo Soxhlet.

    Material y equipo

    Equipo de reflujo Soxhlet de 250 ml.

    Perlas de ebullicin.

    Cartuchos de celulosa o fibra de vidrio.

    Balanza analtica.

    Vaso de precipitados 250 ml.

    Viales.

    Esptula. Reactivos

    Sulfato de sodio anhidro (Na2SO4). Diclorometano (cloruro de metileno, CH2Cl2) grado HPLC.

    Procedimiento

    1) Colocar de 5 a 10 g de suelo seco y finamente molido en un cartucho de

    celulosa o fibra de vidrio.

    2) Adicionar sulfato de sodio anhidro en una relacin suelo:sulfato 1:1 y mezclar.

    3) Colocar cada cartucho conteniendo las muestras dentro de la camisa o

    columna extractora del equipo Soxhlet.

    4) Adicionar 125 5 ml de diclorometano en el matraz de bola y colocar

    suficientes perlas de ebullicin para evitar la proyeccin del solvente al

    calentarse.

    5) Ensamblar el equipo Soxhlet e iniciar calentamiento hasta alcanzar una temperatura de 45C.

    6) Mantener el reflujo en estas condiciones durante 8 horas, de tal manera que

    se efecten entre 6 y 8 reflujos por hora, lo que permitir la liberacin de los

    analitos.

  • 51

    7) Despus de 8 horas, el extracto orgnico contendr todos los hidrocarburos

    solubles en diclorometano. Pasar el matraz bola a un rotoevaporador y

    concentrar el extracto orgnico a sequedad.

    8) Recuperar el concentrado en un vial de 40 ml con tapn de tefln para su cuantificacin.

    Cuantificacin de hidrocarburos por el mtodo gravimtrico de

    Asfltenos. (ASTM D6560, 2000).

    Este mtodo se basa en la propiedad de los asfltenos de ser insolubles en algunos

    solventes (hexano, por ejemplo), mientras que las otras fracciones de los

    hidrocarburos totales del petrleo no lo

    son, facilitando con esto la separacin de estos compuestos. Los asfltenos, por ser

    insolubles, precipitan formando un slido negro que puede pesarse al eliminar el

    hexano con los hidrocarburos solubles en l.

    Material y equipo

    Matraz de bola de 250 ml.

    Viales o tubos de vidrio de 25 ml.

    Pinzas para matraces de bola viales o tubos de vidrio.

    Balanza analtica.

    Pipeta de 10 ml.

    Jeringa de vidrio de 20 ml.

    Portamembrana de acero inoxidable.

    Filtros de fibra de vidrio GF/C Whatman.

    Sonicador.

    Rotoevaporador. Reactivos Hexano (CH3 (CH2)4CH3) grado HPLC.

  • 52

    Procedimiento

    1) Poner a peso constante el recipiente donde se colocar el extracto orgnico

    obtenido (matraz de bola para la extraccin, vial o tubo de vidrio).Colocar el

    recipiente en la estufa a 120C durante 4 horas. Sacar este material y

    colocarlo en un desecador para que se enfre. Pesar el

    recipiente, despus colocarlo otra vez dentro de la estufa y volver a realizar

    el procedimiento hasta que el peso no cambie. Anotar el peso del recipiente

    (RA).

    2) Una vez que el extracto orgnico obtenido est en un matraz de bola, tubo o

    vial de vidrio a peso constante, se procede a la evaporacin total del solvente

    (diclorometano) en un rotoevaporador hasta sequedad, y pesar.

    3) La muestra extrada libre de solvente se debe resuspender con hexano: 60

    ml para el mtodo de extraccin por reflujo (Soxhlet) o 5 ml para el mtodo

    de extraccin, agitacin y centrifugacin. Con este solvente precipitarn los

    asfltenos insolubles en hexano (fraccin pesada de los hidrocarburos).

    4) Dejar reposar la muestra en hexano de 12 a 24 horas o bien colocarla en un

    sonicador de 15 a 30 minutos para acelerar la precipitacin de asfltenos

    (slido negro).

    5) Cuando los asfltenos (insolubles en hexano) se observen en el fondo del vial o tubo, se

    procede a separar el precipitado mediante filtracin; tomando el extracto

    orgnico con una jeringa y pasndolo a travs de un filtro de fibra de vidrio a

    peso constante (FFV), que se

    coloca en un portamembranas de acero inoxidable. Una vez que se hizo

    pasar el contenido total del extracto, el filtro de fibra de vidrio se deja secar y

    se pesa (FBVS) para la cuantificacin de asfltenos (AF) retenidos en l.

    6) Pesar el recipiente (matraz de bola, vial o tubo) donde estaba el extracto con

    hexano y asfltenos (RB).

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    Clculos La cantidad de asfltenos se calcula mediante un balance de slidos obtenidos tanto

    en el recipiente (AR) como en el filtro de fibra de vidrio (AF). Para hacer el clculo de

    concentracin de asfltenos provenientes de la muestra se debe considerar la

    cantidad de suelo que se pes para la extraccin, as como la humedad de la

    muestra. El resultado se expresa en mg de asfltenos/kg de suelo seco y se calcula

    de la siguiente manera:

    AF (mg) = FBVS FFV Donde: AF (mg) = asfltenos contenidos en el filtro de fibra

    de vidrio (mg). FBVS = peso (mg) del filtro de fibra de

    vidrio a peso constante. FFV = peso (mg) del filtro de fibra de vidrio seco por donde se pasa el extracto

    orgnico con hexano y asfltenos.

    AR (mg) = RB RA. Donde: AR (mg) = asfltenos contenidos en el

    recipiente (mg). RA = peso (