JUSTIFICACINTanto el ser humano como los animales al no poder producir por s mismo las vitaminas se ve en la necesidad de ingerirlas, debido a que son indispensables en el metabolismo del ser vivo por ende su importancia. En la actualidad gracias a su descubrimiento se ha podido contener la mortandad por anemia a nivel nacional los casos de depresin han disminuido al tratarse con dosis de este tipo de vitamina la cual se encuentra involucrada en la mayora de las funciones bioqumica del cuerpo.La vitamina B12 o cianocobalamina pertenece a un grupo de molculas grandes y complejas, conocidas como cobaltocorrinides. Debido a sus implicaciones en reacciones bioqumicas importantes, como sntesis de protenas y cido nucleicos y el metabolismo de carbohidratos, la vitamina B12 ha originado gran inters y tiles aplicaciones en la salud y alimentacin de los hombres y animales (Bykhovskii et al., 1991: Spalta et al 1989). Dada la complejidad de su sntesis qumica, actualmente ella es producida exclusivamente por va biosinttica, principalmente por bacterias de los gneros Pseudomonas y Propionibacteriun, que presentan alta productividad y rpido crecimiento (Quesada-Chanto et al 1998: Ye et al 1996: Fa et al, 1984).La vitamina B12 es una de las vitaminas B esenciales para mantener el cuerpo sano. Tambin conocida como cobalamina, la vitamina B12 es necesaria para: Convertir los carbohidratos, las grasas y las protenas de los alimentos en energa. Sntesis de ADN Ayudar en la formacin de glbulos rojos sanos Mantener el funcionamiento del sistema inmune en su nivel mximo. Crear la cubierta protectora de todas las clulas nerviosas en el cuerpo.

INTRODUCCINLas vitaminas son sustancias orgnicas extremadamente necesarias para el funcionamiento de muchas formas de vida, incluyendo la humana (Florent, 1986). Gran parte de los microorganismos vivos no pueden sintetizarlas y deben, de esta forma, obtenerlas de fuentes externas.La vitamina B12 fue descubierta como resultado de investigaciones sobre anemia megaloblstica. Su aislamiento se dio en 1948, pero su sntesis qumica completa slo fue obtenida en 1973. Sin embargo, debido al gran nmero de etapas involucradas, el procedimiento no alcanz inters industrial. Actualmente, la vitamina B12 es producida exclusivamente por va fermentativa. Segn Spalla, debido a sus implicaciones en reacciones qumicas importantes, la vitamina B12 origin gran inters y tiles aplicaciones en la salud, tanto de personas como de animales.La produccin mundial de vitamina B12 vara de 5 a 10 toneladas/ao, con un precio medio de $ 5 000/kg (USD) /2/. Brasil se ha tornado a un tradicional importador, con compras anuales del orden de cinco millones de dlares (Trade Pointde Campinas, So Paulo, 1997).A medida que la investigacin de la vitamina B12 evolucion, se torn claro que la mejor fuente productora es representada por los microorganismos. Actualmente, ella es sintetizada por una gran variedad de bacterias, destacndose los gneros Pseudomonas, Propionibacterium y Corynebacterium.La vitamina B12 pertenece a un grupo de molculas grandes y complejas, denominadas cobalto-corrinoides. Todos los cobaltocorrinoides cuyo ligante axial inferior de molcula es el 5,6 dimetilbenzimidazol son conocidos como cobalaminas. De la misma forma, si el ligante axial superior est constituido por un radical ciano, se obtiene la cianocobalamina o la verdadera vitamina B12.La vitamina B12 es particularmente importante en la maduracin de glbulos rojos de la sangre y se halla relacionada con el metabolismo del cido flico. Adems interviene en la sntesis del ADN, del ARN y de las protenas; mantiene la vaina de mielina de las clulas nerviosas, acta en la sntesis de neurotransmisores; y es necesaria para transformar los cidos grasos en energa (reacciones de isomerizacin).

ORGANISMOS UTILIZADOS PARA MICROOPRODUCCINDada la complejidad de su sntesis qumica, la forma ms econmica de produccin es exclusivamente con ayuda de microorganismos. La produccin de vitamina B12 incluye una gran variedad de bacterias y actinomicetos, pero de los que han ofrecido mejores rendimientos pocos han sido seleccionados para uso a nivel industrial, entre los que se encuentran Propionibacterium shermanii con un rendimiento de 23 mg/l, Propionibacterium freudenrenchii con 19 mg/l y Pseudomonas denitrificans con 60 mg/l. Siendo esta ultima la cepa mayor productora de vitamina B12 (Crueger, W .1993).De acuerdo con Quesada-Chanto et al., Cummin y Johnson y Keuth y Bisping, la utilizacin de Pseudomonas y Propionibacterium se ha justificado, debido al hecho de que esas bacterias y sus mutantes presentan ventajas, tales como el aumento intracelular del contenido de vitamina, alta productividad y un rpido crecimiento.

CLASIFICACIN CIENTFICACuadro 1. Clasificacin cientfica de Pseudomonas denitrificansREINO:BACTERIA

Filo:Proteobacteria

Clase:Gamma Proteobacteria

Orden:Pseudomonadales

Familia:Pseudomonadaceae

Gnero:Pseudomonas

Especie:P. denitrificans

CARACTERSTICAS MICROBIOLGICAS DE Pseudomonas denitrificansPseudomonas denitrificanses un grupo importante de bacilos Gram-negativos quimioorganotrficos aerbicos. CARACTERSTICAS GENERALES:Bacilos rectos o curvados; tamao de 0.5-1.0m por 1.5-4.0 m; sin esporas; Gram negativos; metabolismo respiratorio, nunca fermentativo, pueden producir aerbicamente pequeas cantidades de cido procedentes de glucosa; utilizan compuestos orgnicos de bajo peso molecular, no polmeros; algunos son quimiolitotroficos y utilizan H2 o CO como nicos donadores de electrones; requieren condiciones mnimas de humedad (25 - 75 % de la capacidad de campo); el pH debe ser neutro, entre 7.0-7.8 (pH ptimo 7.1), evitando al mximo las fluctuaciones. CINTICA DE CRECIMIENTO DE Pseudomonas denitrificansLa figura 3 muestra el patrn de crecimiento de biomasa pre-cultivada bajo condiciones aerbicas con presencia de nitrato. Posteriormente crece aerbicamente, de nuevo con presencia de nitrato. La biomasa creci exponencialmente durante 2-h de la fase aerbica, luego experiment una fase lag de aproximadamente 1 hora antes de reanudar el crecimiento. Este retraso, que se produjo despus de la transicin entre las condiciones aerobias y anxicas, es el retraso diauxico. Este fenmeno para la conmutacin entre los compuestos (por ejemplo, glucosa y sorbitol) fue descrito por primera vez por Monod (1949).

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Fig. 3 Crecimiento diauxico de Pseudomonas denitrificans debido al cambio de aceptores de electrones del oxgeno en nitrato. (Biomasa fue pre-cultivadas en condiciones aerobias con nitrato presente, la fase aerbica tambin tena nitrato).Si el nitrato est ausente en el pre-cultivo, los rezagos diauxicos son largos (4-9,5 h), mientras que con la presencia de nitrato se obtienen rezagos diauxicos cortos (1-4,5 h). La presencia de nitratos tiene un impacto significativo en las caractersticas de crecimiento bacteriano con las mezclas binarias de sustratos de carbono (Hamilton y Dawes, 1959, 1960, 1961; Narang et al, 1997).Cuando la fase aerobia es corto, la presencia o ausencia de nitrato durante esta fase no afecta apreciablemente la duracin del retraso diauxico

(Fig. 4). Para el caso de largas fases aerobias, la presencia de nitrato durante la fase aerbica acortado el desfase (4 vs 7 h; Fig. 5).

Fig. 4. Efecto de la presencia de nitrato durante una fase corta de crecimiento aerbico.

Fig. 5 Efecto de la presencia de nitrato durante la fase de crecimiento largo aerbico.

En crecimiento cuando no se contienen nitratos la fase lag es corta, esto se puede ver en la figura 6.

Fig. 6 Crecimiento tpico diauxico tras pre-cultivo anxico cuando la fase aerbica no contiene nitratos.

CONSTANTES CINTICASPasa Pseudomonas denitrificans se encontr un tiempo de duplicacin (td) de 0.58 h y por tanto, una velocidad mxima especfica de crecimiento (max) de 1.20 h-1, y una constante promedio de velocidad (Ks) de 1.35 g/L[footnoteRef:1] [1: ]

MEDIO DE CULTIVOLa cepa necesita nutrientes tradicionales, tales como extracto de levadura, sacarosa y varias sales minerales en el medio de crecimiento. Para mejorar la produccin de vitamina B12, el medio tiene que ser complementado en el comienzo del cultivo con 10-25 mg / litro de DBI y 40-200 mg / litro de nitrato de cobalto (McDaniel, 1962: Daniels, 1970).Del mismo modo, la betana y en cierta medida el cloro, tienen efectos favorables en la activacin de algunos pasos biosintticos y el cido glutmico estimula el crecimiento de bacterias (Daniels, 1966: Koike y Hattori, 1995). Debido a sus bajos costes las melazas de remolacha se utilizan preferentemente en la fermentacin industrial a un 60-120 g/litro de concentracin en conjuncin de fosfato de amonio (2-5 g/litro) y algunos oligoelementos.Sabiendo lo anterior, el medio seleccionado para la produccin de vitamina B12, segn los requerimientos de Pseudomona denitrificans fue el descrito por Florent (1986) y optimizado por Sampaio y Monte Alegre (1999). El medio de cultivo tiene la siguiente composicin en (g/L): sacarosa =100,0; extracto de levadura:2,0; (NH4)2HPO4:5,0; MgSO47H2O:3,0; MnSO4H2O:0,2; CoCl26H2O:0,02; ZnSO47H2O:0,02; Na2MoO42H2O:0,005; Betana:10,0 (Melaza de remolacha:418,0); 5,6 DMI:98,8; pH 7,4. CONDICIONES DEL CULTIVODe acuerdo con Sampaio y Monte Alegre (2000), las condiciones son: Temperatura= 34.6 C, pH 7,1; condiciones mnimas de humedad: 25-75 % de la capacidad de campo; con un lote de 25- 50 litros de medio con 1.2 % de inoculo el tiempo de incubacin es de 25- 30 horas., con una agitacin de 300 rpm y aun aireacinde 0.5 vvm.